pcr em tempo real isabela fonseca 13/04/2010. pcr convencional método sensível permite apenas a...

PCR em Tempo RealPCR em Tempo Real

Isabela FonsecaIsabela Fonseca13/04/201013/04/2010

PCR ConvencionalPCR Convencional

Método sensível Permite apenas a identificação da

presença ou ausência da sequência alvo

Não permite comparação entre diferentes reações já que há oscilações na eficiência de amplificação

Leitura do tipo end-point - final da reação

Cinética da Reação de PCRCinética da Reação de PCR

P = quantidade de produto final

n = número de ciclosE = eficiência da reaçãoT = quantidade inicial de

alvo (molde)Exemplo: n = 40 e E = 1

(100%) temos:P= T(2)40 = T x 1,099 x 1012

Cinética da Reação de PCRCinética da Reação de PCR

Curva Real

Curva Teórica

•Acúmulo de inibidores•Escassez de reagentes•Perda da atividade da DNA polimerase

Fases da PCRFases da PCR

1 - Lag2 - Exponential3 - Linear4 - Plateau


1 - Lag ou BaselineInício da reação.No PCR em Tempo Real, compreende a fase da amplificação em que o equipamento não consegue detectar o sinal de fluorescência emitido.

Log [DNA]Log [DNA]

Cycle #Cycle #


2 - Exponencial ou GeométricaA quantidade de produto é dobrado a cada ciclo (assumindo uma E = 100%). Fase de maior especificidade e precisão. O tamanho depende da concentração e qualidade do ensaio.

Log [DNA]Log [DNA]

Cycle #Cycle #


3 - LinearFase em que os componentes da reação são consumidos e começa a haver uma diminuição na “velocidade” da reação. Cai a eficiência da reação (<100%).Fase de maior variabilidade pois é dependente de vários fatores.

Log [DNA]Log [DNA]

Cycle #Cycle #


4 - PlateauHá pouca ou quase nenhuma formação de produto.Os componentes da reação começam a ficar escassos e há inibição enzimática pela formação de produto.

Log [DNA]Log [DNA]

Cycle #Cycle #

Leitura end point x Tempo Real

Quantificação end point é imprecisa por depender da eficiência de cada reação.

Detecção no início da fase exponencial permite uma quantificação altamente reprodutível.

Placa pipetada por um robô com mesma quantidade de alvo e mix em todos os wells

96 Replicates

-1.00E-01

4.00E-01

9.00E-01

1.40E+00

1 6

11

16

21

26

31

36

Cycle Number

Flu

ore

scence

(delt

a R

n)

96 replicates

Cycle Number

Flu

or

(delt

a Rn

)

-2.00E-02

0.00E+00

2.00E-02

4.00E-02

6.00E-02

8.00E-02

1.00E-01

20 22 24 26 28 30

Threshold = 0.05

96 replicates

Cycle Number

Flu

or

(Delt

a R

n)

geometric

Terminologia do PCR em Tempo RealTerminologia do PCR em Tempo Real

0

0.5

1

1.5

2

20 25 30 35 40 45

-Actin amplificationRQ-RQ+

Cycle #

Rn

Rn-Rn+

Ct=

Threshold

Sample

NTC (no template control)

∆Rn

Baseline

Threshold

Ct: Cycle Threshold

Rn (Normalized Reporter)

ΔRn = (Rn+) - (Rn-)


Baseline - os ciclos iniciais da PCR nos quais há uma pequena alteração no sinal de fluorescência. A emissão está abaixo do nível de detecção do equipamento.A amplificação é exponencial.Normalmente é de 3 a 15.


Threshold - o desvio padrão médio de Rn para os ciclos iniciais da PCR, multiplicado por um fator ajustável. Deve ser ajustado na região inicial associada a um crescimento exponencial do produto da PCR.


Ct - o número do ciclo no qual a fluorescência passa o threshold.É inversamente proporcional a quantidade de alvo presente no início da reação.

Ct =19,41


Referência passiva: é um fluoróforo que fornece um sinal de fluorescência interna o qual pode ser utilizado para normalizar o sinal do reporter dye.A normalização é necessária para corrigir flutuações de fluorescência causada por mudanças na concentração ou volume (evaporação e erros de pipetagem). Ex.: ROX.


