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Mara Cristina Silva Martins Pappalardo
Parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos da
anfotericina B e fluconazol e sua contribuição no estudo
da correlação clínico-laboratorial da criptococose de
sistema nervoso central associada à AIDS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Coordenadoria
de Controle de Doenças da Secretaria de
Estado da Saúde de São Paulo, para obtenção
do Título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Infectologia em
Saúde Pública
Orientadora: Profa. Dra. Marcia de Souza
Carvalho Melhem
SÃO PAULO
2009
Mara Cristina Silva Martins Pappalardo
Parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos da
anfotericina B e fluconazol e sua contribuição no estudo
da correlação clínico-laboratorial da criptococose de
sistema nervoso central associada à AIDS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Coordenadoria
de Controle de Doenças da Secretaria de
Estado da Saúde de São Paulo, para obtenção
do Título de Doutor em
Ciências
Área de Concentração: Infectologia em
Saúde Pública
Orientadora: Profa. Dra. Marcia de Souza
Carvalho Melhem
SÃO PAULO
2009
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES-SP
©reprodução autorizada pelo autor, desde que citada a fonte
Pappalardo, Mara Cristina Silva Martins
Parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos da anfotericina B e
fluconazol e sua contribuição no estudo da correlação clínico-
laboratorial de criptococose de sistema nervoso central associada à
Aids / Mara Cristina Silva Martins Pappalardo - São Paulo, 2009.
Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da
Saúde de São Paulo.
Área de concentração: Infectologia em Saúde Pública
Orientadora: Marcia S. Carvalho Melhem
1. Síndrome de imunodeficiência adquirida 2. Criptococose 3.
Sistema nervoso central 4. Antifúngicos 5. Farmacocinética 6.
Evolução clínica
SES/CCD/CD- 210/08
Dedicatória
Apesar de não ser muito conhecida no “meio acadêmico”, sinto-me
feliz e orgulhosa por ter conseguido estudar, pesquisar e escrever
sobre o assunto que eu queria , e com a orientadora que eu muito
admiro, como pesquisadora , como pessoa e amiga.
Dedico este trabalho aos pouco conhecidos, aos “não estrelas”, aos
moderados e aos “desafinados”(o que seria de nós sem a música ?),
que têm fundamental importância no equilíbrio das relações entre
as pessoas. Não aparecem muito, mas estão sempre presentes.
Dedico-o também a alguns (poucos, mas nobres de caráter e
atitudes) colegas e amigos do “Instituto de Infectologia Emílio
Ribas”, médicos ou não, que acreditam em cada palavra do
documento “Emílio Ribas, a missão”, escrito há alguns anos atrás.
Por fim, dedico-o a todas as pessoas da minha família, com todo o
meu amor.
Pra você, Rô, não tenho o que dizer. Só sentir e continuar vivendo
essa grande história de amor.
Aos meus filhos, desejo que o olhar “adolescente” e crítico nunca
deixe de existir nas suas vidas, independente da idade. Pediria a
vocês um pouco mais de calma, se possível. Calma para pensar,
para avançar, para olhar. Calma para ver coisas e pessoas
importantes, que passam ao nosso redor o tempo todo.
Calma para aprender a sugar ,da vida (em pequenos goles...) , o que
ela tem de mais belo, puro, simples e poderoso: o amor.
Um beijo imenso para todos os “meus anjos” que já foram passear,
estudar e reaprender. Para crescer. Em outras cidades. Um especial
para a minha mãezinha Betinha e outro para a minha “Dindá”.
Agradecimentos A todos os amigos da BIBLIOTECA do IIER, pela gentileza, delicadeza e
paciência comigo, por me ajudarem na procura dos artigos e com o
computador!
Às colegas do LABORATÓRIO do IIER, especialmente à Erica, Simone e
Wilma, que se esforçaram no armazenamento e transporte das amostras de
plasma e líquor dos pacientes do estudo para o IAL. Este trabalho também é
de vocês, e espero que ele sirva de exemplo para que vocês também estudem e
participem de outras pesquisas dentro do IIER.
Aos colegas do 5º andar do IIER (drs.Fátima, Heloíse e Edgar), obrigada pela
ajuda e pelo ânimo que me deram , nas piores horas.
Às minhas “irmãs emilianas” (dras. Ivelise e Elisa, também do 5º andar do
IIER), além do meu sincero agradecimento por tudo o que fizeram por mim,
minha eterna amizade e orgulho por ter amigas como vocês.
Às secretárias da Pós-Graduação do IIER, Margareth e Mônica. Obrigada pela
paciência e pelo bom humor contagiante de ambas.
Aos amigos da MICOLOGIA do IAL. A nossa amizade só cresceu. Seis anos
se passaram do mestrado até aqui, e apesar de não nos vermos muito, sabemos
que podemos contar uns com os outros. Espero poder ajudá-los mais, daqui
pra frente, seja com palpites ou na pesquisa de artigos e redação de trabalhos
científicos. Podem contar comigo, sempre!
Obrigada pelo apoio, pela parte laboratorial do trabalho e ajuda na montagem
de gráficos e tabelas. Este trabalho não é meu , é nosso!!
À minha orientadora Marcia , mais do que muito obrigada. Para ela, minha amizade,
respeito e carinho. Que bom ser sua amiga!!
Aos Professores, aos Mestres, Doutores, e aos que, de uma forma ou de outra,
independente de títulos, dedicam-se ao ensino, seja de que área for.
“Não existe nada mais fatal que o ensino das respostas certas. Para isto
existem as escolas: não para ensinar as respostas, mas ensinar as perguntas. As
respostas nos permitem andar sobre a terra firme. Mas somente as perguntas
permitem entrar pelo mar desconhecido.” (Rubem Alves)
Resumo
A predição de falha clínica no tratamento da criptococose deveria se apoiar,
entre outros parâmetros, na determinação da resistência antifúngica in vitro
ao fluconazol (FCZ) e à anfotericina B (AMB). No entanto, o exame
laboratorial mais usado em microbiologia, a concentração inibitória mínima
(CIM), para cepas de Cryptococcus neoformans (Cn) não permite, ainda,
fazer essa correlação. Outras ferramentas, in vitro, foram propostas para
essa finalidade, entre elas : ação fungicida de AMB e análise da combinação
de AMB e FCZ, além do estudo de aspectos farmacodinâmicos das drogas .
Nesta pesquisa foi analisada a evolução clínico-laboratorial e a eficácia
antifúngica de AMB e FCZ em 21 pacientes com aids e criptococose de
sistema nervoso central(CSNC); 41 amostras de líquor(LCR) foram
analisadas, e o agente isolado foi de uma única espécie: C.neoformans. O
estudo das concentrações de FCZ e AMB em plasma e LCR, avaliada por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) confirmou a presença de
níveis esperados da droga; o contrário foi observado com AMB. Os testes de
microdiluição (EUCAST e CLSI) identificaram amostras menos sensíveis a
FCZ (CIM >16 µg/mL) isoladas de 4 (19,1%) pacientes. Em outros 4 casos,
foi observado alternância do perfil de sensibilidade ao azol em amostras
seriadas , caracterizando heterorresistência. O agente etiológico apresentou
alta sensibilidade, tanto a FCZ (CIM<16µg/mL em 87,8% das amostras),
quanto à AMB(CIM<2µg/mL em 100% das amostras). A análise da
combinação de AMB e FCZ, in vitro, pelo teste do tabuleiro de xadrez
mostrou indiferença para a maioria (32/41; 78%) e adição em 22% (9/41) dos
isolados. Efeito fungicida de AMB, verificado por curvas de morte, ocorreu
entre 6 e 48h para todas as 41 amostras, sendo a maioria deles (70%)
inibida entre 6 e 12 h de exposição; este efeito foi independente da CIM para
cada isolado. Os maiores valores, tanto de efeito fungicida (48 h) quanto de
CIM (1 µg/mL) não foram associados a isolados dos três casos de óbito ou,
mesmo, a de dois pacientes com recidiva, demonstrando falta de correlação
entre os dois parâmetros laboratoriais e a evolução clínica.
A mortalidade geral foi 23,8% (5/21) sendo CSNC a causa principal (3/5;
60%) com letalidade de 14,3%(3/21). A análise dos parâmetros de CIM de
AMB e FCZ, efeito fungicida para AMB e interação aditiva in vitro entre AMB
e FCZ não contribuiram para a predição de falha clínica. Desde que o
continente latinoamericano possui número expressivo de pacientes com
CSNC associada à aids, é necessário desenvolver novas metodologias
laboratoriais, que possam atuar como preditivas de evolução clínica. Pelo
nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho enfocando parâmetros
farmacocinéticos e farmacodinâmicos de AMB e FCZ e a possível utilidade
desses testes in vitro como fatores preditivos de falha clínica
Abstract
Phisicians have long searched for a laboratory test that could predict
the clinical outcome in patients with cryptococcosis. Predict of clinical failure
in the treatment of cryptococcosis should be based on some parameters
such in vitro antifungal susceptibility testing for fluconazole (FCZ) and
amphotericin B (AmB). However, the most common test used in
microbiology, the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) for
isolates of Cryptococcus neoformans hasn’t been able to demonstrate this
important correlation. Some other tools have been evaluated and
investigated, like pharmacokinetics and pharmacodynamics aspects to both
drugs and fungicidal activity by AmB. We analyzed clinical and laboratorial
aspects such success or failure, antifungal efficacy by two antifungal drugs in
21 Brazilian patients with aids and cryptococcosis of central nervous system.;
41 isolates from cerebrospinal fluid(CSF) were analised, and the agent was
C. neoformans in all of them. Concentrations of FCZ and AmB in plasma and
CSF were determined by high performance liquid chromatography
(HPLC.neC). The results demonstrated adequate FCZ levels in both, sera
and CSF; the opposite was observed in AmB tests. Determination of FCZ-
MIC by EUCAST and CLSI microdilution methods identified less susceptible
isolates (MIC >16µg/mL) in 19.1% patients. In another 4 cases we detected
heteroresistance to FCZ, in serial isolates with different patterns of MICs.
High susceptibility of Cryptococcus neoformans isolates was verified for both
drugs, FCZ (87.8%) and AmB (100%). The combination of AMB plus FCZ in
vitro was analysed by FICI (fractional inhibitory concentration index) through
checkerboard methodology and detect indifference in 78%, and addition
effect in 22% of isolates. We studied fungicidal activity of AmB by time-kill
methodology and all the 41 isolates died until 48 h of exposition to 1 µg/mL of
the drug. The majority of isolates (70%) died between 6h and 12 h, and we
didn’t find any correlation between the two methods. Lowest susceptibility
(fungicidal effect at 48h or MIC 1 µg/mL) by AmB was not correlated to
clinical failure (deaths) in 3 patients or cryptococcal meningitis recurrence in
2 patients. Mortality was 23.8%, and cryptococcosis was responsible of most
(3/5; 60%) of deaths, with 14.3% of lethality. All these parameters were
unable to predict clinical failure. Continued investigation of in vitro drug
susceptibility testing for C. neoformans is warranted and urgently needed
given the expressive numbers of individuals with AIDS-associated
cryptococcal meningitis in Latin American continent. To our knowledge, this
is the first pharmacokinetics and pharmacodinamic study on drugs used in
cryptococcal meningitis, aiming to analyze these laboratory tests to predict
the clinical failure.
Lista de abreviaturas e siglas
1x/dia uma vez ao dia
5FC 5 flucitosina
aids síndrome da imunodeficiência adquirida
AMB anfotericina B
AUC área sob a curva
breakpoint ponto de corte
CIF concentração inibitória fracionada
CIM concentração inibitória mínima
CIM50 CIM que inibe 50% das amostras testadas
CIM90 CIM que inibe 90% das amostras testadas
CFM concentração fungicida mínima
CGB canavanina, glicina, bromotimol
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
CQ controle de qualidade
CSNC criptococose de sistema nervoso central
EPA efeito pós-antibiótico
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
FC farmacocinética
FCZ fluconazol
FD farmacodinâmica
HAART terapia antiretroviral de alta potência; “highly active
antiretroviral therapy”
HIC hipertensão intracraniana
HIV vírus da imunodeficiência adquirida
IAL Instituto Adolfo Lutz
IC50 coeficiente de inibição de 50% de crescimento das amostras
IC90 coeficiente de inibição de 90% de crescimento das amostras
ICIF índice de concentração inibitória fracionada
IIER Instituto de Infectologia Emílio Ribas
IO infecção oportunista
IRA insuficiência renal aguda
ITZ itraconazol
LBA lavado broncoalveolar
LCR líquido cefalorraquideano; líquor
LD limite de detecção
LQ limite de quantificação
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
nm nanômetro
PCR reação em cadeia da polimerase
PIC pressão intracraniana
QC quimiocitológico
RNM ressonância magnética
SNC sistema nervoso central
SRI síndrome da reconstituição imunológica
T ½ tempo de meia-vida
TC tomografia computadorizada
Ttau/CIM tempo que a concentração plasmática fica acima da CIM
UFC unidades formadoras de colônias
VAR variedade
Vd volume de distribuição
µg micrograma
µL microlitro
Lista de Tabelas, Figuras, Quadros e Apêndices
Figura 1: esquema de placa de microtitulação contendo concentrações (µg/mL) de anfotericina B para teste da CIM,segundo EUCAST. C+: controle positivo de crescimento, C-:controle negativo, ATCC: cepa-padrão 25 Figura 2: esquema de placa de microtitulação contendo concentrações (µg/mL) de fluconazol(em itálico) e anfotericina B(em negrito) para teste do xadrez. C+: controle positivo de crescimento, C-:controle negativo 29 Figura 3: esquema de resultado do teste de xadrez com fluconazol (em itálico) e anfotericina B(em negrito). CIM e CIM: concentração inibitória mínima de anfotericina B e fluconazol. � Concentração inibitória fracionada de cada droga. C+: controle-positivo de crescimento. C-: controle negativo 30 Figura 4: freqüência de insuficiência renal aguda (IRA) e uso de anfotericina B em pacientes com criptococose e aids 35 Figura 5: placas de Petri contendo colônias de Cryptococcus neoformans utilizados em testes de curvas de morte, ilustrando a diminuição do número de colônias (ufc/mL) ao longo do tempo de exposição à anfotericina B. A Tempo de exposição 0 (zero). B Tempo de 6 horas. C Tempo de 12 horas 43 Figura 6: porcentagem de morte em 41 amostras clínicas de Cryptococcus neoformans após exposição (h) a 1 µg/mL de anfotericina B. 44 Figura 7: porcentagem cumulativa de morte em 41 amostras clínicas de Cryptococcus neoformans após exposição(h) a 1 µg/mL de anfotericina B 44 Figura 8: perfil típico de curva de morte (média) observado em 34 amostras clínicas de Cryptococcus neoformans expostas a 1 micrograma de anfotericina B. Eixo X , 1=T0 2=T6 3=T12 4=T24 5=T48 6=T72 . 45 Figura 9: perfil atípico de curva de morte observado em 7 amostras clínicas de Cryptococcus neoformans isoladas de quatro casos, com persistência de células viáveis após exposição a 1 micrograma de anfotericina B. Eixo X , 1=T0 2=T6 3=T12 4=T24 5=T48 6=T72 . 45 Figura 10: efeito fungicida de anfotericina B, por testes de curvas de morte, amostras de 5 casos de criptococose associada aids que foram a óbito 46 Figura 11: exemplo de isobolograma obtido a partir da placa de microtitulação para teste do tabuleiro do xadrez para análise de combinação de drogas distribuídas em várias concentrações (µg/mL). Interpretação: efeito de indiferença na associação de anfotericina B (AMB) com fluconazol (FCZ). CIM: concentração inibitória mínima. 49
Quadro 1: Efeito fungicida de anfotericina B, por testes de curva de morte, em 5 casos de criptococose associada à aids que foram a óbito 46 Quadro 2: Distribuição de amostras de C. neoformans tolerantes à anfotericina B, em testes de curva de morte, segundo óbito por criptococose e outras causas. 47 Quadro 3: Distribuição de amostras de C. neoformans tolerantes à anfotericina B, em testes de curva de morte, segundo óbito por criptococose em 21 casos 47 Quadro 4: Valores plasmáticos e liquóricos de anfotericina B de dez casos de criptococose e aids obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). 51 Tabela 1: Número de amostras de Cryptococcus neoformans de 21 pacientes com criptococose de sistema nervoso central, IIER, 2004-2005, segundo efeito fungicida de anfotericina B (1µg/mL) 43
Apêndice 1: dados clínicos e terapêuticos de 21 pacientes com criptococose de sistema nervoso central associada à aids, IIER,2004-2005 122 Apêndice 2: resultados de testes de sensibilidade para fluconazol, itraconazol e anfotericina B para 41 amostras de 21 pacientes com criptococose de sistema nervoso central, IIER, 2004-2005 124 Apêndice 3: parâmetros farmacodinâmicos para avaliação de sensibilidade de 13 amostras de Cryptococcus neoformans, obtidas de 12 pacientes sob uso de fluconazol 127
Índice
1 Introdução 1
1.1 Etiologia e fisiopatogenia da criptococose 1
1.2 Epidemiologia da criptococose em aids 3
1.3 Aspectos clínicos e laboratoriais da criptococose
de sistema nervoso central em aids 4
1.4 Tratamento de criptococose de sistema nervoso
central em aids 7
1.5 Resistência a antifúngicos 11
2 Objetivos 18
2.1 Geral
2.2 Específicos
3 Material e métodos: 19
3.1 Pacientes 19
3.2 Amostras biológicas 21
3.3 Exames complementares 21
3.4 Exames micológicos 21
3.5 Testes de sensibilidade in vitro frente
à anfotericina B, fluconazol e itraconazol 22
3.5.1 Determinação da CIM 22
3.5.2 Curvas de morte 25
3.5.3 Teste do tabuleiro de xadrez 26
3.5.4 Dosagem de anfotericina B e fluconazol 31
3.6 Análise estatística 33
4 Resultados 34
5 Discussão 52
6 Conclusões 90
7 Referências bibliográficas 91
8 Anexos 128
1
1 Introdução
Criptococose é micose sistêmica causada pela levedura capsulada
Cryptococcus spp., descoberta em 1895 por Sanfelice, na Itália. A doença
sempre esteve associada à deficiência de imunidade celular, acometendo
pacientes sob uso de medicamentos imunossupressores ou com linfomas,
leucemias, sarcoidose e outras patologias causadoras de imunodeficiência.
