PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO S UL

PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA E CIÊNCIAS DA SAÚDE

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA

TESE DE DOUTORADO

JULIA DE BARROS MACHADO

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE COTININA E HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS NO LÍQUIDO AMNIÓTICO E CORDÃO UMBILICAL AO NASCIMENTO

PORTO ALEGRE 2014

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO S UL

FACULDADE DE MEDICINA

PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA E CIÊNCIAS DA SAÚDE

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA

NÍVEL: DOUTORADO

JULIA DE BARR OS MACHADO

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE COTININA E HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS NO LÍQUIDO AMNIÓTICO E

CORDÃO UMBILICAL AO NASCIMENTO

PORTO ALEGRE 2014

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO S UL

FACULDADE D E MEDICINA

PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA E CIÊNC IAS DA SAÚDE

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA

NÍVEL: DOUTORADO AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE COTININA E HIDROCARBONETOS

POLICÍCLICOS AROMÁTICOS NO LÍQUIDO AMNIÓTICO E CORDÃO UMBILICAL AO NASCIMENTO

JULIA DE BARROS MACHADO

Tese de doutorado apresentada como requisito para obtenção do Grau de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS). Orientador: Prof. Dr. José Miguel Chatkin

PORTO ALEGRE 2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação ( CIP)

M149a Machado, Julia de Barros

Avaliação dos níveis de cotinina e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos no líquido amniótico e cordão umbilical ao nascimento / Julia de Barros Machado. – Porto Alegre, 2014.

87 f. : il.

Tese (Doutorado em Medicina e Ciências da Saúde, área de concentração Clínica Médica) – Faculdade de Medicina, PUCRS.

Orientador: Prof. Dr. José Miguel Chatkin.

1. Clínica Médica. 2. Obstetrícia. 3. Gestação. 4. Tabagismo. 5. Cotinina. 6. 1-hidroxipireno. 7. Benzopireno. I. Chatkin, José Miguel. II. Título.

CDD 618.2 NLM WQ 200 NLM QY 335

Ficha Catalográfica elaborada por

Vanessa Pinent CRB 10/1297

Dedico a meu marido Lucas por todo apoio, am or e compreensão e a minha filha Laura que iniciou o Doutorado “dentro da minha barriga”, tendo que entender, desde bebê, que nada vem sem esforço e dedicação, e que sempre devemos transformar a adversidade em aprendizado.

AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente aos meus pais, Paulo e Flávia, por todo amor,

dedicação e ensinamentos. Pela confiança e estímulo em alcançar todos os meus objetivos.

Às minhas irmãs Paula, Bruna e Amanda, pelo apoio e ajuda com a minha

filha. Só entendi o quanto o amor de um irmão é grande, no momento em que deixava a minha filha com uma delas e parecia que ela estava comigo.

Ao meu Orientador Dr. José Miguel Chatkin, pela dedicação,

disponibilidade, auxílio, confiança e acompanhamento exercido ao longo destes anos.

Às Dras. Flávia Valladão Thiesen e Aline Rigon Zimmer, pela realização de

todas as análises laboratoriais, verdadeiras coorientadoras deste trabalho, que, infelizmente, por questões burocráticas não puderam ser assim denominadas.

À Ana Paula Goulart, pela ajuda nas coletas dos materiais, tentei motivar

várias pessoas, mas a Ana foi a única que assumiu a reponsabilidade e ajudou-me muito neste processo trabalhoso.

Às Dras. Letícia Paula, Bartira da Costa e Daniela Blanco, por terem

participado do processo de qualificação e terem feito sugestões importantes para o crescimento da minha tese.

À Comissão Científica do XXXVII Congresso Brasileiro de Pneumologia e

Tisiologia, pelo prêmio de melhor trabalho na área temática do tabagismo e por terem me possibilitado apresentá-lo no Congresso.

Às pacientes que concordaram em participar do trabalho, pois sem elas ele

não seria possível. Enfim, a todas as pessoas que estiveram ao meu lado e souberam

entender a minha ausência em alguns momentos, pois... “Todas as vitórias ocultam uma abdicação”. (Simone de Beauvoir)

RESUMO O tabagismo na gestação tem sido associado a inúmeras alterações, impactando em várias fases do desenvolvimento fetal, incluindo efeito teratogênico. O objetivo deste estudo foi avaliar se a exposição materna a algumas substâncias tóxicas existentes na fumaça do cigarro (cotinina, 1-hidroxipireno e benzopireno) são transmitidas ao feto. Através de delineamento transversal controlado, foram selecionadas 125 gestantes internadas no Centro Obstétrico do Hospital São Lucas da PUCRS, em Porto Alegre. As voluntárias foram classificadas conforme seu status tabágico: 37 tabagistas ativas, 25 tabagistas passivas e 63 não fumantes (controles). Foram realizadas as dosagens de cotinina e 1-hidroxipireno na urina materna e líquido amniótico; cotinina e benzopireno no sangue do cordão umbilical através de cromatografia líquida de alta eficiência. Para estimar a diferença proporcional das variáveis assimétricas entre os grupos utilizou-se a razão das médias (RM) e intervalo de confiança de 95%. Para o cálculo das diferenças entre os grupos foi utilizado o teste post-hoc de Tukey. Todas as variáveis estudadas apresentaram diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e tabagista. Não foi observada diferença significativa entre os grupos controle e tabagista passivo. A concentração de cotinina foi cerca de 6 vezes maior na urina das gestantes tabagistas, RM: 5,92 [2,59 - 13,55], p

ABSTRACT

Cigarette smoking during pregnancy has several impacts on fetal

development, including teratogenic effects. The objective of this study was to assess whether the toxic substances

(cotinine and polycyclic aromatic hydrocarbons) found in pregnant smokers are transmitted to their fetuses. The outcomes were analyzed measuring cotinine and 1-hydroxypyrene in the amniotic fluid and maternal urine, benzopyrene and cotinine in the umbilical cord blood.

Through a controlled cross-sectional design, 125 pregnant women were selected and classified according to their smoking status: 37 current smokers, 25 passive smokers and 63 non-smokers (controls). We performed high-performance liquid chromatography to measure substances’ concentrations. A post-hoc Tukey’s test was used to analyze the differences between the groups.

All variables were significantly different between controls and smokers. The mean ratios between the concentration of cotinine in smokers compared to controls were as follows: 5.9 [2.5 - 13.5], p < 0.001 in the urine; 25 [11.9 - 52.9], p < 0.001 in the amniotic fluid; and 2.6 [1.0- 6.8], p = 0.044 in the umbilical cord blood.

The mean ratios of 1-hydroxypyrene concentration between smokers and controls were 7.3 [1.6 - 29.6], p = 0.003 in the urine and 1.3 [1.0 - 1.7], p = 0.012 in the amniotic fluid, and of benzopyrene in umbilical cord blood was 2.9 [1.7 - 4.7], p < 0.001.

There were no significant differences between controls and passive smokers. When comparing the three groups together, there were statistical differences between all variables.

Thus, the fetuses of pregnant smokers are exposed to toxic and carcinogens substances. To our knowledge, this is the first study to measure 1-hydroxypyrene in the amniotic fluid and benzopyrene in umbilical cord blood by high-performance liquid chromatography when considering pregnant women in relation to smoking exposure only.

Keywords: Pregnacy, tobacco, cotinine, polycyclic aromatic hydrocarbons

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Principais causas de morte no mundo ................................................12 Figura 2: Detecção de cotinina em gestantes e fetos.........................................25 Figura 3: Mecanismos de mutagênese dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos............................................................................................................27. Figura 4: Recrutamento das gestantes ..............................................................36

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Características da população em estudo ...........................................42 Tabela 2: Comparação de variáveis selecionadas entre os grupos segundo hábito tabágico ....................................................................................................43 Tabela 3: Médias geométricas e desvios padrões geométricos dos grupos ......44

LISTA DE ABREVIATURAS OMS: Organização Mundial da Saúde VIGITEL: Vigilância de fatores de risco e proteção para doenças crônicas por inquérito telefônico CO: Monóxido de carbono OR: Odds Ratio IC: Intervalo de confiança COex: Monóxido de carbono exalado DPP: Descolamento prematuro de placenta HPLC: High Performance Liquid Cromatography HPAs: Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos CIUR: Crescimento intrauterino restrito CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência RM: Razão das médias 1-OHP:1- hidroxipireno PUCRS: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

SUMÁRIO

1. REFERENCIAL TEÓRICO ............................ .......................................... .......................11

1.1. Tabagismo ............................... ............................................................................. 11

1.1.1. Tabagismo no Mundo .............. ................................................................... 11

1.1.2. Tabagismo no Brasil ............. ...................................................................... 13

1.1.3. Epidemiologia do Tabagismo na Ges tação.............................................. ...15

1.1.4. Efeitos do Tabagismo na Gestação ........................................................... 17

1.2. Cotinina ................................ ................................................................................ 22

1.3. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos ........................................................ 26

2. JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE........................ .................................................................31

2.1. Justificativa............................ ..................................................................................31

2.2. Hipótese ................................ ............................................................................. ..32

2.2.1.Hipótese Nula....................... .........................................................................32

3. OBJETIVOS ...................................... ............................................................................ 32

3.1. Objetivo Geral .......................... ............................................................................ 32

3.2. Objetivos Específicos ................... ....................................................................... 32

4. METODOLOGIA..................................... ....................................................................... 33

4.1. Delineamento ............................ ........................................................................... 33

4.2. População................................ ............................................................................. 33

4.2.1. Critérios de Inclusão ........ ........................................................................ 33

4.2.2. Critérios de Exclusão......... ...................................................................... 33

4.3. Métodos ................................. ............................................................................... 34

