paulo diniz da gama - teses.usp.br · descritores: 1.esclerose múltipla 2.líquido...

i

Paulo Diniz da Gama

Estudo de bandas oligoclonais restritas ao lquido

cefalorraquidiano em pacientes com esclerose mltipla

na cidade de So Paulo

Tese apresentada Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo para obteno do ttulo

de Doutor em Cincias

rea de concentrao: Neurologia

Orientador: Prof. Dr. Dagoberto Callegaro

So Paulo

2009

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Gama, Paulo Diniz da

Estudo de bandas oligoclonais restritas ao lquido cefalorraquidiano em

pacientes com esclerose mltipla na cidade de So Paulo / Paulo Diniz da Gama.

-- So Paulo, 2009.

Tese (doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo.

Departamento de Neurologia.

rea de concentrao: Neurologia.

Orientador: Dagoberto Callegaro.

Descritores: 1.Esclerose mltipla 2.Lquido cefalorraquidiano 3.Bandas

oligoclonais 4.Brasil

USP/FM/SBD-149/09

ii

Dedico Gisah, sinnimo de determinao, incentivo, carinho,

cumplicidade e principalmente compreenso por minha ausncia,

concedendo uma oportunidade de me realizar.

Aos meus filhos Rodrigo e Daniel, cuja tica, amor e

generosidade so uma constante. Que este trabalho, fruto de

grande esforo pessoal, sirva de referncia para que vocs

possam sempre lembrar que as conquistas residem na no

desistncia de seus sonhos, e de que vale a pena criar marcos

durante nossa breve passagem pela vida.

Aos meus pais, Dr. Diniz e Dona Neuza, que dedicaram suas

vidas formao de seus filhos, e pelo apoio e exemplos de luta,

doao, amor e respeito.

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeo

Ao Prof. Dr. Dagoberto Callegaro, responsvel pelo servio de

Doenas Desmielinizantes do Hospital das Clnicas da Faculdade de

Medicina de Universidade de So Paulo, orientador desta obra, pela

confiana, pela amizade, pelo exemplo pessoal e profissional, somado aos

ensinamentos e incentivos durante estes anos. Meu eterno agradecimento.

Ao Prof. Dr. Luis dos Ramos Machado, professor do Departamento

de Neurologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo, co-

orientador desta obra, pela disponibilidade e ajuda no acompanhamento em

todas as fases da pesquisa.

Ao Prof. Dr. Marco Aurlio Lana Peixoto, professor de Neurologia e

Oftalmologia da Universidade Federal de Minas Gerais, pela reviso deste

trabalho, incentivo e interveno desde os primeiros momentos da deciso

do incio desta obra.

Ao Prof. Dr. Jos Antnio Livramento, professor do Departamento

de Neurologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo e

Chefe pelo Centro de Investigaes em Neurologia da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo e ao Dr. Hlio Rodrigues Gomes,

responsvel pelo Centro de Investigaes Neurolgicas da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo, pela importante misso de realizar

a anlise laboratorial das amostras de lquido cefalorraquidiano, pelo apoio e

pelas orientaes.

iv

Ao Prof. Dr. Sandro Blasi Espsito, professor de neurologia da

Pontifcia Universidade Catlica de So Paulo, campus Sorocaba, pelo

incentivo, pelas oportunidades concedidas, e pela confiana em mim

depositada durante todos estes anos, tributos que em muitas vezes s so

oferecidos a um irmo.

Ao Prof. Dr. Dario Doretto, ex-professor de neurologia da Pontifcia

Universidade Catlica de So Paulo, campus Sorocaba, pelos exemplares

ensinamentos prticos da semiologia neurolgica e pelo compartilhamento

incondicional de seus conhecimentos, fundamentais para a minha formao.

Dra. Ciclia Yuko Wada, PhD em Bioestatstica da Statpharm

Consultoria Cientfica, pela orientao e ajuda na concluso da anlise

estatstica deste estudo.

Aos Drs. Tarso Adoni, Douglas Kazutoshi Sato, Thiago de Faria

Junqueira e Samira Luisa dos Apstolos Pereira, mdicos colaboradores

do servio de Doenas Desmielinizantes do Hospital das Clnicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo, cuja participao foi

de suma importncia para o recrutamento da casustica.

Sra. Maria Adelaide Rodrigues Bento, voluntria do ambulatrio

de doenas desmielinizantes, pela dedicao, eficincia e amor a sua

funo.

v

s Sras. Darcy Terezinha Borges e Camila Caroline de Sena,

tcnicas do Centro de Investigaes em Neurologia da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo, pela eficiente misso de

elaborao tcnica das amostras, e pela ateno dispensadas durante toda

a pesquisa.

Em especial aos pacientes que participaram do estudo, pela doao,

confiana no meu trabalho, e pela inesgotvel esperana que alimenta

nossos anseios de mudana.

vi

Acredito que algo poder vir disto!

H.I. Quincke (primeira puno lombar, 1891)