Antes da aids, eram raros os casos descritos da doença (Mitchell e Perfect,
1995). É uma das infecções oportunistas (IO) definidoras de aids, e em
países subdesenvolvidos, ainda apresenta importante porcentagem de
mortalidade (Horta et al. 2002; Ministério da Saúde, Brasil, 2004;
Pappalardo et al., 2007; Lindenberg et al., 2008). Criptococose não é doença
de notificação compulsória e isso dificulta o conhecimento do valor exato de
sua prevalência no Brasil. Doença criptocóccica é definida por antígeno
criptocóccico sérico em título > 16 ou título > 4 no líquido cefalorraquideano
(LCR) ou cultura positiva para Cryptococcus neoformans no LCR ou ambos
(Newton Jr. et al.,1995). A forma prevalente da doença em pacientes com
aids e com linfócitos T CD4 < 100/ mm3 é a meningoencefálica (Mitchell e
Perfect, 1995). Associada à aids, a doença se apresenta com maior
envolvimento de sistema nervoso central (SNC), extraneural e
extrapulmonar, maior probabilidade de positividade ao exame direto do
líquido cefalorraquideano (LCR) e hemoculturas, além de menor número de
células inflamatórias no LCR (Perfect e Casadevall, 2002).
1.1 Etiologia e Fisiopatogenia da criptococose
O número de espécies do agente da criptococose humana está em
discussão, mas, atualmente, suas características fenotípicas e genotípicas
2
permitem a separação em duas espécies: Cryptococcus neoformans (com
sorotipos A, D e AD) e Cryptococcus gattii (com sorotipos B e C) , segundo
proposta de Kwon-Chung e Varma (2006). Durante muitos anos, aceitou-se
apenas uma espécie, C.neoformans, com duas variedades: neoformans e
gattii, apesar de relatos de outras espécies associadas a quadros de
infecção humana (Kwon-Chung, 2005). Em 1999, Franzot et al., baseados
em estudos de biologia molecular, propuseram a var. grubii ; porém, outros
autores verificaram que a var. neoformans continha os sorotipos A, D e AD
com genótipos 1a, 1b e 1c, enquanto a var. grubii continha os genótipos 2a,
2b e 2c. Assim, a diferença entre essas variedades seria baseada nos
genótipos das cepas (Kwon-Chung e Varma, 2006).
A predominância de C.neoformans como agente de criptococose
associada à aids é notada no mundo todo. O sorotipo A tem ampla
distribuição no mundo todo e é o mais descrito em pacientes com aids. Na
Europa, o sorotipo D é responsável por quase 20% das infecções
criptocóccicas em aids. A espécie C.gattii, por sua vez, tem maior
capacidade de causar infecções em indivíduos imunocompetentes , e é
mais descrita em áreas tropicais e subtropicais. C. gattii tem seu habitat em
árvores, em especial, em eucaliptos, enquanto C. neoformans , apesar de
ter sido também isolada de árvores, é descrita com freqüência em frutas e
excretas de várias aves, em particular de pombos (Perfect e Casadevall,
2002).
A maioria das infecções por Cryptococcus spp. é adquirida por
inalação de propágulos infectantes. A partir dos alvéolos pulmonares, a
levedura pode atingir qualquer parte do corpo humano, mas é usual o
acometimento de pulmões, SNC, pele, próstata e olhos. Substâncias
presentes no SNC do hospedeiro, como catecolaminas, epinefrina e outras,
funcionam como substratos para fenoloxidase, enzima importante na
produção de melanina pela levedura. Isso poderia explicar seu forte tropismo
por essa localização anatômica (Liu et al.,1999). Glucuroxilomanose,
galactoxilomanose e manoproteínas, componentes da cápsula de
Cryptococcus spp., são responsáveis, em parte, pela virulência desta
3
levedura, pois alteram os mecanismos de fagocitose dos macrófagos. Os
altos níveis de antígenos capsulares de Cryptococcus spp. em pacientes
com aids determinam a formação de imunocomplexos, que impedem a livre
atividade de anticorpos específicos. O excesso de antígeno capsular
bloqueia a ação de linfócitos T CD4, assim como a ação dos macrófagos
efetores, determinando a ativação policlonal dos linfócitos B, com reação
anárquica do sistema imune humoral (van der Horst et al., 1997). Outros
produtos sintetizados por Cryptococcus spp., como manitol, melanina e
prostaglandinas, podem também afetar a resposta imune do hospedeiro.
1.2 Epidemiologia da criptococose em aids
O impacto da terapia antiretroviral potente- HAART- sobre a
frequência das infecções oportunistas em pacientes com aids, pode ser
avaliado por vários estudos. Em 2001, Manfredi et al., comparando 86
pacientes com aids, diagnosticados na era pós-HAART (1997-2000) com
342 pacientes diagnosticados na era pré-HAART (1985-1995), observaram
que, apesar da HAART, a grande maioria dos pacientes não pode ser
beneficiada por ela antes do diagnóstico de criptococcose.
Na África, a micose foi a doença inicial definidora de aids em 84% de
65 pacientes, enquanto que tuberculose pulmonar o foi em 14% (Moosa e
Coovadia,1997). A incidência da doença continua aumentando em algumas
regiões da África e da Ásia, podendo refletir diferenças na exposição ao
agente ou falta de manejo da infecção pelo vírus da imunodeficiência
adquirida (HIV), segundo Bicanic et al., em 2005. Manfredi e Chiodo (2000)
constataram, na era pós-HAART, tendência à diminuição de algumas IOs,
tais como: criptococose, citomegalovirose, micobacteriose, criptosporidiose e
encefalopatia pelo HIV, mas aumento relativo de pneumocistose, candidíase
esofágica, síndrome da emaciação, tuberculose, linfoma não-Hodgkin, além
da estabilidade das taxas de sarcoma de Kaposi e toxoplasmose de SNC.
4
Estudos brasileiros de prevalência da micose são escassos, mas
demonstram diminuição da doença, de 6% a 8%, até 1997, para taxas de
1,55% a 3,5 %, após a introdução de HAART (Guimarães, 2000; Secretaria
de Estado de Saúde de São Paulo, 2005). Apesar da diminuição do número
de casos brasileiros da doença, ela ainda é considerada importante pela sua
morbi-mortalidade (Pappalardo et al., 2009). É a segunda IO do SNC mais
frequente no Brasil (Ministério da Saúde do Brasil, 2004; Vidal et al., 2005;
Oliveira et al., 2006).
Dados da Seção de Estudos e Planejamento do Serviço de
Epidemiologia do Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER) mostravam
diminuição de criptococose de sistema nervoso central (CSNC) em aids, em
pacientes internados ou ambulatoriais: 6,8% em 1998; 5,8% em 1999; 4,6%
em 2000; 3,1% em 2001 e em 2002 (Pappalardo e Melhem, 2003). Os
respectivos números de pacientes internados e/ou em seguimento
ambulatorial por criptococose foram 45 casos em 2003, 38 em 2004, 34 em
2005, 42 em 2006. Em 2007, de 1006 notificações de aids, 38(3,8%)
tiveram diagnóstico de criptococose extra-pulmonar até a notificação de aids;
em 2008, de 1058 casos, 28(2,6%), e até 27/04/2009, de 160 notificações de
aids, 5 (3,1%) tiveram criptococose extra-pulmonar. No IIER, apenas são
contados os números de pacientes com a micose extra-pulmonar até o
momento da notificação de aids. Os pacientes que apresentam a doença
depois disso, não são contados. O foco, para a notificação de casos, é aids,
e não criptococose, ou outra infecção oportunista.
Na prática clínica, criptococose continua sendo frequente nos
pacientes que não querem receber HAART, nos que não são aderentes à
essa terapêutica ou quando há falência do esquema antiretroviral (Pedezert
et al., 2004).
1.3 Aspectos clínicos e laboratoriais da criptococose de sistema nervoso
central em aids
5
O acometimento do SNC é a forma mais comum de criptococose
extrapulmonar, e é a mais frequentemente letal. A doença pode acometer as
meninges e, através do LCR, todo o espaço subaracnóide (meningite), e/ou
pode produzir lesões na massa encefálica difusamente (encefalite), ou sob a
forma de abscessos grandes e profundos (criptococomas). O fungo
atravessa a barreira hematoencefálica, formada principalmente por células
endoteliais, e a célula CD44 parece ser o receptor primário durante a
infecção (Jong et al., 2008).
Na maioria dos casos, alguns sinais e sintomas auxiliam no
diagnóstico clínico de CSNC: cefaléia, febre, náuseas, vômitos, convulsões e
alteração do comportamento e/ou do humor. Entretanto, deve-se pensar na
doença, mesmo quando o paciente com aids apresenta apenas febre e mal
estar (Mitchell e Perfect, 1995; Saag et al., 2000).
Os testes micológicos empregados no LCR para diagnóstico são:
exame direto com coloração pela tinta nanquim (tinta da China), pesquisa de
antígenos capsulares por reação de aglutinação e cultura. O exame direto do
LCR com tinta da China, de fácil preparo, é positivo para cerca de 80% dos
pacientes com aids e 50% dos pacientes sem aids (Powderly, 1993; Perfect
e Casadevall, 2002). A visualização da cápsula de polissacarídeos, em
tecidos, pode ser feita por colorações específicas, como mucicarmim e
alcian blue. A coloração pela prata (Groccot e Gomori) é útil, apesar de não
ser específica para Cryptococcus spp. A técnica de Fontana-Masson permite
a identificação da presença de melanina.
O teste sorológico para a detecção do antígeno polissacarídeo
criptocóccico é tanto específico quanto sensível (> 90%). O método
comercial consiste em teste de aglutinação com partículas de látex. Um teste
positivo em títulos > 4 em um fluido biológico sugere fortemente infecção.
Testes falso-negativos são raros e podem ocorrer em casos com títulos
baixos, em amostras de pacientes com infecção recente, em soros contendo
imunocomplexos ou, ainda, com títulos altos de antígenos (efeito prozona).
Pacientes infectados com cepas pouco encapsuladas e, portanto, com
pequena produção e liberação de polissacárides, também podem apresentar
6
resultados falso-negativos (Mendes-Giannini e Melhem, 2000; Reiss et al.,
2002).
O isolamento do agente etiológico, em meios de cultura, é
considerado o teste “padrão-ouro” no diagnóstico da micose, com
sensibilidade de 90% (Mitchell e Perfect,1995; Negroni, 2001). As
hemoculturas, pelos métodos de centrifugação e lise e sistemas
automatizados, permitem o isolamento de Cryptococcus spp. em 10% a
30% dos casos de criptococose (Yagupsky e Menegus,1990; Silva et al.,
1996; Pasqualotto et al., 2004). Já o estudo de Whimbey et al. (1986)
mostrou mais de 70% de sensibilidade para detectar criptococcemia em
pacientes com aids e criptococose.
Métodos moleculares, tal como a detecção de DNA em soro e/ou
LCR, carecem de padronização. A reação da polimerase em cadeia (PCR) é
citada por alguns autores como extremamente útil no diagnóstico e
seguimento terapêutico dos pacientes (Jain et al., 2005; Almeida et al., 2007;
Martins et al., 2007).
Exames de neuroimagem, como tomografia de crânio (TC) ou
ressonância magnética (RNM), usualmente, não mostram lesões que
ocupam espaços. Pode haver sinais de atrofia cerebral, com aumento do
tamanho dos ventrículos laterais, aprofundamento dos sulcos e cissuras
cerebrais, além de perda da homogeneidade do parênquima encefálico.
Com menor frequência, pode haver sinais de vasculite. A ressonância de
crânio, mais sensível que a TC, pode mostrar lesões nodulares situadas na
base do encéfalo (Hospenthal e Bennett, 2000).
Sinais de mau prognóstico em casos de CSNC são: i) alteração do
estado mental, ii) presença de hipertensão intracraniana (HIC), iii) títulos de
antígeno criptocóccico no LCR > 1024, iv) hiponatremia, v) contagem de
leucócitos no LCR< 20 células/mL, vi)tinta da China positivo,
vii)hipoglicorraquia, viii) cultura positiva para Cryptococcus neoformans em
sítios extraneurais, viii)níveis de linfócitos T CD4 abaixo de 50 células/mm3
(Mitchell e Perfect, 1995; Bava et al., 1999 ; Negroni, 2001).
7
A chamada síndrome de reconstituição imunológica (SRI), que ocorre
em várias IOs associadas à aids, também é descrita em criptococose. O
quadro é de cefaléia, piora clínica em um paciente com CSNC previamente
diagnosticada, que iniciou HAART com aumento substancial de CD4, entre
uma semana e onze meses após o início de HAART. O diagnóstico é feito
por exclusão, e o quadro clínico é atribuído ao aumento da reatividade aos
antígenos criptocóccicos (Woods et al., 1998 ; Cattelan et al., 2004).
1.4 Tratamento de criptococose de sistema nervoso central em aids
No Brasil, o tratamento de CSNC é feito com AMB ou FCZ, pois não
há mais flucitosina (5FC) disponível no mercado farmacêutico, infelizmente.
Ambas as drogas podem ser usadas na fase de ataque ou indução, mas,
normalmente, os médicos iniciam o tratamento com AMB.
Segundo Saag et al. (2000), o tratamento inicial pode ser feito por
diversos esquemas: a) AMB(0,7-1,0 mg/kg/dia) + 5FC(100 mg/kg/dia) por 2
semanas, seguido de 400-800 mg/dia de FCZ por, pelo menos, 10
semanas(fase de consolidação); b) AMB + 5FC por 6-10 semanas; c) AMB-
por 6 a 10 semanas; d)FCZ: 400-800 mg/dia, por 10-12 semanas; e)ITZ: 400
mg/dia, por 10-12 semanas; f) FCZ(400-800 mg/dia) + 5FC, por 6 semanas;
g) formulação lipídica de AMB(3-6 mg/kg/dia) por 6-10 semanas.
Para os referidos autores, o tratamento de escolha é a alternativa a, e
citam ainda, que, na ausência de 5FC, pode-se usar AMB sozinha, e que
após as duas primeiras semanas de tratamento, pode-se iniciar a fase de
consolidação, preferencialmente com FCZ, por 8 semanas, ou até a
esterilização do LCR. As opções para a fase de manutenção, ainda segundo
Saag et al. (2000) são: a) FCZ(200-400 mg/dia); b)ITZ: 400 mg/dia;
c)AMB:1mg/kg/dia, 1- 3x /semana. Para esta fase do tratamento, os
referidos autores também escolhem a alternativa a como sendo a de
primeira escolha. A fase de manutenção deve ser mantida, como prevenção
secundária de criptococose em aids, até que os níveis de CD4 estabeleçam-
8
se acima de 100 - 200 células/mm3, por mais de seis meses (Haddad e
Powderly, 2001; Kaplan et al., 2002). Antes da era HAART, as recidivas pós-
tratamento de CSNC em aids, chegavam a ser de 50% a 60%. O uso de
200 mg/dia de FCZ por tempo indeterminado reduziu essas taxas a menos
que 5%, em países desenvolvidos. Fluconazol é superior à AMB e ao
itraconazol (ITZ) na fase de manutenção (Powderly et al.,1992a;1992b; Saag
et al., 1999).
Os principais fatores que afetam a distribuição corpórea dos agentes
antifúngicos são o tamanho da molécula, grau de ligação proteica e via de
eliminação de cada um deles (Ashley et al., 2006).
1.4.1 Anfotericina B (AMB)
Anfotericina B, fármaco do grupo dos polienos, é usada desde sua
descoberta, em 1956, para tratamento de micoses sistêmicas, incluindo
CSNC. Seu efeito antifúngico é dependente das duplas pontes conjugadas
do anel macrolídico. Essa parte hidrofóbica da molécula liga-se a esteróis,
em especial, ao ergosterol, principal esterol da membrana citoplasmática
dos fungos. Este mecanismo de ação explica grande parte da toxicidade do
polieno, pois ocorre ligação também aos esteróis da membrana plasmática
humana, como o colesterol. A ligação da droga ao lipídeo altera a
permeabilidade seletiva da célula, originando poros permeáveis à saída de
água e íons potássio, amônio e fosfato, além de açúcares e proteínas.
Ocorre, a seguir, deterioração metabólica e morte celular(Sokol-Anderson et
al., 1986).
A absorção oral de AMB é mínima (5%) e, por ser pouco absorvida
pelo trato gastrointestinal, ela deve ser administrada, exclusivamente, por via
endovenosa. Em solução glicosada, sob forma desoxicolato, é administrada
de forma lenta, durante 4 a 6 horas, uma vez ao dia (Saag e Dismukes,
1988). A dose utilizada é de 0,7-1 mg/kg/dia, devido à sua toxicidade
relacionada à dose. Anfotericina B é fármaco potencialmente nefrotóxico,
9
pelo efeito vasoconstritor nas arteríolas renais aferentes, resultando em
diminuição do fluxo sanguíneo glomerular e tubular. A diminuição da filtração
glomerular ocorre em 5% a 80% dos pacientes. A partir daí, ocorrem
alterações de eletrólitos, levando à perda de potássio, retenção de
hidrogênio, acidose tubular renal e hipomagnesemia. Também é mielotóxica,
geralmente provocando anemia, devido à inibição da síntese de
eritropoetina, além da ação direta sobre a medula óssea (Catálan e Montejo,
2006) .
No IIER, a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) e a
Farmácia só disponibilizam AMB lipossomal (Ambisome®) em casos de
insuficiência renal comprovada, com determinados níveis de uréia e
creatinina séricas, pois a medicação é muito onerosa.
1.4.2 Fluconazol (FCZ)
Fluconazol é um triazol sintetizado na década de 80, dependente do
citocromo P-450, que age inibindo a enzima 14 α-dimetilase, responsável
pela conversão de lanosterol para ergosterol (Andriole, 1998). O fármaco
encontra-se disponível em cápsulas para uso oral e ampolas, para uso
endovenoso. Fluconazol pode ser usado em doses orais de 50 mg/dia a
2g/dia. Entretanto, a dose-padrão em adultos é de 400 mg/dia a 800 mg/dia,
e em crianças, de 10-12 mg/kg/dia.
As duas apresentações de FCZ têm a mesma farmacocinética, e uma
dose diária resulta em altos níveis sanguíneos, rápido equilíbrio sérico e boa
penetração tecidual (Andriole, 1998; Louie et al.,1998). Depois da
administração oral, FCZ é rapidamente absorvido, atinge concentrações
plasmáticas altas e é excretado lentamente, com meia vida de 30 horas. A
biodisponibilidade é alta, aproximadamente 90%, com a administração
endovenosa.
10
1.4.3 Itraconazol (ITZ)
Itraconazol (ITZ) é um composto triazólico descoberto em 1986.
Como fluconazol, também exerce seu efeito sobre o citocromo P-450 dos
fungos, alterando e resultando no rompimento da membrana citoplasmática,
sem afetar, em doses terapêuticas, o sistema enzimático do homem. Sua
absorção depende da presença de ácido no estômago e de alimentos. A
concentração plasmática do fármaco é baixa, mas atinge taxas bem altas
em tecidos adiposos. Concentrações no fluido ocular, cerebrospinal e saliva
são desprezíveis. Apesar de sua pobre penetração no LCR de humanos e
outros animais, muitos pacientes com CSNC foram tratados com ITZ com
sucesso na fase aguda da doença (van der Horst, 1997); é droga de
segunda escolha no tratamento da fase supressiva da micose (Andriole,
1998).