4.3.1. Recrutamento das Gestantes ... ............................................................... 34

4.3.2. Procedimentos Laboratoriais .. ................................................................ 37

4.3.2.1. Extração de cotinina na urina ............................................. .............. 37

4.3.2.2. Extração de cotinina no líquido amniótico ................................. ..... 37

4.3.2.3. Extração de cotinina no sangue do cordão umbilical .................... 38

4.3.2.4. Análise de cotinina .... ........................................................................ 38

4.3.2.5. Extração de 1-hidroxipir eno na urina ...................................... ........ 39

4.3.2.6. Extração de 1-hidroxipir eno no líquido amniótico ......................... 39

4.3.2.7. Análise do 1- hidroxipir eno ............................................... ............... 40

4.3.2.8. Extração de benzopireno no cordão umbilical .............................. . 40

4.3.2.9. Análise do Benzopireno................. ......................................................40

4.4. Análise Estatística................... .............................................................................41

4.5. Aspectos Éticos....................... .............................................................................41

5.RESULTADOS....................................... ............................................................................42

6. DISCUSSÃO.......................................................................................................................45

7. CONCLUSÕES...................................................................................................................50

8. BIBLIOGRAFIA.................................... ..............................................................................51

9. ANEXOS ............................................................................................................................58

Anexo 1: Aprovação do Comitê de Ética em Pesquis a...........................................59

Anexo 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarec ido.........................................60

Anexo 3: Ficha de coleta de dados........ ...................................................................62

Anexo 4: Resposta da Revista PLOS ONE.... ...........................................................63

Anexo 5: Título de melhor trabalho por eixo temáti co de tabagismo do XXXVII

Congresso Brasileiro de Pneumologia e Tisiologia... ................................................64

Anexo 6: Artigo.......................... .................................................................................65

11

1. REFERENCIAL TEÓRICO 1.1. Tabagismo

1.1.1. Tabagismo no mundo

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que um terço da

população mundial adulta seja fumante; dos quais 80% vivem nos países em

desenvolvimento e destes, 27% são mulheres. Cerca de metade dos fumantes

morrem precocemente devido a condições associadas ao tabagismo 1.

O tabagismo é a principal causa evitável de morte no mundo 2-4, mata

cerca de 6 milhões de pessoas por ano, 200 mil no Brasil 1,5. O número

representa uma morte a cada seis segundos 1.

Até 2030, a estimativa da OMS é que 8 milhões de pessoas possam

morrer em consequência do fumo. O tabaco foi classificado como um dos fatores

que mais contribuem para a epidemia de doenças não contagiosas como

cardiopatias, doenças vasculares, câncer e enfisema. O grupo é responsável por

63% de todas as mortes no mundo 1.

A prevalência é maior entre os homens, no entanto, a taxa está

aumentando entre as mulheres, especialmente às jovens, em muitos países.

Esse grupo frequentemente é vítima de exposição passiva, doença e morte 1. A

exposição ao fumo passivo ocorre mais comumente em casa, local de trabalho e

áreas públicas, sendo especialmente perigoso para bebês, crianças, gestantes e

fetos, e é responsável por 600 mil mortes por ano 6.

O tabaco causou 100 milhões de mortes durante o século XX e se a

tendência atual continuar, cerca de um bilhão de pessoas vão morrer durante o

século XXI devido ao uso do tabaco. É o produto tóxico com o maior efeito

12

teratogênico no desenvolvimento humano, além de apresentar impacto negativo

na saúde pública e economia das nações 6.

Exposição à fumaça do cigarro, voluntária ou involuntária, ocorre em

todas as idades e vem de várias fontes, resultando na inalação de produtos

químicos, causando efeitos negativos em praticamente todas as fases da vida,

inclusive no desenvolvimento e sobrevivência do recém-nascido 7. As principais

causas de morte no mundo tem o tabagismo como um dos fatores de risco

(Figura1).

Figura 1: Principais causas de morte no mundo

O consumo de tabaco é responsável pela morte de cerca de 1 em cada

10 adultos no mundo inteiro. Nos países de alta renda, sete em cada 10 mortes

são de pessoas com 70 anos ou mais. Predominam mortes por doenças

cardiovasculares, câncer, doença pulmonar obstrutiva crônica ou diabete.

13

Infecções respiratórias inferiores permanecem a única causa infecciosa líder de

morte. Apenas 1 em cada 100 mortes é de criança com menos de 15 anos 8. Em

países de baixa renda, quase 4 em cada 10 mortes são de crianças menores de

15 anos e apenas 2 em cada 10 mortes são de pessoas com 70 anos ou mais.

Predominam as mortes por doenças infecciosas: infecções respiratórias

inferiores, síndrome da imunodeficiência adquirida, doenças diarreicas, malária e

tuberculose; sendo coletivamente responsáveis por quase um terço de todas as

mortes nesses países. Complicações no parto, prematuridade, asfixia e trauma

estão entre as principais causas de morte 8.

Enfim, 8 das 10 principais causas de morte no mundo tem o tabagismo

como um dos fatores de risco para o desenvolvimento da doença 8.

1.1.2. Tabagismo no Brasil

De acordo com o levantamento anual da vigilância de fatores de risco e

proteção para doenças crônicas por inquérito telefônico (VIGITEL- 2012), que

traça perfil de hábitos que influenciam a saúde do brasileiro, a parcela da

população acima de 18 anos que fuma caiu 20% nos últimos seis anos. A

pesquisa aponta que 12% da população brasileira fuma, enquanto que em 2006

o índice era de 15%. Apesar da queda, a frequência maior permanece entre os

homens: o número passou de 19% (2006) para 15% (2012). Entre as mulheres

caiu de 12% (2006) para 9% (2012) 9.

Além disso, ocorreu redução na frequência de fumantes passivos, no

domicílio e local de trabalho, de 12% para 10%. Continua em queda a frequência

de homens que fumam 20 ou mais cigarros por dia, 6% para 5%. Em relação ao

número de adultos fumantes por cidade, o levantamento mostra que a capital

14

com a maior concentração é Porto Alegre (RS) com 18%, que também detém a

maior proporção de pessoas que fumam 20 cigarros ou mais por dia (7%). Já a

capital com o menor índice é Salvador (BA), onde 6% da população adulta diz

ser fumante 9. A pesquisa mostrou também que o hábito de fumar é maior entre

pessoas com até oito anos de escolaridade (16%), quase o dobro da frequência

observada entre as pessoas mais escolarizadas (12 anos ou mais), que atinge

9% 9.

No Brasil, as doenças crônicas não transmissíveis foram responsáveis por

72,4% do total de mortes em 2012, com destaque para doenças do aparelho

circulatório, neoplasias e diabete 9. De acordo com a OMS, um pequeno

conjunto de fatores de risco responde pela grande maioria das mortes por

câncer, doenças pulmonares e doenças cardiovasculares. Ainda hoje, o uso do

tabaco continua sendo líder global entre as causas de mortes evitáveis 10.

Apesar de estar ocorrendo um decréscimo no tabagismo, existe uma

tendência proporcional de crescimento do tabagismo feminino em relação ao

masculino ao longo das últimas décadas. Isso aponta para um quadro

extremamente complexo, em que problemas emergentes se articulam aos

anteriores e em que questões de saúde reprodutiva se associam às não

reprodutivas. O uso do tabaco potencializa os riscos, por exemplo, das

associações entre doenças cardiocerebrovasculares e a contracepção hormonal

e em várias doenças relacionadas à gravidez e ao parto. As tendências

epidemiológicas do tabagismo apontam para um problema que, dentro de

poucos anos, será majoritariamente feminino 10.

15

1.1.3. Epidemiologia do tabagismo na Gestação

O tabagismo antes e durante a gestação é a principal causa evitável de

doença e morte entre gestantes e crianças. As mulheres que param de fumar

antes de engravidar ou logo que sabem estar grávidas diminuem

significativamente os riscos dos efeitos danosos do fumo 11.

Estima-se que se todas as mulheres nos Estados Unidos parassem de

fumar haveria redução de 11% nos natimortos e 5% nas mortes neonatais.

Fumar ainda é frequente durante a gravidez, particularmente impactando

gestações em mulheres mais jovens e menos instruídas 11. É maior a

prevalência de tabagismo entre as mulheres que vivem abaixo da linha da

pobreza 12.

A literatura mundial mostra que a prevalência do tabagismo na gestação,

embora venha diminuindo nas últimas décadas, ainda é alta, variando entre 12%

e quase 40%. Em uma coorte realizada na cidade de Pelotas, RS, foi detectada

prevalência de 35,6% de fumo na gestação em 1982 e posterior redução para

25,1% em 2004 13. Outros estudos 14-16 mostram prevalência em torno de 23 a

25%. Estudo realizado em Porto Alegre, incluindo 718 puérperas, encontrou um

percentual de 23% de fumantes ativas 17.

Estudo realizado em 2002, na Cantabria (Espanha), revelou um

decréscimo importante dessas cifras em apenas 4 anos, em que as taxas caíram

de 53.6% (em 1998) para 39.4% (em 2002), permanecendo, entretanto, como

uma das mais altas da União Européia 18. Nos Estados Unidos também houve

uma queda na prevalência do tabagismo na gestação, caindo de 20%, em 1989

para 12% em 2000 19.

16

Na Inglaterra 38% das gestantes, convivem em casa, com no mínimo um

fumante, sofrendo ela e o feto, os efeitos do tabagismo passivo 20. Somente um

pequeno número das gestantes recebe ajuda para parar de fumar durante a

gestação, pois os profissionais tem medo de que a abordagem desse tema

interfira na relação médico-paciente 20. As gestantes que foram orientadas a

parar de fumar obtiveram taxas de cessação efetivamente maiores (38%) do que

aquelas que foram orientadas apenas a diminuir o número de cigarros (8%). A

recomendação, portanto, é que sempre se oriente as gestantes a parar com o

tabagismo e não apenas a reduzir o número de cigarros 20.

Estudo recente avaliou a prevalência do uso de tabaco na gestação em

países de média e baixa renda. A prevalência global do uso foi de 2,6% (IC 95%;

1,8 - 3,6); a menor prevalência foi na região Africana (2,0%; 1,2 - 2,9) e a maior

foi na região do Sudeste Asiático (5,1%; 1,3 - 10,9) 21.

