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PRESERVAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS

Ivano de Filippis [email protected]

[email protected]

Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZInstituto Nacional de Controle

de Qualidade em Saúde – INCQS

Utilização frequente de culturas para pesquisa, produção de biológicos ou ensaios

• Contaminação

• Diminuição da viabilidade

• Mutações

Porque preservar microrganismos?

Criopreservação

- Congelamento e preservação na fase líquida

ou gasosa de N2 líquido.

- Congelamento e preservação abaixo de -70°C.

Dessecação

- Preservação por liofilização

- Preservação por centrifugação

- Preservação por “L-drying”

Metodologias de preservação metabolicamente inativas:

- Repiques periódicos em ágar ou meio líquido

- Manutenção de culturas em “slant” com óleo mineral

- Preservação em água (Castellani)

Metodologias de preservação metabolicamente ativas:

Congelamento:

-20° C:Vantagens: barato, equip.simples, contam. reduzida, necessidade de pouco espaço.Desvantagens: monitoração do equip., manutenção frequente dos mos., estruturas biológicas instáveis.

-70° C:Vantagens: estabilidade, armazenamento por longos períodos.Desvantagens: custo equip./manutenção constante.


Liofilização

Vantagens:

- Produção, distribuição e armazenamento de lotes

- Alta viabilidade durante a estocagem (50 anos)

- Produção de grande número de ampolas/lote

- Armazenamento simples/pouco espaço

Desvantagens:

- Alto custo inicial

- Utilização de diversos reagentes/mat. laboratório


Liofilização em ampolas

Ampola estrangulada:

Vantagens:

- Maior durabilidade

- Menor espaço p/estocagem

- Menor custo

Desvantagens:

- Dois ciclos de liofilização

- Menor resistência a impactos

- Menor durabilidade


Liofilização em ampolas

Frasco-ampola:

Vantagens:

- Apenas um ciclo para liofilização

- Menor tempo de liofilização

- Maior resistência a impactos

Desvantagens:

- Menor durabilidade

- Maior custo

- Necessidade de equipamento p/fechamento das ampolas


Liquid-drying

• Preservação de mo sensíveis ao estágio inicial de congelamento no processo de liofilização convencional.

• As culturas não são previamente congeladas e a dessecação ocorre a partir da fase líquida.

• Criopreservador submetido ao processo de liofilização convencional.


Liquid-drying

• Suspensão do microrganismo no mesmo criopreservador égotejada sobre o liófilo.

• Ampolas são novamente submetidas ao processo de lioflização

• O liófilo está apenas úmido com a suspensão do mo � não háborbulhamento (fervura) do material durante o vácuo.


Repiques periódicos:Vantagens: barato, não requer equipamentos especiais.

Desvantagens: mutações, contaminações, manutenção

frequente, espaço.

Óleo mineral: Repiques menos frequentes, menor taxa de

contaminação/mutações.

Metodologias de preservação Metabolicamente ativas:

“Skim Milk”: mais utilizado para liofilização, baixo custo, boa recuperação.

Carbohidratos: bastante utilizados, necessitam meio de cultura, resultados variáveis.

Soro e sangue: específicos para alguns mo; podem inibir alguns mo.

DMSO: congelamento de céls., tóxico p/alguns mo.

Glicerol: procedimento simples, método de congelamento mais utilizado.

Criopreservadores

Dois tipos básicos

Proteção intra-celular:

glicerol e DMSO �� congelamento -20 a -196ºC

Proteção extra-celular:

“Skim Milk”, glicose, lactose, manitol, sacarose,

sorbitol, inositol, (apenas liofilização)

Criopreservadores

Congelamento: gêlo � dano à célula � congelamento do soluto (mistura eutética) � temperatura eutética (Ex.: NaCl = -21.8° C)

Criopreservador: componente não-iônico � substituição da água reduzindo o aumento da concentração iônica. Ex. glicerol, DMSO.

Criopreservadores

Criopreservação

Preparo do criopreservador

• Sol. aquosa a 5% � DMSO

• Sol. aquosa a 10% - 20% � glicerol

Congelamento

• Ressuspender o crescimento no criopreservador

• Congelar segundo metodologia específica.

CriopreservaçãoNitrogênio Líquido

1. Crescimento fase log em meio líquido

2. Criotubo de poliestireno com ou sem pérolas de vidro/plástico

3. Transferir a cultura para 100-200µl de meio líquido + glicerol estéril [C] final de 15-20%

• Células � Congelar a 1-2ºC/min ou -20ºC-70ºC/30´

• Microrganismos � Colocar em -70ºC/1 hora

• Imergir as ampolas na fase líquida do LN2

PRESERVAÇÃO DE ANAERÓBIOS

Manter a atmosfera anaeróbica das ampolas ou criotubos “lavando” com mistura de N2/CO2

Selar as ampolas ou criotubos com a mistura gasosa apropriada para o gênero.