1.4.4 5-Flucitosina (5FC)
Pela ação de desaminases, o fármaco se transforma em 5-
fluorouracil, que é fosforilado e ligado ao RNA do fungo, transformando-o em
RNA defeituoso. Assim, este antifúngico atua na inibição da síntese de DNA
(Andriole,1998). É disponível apenas em apresentação oral, e a dose
terapêutica é de 100 a 150 mg/Kg/dia, em 4 tomadas. Os níveis séricos são
de 35 µg/mL a 70 µg/mL, e a ½ vida sérica é de 3 a 6 h, em indivíduos
normais. Liga-se minimamente a proteínas séricas, distribui-se amplamente
nos tecidos corpóreos (Bodey,1996). Atravessa a barreira hematoencefálica,
e, aproximadamente 65% a 90% de sua concentração plasmática é
encontrada simultaneamente no LCR.
1.4.5 Outras drogas
11
Azóis de nova geração, como voriconazol, posaconazol e
ravuconazol, possuem o mesmo modo de ação do FCZ. As três drogas
apresentam excelente atividade in vitro contra C.neoformans, e alguns
estudos animais também foram animadores (Perkins et al., 2005; Illnait-
Zaragozi et al., 2008). Além dos novos azóis, existem os antifúngicos que
atuam na inibição da síntese de 1-3 β-glucana, representados pelas
equinocandinas. Cryptococcus não é inibido pelas equinocandinas, por não
ter concentração significativa deste polissacáride em sua parede (Abruzzo et
al., 1997). Na busca de outros possíveis alvos de ação fungicida contra a
virulência de C.neoformans, Chayakulkeree et al. (2007) estudaram a
síntese de ácidos graxos e seu controle genético pela ação dos genes FAS1
e FAS2. Concluíram que eles podem, potencialmente, ser alvos fungicidas
para C.neoformans, além de possuirem efeito sinérgico com os azóis.
1.5 Resistência a antifúngicos
Devido ao crescimento da população imunocomprometida e do uso
cada vez mais freqüente de profilaxia e tratamento empírico com
antifúngicos, há grande preocupação dos especialistas sobre a possibilidade
de aumento de cepas de fungos resistentes a esses fármacos, incluindo
Cryptococcus spp. As maiores taxas de falha clínica, associadas à
resistência clínica são verificadas frente às drogas imidazólicas, mas alguns
estudos revelam o fato também com anfotericina B (Powderly et al., 1992a;
Canuto e Rodero, 2002; Loeffler e Stevens, 2003).
Resistência clínica é definida, classicamente, como persistência ou
progressão de uma infecção, mesmo com a administração do tratamento
antifúngico adequado. Resistência antifúngica, por sua vez, é um fenômeno
verificado in vitro, no qual o agente etiológico consegue se desenvolver na
presença de concentrações terapêuticas da referida droga.
As culturas de fungos, assim como as de outros microrganismos,
podem ser heterogêneas, ou seja, compostas de múltiplas cepas. Essa
12
diversidade reflete diferenças moleculares, que podem conferir perfis
distintos de resistência observados in vitro, que se denomina
heterorresistência (Falagas et al., 2008). Para os referidos autores, seria um
estágio precursor, que poderia ou não levar à emergência de cepas
resistentes. O significado clínico desse fenômeno não é conhecido, podendo
não haver nenhuma implicação em mudança terapêutica, desde que a
aquisição de resistência pode vir acompanhada de perda de virulência. A
heterorresistência ao fluconazol em Cryptococcus neoformans foi estudada
por Yamazumi et al. (2003), com base na descrição do fenômeno feita
anteriormente por Mondon et al. (1999). Os autores descreveram clones
resistentes e clones sensíveis, com determinação de CIMs altas e baixas,
dentro de uma única colônia de C.neoformans. Groll e Kolve (2004) citam
que, diferentemente das bactérias, nas quais a resistência pode emergir
rapidamente , com os fungos isso não ocorre, pela sua natureza eucariótica,
e pelo tempo maior de replicação. O patógeno pode ser intrinsicamente
resistente ao fármaco (resistência primária) ou pode desenvolver resistência
pela exposição à droga durante o tratamento, caracterizando resistência
secundária (Perea e Patterson, 2002; Groll e Kolve, 2004).
1.5.1 Determinação de sensibilidade a antifúngicos
Os estudos de sensibilidade in vitro aos antifúngicos começaram a ser
realizados na década de 60. Idealmente, devem fornecer informações
precisas a respeito da resistência de determinado fungo isolado de material
biológico de paciente, exatamente como os antibiogramas o fazem, frente às
infecções bacterianas (Johnson et al.,1996).
A indicação dos testes de sensibilidade antifúngica deve ser feita em
determinadas situações, como: i) cepas provenientes de pacientes
submetidos, previamente, a tratamento ou à profilaxia com antifúngicos , ii)
quando for constatada falha terapêutica , iii) se o agente etiológico pertencer
13
a espécie com sensibilidade pouco conhecida (Cuenca-Estrella e Rodriguez-
Tudela, 2002).
Os testes de sensibilidade antifúngica in vitro destinam-se a
determinar a concentração fungicida mínima (CFM) ou a concentração
inibitória mínima (CIM). A determinação de CFM pode ser feita por três
maneiras: 1) estimar a CFM partindo-se da determinação da CIM ; 2)
estimar a diluição do soro capaz de matar o organismo causador da infecção
(atividade fungicida do soro), obtendo-se soro de paciente em tratamento
antifúngico; 3) com uma concentração fixa do antimicrobiano, estima-se o
número de microrganismos sobreviventes em função do tempo (curva de
morte ou de mortalidade). O parâmetro mais tradicional para avaliar a
sensibilidade a antifúngicos é a CIM (Rodriguez-Tudela et al., 2003).
1.5.1.2 Concentração inibitória mínima (CIM)
Os métodos para determinação da CIM, por diluição em meio líquido
(macrodiluição em tubos e microdiluição em placas de microtitulação) são os
mais estudados, tanto por comitês de especialistas norte-americanos -
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), atualmente
denominado Clinical Laboratory Standards Institute-(CLSI), quanto por
comitês europeus- European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing (EUCAST). Os métodos são equivalentes e os valores de CIM são
correspondentes, conforme confirmado em distintos estudos (Rodriguez-
Tudela et al., 2001; Cuenca-Estrella et al., 2002; Espinel-Ingroff et al., 2005;
Dias et al., 2006; Rodriguez-Tudela et al., 2007b; Claudino et al., 2008).
Fitas de ágar impregnadas com gradiente de concentrações de
antifúngicos (Etest, AB - BioDisk, Suécia) também são utilizadas para a
determinação da CIM, e os resultados são comparáveis aos testes de
microdiluição dos comitês CLSI e EUCAST (Alves e Cury, 1992; Colombo,
1995; Claudino et al., 2008).
14
Estudos recentes avaliaram a utilidade do teste de sensibilidade
antifúngica em “tempo real”, aplicado ao gênero Candida, e concluíram que,
quando o teste é feito de rotina no laboratório assistencial, os médicos
consideram os resultados úteis, e, não infrequentemente, alteram o
tratamento, após o resultado do teste. Assim, teste de sensibilidade
antifúngica em candidemia pode servir como adjuvante do tratamento (Rex e
Pfaller, 2002; Baddley et al., 2004).
Dado um determinado resultado de sensibilidade a antifúngico,
expresso em valores de CIM, busca-se a interpretação desse dado. A
classificação da sensibilidade do agente etiológico, denominado breakpoint,
(ponto de corte, valor acima do qual o agente infeccioso estudado é
resistente, in vitro, ao antifúngico testado) ainda não existe para cepas de
Cryptococcus spp. Em 1997, o subcomitê de testes antifúngicos do CSLI
propôs breakpoints para interpretar CIMs de FCZ contra cepas de Candida
spp. Esses breakpoints, que foram subsequentemente incorporados ao
documento M27-A, são os seguintes: CIM < 8 µg/mL para a categoria
sensível, CIM de 16µg/mL e 32 µg/mL para classe de cepas com
sensibilidade dependente da dose- SDD- e CIM > 64 µg/mL para o grupo de
resistentes (Rex et al., 1997). Esses breakpoints foram derivados, na maior
parte, de estudos com candidíase de mucosa oral em pacientes com aids
(Rex et al., 2001), e foram reavaliados por Rex e Pfaller, em 2002.
Em relação à criptococose, grupos norte-americanos e europeus têm
se empenhado em melhorar a sensibilidade dos testes in vitro, no intuito de
conhecer o perfil de sensibilidade de seu principal agente, Cryptococcus
neoformans, para guiar o tratamento clínico (NCCLS, 1997; Cuenca-Estrella
et al., 2001; NCCLS, 2002).
Devido a limitações do teste de sensibilidade in vitro, ele não é
rotineiramente recomendado na prática clínica de acompanhamento de
pacientes com CSNC associada à aids (Rex et al., 2001).
O número de estudos que têm estabelecido o valor da sensibilidade
antifúngica como preditor de resposta clínica em pacientes com infecção por
C.neoformans ainda é limitado (Casadevall et al., 1993; Birley et al., 1995;
15
Armengou et al., 1996; Groll e Kolve, 2004). Por isso, breakpoints para este
patógeno ainda não foram estabelecidos.
A baixa ou ausente sensibilidade de um agente etiológico ao
antifúngico é somente um dos elementos que contribuem para a resistência
clínica. Outros fatores que determinam a resistência clínica incluem a
farmacocinética do antifúngico usado, fatores individuais do hospedeiro,
doença de base e sítio de infecção (Perea e Pattersom, 2002).
1.5.1.3 Concentração inibitória mínima ”farmacodinâmica”
Embora CIM expresse a atividade de um antimicrobiano sob certas
condições in vitro, ela não leva em conta outros fatores que contribuem para
a evolução clínica in vivo, como concentrações séricas e tissulares do
antimicrobiano. As novas abordagens para avaliar eficácia de antifúngicos
envolvem conceitos farmacocinéticos e farmacodinâmicos. O pico sérico e a
meia vida (T ½), definida como o tempo necessário para que a concentração
da droga caia à metade do pico máximo, são importantes para o cálculo do
intervalo das doses. A concentração plasmática da droga ao longo de 24h,
denominada área sob a curva (AUC) é outro conceito farmacocinético bem
utilizado, e representa o total da droga exposta. Dentre os parâmetros
farmacodinâmicos, os mais importantes são: i) relação AUC/CIM, ii) efeito
pós-antibiótico, ou seja, a manutenção da atividade antifúngica mesmo com
níveis séricos abaixo da CIM , iii) característica da droga, se é concentração-
dependente ou tempo-dependente. Outros valores farmadinâmicos, são: i)
volume de distribuição (Vd), entendido como aquele a ser administrado para
que a droga total alcance o nível terapêutico e ii) plateau ou steady-state
(estado de equilíbrio dinâmico), que representa o nível sérico de equilíbrio,
que ocorre após cerca de quatro doses de antifúngico (Andes, 2003; Groll e
Kolve, 2004).
A avaliação das relações farmacocinéticas e farmacodinâmicas em
humanos, têm, como base, modelos experimentais de infecção. Os estudos
16
em modelos animais permitem analisar parâmetros, tais como: Cmax/CIM
(concentração máxima/CIM), AUC/CIM (área sob a curva/CIM) e tempo que
a concentração plasmática fica acima da CIM (Ttau>CIM). Valores de
breakpoints são determinados de acordo com a evolução clínica e dentro do
enfoque farmacológico, fornecendo subsídios para medir a eficácia
antifúngica (Groll et al., 2003; Groll e Kolve, 2004).
Outros testes in vitro podem ser avaliados, em busca de parâmetros
que possam se somar à CIM, no estudo da correlação clínico-laboratorial da
CSNC em aids.: - teste de curva de morte, que estuda a relação entre a
droga e o agente infeccioso de forma dinâmica, e não estática, como o teste
de microdiluição; - teste de tabuleiro do xadrez, que analisa a combinação
de drogas.
1.5.1.4 Curvas de morte
A curva de morte expressa a porcentagem de microorganismos
mortos produzida por uma concentração fixa do antifúngico em condições
pré-estabelecidas, contando-se o número de células viáveis a intervalos
periódicos de incubação. Gráficos tipo dose (tempo)-resposta podem ser
construídos, na base log 10, para ilustrar a diferença (%) entre as contagens
das amostras segundo os distintos períodos de incubação. O ponto final de
reação (endpoint) é definido como a taxa de morte > 99,9 % em relação à
contagem de colônias no tempo zero. Uma vantagem do teste é que ele
oferece informação da dinâmica no tempo da ação de um antifúngico sobre
o agente etiológico. Podem ser ensaiadas várias concentrações da droga,
como fizeram Klepser et al. (1997b;1998b), que estudaram a atividade de
fluconazol e AMB contra isolados de C. albicans e C.neoformans usando
esse método.
1.5.1.5 Teste do tabuleiro de xadrez
17
Para pacientes sob uso de drogas combinadas, pode ser interessante
a avaliação in vitro dessa interação, e suas conseqüências na atividade
antifúngica. Vários modelos experimentais existem para medir o efeito de
combinações de antimicrobianos (Eliopoulos e Moellering Jr.,1996; Odds,
2003). Um dos mais conhecidos e simples é o que emprega um conjunto
bidimensional de concentrações seriadas de duas drogas. Os resultados
permitem calcular o chamado índice de concentração inibitória fracionada
(ICIF). O termo “tabuleiro de xadrez” se refere ao arranjo de tubos, ou de
poços de microplacas, preeenchidos com múltiplas concentrações de cada
um dos dois antifúngicos (Odds, 2003; Johnson et al., 2004).
Para Groll e Kolve (2004), os métodos para avaliação de sensibilidade
a antifúngicos estão sendo continuadamente refinados, e as relações
concentração-efeito in vivo e in vitro estão sendo crescentemente
exploradas. Apesar de tudo isso, as infecções fúngicas invasivas são difíceis
de diagnosticar e de tratar e, porisso, novas abordagens devem ser
desenvolvidas e colocadas em prática, para manejo dessas infecções (Rex
et al., 1997; Groll et al., 2001; Andes, 2003a).
18
2 Objetivos
2.1 Geral
Avaliar parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos de
anfotericina B e fluconazol como preditores de falha clínica em criptococose
de sistema nervoso central associada à aids.
2.2 Específicos
1. Analisar fatores clínicos, terapêuticos e laboratoriais na evolução
clínica de pacientes com aids e criptococose de sistema nervoso
central
2. Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol
(FCZ) e anfotericina B (AMB) frente aos isolados de Cryptococcus
neoformans, como parâmetro isolado e sob o ponto de vista
farmacodinâmico
3. Verificar a razão da concentração de FCZ e AMB, entre líquido
cefalorraquideano e plasma
4. Avaliar, in vitro, por método do tabuleiro de xadrez, a atividade da
associação de AMB e FCZ frente ao agente etiológico da criptococose
5. Correlacionar CIM e efeito fungicida para AMB
6. Verificar diversidade do perfil de sensibilidade do agente etiológico em
pacientes com isolados múltiplos
7. Comparar sensibilidade dos isolados frente a itraconazol e fluconazol,
para verificação de resistência cruzada
19
3 Material e Métodos
O estudo analisou, retrospectivamente, uma coorte de 21 pacientes,
de 09/2004 a 06/2005, com avaliações no momento do diagnóstico e da
internação, na 2ª semana e no 3º mês de doença. As informações foram
retiradas de prontuários médicos. O projeto foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa (Anexos) do Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER)
e pelo Comitê de Ética do Instituto Adolfo Lutz (IAL) , onde foram executados
os procedimentos micológicos e testes de sensibilidade a drogas
antifúngicas.
3.1 Pacientes
O grupo foi composto, inicialmente de 32 pacientes com criptococose
de sistema nervoso internados no IIER entre setembro de 2004 e março de
2005. Desse grupo, cinco casos foram excluídos, por não terem aids. De
outros seis pacientes as amostras de plasma e/ou LCR não foram
emparelhadas para a realização de cultura e, por esse motivo, foram
também excluídos deste estudo.
O grupo desta tese foi constituído por 21 pacientes com aids
(CDC,1987), maiores de 13 anos, sendo 15 (71,4%) com episódio inicial de
criptococose de sistema nervoso central e aids. Os demais pacientes se re-
internaram com recidiva da doença (p1,p2,p3,p8,p17,p20). Todo paciente,
ou seu responsável, assinou o termo de consentimento (Anexos).
Os seguintes dados foram compilados: identificação do paciente,
sexo, idade, contagem de linfócitos T CD4, pesquisa de sítio extraneural do
agente etiológico, exames de LCR (quimiocitológico, exame direto com tinta
da China, pesquisa do antígeno polissacarídico de Cryptococcus
neoformans, número de células fúngicas, índice de gemulação e cultura),
20
sinais e sintomas associados à criptococose, controle da pressão
intracraniana (PIC), terapêutica antifúngica instituída, tratamento
antiretroviral, presença de outra IO além da criptococose, evolução clínica e
seguimento micológico durante o tempo da internação do paciente
(Apêndice 1). Avaliação clínico/laboratorial foi realizada na 2ª semana
(endpoint clínico precoce) e no 3º mês (endpoint clínico tardio).
Os critérios de inclusão dos casos de CSNC foram: i) pacientes com
idade maior ou igual a 13 anos, de ambos os sexos , ii) 1ª coleta de LCR
com cultura positiva para Cryptococcus spp. e feita no momento do
diagnóstico do primeiro episódio de CSNC, iii) diagnóstico prévio de
criptococose, com recidiva, iv) diagnóstico de aids segundo normas do
CDC-1987 , v) prontuário médico disponível no Serviço de Arquivo Médico
(SAME) do IIER.
Cura clínica da CSNC foi definida como remissão total ou parcial dos
sinais e sintomas que levaram ao diagnóstico de CSNC e internação do (a)
paciente. Cura micológica foi considerada quando houve resultado negativo
para isolamento do agente etiológico em cultura de LCR.
Falha clínica da CSNC foi definida como um dos seguintes critérios,
além da ausência daqueles definidos para cura clínica: i) cultura positiva
para Cryptococcus spp. no LCR, em período próximo ao óbito (duas
semanas), ii) atestado de óbito com causa mortis “CSNC”.