São fatores de risco para o uso de tabaco na gravidez: pessoas de pele

branca, baixo nível socioeconômico, baixa escolaridade e não ser casada.

Gestantes que fumam após a 20ª semana de gravidez costumam apresentar

maior consumo de álcool do que as que pararam de fumar. Ainda, a condição de

sobrepeso pré-gravídico também foi relacionada com a continuidade do

tabagismo 16.

Aproximadamente 10,7% das mulheres relatam fumar durante os últimos

três meses de gravidez. Das mulheres que fumavam três meses antes da

gravidez, 54% pararam durante a gestação. Entre as mulheres que param de

fumar, 44% tem recaída dentro de 6 meses após o parto 22.

Um dos grandes problemas enfrentados ao estudar a prevalência do

tabagismo na gestação, refere-se ao fato da informação obtida pelos

17

pesquisadores ser fornecida pela própria gestante. Sabe-se que muitas se

sentem constrangidas diante da forte pressão social e omitem dados a respeito

do tabagismo. Assim, algumas vezes é necessário validar as informações

recebidas para assegurar a qualidade científica dos estudos 23.

1.1.4. Efeitos do Tabagismo na gestação

Os efeitos mais estudados do tabagismo na gestação estão relacionados

à nicotina e ao monóxido de carbono. Ambos atravessam rapidamente a

placenta, e com a exposição crônica, os níveis dessas substâncias no

compartimento fetal, podem exceder os do compartimento materno 7.

A nicotina é claramente neuroteratogênica, impactando o cérebro em

estágios críticos do desenvolvimento 24. Desse modo, é a mais provável causa

de problemas cognitivos, emocionais e comportamentais observados em filhos

de fumantes. Além disso, a exposição à fumaça do cigarro ao longo do

desenvolvimento pré-natal e ou pós-natal aumenta a probabilidade de

comportamento de dependência a drogas lícitas e ilícitas na adolescência ou

idade adulta 25.

O desenvolvimento de outros órgãos, incluindo o pulmão 26,27, também é

prejudicado pela nicotina nessa fase da vida. O uso de tabaco, durante a

gestação, confere aos descendentes, não apenas desta gravidez e sim por

várias gerações, frequências aumentadas de inúmeras doenças, em

demonstração clara dos fenômenos epigenéticos. Grávidas fumantes tem maior

possibilidade de terem filhos e netos com asma, mesmo que não sejam

asmáticas e que as mães de gestações posteriores não permaneçam fumando

28-30.

18

O monóxido de carbono (CO), presente na fumaça do cigarro, é

rapidamente absorvido e liga-se à hemoglobina, formando carboxihemoglobina

no sangue materno e fetal. Relatos de casos de intoxicação aguda grave por

monóxido de carbono em gestantes incluem morte fetal e malformações. A

formação de carboxihemoglobina resulta em hipóxia fetal, que se for

suficientemente grave, é teratogênica ao feto 31. A exposição ao CO tem sido

consistentemente associada à diminuição do peso ao nascer e ao parto

prematuro em estudos de exposição à poluição do ar ambiente durante a

gravidez 32-38.

O tabagismo tem sido associado também ao aumento de risco de aborto

espontâneo. Em um estudo caso-controle de base populacional na Suécia,

mulheres foram classificadas pela concentração de cotinina no plasma quanto à

exposição tabágica. O risco de aborto espontâneo foi maior nos grupos de

exposição passiva (OR 1,67 [IC 95% 1,17-2,38]) e fumantes (OR 2,11 [IC 95%

1,36-3,27]) 39.

O tabagismo materno também altera o fluxo de sangue na placenta e

provoca alterações do equilíbrio entre proliferação e diferenciação do

citotrofoblasto. Em relação ao fluxo, estudo encontrou um padrão de perfusão

materno-fetal com características de hipóxia crônica nas fumantes. Foi realizada

a quantificação objetiva do tabagismo em gestantes através das dosagens de

cotinina urinária e monóxido de carbono exalado (COex) e avaliada a relação

com os índices de resistência das artérias uterinas, umbilical e cerebral média

fetal pelo estudo ecográfico dopplervelocimétrico. Ao estratificar as pacientes

conforme a carga tabágica, dosada através do COex, observou-se aumento da

resistência associado à elevação dos níveis de COex nas medidas das artérias

19

uterinas e umbilical e diminuição na resistência da artéria cerebral média, todos

estatisticamente significativos. Quando foi avaliado em relação aos níveis de

cotinina urinária, também detectou aumento dos índices de resistência vascular

da artéria uterina esquerda e umbilical associado com os valores da cotinina,

estatisticamente significativo. A artéria uterina direita mostrou tendência ao

aumento da resistividade, porém não significativo. A artéria cerebral média

evidenciou tendência de diminuição da resistência com o aumento da carga

tabágica, não significativo 40.

Em relação ao citotrofoblasto, alterações no gene e na expressão das

suas proteínas, incluindo aqueles que orientam respostas celulares e a tensão

de oxigênio, já foram relacionadas ao tabagismo. Observa-se também o

espessamento da membrana basal trofoblástica, aumento de colágeno nas

vilosidades e diminuição da vascularização da placenta 41.

Outra complicação relacionada ao tabagismo na gestação é o

descolamento prematuro da placenta (DPP) que ocorre em cerca de 1% das

gestações e a recorrência é de 20 a 30 vezes maior em fumantes. Uma revisão

sistemática e meta-análise sobre descolamento prematuro da placenta em

relação ao tabagismo materno incluiu 13 estudos com um total de 1.358.083

gestações 42. A incidência global de DPP foi de 0,64% e o tabagismo materno foi

associado com um aumento no risco de 90% (OR 1,9 [IC 95% 1,8-2,0]).

Tabagismo materno tem sido associado também com placenta prévia 43.

Um estudo populacional em Taiwan também encontrou associação de placenta

prévia (OR de 3,3 [IC 95% 1,2-9,1]) com o fumo 44. Maior incidência de parto

pré-termo em tabagistas também tem sido observada 45-47, particularmente em

multíparas 48.

20

Em 1957, Simpson reconheceu que o tabagismo materno provoca menor

peso ao nascer 49. Estes resultados têm sido amplamente replicados e hoje se

sabe que o tabagismo ativo 50,51 ou passivo 52,53 causa diminuição do peso ao

nascer. Kramer 54 estimou redução do peso ao nascer de 5% para cada maço

de cigarros fumados por dia, durante a gravidez. Meyer e Comstock 55

estimaram decréscimo de peso de 150 - 300 g em prole de mães fumantes.

Estudos que avaliaram somente a exposição à fumaça do tabaco durante a

gravidez estimaram diminuição de 35-90 g de peso ao nascer nos filhos de mães

expostas 53,56-58.

Os efeitos da fumaça do tabaco sobre o peso ao nascer 7 são

principalmente devido à restrição do crescimento fetal 54 e apresentam uma

relação dose-resposta clara 50. Os mecanismos subjacentes aos efeitos do

tabaco sobre o crescimento fetal não são totalmente compreendidos e

provavelmente devem ser multifatoriais. Fetos de fumantes tendem a ter

hemoglobina e hematócrito elevados 59 e respostas nitidamente relacionadas à

hipóxia. Outro aspecto importante é o aumento da mortalidade intraútero e

neonatal relacionada ao tabagismo materno 60.

O tabagismo materno também pode ser teratogênico, afetando as

estruturas em desenvolvimento. No entanto, a suscetibilidade exibida pode estar

ligada à genótipos específicos do sistema de metabolização e à genes

específicos do desenvolvimento 61.

Para analisar o potencial efeito genotóxico do tabagismo materno durante

a gravidez, de la Chica et al. 62 analisaram a instabilidade cromossômica em

células de líquido amniótico coletadas de fumantes e não-fumantes durante

amniocentese. Tabagismo materno de 10 ou mais cigarros por dia, durante pelo

21

menos 10 anos e durante a gravidez, foi associado com aumento da

instabilidade cromossômica. A banda 11q23, implicada em doenças malignas

hematopoiéticas, pareceu ser particularmente sensível. Zalacain et al. 63

relataram significativa elevação no número de micronúcleos (marcador de dano

cromossômico) no sangue do cordão umbilical de recém-nascidos de mães

fumantes em comparação com não fumantes.

O cigarro contém numerosos agentes cancerígenos que podem

atravessar a placenta. Sasco e Vainio 64 revisaram a literatura sobre a

associação entre a exposição pré-natal à fumaça do tabaco e aumento do risco

de câncer infantil. Foram incluídos 50 estudos de base populacional de vários

países, bem como 50 estudos adicionais sobre os mecanismos e metabolismos,

sem encontrar nenhuma associação forte e consistente entre fumar durante a

gravidez ou exposição ao fumo passivo e câncer na infância. No entanto, estudo

de revisão encontrou aumento do risco relativo de alguns tipos de câncer na

infância, incluindo tumores cerebrais, leucemia e linfoma 7. Em um estudo

prospectivo de 1,4 milhões de nascimentos na Suécia, Brooks et al. 65

encontraram risco aumentado de tumores cerebrais benignos e malignos.

Relação entre tabagismo materno, sobrepeso e obesidade infantil tem

sido também consistentemente relatada na literatura, incluindo aumento do

índice de massa corporal 7. Mulheres que fumam no início da gestação

apresentam maior frequência de diabete gestacional e obesidade nas suas filhas

66. Morley et al. 67 acharam associação entre tabagismo materno e o aumento da

pressão arterial nos filhos.

O tabagismo passivo durante a gravidez também está relacionado com

restrição de crescimento intrauterino 68, aborto 69, ruptura prematura de

22

membranas, descolamento prematuro da placenta e baixo peso ao nascer 70,71.

As pessoas podem estar expostas à fumaça do cigarro em vários lugares tais

como casa, trabalho ou áreas públicas 72. Mais de 95% das esposas dos

fumantes são expostas à fumaça do cigarro durante a gestação 73.