vii

SUMRIO

Lista de Abreviatura

Lista de Siglas

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Resumo

Abstract

1 INTRODUO .............................................................................. 20

2 REVISO DA LITERATURA ........................................................ 23

2.1 Histrico ...................................................................................... 24

2.2 Anatomia e fisiologia ................................................................... 27

2.3 A coleta do LCR .......................................................................... 30

2.4 A anlise do LCR ........................................................................ 31

2.4.1 Exame fsico ............................................................................. 33

2.4.2 Exame citolgico ....................................................................... 33

2.4.3 Exame qumico de rotina .......................................................... 33

2.4.4 Anlise quantitativa das protenas ............................................ 34

2.4.4.1 A albumina ............................................................................. 34

2.4.4.2 As imunoglobulinas ................................................................ 35

2.4.5 Anlise qualitativa das protenas pesquisa de BOC .............. 37

2.5 Alteraes do LCR na EM ........................................................... 41

2.6 A demografia e a interpretao dos resultados ........................... 43

2.6.1 Variaes na apresentao clnica ou fase evolutiva da EM ... 45

2.6.2 Constituio gentica de cada populao ................................ 46

2.6.3 Diferenas na metodologia de pesquisa .................................. 47

2.6.4 Diferentes tcnicas de anlise do LCR empregadas ................ 47

3 OBJETIVOS .................................................................................. 49

4 CASUSTICA E MTODOS .......................................................... 51

4.1 Critrios de incluso e excluso ................................................... 52

4.1.1 Critrios de incluso para pacientes portadores de EM e CIS .. 53

viii

4.1.2 Critrios de incluso para portadores de DNI ........................... 53

4.1.3 Critrios de incluso de pacientes controles ............................. 54

4.1.4 Critrios de excluso ................................................................ 54

4.2 Protocolo da avaliao clnica de portadores de EM ................... 55

4.2.1 Dados demogrficos ................................................................. 55

4.2.2 Quadro clnico ........................................................................... 56

4.3 Protocolo da avaliao clnica para portadores de DNI ............... 58

4.3.1 Dados demogrficos ................................................................. 58

4.3.2 Histria clnica .......................................................................... 58

4.3.3 Exame fsico neurolgico .......................................................... 59

4.4 Protocolo dos pacientes do grupo controle ................................. 59

4.5 Protocolo de exames complementares ....................................... 59

4.5.1 Os exames bioqumicos e sorolgicos solicitados ................... 60

4.5.2 Exame de neuro-imagem ......................................................... 61

4.5.3 Protocolo de anlise das variantes clssicas do LCR .............. 62

4.5.4 Protocolo para a anlise quantitativa das protenas do LCR .... 63

4.5.5 Protocolo para a anlise qualitativa das protenas do LCR ...... 64

4.6 Fluxograma do atendimento mdico ............................................ 65

4.7 Anlise estatstica ........................................................................ 66

4.7.1 Teste da validade ...................................................................... 66

4.7.2 Estatstica descritiva ................................................................. 67

4.7.3 Inferncias estatstica ............................................................... 68

4.7.4 Software utilizados .................................................................... 68

4.8 Aspectos ticos ............................................................................ 69

5 RESULTADOS ............................................................................... 70

5.1 Dados demogrficos .................................................................... 71

5.1.1 Idade ........................................................................................ 71

5.1.2 Gnero ...................................................................................... 72

5.1.3 Etnia .......................................................................................... 73

5.2 Quadro clnico .............................................................................. 74

5.3 Anlise qualitativa das protenas do LCR .................................... 75

5.3.1 Estudo de BOC pela FIE em pacientes com EM ...................... 75

ix

5.3.2 Estudo de BOC pela FIE em pacientes com CIS ..................... 75

5.3.3 Estudo de BOC pela FIE em pacientes com DNI ..................... 75

5.3.4 Estudo de BOC pela FIE em pacientes controle ...................... 76

5.3.5 Estudo de BOC pela FIE terapia imunomoduladora .................. 76

5.3.6 Estudo de BOC pela eletroforese em gel de agarose ................ 77

5.4 Anlise quantitativa das protenas do LCR ................................... 77

5.4.1 O quociente de albumina ............................................................ 77

5.4.2 O ndice de IgG ........................................................................... 78

5.4.3 O normograma ............................................................................ 79

5.5 O estudo quimiocitolgico de rotina do LCR .................................. 82

5.6 Resultados do LCR com as caractersticas demogrficas ............. 82

5.6.1 Gnero ........................................................................................ 82

5.6.2 Etnia ............................................................................................ 83

5.6.3 A associao entre gnero e etnia com as BOC ........................ 84

5.6.4 A associao entre gnero e etnia com o ndice de IgG ............ 85

5.7 O quadro clnico e a anlise do LCR ............................................. 86

5.7.1 As diferentes formas clnicas da EM e a anlise do LCR ........... 86

5.7.2 A sintomatologia e evoluo clnica e as BOC ........................... 88

5.8 Anlises estatsticas ...................................................................... 90

5.8.1 Testes de validade da FIE para o diagnstico da EM ................. 90

5.8.2 Testes de validade da EGA para o diagnstico da EM .............. 91

5.8.3 Testes de validade do I IgG para o diagnstico da EM ............... 91

6 DISCUSSO ..................................................................................... 92

6.1 Caracterizao da casustica ......................................................... 93

6.2 A anlise do LCR ........................................................................... 95

6.3 As caractersticas demogrficas .................................................... 98

6.4 O quadro clnico ............................................................................. 100

6.5 Consideraes finais .................................................................... 102

7 CONCLUSES ................................................................................ 106

ANEXOS ............................................................................................... 108

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................... 133

APNDICE

x

LISTA DE ABREVIATURAS

a.C. Antes de Cristo

ADEM Encefalomielite Disseminada Aguda

BOC Bandas Oligoclonais

CIS Sndrome Clnica Isolada

DNI Doena Neurolgica Inflamatria

EDSS Escala Expandida do Status de Incapacidade

EEUU Estados Unidos da Amrica

EGA Eletroforese em Gel de Agarose

EM Esclerose Mltipla

FIE Focalizao Isoeltrica

FLAIR Fluid Attenuate Inversion Recovery

FN Falso Negativo

FP Falso Positivo

Gd Gadolnio

g.l. Grau de liberdade

HIV Vrus da Imunodeficincia Humana

HLA Antgeno Leucocitrio Humano

HTLV Virus T-linfotrpico Humano

IB Immunoblotting

IC intervalo de confiana

IgA Imunoglobulina A

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

IP Impregnao pela Prata

IRM Imagem de Ressonncia Magntica

LCR Lquido Cefalorraquidiano

MHC Complexo de Histocompatibilidade Maior

NR No Referido

xi

ODD Outras Doenas Desmielinizantes

PP Primariamente Progressiva

PR Progressiva Recorrente

Q Alb Quociente de Albumina

Q IgG Quociente de Imunoglobulina G

R Risco Relativo

RR Remitente Recorrente

SNC Sistema Nervoso Central

SP Secundariamente Progressiva

VN Verdadeiro Negativo

VP Verdadeiro Positivo

VR Valor de referncia

xii

LISTA DE SMBOLOS

g grama

kg quilograma

mg miligrama

ml mililitro

mm milmetro

MUI milhes de unidades internacionais

ng nanograma

ph potencial hidrogeninico

vs versos

X2 qui-quadrado

/ por

mais ou menos

menor ou igual

maior ou igual

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Compartimentos do sistema nervoso central ....................... 28

Figura 2 Compartimentos do lquido cefalorraquidiano ..................... 30

Figura 3 Organograma da anlise do lquido cefalorraquidiano ........ 32

Figura 4 Normograma de acordo com Reiber e Felgenhauer ............ 36

Figura 5 Interpretao dos resultados das bandas oligoclonais de

imunoglobulinas .................................................................... 39

Figura 6 Distribuio da etnia nos diversos grupos de pacientes ....... 73

Figura 7 Distribuio em porcentagem das formas clnicas da

esclerose mltipla ................................................................. 74

Figura 8 Grfico de intervalos do ndice de IgG vs BOC..................... 79

Figura 9 Distribuio da anlise das imunoglobulinas nas diversas

patologias.............................................................................. 80

Figura 10 Quociente de imunoglobulina plotado contra o quociente

de albumina nos trs grupos de pacientes ........................... 81

Figura 11 Associao do gnero e etnia dos pacientes portadores

de esclerose mltipla, analisados quanto presena de

bandas oligoclonais .............................................................. 85

Figura 12 Associao do gnero e etnia dos pacientes portadores

de EM analisados quanto ao ndice de IgG ......................... 86

Figura 13 Distribuio da presena de bandas oligoclonais pela

focalizao isoeltrica nas diferentes formas clnicas ......... 87

Figura 14 Distribuio da presena de bandas oligoclonais pela

focalizao isoeltrica segundo as formas clnicas

progressivas e a forma remitente recorrente ....................... 88

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Estudo da presena de bandas oligoclonais em pacientes

com esclerose mltipla ......................................................... 44

Tabela 2 Imagens de ressonncia magntica no diagnstico da

esclerose mltipla ................................................................ 62

Tabela 3 Caractersticas clnicas do grupo de pacientes com

doenas neurolgicas inflamatrias e correlao com a

presena de bandas oligoclonais .......................................... 76

Tabela 4 Caractersticas clnicas dos pacientes com esclerose

mltipla e correlao com a presena de bandas

oligoclonais ........................................................................... 89

Tabela 5 Valores, em porcentagem, dos indicadores de significncia

na deteco de bandas oligoclonais para o diagnstico da

esclerose mltipla ................................................................ 90

xv

RESUMO

GAMA, P.D. ESTUDO DE BANDAS OLIGOCLONAIS RESTRITAS AO LQUIDO CEFALORRAQUIDIANO EM PACIENTES COM ESCLEROSE MLTIPLA NA CIDADE DE SO PAULO. [tese]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2009.

Introduo: O diagnstico da esclerose mltipla (EM) embora seja clnico, se completa com os resultados de imagem de ressonncia magntica, somados ainda com a anlise do lquido cefalorraquidiano (LCR), que se constituem em ferramentas indispensveis. A presena das bandas oligoclonais (BOC) no LCR faz parte do estudo da EM, assim como auxilio no diagnstico. Existem grandes variaes quanto frequncia de BOC em pacientes com EM nas diferentes populaes, desde 90% em pases nrdicos europeus, at 30 a 60% no Japo, China, ndia e Lbano. O presente estudo tem o objetivo de estabelecer o valor da anlise do LCR para o diagnstico da EM em nossa populao, com nfase na pesquisa de BOC. O estudo tambm objetiva correlacionar os resultados destas anlises com as caractersticas clnicas e demogrficas da amostra selecionada. Casustica e Mtodos: Foram estudados 145 pacientes selecionados do Centro de Referncia de Doenas Desmielinizantes do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina de Universidade de So Paulo, no perodo de agosto de 2005 a janeiro de 2008. Foram registrados para o estudo os dados demogrficos, clnicos e da evoluo da doena. O diagnstico da EM foi estabelecido segundo o painel internacional de McDonald, revisado em 2005. A tcnica utilizada para a pesquisa de BOC foi a focalizao isoeltrica, seguida do immunoblotting, simultaneamente no LCR e no soro sanguneo. Os resultados desta anlise no foram utilizados para estabelecer o diagnstico, ou para incluir pacientes na casustica da pesquisa. O grupo controle foi selecionado entre aqueles que se submeteram anestesia raquidiana para cirurgias de pequeno porte. Resultados: Apresentaram BOC: 54,4% dos 90 pacientes com EM; 31,2% dos 16 pacientes com sndrome clnica isolada; 17,9% dos 39 pacientes com doenas neurolgicas inflamatrias. No grupo controle, os 19 pacientes no apresentaram BOC. A sensibilidade das BOC foi calculada em 54,4%. A especificidade foi de 100% quando comparado ao grupo controle. Quando comparado com o grupo de pacientes com doenas neurolgicas inflamatrias, a especificidade foi de 82,1%. Nos pacientes que se autodeclaram de cor parda ou preta, a frequncia de BOC foi maior, com significncia na borda do nvel de significncia de 5% (p=0,0518). Quanto aos aspectos clnicos evolutivos foi constatada maior presena de BOC nas formas progressivas recorrentes (100%); seguida da forma primariamente

xvi

progressiva (87,5%); secundariamente progressiva (54,5%) e forma remitente recorrente (44,3%). A homogeneidade das BOC segundo as formas clnicas foi significante (p=0,0103), ao nvel de significncia de 5%. Concluses: Este trabalho demonstra que a frequncia de BOC em pacientes com EM foi de 54,4%, sendo menor que em outras sries mundiais. Estes resultados tambm no confirmam aqueles obtidos em estudos brasileiros prvios. A etnia e as formas de evoluo clnica da doena influenciaram com significncia na frequncia de aparecimento das BOC. A baixa frequncia das BOC no LCR de pacientes com EM pode ser decorrente de fatores associados baixa e mdia prevalncia da doena nesta regio.

Descritores: 1. Esclerose mltipla 2. Lquido cefalorraquidiano 3. Bandas oligoclonais 4. Brasil

xvii

ABSTRACT

GAMA, P.D. STUDY OF OLIGOCLONAL BANDS RESTRICTED TO THE CEREBROSPINAL FLUID IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS IN THE CITY OF SO PAULO. [thesis]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2009.

Introduction: The diagnosis of multiple sclerosis (MS) although clinical, is rounded out with the results of magnetic resonance imaging, in addition to an analysis of the cerebrospinal fluid (CSF), which form a set of indispensible tools. The presence of oligoclonal bands (OCB) in the CSF is used in the study and for the diagnosis of MS. The frequency of OCB in MS patients varies widely in different populations, ranging from 90% in Nordic countries, to 30 to 60% in Japan, China, India and Lebanon. The objective of the present study is to establish a reference value for the analysis of CSF for the diagnosis of MS in our population, with an emphasis on the study of OCB. A further objective of the study is to correlate the results of these analyses with the clinical and demographic characteristics of the sample selected. Methods: The sample was composed of 145 patients selected from the Demyelinating Diseases Reference Center of the Clinical Hospital of the University of So Paulo, from August 2005 to January 2008. Records containing demographic, clinical and disease progression were used for the study. The diagnosis of MS was established according to 2005 Revisions of the McDonald Criteria. To detect OCB, isoelectric focusing was employed, followed by immunoblotting, simultaneously in both the CSF and blood serum. The results of this analysis were not used to establish the diagnosis or to include patients in the study sample. The control group was selected from those who were submitted to spinal tap for anesthesia in minor surgery. Results: OCB were found in 54.4% of the 90 patients with MS, 31.2% of the 16 patients with isolated clinical syndrome, and 17.9% of the 39 patients with inflammatory neurological diseases. In the control group, 19 patients did not present OCB. The sensitivity of OCB was calculated to be 54.4%. The specificity was 100% when compared to the control group. When compared with the group of patients with inflammatory neurological diseases, the specificity was 82.1%. For the patients who classified themselves as colored or black, the frequency of OCB was higher, with borderline significance using a significance level of 5% (p=0.0518). With regard to clinical evolution of MS, the highest presence of OCB was found in the relapsing progressive types (100%); followed by the primary progressive type (87.5%); secondary progressive type (54.5%); and relapsing remitting type (44.3%). The homogeneity of the OCB in relation to the clinical types was significant

xviii

(p=0.0103), at a significance level of 5%. Conclusions: This study shows that the frequency of OCB in patients with MS was 54.4%, lower than the findings of other worldwide series. Moreover, these results do not confirm those obtained in other Brazilian studies. Race and clinical progression of the disease influenced, in a statistically significant manner, the frequency of the presence of OCB. The low frequency of OCB in the CSF of patients with MS may be the result of factors associated with the low and medium prevalence of this disease in this region.