Reporter dye - o fluoróforo que é emite fluorescência utilizada para indicar amplificação durante a PCR.Ex.: FAM, SYBR Green.

5' 6-FAM™

Quencher - o fluoróforo que reduz a fluorescência emitida pelo reporter dye.Ex.: TAMRA, MGB (não fluorescente).

3' TAMRATM


Rn: = Intensidade de Emissão do Reporter/ Intensidade de Emissão da Referência Passiva

ΔRn = (Rn+) - (Rn-)

Rn+: O valor Rn da reação contendo todos os componentes, incluindo o molde

Rn-: O valor Rn de uma amostra não reagente. Pode ser obtido a partir dos ciclos iniciais ou de uma reação que não contenha nenhum molde.


Eficiência da Reação - é a taxa na qual o amplicon é gerado. Se a quantidade de amplicon dobrar a cada fase a eficiência da reação é 100%.

Onde:E = eficiência da reaçãob = inclinação da curva

Influenciada pela qualidade dos reagentes, montagem do experimento, tamanho , estrutura e conteúdo de GC do amplicom, presença de inibidores de PCR, qualidade da amostra e análise.

Construída a partir de uma curva padrão.Valores ótimos de 90% a 110%, que corresponde a um

valor de b entre -3,58 e -3,10).


Padrão - uma amostra de concentração conhecida utilizada para construir uma curva padrão.

Controle endógeno ou referência ativa - o Ct gerado é utilizado para normalizar os dados experimentais. Ex. GAPDH, β-Actina e 18S rRNA.

Controle Exógeno - RNA ou DNA conhecido inserido em cada amostra numa concentração conhecida.Ativa - Controle positivo interno (IPC) Utilizada para diferenciar verdadeiros alvos

negativos da inibição do PCR.Calibrador - uma amostra utilizada como base para

resultados comparativos.


Tipos de QuantificaçãoTipos de QuantificaçãoAbsoluta

Determinação do número exato de moléculas.Relativa

Análise comparativa do ácido nucleico alvo com o do controle interno ou do calibrador

Quantificação AbsolutaQuantificação AbsolutaDeterminação do número exato de moléculas

de ácido nucleico alvo.Utilizado para quantificar amostras

desconhecidas interpolando suas quantidades a partir de uma curva padrão.

AplicaçõesQuantificação de carga viralTransgênicosTerapia GênicaDetecção de Patógenos

Curva Padrão - QACurva Padrão - QAÉ construída plotando-

se no eixo X o log da quantidade inicial do número de cópias do alvo (quantidade conhecida) e no eixo Y plota-se o Ct.

Cada reação é feita em duplicata ou triplicata.

Obtêm-se uma equação da reta e obtêm-se os valores de R2 e X (quantidade desconhecida amostra).Valor ideal de R2 =

0,999

Curva Padrão - QACurva Padrão - QANormalmente é utilizado um plasmídio ou

molécula de RNA transcrita in vitro como padrão.As concentrações devem ser medidas por

espectrofotometria (A260) ou convertida ao número de cópias usando um padrão de peso molecular de DNA ou RNA.

Deve ser executada por uma técnico bem treinado em pipetagem, já que os padrões serão diluídos a concentrações em torno de 106 a 1012 vezes.

Os padrões diluídos devem ser estáveis.

Curva Padrão - Análise de ResultadoCurva Padrão - Análise de Resultado

Quantificação RelativaQuantificação RelativaDetermina a quantidade de expressão de um gene

alvo em uma determinada amostra relativa à outra de referência (tal como uma amostra controle não tratada - calibrador).

Calibrador pode ser uma amostra não tratada ou, por exemplo, no tempo zero de um experimento.

Fornece uma comparação acurada entre o nível inicial do alvo em cada amostra sem requerer o exato número de cópias. Deste modo, pode-se determinar o nível relativo do alvo na amostra sem necessidade de construir uma curva padrão.