Enfim, o tabagismo tem sido associado a inúmeras alterações, impactando

em várias fases do desenvolvimento, e esses efeitos não se restringem ao

período gestacional e neonatal, seguem ao longo da vida e podem ser

transmitidos às gerações seguintes por efeitos epigenéticos 24,25,28-30,66,67.

1.2. Cotinina

A cotinina é o principal metabólito da nicotina 74-76. Apresenta meia-vida

mais longa do que a mesma 74,77; uma característica que a faz ser amplamente

utilizada como marcador biológico para medir a exposição ao tabaco 78-80.

A dosagem de cotinina é considerada o padrão-ouro para avaliar status

tabágico, devido à capacidade de detectar baixo consumo ou mesmo uso

esporádico de tabaco 81, mas tem como desvantagem: alto custo, necessidade

de equipamento e equipe treinada. Sua meia-vida prolonga-se por 36 a 40

horas, em média e, mesmo sendo coletada até dois dias após o último cigarro

fumado, pode-se recuperar até 90% 82. Tanto em fumantes passivos quanto em

ativos, seus níveis de concentração são lineares com a quantidade de tabaco

inalada direta ou indiretamente 81.

Esse método é útil para validação das informações prestadas pelo

fumante. Porém, é preciso atentar para as variações individuais em relação à

nicotina consumida, pois existem diferentes taxas de metabolização de nicotina

23

e de conversão em cotinina, podendo variar de 55% a 92%. Mesmo assim, a

aferição da cotinina reflete com acurácia o grau de exposição tabágica 82.

Uma vez absorvida a nicotina pelo trato respiratório, mucosa oral, trato

gastrointestinal e até pela derme, a distribuição ocorre de forma livre para todo o

organismo 83. Assim, a cotinina aparece em todos os fluidos biológicos de

indivíduos expostos em poucos minutos por biotransformação da nicotina no

fígado. Por sua vez, a cotinina é oxidada e o produto final é eliminado na urina

durante cerca de 2 a 3 dias 83. A quantificação materna pode ser realizada na

urina 84, plasma 85, cabelo 86 e saliva 87. Como a informação da gestante pode

não ser verdadeira, a sua mensuração ajuda a avaliar a exposição, e até

mesmo, confirmar o status tabágico 88.

Os valores de referência para cotinina encontrados na literatura são muito

variáveis. Os níveis usados como ponto de corte para a cotinina salivar são de

15 µg/L, enquanto que para a urinária são de 50 µg/L 89. A Society of Research

in Nicotine and Tobacco 90, em 2001, definiu os melhores pontos de corte da

cotinina plasmática, concluindo que valores acima de 14 µg/L indicam tabagismo

ativo, porém tais níveis tendem a subestimar o número de fumantes reais em

inquéritos populacionais. Diante disso, sugerem baixar o ponto de corte para até

3,0 µg/L, sendo que a sensibilidade e a especificidade passam a ser de 96% e

97%, respectivamente.

Assim como os outros marcadores, a dosagem da cotinina também possui

limitações. O uso concomitante de certas medicações pode elevar seus valores,

como as várias formas de reposição nicotínica e isoniazida 90. Além disso,

existem alimentos que possuem nicotina como o tomate, batata, couve-flor e chá

preto, que mesmo apresentando pequenas quantidades da substância, podem

24

interferir na análise do biomarcador. Entretanto, a quantidade consumida em

uma dieta normal não ultrapassa 10% da nicotina consumida por fumantes,

resultando em um adicional de 0,7 µg/L de cotinina na urina, não causando

impacto que comprometa a interpretação do resultado 82.

Os métodos de detecção nos fluídos biológicos são colorimétricos,

imunológicos ou cromatográficos. O mais utilizado é o HPLC (high performance

liquid cromatography) ou cromatografia líquida de alta eficiência. Essa é a

técnica de eleição por apresentar alta sensibilidade e especificidade para a

análise da cotinina 91.

A dosagem da cotinina é também considerada o melhor preditor para

analisar o status tabágico, mesmo durante a gestação 92. Gestantes

metabolizam a cotinina mais rapidamente que as não gestantes, devendo então

ser considerado que sua meia-vida fica reduzida 90. Há diferenças no seu

metabolismo também entre diferentes etnias, sendo que em afro-americanos e

chineses a metabolização se dá de forma mais lenta 93.

A presença de nicotina e seus metabólitos já foram avaliadas também no

líquido amniótico. Teoricamente, altas concentrações dessas substâncias

poderiam se acumular no líquido amniótico, devido a capacidade de difusão

através das membranas amniocoriônicas, adicionalmente à quantidade de

nicotina que entra através da placenta. Após a passagem para o líquido

amniótico, essas substâncias seguem circulando pelo processo de deglutição do

feto e eliminação na urina fetal. O baixo pH, também propicia o acúmulo de

substâncias como as estudadas 94.

Em comprovação a este raciocínio, Jordanov et al. 86 observaram que a

concentração de cotinina no líquido amniótico ao nascimento pode ser 2 vezes

25

maior que na urina materna. Köhler et al. 94 detectaram nicotina no líquido

amniótico de todas fumantes, porém não nas tabagistas passivas.

Também já foi quantificada cotinina no sangue do cordão umbilical, sendo

que os níveis encontrados foram relacionados com tabagismo ativo, tabagismo

passivo e com os efeitos do tabagismo no peso ao nascer, parecendo ser um

bom marcador 76.

Enfim, sabe-se que a cotinina pode ser utilizada como marcador de

exposição ao tabaco em gestantes, na urina e sangue materno, mecônio do

recém-nascido, líquido amniótico, urina fetal ou sangue do cordão umbilical 95.

Figura 2: Detecção de cotinina em gestantes e fetos.

NICOTINA

COTININA

Meia vida 36-40 horas

Detectada na urina, cabelo, saliva, sangue, líquido

amniótico, mecônio e sangue do cordão umbilical

26

1.3. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são uma classe de

compostos orgânicos que contém dois ou mais anéis aromáticos condensados,

constituídos de átomos de carbono e hidrogênio. À temperatura ambiente, os

HPAs são sólidos e as características gerais comuns a essa classe de

compostos são o alto ponto de fusão e de ebulição, a baixa pressão de vapor e a

pouca solubilidade em água, a qual tende a diminuir com o aumento da massa

molecular. Os HPAs são solúveis em muitos solventes orgânicos, altamente

lipofílicos 96. São poluentes do ar gerados pela combustão de motor dos veículos

e de fábricas, também são encontrados em algumas comidas, principalmente as

defumadas, e pela combustão de folhas de tabaco, através do tabagismo 97.

A maioria dos compostos HPA são metabolizados e excretados na urina,

com meia vida de 18 horas 98,99, podendo ser todos utilizados como

biomarcadores de exposição recente aos HPAs 100. Desde 1985, o 1-

hidroxipireno, metabólito principal dos pirenos, tem sido usado como

biomarcador dos HPAs 101. Llop et al. 102 mostraram que o 1-hidroxipireno é um

bom marcador para avaliar a exposição ao cigarro, além da exposição recente a

poluição aérea.

Quando a dosagem é realizada no sangue, o biomarcador utilizado

geralmente é o benzopireno. Está bem estabelecido que a exposição ambiental

ao benzopireno causa múltiplos efeitos deletérios, dependendo da dose e do

tempo de exposição 103. O benzopireno é rapidamente metabolizado pela

placenta e acumulado no tecido fetal durante a gestação em ratos 104. Perturba

os padrões de metilação do DNA em sistemas experimentais 105,106, o que está

associado à instabilidade do genoma e ao risco de câncer subsequente 107,108.

27

Após a exposição, HPAs são metabolizados para formar produtos

fenólicos e epóxidos reativos, que tem a capacidade de se ligar ao DNA,

formando o complexo HPA-DNA adducts 109. O HPA-DNA adducts aumenta a

probabilidade de mutações genéticas e por isso é associado com várias formas

de câncer 110. Como hipótese, a via cancerígena para os HPAs, ou seus

metabólitos, envolve a produção de espécies reativas de oxigênio, que gera

stress oxidativo e pode levar à peroxidação de lípidios, modificação de proteínas

e dano ao DNA 111.

Figura 3: Mecanismos de mutagênese dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

Nos seres humanos, a exposição materna a determinados HPAs

cancerígenos durante a gravidez pode provocar danos ao DNA, modificação de

histona e anomalias cromossômicas fetais 112 em uma faixa de exposição

ambiental relevante. DNA-adducts foram detectados no DNA do sangue do

28

cordão umbilical fetal humano, bem como no sangue materno, após a exposição

aos HPAs em ar ambiente 113. A quantificação da exposição pré-natal aos HPAs,

realizada por monitoramento de ar, prediz significativo aumento de aberrações

cromossômicas em sangue do cordão umbilical, guardando relação dose-

resposta 114. Assim, exposição pré-natal a HPAs pode aumentar o risco de

câncer também em seres humanos 114.

Os HPAs atravessam a placenta, e o feto por estar em desenvolvimento é

até 10 vezes mais sensível do que a mãe para sofrer danos no DNA 113. O

desenvolvimento embrionário precoce é um período particularmente sensível

para a desregulação epigenética como consequência de exposições ambientais,

porque as taxas de síntese de DNA são altas e os padrões de metilação do DNA

estão sendo estabelecidos 115.

Perera et al. 113 propuseram que a transferência transplacentária de HPA

para o feto poderia ter impacto significativo sobre o desenvolvimento fetal. Essa

afirmação foi feita com base em uma série de estudos que encontraram redução

na circunferência craniana no nascimento correlacionada com um quociente de

inteligência menor, além de pobre funcionamento cognitivo e desempenho

escolar na infância 116,117. Além disso, encontrou-se associação com restrição do

crescimento intra-uterino 118, pequeno para a idade gestacional 119, e parto

prematuro119. Quando o grupo de recém-nascidos monitorados no pré-natal foi

seguido na idade escolar, observou-se prejuízo no desenvolvimento neurológico

112 e aumento na probabilidade de sintomas relacionados à asma 120.