Descriptors: 1. Multiple sclerosis 2. Cerebrospinal fluid 3. Oligoclonal bands 4. Brazil

1 INTRODUO

Introduo 21

1 INTRODUO

A esclerose mltipla (EM) uma doena do sistema nervoso central

(SNC) considerada como uma doena desmielinizante de origem

inflamatria crnica1,2. Caracteriza-se por uma resposta auto-imuno a

componentes da mielina1,2,3, que se manifestada em indivduos

geneticamente susceptveis4,5,6, desencadeada por um ou mais agentes

ambientais7,8. Um processo degenerativo de clulas nervosas esta presente

na fisiopatologia da doena. Linhas de pesquisam especulam se este

processo degenerativo antecede, ou se consequente do processo

inflamatrio9,10.

As limitaes da abordagem diagnstica atual que no h um

parmetro clnico ou paraclnico, que possa garantir ou excluir o diagnstico

da EM, de maneira inequvoca11,12,13.

Enquanto as tcnicas de imagem so de particular importncia para

demonstrar leses caractersticas, e comprovar a disseminao destas

leses no tempo e espao12,14,15, o LCR se constitui como importante

ferramenta que demonstra uma inflamao crnica no SNC, com

caractersticas prprias da doena2,8,16. O estudo do LCR tambm permite

afastar o diagnstico de outras doenas, passveis de incluso entre os

diagnsticos diferenciais da EM3,11,17,18.

Introduo 22

Medidas da concentrao das imunoglobulinas so um importante

item da anlise do LCR, comprovando a presena de uma atividade

inflamatria2,8,19. Um dos mtodos mais utilizados para a caracterizao da

produo intratecal de imunoglobulinas a pesquisa de bandas oligoclonais

(BOC), simultaneamente no LCR e no soro13.

As BOC no so alteraes especficas da EM. Demonstra-se a

presena de BOC em vrias outras doenas inflamatrias ou infecciosas do

SNC, embora os registros quanto sua frequncia sejam variveis3,11,18.

Alm disso, alguns autores descrevem a presena de BOC mesmo em

doenas no inflamatrias18,19,20.

Existem grandes variaes, nas diferentes populaes, quanto

frequncia de BOC em pacientes com EM6,21,57. So evidentes, contudo, as

variaes na apresentao clnica nos diversos estudos, as bases genticas

de cada populao, e as diferentes tcnicas de anlise empregadas, o que

podem levar a diferentes resultados3,11.

O conhecimento da frequncia de BOC da populao a que visamos

assistir, conjuntamente com a utilizao da melhor tcnica de anlise

empregada, so fundamentos essenciais para a otimizao da fase

investigativa, levando a uma consequente melhor estratgia teraputica.

2 REVISO DA LITERATURA

Reviso da Literatura 24

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 Histrico

Na antiguidade, as noes que se tinham do LCR eram muito

imprecisas. No sculo XVII a.C., foi descrito no papiro de Edwin, a presena

de um fludo dentro das cavidades cerebrais. Em 460 a.C. atribui-se a

Hipcrates a puno ventricular em pacientes com hidrocefalia. Herophilus

(335 a.C.) conhecia a existncia dos ventrculos cerebrais como estrutura

anatmica, porm desconhecia suas funes. Galenus (131 a.C.) fez

referncia a um lquido que procedia dos ventrculos cerebrais e era

eliminado pela fossa nasal22.

Na idade moderna, Vesalius (1514), em seus estudos sobre a

localizao da alma, mencionou certo lquido no crebro. Pacchioni (1729)

afirmou que uma linfa se localizava entre a membrana mole e as

circunvolues do crebro, porm no forneceu provas objetivas. Cotugno

(1764), em seus estudos em peixes e rpteis, foi aquele que pela primeira

vez demonstrou que um lquido claro preenchia os ventrculos e os espaos

subaracnides, estabelecendo definitivamente que o LCR estava presente

no crnio em condies normais22.


Magendie (1822) fez a primeira descrio completa do LCR afirmando

que a sua funo era protetora do SNC em aspectos mecnicos, devido

distribuio das foras de presso para todo o crnio, idia ainda

considerada verdadeira em nossos tempos23.

Quincke (1891) foi o primeiro a fazer a puno lombar no homem com

finalidade diagnstica, com uma simples agulha e sem inciso da pele. Ele

abriu assim um novo campo para as pesquisas prticas e tericas sobre o

LCR23.

A anlise do LCR era baseada no exame microscpico de clulas e

medidas semiquantitativas das protenas totais. Deste modo tornou-se

possvel a distino entre meningite/meningoencefalite bacteriana e no

bacteriana11,25.

No Brasil, os estudos sobre o LCR iniciaram-se no ano de 1897, seis

anos depois das descries de Quincke. Miguel Couto realizou pela primeira

vez em nosso pas a puno lombar, em um paciente do Hospital da

Misericrdia do Rio de Janeiro. Neste mesmo ano, Correa defendia a tese

intitulada Valor diagnstico e therapeutico da puncco lombar no Rio de

Janeiro23.

A distino das clulas no LCR, com tcnicas envolvendo mtodos da

citognesis, tornou possvel identificar clulas especficas, como linfcitos,

clulas plasmticas e clulas B ativadas. Concluiu-se que estas clulas

alcanavam o tecido do SNC provindas da migrao da circulao sistmica,


atravs da barreira hemato-LCR. Estas clulas seriam responsveis pela

produo de imunoglobulinas25.

O desenvolvimento da reao coloidal foi de grande ajuda no

diagnstico de doenas inflamatrias crnicas do SNC25. Graas

eletroforese em papel24,26, foi possvel demonstrar que um aumento da

gamaglobulina total leva a uma disfuno do equilbrio coloidal. A

diferenciao entre a produo de imunoglobulinas no soro sanguneo e da

produo intratecal ainda no era possvel, e por isso esta tcnica no teve

um valor diagnstico imediato.

Aps ter se tornado claro que havia uma distinta correlao entre a

concentrao das protenas do LCR e do soro, a anlise destas

concentraes se tornou mandatria para determinar a proporo de

imunoglobulinas, que eram produzidas dentro do SNC27,28.

Uma vez que a albumina somente sintetizada no fgado e no

catabolizada dentro do SNC, a razo LCR/soro da albumina foi considerada

como um marcador puro de permeabilidade da barreira hemato-LCR.

Correlacionando a razo imunoglobulina do LCR e soro com a razo de

albumina do LCR e soro, foi possvel compensar a quebra da barreira27,28.

Neste contexto, vrias frmulas foram propostas para o clculo da

produo intratecal de imunoglobulinas28,29,30,31. Estas frmulas mostraram

sensibilidades semelhantes que variam de 50 a 70%. Dentre estas frmulas

a mais utilizada o ndice de IgG.


Depois da introduo do diagrama de razo emprica29, que revelou

uma relao no linear entre a razo de imunoglobulina e albumina, uma

ilustrao grfica e quantitativa da sntese intratecal de imunoglobulinas

tornou-se possvel.

Com o auxlio da eletroforese em Agar, Lwenthal et al (1969)24 foram

capazes de descrever uma expressiva zona de fraes de gamaglobulinas

em patologias inflamatrias do SNC. Posteriormente, Laterre et al (1970)32

introduziram o termo oligoclonal para denominao destas fraes, que

mais tarde foi designada de bandas oligoclonais.

2.2 Anatomia e fisiologia

O SNC pode ser dividido em quatro compartimentos (Figura 1):

1) o sistema vascular;

2) o espao intracelular;

3) o espao extracelular;

4) e o compartimento do LCR.

A barreira hemato-enceflica separa o sistema vascular do espao

extracelular do parnquima cerebral. A barreira hemato-LCR separa o

sistema vascular do compartimento do LCR. evidente que todo o


parnquima cerebral no margeia o espao subaracnide, havendo reas

prximas do compartimento do LCR e reas distantes33,34.

Figura 1. Compartimentos do sistema nervoso central (Adaptado de Felgenhauer 1995

33)

O LCR envolve todo o SNC. Esse revestimento lquido de extrema

importncia34:


1) Para a proteo mecnica do sistema nervoso, em relao a

foras normais (como a gravitacional), quer em relao a foras

no-fisiolgicas (como no traumatismo crnio enceflico);

2) Para a rpida difuso de substncias entre as diferentes

estruturas com as quais est em contato, sejam endgenas

sejam medicamentos injetados dentro do sistema do LCR;

3) Para a homogeneizao das respostas de defesa, quando o

SNC acometido por processos infecciosos, como nas

meningites e nas encefalites.

Os sistemas de barreiras so importantes para a manuteno das

propriedades individuais de cada tecido, sendo que neste contexto as

clulas endoteliais representam o principal papel. Associado s membranas

basais dos tecidos, as tight-junctions esto relacionadas a permeabilidade

seletiva entre o parnquima e o sangue11,34.

Morfologicamente, a barreira hemato-enceflica e a barreira hemato-

LCR diferem-se na estrutura de densidade, que responsvel pela excluso

ou permeabilidade de uma determinada substncia. Enquanto a barreira

hemato-enceflica no mostra qualquer permanente fenestrao, a barreira

hemato-LCR (plexos corides) possui diversas fenestraes e vesculas

pinocticas, que formam um macro filtro de protenas11,34.

A Figura 2 mostra as estruturas anatmicas que esto relacionadas

com o fluxo do LCR no SNC.


Figura 2. Compartimentos do lquido cefalorraquidiano

2.3 A coleta do LCR

A obteno do LCR, com o propsito de diagnstico, s pode ser

indicada aps ter se considerado potenciais contra-indicaes. Antes da

coleta, necessrio obter um consentimento livre e esclarecido, assinado

pelo paciente ou por seu responsvel legal35.


O LCR extrado por uma das trs vias; lombar (por puno do fundo

de saco dural), suboccipital (por puno da cisterna magna), e ventricular

(por puno de um dos ventrculos laterais).

Na rotina, esta indicada a puno lombar devido s mnimas

complicaes. A puno para a obteno do LCR esta contra indicada em

condies clnicas como23,34:

1) Hipertenso intracraniana

2) Terapia com anticoagulates;

3) Doenas sistmicas que interferem com a coagulao;

4) Processos inflamatrios infiltrativos (infeces, neoplasias) da pele

ou do trajeto da rea de puno;

5) Patologias degenerativas ou malformaes da coluna lombar;

6) Condies estruturais devido manipulao cirrgica;

7) Sinais de leses compressivas medulares, com risco de agravar o

dficit neurolgico;

2.4 A anlise do LCR

A coleta do LCR facilmente realizada e fundamental para o

diagnstico das doenas infecciosas, inflamatrias e neoplsicas.