Casos de recidiva foram definidos em pacientes que apresentavam
um ou mais dos seguintes critérios: i) episódio prévio confirmado
laboratorialmente de CSNC, com resolução dos sintomas, por tempo maior
ou igual a um mês, depois do tratamento; ii) aderência relatada ao
tratamento da fase de manutenção com 200 mg de FCZ/dia ; iii) recorrência
dos sinais e sintomas de CSNC; iv) teste do antígeno para Cryptococcus
spp. positivo e/ou cultura positiva para C. neoformans no LCR posterior a
exame negativo desses testes; v) piora clínica, com nova internação e
aumento da dosagem de FCZ; vi) mudança de terapêutica antifúngica, de
FCZ para AMB; vii) nenhum outro diagnóstico alternativo.
21
3.2 Amostras biológicas
Amostras biológicas (LCR, sangue, urina e, eventualmente, outro
material de localização anatômica da infecção) foram coletadas de cada
paciente, conforme a solicitação médica e a rotina da enfermagem do IIER.
No Pronto Socorro (PS) do IIER, as amostras foram colhidas quando
solicitadas, sem horários pré-estabelecidos. Nas enfermarias, geralmente, a
coleta de material biológico ocorreu quatro horas após, ou duas horas antes
da administração de AMB (iniciada, aproximadamente, às 10 horas da
manhã) e da primeira dose de FCZ. Fluconazol é dado duas vezes ao dia: a
primeira dose às 10 horas e a segunda às 22 horas.
3.3 Exames laboratoriais de rotina
Os seguintes exames foram realizados no Laboratório do IIER:
quimiocitológico de LCR, pesquisa do antígeno polissacarídico no LCR e no
sangue, qualitativa e quantitativa, por reação de aglutinação com soro imune
adsorvido em partículas de látex (Immuno-Mycologics Inc.,OK,EEUU),
exame direto para fungos no LCR, tinta da China no LCR e cultura para
fungos (LCR, sangue e urina). O laboratório foi responsável pela contagem
de linfócitos T CD4, assim como pela realização de outros exames de rotina
solicitados pelo médico assistente do (a) paciente.
3.4 Exames micológicos
O exame direto foi feito utilizando-se tinta da China (Warren e
Shadomy, 1991), assim como o cálculo do índice de gemulação-IG-(número
de células em brotamento/100 células da levedura).
22
A cultura, para isolamento do agente, foi realizada em ágar
Sabouraud com cloranfenicol (100 µg/mL) incubado a 37o C, por período
máximo de 14 dias (Lacaz et al., 1991). As amostras das leveduras foram
identificadas no Laboratório do IIER, segundo análise morfológica, o que
permitiu a sua classificação dentro do gênero Cryptococcus (Fell e Statzell-
Tallman, 1998). Posteriormente, os isolados foram enviados e congelados
na Seção de Micologia do Serviço de Parasitologia, Divisão de Biologia
Médica, do Instituto Adolfo Lutz (IAL) de São Paulo, onde foram submetidos
à identificação acurada e testes de sensibilidade antifúngica.
A identificação da espécie foi feita por análise das características
bioquímicas, em provas de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio.
Os caracteres morfológicos foram estudados segundo a metodologia
descrita por Fell e Statzell-Tallman, 1998. Cepas caracterizadas como
Cryptococcus spp. foram submetidas ao meio CGB (canavanina, glicina e
bromotimol), assim como a prova de assimilação de D-prolina (Kwon-Chung
e Bennett,1992), para a diferenciação das duas espécies.
3.5 Testes de sensibilidade in vitro frente à AMB, FCZ e ITZ
3.5.1 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
As amostras de Cryptococcus neoformans foram mantidas sob
temperatura de -20oC conforme metodologia descrita por Nery et al., em
2001, até o momento dos testes. Amostras de LCR isoladas de um mesmo
paciente foram processadas imediatamente, segundo metodologia descrita
na publicação M27-A2 (NCCLS, 2002) modificada por EUCAST(2003). As
cepas isoladas foram testadas in vitro frente à AMB, FCZ e ITZ. As cepas-
padrão de referência foram: C.krusei ATCC 6258 e C.parapsilosis ATCC
22019, utilizadas em todas as placas de microdiluição, para validar cada
prova. O meio usado no estudo foi RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, USA) sem
bicarbonato de sódio e com L-glutamina.
23
Os resultados foram expressos em CIM (µg/mL). Para FCZ, a
interpretação foi a de Aller et al. (2000), segundo a qual, valores de MIC de
16 ug/mL classificam as cepas como resistentes a este azol. Para AMB, a
interpretação utilizada foi a adotada por Shadomy e Pfaller (1992) e Nolte et
al. (1997), segundo os quais, valores de CIM >2 µg/mL classificam as cepas
como resistentes a este polieno.
Para ITZ, a interpretação adotada foi a descrita no doc. M27-A2
(NCCLS, 2002), sendo sensível para CIM < 0,125 µg/mL, SDD em CIM entre
0,25 e 0,5 µg/mL e resistente para CIM > 1,0µg/mL.
AMB foi adquirido comercialmente (Sigma, St.Louis,USA) e FCZ foi
cedido pela empresa fabricante, Pfizer do Brasil. Itraconazol foi cedido pela
empresa fabricante, Janssen do Brasil. Cada um desses antifúngicos foram
avaliados em dez concentrações diferentes. Inicialmente, foram preparadas
as soluções-mãe, conforme recomendação do documento M27-A2 (NCCLS,
2002). As soluções-mãe de AMB e ITZ, na concentração de 1600 ug/mL,
foram preparadas em DSMO (dimetilsulfóxido) e a de FCZ, na concentração
de 5120 ug/mL, foi preparada em água destilada.
As soluções-uso, para serem colocadas nas placas de microtitulação,
foram preparadas de modo que as concentrações finais dos antifúngicos,
após a adição do inóculo de levedura, variaram de 64 µg/mL a 0,125 µg/mL
para FCZ, e de 16 µg/mL a 0,03 µg/mL, para AMB e ITZ. Cada antifúngico
foi distribuído, em alíquotas de 100µL, em uma placa de microtitulação,
desde a coluna 2 até a 11, correspondendo, a cada coluna, uma
concentração. As placas foram então congeladas à temperatura de -70οC
até o momento do uso, por período máximo de seis meses (EUCAST, 2008).
Um inóculo de cada amostra das leveduras isoladas de pacientes foi
preparado com o auxílio da escala de McFarland como suspensão salina em
concentração de 1 a 5.105 ufc/mL (EUCAST, 2003). Alíquotas de 100 µL de
cada inóculo foram colocadas nos poços das placas contendo antifúngicos, e
sua concentração final foi reduzida à metade (0,5 a 2,5 x 105 ufc/mL). Em
cada placa foram colocados inóculos de 6 leveduras, sendo as duas últimas
fileiras (G e H) destinadas às cepas-padrão, para controle interno de
24
qualidade do teste. O controle de esterilidade, preparado em toda a coluna
1, foi feito com o meio RPMI, sem antifúngico e sem inóculo, o qual serviu
também, na hora da leitura, como “branco” do espectrofotômetro. O controle
de crescimento, denominado de controle positivo, foi colocado na coluna 12,
sendo preparado com 100µL de RPMI e 100 µl de inóculo.
As placas foram, então, tampadas e incubadas à 35°C, em estufa
incubadora. A leitura de turbidez, resultante do crescimento das amostras,
foi realizada às 48h e, se necessário, às 72h. A absorbância dos orifícios foi
lida em espectrofotômetro (TITERTEK MULTISCAN, FLOW, Suécia) a 492
nm, e os valores foram registrados em impressora, para posterior
compilação e análise de resultados.
O ponto de leitura ou “endpoint”, que indicou a concentração inibitória
mínima (CIM) de fluconazol e itraconazol foi o que permitiu inibição de 50%
do crescimento (“inhibition concentration” ou IC50) de cada amostra de
leveduras, em relação ao seu controle positivo. Para AMB, o ponto de leitura
foi o que inibiu 90% (IC90) do crescimento de cada amostra (EUCAST,
2003). Um esquema de placa e resultado de CIMs para anfotericina B consta
da Figura 1.
25
Figura 1. Esquema de placa de microtitulação contendo concentrações
(µg/mL) de anfotericina B para determinação de CIM, segundo EUCAST.
C+: controle-positivo ou de crescimento, C-: controle-negativo ou
esterilidade, ATCC: American Type Culture Collection, números de cepas-
padrão (Gentileza: Giovane Coutinho).
3.5.2 Curvas de morte
As culturas foram subcultivadas duas vezes em placas de ágar
dextrose batata, previamente, aos testes de curva de morte, segundo
recomendado por Klepser et al. (1997a). Três a cinco colônias, após
crescimento de 24-48 h na placa, foram suspensas em 9 mL de água estéril.
A suspensão foi ajustada, de acordo com a leitura espectrofotométrica, à
mesma turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente
1.106 a 5.106 ufc/mL). Um mililitro da suspensão ajustada foi adicionada a 9
mL de RPMI 1640 tamponado com tampão MOPS. Isso resultou em diluição
da suspensão fúngica em 1:10, tornando-a com 1.105 a 5.105 ufc/mL. O
CCCC---- C+ C+ C+ C+ CCCC
Anfotericina B (µg/mL) 16 16 16 16 8 8 8 8 4 4 4 4 2 2 2 2 1 1 1 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,030,5 0,25 0,12 0,06 0,030,5 0,25 0,12 0,06 0,030,5 0,25 0,12 0,06 0,03
ATCC 6258ATCC 6258ATCC 6258ATCC 6258
ATCC 22019ATCC 22019ATCC 22019ATCC 22019
6 Amostras
26
inóculo foi também transferido à solução de 1 µg/mL de AMB (diluição 1:10).
O limite de detecção do teste foi 33 ufc/mL. Alíquotas de 30 µL dessa
suspensão foram plaqueadas em ágar batata e incubadas a 35o C. Este
procedimento foi considerado tempo zero (T0) de incubação com a droga.
Em tempos pré-determinados, de 6h, 12h, 24h, 48h e 72 h, alíquotas de 100-
µL foram removidas da suspensão com antifúngico, diluídas em RPMI na
razão de 1:10 e plaqueadas como descrito. Esses procedimentos
constituíram os tempos T6, T12, T24, T48, e T72. Após 72h de incubação a
35°C, as colônias foram contadas para elaboração da curva de morte de
cada amostra de levedura. O tempo para alcançar >99,9% de redução do
inóculo inicial foi determinado para cada isolado (Pearson et al., 1980).
Atividade fungicida (endpoint) foi, portanto, considerada quando o número de
unidades formadoras de colônias (ufc) por mililitro foi <99,9%, quando
comparada ao tamanho do inóculo inicial sem a droga. Controle-positivo de
crescimento do inóculo foi preparado em solução de RPMI sem adição de
AMB e, do mesmo modo, foi preparado de T0 a T72.
A contagem (log10 do número de ufc/mL) versus tempo foi inserida em
gráficos, para estudo de comparações da atividade antifúngica. Uma curva
de morte versus tempo foi feita para cada isolado e comparado com o valor
de CIM. Uma curva de morte com valores médios, contemplando todas as
amostras, foi elaborada e comparada com a curva do controle-positivo. A
técnica permitiu estimar a diminuição no número de fungos viáveis ao longo
do tempo.
3.5.3 Teste do tabuleiro de xadrez
A atividade relativa de fluconazol e anfotericina B foi medida através
desse método, derivado do procedimento-padrão estabelecido pelo CLSI
para microdiluição em caldo para estudo de teste de sensibilidade
antifúngica (NCCLS, 2002). O teste foi feito em meio RPMI 1640 (Cultilab,
Br) tamponado em pH 7,0, com 0,165 M de ácido
27
morfolinopropanelsulfônico(MOPS). Volumes de 50 µL de cada droga em
concentração de 4 vezes a concentração final foram dispensados em
orifícios das placas de microtitulação, entre as colunas 2 a 11 e as fileiras A
a G.
As concentrações finais de agentes antifúngicos variaram de 16µg/mL
a 0,25µg/mL, para FCZ, e de para 4µg/mL a 0,008 µg/mL para AMB. Inóculo
fúngico (100 µL), preparado por espectrofotometria e depois diluído para
obter concentrações variando de 1.105 a 5.105 ufc/mL, foi adicionado aos
orifícios contendo antifúngicos (Petrou e Rogers, 1991). Controle-positivo foi
preparado com inóculo e RPMI (100 µL de cada) no orifício H1. Controle-
negativo contendo 200 µl de RPMI foi adicionado ao orifício A1. Em todos os
orifícios da coluna 12 foram colocadas concentrações de fluconazol e
inóculo em parte iguais (100 µL), de modo a obter gradiente de 32 µg/mL a
0,25µg/mL. Do mesmo modo, na fileira H foram preparadas concentrações
finais de anfotericina B de 8 µg/mL a 0,015 µg/mL e inóculo. Desse modo,
em cada placa, foi avaliado um isolado de C.neoformans frente a fluconazol
e anfotericina B isoladamente e em associação dessas drogas (Figura 2). As
placas foram incubadas a 35o C e lidas depois de 48h a 72h. A leitura foi
feita a “olho nu” e por espectrofotometria, com leitor de placas (Titertek
Multiskan, Flow, Suécia) em 492 nm.
O endpoint do teste combinatório, com AMB e FCZ, foi a menor
concentração de cada droga, que inibiu completamente o crescimento da
amostra, representada por turbidez zero (Figura 3). Foi considerada CIM de
anfotericina B, a menor concentração da coluna H, que inibiu completamente
(turbidez zero) o crescimento do isolado avaliado. A CIM de FCZ foi a
concentração inibitória mínima da droga distribuída na coluna 12 , que
permitiu inibição de 50% do crescimento (“inhibition concentration” ou IC50)
da amostra de leveduras, em relação ao controle positivo.
Para avaliar o efeito combinatório de fluconazol e anfotericina B, se
sinérgico, aditivo, indiferente ou antagônico, foi adotado o índice de
concentração inibitória fracionada (ICIF). ICIF é obtido com a soma da
concentração inibitória fracionada (CIF) da droga a mais a CIF da droga b. A
28
CIF da droga a é a soma da CIM quando ela é usada em combinação com
a droga b dividido pela CIM da droga a quando ela é usada sozinha. A
interação é definida como sinérgica quando o ICIF é menor ou igual a 0,50.
Aditiva quando ICIF > 0,50 e < 1,0, indiferente se ICIF >1 e < 4 e antagônica
quando ICIF > 4,0 (Clancy et al., 1997; Patterson et al., 2000; Odds, 2003;
Rodriguez-Tudela et al., 2003; Johnson et al., 2004).
Os testes foram feitos em duplicata e o cálculo da CIF de cada droga foi feito
segundo a fórmula:
A + B = CIF A + CIF B = ICIF
CIM a CIM b
onde,
A= CIM do fármaco a em combinação
CIM a= CIM do fármaco a sozinho
B= CIM do fármaco b em combinação
CIM b = CIM do fármaco b sozinho
29
Figura 2. Esquema de placa de microtitulação contendo
concentrações (µg/mL) de fluconazol (em itálico) e anfotericina B (em
negrito) para teste do xadrez. C+, controle positivo de crescimento;
C-, controle negativo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A C- 16
4
16
2
16
1
16
0,5
16
0,25
16
0,12
16
0,06
16
0,03
16
0,015
16
0,008
32
B 8
4
8
2
8
1
8
0,5
8
0,25
8
0,12
8
0,06
8
0,03
8
0,015
8
0,008
16
C 4
4
4
2
4
1
4
0,5
4
0,25
4
0,12
4
0,06
4
0,03
4
0,015
4
0,008
8
D 2
4
2
2
2
1
2
0,5
2
0,25
2
0,12
2
0,06
2
0,03
2
0,015
2
0,008
4
E 1
4
1
2
1
1
1
0,5
1
0,25
1
0,12
1
0,06
1
0,03
1
0,015
1
0,008
2
F 0,5
4
0,5
2
0,5
1
0,5
0,5
0,5
0,25
0,5
0,12
0,5
0,06
0,5
0,03
0,5
0,015
0,5
0,008
1
G 0,25
4
0,25
2
0,25
1
0,25
0,5
0,25
0,25
0,25
0,12
0,25
0,06
0,25
0,03
0,25
0,015
0,25
0,008
0,5
H 8
4 2 1
0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 0,015 0,25
30
Figura 3 . Esquema de resultado teste do xadrez com fluconazol (em
itálico) e anfotericina B (em negrito). CIM e CIM: concentração
inibitória mínima de anfotericina B e fluconazol.
*Concentração inibitória fracionada de cada droga. C+, controle
positivo de crescimento; C-, controle negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A C- 16
4
16
2
16
1
16
0,5
16
0,25
16
0,12
16
0,06
16
0,03
16
0,015
16
0,008
32
B 8
4
8
2
8
1
8
0,5
8
0,25
8
0,12
8
0,06
8
0,03
8
0,015
8
0,008
16
C 4
4
4
2
4
1
4
0,5
4
0,25
4
0,12
4
0,06
4
0,03
4
0,015
4
0,008
8
D 2
4
2
2
2
1
2
0,5
2
0,25
2
0,12
2
0,06
2
0,03
2
0,015
2
0,008
4
E 1
4
1
2
1
1
1
0,5
1
0,25
1
0,12
1
0,06
1
0,03
1
0,015
1
0,008
2
CIM
F 0,5
4
0,5
2
0,5
1
0,5
0,5
0,5
0,25
0,5
0,12
0,5
0,06
0,5
0,03
0,5
0,015
0,5
0,008
1
G 0,25
4
0,25
2
0,25
1 *
0,25
0,5
0,25
0,25
0,25
0,12
0,25
0,06
0,25
0,03
0,25
0,015
0,25
0,008
0,5
H C+ 8
4 2 1
CIM
0,5
0,25 0,12 0,06 0,03 0,015 0,25
31
3.5.4 Dosagem de AMB e FCZ
As dosagens séricas e liquóricas de AMB e FCZ foram feitas no
Laboratório de Farmacologia Terapêutica - Unidade de Pesquisa Clínica do
Departamento de Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo (USP), através de cromatografia líquida de alta
precisão (HPLC), conforme metodologias padronizadas previamente (Perez
et al., 2005; 2006; Perez, 2007). O método para quantificação de FCZ e
AMB em pequenos volumes de material biológico (200 µL de LCR e plasma)
serviu para investigação da penetração dos fármacos no SNC.
3.5.4.1 Extração de fluconazol e de anfotericina B
Os padrões de referência foram fornecidos com os laudos de pureza e
documentação complementar dada pela indústria farmacêutica. A água
ultrapura para o procedimento foi obtida dos sistemas MILLIQ-MILLIDI R,
MILLIPORE do Brasil.