Jules et al. 103 sugerem que a exposição intraútero ao benzopireno

predispõe os recém-nascidos a déficits funcionais no desenvolvimento

cardiovascular , o que pode contribuir para disfunção cardíaca ao longo da vida.

29

Rundle et al. 121 sugerem que exposição pré-natal a HPAs causa aumento

de ganho de massa gorda durante a infância e aumenta risco de obesidade.

Langlois et al. 122 mostraram associação entre a exposição materna ocupacional

a HPAs e aumento de risco de lábio leporino com ou sem fenda palatina.

Estudo recente apoia as outras descobertas de que a exposição

transplacentária ao benzopireno através da inalação materna produz danos ao

DNA no feto em desenvolvimento. Ele também confirma que aumentou a

suscetibilidade fetal à exposição pré-natal HPAs, devido ao DNA adducts

representar um pró-carcinógeno na alteração do DNA 123. Isso deveria ser visto

como uma questão de saúde pública, pois está relacionado essecialmente à

exposição em áreas altamente poluídas.

Topinka et al. 124 mostraram resultados que sugerem um efeito protetor

significativo da barreira placentária contra o efeito genotóxico de alguns

componentes do tabaco, entre a circulação materna e fetal,

sob exposição mais intensa, representada por tabagismo ativo ou passivo.

Em indivíduos expostos à poluição ambiental, sem significativa

contribuição do fumo, o efeito protetor da placenta não foi observado.

Outros estudos confirmaram essa hipótese de que a exposição aos HPAs

durante a gravidez pode aumentar o estresse oxidativo, o que influenciaria os

resultados do parto e a saúde da criança posteriormente 111,112,125,126. Karttunen

et al. 127 confirmaram que a exposição materna ao benzopireno pode conduzir a

sua transferência para o feto, bem como a ligação de seu metabólito ao DNA da

placenta.

Rappolee et al. 128 mostraram que benzopireno pode perturbar a

diferenciação em células-tronco trofoblásticas placentárias, o que é importante

30

para produzir os primeiros hormônios placentários que surgem na implantação

do concepto. Stejskalova e Pavek 129 confirmaram que o HPA-DNA aduccts na

placenta também levaram à complicações na gravidez, tais como parto

prematuro, restrição do crescimento intra-uterino (CIUR), anormalidades

estruturais, morte fetal, descolamento de placenta, risco de baixo peso ao

nascer, baixo comprimento ao nascimento e diminuição da circunferência

craniana.

Devido a essas alterações decorrentes da exposição aos HPAs, a rápida

urbanização, o aumento do número de fábricas, a extensa rede de auto-estradas

e a disponibilidade de carros e outros meios de transporte, que ocorrem no

mundo, ocasionando o aumento na emissão de poluentes tem preocupado os

pesquisadores 130. Apesar desses outros fatores de exposição aos HPAs, o

tabagismo é o fator mais importante de exposição na população em geral, e

principalmente, na nossa população.

Estudo achou valores com diferença estatística significativa nos níveis de

1-hidroxipireno urinário entre tabagistas e não tabagistas 131. Numa análise

multivariada feita por Kawamoto et al. 132, o cigarro foi a variável que mais

influenciou os níveis de 1-hidroxipireno, seguido pela dieta rica em carne e

peixes. Merlo et al. 133 não achou associação entre dieta e excreção de 1-

hidroxipireno na urina. Estudo realizado na Espanha mostrou que as pacientes

que fumam tendem a ter também uma dieta rica em HPAs 134.

Tabagistas excretam significativamente doses maiores de 1-hidroxipireno

na urina que não tabagistas e esses valores correlacionam-se muito bem com o

número de cigarros fumados 135. Apenas poucos estudos investigaram HPAs em

mulheres grávidas e sua relação com os resultados do parto 136 ou fatores de

31

estilo de vida 102,135, a maioria foca na exposição ambiental. Sendo o cigarro o

principal fator de exposição, esse também deve ser estudado.

2. JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE

2.1. Justificativa

O tabagismo na gestação expõe o feto à fumaça do cigarro, que contém

milhares de constituintes químicos e aditivos, incluindo metais pesados tóxicos e

agentes cancerígenos conhecidos, dentre eles os HPAs. Esses produtos

reconhecidamente têm papel de toxicidade no desenvolvimento fetal, e os

efeitos, provavelmente, seguem ao longo da vida e necessitam ainda ser melhor

elucidados [6].

Há uma preocupação crescente em relação à exposição das pessoas e

gestantes aos HPAs via poluição ambiental 117,121-123, porém o fator que mais

expõe o ser humano aos HPAs é o tabagismo.

Em gestantes, o metabolismo de muitas substâncias é diferente, além de

ser difícil avaliar a interferência de fatores alimentares e exposição ambiental.

Assim, é interessante comparar em uma mesma população, com dieta similar, e

mesmo ambiente de poluição, para isolar a verdadeira exposição dos fetos aos

produtos químicos decorrentes do tabagismo, tanto ativo quanto passivo,

diminuindo os possíveis fatores confundidores.

Como a embriogênese é um período crítico para o desenvolvimento do

feto, e sabe-se que exposição nesta fase pode ter efeitos ao longo da vida e em

futuras gerações através da epigenética, pretende-se quantificar a exposição

fetal a substâncias tóxicas, como os HPAs e nicotina, através de seus

32

marcadores (1-hidroxipireno, benzopireno e cotinina) dosados no líquido

amniótico e no sangue do cordão umbilical.

2.2. Hipótese

Substâncias tóxicas da fumaça do cigarro inaladas pelas gestantes

tabagistas, dosadas através da cotinina e os HPAs, passam para o feto através

do líquido amniótico e do sangue do cordão umbilical.

2.2.1. Hipótese Nula (H0)

Substâncias tóxicas da fumaça do cigarro inaladas pelas gestantes

tabagistas não passam para o feto através do líquido amniótico e do sangue do

cordão umbilical.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Estudar se a exposição materna a substâncias tóxicas do cigarro,

dosadas através da cotinina, 1-hidroxipireno e benzopireno são transmitidas ao

feto.

3.2. Objetivos Específicos

- Quantificar o 1-hidroxipireno e cotinina no líquido amniótico,

- Quantificar a cotinina e benzopireno no sangue do cordão umbilical

- Quantificar o 1-hidroxipireno e cotinina na urina materna

33

4. METODOLOGIA

4.1. Delineamento

Estudo transversal controlado.

4.2. População

Foram recrutadas, após assinatura de termo de consentimento, gestantes

que internaram em trabalho de parto no Centro Obstétrico do Hospital São Lucas

da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), entre julho

de 2010 e julho de 2013, com idade entre 18 e 35 anos, sem doenças prévias ou

gestacionais concomitantes.

4.2.1. Critérios de inclusão

- TABAGISTAS:

Gestantes tabagistas por pelo menos 5 anos (mais de 100 cigarros na

vida e fumando na atualidade).

- TABAGISTAS PASSIVAS:

Gestantes não tabagistas (não fumam desde o período pré-concepcional

de 6 meses) que resida com um tabagista que fume dentro do domicílio.

- CONTROLE:

Gestantes não tabagistas (nunca fumantes).

4.2.2. Critérios de exclusão

Pacientes que não quiseram participar do estudo, história de psicopatias,

analfabetas, trabalho de parto prematuro (antes das 37 semanas), ruprema,

infecções e adição a outras drogas.

34

4.3. Métodos

4.3.1. Recrutamento das Gestantes

As gestantes foram recrutadas no momento da internação no Centro

Obstétrico do Hospital São Lucas da PUCRS em trabalho de parto. Após

aceitarem participar do estudo, responderam a um questionário em relação a

dados demográficos, hábitos e tabagismo. No momento da internação, foi

coletada urina materna. No momento da ruptura das membranas, foi coletado

líquido amniótico e no parto, sangue do cordão umbilical.

A coleta da urina foi realizada em frasco específico para coleta de exame

qualitativo de urina, estéril e armazenado em 2 frascos (1 para análise da

cotinina e outro para a análise do 1-hidroxipireno) em freezer a temperatura de -

200 C. Os frascos eram identificados somente com o nome do material e o

número da paciente.

A coleta de líquido amniótico foi feita conforme a evolução da paciente,

quando a ruptura das membranas era espontânea, conforme evolução do

trabalho de parto, a coleta era realizada através de espéculo vaginal e seringa

na saída do colo uterino e fundo vaginal. Quando a ruptura era realizada pelos

médicos, o material era coletado em cuba rim estéril e a ruptura realizada com

amniótomo. Após a coleta, o material era armazenado em 2 frascos (1 para

análise da cotinina e outro para a análise do 1-hidroxipireno) em freezer a

temperatura de -200 C. Os frascos eram identificados somente com o nome do

material e o número da paciente.

A coleta de sangue do cordão umbilical foi realizada após o nascimento,

logo após o clampeamento do cordão e dequitação da placenta, sendo coletado

por aspiração manual, agulha 18G (1,20 x 40 mm) e seringa de 20 mL.

35

Armazenamento em frasco vacuette com tampa vermelha de coleta de sangue

que contém z serum clot activator, guardado em geladeira a 50 C por 6 horas,

para separação do soro, e coletado com pipeta somente o soro e armazenado

em 2 frascos de Eppendorf em freezer a -200 C, também identificados somente

com o número da paciente (1 para a análise da cotinina e outro para análise do

benzopireno). No processo de validação dos métodos verificamos que a análise

do benzopireno não poderia ser realizada em sangue total, porque o mesmo

coagulava e dificultava a análise.

As gestantes foram subdivididas em 3 grupos conforme a informação por

elas fornecidas em relação ao tabagismo: tabagista, tabagista passiva e grupo

controle.