A metodologia adequada para anlise do LCR, com estudo em paralelo

do soro, encontra-se esquematizada na Figura 3.


Figura 3. Organograma da anlise do lquido cefalorraquidiano (Adaptado de Zettl UK, Tumani H, 2005

11)


A rotina da anlise do LCR deve conter11,23,34:

2.4.1 Exame fsico

1) Medida de presso antes e aps a coleta;

Valor de referncia (VR): 5 a 25 cm de H2O, paciente deitado para a

presso inicial e 50% desse valor para a presso final;

2) Aspecto VR: lmpido, transparente;

3) Cor VR: incolor.

2.4.2 Exame citolgico

1) Citologia global VR: at 4 clulas/mm3, ausncia de hemcias;

2) Citologia diferencial VR: perfil linfomonocitrio, com expressivo

predomnio de linfcitos (80 a 90%);

3) Imunocitologia VR: ausncia de linfcitos ativados, neutrfilos,

eusinfilos, plasmcitos, clulas atpicas ou neoplsicas;

2.4.3 Exame qumico de rotina

1) Protenas totais VR: 15 a 40 mg/dl lombar; 15 a 27 mg/dl

subocipital;

2) Glicose VR: 50 a 70% da glicemia;


3) Lactato VR: 9 a 19mg/dl;

4) Reaes de Pandy e Takata-Ara VR: negativa;

5) Pesquisas com pouca utilidade prtica, mas que podem ser

incorporadas na rotina: cloreto; uria; atividade enzimtica de TGO,

DHL, ADA.

2.4.4 Anlise quantitativa das protenas2,3,11,34 :

2.4.4.1 A albumina

A avaliao da funo da barreira hemato-LCR (termo mais

apropriado para este contexto) consiste na anlise da razo LCR/soro de

albumina, uma vez que esta protena no produzida ou catabolizada no

SNC, e com isto se torna um marcador de permeabilidade. A coleta

conjunta, para anlise em paralelo do LCR e soro, necessria para

determinar o quociente de albumina. A anlise realizada por nefelometria.

O valor de referncia deve ser avaliado na dependncia da idade do

paciente:

1) < 5 x 10-3 at 20 anos;

2) < 6,5 x 10-3 at 40 anos;

3) < 8,0 x 10-3 acima de 40 anos.


2.4.4.2 As imunoglobulinas2,3,11,34

A anlise da IgG parte essencial do programa bsico de pesquisa. A

anlise da IgA e IgM fornecem informaes adicionais no diagnstico de

doenas inflamatrias agudas do SNC.

Assim como na albumina, a coleta conjunta e o estudo em paralelo do

LCR e do soro so condies essenciais. Os valores de referncia para o

quociente de IgG so dependentes da integridade da barreira hemato-LCR e

com isto no h efetividade a tentativa de estipular valores.

Para uma correta interpretao deve ser correlacionado o quociente de

IgG com o quociente de albumina, razo esta determinada como ndice de

IgG:

Quociente de IgG

ndice de IgG = VR: < 0,8

Quociente de Alb

A melhor avaliao orientada pela aplicao de grficos de razes

empricas (normogramas), nos quais a razo LCR/soro de IgG, IgA e IgM

so correlacionados com o quociente de albumina, que parmetro de

funo da barreira (Figura 4).


Figura 4. Normograma de acordo com Reiber e Felgenhauer

29

Nesta representao grfica poderemos constatar no somente a

presena de imunoglobulinas no SNC, mas tambm correlacion-las com as

imunoglobulinas do soro (Q IgG), e desta forma excluir a passagem passiva

pela barreira hemato-LCR. Ainda existe a correlao da concentrao da

albumina no LCR com a do soro (Q Alb), que marcador de integridade da

barreira hemato-LCR29.

A concentrao de albumina no LCR sofre influncia com a idade do

paciente. O grfico mostra o incio da quebra de barreira conforme essa

variante.


No grfico de razes emprica podemos identifica cinco padres

especficos29 :

I. Normal

II. Sntese intratecal de IgG (padro encontrado na EM);

III. Leve disfuno da barreira hemato-LCR (p.ex. sndrome

de Guillain Barr);

IV. Combinao de II e III (p. ex. neuroborreliose)

V. Severa disfuno da barreira hemato-LCR (p. ex.

meningite purulenta)

Quase todas as doenas inflamatrias do SNC so primariamente

caracterizadas pela sntese de IgG, e por isso essa sntese no

patognomnica de uma determinada patologia. Para isso deve ser

complementado o estudo com a pesquisa de anticorpos especficos,

utilizando mtodos apropriados34.

2.4.5 Anlise qualitativa das protenas pesquisa de bandas oligoclonais

(BOC)

Tcnicas de anlise qualitativa, baseadas em procedimento

eletrofortico, so de grande sensibilidade para investigar a produo


intratecal de imunoglobulinas, indicando atividade clonal restrita de

clulas B2,3,8,11,34.

Diversos mtodos e modificaes, com graus variados de sensibilidade

e especificidade, tm sido descrito para a demonstrao de BOC no LCR. A

eletroforese de protenas em gel de agarose, Agar gel e acetato de celulose

so mtodos que requerem grande volume de LCR, que deve ser

concentrado e ultrafiltrado. Uma parcela expressiva de protenas pode ser

perdida durante esse processo, ou tambm perder sua propriedade

migratria3.

A mais vlida tcnica atualmente utilizada a focalizao isoeltrica

(FIE)3,13,34. Esta tcnica consiste na formao de um gradiente de ph, que

gerado e mantido no gel por anflitos sintticos (tampes que aderem

agarose e que tm pontos isoeltricos diferentes). Protenas no

concentradas do LCR, colocadas neste gradiente, iro migrar

eletroforeticamente at que alcancem seus pontos isoeltricos, onde as

protenas sero focadas. A FIE ainda permite que pequenas quantidades de

protenas se concentrem em bandas justas.

Alm da tcnica de separao das protenas, os mtodos de

visualizao das imunoglobulinas assumem especial importncia3,8,11,13.

As tcnicas de imunodeteco so atualmente mais empregadas, por

serem mtodos que visualizam especificamente bandas de IgG. Outras

tcnicas, como a impregnao pela prata, mesmo utilizando a FIE,

visualizam todas as classes de imunoglobulinas (IgA, IgM, IgD), cadeias


livres de kappa leve ou lambda, alm de outras protenas derivadas do SNC

que eventualmente estejam presentes na faixa das imunoglobulinas,

podendo fornecer falsos positivos3,44.

A definio de presena de BOC consiste na comprovao da

presena de dois ou mais clones de imunoglobulinas presentes no LCR e

ausentes no soro. Na anlise dos resultados, seis diferentes padres so

encontrados (Figura 5)8,11,13 :

Figura 5 Interpretao dos resultados das bandas oligoclonais de imunoglobulinas (IgG)


Os padres dos resultados da pesquisa de BOC so:

I. Nenhuma banda de IgG no LCR;

II. BOC restritas ao LCR;

III. BOC restritas ao LCR com adicionais bandas idnticas no

LCR e soro;

IV. Padres de bandas idnticos no LCR e soro;

V. Bandas monoclonais no LCR e soro;

VI. Bandas de IgG apenas no soro.

Apenas os padres II e III representam sntese intratecal de IgG.

No ltimo painel internacional de especialistas, para consenso e

recomendaes da anlise do LCR13, considerou-se a FIE seguido do

immunoblotting a tcnica padro ouro para a pesquisa de BOC.

A grande utilidade deste mtodo levou a sua incluso nos critrios de

diagnstico da EM12. Deve ser considerada a condio de que nas

populaes de alta prevalncia da doena, a pesquisa de BOC tem uma

sensibilidade em torno de 95%3,11,13. Torna-se um marcador do processo

inflamatrio da EM que permite utiliz-lo como recurso diagnstico

imprescindvel.

Quando positivo em pacientes com sndrome clnica isolada (CIS)

possvel concluir que a leso observada na imagem de ressonncia


magntica (IRM) decorrente de um processo inflamatrio, direcionando o

diagnstico da EM14.

Tintor M, et al (2008)36 descrevem uma coorte de 113 pacientes,

acompanhados por um perodo de 45 meses. Pacientes com CIS e ausncia

de leses a IRM apresentam nesse perodo 23% de converso para EM,

quando as BOC estavam presentes, e apenas 4% evoluem para EM, quando

as BOC estavam ausentes. Quando as leses a IRM estavam presentes, o

estudo das BOC aumentou consideravelmente a sensibilidade para o

diagnstico. A pesquisa ainda concluiu que as CIS com presena de BOC

tm a chance dobrada de apresentaram um segundo surto, independente-

mente das IRM.

2.5 Alteraes do LCR na EM

A EM no possui um marcador patognomnico, clnico ou paraclnico,

que fornea prova inequvoca da doena13.

A anlise do LCR, contudo, pode fornecer uma combinao de

diversas caractersticas fsicas, qumicas e citolgicas, que em conjunto

fornecem grandes subsdios para o diagnstico.

Na EM descrito um padro relativamente constante de alteraes, em

relao ao que ocorre em outras doenas inflamatrias:


1) O nmero de clulas costuma ser normal ou pleocitose discreta,

geralmente abaixo de 30 clulas/mm3, com predomnio absoluto de

clulas linfomononucleares3,11;

2) O teor de protenas totais costuma ser normal ou apresentar

aumento discreto, geralmente abaixo de 70 mg/dL8,37 ;

3) O quociente de albumina frequentemente normal (abaixo de 8 x

10-3) ou levemente aumentado (entre 8 - 10 x 10-3), indicando

ausncia ou discreta disfuno da barreira hemato-LCR11,37 ;

4) Existe sntese aumentada de IgG intratecal, constada por provas

quantitativas (ndice de IgG, diagrama de razes empricas), que

permanece inalterada durante todo o curso da doena3,38;

5) A sntese de imunoglobulinas IgA e IgM podem estar presentes na

EM, porm nunca devem ser dominantes2,39,40;

6) A sntese aumentada de IgG tambm constatada pela presena de

BOC restritas ao LCR13.

Em acrscimo, a EM costuma revelar um padro peculiar de

apresentao das BOC:

1) As BOC no desaparecem durante todo o curso clnico da doena3,8;

2) As BOC no apresentam relao com os perodos de exacerbao

dos sintomas clnicos8,11;


3) No habitual a presena de BOC simultaneamente no LCR e no

soro, mesmo que seja identificado maior nmero de bandas no

LCR8,41;

4) detectado maior nmero de BOC, em comparao com outras

doenas inflamatrias do SNC11,41 ;

Achados diferentes devem suscitar dvidas quanto ao diagnstico da

EM, devendo o investigador insistir na procura de outras doenas.