Utilizar criopreservador reduzido

CRIOPRESERVAÇÃO

Considerações finais

• Durante o congelamento, quanto maior a temperatura, maior o tamanho dos cristais de gelo formados.

• Cristais de gelo grandes em temperaturas próximas de zero, causam maiores danos.

• Mesmo após congelamento perfeito, a recristalização do gelo (a partir de –120C), pode causar danos à célula (thawing damage).

• O descongelamento rápido evita a recristalização e diminui o tempo de contato de grandes cristais com estruturas celulares.

• Microrganismos Gram positivos são mais resistentes pela presença de peptideoglicana na parede.

Escolha do método de preservação

• Manutenção da viabilidade

• Frequência de mutações

• Pureza

• Custo de manutenção

• Número de culturas/espaço

• Valor das culturas

• Fornecimento e transporte

• Frequência de uso

• Disponibilidade de Recursos

Vida média de alguns gêneros bacterianos preservados por diferentes métodos

Gênero Repiquesa Óleo mineral -70C LN2 Liofilização(meses) (anos) (anos) (anos) (anos)

Acetobacter 1-2 1 1-3 >40 >40

Achromobacter 1 1-2 1-3 >40 >40

Agrobacterium 1-2 1-2 -- >40 >40

Bacillus 2-12 1 2-3 >40 >40

Erwinia 1-4 1-2 -- >40 >40

Gluconobacter 1 -- -- >40 >40

Lactobacillus 1 semana -- -- >40 >40

Methanobacteriuma 1 -- -- >40 5

Methanomonasa 1 -- -- >40 5

Xanthomonas -- -- 1-2 >40 >40

aDepende do meio utilizado e da espécie.(adapatado de Murray, 1994)

Teste acelerado de viabilidade após preservação

A viabilidade de mo preservados por liofilização ou L-drying é

diretamente afetada pela temperatura durante a estocagem.

Ex.: 8 anos a 5°C = 2 semanas a 37°C.

log St = log S0 – (logS0 – logSac) . t/8

Onde: St = viabilidade após t anos a 5°C

S0 = viabiliadade imediatamente após liofilização/L-drying

Sac = viabilidade após estoque a 37°C por 2 semanas

Sendo: S0 = 107 UFC/ml, Sac = 105 UFC/ml e t = 8 anos

Temos: St = 7 – (7 – 5) 8/8 � St = 7-2 � St = 105 UFC/ml

Teste acelerado de viabilidade após preservação

O tempo no qual os mo perdem totalmente sua viabilidade

durante a preservação a 5°C pode ser calculado por:

t = 8 . log S0 / (logS0 – logSac)

Onde: t = anos necessários p/perda total da viabilidade

S0 = viabiliadade imediatamente após liofilização/L-drying

Sac = viabilidade após estoque a 37°C por 2 semanas

Sendo: S0 = 108 UFC/ml e Sac = 105 UFC/ml

Temos: t = 8.8 / (8 – 5) � t = 64 / 3 � t = 21 anos e 3 meses

TESTES PRÉ E PÓS-LIOFILIZAÇÃO

• Viabilidade (pré e pós):Diluições seriadas ou alça calibrada

• Pureza (pré e pós):Meio rico / 37°C / aerobioseIsoenzimas

• Identidade (pré e pós):Provas bioquímicasPCR-16SPCR genes funcionais específicosRAPD-PCR, Pulse-field

• Umidade (pós):Carl Fisher

• Vácuo (pós):Spart Tester

Freeze-drying and cryopreservation of bacteria.(Perry, S.F. Molecular Biotechnology, 9:59-64, 1998)

• Congelamento e liofilização são os métodos mais usados para a conservação de microrganismos.

• Nenhum método é capaz de alcançar uma taxa de recuperação de 100%.

• Se a preservação de 100% das células for imprescindível, aconselha-se utilizar os dois métodos em paralelo.

• Na temperatura alcançada pelo Nitrogênio líquido (-160 a -190 C), a viabilidade celular não tem praticamente nenhuma relação com o período de armazenamento, e os sistemas biológicos estão geneticamente estáveis.

Freeze-drying and cryopreservation of bacteria. (Perry, S.F. Molecular Biotechnology, 9:59-64, 1998)

• A criopreservação a -60/-80C, permite boa recuperação e pode ser usado quando não houver disponibilidade de N2 líq., onde uma pequena perda da viabilidade étolerada.