36

954 EN

Figura 4: Recrutamento das gestantes

954

ENTREVISTADAS

130 RECRUTADAS

824 EXCLUÍDAS

HIPERTENSÃO, PRÉ-ECLÂMPSIA, DIABETE PRÉVIO E

GESTACIONAL, RUPREMA, PREMATURIDADE,

INFECÇÕES, USO DE DROGAS

5 PERDAS

TABAGISTA PASSIVA

25

CONTROLE

63

TABAGISTAS

37

37

4.3.2. Procedimentos laboratoriais

4.3.2.1. Extração de cotinina na urina

A extração foi realizada seguindo o método de Cattaneo e colaboradores

137. Foram pipetados 2,0 mL de urina centrifugada. Posteriormente, foi

adicionado 25 μL de NaOH 10 M, 100 μL de padrão interno (2-fenilimidazol,

1,0μg/mL) e 4,0 mL de diclorometano. A seguir, essa solução foi agitada por 40

minutos em homogeneizador e centrifugada por 10 minutos a 3000 rotações por

minuto. Dois mL da fase orgânica foram transferidos para um frasco evaporador

e colocados em termobloco (Pierce®, modelo 18940), sob corrente de nitrogênio

e temperatura ambiente, até secagem. Posteriormente, o resíduo foi

reconstituído com 200 μL de fase móvel e foram injetados 20 μL no

Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) 137.

4.3.2.2. Extração de cotinina no líquido amniótico

Para a extração de cotinina do líquido amniótico, foram pipetados 1 mL de

líquido amniótico, 25 µL de hidróxido de sódio, 25 µL de padrão interno 2-

fenilimidazol (0,25 µg/mL) e após, foi adicionado 2,0 mL de diclorometano. Essa

solução foi misturada por 40 minutos em um homogeneizador e centrifugada por

15 minutos a 3000 rotações por minuto. A fase aquosa foi extraída novamente

para maior recuperação, onde foram adicionados 2,0 mL de diclorometano e

seguiu-se o mesmo processo de homogeneização e centrifugação. Quatro mL

da fase orgânica foram transferidos para um frasco evaporador e colocados em

um termobloco (Pierce®, modelo 18940) sob corrente de nitrogênio e

temperatura de 37º C, até secura. O extrato foi reconstituído com 200 µL da

fase móvel e foram injetados 20 μL no CLAE 137.

38

4.3.2.3. Extração de cotinina no sangue do cor dão umbilical

Para a análise de cotinina no sangue foi utilizado o método desenvolvido

por Petersen e colaboradores138. O sangue foi centrifugado e separado o soro.

Desta forma, 600 µL de soro foram tratados com 25,0 µL de hidróxido de sódio

10 M e 25,0 µL de 2-fenilimidazol (padrão interno, 5,0 µg/mL).

Subsequentemente, a amostra foi extraída com 5,0 mL de diclorometano. Uma

alíquota de 4 mL da fase orgânica foi separada e seca sob corrente de nitrogênio

a temperatura ambiente. A amostra seca foi reconstituída com 100 µL de fase

móvel e 20 µL foram injetados no CLAE 138.

4.3.2.4. Análise de cotinina

Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Agilent® (Agilent

Technologiess, Santa Clara, CA, USA) equipado com detector de ultravioleta,

bomba isocrática e injetor manual de amostras. A separação cromatográfica foi

realizada utilizando coluna Zorbax® Eclipse XDB-C8 (4,6mm x 150mm x 5μm

Agilent) protegida por uma pré-coluna Zorbax® Eclipse XDB-C8 (4,6 x 12,5 mm,

5 μm Agilent). A fase móvel foi constituída de uma mistura de

Água:Metanol:Acetato de Sódio 0,1M:Acetonitrila (50:15:25:10). Cinco mL de

trietilamina e 7,14 gramas de ácido cítrico foram adicionados para cada litro de

fase móvel e o pH da fase móvel foi ajustado para 4,4 com ácido acético glacial.

Foi mantido um fluxo isocrático de 0,5 mL/min com a detecção por ultravioleta

em 260 nm, produzindo um tempo total de corrida de 10 minutos. Para

determinação dos níveis de cotinina foi utilizado o software ChemStation obtido

também da Agilent®.

39

4.3.2.5. Extração de 1-hidroxipireno na urina

Para avaliação de 1-hidroxipireno na urina, 2,5 mL de urina foram tratados

com 5,0 mL de tampão acetato pH 5,0 e 10 µL da enzima β-glicuronidase-

arilsufatase. Subsequentemente a amostra foi incubada em banho-maria 37ºC

por 2 horas. Após a incubação, a amostra foi submetida a extração em fase

sólida sob pressão com cartuchos de sílica C18, ativados com 2 mL de metanol,

seguido de 5 mL de água ultrapura. A amostra hidrolisada foi aplicada a um fluxo

de aproximadamente 1,5 mL/min. O cartucho foi sequencialmente lavado com 6

mL de metanol 40% e o analito eluído com 2 mL de isopropanol. O solvente foi

evaporado a 37ºC sob corrente de nitrogênio e o resíduo foi reconstituído com

200 μl de metanol, dos quais 50 μl foram injetados no CLAE.

4.3.2.6. Extração de 1-hidroxipireno no líquido amn iótico

Para a extração do 1-hidroxipireno do líquido amniótico, a 2,0 mL de

líquido amniótico foram adicionados 2,0 mL de tampão acetato pH 5,0 e 20 µL

de enzima β-glicuronidase-arilsulfatase. Os tubos foram agitados por 30

segundos e incubados a 37°C por 2 horas para promover a hidrólise dos

produtos conjugados. A seguir, as amostras foram resfriadas a temperatura

ambiente e foram adicionados 4,0 mL de éter etílico. As soluções foram

homogeneizadas por inversão e agitação durante 1 minuto e centrifugadas.

Após, a fase orgânica foi transferida para frasco evaporador e o procedimento de

extração foi repetido para aumentar o rendimento do processo de extração.

Evaporaram-se as amostras sobre corrente de ar comprimido a 37°C, e após

secas, as mesmas foram reconstituídas com 250 µL de metanol e 20 µL foi

injetado no CLAE.

40

4.3.2.7. Análise de 1-hidroxipireno

Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Shimadzu® LC-

Class 10 equipado com detector de fluorescência, bomba isocrática e injetor

manual de amostras. A separação cromatográfica foi realizada utilizando coluna

LiChospher® 100 RP-18 (4,6x150 mm, 5 μm) protegida por pré-coluna

(4,6×12,5 mm, 5 μm RP-18 LiChospher® 100). A fase móvel foi constituída de

uma mistura de Metanol:Acetonitrila:Água (35:35:30). Foi mantido um fluxo de

1,0 mL/min e a detecção foi feita por fluorescência (Excitação=242nm,

Emissão=388nm), produzindo um tempo total de corrida de 30 minutos.

4.3.2.8. Extração de benzopireno no sangue do cordã o umbilical

Na análise do benzopireno no sangue do cordão umbilical, para a

extração utilizou-se 150 ul de soro/sangue, adicionando 850 uL de água e

extraiu-se com 4 mL de ciclohexano, agitou-se em vortex e por

inversão. Após centrifugar por 10 minutos, a 1500 rotações por minuto, retirou-se

a fase superior para outro tubo. Repetiu-se o processo de extração novamente,

retirando a fase superior e juntando com a anterior. A fase orgânica e seca e

o resíduo ressuspendido em 250 ul de fase móvel, filtrou-se e injetou-se no

CLAE.

4.3.2.9. Análise do benzopireno

As condições cromatográficas foram: cromatógrafo Líquido de Alta

Eficiência com detector Fluorescencia, Shimadzu, fase móvel = ACN:H2O

(750:250), coluna RP-18 (4.6x100mm e 5 micron), fluxo: 1ml/min, volume de

injeção: 20μL - Injetor manual, detecção: Excitação=290nm, Emissão=430 nm.

41

4.4. Análise Estatística

Dados quantitativos foram descritos por média e desvio-padrão. Para a

comparação dos grupos as variáveis quantitativas receberam transformação

logarítmica sendo apresentadas como médias geométricas e desvio padrão das

médias geométricas. Para estimar a diferença proporcional das variáveis

assimétricas entre os grupos, utilizou-se a razão das médias (mean ratio) e o

intervalo de confiança (IC) de 95%. A razão das médias representa, em termos

relativos, quantas vezes a média de um grupo é maior do que a de outro. Foi

obtida em um modelo de análise de covariância de erro-padrão robusto aplicado

aos logaritmos das medidas. Para localização das diferenças entre os grupos,

utilizou-se o procedimento de post-hoc de Tukey. O nível de significância

adotado foi de 0,05. Os dados foram analisados com o programa SPSS versão

21.0.

4.5. Aspectos Éticos

Projeto aprovado no Comitê Científico do HSL em Maio de 2010,

aprovado Comitê de Ética em Junho de 2010, número 10/05066. Aprovado em

Abril de 2011 no Comitê Científico da Pós-Graduação.

Os exames realizados não ofereceram riscos às gestantes e nem aos

fetos. Somente foram incluídas aquelas pacientes que, após lerem o Termo de

Consentimento, aceitaram participar da pesquisa, estando cientes de que

poderiam sair do estudo a qualquer momento se assim desejassem.

42

5. RESULTADOS

Foram incluídas 125 gestantes, sendo 63 no grupo controle, 25 tabagistas

passivas e 37 tabagistas. Os grupos não apresentaram diferenças

estatisticamente significativas em termos de idade e aspectos obstétricos (tabela

1).

Na tabela 2 são apresentados os resultados das variáveis cotinina na

urina materna, no sangue de cordão umbilical e no líquido amniótico, seguidos

das medidas 1-hidroxipireno na urina materna e no líquido amniótico, e

benzopireno no sangue do cordão umbilical.

Tabela 1 - Características da população em estudo

Característica

Controle (n= 63)

Tabagista Passiva (n= 25)

Tabagista (n = 37)

P

Idade, anos

26 ± 5 24 ± 6 26 ± 5 0,24

IMC, Kg/m 2

27 ± 5 28 ± 5 28 ± 4 0,49

Gestaç ões

2 ± 1 2 ± 2 2 ± 1 0,17

Idade gestacional, Semanas

38 ± 1 38 ± 1 39 ± 1 0,15

Peso, g

3349 ± 409 3375 ± 433 3225 ± 528 0,33

Apgar 5º minuto

9 ± 0,7 9 ± 0,6 9 ± 1 0,09

Os dados são apresentados como média ± desvio-padrão. IMC: Índice de massa corporal 139 .