2.6 A demografia e a interpretao dos resultados

So registradas grandes variaes, nas diferentes populaes, quanto

frequncia de BOC em pacientes com EM.

Nos pases nrdicos europeus descrito a sensibilidade das BOC para o

diagnstico da EM que oscila entre 90 a 95%14,19,42,43,44, enquanto que no sul

europeu nota-se certa reduo de sua frequncia, variando entre 65 a

90%20,45,46,47,48,52,53. Esta tendncia tambm se registra na Amrica do Norte,

onde Canad60 e norte dos Estados Unidos41 so descritas maior frequncia da

doena do que no sul dos Estados Unidos64. No encontramos trabalhos de

frequncia de BOC descritos no Mxico. Em pases orientais como Japo6,56,58

e China21,55, a frequncia de BOC tende a ser menor, variando entre 40 a 70%.

Poucos estudos, elaborados com metodologias apropriadas, so

relatados em outras partes do mundo. Registros mostram a tendncia de


declnio, em comparao com as reas de alta prevalncia da doena, com

freqncias de 40% no Lbano57,30% na ndia59 e 3% em Formosa63(Tabela 1).

Tabela 1. Estudo da presena de BOC em pacientes com EM em diferentes populaes.

% de BOC +

Pais Mtodo EM DNI Controle Referncias

Noruega FIE IF 100% 9% Lunding J et al 200019

ustria FIE IB 99% 68% 70% Mayringer I et al 200579

Srvia e Mont. FIE IF 96% Drulovic J et al 199542

Eslovnia FIE IF 95% Rot et al 200814

Noruega FIE IB 93% 67% 4% Mygland A et al 200743

EEUU FIE IB 90% 15% Fortini AS et al 200341

Dinamarca FIE IB 89% 25% 0% Sellebjerg F et al 199644

Canad FIE IF 89% Siritho S et al 200960

Itlia FIE 89% Annunziata P et al 200645

Espanha FIE IB 87% 52% 17% Falip M et al 200120

Frana FIE 85% 21% 8% Bourahoui A et al 200446

Turquia FIE IP 86% Idiman E et al 200947

Portugal FIE IF 82% 40% 3% S MJ et al 200548

frica do Sul NR 82% Bhighee A et al 200749

Rep. Checa FIE IB 81% 7% Bednarova et al 200550

Frana FIE IF 78% 7% Fromont A et al 200552

Holanda FIE IF 77% Koch M et al 200751

Espanha FIE IP 74% 0% Mir J et al 199253

Austrlia FIE 66% 23% Wu JS et al 200854

China FIE IP 63% 47% 4% Li B et al 200755

Japo FIE IF IP 56% Fukazawa et al 19986

Japo FIE EGA 55% Nakashima I et al 200256

China NR 40% Lau KK et al 200221

Lbano NR 40% Yamout B et al 200857

Japo FIE 33% Tanaka K et al 200558

ndia NR 30% Syal P et al 199959

Tailndia NR 21% Siritho S et al 200761

Cingapura NR 21% Das A 199862

Formosa FIE 7% 0% Chang KH et al 200663

Legendas: BOC (bandas oligoclonais); DNI (doenas neurolgicas inflamatrias); FIE (focalizao isoeltrica); IB (immunoblotting); IF (imunofixao); IP (impregnao pela prata); EGA (eletroforese em gel de agarose); NR (no referido).


No Brasil, dois estudos de Puccioni-Sohler M, et al (1999)65 (2001)66,

descrevem em ambos a frequncia de 85% de BOC, em pacientes com EM.

Brando CO et al, tambm em dois trabalhos (2005)67 (2006)68, registram a

frequncia de 91% e 84% respectivamente. Alves-Leon SV, et al (2008) j

registram menor frequncia de BOC, 64% em uma srie carioca de

pacientes com EM.

Resultados mundiais to divergentes provavelmente se devem a um ou

mais dos seguintes fatores:

2.6.1 Variaes na apresentao clnica ou fase evolutiva da EM.

A fase evolutiva pode influenciar o aparecimento de BOC. descrita a

frequncia de 30 a 60% de BOC em pacientes com o primeiro episdio

desmielinizante, ou CIS14,36. Crticas podem ser tecidas neste contexto, uma

vez que nesta condio, o diagnstico da EM ainda no est estabelecido, e

as manifestaes sindrmicas podem corresponder a outras entidades

nosolgicas.

As formas clnicas da EM tambm podem influenciar no estudo de

BOC. Algumas entidades sindrmicas podem manifestar diferenas

fisiopatognicas com a forma clssica da EM, e podem mascarar os

resultados. Exemplo disto a forma ptico espinal da EM, descrita em

pases orientais. descrito baixa frequncia de BOC nessa forma

clnica56,69,70. Quando pacientes com esse diagnstico so includos com


pacientes portadores da forma clssica da EM, a frequncia de BOC nessas

amostras tende a baixar.

2.6.2 Constituio gentica de cada populao, com maior ou menor grau de

miscigenao.

A susceptibilidade gentica um fator reconhecido no

desencadeamento da EM1,4,5,6. Uma vez que este fator influencia os

mecanismos fisiopatognicos, plausvel esperar que marcadores de

atividade inflamatria possam tambm sofrer influncias5,6,70.

Estudos em pases orientais confirmam a baixa frequncia de BOC,

registrada naquelas populaes. A Tabela 1 mostra estes dados.

Os afrodescendentes tambm apresentam uma proteo gentica

para o desencadeamento da EM. Baixos so os registros da doena em

pases africanos49, na populao afrodescendente europia71, norte

americana5,72,73,74,75 e sul americana76. De especial interesse so as

manifestaes clnicas evolutivas desses pacientes, que apresentam uma

forma mais agressiva da doena74,75,76,77.

Diante destas manifestaes clnicas, tambm aceitvel esperar

diferenas nos marcadores de inflamao. Rinker JR et al (2007)72, em um

estudo norte americano, descrevem que apesar de baixa incidncia de

afrodescendentes portadores de EM, existe uma maior concentrao de

imunoglobulinas no LCR desses pacientes, mensuradas por tcnicas


quantitativas (ndice de IgG e razo de sntese de IgG) e pela maior

presena de BOC.

2.6.3 Diferenas na metodologia de pesquisa.

Para o estudo de BOC, ainda no possvel automatizar os resultados.

A leitura da focalizao isoeltrica das protenas do LCR e do soro feita

visualmente. Por isso, o momento da leitura um evento de suma

importncia, no devendo sofrer qualquer forma de influncia que possa

modificar os resultados3,11,34.

Contrariamente a alguns exames subsidirios, em que dados

semiolgicos podem contribuir com a interpretao dos resultados, a leitura

de BOC deve ser isenta de qualquer forma de informao3.

No que se refere pesquisa clnica, esta orientao ainda se torna

mais incisiva e at certo ponto bvia. A metodologia dos ensaios clnicos

deve possuir um rigor que garanta no s a anlise cega das amostras de

LCR, como tambm no oposto da pesquisa, a seleo de candidatos no

deve ser influenciada pelos resultados dos estudos do LCR.

A no observao destas recomendaes, inevitavelmente levar a

vieses que influenciaro os resultados.

2.6.4 Diferentes tcnicas de anlise do LCR empregadas


Como descrito anteriormente, existem vrios mtodos baseados em

procedimento eletrofortico para constatao da presena de BOC. Alm

dos mtodos de separao, as tcnicas de visualizao das protenas

tambm possuem grande importncia. Diversas revises sobre o assunto

constatam diferentes graus de sensibilidade e especificidade nas diversas

tcnicas19,43,52,78,79,81.

Reunio de consenso de especialistas em painel internacional

recomenda a tcnica da FIE seguida do immunoblotting13.

Os diferentes mtodos aplicados nos diferentes ensaios clnicos podem

explicar a grande variabilidade dos resultados.

3 OBJETIVOS

Objetivos 50

3. OBJETIVOS

1. Determinar a sensibilidade do estudo de BOC para o diagnstico da

EM, utilizando a tcnica da focalizao isoeltrica seguida do

immunoblotting, em pacientes atendidos em Hospital Universitrio de

So Paulo, servio de referncia para diagnstico e tratamento da

EM;

2. Determinar a especificidade desse mtodo, comparando com dois

grupos controles: doenas neurolgicas inflamatrias e pacientes

sem doenas neurolgicas.

3. Comparar esses resultados com caractersticas clnicas e

demogrficas dessa populao.

4 CASUSTICA E MTODOS

Casustica de Mtodos 52

4. CASUSTICA E MTODOS

O presente estudo clnico - laboratorial foi realizado a partir da seleo

de pacientes admitidos do Ambulatrio de Doenas Desmielinizantes do

Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So

Paulo (HC-FMUSP) e do centro cirrgico dessa mesma instituio, durante o

mesmo perodo.

Os pacientes foram divididos em quatro grupos:

Grupo 1: Pacientes portadores de EM, em suas quatro formas clnicas.

Grupo 2: Pacientes que apresentaram o primeiro episdio clnico

indicativo de evento desmielinizante ou CIS.

Grupo 3: Grupo controle de pacientes com doenas neurolgicas

inflamatrias.

Grupo 4: Grupo controle de pacientes sem queixas neurolgicas,

admitidos na clnica cirrgica, e que se submeteram a pequenas cirurgias

que exigiram anestesia raquidiana.

4.1 Critrios de incluso e excluso


4.1.1 Critrios de incluso para o grupo de pacientes portadores de EM e

CIS:

1) Sinais e sintomas neurolgicos compatveis com diagnstico clnico

de EM ou CIS, segundo critrios do painel internacional de

McDonald, revisado em 2005.

2) Confirmao por meio de IRM, conforme protocolo de imagem da

pesquisa.

3) Ausncia de doenas infecciosas ou outras doenas inflamatrias,

rastreada com exames subsidirios, conforme protocolo da

pesquisa.

4.1.2 Critrios de incluso para o grupo de pacientes portadores de doenas

neurolgicas inflamatrias (DNI):

1) Os pacientes devem apresentar sinais e sintomas neurolgicos

compatveis com diagnstico clnico de DNI classificadas como:

a) Neuromielite ptica ou doena de Devic;

b) Encefalomielite disseminada aguda ou ADEM;

c) Mielopatia inflamatria monofsica ou recorrente;

d) Neurite ptica recorrente;

e) Vasculite primria do SNC ou secundria a doenas do

colgeno;

f) Infeces crnicas do SNC.