• De um modo geral temperaturas acima de -30 C não apresentam bons resultados devido à formação de misturas eutéticas.

• O método das contas ou pérolas de vidro, é aconselhado para diminuir espaço e evitar os constantes descongelamentos das amostras.

Coleção de Microrganismos de Referência do

INCQS/FIOCRUZ

� Criada em 1983 �� 1a cultura: Bacillus subtilis INCQS 00001 (ATCC 6633) lote 1083001

� Coleção de Referência Nacional (Farmacopéia brasileira)

� 1989 �� inscrita na World Federation of Culture Collection (WFCC), INCQS-WDCM 575.

� 2008 �� Credenciamento - fiel depositário

HISTÓRICO

� 2009 – ANVISA deposita cepa Mycobacterium massiliense

INCQS 00594

“Ensaio de avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes hospitalares para artigos semi-críticos”RDC no. 75 de 23/10/08.

HISTÓRICO

4. Direitos de distribuição (marcar apenas uma opção)

� O depositante transfere os direitos de propriedade da cepa para

o INCQS.

� O depositante não transfere os direitos de propriedade da cepa

para o INCQS, mas permite sua distribuição irrestrita.


para o INCQS, mas permite sua distribuição restrita somente às

instituições designadas pelo depositante.


para o INCQS, e não permite sua distribuição.

Depósito

� Aplicações: controle microbiológico de produtos farmacêuticos, vacinas, medicamentos, referências para pesquisa, etc.

� Serviços: preservação, fornecimento, identificação fenotípica/molecular, depósito, consultorias, etc.

� INCQS �� Sistema de Gestão da QualidadeNorma ABNT NBR ISO/IEC 17025 - 2004

CARACTERÍSTICAS

69,30%3,80%

3,20%

2,20%

2,00%

19,50%ATCCCCTDSMZCDCNCTCOthers*

Origem das linhagens

*Outros: (FDA, NIH, CIP, CCUG, SSI, UFRJ, UERJ, UFF, UFPE, LFB, IAL, etc.)

ACERVO� Bacterias

– 630 linhagens (69 gêneros)

� Fungos– 277 linhagens (36 gêneros)

� Archaea– 29 linhagens (19 gêneros)

� TOTAL = 936 cepas de referência

SEGURANÇA E BIOSSEGURANÇA

� Segurança do acervo/dados– Acesso físico– Sistema de memória– Serviço de Informática centralizado ��Backup diário

� Envio de amostras – Normas internacionais - IATA

� Biossegurança– 99% �� NB-2– NB-3 �� mantidas em condições NB-3

� Bacterias:� Criopreservação �� 5% do acervo, backup

� -70°C, N2 líquido� Liofilização �� 95% do acervo

� Fungos e leveduras:� Repiques periódicos� Óleo mineral� Criopreservação �� 5% do acervo, backup

� -70°C, N2 líquido� Liofilização �� 95% do acervo

� Archaea:� Liquid-Drying (L-Drying) �� 90% do acervo� Cultura ativa �� 10% do acervo� Criopreservação �� backup

Métodos de preservação

Fornecimento de microrganismos

Depto. Microbiologia - Lab. Microrganismos de Referência09*=até set/2009

16 119187

259317

476

719

434

918

789

670

468

692

570

721

10101097

895 886

11641110 1148

1332

1003901

1314

1013

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08 09*

Solicitações Ampolas fornecidas

Controle da Qualidade

• Vácuo �� Spart Tester

• Umidade �� Carl Fisher

• Viabilidade

• Pureza

• Identidade

• Métodos convencionais

• Métodos moleculares

• 16S, tDNA-PCR, PCR genes funcionais,

ERIC-PCR, RAPD, etc.

� Linhas de pesquisa vinculadas às atividades da coleção� Epidemiologia molecular de isolados clínicos

� Desenvolvimento de métodos rápidos de Diagnóstico molecular

� Taxonomia e Filogenia molecular de isolados clínicos e ambientais

� Diversidade Molecular Ambiental – recursos hídricos, solo, sedimentos

� Isolamento e descrição de novas espécies e/ou gêneros de isolados brasileiros

� Micorremediação

� Treinamento (externo e interno) da equipe para as atividades da coleção � ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005

� Normas de Biossegurança

� Treinamento em centros nacionais e internacionais

Pesquisa e Treinamento

Coleção de Microrganismos de Referência Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – INCQS Av. Brasil, 4365 – Manguinhos

Rio de Janeiro – RJ21045-900

Tel.: 21-3865-5236FAX: 21-2290-0915

Ivano de Filippis [email protected]

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