2018

Juliana Mariotti Guerra Médica Veterinária

Pesquisadora Científica

jumariotti.vet@gmail.com

Patologia Morfológica e Molecular Aplicadas

à Inovação Diagnóstica e Vigilância da

Leishmaniose visceral

INTRODUÇÃO

PATOLOGIA

INTRODUÇÃO

■ SAÚDE ÚNICA

Reconhece a inter-relação

entre a saúde animal,

humana e ambiental.

"Entre a medicina animal e a

medicina humana não

existem linhas divisórias e

nem deve existir.” Rudolph

Virchow (1821-1902).

INTRODUÇÃO

FERRAMENTAS DIAGNÓSTICAS

■ Macroscopia

■ Citologia convencional / parasitológico direto

■ Citologia em meio líquido

■ Emblocado celular

■ Histopatologia

■ Colorações histoquímicas

■ Imunohistoquímica

■ Técnicas moleculares: Hibridização in situ, PCR,

sequenciamento.

MACROSCOPIA

Barbosa et al., 2017; Taniguchi, 2013

Achados clínicos e necroscópicos de cães soropositivos para

LVC

75,1272,10

53,72

42,0137,66

33,78

6,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

Espleno

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Hep

atom

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Linfon

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quên

cia

(%

)

■ Parasitológico direto.

■ Pesquisa de formas amastigotas em raspados de lesões

cutâneas e aspirados de medula óssea, linfonodo, baço.

■ Colorações do tipo Romanowsky

■ Sensibilidade: esfregaços esplênicos 93.1 - 98.7%, de medula

óssea 52 – 85%, e de linfonodo 52 – 58% em humanos; 34%

em esfregaços nodais de cães.

■ Especificidade: 100%

CITOLOGIA CONVENCIONAL

Paiva-Cavalcanti et al., 2015; Guerra et al., 2015

Métodos de coleta de amostras:

Punção por agulha fina: com ou sem aspiração

Impressão, escarificação ou esfoliação

[Cowell e Tyler, 2002]

CITOLOGIA CONVENCIONAL

Esfregaço de lâmina-sobre-lâmina (“Squash”)

Lâminas secas ao ar

Identificação do animal no lado oposto ao do material na

lâmina

Armazenar em porta lâminas ou separadas depois de secas

Não conservar na geladeira

Não colocar uma lâmina úmida sobre a outra

CITOLOGIA CONVENCIONAL

CITOLOGIA CONVENCIONAL

Magno, 2014

Fernandes, 2015; Lorente, 2015

• Vantagens

– Detecção rápida e eficaz

– Baixo custo

– Fácil execução

– Segura, pouco invasiva

– Alta especificidade

• Desvantagens

– Baixa sensibilidade

– Profissional capacitado

– Interferentes : • Sangue

• Leucócitos

• Dessecamento

• Sobreposição

CITOLOGIA CONVENCIONAL

■ Transferência imediata de células coletadas para meio preservativo.

■ Objetivos:

■ Minimizar artefatos e uniformizar esfregaços;

■ Automatizar e padronizar a confecção do esfregaço citológico;

■ Reduzir custos de RH

■ Possibilidade de produção de mais de um esfregaço;

■ Permite a realização de exames complementares.

■ Sensibilidade de 20% e especificidade de 100% em esfregaços

nodais em cães.

CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO

Fernandes et al., 2016

CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO

CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO

Arquivo pessoal

• Vantagens – Fixação imediata;

– Padronização;

– Amostra bem distribuída;

– Redução do tempo de leitura;

– Redução de elementos que obscurecem a amostra;

– Redução de insatisfatórios;

– Possibilidade de realização de testes complementares e mais esfregaços.

• Desvantagens – Perda do padrão de

arquitetura por rompimento dos grupamentos

– Perda de coesão entre as células;

– Redução do tamanho celular e nuclear;

– Redução de elementos do fundo

Fernandes et al., 2016; Lorente, 2015

CITOLOGIA EM MEIO LÍQUIDO

Colheita e fixação das células

Agregação e formação de sedimento

Processamento histológico

Múltiplos cortes

Colorações específicas

Imuno-citoquímica

Forma de preparação citológica na qual o precipitado da amostra centrifugada é

incluído em parafina e submetido a processamento histológico habitual.

Fernandes et al., 2016

EMBLOCADO CELULAR

Agente agregador

Fernandes et al., 2016

Agente fixador

EMBLOCADO CELULAR

EMBLOCADO CELULAR

Arquivo pessoal

EMBLOCADO CELULAR

• Vantagens – Simples e reprodutível

– Aumento da celularidade

– Maior representatividade

– Visualização parcial da arquitetura tecidual

– Aplicação de métodos complementares (ICQ, colorações histoquímicas)

– Armazenamento da amostra em temperatura ambiente

• Desvantagens – Maior custo

– Maior tempo de preparo

– Redução do tamanho celular

– Necessidade de maior concentração celular

EMBLOCADO CELULAR

HISTOPATOLOGIA

■ Coleta de amostras:

■ Biópsia incisional, por punch, por agulha grossa, excisional

■ Autópsia / Necrópsia: fragmentos de 2 cm3 dos tecidos,

especialmente, pele (cães), linfonodo, baço, medula óssea, fígado,

pulmão e coração.

HISTOPATOLOGIA

• Fixação adequada do material – Solução de formalina 10%

tamponada.

• Quantidade adequada de fixador – (10 vol. fixador / 1 vol. tecido)

• Tempo de fixação: mínimo de 24 horas.

