… de outubro de 2016

C A M E V E TCódigo: 000

TRÂMITE IDATA: … de outubro de 2016

GUIA DE PROVA DE POTÊNCIA PARA VACINAS INATIVADAS BOVINAS QUE CONTENHAM EM SUA FORMULAÇÃO O VÍRUS

DA DIARREIA VIRAL BOVINA

Guia n° 2 - G.V.

AUTORES PROSAIA

Participaram da confecção deste guia os seguintes especialistas (listados por ordem alfabética), que formam o grupo ad hoc do Vírus da Diarreia Viral Bovina da Fundação PROSAIA:

AUTOR PRINCIPAL

Dra. Viviana Parreño (Instituto de Virologia / INCUINTA CICVeA, INTA Castelar. Pesquisadora Independente CONICET)

AUTORES SECUNDÁRIOS

Dr. Gustavo Combessies (Laboratório Azul)

Dr. Fernando Fernández (INTA. Coordenador Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento)

Dra. Valeria Gonzalez Thomas (Analista Profissional do Departamento de Controle de Vacinas da Coordenação de Virologia. Direção de Laboratório Animal. Direção Geral de Laboratório e Controle Técnico. Serviço Nacional de Sanidade e Qualidade Agroalimentar – SENASA)

Dr. Alejandro Ham (Laboratório Biogênese Bagó S.A. - CAPROVE).

Dr. Darío Malacari (Laboratório CRESAL Veterinária S.A.)

Dr. Anselmo Odeón (INTA Balcarce)

Dra. Andrea Pecora (Instituto de Virologia , CICVeA, INTA Castelar. Pesquisadora Assistente - CONICET)

Dra. Maria Sol Perez Aguirreburualde (Instituto Patobiologia, INTA Castelar)

Dra. Sandra Tobolski (Laboratório Biogênese Bagó S.A. - CAPROVE).

Dra. María Marta Vena (Médica veterinária. Consultora independente em pesquisa e desenvolvimento e assuntos regulatórios).

Dr. Andres Wigdorovitz (INCUINTA, CICVeA, INTA Castelar, Pesquisador INDEPENDIENTE CONICET)

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Responsável pela coordenação do grupo: Javier Pardo – Médico veterinário (Fundação PROSAIA).

Tabela de conteúdos

Prólogo ...............................................................................................................................31. Introdução.........................................................................................................................52. Guia: Controle de potência em cobaias.............................................................................62.1. Esquema da prova..........................................................................................................72.1.1. Cobaias........................................................................................................................72.1.2 Procedimento...............................................................................................................72.1.3. Interpretação................................................................................................................82.1.4. Critério de validação do teste......................................................................................82.1.5. Cálculos.......................................................................................................................92.1.6. Critério de aprovação..................................................................................................93. Harmonização de ensaios para a região............................................................................94. Referências......................................................................................................................10

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PROVA DE POTÊNCIA PARA VACINAS INATIVADAS BOVINAS QUE CONTENHAM EM SUA FORMULAÇÃO O VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA

1. INTRODUÇÃO

O Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB) pertence ao gênero pestivírus da família

Flaviviridae (Ridpath, 2005). O VDVB se classifica em genótipos (1 e 2). O genótipo 1, por sua

vez, pode ser subdividido em 17 subgenótipos e o genótipo 2, em 3 subgenótipos (Giammarioli,

Pellegrini, Casciari, Rossi, & De Mario, 2008). Os dois genótipos podem ser diferenciados entre si

mediante análises genéticas e com a utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) dirigidos contra

as glicoproteínas principais do invólucro E2 e ERNS (Nettleton, Paton, & Bela, 1997).

Recentemente, foi proposta a inclusão de uma nova espécie conhecida como “Vírus Hobi” ou

“VDVB-3” (Shi et al., 2016). O VDVB pode apresentar dois biótipos: o não-citopatogênico

(NCP) e o citopatogênico (CP), classificados conforme os efeitos visíveis (lesões) gerados nos

cultivos celulares epiteliais (Ouisa, Assieb, & Rchambaulta, 2005). Em geral, o biótipo NCP é o

que aparece com maior freqüência em bovinos.