Para a determinação de níveis plasmáticos de AMB, foi utilizada a
precipitação de proteínas do plasma com o solvente acetonitrila. Assim,
amostras de 500 µL de plasma foram pipetados para tubos de Eppendorf
contendo padrão interno adicionado a 1 mL de acetonitrila. A mistura foi
agitada em vórtex por 10 segundos, seguida de centrifugação a 600 rpm por
40 minutos, aspiração do sobrenadante e descarte do resíduo sólido. Do
sobrenadante decantado foi transferida uma alíquota de 100 µL para tubo
cônico e o extrato foi concentrado à secura sob fluxo de nitrogênio ou ar
comprimido. Depois, o extrato seco foi dissolvido com 100 µL de solução de
lavagem e volumes entre 20 e 50 µL foram injetados automaticamente no
cromatógrafo.
Para a determinação de níveis plasmáticos de FCZ, foi utilizada
extração simples em fase líquido-líquido. Às amostras de 500 µL de plasma
contendo padrão interno foram adicionadas 3 mL de diclorometano. A
mistura foi agitada em vórtex por 1 minuto, seguida de centrifugação a 600
32
rpm por 40 minutos, separação das fases por aspiração do sobrenadante
com descarte da fase aquosa. O tubo de extração contendo a fase orgânica
foi imerso em banho de nitrogênio líquido para o congelamento e separação
da fase aquosa residual. O extrato orgânico foi transferido para tubo cônico e
concentrado à secura sob fluxo de nitrogênio ou ar comprimido. Em seguida,
o extrato seco foi dissolvido em 100 µL de solução de lavagem, e volumes
de 50 µL foram injetados automaticamente no cromatógrafo.
Tanto para AMB quanto para FCZ no LCR, não foi necessária a
purificação que precede a quantificação através da cromatografia.
3.5.4.2 Análise cromatográfica
As análises foram realizadas por cromatografia líquida de alta
eficiência e detector de ultra-violeta (CLAE-UV) em cromatógrafo líquido
(SHIMADZU-10 A, Japão), utilizando coluna de fase reversa Nova Pack de 4
mícron, C18, 150x 3,9 mm, comprimento X diâmetro interno. A fase móvel
binária foi constituída de água UP e acetonitrila (85:15 v/v), sob vazão de 0,5
mL/min, em sistema isocrático de eluição. Os picos referentes aos
compostos de interesse foram monitorados através de um detector de
ultravioleta SHIMADZU SPD-10A no comprimento de onda de 210 nm para
FCZ e 340 nm para AMB . A integração da área dos picos dos fármacos e
padrão interno foi feita utilizando-se um registrador-integrador (Cromatopac
CR-6 A–SHIMADZU, Japão).
As concentrações dos antifúngicos nas matrizes biológicas dos
pacientes foram estimadas a partir da curva de calibração do dia em plasma
(6-10 pontos) e seis controles de qualidade (CQ) internos (CQs alto, médio e
baixo, em duplicata), para a aceitação da curva/dia, que possibilitou o
cálculo da concentração desses antifúngicos no plasma. O mesmo foi feito
para a determinação das concentrações liquóricas, a partir da curva de
calibração e CQs em solução salina.
33
Para fluconazol, os níveis plasmáticos (pico e AUC) teóricos e
previstos na bula do produto comercializado, foram utilizados para cálculo
das relações pico/CIM e AUC/CIM.
3.6 Análise estatística
Os resultados das dosagens in vivo foram analisadas por estatística
paramétrica ou não paramétrica, e análise de variância para medidas
repetidas, através dos programas estatísticos GraphPad Software
Incorporated, GradPad Instat e GMC Basic Software. A correlação entre CIM
e efeito fungicida foi analisada pelo coeficiente R. Os resultados foram
expressos por limites, superior e inferior, e faixa de variação.
Os valores de CIM foram analisados em média, mediana, moda,
intervalo, CIM50 e CIM90.
Todos os dados categóricos foram calculados na forma de frequência
absoluta (n) e relativa (%); foram comparados através do teste de Qui-
Quadrado de Pearson, ou Teste Exato de Fisher, de acordo com o tamanho
da amostra. Os dados contínuos e semi-contínuos foram analisados em
mediana e quartis e comparados através do teste de Mann-Whitney.
Para avaliar a correlação entre variáveis contínuas e semi-contínuas
entre as duas variáveis foi realizado teste de Spearman (Spearman’s rho),
sendo atribuído a este índice de correlação (r) a variação de zero a um,
sendo valor 1 a correlação ideal e valor > 0,4, boa correlação. Foi
considerado, para todo o estudo, p<0,05 para rejeitar a Hipótese de
Nulidade.
34
4 Resultados
4.1 Aspectos clínicos, laboratoriais, terapêuticos e evolução
Os aspectos clínicos e terapêuticos do grupo analisado neste estudo
constam do Apêndice 1. Os vinte e um pacientes que fizeram parte do
estudo foram seguidos, prospectivamente, no período de setembro de 2004
a março de 2005. Havia dezessete homens e quatro mulheres, com idade
entre 28 e 54 anos e o fator idade não foi correlacionado com óbito (Mann-
Whitney, p=0,439).
O estado mental, avaliado no momento da entrada do paciente ao
Pronto Socorro do IIER, foi citado em 18 prontuários (18/21; 85,7%) ,
constando “discreta agitação e agressividade” ou “discreta confusão mental”.
Sinais e sintomas mais comuns nos 21 pacientes foram: cefaléia (17/21;
80,95%), náuseas e/ou vômitos (10/21; 47,6%) e febre (8/21; 38,1%).
Dos 21 pacientes, 5 (5/21= 23,8%) foram a óbito, todos do sexo
masculino (p1,p2,p6,p12,p17). Três óbitos (3/5;60%) foram, diretamente,
relacionados à criptococose (p2, p6 e p12). No dia do óbito, dois (2/3;
66,7%) pacientes estavam em uso de AMB (p6,p12) e um (1/3; 33,3%) em
uso de FCZ (p2). Dois (2/3; 66,7%) destes pacientes usavam HAART na
ocasião.
Dezoito pacientes receberam, inicialmente, AMB, em dose diária de
50 mg. Os casos 17 e 20 usaram somente FCZ, e o caso 2 usou FCZ por
uma semana, antes de receber AMB. O uso de FCZ não foi associado a
óbito (Mann-Whitney, p=0,360).
Insuficiência renal foi diagnosticada em sete (7/21; 33,33%) casos
(p1,p3,p10,p12,p14,p16,p18). Doze (12/21;56,87%) pacientes não tiveram
comprometimento renal e em dois prontuários não havia essa informação.
Não houve relação entre uso de AMB e insuficiência renal (Qui-quadrado, p=
0,412) ou IRA por uso de AMB e óbito (Pearson, p=0,643) (FIGURA 4).
35
Figura 4. Freqüência de insuficiência renal aguda (IRA) e uso de anfotericina B (AMB) em pacientes com criptococose e aids.
Quinze casos eram de primeiro episódio de CSNC, e seis eram de
recidiva. No total, foram coletadas quarenta e uma amostras de LCR. No dia
da coleta de líquor e/ou plasma (Apêndices 2 e 3), os pacientes p1 e p2
estavam em uso de 200 mg/dia de FCZ. P1 iniciou AMB no 1º dia de
internação, após o resultado de LCR. P2 usou 200 mg/dia de FCZ de15/09 a
22/09/04, quando passou a usar AMB. O 1º episódio de CSNC de p3 foi em
08/2004. Na internação de 07/01 a 15/03/05, usou AMB de 12/01 a 19/01/05.
O fármaco foi suspenso por elevação dos níveis de uréia e creatinina
séricas. Usou FCZ (800 mg/dia) até o dia da alta, e no dia da coleta, já
estava em uso de FCZ. P8 teve o 1º episódio de CSNC em 05/2004. Fez
seguimento clínico posterior irregularmente. Em 13/10/04(dia da coleta)
usava FCZ, em dose não citada no prontuário. P17 teve o 1º episódio de
CSNC em 04/2004. Na internação de 01/11/04 a 29/01/05(data do óbito),
usou 400 mg/dia de FCZ o tempo todo. No prontuário, essa dose é citada
como sendo profilaxia secundária. P 20 teve o 1º episódio de CSNC em
IRA em uso de AMB Sim Não
N
10
8
6
4
2
0
Sim Não
AMB
36
06/2004. Na internação de 29/01 a 18/02/05, quando coletou material para
este estudo, usou 800 mg/dia de FCZ o tempo todo.
Os pacientes p5 (2 amostras, uma sem antifúngico, e outra sob uso
de FCZ) e p15 usavam 400 mg/dia de FCZ. O paciente p9 tem 2 amostras,
ambas sob 800 mg/dia de FCZ. Os casos 4, 5 e 12 não usavam nenhum
antifúngico no dia da coleta. O paciente p13 tem 2 amostras, uma sem
antifúngico, e outra sob o uso de FCZ (800 mg/dia). Os casos 11,14 e 21
têm uma amostra cada um, coletadas em vigência de AMB. P6 tem 7
amostras, p16 tem 2 amostras, e p19 tem 5 amostras, todas coletadas em
vigência de AMB. P7 tem 2 amostras (uma sob uso de AMB e outra sob uso
de FCZ); p10 tem 3 amostras(2 com AMB e uma com FCZ); p18 tem 2
amostras(uma coletada sem nenhum antifúngico, e a outra,na vigência de
AMB), e p20 tem 3 amostras, 2 sob uso de AMB e uma sob uso de FCZ.
Dezoito (85,7%) pacientes receberam HAART durante a terapêutica
antifúngica. Oito (38,1%) pacientes iniciaram a medicação antiretroviral
antes do diagnóstico de CSNC e os demais pacientes iniciaram HAART,
após hospitalização, entre um e cinco dias após o início da terapia
antifúngica. Dois pacientes não receberam HAART (p10,p13), e esse dado
não foi obtido do prontuário de p19. O uso de antiretrovirais não foi
associado à maior sobrevida.
Dois (2/21; 9,52%) pacientes (p2,p3) receberam o diagnóstico de
síndrome de reconstituição imunológica. P2 teve aumento do número
absoluto de células T CD4 de 29 (maio de 2004) para 276 células/mm3
(agosto de 2004), em prazo de cerca de 80 dias após início de HAART e
AMB, quando do primeiro episódio de CSNC. A carga viral em 08/2004 era
<400 cópias/ml. P3 tinha CD4 de 7 células/mm3 e carga viral de 100.000
cópias/ml em 08/2004 (1º episódio da doença). Na internação de janeiro a
março/2005, tinha CD4 de 184 células/mm3 e carga viral <400 cópias/mL.
CSNC foi a única IO associada à aids em nove (9/21; 42,85%)
pacientes. Dos doze restantes, na mesma internação, seis casos
(p2,p8,p12,p13,p15,p21) também foram tratados para tuberculose de SNC.
O caso 2 tinha formação nodular sólida em TC de tórax, recebendo
37
tratamento empírico para TB. O caso 13 tinha baciloscopia e cultura positiva
para M.tuberculosis no escarro, mas recebeu tratamento para tuberculose de
SNC. Nos demais casos, não há relatos de como foi feito o diagnóstico de
TB. O caso 7 teve micobacteriose atípica de SNC, com cultura de LCR e
gen probe + para M.avium.
Cinco casos (p1,p10,p14,p17,p19) tiveram também diagnóstico de
toxoplasmose de SNC. O caso 1 teve, inicialmente, diagnóstico de CSNC,
mas, na alta, tinha diminuição de força muscular em dimídio direito. Quando
reinternou, dois meses depois, uma nova TC de crânio sugeriu vasculite por
toxoplasmose. Onze dias antes do óbito, novo exame mostrou lesão
irregular, mal definida, com captação de contraste e edema perilesional na
região occipital esquerda. As hipóteses sugeridas foram: isquemia,
criptococose parenquimatosa, linfoma ou toxoplasmose. Foi tratado
empiricamente para toxoplasmose. Os casos 10 e 14 tiveram toxoplasmose
de SNC previamente à CSNC, mas não há citação, no prontuário, de como
foi feito o diagnóstico. O caso 17 apresentou neuroimagem sugestiva de
toxoplasmose. Com o tratamento conjunto ao de criptococose, a segunda
TC mostrou melhora da imagem. O caso 19 também apresentou os dois
diagnósticos juntos. Na internação de 11/04 a 04/2005, fez RNM de crânio
em 02/2005, que mostrou alargamento dos espaços de Virchow-Robin
associados a áreas de alteração do sinal núcleo-capsular bilateralmente, às
vezes assumindo aspecto nodular (criptococose parenquimatosa). Na alta,
saiu em uso de FCZ e esquema para toxoplasmose. A presença de outras
infecções oportunistas, além da criptococose de sistema nervoso central,
não foi relacionada ao óbito (Pearson, p=0,398).
38
4.2 Aspectos laboratoriais
A celularidade do LCR no momento do diagnóstico variou de 1 a 455
células/mm3. A dosagem de proteínas oscilou entre 27 a 395 mg/mL. A
avaliação de glicorraquia indicou variação de 14 a 63 mg/mL. O exame
direto revelou 3 a 4400 células fúngicas. Tinta da China foi positiva em 16
pacientes. Quatro pacientes apresentaram tinta da China negativa e esse
dado não foi possível obter de um paciente. O índice de gemulação variou
de 0,3% a 20%.
Aglutinação em látex no LCR foi realizada em 12 pacientes: o teste foi
não reagente em sete (7/12; 58,33%) pacientes (p3,p4,p5,p6,p11,p12,p21)
e foi reagente em cinco pacientes; destes, dois realizaram teste
quantitativo,com resultados de 4(p2) e 64(p20). O teste de látex qualitativo
foi realizado em três pacientes (p8,p17,p19). Em nove (42,9%) prontuários,
não consta essa informação. Nenhum desses parâmetros, quais sejam,
celularidade, proteínas, glicose, células fúngicas, título de antígeno, tiveram
associação com óbito (Mann-Whitney, p=0,250; 0,912; 0,360; 0,791; 1,
respectivamente).
O agente da infecção no grupo estudado foi classificado dentro de
uma única espécie: Cryptococcus neoformans, de acordo com os resultados
das provas fenotípicas, monitoradas com cepas-padrão. A leitura das provas
no meio CGB foi clara e simples, não havendo dúvidas em seu resultado.
A pesquisa de C. neoformans em foco extraneural foi citada no
prontuário de doze (12/21;57,14%) pacientes, e em 9 casos, o dado não
consta. Pesquisa de C.neoformans no sangue foi solicitada em dez
pacientes, na urina, em seis e na medula óssea, em três casos. Os casos 1,
3 e 18 tinham hemocultura e urocultura negativas para fungos. P7 tinha
presença de C.neoformans no sangue e medula óssea. P9 tinha urocultura
negativa. P4 tinha hemocultura negativa e urocultura positiva para
C.neoformans. P2 tinha hemocultura e urocultura negativas, mas tinha
úlcera esofágica cujo anátomo-patológico revelou C.neoformans. P21 tinha
biópsia ganglionar com C.neoformans, e pesquisa do fungo negativa em
39
medula óssea. P19 tinha hemocultura e medula óssea sem crescimento
fúngico, e p10, p11e p13 tinham hemoculturas com resultado negativo. O
sítio extra-neural não teve correlação com óbito (Mann-Whitney, p=0,485).
Exames tomográficos do crânio foram feitos em 16 (76.2%)
pacientes; o dado não constava nos demais prontuários.
A informação sobre avaliação de hipertensão intracraniana (HIC),
medida por raquimanometria (Manômetro de Claude, Riester), foi constatada
em dezesseis prontuários. HIC foi confirmada em 9 (9/16; 58,82%);
pacientes (p3,p4,p5,p6,p7,p8,p10,p14,p16), tendo dois destes (p7 e p8),
evolução para derivação lombo-peritoneal. Sete pacientes (7/16; 41,2%) não
tiveram hipertensão intracraniana. Este procedimento não foi citado em cinco
prontuários. A análise de HIC como relacionada ao óbito não indicou
correlação significativa (Qui-quadrado,p=0,439)
Cultura negativa para C.neoformans no LCR na 2ª semana ocorreu
em 6 casos (p1,p2,p3,p4,p5,p18). Em 8 casos, a cultura continuava positiva
(p6,p7,p8,p10,p11,p12,p14,p16), e, em 7 prontuários, esse dado não foi
obtido .
Quanto aos linfócitos T CD4, em três (3/21; 14,3%) pacientes, não
houve medição. Dos 18 restantes, 16 casos tinham CD4 < 100 células/mm3.
Os casos 10 e 12 tinham CD4 de 226 e 369 células/mm3, respectivamente. O
menor valor encontrado foi 4 células/mm3 e o maior 369 células/mm3
(Apêndice 1). O valor de CD4 não teve correlação com óbito (Mann-Whiney,
p=0,364).
4.3 Concentração inibitória mínima (CIM) de anfotericina B, fluconazol e
itraconazol
Os valores de CIM para AMB e FCZ foram avaliados, inicialmente,
pelo método EUCAST e, posteriormente, pelo método de CLSI; este último
foi realizado simultâneo ao teste do tabuleiro de xadrez, utilizando-se a
mesma placa. Para AMB, os resultados foram: de 0,12 µg/mL a 1 µg/mL
40
(EUCAST) e de 0,25 µg/mL a 1 µg/mL (CLSI); moda de 0,12 µg/mL
(EUCAST) e 1 (CLSI); média de 0,28 µg/mL (EUCAST) e 0,77 µg/mL
(CLSI); desvio padrão de 0,18 µg/mL (EUCAST) e 0,27 µg/mL (CLSI); CIM50
de 0,25 µg/mL (EUCAST) e 1 µg/mL (CLSI) e CIM90 de 0,5 µg/mL (EUCAST)
e 1 µg/mL (CLSI).
Os resultados de CIM para FCZ foram: intervalo de 0,25 µg/mL a 8
µg/mL (EUCAST) e de 0,25 µg/mL a 16 µg/mL(CLSI); moda de 4 µg/mL
(EUCAST) e 8 µg/mL (CLSI); média de 3,1 µg/mL (EUCAST) e 5,97 µg/mL
(CLSI); desvio padrão de 2,7 µg/ mL (EUCAST) e 4,8 µg/mL (CLSI); CIM50
de 2 µg/mL (EUCAST) e 4 µg/mL (CLSI) e CIM90 de 8 µg/mL (EUCAST) e
16 µg/mL (CLSI). Valor de 16 µg/mL foi encontrado em cinco (5/41; 12,2 %)
isolados de quatro (4/21;19,1%) pacientes (p2,p8,p14,p16), pelo método
CLSI.
Para itraconazol, os resultados de CIM foram avaliados somente pelo
EUCAST, sendo o intervalo de 0,015 µg/mL a 0,5 µg/mL; moda de 0,06
µg/mL; média de 0,11 µg/mL; desvio padrão de 0,12 µg/mL; CIM50 de 0,06
µg/mL e CIM90 de 0,25 µg/mL.