2) Os pacientes devem apresentar exame de IRM compatvel com

DNI, conforme previsto no protocolo da pesquisa.

3) Os pacientes devem apresentar exames laboratoriais que suportem

o diagnstico de DNI, conforme previsto no protocolo da pesquisa.

4.1.3 Critrios de incluso do grupo de pacientes com ausncia de doenas

neurolgicas.

1) Ausncia de sinais de envolvimento do SNC;

2) Ausncia de infeces sistmicas.

4.1.4 Critrio de excluso

Critrio de excluso usado para todos os pacientes:

Ter realizado anteriormente exame de LCR, com pesquisa de BOC.

A anuncia para a realizao do estudo por parte dos pacientes, ou seus

responsveis legais (para pacientes menores de idade ou sem condies

neurolgicas de compreender os termos do estudo), foi obtido mediante a

assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido Para pacientes do

ambulatrio de doenas desmielinizante foi utilizado o Anexo 1 e para

indivduos do grupo controle foi utilizado o Anexo 2.


4.2 Protocolo da avaliao clnica para pacientes portadores de EM

As informaes sobre os dados demogrficos, quadro clnico e

evolutivo dos pacientes portadores de EM foram coletados seguindo o

Protocolo Clnico Pr-Estabelecido (Anexo 3):

4.2.1 Dados demogrficos

Foram coletadas informaes sobre:

1) Idade;

2) Gnero;

3) Naturalidade e procedncia;

4) Grupo tnico.

Devido ao alto grau de miscigenao da nossa populao, a distino

da etnia um assunto muito complexo. O mtodo utilizado para esta

pesquisa foi o preconizado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

(IBGE)80, aplicado desde o Censo de 2000. Para a distino de raa/cor

(termo melhor empregado) os pacientes se autodeclararam de cor:

a) Amarela;

b) Branca;

c) Indgena;


d) Parda;

e) Preta.

4.2.2 Quadro clnico

O quadro clnico envolveu:

1) Idade ao incio dos primeiros sintomas;

2) Modo de incio: monossintomtico ou polissintomtico;

3) Sintomas iniciais: foram coletadas informaes sobre a presena

dos sintomas neurolgicos da primeira manifestao: dficit motor;

sensitivo; cerebelar; tronco enceflico; esfncteres; sintomas da

neurite ptica e sintoma de Lhermitte;

4) Sintomas no curso da doena: os acima pesquisados alm de:

fadiga; intolerncia ao calor; dor; crises espsticas; sintoma de

Uhthoff; depresso; declnio cognitivo e psicose;

5) Forma evolutiva da doena: recorrente-remitente; secundariamente

progressiva; primariamente progressiva; progressiva recorrente;

6) Durao da doena: considerado tempo decorrente entre a idade ao

incio dos sintomas e a idade ao ltimo exame;

7) Intervalo entre o primeiro e o segundo surto;

8) Nmero de surtos durante o primeiro ano; durante os trs primeiros

anos; durante os cinco primeiros anos;


9) Tempo de converso entre as formas recorrente-remitente e

secundariamente progressiva;

10) Grau de incapacidade ao ingresso na pesquisa, medido pela escala

de status da incapacidade expandida de Kurtzke (EDSS) fora do

surto;

11) Intervalo entre os primeiros sintomas e o grau de incapacidade:

tempo para atingir os graus de incapacidade: EDSS 4; EDSS 6;

EDSS 7 e EDSS 8;

12) Tratamento profiltico: se o paciente faz uso de tratamento

profiltico e ano de incio;

13) Tratamento profiltico utilizado:

a) Imunomoduladores: betainterferona Ia 30mc/semana;

betainterferona Ia 22mc ou 44mc/3x por semana;

betainterferona Ib 8 MUI dias alternados; acetato de glatirmer

20mg diariamente;

b) Imunossupressores: corticosterides; azatioprina; metotrexate;

mitoxantrone; ciclofosfamida; imunoglobulina.

14) Formas familiares: presena ou no de formas familiares da

doena e grau de parentesco do acometido: irmo; pais; filhos;

primos de primeiro grau; tios/sobrinhos.


4.3 Protocolo da avaliao clnica para pacientes portadores de DNI

Para o grupo de pacientes portadores de DNI foram pesquisados:

4.3.1 Dados demogrficos:

1) Idade;

2) Gnero;

3) Grupo tnico: determinado de acordo com a autodeclarao dos

pacientes80 em cor:

a) Amarela;

b) Branca;

c) Indgena;

d) Parda;

e) Preta;

4.3.2 Histria clnica:

1) Tempo de incio dos primeiros sintomas;

2) Primeiros sintomas;

3) Sintomas no decorrer da doena;

4) Tempo de evoluo da doena;

5) Histria familiar.


4.3.3 Exame fsico neurolgico.

O exame fsico neurolgico foi realizado seguindo a rotina do

ambulatrio de doenas desmielinizantes do HC-FMUSP.

4.4 Protocolo dos pacientes do grupo controle

Os constituintes deste grupo foram recrutados entre aqueles pacientes

que se submeteram a anestesia raquidiana para procedimentos cirrgicos

diversos no centro cirrgico do HCFMUSP. Foram excludos pacientes com

quadros infecciosos.

4.5 Protocolo de exames complementares.

Na primeira avaliao foram solicitados exames complementares para

apoiar o diagnstico da EM e para excluso de doenas passveis de

diagnsticos diferenciais17,18. O protocolo investigativo tambm direcionou a

confirmao do diagnstico de DNI.


4.5.1 Os exames bioqumicos e sorolgicos solicitados foram:

1) Hemograma;

2) Velocidade de hemossedimentao;

3) Uria e creatinina;

4) Transaminases,

5) Bilirrubinas totais e fraes;

6) Glicemia;

7) Clcio;

8) Tiroxina livre e hormnio treo-estimulante;

9) Protena C reativa;

10) Fator antincleo e suas fraes quando alterado;

11) Prova do ltex,

12) Fraes 3 e 4 do complemento,

13) Anticorpos anticardiolipina das classes IgM e IgG;

14) Pesquisa do anticoagulante lpico;

15) Dosagem de cianocobalamina e folato;

16) Imunologia para sfilis,

17) Imunologia para hepatite B e C,

18) Imunologia para o HIV;

19) Imunologia para o HTLV.


20) Exames adicionais foram solicitados em casos especficos, quando

necessrio.

4.5.2 Exame de neuro-imagem

Os pacientes foram submetidos a exame de IRM convencional,

realizada no plano axial e pesadas em T1, T2 e FLAIR, e coletadas imagens

aps administrao de contraste paramagntico (gadolnio), pesadas em T1.

Os resultados dos exames foram analisados por radiologistas

especializados em neuroimagem e posteriormente reavaliados diante do

quadro clnico dos pacientes.

Foram utilizados os seguintes parmetros para avaliao de imagem:

1) Para o diagnstico de EM ou CIS as imagens devem seguir os

critrios de Barkhoff, conforme previstos nos critrios de diagnstico

revisados de 200512 (Tabela 2).

2) Para o diagnstico de DNI, as imagens:

a) No devem preencher os critrios de Barkhoff;

b) Podem revelar sinais de atividade inflamatria, com quebra da

barreira hemato-enceflica, constatada pela captao de

gadolnio;

c) Devem ser condizentes com os seis diagnsticos descritos nos

critrios de incluso, em conjunto denominados de DNI.


Tabela 2. Imagens de ressonncia magntica no diagnstico da esclerose mltipla

_____________________________________________________ 3 de 4 critrios:

1 leso Gd-captante ou 9 leses hiperintensas em T2 no Gd-captante

1 ou mais leses infratentoriais

1 ou mais leses justacorticais

ou mais leses periventriculares

OBS.:

uma leso medular equivale a uma leso infratentorial;

uma leso medular captante equivale a uma leso cerebral captante;

uma leso medular pode ser somada s leses cerebrais para alcanar o nmero de leses em T2

_____________________________________________________

critrios de Barkhoff, revisados em 200512

4.5.3 Protocolo de anlise das variantes clssicas do LCR

O estudo do LCR foi solicitado aps preenchimentos dos critrios

clnicos e de IRM que confirmaram o diagnstico.

O exame do LCR foi realizado de acordo com a rotina clssica:

1) Exame fsico: aspecto; cor;

2) Exame citolgico: contagem global e diferencial de clulas;

3) Exame qumico: glicorraquia; dosagem de lactato; protenas totais;

reao de Pandy e Takata-Ara;


4) Reaes imunolgicas para cisticercose; sfilis; HTLV; HIV e

toxoplasmose;

5) Em casos especficos frente a suspeita clnica, foram solicitadas

reaes imunolgicas especficas, pesquisa de material antignico e

PCR.

4.5.4 Protocolo para a anlise quantitativa das protenas do LCR

Em todos os pacientes foram feitos exames simultneos de LCR e de

soro sanguneo. O sangue foi coletado no momento da puno lombar.

Foram feitos estudos para investigao de imunoproduo intratecal

quantitativa de IgG. Para tanto, foram determinadas as concentraes por

nefelometria de IgG e de albumina, no soro e no LCR. A seguir, foram

determinados:

1) Os quocientes de albumina e de IgG (razo entre os teores dessas

variveis no LCR e no soro) e considerado elevado quando:

a) 5 x 10-3 para idade inferior a 20 anos;

b) 6,5 x 10-3 para idade inferior a 40 anos;

c) 8 x 10-3 quando a idade do paciente superava os 40 anos.

2) O ndice de IgG (razo entre os quocientes de IgG e de albumina):

considerado elevado quando igual ou superior a 0,8;

3) O nomograma de Reiber e Felgenhauer.


4.5.5 Protocolo para a anlise qualitativa das protenas do LCR: a pesquisa

de BOC.

Foram utilizadas duas tcnicas para a determinao das BOC:

1) Eletroforese em gel de agarose (Helena Laboratories, Beaumont,

Tx, fitas de acetato marca Erviegas, corante Amido Schwartz);

2) Focalizao isoeltrica (FIE) em gel de polyacrilamida (ETC

Elektrophorese Technok Bahnhofstr), seguida de immunoblotting.