Na Argentina, os dados reportados por Odeón e colaboradores, a partir de um levantamento

sorológico realizado em três regiões do país (Buenos Aires, La Rioja e Corrientes), revelaram uma

elevada prevalência (48,6% - 90,7%) de anticorpos contra o VDVB 1ª, em bovinos adultos (acima

de 2 anos), indicando uma ampla distribuição e exposição a este vírus no rebanho bovino dessas

províncias argentinas (Odeón et al., 2001). Em concordância com estes dados, relatórios mais

recentes descrevem prevalências de 79.8% (77.9%-80.8%) em animais adultos, em rebanhos de

criação da Província de Chubut (Pérez Aguirreburualde, 2014)(Pérez A., 2014). Quanto às

variantes virais que circulam na Argentina, o subgenótipo 1b do VDVB é o mais comum

(atingindo 70% dos isolamentos), seguido pelo subgenótipo 1a e pelo genótipo 2 (Pecora et al.,

2014; Pecora, Pérez Aguirreburualde, Zabal, & Dus Santos, 2017). Estas porcentagens variam de

acordo com o país. No Brasil, 80% dos isolamentos analisados, no último estudo epidemiológico

publicado, pertencem ao VDVB-1a, VDVB-2b e Vírus Hobi-like (também conhecido como

VDVB-3) (Silveira et al., 2015, 2017)(Silveira et al., 2015). No México, recentemente, reportou-se

a predominância do subgenótipo 1c do VDVB, entre 60 isolamentos estudados neste país (Gomez-

Romero, Basurto-Alcantara, Verdugo-Rodriguez, Bauermann, & Ridpath, 2017)

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No último estudo filogenético realizado no Uruguai, a maioria dos isolamentos do VDVB

analisados foi agrupada dentro do subgenótipo 1a, embora tenham sido encontrados também

isolamentos VDVB-1i e VDVB-2b (Maya et al., 2016). No Chile, encontrou-se porcentagens

similares de isolamentos VDVB-1 e VDVB-2 (Pizarro-Lucero et al., 2006). Nos Estados Unidos,

alguns trabalhos indicam que o subgenótipo 1b é o mais frequente em rebanhos bovinos (Fulton,

2015; Ridpath et al., 2011).

Embora seja um vírus ubíquo, vários países da União Europeia implantaram planos para o

controle/erradicação da diarreia viral bovina, baseados na detecção e na eliminação de animais

persistentemente infectados (PI) (Ståhl & Alenius, 2012).

Infecção aguda

É a forma clássica desta doença. Provavelmente, a rota de transmissão seja através das vias

orofaríngeas e respiratórias. O animal pode se infectar com um biótipo CP ou NCP e desenvolver

uma afecção respiratória, digestiva ou reprodutiva. O resultado pode ser uma infecção subclínica

ou uma doença severa com uma alta incidência de mortalidade, que pode vir acompanhada de

trombocitopenia e diátese hemorrágica, dependendo do genótipo do vírus atuante (Ridpath, 2005).

A afecção respiratória pode ser uma das manifestações da infecção generalizada pelo VDVB e

alguns investigadores associam esta doença com as cepas do subgenótipo 1b (Fulton et al., 2002).

O tropismo deste vírus pelo sistema imunológico ao infectar as células brancas, causando depleção

de linfócitos B e T circulantes, resulta em uma imunossupressão temporária que favorece a

infecção com outros patógenos (Bolin, 2002).

Existe evidência epidemiológica e experimental de que o VDVB está diretamente

associado ao Complexo Respiratório Bovino (CRB); interagindo com patógenos como o Vírus

Sincicial Respiratório (VRS), Parainfluenza bovina tipo 3 (PI-3), Herpesvírus Bovino Tipo 1

(Rinotraqueíte infecciosa bovina, IBR), Mannheimia haemolytica; Mycoplasma bovis; etc

(Grissett, White, & Larson, 2015).