Os resultados de CIM constam no Apêndice 2 e a análise de
correlação entre CIM e evolução mostrou resultado não significativo para
FCZ (EUCAST p=0,824, CLSI p=0,498), AMB (EUCAST p=0,498, CLSI
p=0,203) ou ITZ (EUCAST p=0,100).
Dez pacientes tiveram mais de uma amostra analisada neste estudo,
e serviram para análise de heterorresistência a antifúngicos. Para fluconazol,
heterorresistência foi verificada em isolados de quatro (4/10; 40%) dos 10
pacientes (p6,p10,p18,p19), pelo parâmetro CIM. Para AMB,
heteroresistência foi verificada em amostras de dois pacientes (p6,p16) pela
CIM; por curvas de morte, foi observada em 9 de 10 casos com amostras
seriadas (p6,p7,p9,p10,p13,p16,p18,p19,p20).
Para ITZ, foram encontradas oito (8/41; 19,5%) amostras S-DD,
sendo seis com valor de 0,25 µg/mL e duas com valor de 0,5 µg/mL. Estes
isolados foram obtidos de seis (6/21; 28,6%) pacientes (p2,p6,
41
p11,p12,p13,p21) e a CIM de fluconazol foi de 0,5 µg/mL (p21), 4 µg/mL
(p6,p11,p13), 8 µg/mL (p12) e 16 µg/mL (p2).
A análise dos resultados de CIM obtidas pelas duas metodologias,
EUCAST e CLSI, mostrou correlação para fluconazol (r=0,834; p<0,001) e
para AMB (r=0,7; p< 0,001). O fenômeno trailing caracterizado pelo
crescimento residual em concentrações acima do valor de CIM para FCZ foi
observado em 20 das amostras, neste trabalho, em ambas as metodologias.
42
4.4 Curvas de morte para AMB
Para a padronização do método de curvas de morte, foram
realizados, inicialmente, testes em quadruplicata, com sete amostras clínicas
de C.neoformans mantidas na micoteca da Seção de Micologia do IAL.
Estas amostras foram obtidas de LCR de cinco pacientes com aids.
Posteriormente, testes de curvas de morte para todas as 41 amostras dos 21
pacientes foram realizados (Apêndice 2). O aspecto de placas de Petri em
distintos períodos de exposição das amostras de Cryptococcus neoformans
a 1 µg/mL de anfotericina B, está ilustrado na Figura 5.
O tempo necessário para o efeito fungicida (endpoint) no método de
curva de morte variou de 6 h a 48 h, sendo que 70,6% dos isolados
morreram entre 6 e 12 h, 7,3% em 24 h e 21,9 em 48 h (Tabela 1 e Figuras
6, 7, 8).
A análise do efeito fungicida sobre amostras isoladas de casos com
óbito e sem óbito por criptococose, revelou que 75 % das amostras dos 3
casos com óbito foram inibidas em 8 h; para os casos sem óbito a inibição
ocorreu em 30 h (Quadro 1; Figura 11). A análise estatística por teste de
Mann-Whitney revelou correlação entre efeito fungicida maior e óbito por
criptococose (p=0,046).
43
zero 6 horas
12 horas
Figura 5 Placas de Petri contendo colônias de Cryptococcus neoformans utilizados em testes de curvas de morte, ilustrando a diminuição do número de colônias (ufc/mL) segundo tempo de exposição à 1 µg de anfotericina B.
Tabela 1. Número de amostras de Cryptococcus neoformans de 21 pacientes com aids e criptococose de sistema nervoso central, IIER, 2004-2005, segundo efeito fungicida de anfotericina B (1µg/mL)
Tempo N %
6 horas 14 34,15
12 horas 15 36,59
24 horas 03 7,32
48 horas 09 21,94
72 horas 00 0
Total 41 100
44
Figura 6. Porcentagem de morte em 41 amostras clínicas de Cryptococcus neoformans após exposição (h) a 1 µg/mL de anfotericina B.
Figura 7. Porcentagem cumulativa de morte em 41 amostras clínicas de
Cryptococcus neoformans após exposição (h) a 1 µg/mL de anfotericina B
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
0
10
20
30
40
h
%
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
h
%
horas
%
45
Figura 8. Perfil típico de curva de morte (média) observado em 34 amostras clínicas de Cryptococcus neoformans expostas a 1 micrograma e anfotericina. Eixo X , 1=T0 2=T6 3=T12 4=T24 5=T48 6=T72 .
Figura 9. Perfil atípico de curva de morte observado em 7 amostras, de Cryptococcus neoformans isoladas de quatro casos, com persistência de células viáveis após exposição a 1 micrograma de anfotericina B. Eixo X , 1=T0 2=T6 3=T12 4=T24 5=T48 6=T72 .
1
1,00E+0,3
1,00e+0,5
1,00E+06
1 2 3 4 5 6
exposição (h)
Log10(ufc/mL)
Perfil de curva de morte de 6 amostras de Cryptococcus
neoforman com persistência de células viáveis após exposição a 1 micrograma de anfotericina B.
1
1,00E+0,2
1,00E+0,3
1,00E+0,5
1,00E+0,6
1 2 3 4 5 6
exposição (h)
Log10(ufc/mL)
46
Quadro 1. Efeito fungicida de anfotericina B, por testes de curva de morte,
em 5 casos de criptococose associada à aids que foram a óbito
Percentis ÓBITO POR
CRIPTOCOCOSE 25 50 75
Efeito fungicida (h) Não 10,00 24,00 30,00
Efeito-fungicida(h) Sim 6,00 6,00 8,14
Figura 10. Efeito fungicida de anfotericina B, por testes de curvas de morte,
em amostras de 5 casos de criptococose associada à aids que foram a óbito.
A comparação de resultados de CIM e efeito fungicida foi realizada
pelo coeficiente de Pearson (p= 0,3507; IC 95%) e por índice de correlação
de Spearman (r=0,3507), em que ambos os métodos confirmam a hipótese
nula de não-associação entre CIM e efeito fungicida.
Em sete (14,6%) amostras de 4 (19,1%) pacientes foi verificado
crescimento de colônias após o endpoint fungicida (Figura 11): amostras
127, 128 e 129, obtidas do paciente p20 ; a amostra afg1, isolada do
paciente p3; amostras 154 e 158, isoladas do paciente p6, e a amostra 178,
isolada do paciente p21. A presença destas amostras, denominadas
tolerantes, foi avaliada quanto ao óbito. Quando foram avaliados os óbitos
Efe
ito F
ungi
cida
(ho
ras)
ÓBITO POR CRIPTOCOCOSE Sim Não
-
50 40 30 20 10 0
47
segundo a causa, por criptococose ou não, verificou-se amostragem
insuficiente para análise estatística de causa e efeito (Quadro 2). O Quadro
3 mostra a análise realizada para a ocorrência de amostras tolerantes e
óbito no grupo de 21 pacientes de criptococose e aids, em que não houve
correlação.
Quadro 2. Distribuição de amostras de C. neoformans tolerantes à anfotericina B, em testes de curva de morte, segundo óbito por criptococose e outras causas.
Casos de
óbito por
criptococose
Casos de
óbito por
Outra causa
Total
Óbitos
Sim 1 0 1 Casos com cepas
tolerantes não 2 2 4
Total 3 2 5
Quadro 3. Distribuição de amostras de C. neoformans tolerantes à anfotericina B, em testes de curva de morte, segundo óbito por criptococose em 21 casos.
Casos de óbito por
criptococose
Sim Não
Total
casos
Sim 1 3 4 Casos com amostras
tolerantes não 2 15 17
Total 3 18 21
p=0,48; Qui-quadrado de Fisher
48
4.6 Metodologia do tabuleiro de xadrez para AMB e FCZ
A avaliação prévia do método de tabuleiro de xadrez foi realizada com
sete amostras clínicas de C.neoformans mantidas na micoteca da Seção de
Micologia do IAL, obtidas de LCR de cinco pacientes com aids (dados não
mostrados). Após este estudo-piloto, foram realizadas as reações para todas
as 41 amostras. Um exemplo de efeito de interação das drogas consta na
Figura 11, cujo gráfico é denominado de isobolograma (Odds, 2003;
Johnson et al., 2004).
Os valores de CIF (concentração inibitória fracionada de AMB e FCZ,
isoladamente), ICIF(representação matemática da interação das duas
drogas) e a interpretação de ICIF, constam do Apêndice 2.
Efeito aditivo foi encontrado em nove (9/41; 22%) amostras de seis
(6/21; 29%) pacientes, independentemente do tratamento. Para as demais
amostras (32/41; 78%) a combinação das drogas foi indiferente para ação
inibitória das duas drogas. Efeito antagônico não foi observado no conjunto
de amostras estudado.
49
Figura 11. Exemplo de isobolograma obtido a partir da placa de microtitulação para teste do tabuleiro do xadrez para análise de combinação de drogas distribuídas em várias concentrações (µg/mL). Interpretação: efeito de indiferença na interação de anfotericina B (AMB) com fluconazol (FCZ). CIM, concentração inibitória mínima.
Flu
co
na
zo
l
Anfotericina B
CIM da anfotericina CIM da combinação CIM de fluconazol
50
4.7 Dosagem in vivo de fluconazol e AMB
Amostras de plasma e/ou LCR de doze pacientes
(p1,p2,p3,p5,p7,p8,p9,p10,p13,p15,p17,p20) foram analisadas sob
parâmetros farmacodinâmicos de FCZ. Em seis casos
(p1,p2,p3,p10,p15,p20), os níveis plasmáticos ficaram dentro ou acima dos
níveis esperados. Em dois casos (p5,p8) não foi possível a dosagem
pareada com o plasma, tendo-se apenas a dose do azol no LCR; o valor
plasmático foi calculado, pois a dose diária de FCZ era conhecida (nível
teórico previsto). O monitoramento das concentrações de fluconazol no
plasma e no LCR de oito pacientes (p1,p2,p3,p7,p9,p10,p13,p15) forneceu
as razões que permitiram estimar a penetração do antifúngico no SNC. Na
maioria dos oito casos, a relação foi boa (50%-70%). Em três casos
(p1,p3,p10),os níveis de FCZ em LCR ficaram entre 50% e 70% da dose
encontrada no plasma, e em outros dois pacientes (p9,p13), essa
porcentagem ficou entre 70% e 100%.
.
Os dados completos e compilados, oriundos das dosagens
plasmáticas e liquóricas de fluconazol, costam do Apêndice 3. O
monitoramento das concentrações de FCZ, no plasma e no LCR, por HPLC,
forneceu os percentis de penetração do fármaco no SNC. As concentrações
plasmáticas situaram-se entre 14,3 µg/mL e 75,2 µg/mL, com valor médio de
36,64 µg/mL e desvio-padrão de 24,93.
A maior concentração determinada no LCR foi 45,6 µg/mL e a menor
foi zero, com média de 19,53 µg/mL e desvio-padrão de 14,44. A relação
entre nível liquórico e plasmático variou de 0-99%. A proporção entre nível
plasmático e CIM situou-se entre 1 a 132; entre nível plasmático e CIM
variou de 0 e 216. A relação entre pico plasmático (teórico esperado) e o
valor de CIM variou entre 0,6 e 120. As análises de correlação entre
concentração liquórica e plasmática de FCZ e a relação entre LCR/plasma
mostraram valores não significativos para ocorrência de óbito
(respectivamente, p=0,750; p=1,0; p=0,500).
51
Com o parâmetro farmacodinâmico de AUC (teórico)/CIM verificou-se
valores entre 12,5 e 1600 para fluconazol. Não foi observada correlação
entre esse parâmetro e óbito por criptococose (Mann-Whitney, p=0,250).
Para anfotericina B foram avaliadas amostras pareadas de dez
pacientes que fizeram uso da droga. Os dados das dosagens de anfotericina
B mostraram concentrações médias de AMB de 2,18 (0,16-9,29) µg/mL no
plasma e 0,83 (0,02-5,23) µg/mL no LCR. Os valores encontrados para os
dez casos constam do Quadro 4 . Nota-se que no caso 12 houve resultado
positivo para anfotericina B mesmo sem tratamento com a droga, e no caso
6, concentração maior no LCR, em relação à do plasma.
Quadro 4. Valores plasmáticos e liquóricos de anfotericina B de dez casos
de criptococose e aids obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC).
Tratamento Caso Coleta
Droga Dose Total
(mg)
[Plasma]
µµµµg/mL
[LCR]
µµµµg/mL
Relação
(%)
[LCR] / [PLASMA]
1 15/9/2004 AMB 500 9,29 0,08 0,9
2 23/9/2004 AMB 50 2,09 0,02 1,0
3 01/2/2005 FCZ* 800/dia 0,36 0,16 44,4
6 13/09/2004 AMB 100 6,98 0,41 6,0
24/9/2004 AMB 700 ,30 3,02 70,0
26/9/2004 AMB 800 1,86 5,23 281,0
9 10/10/2004 AMB 50 0,16 0,15 93,8
13/10/2004 AMB 200 0,67 0,15 22,4
10 04/11/2004 FCZ** 800/d 0,18 0,15 83,3
12 26/10/2004 0*** - 0,99 0,95 96,0
13 22/11/2004 FCZ**** 800/d 0,71 0,16 22,5
16 12/11/2004 AMB 150 0,35 0,15 43,0
19 23/11/2004 AMB 50 0,42 0,15 36,0
[ ], concentração; AMB, anfotericina B; FCZ, fluconazol, * tratamento prévio com 350 mg de
AMB e suspenso 15 dias antes; ** tratamento prévio com 450 mg de AMB e suspenso 7 dias
52
antes;*** Sem tratamento prévio com antifúngicos, apenas tuberculostáticos;**** tratamento
prévio com 600 mg de AMB e suspenso 12 dias antes
5 Discussão
Alguns parâmetros de mau prognóstico em CSNC são conhecidos
antes mesmo da era aids (Diamond e Bennett, 1974).Quando a micose é
associada à aids, outros fatores tendem a piorar ainda mais a evolução
clínica do paciente, a começar pela imunodeficiência.
Estudos de correlação clínico-laboratorial continuam sendo
realizados, apesar da dificuldade dos testes de sensibilidade in vitro em
separar isolados de C.neoformans resistentes e sensíveis à AMB, que ainda
é o fármaco mais usado na fase aguda da doença. Assim, atualmente,
busca-se estudar se parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos dos
antifúngicos podem contribuir como preditores de falha clínica, auxiliando no
manejo difícil desta doença.
Dos 21 pacientes do estudo, 17 eram homens, confirmando o achado
mais comum de criptococose em pacientes do sexo masculino, relatado
amplamente na literatura (Mirza et al., 2003; Dromer et al., 2004). A idade
variou de 28 a 54 anos, que reflete a faixa etária de maior incidência de aids
até o momento.
Os sintomas mais comuns relatados foram cefaléia (17/21= 80,95 %),
náuseas e/ou vômitos (10/21 = 47,6%) e febre (8/21 = 38,1%), o que
também vai de encontro aos achados da literatura consultada. Alteração de
estado mental, descrito neste trabalho em 85,7% dos casos, é considerado
um dos mais importantes fatores de mau prognóstico na evolução de CSNC,
mesmo que o paciente não tenha infecção pelo HIV (Diamond e Bennett,
1974; Mitchell e Perfect,1995; Darras-Joly et al., 1996; Antinori et al., 2001).
Dos 21 pacientes internados, inicialmente, 18 foram tratados com
AMB. O polieno foi trocado por FCZ em 7 pacientes
(p1,p3,p10,p12,p14,p16,p18), devido à insuficiência renal. Quando houve
melhora da função renal, dois pacientes (p3,p16) voltaram a usar AMB. O
paciente p9 trocou AMB por FCZ devido à flebite. A predileção pelo uso de
53
AMB na fase de indução do tratamento de CSNC é clara e imperativa no
mundo todo, mesmo sendo evidente seu efeito colateral mais grave, a
insuficiência renal (Catalán e Montejo, 2006). O Brasil precisa voltar a ter
flucitosina, já que há evidências clínicas em número suficiente, que mostram
o grande benefício da sua associação com anfotericina B, pelo menos nas
duas primeiras semanas de tratamento. As diretrizes norteamericanas para o
manejo de criptococose, o consenso brasileiro em criptococose (Kon et al.,
2008) e outros autores também endossam esse parecer, visando a rápida
esterilização do LCR (Bennett et al.,1979; Saag et al., 2000; Bicanic e
Harrison,2004; Dromer et al., 2007).
O paciente p2 usou 200 mg/dia de FCZ, na internação em que foi
realizado este trabalho, por seis dias, até ser feito o diagnóstico de CSNC.
Posteriormente, usou AMB por 16 dias, e por dificuldade de acesso venoso,
iniciou 800 mg/dia de FCZ, até o dia do óbito. Os pacientes p17 e p20
usaram, respectivamente, 400 mg/dia e 800 mg/dia de FCZ a internação
toda , e ambas as doses foram descritas como profilaxia secundária de
criptococose. P17 faleceu na internação das coletas, e no atestado de óbito,
CSNC não apareceu como “causa mortis”. P20 também faleceu, quase 3
meses após a internação na qual foi feito este estudo. No atestado de óbito,
não havia referência à CSNC, nem como IO prévia. Vale ressaltar que a
dose de FCZ preconizada para profilaxia secundária de CSNC é 200 mg/dia.
As doses usadas pelos casos 17 e 20 são, normalmente, utilizadas na
chamada fase de consolidação, fase anterior à de profilaxia secundária.
Geralmente, criptococose costuma acometer pacientes com aids com
CD4 < 100 células/ mm3, mas o encontro de células CD4 maior que esse
valor não afasta o diagnóstico da doença (Mitchell e Perfect, 1995). Nesta
pesquisa, o valor absoluto de linfócitos T CD4, em 18 pacientes, variou de 4
a 369 células/mm3, e dos dezoito, dois pacientes(11,11%) tinham valores >
100 células/mm3. Valores mais altos de CD4 podem refletir o uso de HAART.
Pappalardo et al. (2007) relataram, em estudo pré-HAART, que 29 de 35
casos tinham CD4< 100 células/mm3, e destes, 73,3% apresentavam CD4<
50 células/mm3.
54
Dos 21 casos, cinco pacientes do sexo masculino foram a óbito,
sendo 60% destes, relacionados à CSNC. A letalidade foi de 14,3%(3/21),
ocorrendo dentro dos primeiros meses de infecção criptocóccica.