O estudo da FIE seguiu critrios rigorosos de qualidade em

conformidade com as diretrizes e recomendaes de especialistas em painel

internacional (Freedman M et al, 200513), e seguiram as seguintes etapas:

Cada amostra de LCR e de soro sanguneo foi realizada FIE em

aparelho CWP-400 Isolab Inc. Em cada corrida havia uma amostra-controle

positiva.

Aps o trmino da isofocalizao, as protenas foram transferidas para

uma membrana de nitrocelulose (Bio Agency). A deteco das BOC foi

realizada atravs do mtodo de immunoblotting utilizando: um anticorpo

primrio (Goat-anti-human IgG, Sigma) e um anticorpo secundrio (policlonal

rabbit anti-goat immunoglobulins, Dako Cytomation). Posteriormente, foi feita

a revelao com 3-amino-9-etilcarbazole (Sigma).


A deteco das BOC foi considerada positiva quando existiam duas ou

mais faixas de concentrao na frao das imunoglobulinas, estando elas

ausentes no soro.

Para maior confiabilidade, a leitura dos resultados foi realizada por dois

examinadores que desconheciam o grupo a que pertenciam as amostras de

LCR e sangue. Havendo dvidas ou divergncias quanto interpretao de

determinado resultado, a amostra em questo era processada novamente,

com nova leitura.

4.6 Fluxograma do atendimento mdico

Todos os pacientes foram atendidos no ambulatrio de Doena

Desmielinizante do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo.

A anamnese e o exame fsico foram feitos por ocasio da primeira

consulta, sempre pelo mesmo pesquisador, e reavaliados por um segundo

pesquisador, ambos neurologista com experincia no diagnstico de

doenas desmielinizantes.

Aps a anamnese os pacientes eram encaminhados para realizao de

exames qumicos e sorolgicos no Laboratrio Central do HC-FMUSP e IRM

realizado no Departamento de Radiologia do HC-FMUSP. Para o estudo de

IRM foram tambm utilizados outros servios de imagem da regio.


O exame de LCR foi colhido por um nico mdico neurologista, do

laboratrio de LCR do HC-FMUSP, onde foram realizadas provas de rotina.

Frao de cada amostra foi encaminhada para o laboratrio do Centro de

Investigaes em Neurolgica da FMUSP para realizao da eletroforese de

protenas convencional e FIE. Outra frao de LCR foi encaminhada para o

laboratrio Fleury para realizao da nefelometria para dosagem de

protenas.

Aps a confirmao do diagnstico os pacientes receberam a

programao teraputica apropriada, com acompanhamento conduzido

segundo a rotina do servio.

4.7 Anlise estatstica:

4.7.1 Testes da validade

Foram calculadas a sensibilidade e a especificidade do mtodo de

deteco de BOC para o diagnstico da EM.

Considerou-se como grupo pesquisado o grupo 1 (pacientes

portadores de EM) e, como controles, outros dois grupos: o grupo 3

(doenas neurolgicas inflamatrias) e o grupo 4 (ausncia de doenas

neurolgicas).


Conceituamos como:

1) Verdadeiros positivos (VP) - pacientes com BOC positivas e

diagnstico de EM;

2) Verdadeiros negativos (VN) - pacientes com BOC negativas nos dois

grupos controles, calculados separadamente;

3) Falsos positivos (FP) - pacientes com BOC positivas dos grupos

controles, tambm calculados separadamente;

4) Falsos negativos (FN) - pacientes com BOC negativas e diagnstico

de EM.

Clculos da validade:

1) A sensibilidade foi calculada utilizando a razo VP/VP+FN;

2) A especificidade pela razo VN/VN+FN;

3) O preditor positivo pela razo: VP/VP+FP;

4) O preditor negativo pela razo: VN/VN+FN;

5) A acurcia pela razo: VP+VN/VP+VN+FP+FN.

4.7.2 Estatstica descritiva:

1) Frequncias e porcentagens de BOC vs gnero, etnia e formas

clnicas da EM;

2) Estatsticas sumrias do ndice de IgG vs gnero, etnia e formas

clnicas;


3) Estatsticas sumrias do ndice de IgG vs BOC;

4.7.3 Inferncia estatstica:

1) Testes de homogeneidade de BOC ou vs etnia, gnero e formas

clnicas:

a) A estatstica do teste de homogeneidade utilizado foi o X2 de

Pearson, com 1 e 3 graus de liberdade.

b) A rejeio da hiptese H0 foi verificada quando p-valor (p) do

teste for menor que o nvel de significncia do teste (

2) Testes de associao das tabelas de classificao cruzada:

a) O teste estatstico utilizado em tabelas de classificao cruzada

foi o teste de Cochran-Mantel e Haenzel (CMH).

b) A estatstica do teste CMH foi o X2 de Pearson, com 1 grau de

liberade.

3) O testes de comparao de mdias do ndice de IgG segundo

etnia, gnero, formas clnicas vs BOC foi o teste t de Student.

4) O teste de comparao de mdias de IgG segundo formas clnicas

em 4 nveis foi o teste F de Snedecor.

4.7.4 Software utilizados

1) Minitab statistical sofware verso 14

2) Microsoft Office Home verso 2007


4.8 Aspectos ticos

O projeto de pesquisa do presente estudo teve a aprovao da

Comisso de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo. A aprovao do estudo de

pacientes do ambulatrio de doenas desmielinizantes encontra-se no

Anexo 6, e a do grupo de indivduos sem doenas neurolgica encontra-se

no Anexo 7.

RESULTADOS

Resultados 71

5. RESULTADOS

O presente estudo clnico - laboratorial selecionou 145 pacientes

admitidos consecutivamente no perodo de agosto de 2005 a janeiro de 2008

no Ambulatrio de Doenas Desmielinizantes do Hospital das Clnicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (HC-FMUSP) e de 19

indivduos admitidos no centro cirrgico dessa mesma instituio, durante o

mesmo perodo. A distribuio da casustica resultou:

1) 90 pacientes com EM em suas quatro formas clnicas;

2) 16 pacientes com CIS;

3) 39 pacientes com doenas neurolgicas inflamatrias;

4) 19 pacientes sem queixas neurolgicas.

5.1 Dados demogrficos

5.1.1 Idade

Resultados 72

As idades dos 164 pacientes que ingressaram nesta pesquisa assim

se distribuiram:

1) No grupo de pacientes portadores de EM, a idade variou de 15 a 64

anos, com mdia de 35,6 12,1 anos e mediana de 34 anos.

2) No grupo de pacientes portadores de CIS, a idade variou de 17 a 37

anos, com mdia de 25,4 8,2 anos e mediana de 25 anos.

3) No grupo de pacientes portadores de doenas neurolgicas

inflamatrias, a idade variou de 21 a 54 anos, com mdia de 31,5

18,4 anos e mediana de 30 anos.

4) No grupo controle a idade variou de 23 a 63 anos, com mdia de 39,2

16,2 anos e mediana de 38 anos.

5.1.2 Gnero

1) Dos 90 pacientes portadores de EM, 67 (74,4%) eram do sexo

feminino. A razo feminino/masculino foi de 2,9/1.

2) Dos 16 pacientes portadores de CIS, 11 (68,7%) eram do sexo

feminino, A razo feminino/masculino foi de 2,2/1.

3) Dos 39 pacientes portadores de doenas neurolgicas inflamatrias,

27 (69,2%) eram do sexo feminino. A razo feminino/masculino foi de

2,3/1.

Resultados 73

4) Dos 19 pacientes do grupo controle, 13 (68,4%) eram do sexo

feminino. A razo feminino/masculino foi de 2,2/1.

5.1.3 Etnia

Da totalidade dos pacientes portadores de EM estudados, 65 se

autodeclararam de cor branca, 17 parda, 7 preta e um paciente de cor

amarela. No houve nenhum que se autodeclarou indgena (Figura 6).

Figura 6 - Distribuio da etnia nos diversos grupos de pacientes.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Esclerose Mltipla Doenas Inflamatrias

Controle

72,2%

54,4%63,2%

18,9%

28,2%26,3%

7,8%12,8%

10,5%

1,1% 2,6%

branca parda negra amarela

Resultados 74

5.2 Quadro clnico

5.2.1 Formas clnicas

As formas clnicas dos 90 pacientes portadores de EM se distriburam em:

1) remitente recorrente (RR) 61 pacientes;

2) secundariamente progressiva (SP) 11 pacientes;

3) primariamente progressiva (PP) 16 pacientes e;

4) progressiva recorrente (PR) 2 pacientes.

A distribuio das formas clnicas da EM distribudos em porcentagem,

encontra-se na Figura 7.

Figura 7 Distribuio em porcentagem das formas clnicas da esclerose mltipla.

Formas clnicas da esclerose mltipla

remitente recorrente 67,8%

secundariamente progressiva

12,3%

primariamente progressiva

17,7%

progressiva recorrente 2,2%

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

Resultados 75

5.3 Anlise qualitativa das protenas do LCR

5.3.1 Estudo de BOC pela FIE em pacientes com EM:

Dos 90 pacientes com EM, 49 apresentaram BOC (54,4%) e 41

apresentaram ausncia de BOC (45,6%) no LCR.

5.3.2 Estudo de BOC pela FIE em pacientes com CIS:

Dos 16 pacientes com CIS, 05 apresentaram BOC (31,3%) e 11


5.3.3 Estudo de BOC pela FIE em pacientes com doenas neurolgicas

inflamatrias (DNI):

Dos 39 pacientes com DNI, 7 apresentaram BOC (17,9%) e 32


A distribuio das caractersticas clnicas do grupo de pacientes com

DNI e a relao com a presena de BOC, encontram-se na Tabela 3.

Resultados 76

Tabela 3. Caractersticas clnicas do grupo de pacientes com doenas neurolgicas inflamatrias e correlao com a presena de bandas oligoclonais

Doenas inflamatrias do SNC Nmero BOC + %

Neurite ptica recidivante 2 2 100 Mielopatia pelo HTLV 2 1 50 Esquistossomose 2 1 50 Vasculite no sistema nervoso 15 3 20 Neuromielite ptica 6 0 0 Mielite recidivante 4 0 0 Encefalomielite disseminada aguda 3 0 0 Hepatite B e C 3 0 0 Neurite ptica viral 1 0 0 Sfilis 1 0 0

Legendas: (BOC) bandas oligoclonais pela focalizao isoeltrica; SNC (sistema nervos central); HTLV (vrus T - linfotrpico humano)

5.3.4 Estudo de BOC pela FIE em pacientes sem doenas neurolgicas:

No grupo de 19 pessoas sem doena neurolgica, nenhum dos

indivduos apresentou BOC.