Infecção congênita

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As consequências da infecção fetal causada pelo VDVB dependem do momento da

exposição ao vírus durante a gestação e está associada à disseminação transplacentária durante a

viremia. Se a infecção fetal ocorrer entre 0 a 45 dias da gestação, esta pode causar morte

embrionária; uma infecção entre 45 a 175 dias da gestação pode provocar aborto, defeitos

congênitos e/ou imunotolerância. Se a infecção ocorrer entre os dias 125 e 285, poderá provocar

aborto e nascimento de bezerros fracos, embora também seja comum o nascimento de bezerros

normais com anticorpos neutralizantes pré-colostro contra o VDVB (Malacari, Pecora, Capozzo,

& Odeón, 2016). A infecção venérea pode ocorrer quando são utilizados touros infectados de

forma aguda ou PI. A contaminação do sêmen com o VDVB ocorre porque este replica na

vesícula seminal e na glândula prostática. O sêmen infectado apresenta diminuição em sua

motilidade espermática e um aumento porcentual nas anormalidades morfológicas dos

espermatozóides (González Altamiranda et al., 2012; Ridpath, 2005). Um fator de risco ocasional

pode ser a presença de touros não virêmicos, mas com infecção testicular persistente, os quais

eliminam os vírus através do sêmen, de forma contínua.

Infecção persistente

Os animais PI são produtos da infecção transplacentária durante a gestação entre 35 a 125

dias. Acredita-se que o requisito para a geração da persistência recaia sobre a exposição ao vírus

quando o sistema imune do feto está em desenvolvimento (entre 40 a 125 dias). Este quadro está

associado à infecção por biótipos NCP e os animais infectados passam a ser os principais

transmissores da doença. Os animais PI são imunotolerantes aos vírus homólogos do VDVB; no

entanto, resultam imunocompetentes às cepas heterólogas do VDVB e também a outros agentes

infecciosos como HVBo, PI-3, etc. (Lanyon, Hill, Reichel, & Brownlie, 2013). Nos animais

persistentemente infectados (PI), o VDVB persiste em todos os tecidos, especialmente nas células

do sistema imune (Peterson, 2010).

Doença das mucosas

A doença das mucosas (DM) é uma manifestação esporádica da infecção pelo VDVB, que

acomete os animais PI ao serem infectados pelo biótipo CP. A presença do biótipo CP pode ser

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externa por sobre-infecção com biótipos CP homólogos (Ridpath, 2005), ou então, em decorrência

de rearranjos moleculares (mutação) na cepa NCP persistente (i.g. deleções, inserções, duplicações

de sequências virais e inserções de sequências do hospedeiro), originando assim a cepa CP. A

doença apresenta sinais clínicos severos (incluindo leucopenia severa, diarreia profusa, erosões e

ulcerações em todo o aparelho digestivo), baixa morbidade e uma letalidade próxima a 100%. A

DM pode apresentar um curso agudo ou crônico, dependendo da homologia entre o VDVB NCP e

o CP que acomete o animal PI (Bolin, 1995).

Síndrome hemorrágica

Esta síndrome, associada a infecções agudas com cepas do VDVB do genótipo 2, provoca

nos bovinos diarreia com sangue, epistaxe, congestão na conjuntiva e mucosas, hemorragias

petequiais e equimóticas nas mucosas, pirexia, leucopenia, linfopenia e neutropenia, com altas

taxas de mortalidade (Ridpath, Neill, Vilcek, Dubovi, & Carman, 2006).

Exames sorológicos

Os anticorpos induzidos após a infecção ou com a vacina contendo o VDVB presentes no

soro dos bovinos, podem ser detectados mediante técnicas clássicas de neutralização viral (NV) ou

mediante o teste de ELISA. Em cada teste, devem ser incluídos soros controles positivos e

negativos. Os resultados dos mesmos devem estar dentro dos limites predeterminados para que os

testes sejam considerados válidos/satisfatórios.