Apesar do declínio da incidência de criptococose, a taxa de
mortalidade em pacientes com infecção pelo HIV permanece entre 15-20%,
no terceiro mês da CSNC, em países onde HAART é disponível (Lortholary
et al., 2006). Entretanto, a mortalidade é muito maior em alguns países da
África e Ásia, chamando a atenção para a dificuldade de manejo terapêutico
da co-infecção HIV e criptococose. A tendência de diminuição na freqüência
da criptococose e outras IOs, apresentou-se mais acentuada em países
desenvolvidos, onde existe grande acesso à HAART (Palella et al., 1998). O
uso de fluconazol semanal para profilaxia primária e secundária de
candidíase oral em pacientes com aids, pode ter contribuído para a
diminuição da incidência de criptococose nesses países (Newton Jr et
al.,1995). No Brasil, não há estudos sobre o uso de profilaxia primária com
FCZ ou com itraconazol em criptococose.
Na África e em outros países nos quais ainda não há livre acesso aos
sistemas de saúde, às medicações antiretrovirais e nem mesmo a todas as
medicações usadas em profilaxia das IOs, a situação é bem diferente:
estudos africanos de coorte mostram que as taxas de mortalidade nas duas
primeiras semanas de tratamento de criptococose ainda são altas (13% a
44%) devido a vários fatores, entre eles: apresentação tardia do paciente ao
serviço de saúde, falta de antifúngicos, inabilidade de monitoramento
adequado da pressão intracraniana e indisponibilidade de HAART (Moosa e
Coovadia, 1997; Mwaba et al., 2001; Bicanic et al., 2005). A mortalidade
pode ser ainda maior se a busca do agente etiológico através de testes
diagnósticos só for feita em casos de meningite, pois sabe-se que pacientes
com aids podem ter CSNC e apresentar somente febre e/ou mal estar
(French et al., 2002).
Em estudo anterior, Pappalardo et al. (2007) verificaram, em série de
35 casos, alta mortalidade (68,6%) relacionada, entre outros fatores, à
inexistência de HAART e falta de manejo de HIC. De modo diverso, nesta
55
pesquisa, a maioria dos pacientes (85,7%) estava em uso de HAART. Sabe-
se que o uso de HAART diminui a mortalidade em aids ao longo da evolução
da doença. Entretanto, o momento ideal de início de HAART durante o
tratamento de infecções oportunistas pode ser uma difícil decisão, também
relacionada ao tipo de IO apresentada pelo paciente. Em criptosporidíase,
por exemplo, o início mais precoce de HAART pode beneficiar o paciente.
Por outro lado, estudos observacionais de pacientes com aids e tuberculose
ou micobacteriose atípica disseminadas ou meningite criptocóccica, sugerem
que o início de HAART após 4, 8 ou 12 semanas após o início de tratamento
específico dessas IOs está relacionada à diminuição do risco de síndrome
de reconstituição imunológica(SRI) e de graves sequelas (Lortholary et al.,
2005). As principais sequelas de CSNC são:- deficit mental (30%);- redução
da acuidade visual (8%);- paralisia permanente de nervos cranianos(5%) e
hidrocefalia.
Alguns médicos do IIER preferem iniciar HAART durante a
internação, enquanto o paciente está na fase de indução do tratamento de
CSNC (observação pessoal). Entretanto, além da introdução de HAART não
se tratar de emergência médica, a tática de retardar seu início pode diminuir
as complicações decorrentes do processo inflamatório advindo da SRI. Em
geral, a SRI ocorre nos primeiros três meses após o início de HAART, mas
pode ocorrer alguns dias após a introdução dos antivirais, até um prazo
maior do que três meses (Haddad e Powderly, 2001). Ocorrendo mais
precocemente, a síndrome pode gerar piora da sintomatologia clínica e das
lesões no parênquima cerebral, como realce de contraste ou criptococomas
(Woods et al., 1998). Lortholary et al. (2005) descreveram, na França, em
estudo de coorte, o aparecimento da SRI em média oito meses após o
diagnóstico de criptococose, com mortalidade de 25%. Bicanic et al. (2009),
em estudo prospectivo de coorte de 65 pacientes, encontrou SRI em 17%,
taxa similar (19%) à encontrada em estudo retrospectivo, feito na Tailândia.
Outro argumento desfavorável ao uso mais precoce de HAART é a
possibilidade de presença de outra IO associada à criptococose, e para a
qual, o paciente precisará usar mais medicamentos, sofrendo sobrecarga do
56
trato gastro-intestinal, além de maior tempo de internação. Esta situação
aumenta a chance de infecções hospitalares e de problemas psicológicos,
devido à longa permanência hospitalar.
No presente estudo, os pacientes p2 e p3, com diagnóstico de SRI,
apresentaram a síndrome dentro do prazo mais comumente descrito na
literatura (Gea-Banacloche e Lane, 1999). Muitos pacientes, assim como os
observados neste tabalho, após o início ou modificação do esquema
HAART, desenvolvem apresentação atípica da doença, com sinais clínicos
de meningite aguda, piora do estado clínico, pleocitose no LCR, cefaléia
recorrente com aumento da pressão intracraniana, todos associados à
ausência de crescimento de C. neoformans em cultura de LCR, além de
resposta virológica (carga viral indetectável) e imunológica (aumento de
células CD4) à HAART. Linfadenite focal e necrotizante também é descrita
em casos de criptococose associada à SRI (Haddad e Powderly, 2001;
Lortholary et al., 2005).
O consenso brasileiro em criptococose indica o início de HAART na
fase de manutenção do tratamento de criptococose (Kon et al., 2008).
Nove pacientes (9/21;42,85%) apresentaram CSNC como a única IO
associada à aids. Dos doze restantes, seis também se submeteram a
tratamento de tuberculose de SNC, cinco tiveram associação com
toxoplasmose de SNC, e um caso apresentou CSNC e micobacteriose
atípica de SNC.
Guimarães (2000), estudando infecções oportunistas em aids no
Brasil, no período de 1980 a 1999, descreveu tuberculose pulmonar ou
disseminada , criptococose extra-pulmonar e toxoplasmose cerebral como
as segunda, quinta e sétima IOs presentes no momento da notificação de
casos de aids. Interessante notar que, nesta pesquisa, essas foram as
únicas IOs associadas à criptococose, também com envolvimento do SNC.
O diagnóstico diferencial de CSNC é feito com outras afecções
neurológicas comuns em aids, como tuberculose, toxoplasmose, linfoma,
leucoencefalopatia multifocal progressiva, encefalopatia pelo HIV,
histoplasmose e nocardiose. A diferenciação entre criptococose e
57
tuberculose de SNC nem sempre é tarefa fácil, pois as duas doenças têm
semelhanças entre si, e podem estar presentes concomitantemente.
Toxoplasmose de SNC, pela sua frequência em pacientes com aids no
Brasil, é outro importante diagnóstico diferencial, e muitas vezes, o paciente
recebe tratamento empírico. O Grupo de Neurociências do IIER, ao lado de
especialistas do Instituto Adolfo Lutz e do Instituto de Medicina Tropical de
São Paulo, solicita a realização da técnica molecular de reação em cadeia
da polimerase (PCR) em LCR, nos casos de dificuldade diagnóstica (dados
não publicados).
No diagnóstico de CSNC, o exame quimiocitológico de LCR dos 21
pacientes revelou celularidade de 1 a 455, com predomínio de células
linfomonocitárias em 100% dos casos. Proteinorraquia de 27 a 395 e
glicorraquia de 14 a 63. Esses achados são os mesmos encontrados
anteriormente na literatura (Vandepitte, 1990; Rozembaum e Rios-
Gonçalves, 1994; Reis-Filho et al., 1994). A contagem de leucócitos no LCR
abaixo de 20/mL (na fase pré-tratamento) é um dos fatores preditivos de
morte de pacientes com aids e CSNC(van der Horst et al., 1997).
O laboratório de Microbiologia do IIER é um dos poucos, segundo a
literatura consultada, que realiza a análise do índice de gemulação (IG) de
C.neoformans. Em regra, esse exame não é citado nos estudos clínicos de
criptococose, com poucas exceções (Liso,1998 ; Rúbio et al., 2007). Quando
há gemulação, a levedura está viva, pois está se multiplicando; porém, o
contrário não é verdade, uma vez que a célula pode estar viva, sem estar no
estágio de reprodução. Quanto maior o número de células fúngicas e quanto
maior o índice de gemulação, pior a evolução. É importante frisar que, como
essa análise é feita em todas as amostras de LCR encaminhadas ao
Laboratório, o índice pode ser útil no acompanhamento da evolução da
doença. Entretanto, não foi possível a comparação das taxas de IG aqui
encontradas com achados de outros autores.
Larsen et al. (2005;2007) indicaram que a contagem de células
fúngicas no LCR tem relação com a evolução clínica e sugerem que, em
pacientes com aids e CSNC, a contagem de unidades formadoras de
58
colônias (ufc) de C.neoformans no LCR, antes e durante o tratamento com
AMB ou FCZ, seja um método mais acurado de avaliação microbiológica, do
que, simplesmente o resultado da cultura. Essa é uma tentativa de melhoria
no critério microbiológico de cura, que atualmente se baseia na ocorrência
de cultura negativa.
Neste trabalho, a contagem de blastoconídios de leveduras ao exame
quimiocitológico de LCR permitiu verificar células fúngicas de 3 a 4400/ mm3
de LCR no momento do diagnóstico. Entretanto essa contagem
microscópica não diferencia células viáveis de células mortas, as quais
somente seriam avaliadas com a técnica de contagem de ufc/mL, a partir da
semeadura da amostra. Por dificuldades técnicas, este método não foi
realizado neste estudo. Para Graybill et al. (2000), existe uma possível
relação entre o maior número de células fúngicas no LCR e o achado de
hipertensão intracraniana. Nesta pesquisa, de nove pacientes com HIC, o
número de células fúngicas no LCR pré-tratamento variou de 20 (p14) a
4400 (p6).
Tinta da China foi realizada na maioria dos casos (95,2%), indicando
bom aproveitamento dessa técnica. O teste, de fácil execução, permite o
diagnóstico em poucos minutos e tem sensibilidade de 75% a 93,8% (Chuck
e Sande, 1989; Rozembaum e Rios-Gonçalves,1994). O consenso brasileiro
em criptococose afirma que a microscopia é positiva quando há 103 a 104
ufc/mL de células fúngicas, e que não é preditora de evolução (Kon et al.,
2008).
Neste estudo, o resultado foi positivo para a maioria dos casos,
demonstrando boa sensibilidade do teste (80%) em relação à cultura. Além
disso, todos os materiais com exames diretos positivos foram também
positivos no exame quimiocitológico de LCR. A sensibilidade do exame
direto com tinta da China é maior do que a obtida no método de isolamento
em cultura, desde que podem ser vistas células inviáveis que não crescem
em cultura e, além disso, a alíquota do LCR semeado pode não ser
representativa deste material, se o número de células for extremamente
baixo. Dos 20 casos, 16 tinham exame direto positivo (16/20; 80%). Nos 4
59
casos (p2,p11,p19,p20) em que o exame direto resultou negativo, poderia
haver atraso no diagnóstico e, consequentemente, o tratamento específico.
Porém, três deles tiveram resultado de pesquisa de antígeno polissacarídico
de C. neoformans positivo, o que possibilitou o diagnóstico correto. Além
disso, a cultura de LCR nos quatro casos também mostrou crescimento da
levedura. Esse dado mostra a importância da solicitação completa de
exames micológicos, pois os mesmos se complementam para o diagnóstico
final de criptococose.
Um dos fatores preditivos de morte durante o tratamento, com AMB
ou FCZ, de pacientes com aids e CSNC, é o título de antígeno no LCR
acima de 1024 (van der Horst et al., 1997). Nesta pesquisa, dois pacientes
(p2,p20) tiveram LCR avaliado quantitativamente para antígeno
polissacarídico, e apresentavam títulos baixos (4 e 64, respectivamente), se
comparados ao valor indicativo de maior gravidade. O teste de aglutinação
em látex foi realizado em cinco casos (p2,p8,p17,p19,p20), sendo que p2
também apresentava látex positivo no sangue. O teste foi feito em um
paciente (p8) cuja amostra foi positiva ao exame direto, o que demonstra
falta de algoritmo para solicitação de exames ou demora na notificação da
pesquisa direta. Na maior parte das vezes, o teste realizado no IIER é o
qualitativo, com soro ou LCR diluído a 1:8 confirmando o diagnóstico de
criptococose ativa, pois, para tal, é preciso que a titulação seja maior que 4.
Títulos menores do que 4 são altamente sugestivos de infecção
criptocóccica (Reiss et al.,2002). Na prática clínica, detecção e titulação de
antígeno criptocóccico são usadas para avaliar disseminação, severidade da
doença e resposta ao tratamento. Altos títulos de antígenos no LCR podem
estar associados à ausência de esterilização no LCR ou morte em pacientes
HIV+ com meningoencefalite (Graybill et al., 2000). Esse teste, tanto
sensível quanto específico para criptococose, é oneroso para o nosso meio.
Além disso, para acompanhamento da evolução da doença, seriam
necessários testes seriados, o que é inviável, devido ao alto custo. Assim,
em nossa opinião, esse teste deveria ser feito apenas nos casos em que a
coloração por tinta da China fosse negativa.
60
Criptococose extraneural também é fator de mau prognóstico em aids.
No presente estudo, esse importante parâmetro não foi pesquisado em nove
casos, demonstrando que a busca do agente em foco extraneural deve ser
intensificada. A pesquisa do fungo em foco extraneural revelou hemocultura
positiva no paciente p7, que também teve crescimento de C.neoformans na
medula óssea. O paciente p4 apresentou urocultura com C.neoformans. O
paciente p2 teve úlcera esofágica, cujo anátomo-patológico revelou C.
neoformans. O paciente p21 apresentou crescimento do fungo em biópsia
ganglionar.
Fungemia é, provavelmente, um importante degrau no
desenvolvimento e na persistência da meningoencefalite. Sua ocorrência
sugere que C.neoformans no sangue pode contribuir para reinfecção
subseqüente do SNC, uma hipótese defendida por dados obtidos no estágio
inicial da infecção em modelo de criptococose murina (Lortholary et
al.,1999). Pasqualotto et al. (2004), estudaram 28 casos de criptococcemia
observados em período de 7 anos; a maioria dos pacientes era
imunodeficiente (89,3% tinham aids).
Exames de imagem são úteis na CSNC, porém, as alterações vistas à
tomografia computadorizada (TC) de crânio, podem ser as mesmas vistas na
encefalopatia pelo HIV que está sempre presente, em maior ou menor grau,
em aids. As lesões intracranianas relacionadas à CSNC são: cistos
mucinosos, dilatação dos espaços de Virchow-Robin, meningite circunscrita,
criptococoma, forma granulomatosa miliar, realce meníngeo, ependimite,
ventriculite e hidrocefalia.
Rozembaum e Rios-Gonçalves (1994) relataram quarenta TCs
realizadas em noventa pacientes com CSNC associada à aids, não
encontrando nenhuma alteração em 65% dos exames. O uso de TC ou RNM
de crânio, durante o seguimento clínico, pode mostrar persistência ou
surgimento de massas fúngicas, denominadas criptococomas, enquanto o
paciente apresenta melhora clínica ou permanece estável. Assim, a piora de
lesões pela neuroimagem não significa, necessariamente, falência
terapêutica, pois pode representar reação de células inflamatórias dentro de
61
granulomas, com eliminação de pequenos focos infecciosos (Hospenthal e
Bennett, 2000; Perfect e Casadevall, 2002).
Imagens anormais cerebrais podem ser um parâmetro associado à
morte, mas somente pequenas séries de TCs ou RNMs de crânio foram
publicadas e nenhuma foi claramente endereçada à relação entre lesões
cerebrais e prognóstico (Mitchell e Perfect, 1995). Graybill et al.(2000),em
estudo de HIC, acompanharam 221 pacientes com aids e CSNC ,e
destes,157 tiveram estudos de neuroimagem. As alterações mais
encontradas foram: atrofia (19%), lesões focais (10%), lesões na substância
branca (3%) e realce de lesão (3%). Nenhum paciente apresentou
hidrocefalia obstrutiva. Lizarazo et al. (2007), em estudo epidemiológico na
Colômbia, relataram 185 exames de neuroimagem, sendo 160 TCs e 25
RNMs de crânio; 93(50,3%) desses estudos foram anormais, sendo as
seguintes as alterações encontradas: -atrofia cerebral (27casos); -infartos
cerebrais (19 casos); -granuloma cerebral (14 casos); -hidrocefalia (10
casos); -edema cerebral (6 casos); -encefalite (3 casos); -calcificações (3
casos); -dilatação dos espaços de Virchow-Robin (3 casos); -outras (10
casos).
Nesta pesquisa, dezesseis pacientes fizeram TC de crânio durante a
internação. Em cinco casos, não há citação a este exame. Das tomografias,
14(87,5%) mostravam atrofia cortical, duas mostravam lesão realçada pelo
contraste e, como relatado por Graybill et al. (2000), nenhuma mostrou
hidrocefalia obstrutiva. É importante que esse exame de imagem seja feito
sempre em todos os pacientes com doença neurológica, tanto no
diagnóstico quanto no seguimento, pois, além de oferecer maior segurança à
punção liquórica , mostra a evolução das lesões cerebrais.
Tão importante quanto o tratamento antifúngico, é o tratamento da
hipertensão intracraniana (HIC), caracterizada por pressão intracraniana
>250 mm H2O. Quanto mais cedo HIC for descoberta e tratada, melhor é o
prognóstico do paciente. No IIER, o Grupo de Neurociências utiliza um
fluxograma para controle dessa importante complicação da criptococose
(Andrade, 2006). A conversão do valor encontrado para mm H2O no
62
aparelho de manometria é feito utilizando-se uma tabela de conversão,
sendo que 1 mm Hg = 13,5 mm H2O. A resposta clínica à terapêutica é
melhor nos pacientes com pressão intracraniana (PIC) pré-tratamento em
valor igual ou inferior a 250 mm H2O e naqueles com valores estáveis de
PIC ou com decréscimo de 10 mm H2O ou mais em 2 semanas de
tratamento antifúngico (Graybill et al., 2000). Hipertensão intracraniana
ocorre em cerca de 50% dos pacientes com CSNC, é fator de mau
prognóstico, e a falha no seu controle pode levar a graves seqüelas
neurológicas (Graybill et al., 2000; Shoham et al., 2005).
No presente estudo, PIC foi verificada em dezesseis pacientes;
destes, nove tiveram HIC diagnosticada (9/16-56,25%), indo de encontro aos
achados de Graybill et al. (2000) e Shoham et al.(2005). Não há citação de
medida de PIC na evolução de cinco pacientes e, mesmo sendo a avaliação
de PIC norma já bem estabelecida no IIER, o dado indica que isso nem
sempre é realizado.