• Potes adequados: plástico, boca larga, rosqueável.

• Não congelar

HISTOPATOLOGIA

■ Estudo microscópico das células e dos tecidos.

■ Coloração padrão: hematoxilina e eosina.

■ Padrão morfológico das lesões.

■ Associação com possíveis etiologias.

■ Colorações histoquímicas específicas: Giemsa.

■ Permite a realização de exames complementares: imuno-

histoquímica, hibridização in situ, PCR.

■ Conservação do material emblocado em parafina à

temperatura ambiente.

Esquema gentilmente cedido por Cristina Kanamura.

HISTOPATOLOGIA

■ Alterações multissistêmicas.

■ Amastigotas podem ser observadas no interior de macrófagos

(ocasionalmente outros leucócitos, células endoteliais,

fibroblastos e células neoplásicas) em mútiplos tecidos.

■ Infiltrado inflamatório com macrófagos, linfócitos, plasmócitos

e, menos frequentemente, neutrófilos e eosinófilos.

■ Tecidos mais afetados: baço, pele, fígado, linfonodo, rim, MO.

■ Lesões cardíacas, oculares, musculares, vasculares e de

sistema nervoso.

HISTOPATOLOGIA

Arquivo pessoal

HISTOPATOLOGIA

Arquivo pessoal

HISTOPATOLOGIA

Arquivo pessoal

HISTOPATOLOGIA

Guerra et al., 2014

HISTOPATOLOGIA

Réssio; Iglezias, 2018

HISTOPATOLOGIA

• Vantagens – Simples e reprodutível

– Maior representatividade

– Visualização da arquitetura tecidual

– Aplicação de métodos complementares (ICQ, colorações histoquímicas)

– Armazenamento da amostra em temperatura ambiente

• Desvantagens – Maior custo

– Maior tempo de preparo da amostra

– Redução do tamanho celular

– Equipamentos específicos para preparo das lâminas

– Profissional capacitado

HISTOPATOLOGIA

IMUNO-HISTOQUÍMICA

■ Método de identificação de antígenos nos tecidos, utilizando o

princípio da ligação-específica de anticorpos e antígenos.

Imuno-histoquímica IMUNO-HISTOQUÍMICA

Magno, 2014

EMBLOCADO CELULAR CITOLÓGICO

■ Sensibilidade: 70.0%.

■ Especificidade: 100%

IMUNO-HISTOQUÍMICA

■ Sensibilidade: 92.0%.

■ Especificidade: 100% Arquivo pessoal

IMUNO-HISTOQUÍMICA

Réssio; Iglezias, 2018

• Vantagens – Associação da marcação

com arquitetura tecidual

– Aplicação em diferentes tecidos.

– Alta sensibilidade e especificidade

– Distinção das estruturas marcadas

• Desvantagens – Alto custo

– Anticorpos limitados

– Identificação de gênero

– Maior tempo de preparo da amostra

– Equipamentos específicos para preparo das lâminas

– Profissional capacitado para realização e leitura

IMUNO-HISTOQUÍMICA

HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

■ Método de identificação de sequências específicas de

nucleotídeos em células ou cortes histológicos.

HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

Kimura; Nonogaki; Shirata, 2014

■ Sensibilidade: 87,5%.

■ Especificidade: 100%

• Vantagens – Associação da marcação

com arquitetura tecidual

– Aplicação em diferentes tecidos.

– Alta sensibilidade e especificidade

– Identificação de espécie

– Distinção das estruturas marcadas

• Desvantagens – Alto custo

– Maior tempo de preparo da amostra

– Equipamentos específicos para preparo das lâminas

– Profissional capacitado para realização e leitura

HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

TÉCNICAS MOLECULARES

Takahashi; Barrel, 2018

TÉCNICAS MOLECULARES

Paiva-Cavalcanti et al., 2015

FLUXOGRAMA DIAGNÓSTICO Cão sintomático ou assintomático com sorologia reagente (TR-DPP + Elisa) em município indene, sem

histórico de deslocamento para municípios endêmicos

Parasitológico direto (MO, linfonodo, baço e/ou pele) ou imuno-histoquímica

Negativo nos dois testes: realizar novas coletas e

manter vigilância

Positivo em pelo menos um teste

Ausência de Lu. Longipalis(Município não-receptivo e/ou

sem inquérito entomológico)

Presença de Lu. Longipalis(Município receptivo)

Adoção de medidas de controle

Levantamento entomológicoColeta e processamento de amostras para cultura

Negativa

Realizar novas coletas e tentativas

Positiva

Isolamento e caracterização da espécie de Leishmania

Sem isolamento

Realizar novas coletas e

tentativas de isolamento

Isolamento e caracterização de

espécie diferente da L. chagasi

Descartar o caso e rediscutir a

classificação do município e as

ações de controle

Isolamento e caracterização da espécie L. chagasi

Caso confirmado e encerrado. Iniciar ou manter as medidas

de controle

480/2013- CGDT/DEVIT/SVS-MS

AGRADECIMENTOS

SECRETARIA DO ESTADO DA SAÚDE – COORDENADORIA DE CONTROLE DE

DOENÇAS

INSTITUTO ADOLFO LUTZ

Centro de Parastiologia e Micologia

Centro de Patologia

SERVIÇOS DE VIGILÂNCIA DE ÓBITOS

SERVIÇOS MUNICIPAIS DE CONTROLE DE ZOONOSES

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DA USP

Departamento de Patologia

OBRIGADA !!!!