5.3.5 Estudo de BOC pela FIE em pacientes fazendo uso de terapia

imunomoduladora (interferonas ou acetato de glatirmer):

A positividade das BOC nos pacientes tratados com imunomoduladores

foi de 51,2% (21 pacientes). Estavam em tratamento 41 pacientes desta

casustica.

Resultados 77

5.3.6 Estudo de BOC pela eletroforese em gel de agarose (EGA).

O estudo da EGA mostrou menor sensibilidade para identificar BOC

nos diversos processos patolgicos:

1) EM - 90 pacientes, 21 apresentaram BOC (23,3%);

2) CIS - 16 pacientes, 2 apresentaram BOC (12,5%);

3) Outras desmielinizantes - 15 pacientes, nenhum apresentou BOC

(0%);

4) Vasculites do SNC - 15 pacientes, nenhum apresentou BOC (0%);

5) Infeces crnicas do SNC - 09 pacientes, 01 apresentou BOC

(11,1%);

6) Grupo controle sem doenas neurolgicas - 19 pacientes, nenhum

apresentou BOC.

5.4 Anlise quantitativa das protenas do LCR

5.4.1 O quociente de albumina

O estudo revelou elevao do quociente de albumina em 14,1% dos

pacientes com EM, indicando algum grau de disfuno da barreira hemato-

LCR.

Resultados 78

5.4.2 O ndice de IgG

O ndice de IgG apresentou:

1) Aumento (0,8) em 47 (52,2%) dos 90 pacientes com EM; mdia de

1,02 ( 0,67) e mediana de 0,8;

2) Pacientes com CIS revelaram 37,5% de aumento do ndice de IgG;

mdia de 0,79 ( 0,36) e mediana de 0,58;

3) No grupo de pacientes com doenas inflamatrias do SNC, houve

aumento do ndice de IgG em 14 dos 39 pacientes (35,8%). A mdia

foi de 0,70 ( 0,48) e mediana de 0,77;

4) No grupo controle, um dos 19 pacientes apresentou leve aumento do

ndice de IgG (5,2%). A mdia foi de 0,52 ( 0,11) e mediana de

0,50.

Quando se associa o resultado do ndice de IgG com a pesquisa de

BOC nos pacientes com EM podemos observar:

1) Que houve concordncia entre presena de BOC e ndice de IgG

elevado em 37 pacientes com EM (41,1%);

2) Quando se considera resultado de LCR alterado (conforme

determinado pelo painel internacional de 200512), ou seja, presena

de BOC e/ou aumento do ndice de IgG, foi possvel sua

caracterizao em 56 dos 90 pacientes (62,2%);

Resultados 79

3) A diferena entre as mdias do ndice de IgG quanto a presena ou

no de BOC resultou significante, com p

Resultados 80

A Figura 9 mostra o resultado das anlises das imunoglobulinas nas

diversas patologias.

Figura 9 Distribuio da anlise das imunoglobulinas nas diversas patologias. Legendas: BOC (bandas oligoclonais); EM (esclerose mltipla); CIS (sndrome clnica isolada); ODD (outras doenas desmielinizantes) que incluem: neuromielite ptica, neurite ptica recidivante, mielite recidivante, encefalomielite disseminada aguda.

5.4.3 O normograma

A distribuio da concentrao da imunoglobulina contra a

concentrao da albumina segundo o normograma de Reiber e Felgenhauer

encontra-se representado na Figura 10.

54%

31%

20% 20%

11%

0%

24%

14%

0% 0%

11%

0%

52%

38%

14% 13%

38%

5%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

EM CIS ODD vasculites infeces controle

BOC+ focalizao isoeltrica BOC+ eletroforese em gel agarose ndice de IgG0,8

Resultados 81

Figura 10. Quociente de imunoglobulina plotado contra o quociente de albumina nos

trs grupos de pacientes.

Resultados 82

5.5 O estudo quimiocitolgico de rotina do LCR

As variantes clssicas do estudo do LCR nos pacientes com EM assim

se apresentaram:

1) A mediana do nmero de clulas foi 5, mdia de 7,8 ( 9,3). A

contagem de clulas foi normal em 46,4% ( 4 cels/mm3) e aumento

de at 30 cels/mm3 em 51,7% dos pacientes;

2) A contagem diferencial de clulas mostrou padro linfomonocitrio

em todas as amostras de LCR;

3) A mdia do teor de protenas totais foi de 31,3 mg/dl ( 7,2) e

mediana de 28 mg/dl;

4) Em 98,1% dos pacientes com EM, o teor de protenas totais estava

abaixo de 72 mg/dl e a contagem total de clulas estava abaixo de

30 cels/mm3;

5) As concentraes de glicose e lactato estavam normais em todos os

pacientes.

5.6 Resultado das anlises de BOC e do ndice de IgG comparados com

as caractersticas demogrficas.

5.6.1 Gnero

Resultados 83

Quando se compara a relao do gnero em pacientes portadores de

EM, com o resultado da anlise qualitativa e quantitativa das IgG do LCR,

obtivemos os seguintes resultados:

1) 16 dos 23 pacientes do sexo masculino (69,7%) apresentavam BOC;

2) 33 das 67 pacientes do sexo feminino (49,3%) apresentavam BOC;

3) O teste de no associao entre gnero e presena de BOC

mostrou: X2=2,85; g.I.=1; p=0,0915;

4) A mdia do ndice de IgG no sexo masculino foi de 1,08 ( 0,6),

mediana de 0,89;

5) A mdia do ndice de IgG no sexo feminino foi de 1,0 ( 0,7)

mediana de 0,76;

6) A comparao entre as mdias do ndice de IgG e os gneros

resultou em: t= -0,41; p=0,68; diferena= -0,07; erro padro=0,16;

IC(95%): (-0,25; 0,39).

5.6.2 Etnia

Quando analisamos a autodeclarao da cor da pele com o resultado

da anlise qualitativa e quantitativa das IgG do LCR constatamos que:

1) Dos 66 pacientes brancos, 32 (48,5%) apresentaram BOC;

2) Dos 22 pacientes negros (cor parda/preta), 16 (72,7%) apresentaram

BOC;

Resultados 84

3) A nica paciente amarela apresentou BOC;

4) O teste de no associao entre cor e presena de BOC resultou

em: X2=3,54; g.I.=1; p=0,0518; risco relativo R=0,69; IC (95%): (0,48;

0,98). A homogeneidade de BOC positivas foi significante na borda

do nvel de significncia de 5%;

5) A mdia do ndice de IgG nos pacientes brancos foi 0,99 ( 0,6) e

mediana de 0,7;

6) A mdia do ndice de IgG nos pacientes negros foi 1,1 ( 0,8) e

mediana de 0,9;

7) A nica paciente amarela apresentou ndice de IgG normal;

8) A comparao de mdias do ndice de IgG segundo a cor resultou

em: t= -0,75; P=0,46; diferena= -0,12; erro padro=0,16; IC (95%):

(-0,2; 0,4), no significante no nvel de significncia de 5%.

5.6.3 A associao entre gnero e etnia com a presena de BOC

Quando associamos o resultado das anlises da pesquisa de BOC

pela FIE entre gnero e etnia, obtivemos os seguintes resultados:

1) Os 6 pacientes do sexo masculinos e negros apresentaram BOC

(100%);

2) Dos 17 pacientes do sexo feminino e negras, 10 (58,8%)

apresentaram BOC;

Resultados 85

3) Dos 17 pacientes do sexo masculino e brancos, 10 (58,8%)

apresentaram BOC;

4) Dos 49 pacientes do sexo feminino e brancas, 22 (44,9%)

apresentaram BOC;

5) O teste de no associao resultou em: X2=3,63; g.l=1; p=0,0568; R

comum=0,68; IC(95%) = (0,48;0,97). A associao entre BOC e Cor

ajustado por gnero foi significante na borda do nvel de significncia

de 5%.

A apresentao desta anlise apresenta-se esquematizada na figura 11.

Figura 11 - Associao do gnero e etnia dos pacientes portadores de esclerose mltipla, analisados quanto presena de bandas oligoclonais (BOC). Etnia negra se relaciona aos que se autodeclaram de cor parda/preta. Teste de no-associao: X

2 = 3,63; g.I. = 1; p = 0,0568

44,9 58,8 58,8 100

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Brancas Brancos Negras Negros

BOC +

BOC -

Resultados 86

5.6.4 A associao entre gnero e etnia com o ndice de IgG

A apresentao grfica do ndice de IgG, quando se relaciona com o

gnero e a etnia, encontra-se esquematizada no Figura 12.

Figura 12 - Associao do gnero e etnia dos pacientes portadores de esclerose mltipla analisados quanto ao ndice de IgG. Etnia negra se relaciona aos que se autodeclaram de cor parda/preta. Comparao de mdias: t=-0,75; p=0,46; diferena=-0,12; erro padro=0,16; IC (95%): (-0,2; 0,44). No significante.

5.7 O quadro clnico e a anlise do LCR

5.7.1 As diferentes formas clnicas da EM e a anlise do LCR

A distribuio dos resultados da presena de BOC nas diferentes

formas clnicas mostrou que:

1) Dos 16 pacientes com CIS, 5 (31,2%) apresentaram BOC;

42,5 58,8 66,6 66,6

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Brancas Brancos Negras Negros

IgG elev.

IgG normal

Resultados 87

2) Dos 61 pacientes com a forma RR da EM, 27 (44,3%) apresentaram

BOC;

3) Dos 11 pacientes com a forma SP, 6 (54,5%) apresentaram BOC;

4) Dos 16 pacientes com a forma PP, 14 (87,5%) apresentaram BOC;

5) E os 2 pacientes com a forma PR apresentaram BOC;

6) O teste de no associao resultou em: X2=11,27; g.l=3; p=0,0103,

significante ao nvel de significncia de 5%.

A apresentao destes dados, distribudos em porcentagem,

encontra-se na figura 13.

Figura 13 Distribuio da presena de bandas oligoclonais (BOC) pela focalizao isoeltrica nas diferentes formas clnicas: sndrome clnica isolada (CIS); remitente recorrente (RR); secundariamente progressiva (SP); primariamente progressiva (PP); progressiva recorrente (PR).Teste de no-associao: X

2 = 11,27; q.I. = 3; p = 0,0103

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

paulo diniz da gama - teses.usp.br · descritores: 1.esclerose múltipla 2.líquido...

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