43

Tabela 2 – Comparação de variáveis selecionadas entre os grupos segundo hábito tabágico

Desfecho Controle Tabagista Passiva

Tabagista RM (TP/C)

RM (TxC)

P

n=56 Cotinina na urina, 0,64

a

µg/L (ND a 68)

n=25 0,94

a

(ND a 21)

n=35 3,77

b

(ND a 69)

1,48 [0,59-3,72]

5,92 [2,59- 13,55]

44

Tabela 3 – Média geométrica e desvio padrão geométrico dos gru pos

Controles Tabagistas Passivas

Tabagistas

MG DPG MG DPG MG DPG

Cotinina urinária

(µg/L)

0,64 4,33

0,94 4,31

3,77 6,90

Cotinina no líquido amniótico

(µg/L)

1,47 2,56

1,28 2,28

36,87 9,07

Cotinina no cordão umbilical

(µg/L)

3,36 6,34

3,23 6,20

8,79 7,83

1-hidroxipireno na urina materna

(µmol/mol creatinine)

0,02 17,04

0,05 9,44

0,15 9,63

1-hidroxipireno no

líquido amniótico (µg/L)

0,48 1,65

0,51 1,65

0,67 1,39

Benzopireno no cordão

umbilical (µg/L)

0,39 2,71

0,51 2,08

1,13 1,99

Os dados são apresentados por média geométrica (MG) e desvio padrão geométrico (DPG)

Todas as variáveis estudadas apresentaram diferença estatisticamente

significativa entre os grupos controle e tabagista. Não foram observadas

diferenças significativas entre controles e tabagistas passivas.

A concentração de cotinina foi cerca de 6 vezes maior na urina das

gestantes tabagistas, RM: 5,92 [2,59-13,55], p

45

29,69], p=0,003. No líquido amniótico, o grupo tabagista apresentou

concentração 30% maior que o grupo controle, RM: 1,34 [1,05-1,7], p=0,012. A

concentração de benzopireno foi cerca de 3 vezes maior no sangue do cordão

umbilical dos fetos de mães tabagistas RM: 2,9 [1,76-4,79], p

46

exposição à poluição ambiental. Estudo detectou DNA-adducts no sangue do

cordão umbilical fetal humano, bem como no sangue materno, após a exposição

aos HPAs em ar ambiente 113. Os HPAs atravessam a placenta, e o feto por

estar em desenvolvimento é até 10 vezes mais sensível do que a mãe para

sofrer danos no DNA 113. O desenvolvimento embrionário precoce é um período

particularmente sensível para a desregulação epigenética como consequência

de exposições ambientais, porque as taxas de síntese de DNA são altas e os

padrões de metilação do DNA estão sendo estabelecidos 115.

A concentração de cotinina nas gestantes tabagistas foi aproximadamente

6 vezes maior na urina, 25 vezes maior no líquido amniótico e 2,6 vezes maior

no sangue do cordão umbilical em relação ao grupo controle.

A concentração de 1-hidroxipireno nas gestantes tabagistas foi 7 vezes

maior na urina e 30% maior no líquido amniótico quando comparada ao grupo

controle. As concentrações de benzopireno foi 3 vezes maior no sangue do

cordão umbilical dos fetos das gestantes fumantes comparadas ao grupo

controle.

As substâncias encontradas em maior concentração na urina das

gestantes tabagistas (cotinina e HPAs) passam para os fetos através do líquido

amniótico e sangue do cordão umbilical. O processo de formação do líquido

amniótico, em que os fetos urinam e deglutem a própria urina, forma um ciclo

que aumenta a exposição a essas subtâncias. Isto justifica a concentração de

cotinina ser maior no líquido amniótico. A concentração da cotinina ser mais alta

do que a do 1-hidroxipireno no líquido amniótico pode estar relacionada a maior

meia-vida da cotinina (36 horas) em comparação ao 1-hidroxipireno (18 horas),

ou a solubilidade das substâncias nos diferentes fluidos. Não foi encontrada

47

diferença estatística entre as tabagistas passivas e controles. Provavelmente as

tabagistas passivas não inalam uma quantidade suficiente das substâncias

dosadas para transmitir aos fetos.

As gestantes foram classificadas em relação ao status tabágico conforme

o próprio relato, porque muitas delas ficaram longos períodos em abstinência,

devido às horas de pródromo de trabalho de parto. Muitas relataram que já

estavam há dias com contrações e dor, e por isso não estavam conseguindo

fumar. Devido à meia-vida das substâncias, esse período de abstinência poderia

alterar a classificação das gestantes baseada somente nos valores laboratoriais.

No processo da coleta, tivemos 5 perdas, por não termos conseguido

coletar todos os materiais da mesma gestante. No processo de análise

laboratorial, alguns dos materiais armazenados não estavam em quantidade

suficiente ou em condições adequadas para análise, o que justifica o n diferente

conforme as substâncias nos diferentes grupos.

Para a análise estatística, foram calculadas inicialmente as médias

aritméticas e medianas, porém os resultados não foram satisfatórios devido à

intensa assimetria dos dados. Foram calculadas as médias geométricas e razão

das médias geométricas, utilizando ferramentas estatísticas específicas para

dados assimétricos e próximos ao zero. Também foram calculados os intervalos

de confiança das médias geométricas, porém para interpretá-las é necessário

realizar uma transformação logarítmica e posteriormente Gauss (média +/-

desvio padrão).

Nossos resultados confirmam que a nicotina atravessa a placenta. A

nicotina é uma substância que causa danos ao feto, é neuroteratogênica

impactando o cérebro nas fases mais críticas do seu desenvolvimento 24. Isso

48

justifica os problemas emocionais, cognitivos observados nos filhos de mães que

fumaram na gestação. Além disso, a exposição ao cigarro no período pré e pós-

natal aumenta a probabilidade de dependência a drogas lícitas e ilícitas na

adolescência e idade adulta 25. O desenvolvimento dos órgãos, incluindo os

pulmões, pode ser adversamente afetado pela nicotina 26,27.

Também encontramos aumento da exposição fetal aos HPAs, que são

substâncias conhecidamente carcinogênicas. A via da carcinogênese dos HPAs

e seus metabólitos envolve a produção de espécies reativas de oxigênio, que

geram estresse oxidativo, peroxidação lipídica, modificações das proteínas, dano

ao DNA e pode ter influência ao nascimento e ao longo da vida 111,112,125,126.

Perera et al. 113 propuseram que a transferência placentária de HPAs aos

fetos pode ter impactos significativos no desenvolvimento fetal. Vários estudos

evidenciaram redução da circunferência cefálica ao nascimento, menor

quociente de inteligência e pior desempenho na escola na infância 116,117. Além

disso, os HPAs também estão associados à restrição de crescimento

intrauterino118, trabalho de parto prematuro 119 e aumento na probabilidade de vir

a desenvolver asma 120.

Jules et al. 103, através de estudo realizado em ratos, sugerem que a

exposição intraútero ao benzopireno predispõe os recém-nascidos a déficits

funcionais no desenvolvimento cardiovascular, o que pode contribuir para

disfunção cardíaca ao longo da vida. Rundle et al. 121 sugerem que exposição

pré-natal a HPAs causa aumento de ganho de massa gorda durante a infância e

aumenta risco de obesidade. Langlois et al. 122 mostraram associação entre a

exposição materna ocupacional a HPA e aumento de risco de lábio leporino com

ou sem fenda palatina.

49

Os efeitos dos HPAs nos fetos têm sido amplamente estudados, conforme

mencionado acima. Entretanto, a maioria dos estudos foca na exposição

ambiental 111-114.

O que este estudo acrescenta é que estudamos a exposição fetal aos

HPAs exclusivamente relacionada ao tabagismo, que é o principal meio de

exposição. Avaliamos uma população com uma dieta semelhante, vivendo na

mesma área geográfica, e sem variações significativas na exposição à poluição.

Conseguimos identificar 1- hidroxipireno no líquido amniótico e medimos os

níveis de benzopireno no sangue do cordão umbilical por cromatografia líquida

de alta eficiência, um método simples e barato. Existem estudos que já dosaram

o HPA-DNA-adducts, que mede a modificação no DNA causada pelo

benzopireno, mas é um método caro e complexo 110,113,125.

Enfim, nossos resultados confirmam que gestantes tabagistas tem uma

concentração aumentada de cotinina na urina e transmitem aos seus fetos

através do líquido amniótico e sangue do cordão umbilical. Confirmou que

gestantes tabagistas apresentam maiores concentrações de HPAs na urina que

não tabagistas e que o benzopieno passa para os fetos através do sangue do

cordão umbilical. Conseguimos dosar 1-hidroxipireno no líquido amniótico e

evidenciar maiores concentrações no líquido dos fetos das gestantes fumantes

comparadas ao grupo controle.

50

7. CONCLUSÕES

O estudo realizado permite chegar às seguintes conclusões:

- As substâncias tóxicas da fumaça do cigarro inaladas pelas gestantes

tabagistas, dosadas através da cotinina, 1-hidroxipireno e benzopireno são

transmitidas ao feto.

- A quantificação das substâncias estudadas permitiu identificar aumento

da concentração de cotinina e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos na urina

das gestantes tabagistas, no líquido amniótico e sangue do cordão umbilical de

seus fetos quando comparadas ao grupo controle. Em nenhuma das análises foi

encontrada diferença estatística quando comparados os controles com as

tabagistas passivas.

Desse modo, fetos de gestantes tabagistas estão expostos a substâncias

conhecidamente tóxicas e carcinogênicas.