AplicaçõesEstudos de expressão gênica

Análise de Resultado - QRAnálise de Resultado - QR

Cálculo: Fold-expression changes é calculado usando-se a equação 2−ΔΔC

t, onde:

ΔCt = (Ct alvo - Ct referência)

ΔΔCT = ΔCt amostra - ΔCt calibrador

Análise de Resultado - QRAnálise de Resultado - QR

Fold Change= 2ΔCt

212–6 = 64X menor na amostra

Sistemas de DetecçãoSistemas de DetecçãoBaseados em:

Corantes que se ligam ao DNA SYBR Green

Primers fluorescentes Lux ™ primers - Invitrogen Amplifluor™ qPCR primers - Biosearch

Technologies Plexor™ primer - Promega Scorpion® primers

Sondas TaqMan® - Applied Biosystems Molecular Beacons - Public Health Research

Institute - USA

SYBR GreenSYBR GreenUtiliza o corante SYBR Green que se

intercala a molécula de DNA dupla-fita.Não se liga a DNA fita simples.Durante a PCR o SYBR Green liga-se aos

amplicons formados.Com o aumento na produção de amplicons, a

intensidade de fluorescência é proporcional à quantidade de produto gerado na reação

SYBR GreenSYBR GreenVantagens

Pode ser utilizado para monitorar a amplificação de qualquer sequência de DNA dupla-fita.

Não é necessário sonda, o que reduz o custo do ensaio.

DesvantagensPode gerar sinais falso-positivos - liga-se a

sequências não específicas de DNA dupla fita.Não permite reação multiplex.

SYBR GreenSYBR Green

SYBR GreenSYBR GreenCurva de

Dissociação

SYBR Green - Curva de DissociaçãoSYBR Green - Curva de Dissociação

Sistema TaqManSistema TaqMan®®

Utilização de sondas marcadas, além dos primers, com fluorescência que utilizam a atividade nuclease 5’ da DNA polimerase.

Uma sonda (oligonucleotídeo) é construída contendo um corante reporter fluorescente na extremidade 5’ e um corante quencher na extremidade 3’.Enquanto a sonda está intacta, a proximidade do

quencher reduz a emissão de fluorescência pelo reporter.

Se o alvo estiver presente na reação a sonda se anela logo após um dos primers e é clivada através da atividade da nuclease 5’ enquanto o primer é extendido.Quando o reporter se separa do quencher há um

aumento na emissão de sinal do reporter.


VantagensEnsaio mais específico porque há a

necessidade de hibridização específica entre a sonda e o alvo para gerar sinal fluorescente.

Podem ser feitas reações multiplex com reporters distintos e distinguíveis pelo equipamento.

Reduz o tempo total da reaçãoDesvantagem

Necessidade de síntese de primers e sondas o que aumenta o custo do ensaio.

R QReporter

Quencher

Q

R

PR

TaqMan Fluorescent Dyes

• Passive Reference

»ROX

• Reporter

»FAM

»TET

»JOE

»HEX

»VIC

• Quencher

»TAMRA

»NFQ +MGB


Plataformas de Detecção - Applied Plataformas de Detecção - Applied BiosystemsBiosystems

ABI 7700ABI 5700ABI 7000ABI 7900HTABI 7300ABI 7500

7500 Fast Real-Time PCR System

7500 Real-Time PCR System

Plataformas de DetecçãoPlataformas de DetecçãoRoche

LightCycler® 2.0 Real-Time PCR System

LightCycler 480 System LightCycler® 1536

Real-Time PCR SystemBIO-RAD

CFX96 Real-Time PCR Detection System

CFX384 Real-Time PCR Detection System

MyiQ2 Two-Color Real-Time PCR Detection System MiniOpticon Real-Time PCR Detection System

ABI PRISM® Sistema ÓpticoABI PRISM® Sistema Óptico

Filter Wheel

CCDCamera

Lamp

Excitation Filter

96-Well Plate

Multi-ElementLens

DichroicMirror

Fresnel LensWell Lenses

Fold Mirror

Links AnimaçõesLinks Animaçõeshttp://www.biosearchtech.com/flash/guides/

formats_explained.htmlhttp://croptechnology.unl.edu/

animationOut.cgi?anim_name=taqman.swfhttp://appliedbiosystems.cnpg.com/video/

flatFiles/1088/index.aspx

Obrigada!!!Obrigada!!!

Dúvidas???Dúvidas???

pcr em tempo real isabela fonseca 13/04/2010. pcr convencional método sensível permite apenas a...

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