Observação sobre o teste NV

Para a realização do teste de NV são utilizadas cepas de VDVB CP para simplificar a

leitura dos resultados através do microscópio óptico. Algumas das cepas CP, amplamente

utilizadas, são “Singer”, “Oregon C24V” e “NADL”, pertencentes ao genótipo 1 do VDVB.

No caso específico dos estudos de prevalência, em virtude da variabilidade antigênica

detectada entre as cepas, com base na proteína E2 e considerando que a maior parte dos

anticorpos neutralizantes são gerados contra dita proteína, para realizar os testes de NV é

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conveniente tomar a precaução de selecionar cepas do VDVB apresentando suficiente semelhança

antigênica com as variantes virais circulantes no gado local (Pecora et al., 2014).

Por outro lado, quanto aos estudos experimentais de eficácia/imunogenicidade vacinal, os

ensaios de VN deveriam ser realizados empregando a mesma cepa utilizada na formulação da

vacina, ou uma cepa que apresente uma relação suficiente de homologia com a cepa vacinal.

No que diz respeito aos testes comerciais de ELISA disponíveis no mercado, em sua

maioria, estão baseados na detecção de anticorpos contra as proteínas virais não estruturais do

VDVB, tais como NS3 ou Erns, as quais se mantêm extremamente conservadas entre cepas de

diferentes genótipos. Esta estratégia superaria as limitações previamente descritas para o ensaio de

NV, quanto à variabilidade antigênica entre cepas.

Vacinas

As vacinas contra o VDVB podem ser de dois tipos: as formuladas com o vírus atenuado

ou aquelas produzidas com o vírus inativado. As vacinas produzidas com o vírus atenuado

geralmente dão uma resposta imune mais consistente no que tange à proteção proporcionada, em

comparação com as vacinas inativadas. No entanto, o uso destas vacinas está associado a vários

riscos. Em primeiro lugar, não podem ser aplicadas em fêmeas gestantes, pois podem provocar

infecção fetal e aborto. Por sua vez, a vacinação em animais PI com cepas atenuadas poderia

induzir quadros de DM. Finalmente, deve-se levar em conta que toda vacina viva contendo uma

cepa mal atenuada pode trazer riscos, ou uma reversão à virulência da cepa vacinal, com efeitos

indesejados.

As vacinas de vírus inativados, embora sejam muito mais seguras do que as atenuadas,

precisam ser administradas em várias doses para obter níveis satisfatórios de imunidade e devem

ser formuladas com adjuvantes ou imunomoduladores.

Na Argentina, a autoridade Nacional de Sanidade Animal (SENASA) autoriza, unicamente,

a fabricação de vacinas contendo o vírus inativado. E, somente, em 2012, foram apresentadas para

controle oficial 218 séries, equivalentes a um total de 50.770.794 doses de vacinas virais não

vesiculares bovinas. A partir da implementação da Resolução 598 de 2012, o SENASA dá início

ao controle de potência das vacinas bovinas não vesiculares, mediante o modelo com cobaias.

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Foram descritas vacinas experimentais de subunidades baseadas na glicoproteína E2 do

VDVB, gerada em diversos sistemas de expressão, como os baculovírus em células de insetos, ou

em células de mamíferos. Estas vacinas abrem uma perspectiva futura em termos de “vacinas

marcadoras” ou “DIVA” (discriminate between infected and vaccinated animals), quando forem

utilizadas juntamente com um teste sorológico complementar, que permite distinguir os animais

vacinados dos infectados (van Oirschot, 2001).

Seja qual for o tipo de vacina utilizada para proteger os bovinos contra o VDVB, a

profilaxia deveria vir acompanhada da eliminação dos animais PI, de um programa de controle dos

animais introduzidos no rebanho e do controle do sêmen utilizado.