51

8. BIBLIOGRAFIA

1. World Health Organization. Implementing tobacco control 2011. (Accessed 2013, at http://www.who.int/tobacco/control/en/.) 2. State medicaid coverage for tobacco-dependence treatments--United States, 1994-2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2004;53:54-7. 3. Tobacco use, access, and exposure to tobacco in media among middle and high school students--United States, 2004. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005; 54:297-301. 4. WHO urges more countries to require large, graphic health warnings on tobacco packaging: the WHO report on the global tobacco epidemic, 2011 examines anti-tobacco mass-media campaigns. Cent Eur J Public Health 2011;19:133, 51. 5. World Health Organization. Report on the global tobacco epidemic 2013. Enforcing bans on tobacco advertising, promotion and sponsorship. (Acessed in 2013, at http://www.who.int/tobacco/global_report/2013/en/.) 6. Eriksen M, Mackay J, Ross H. The Tobacco Atlas. (Accessed 2014, at http://www.tobaccoatlas.org/.) 7. Rogers JM. Tobacco and pregnancy. Reprod Toxicol 2009;28:152-60. 8. OMS divulga as dez principais causas de morte no mundo de 2000 a 2011. (Accessed 2014, at http://www.news.med.br/p/saude/367834/oms-divulga-as-dez-principais-causas-de-morte-no-mundo-de-2000-a-2011.htm) 9. Tabagismo: tabelas e indicadores 2012. (Accessed 2013, at http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/tabagismo) 10. Mulher e tabaco. (Accessed 2013, at http://www.inca.gov.br/tabagismo) 11. Fact sheet: preventing smoking and exposure to secondhand smoke before, during and after pregnancy 2007. (Accessed 2013, at http://www.cdc.gov/nccdphp/publications/factsheets/Prevention/smoking.htm) 12. Eaton DK, Kann L, Kinchen S, et al. Youth risk behavior surveillance--United States, 2005. MMWR Surveill Summ 2006;55:1-108. 13. Barros FC, Victora CG, Barros AJ, et al. The challenge of reducing neonatal mortality in middle-income countries: findings from three Brazilian birth cohorts in 1982, 1993, and 2004. Lancet 2005;365:847-54. 14. Bergen AW, Caporaso N. Cigarette smoking. J Natl Cancer Inst 1999;91:1365-75. 15. Pollack HA. Sudden infant death syndrome, maternal smoking during pregnancy, and the cost-effectiveness of smoking cessation intervention. Am J Public Health 2001;91:432-6. 16. Raatikainen K, Huurinainen P, Heinonen S. Smoking in early gestation or through pregnancy: a decision crucial to pregnancy outcome. Prev Med 2007;44:59-63. 17. Galão AO, Soder SA, Gerhardt M, Faertes TH, Krüger MS, Pereira DF, Borba CM. Efeitos do fumo materno durante a gestação e complicações perinatais. Revista do Hospital de Clínicas de Porto Alegre & Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande do Sul 2009;29:6. 18. Palma S, Pardo-Crespo R, Llorca J, Mariscal M, Delgado-Rodríguez M. Smoking among pregnant women in Cantabria (Spain): trend and determinants of smoking cessation. BMC Public Health 2007;7:1. 19. REIS LG et al. Tabagismo e gravidez: um estudo no Rio de Janeiro. Arquivos Brasileiros de Psiquiatria, Neurologia e Medicina Legal 2005;99. 20. How to stop smoking in pregnancy and following childbirth 2010. (Accessed 2013, at http://www.nice.org.uk/guidance/ph26) 21. Caleyachetty R, Tait CA, Kengne AP, Corvalan C, Uauy R, Echouffo-Tcheugui JB. Tobacco use in pregnant women: analysis of data from Demographic and Health Surveys from 54 low-income and middle-income countries. Lancet Glob Health 2014;2:e513-20.

52

22. Tobacco Use and Pregnancy. (Accessed 2013, at www.cdc.gov/reproductivehealth/tobaccousepregnancy/) 23. Leopercio WG, A. Tabagismo e suas peculiaridades durante a gestação: uma revisão crítica. Jornal Brasileiro de Pneumologia 2004;30:9. 24. Dwyer JB, Broide RS, Leslie FM. Nicotine and brain development. Birth Defects Res C Embryo Today 2008;84:30-44. 25. Hellstrom-Lindahl E, Nordberg A. Smoking during pregnancy: a way to transfer the addiction to the next generation? Respiration 2002;69:289-93. 26. Maritz GS. Nicotine and lung development. Birth Defects Res C Embryo Today 2008;84:45-53. 27. Wang L, Pinkerton KE. Detrimental effects of tobacco smoke exposure during development on postnatal lung function and asthma. Birth Defects Res C Embryo Today 2008;84:54-60. 28. Vassoler FM, Byrnes EM, Pierce RC. The impact of exposure to addictive drugs on future generations: Physiological and behavioral effects. Neuropharmacology 2014;76 Pt B:269-75. 29. Li YF, Langholz B, Salam MT, Gilliland FD. Maternal and grandmaternal smoking patterns are associated with early childhood asthma. Chest 2005;127:1232-41. 30. Hollams EM, de Klerk NH, Holt PG, Sly PD. Persistent effects of maternal smoking during pregnancy on lung function and asthma in adolescents. Am J Respir Crit Care Med 2014;189:401-7. 31. Norman CA, Halton DM. Is carbon monoxide a workplace teratogen? A review and evaluation of the literature. Ann Occup Hyg 1990;34:335-47. 32. Gilboa SM, Mendola P, Olshan AF, et al. Relation between ambient air quality and selected birth defects, seven county study, Texas, 1997-2000. Am J Epidemiol 2005;162:238-52. 33. Mannes T, Jalaludin B, Morgan G, Lincoln D, Sheppeard V, Corbett S. Impact of ambient air pollution on birth weight in Sydney, Australia. Occup Environ Med 2005;62:524-30. 34. Wilhelm M, Ritz B. Local variations in CO and particulate air pollution and adverse birth outcomes in Los Angeles County, California, USA. Environ Health Perspect 2005;113:1212-21. 35. Ziaei S, Nouri K, Kazemnejad A. Effects of carbon monoxide air pollution in pregnancy on neonatal nucleated red blood cells. Paediatr Perinat Epidemiol 2005;19:27-30. 36. Leem JH, Kaplan BM, Shim YK, et al. Exposures to air pollutants during pregnancy and preterm delivery. Environ Health Perspect 2006;114:905-10. 37. Ritz B, Wilhelm M, Hoggatt KJ, Ghosh JK. Ambient air pollution and preterm birth in the environment and pregnancy outcomes study at the University of California, Los Angeles. Am J Epidemiol 2007;166:1045-52. 38. Liu S, Krewski D, Shi Y, Chen Y, Burnett RT. Association between maternal exposure to ambient air pollutants during pregnancy and fetal growth restriction. J Expo Sci Environ Epidemiol 2007;17:426-32. 39. George L, Granath F, Johansson AL, Anneren G, Cnattingius S. Environmental tobacco smoke and risk of spontaneous abortion. Epidemiology 2006;17:500-5. 40. Machado Jde B, Plinio Filho VM, Petersen GO, Chatkin JM. Quantitative effects of tobacco smoking exposure on the maternal-fetal circulation. BMC Pregnancy Childbirth 2011;11:24. 41. Jauniaux E, Burton GJ. Morphological and biological effects of maternal exposure to tobacco smoke on the feto-placental unit. Early Hum Dev 2007;83:699-706. 42. Ananth CV, Smulian JC, Vintzileos AM. Incidence of placental abruption in relation to cigarette smoking and hypertensive disorders during pregnancy: a meta-analysis of observational studies. Obstet Gynecol 1999;93:622-8. 43. Chelmow D, Andrew DE, Baker ER. Maternal cigarette smoking and placenta previa. Obstet Gynecol 1996;87:703-6.

53

44. Hung TH, Hsieh CC, Hsu JJ, Chiu TH, Lo LM, Hsieh TT. Risk factors for placenta previa in an Asian population. Int J Gynaecol Obstet 2007;97:26-30. 45. Kyrklund-Blomberg NB, Cnattingius S. Preterm birth and maternal smoking: risks related to gestational age and onset of delivery. Am J Obstet Gynecol 1998;179:1051-5. 46. Fantuzzi G, Aggazzotti G, Righi E, et al. Preterm delivery and exposure to active and passive smoking during pregnancy: a case-control study from Italy. Paediatr Perinat Epidemiol 2007;21:194-200. 47. Nabet C, Lelong N, Ancel PY, Saurel-Cubizolles MJ, Kaminski M. Smoking during pregnancy according to obstetric complications and parity: results of the EUROPOP study. Eur J Epidemiol 2007;22:715-21. 48. Burguet A, Kaminski M, Abraham-Lerat L, et al. The complex relationship between smoking in pregnancy and very preterm delivery. Results of the Epipage study. BJOG 2004;111:258-65. 49. Simpson WJ. A preliminary report on cigarette smoking and the incidence of prematurity. Am J Obstet Gynecol 1957;73:807-15. 50. Cnattingius S. The epidemiology of smoking during pregnancy: smoking prevalence, maternal characteristics, and pregnancy outcomes. Nicotine Tob Res 2004;6 Suppl 2:S125-40. 51. DiFranza JR, Aligne CA, Weitzman M. Prenatal and postnatal environmental tobacco smoke exposure and children's health. Pediatrics 2004;113:1007-15. 52. Windham GC, Eaton A, Hopkins B. Evidence for an association between environmental tobacco smoke exposure and birthweight: a meta-analysis and new data. Paediatr Perinat Epidemiol 1999;13:35-57. 53. Ward C, Lewis S, Coleman T. Prevalence of maternal smoking and environmental tobacco smoke exposure during pregnancy and impact on birth weight: retrospective study using Millennium Cohort. BMC Public Health 2007;7:81. 54. Kramer MS. Determinants of low birth weight: methodological assessment and meta-analysis. Bull World Health Organ 1987;65:663-737. 55. Meyer MB, Comstock GW. Maternal cigarette s