Pelo que sabemos, não há, na região, um critério unificado para avaliar a eficácia das

vacinas inativadas, contendo em sua formulação o VDVB.

2. GUIA: PROVA DE POTÊNCIA EM COBAIAS

Este guia descreve um teste in vivo em animais de laboratório (cobaias), que permite

avaliar a potência (imunogenicidade) de vacinas de vírus inativado ou de subunidades utilizadas na

prevenção da infecção causada pelo VDVB.

Para a validação do modelo, foram seguidas as recomendações internacionais em matéria

de validação de métodos de controle de vacinas veterinárias, em particular, de vacinas combinadas

(EMEA/P038/97, 1998)(RE, 2001). Paralelamente, foram avaliadas, em bovinos e cobaias, vacinas

experimentais e comerciais, formuladas em adjuvantes oleosos e aquosos, contendo a valência

VDVB, combinadas com concentrações variáveis de outros antígenos virais (HVBo, PI-3, VRSB)

e bacterianos (Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,Histophilus sommi, Leptospira sp

y Campylobacter fetus). A imunogenicidade, aferida em ambas as espécies, com o título de

anticorpos neutralizantes contra o VDVB pós vacinação, demonstrou índices de concordância

quase perfeitos entre o modelo cobaia e a espécie de destino. O detalhamento técnico e estatístico

da validação está incluso no ANEXO I deste guia. Este teste pode ser utilizado para o controle de

qualidade de cada série da vacina do VDVB a ser liberado no mercado, sendo uma ferramenta

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prática tanto para as empresas produtoras de vacinas, quanto para o órgão de controle oficial,

garantindo, assim, a presença no mercado de produtos padronizados e eficazes.

No que tange ao bem-estar animal, esta prova atende às diretrizes dos órgãos

internacionais ao substituir e reduzir significativamente o emprego de animais em testes

experimentais (Akkermans and Hendriksen, 1999; Halder et al., 2002; Hendriksen, 2009).

O modelo cobaia desenvolvido, é um ensaio in vivo, mediante o emprego de um número

mínimo de animais (n=6 por vacina e 2 testemunhas/placebos), assegurando um resultado com

uma confiança de 95% (ANEXO1). Além disso, permite avaliar a imunogenicidade induzida para

todos os antígenos virais que a compõem, em vacinas combinadas polivalentes. Este modelo

também resulta apto para avaliar a imunogenicidade de vacinas de subunidades, com base na

proteína E2 ao induzir Ac neutralizantes (Pecora et al., 2015).

2.1 Esquema da prova

2.1.1 Cobaias

São utilizados, no mínimo, 6 animais para cada vacina, com uma idade acima de 30 dias e

um peso de 400 gramas ± 50 gramas, provenientes de uma colônia controlada, isentos de Ac

contra o VDVB. Podem ser utilizados machos ou fêmeas, mas cada grupo deve conter animais do

mesmo sexo, com um prazo de adaptação, após o ingresso na sala de inoculação, de 7 (SETE)

dias, no mínimo.

2.1.2 Procedimento

As cobaias são imunizadas com duas doses de vacina (em um intervalo de 21 dias), por via

subcutânea, com um volume equivalente a 1/5 da dose bovina. Os animais são mantidos sob

estudo durante, pelo menos, 30 dias e são colhidas amostras de soro após 9 dias da revacinação

(30 DPV). Juntamente com a avaliação da/s vacina/s incógnitas (n=6), deve-se incluir um grupo de

animais testemunhas não vacinados (n=2), bem como um grupo de cobaias vacinadas com uma

vacina de referência de potência conhecida (n=6). Após 30 (trinta) dias do início do controle, os

animais vacinados e os animais testemunhas são sangrados, realizando neles o controle sorológico

mediante a técnica da NV (ANEXO II).

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2.1.3 Interpretação

A análise da regressão linear do título de anticorpo determinado pela técnica da NV,

realizada durante a validação do modelo cobaia para a valência VDVB, indicou que a resposta de

anticorpos induzida pelas vacinas com o VDVB, em bovinos e cobaias, foi diretamente

proporcional à concentração de antígeno (Ag) contido na vacina (ensaio dose-resposta) (ANEXO

1).

O modelo cobaia foi capaz de discriminar significativamente entre vacinas aquosas e

oleosas, formuladas com concentrações de Ag de 1 log de diferença (ANEXO 1)m

A partir dos resultados obtidos na curva dose-resposta, foram calculados pontos de corte ou

níveis de títulos de Ac neutralizantes que permitem diferenciar as vacinas, de acordo com a

imunogenicidade induzida em cobaias e bovinos.

Foi estabelecido um ponto de corte que permite discriminar entre vacinas de baixa

imunogenicidade e de imunogenicidade satisfatória (Tabela 1) (consultar detalhes técnicos da

validação no ANEXO I).

Tabela 1 Pontos de corte de classificação de vacinas para VDVB 2016

ESPÉCIEPOTÊNCIA DA VACINA Ac anti-VDVB

Não Satisfatória Satisfatória Muito Satisfatória

COBAIA ȳ < 1,37 1,37 ≤ ȳ ≤ 2,0 2,0 < ȳ

BOVINO Ȳ < 1,54 1,54 ≤ Ȳ ≤ 2,13 2,13 < Ȳ

Tabela 1. Pontos de corte determinados como o log10 do titulo de anticorpos neutralizantes

presentes no soro de cobaias e bovinos vacinados com a vacina incógnita. (y) Título médio de Ac

de grupos de 5 cobaias, avaliado a 30 dias pós-vacinação (dpv); (Y) grupos de 5 bovinos

avaliados a 60 dpv. Os bovinos recebem duas doses de vacina com um intervalo de 30 dias e são

colhidas amostras a 0 e 60 dpv. As cobaias recebem duas doses de vacina (1/5 do volume da

dose bovina), com um intervalo de 21 dias e são colhidas amostras a 30 dpv.

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Vacinas com títulos de Ac neutralizantes acima de 1,37 em cobaias e acima de 1,54 em

bovinos foram associados a vacinas de imunogenicidade satisfatória. No entanto, vacinas que

induzem títulos de Ac inferiores aos mencionados pontos de corte são consideradas não

satisfatórias. (ANEXO I).

2.1.4 Critério de validação da prova das cobaias

Será considerada válida a prova de potência em cobaias, quando a média obtida do título

de Ac dos animais vacinados, com uma vacina de referência, de qualidade satisfatória, estiver

dentro do valor esperado (acima de 1,37 em cobaias e 1,54 em bovinos), e as cobaias controles

não vacinadas (testemunhas) permanecerem soronegativas para Ac neutralizantes contra VDVB

durante toda a experiência.

2.1.5 Cálculos

Serão avaliados todos os soros dos seis animais imunizados com a vacina controlada. Serão

selecionados 5 (CINCO) soros com o maior título obtido (expressado em log10 do inverso da

máxima diluição com atividade neutralizante) e sobre eles será calculada a média aritmética.

2.1.6 Critério de aprovação

Se a média do log10 dos títulos de Ac neutralizantes a 30 dpv nas cobaias vacinadas for

superior ou igual a 1,37, a vacina será considerada satisfatória.

3. HARMONIZAÇÃO DE ENSAIOS PARA A REGIÃO

É recomendável contar com um painel de soros controles positivos e negativos para

anticorpos contra o VDVB, bem como vacinas de referência. Estes reagentes de referência locais

serão utilizados para harmonizar os resultados obtidos em cada laboratório de ensaios que adotar

este método de controle. A vacina de referência permitirá estabelecer a conformidade do ensaio da

imunização das cobaias e o painel de soros, por sua vez, poderá ser utilizado como controle da

técnica sorológica recomendada (NV) e para a padronização de outros ensaios alternativos

(ELISA).

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4. REFERÊNCIAS

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