No Brasil, não existem dados sobre a associação de HIC,
insuficiência renal aguda (IRA) causada pela AMB e evolução clínica
insatisfatória. Admite-se que um dos problemas causados pela HIC seja a
penetração inadequada de antifúngicos no SNC, assim como a IRA pode
alterar os níveis séricos de AMB. Neste estudo foi verificado que não houve
correlação entre IRA e uso de AMB. Além disso, quatro pacientes do estudo
(p3,p10,p14,p16), mesmo com as duas complicações(IRA e HIC), evoluiram
para cura. Os casos 1,12 e 18 só tiveram IRA, sem HIC. P1 foi a óbito por
outra razão que não CSNC, p12 morreu por criptococose, não teve medida
de PIC e p18 evoluiu para cura.
Os casos 4,5,6,7,8 tiveram HIC sem IRA, sendo que p4 sobreviveu,
usou 1460 mg de AMB e também teve tuberculose ganglionar. P5
sobreviveu, usou 2150 mg de AMB. P6 morreu em 16 dias de uso de AMB.
P7 sobreviveu, usou 3260 mg de AMB, evoluiu para derivação lombo-
peritoneal; teve, também, criptococose de medula óssea e micobacteriose
atípica de SNC. P8 sobreviveu com derivação lombo-peritoneal. Na literatura
consultada, não se encontrou estudos sobre a associação IRA e HIC. Além
63
do mais, a amostra de pacientes é pequena e, portanto, nenhuma conclusão
pode ser firmada.
Melhora na segunda semana de tratamento é considerada por muitos
autores como o principal fator no manejo (endpoint clínico) da meningite
criptocóccica. Robinson et al. (1999) consideravam importante a
esterilização precoce do LCR na segunda semana de tratamento, para
melhor prognóstico da doença. Por outro lado, a falência micológica precoce
pode ser associada com morte e com prescrição de FCZ na fase de indução
do tratamento de criptococose, em todas as situações onde haja alta carga
fúngica, indicada pela titulação de antígeno ou cultura, independente se o
paciente tem ou não infecção pelo HIV/aids, segundo Dromer et al. (2007).
No mesmo trabalho, os autores observaram alguns fatores independentes
associados à falência micológica na 2ª semana de tratamento, independente
do “status” HIV do paciente: - disseminação inicial; - alto título de antígeno
sérico no diagnóstico; - ausência de flucitosina durante a fase de indução.
Neste estudo, seis (p1,p2,p3,p4,p5,p18) pacientes tiveram cultura
negativa para C.neoformans no LCR na 2ª semana de tratamento. Quatro
(4/6=66,66%) evoluiram para cura. Os casos p2 e p3 tiveram SRI, e era de
se esperar a ausência do agente etiológico da doença no sítio da infecção.
Oito casos (p6,p7,p8,p10,p11,p12,p14,p16) ainda tinham cultura positiva
para C. neoformans no LCR na 2ª semana, e seis (6/8=75%) evoluiram para
cura. Apenas os casos p6 e p12 faleceram. Pela amostragem pequena, não
foi posssível nenhuma conclusão.
Não há citação, no prontuário, sobre sítio extraneural dos casos
8,12,14,16 e 20. Apenas p7 apresentou C.neoformans em cultura de medula
óssea e sangue. Os pacientes 10 e 11 tinham ausência do agente etiológico
no sangue. Nenhum dos oito casos teve titulação de antígeno
polissacarídico no LCR, assim como ninguém fez uso de flucitosina. Desse
modo, não há como comparar nossos resultados com outros autores que
defendem a positividade da cultura no LCR na 2ª semana de evolução como
fator de mau prognóstico na CSNC.
64
Nem o guidelines norteamericano e nem o consenso brasileiro
abordam regras para a troca de fase de tratamento (Saag et al., 2000; Kon
et al.,2008). De modo geral, se o paciente tem boa evolução clínica, sem
HIC, ele usa duas semanas de AMB, inicia 800 mg/dia de FCZ no hospital e
antes da alta, por volta do 7º dia de FCZ, faz-se nova punção liquórica, para
medida de PIC e avaliação dos parâmetros quimiocitológicos e micológicos.
Assim, nem sempre se espera por duas ou três culturas consecutivas
negativas no LCR para passar à fase de consolidação. Vale lembrar que a
ausência do fungo nas pesquisas liquóricas, pelo fato desse compartimento
poder se tornar estéril mais precocemente, não significa necessariamente
ausência do mesmo no parênquima encefálico.
Por outro lado, se a evolução clínica é ruim, com HIC de difícil
controle, mantém-se AMB por seis a dez semanas e o paciente só inicia FCZ
se estiver estável clinicamente, ou se houver contra-indicação formal ao uso
de AMB. Também, não há relatos de uso de doses maiores do que 800
mg/dia de FCZ, na literatura consultada.
Dannanoui et al.(2006) estudaram melhor a evolução clínica do que
microbiológica. Eles avaliaram os pacientes no diagnóstico, na 2ª semana e
no 3º mês de seguimento e viram que, na 2ª semana, houve 55% de
sucesso terapêutico. Para Dromer et al.(2007), a sobrevida no 3º mês foi
menor em pacientes com alteração neurológica ou imagem tomográfica
cerebral anormal e naqueles pacientes com neoplasia hematológica.
Geralmente após a alta hospitalar, o seguimento clínico do paciente é
feito em outro serviço. Dos 16 casos com sobrevida (16/21; 76,19%), após
três meses, oito tinham tido reinternação (três por recidiva ou piora clínica de
CSNC por má adesão ao tratamento, dois por neurotoxoplasmose, um por
tuberculose, um por neutropenia febril e um por massa pulmonar a
esclarecer e herpes genital); duas pacientes (p7,p8) ainda estavam
internadas, por complicações advindas da CSNC, e cinco estavam em
acompanhamento ambulatorial (três sem outras infecções, e dois fora do
IIER) .
65
O agente infecccioso no grupo estudado pertencia a uma única
espécie: C. neoformans. Nenhum isolado de C. gattii foi encontrado. Não foi
necessária a utilização de provas moleculares para tal confirmação. De outro
modo, a análise de DNA poderia levar à determinação do sorotipo, o qual
também pode ser determinado pela soroaglutinação com kit específico.
Dado o alto custo dessas técnicas, as mesmas não foram realizadas neste
estudo. Neste trabalho, apesar de não haver sido executada a sorotipagem,
sabe-se que no Brasil a maioria dos pacientes com aids tem criptococose
por C. neoformans do sorotipo A (Lacaz e Rodrigues, 1983; Rozembaum e
Rios-Gonçalves, 1994). Dromer et al. (2007) estudaram, prospectivamente,
230 pacientes com criptococose na França, no período de 1997 a 2001. Dos
230, 77% eram HIV+, 22% eram mulheres e 72,5% eram infectados pelo
sorotipo A. Os autores perceberam que a doença era mais grave em:
homens, em pacientes HIV+ e pacientes infectados com C. neoformans
sorotipo A , e consideraram que a resposta clínica pode ter influência do
sorotipo do agente etiológico. Outro estudo mostrou que o sorotipo A foi,
significantemente, menos sensível à AMB e FCZ do que o sorotipo D, tanto
pelo Etest quanto pelo método de microdiluição do CLSI . No entanto, vale
ressaltar que a relevância clínica da associação entre o sorotipo e a
sensibilidade a antifúngicos, ainda está por ser estabelecida (Dannanoui et
al., 2006). Recentemente, Gómez-Lopez et al. (2008) estudaram cepas
clínicas de Cryptococcus spp. de diversos países, incluindo o Brasil, e
compararam a atividade de drogas antifúngicas azólicas, anfotericina B e
flucitosina. Os autores concluíram que Cryptococcus gattii é mais sensível à
AMB e 5FC do que Cryptococcus neoformans. De modo contrário, aos azóis
fluconazol, itraconazol, voriconazol, ravuconazol e posaconazol, os isolados
de C. neoformans foram mais sensíveis do que os de C. gattii. A
sensibilidade maior de C.gattii à AMB, quando comparada à de C.
neoformans, foi anteriormente observada por Tay et al., em 2006.
Apesar de ambas serem leveduras, Cryptococcus spp. e Candida spp.
possuem grandes diferenças bioquímicas e genéticas entre si. Por isso,
deve-se ter a preocupação da busca de testes de sensibilidade antifúngica
66
que sejam mais específicos para Cryptococcus spp. A metodologia do CLSI,
descrita no documento M27-A2, recomenda parâmetros idênticos para testes
in vitro com leveduras do gênero Candida e do gênero Cryptococcus. O teste
recomenda uso do meio RPMI, com glicose a 0,2% tamponado a pH=7,0,
tanto para o método de macrodiluição quanto para microdiluição em placas
de fundo redondo e inóculo inicial em concentração de 0,5 x 103 a 2,5 x 103
ufc/mL.
A metodologia EUCAST é equivalente à do CLSI para leveduras do
gênero Candida (Rodrigues-Tudela et al., 2007a). Gómez-Lopez et al. (2008)
adotaram, com sucesso, o método EUCAST para avaliar sensibilidade de C.
neoformans e C. gattii a diversos antifúngicos, iniciando, a nível
internacional, a validação desse método para avaliar in vitro cepas de
Cryptococcus spp. O método inclui algumas modificações, como: uso do
meio RPMI com glicose a 2%, inóculo de 105 ufc/mL, placas de
microtitulação de fundo plano, leitura do teste com espectrofotometria. A
reação é feita sob temperatura de 35o C em ambos os métodos, e o tempo
de incubação é maior no método do CLSI. Como Cryptococcus spp. cresce
mais lentamente do que leveduras do gênero Candida, para o qual o teste
demora 48h, o período de incubação segundo método do CLSI, deve ser de
70 a 74 h. Neste trabalho, verificou-se, assim como relatado por outros
autores brasileiros, que a incubação do teste realizado segundo o método
EUCAST demora apenas 48h e, eventualmente, poucas cepas necessitam
de maior tempo para leitura de reação (Dias et al., 2006 ; Strob et al., 2007;
Claudino et al., 2008). Rodriguez-Tudela et al. (2000) verificaram,
previamente, que o crescimento de Cryptococcus spp. em culturas estáticas
era muito pequeno e recomendaram a agitação das placas durante a
incubação do teste. Ghannoum et al. (1992) recomendaram o uso de
microdiluição com o meio BYNB (buffered yeast nitrogen base). Nesta
pesquisa, esses procedimentos não foram necessários para as reações,
desde que, todas as amostras de Cryptococcus neoformans desenvolveram-
se, adequadamente, com densidade ótica igual ou acima de 0,3 no tubo
controle de crescimento.
67
O ponto de leitura da reação ou endpoint nos testes com azóis e 5FC
em ambos os métodos é em 50% de inibição (coeficiente de inibição - IC50)
para minimizar o efeito do fenômeno denominado trailing (Rodriguez-Tudela
et al., 2000; Cuenca-Estrella et al., 2001; NCCLS, 2002). Este fenômeno é
representado pelo crescimento residual do fungo, visto como turbidez na
placa de microdiluição, que se mantém acima da CIM, independente do
aumento de concentração da droga.
Neste trabalho, trailing com fluconazol foi verificado em cerca de 20%
das amostras. A ocorrência é ainda pouco observada em cepas de
Cryptococcus spp. e, por outro lado, freqüentemente descrita para isolados
de Candida tropicalis e menos em Candida albicans O fenômeno trailing
poderia causar grande erro nos resultados, levando a falsos valores de altas
CIMs, caso não fosse minimizado pelo artifício da leitura em 50% de
inibição. A determinação espectrofotométrica permite calcular com exatidão
o ponto de 50% de inibição, como ponto final de leitura (endpoint). O uso de
espectrofotômetro, para esse cálculo preciso, já havia sido proposto desde
1992, por Ghannoum et al., e, neste sentido, o método EUCAST é superior
ao do CLSI.
Para AMB, fármaco para a qual não ocorre o fenômeno de trailing, o
endpoint no método do CLSI é IC100, ou seja, a leitura é feita na
concentração do antifúngico que inibe 100% do crescimento do fungo, e no
método EUCAST, o endpoint é IC90.
Resistência natural à AMB não é observada em C.neoformans e a
resistência adquirida é fenômeno muito raro (Powderly et al.,1992a).Em
amostras isoladas de material biológico, alguns mutantes de C.neoformans
mostraram resistência à AMB. Esses mutantes, geralmente, apresentavam
alterações na composição dos esteróis nas membranas, com diminuição ou
ausência de ergosterol, ou ainda, presença de esteróis modificados, com
menor afinidade pelos polienos (Dick et al., 1980; Hadfield et al., 1987;
Walsh e Pizzo, 1988; White et al. 1998; Kontoyiannis e Lewis, 2002). Pierce
et al. (1978) encontraram que, quanto maior a concentração de AMB
necessária para inibir o crescimento de cepas de Candida albicans, maior a
68
alteração na concentração de ergosterol e 4 e 14- esteróis metilados. Sokol-
Anderson , em 1988, encontrou níveis elevados de catalase em cepas de C.
albicans resistentes à AMB, o que diminuiria o efeito oxidativo do polieno.
O crescimento da maioria das cepas dos principais patógenos
fúngicos para o homem (Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis,
Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum) é inibido in vitro a
concentrações de AMB que variam de 0,05 µg/mL a 1,0 µg/mL (Bennett,
1967; Shadomy et al.,1975). Esses dados indicam que cepas para as quais
o valor de CIM exceda esse intervalo devem ser consideradas resistentes à
AMB. Essas concentrações, ainda, são similares aos níveis sanguíneos
obtidos durante o tratamento parenteral com o fármaco e, portanto, CIMs
acima desses valores indicam que as cepas não seriam, em teoria, inibidas
pela AMB. No entanto, não se pode assumir que todos os pacientes
infectados por fungos inibidos frente a concentrações iguais ou inferiores a 1
µg/mL responderão, favoravelmente, à AMB. Outros fatores, como estado
imunológico do hospedeiro e local da infecção também são importantes
(Warnock, 1991).
Nesta pesquisa, observou-se que todos os 41 isolados de
C.neoformans foram sensíveis à AMB, sendo que a CIM variou de 0,25
µg/mL a 1µg/mL por método CLSI e de 0,12 µg/mL a 1,0 µg/mL pelo
EUCAST. A correlação clínico-laboratorial esperada para os casos de falha
clínica com CIM alta não foi observada, desde que valores > 2µg/mL,
imputados a cepas resistentes, não foram encontrados.
Bii et al., em 2006, estudando suscetibilidade antifúngica no Kenia,
relatou que todos os isolados clínicos de C.neoformans eram sensíveis à
AMB (CIM90 de 0,5 µg/mL), confirmando achados anteriores da literatura
internacional e nacional (Brandt et al., 2001; Hsueh et al., 2005; Pedroso,
2006; Dias, 2006). Ainda que o poder discriminatório do método de CIM por
microdiluição para AMB seja baixo, um estudo espanhol realizado com 317
amostras encontrou CIM de 2 µg/mL para 5,3% dos isolados (Perkins et al.,
2005) e outro, com 1811 amostras dos cinco continentes, mostrou o mesmo
valor de CIM em 1% das amostras (Pfaller et al., 2006). Com exceção
69
desses trabalhos, há pouca comprovação de que CIM por microdiluição
demonstre tendência à resistência à AMB. Strob (2007) não encontrou
nenhum valor de CIM acima de 1 µg/mL para 242 amostras do estado de
São Paulo no período de 1995 a 1999. Estudos de tendência anteriores a
esse, foram realizados por Pfaller et al. (2005), que também mostraram que
a sensibilidade à AMB permaneceu inalterada entre 1990 e 2004. Brandt et
al.(2001) analisaram 732 amostras norte-americanas coletadas em dois
períodos (1992 a 1994 e de 1996 a 1998) e confirmaram taxas estáveis de
CIM, sendo valor de 2 µg/mL encontrado em apenas 0,6% das amostras.
Os poucos relatos de valores altos de CIM de AMB e os raros
achados de cepas de Cryptococcus neoformans associados a valores acima
ou igual a 2µg/mL do polieno intrigam especialistas em distintas partes do
mundo e estimulam novas propostas de alternativas metodológicas para
detecção de cepas resistentes à essa droga. Entre elas, e em contraste à
determinação da CIM, que oferece somente dados de inibição, a técnica de
curva de morte mede a atividade microbicida, e oferece um quadro dinâmico
da ação do antimicrobiano. Porisso, ela é técnica mais relevante que a CIM
no estudo da avaliação clínica. Como é um teste que requer muito trabalho
laboratorial, o número de concentrações da droga e de amostras para os
ensaios são limitados.
A interpretação dos resultados de curvas de morte, apesar de mais
difícil do que os de CIM, pode levar à detecção de diferenças na
sensibilidade à AMB entre cepas para as quais a CIM de AMB tenha o
mesmo valor. Entretanto, até o momento, não existe significado clínico para
esses achados. Praticamente, todas as cepas de Cryptococcus spp. isoladas
de material biológico de pacientes com aids e criptococose morrem entre 6 e
24 h após exposição à dose de 1 µg/mL de AMB (Klepser et al., 1998b).
Mesmo assim, a evolução clínica costuma ser desfavorável. O mesmo foi
observado neste estudo, em que foi demonstrado que AMB mostrou efeito
fungicida maior (endpoint 8 h para 75%) sobre amostras de casos que foram
a óbito e menor (endpoint 30h para 75%) sobre amostras de casos que não
70
foram a óbito por criptococose. De outro modo, o número de casos não
permite nenhuma conclusão sobre a validade deste teste como valor
preditivo.
A escolha da concentração a ser estudada é primordial, já que deve
ser representativa da que é alcançada em doses terapêuticas de AMB nos
locais de infecção. Estudos in vitro com AMB empregando testes de curvas
de morte demonstraram atividade dependente de concentração e efeito pós-
antibiótico (EPA) do polieno contra vários fungos (Turnidge et al., 1994;
Klepser et al.,1997a;1997b;1998a;1998b). Poucos, no entanto, são os
estudos de correlação clínico-laboratorial de resistência à AMB, e, porisso,
destacam-se os de Rodero et al. (2000a; 2000b). Esses autores indicaram
as curvas de morte como melhores preditores de resposta clínica do que a
determinação de CIM. A interpretação dos resultados das curvas de morte,
entretanto, foi difícil, desde que algumas cepas não morreram com
concentração de 1µg/ mL de AMB, mas todas morreram frente a 2 µg/mL,
em período que variou de 1h a 6 h. Os autores consideraram que essas
cepas não poderiam ser enquadradas como resistentes mas, pelos
resultados da concentração fungicida mínima (CFM), algumas cepas
deveriam ser classificadas como tolerantes. Concluíram, então, que o uso de
testes fungicidas permite detectar outras formas de resistência, como
tolerância ou persistência, e porisso sugerem que essas técnicas são
melhores preditores de eficácia de drogas contra Cryptococcus spp. do que
CIM.
Neste estudo, a presença de sete amostras tolerantes isoladas de
quatro pacientes não teve correlação com óbito por criptococose. Este dado
confirma a necessidade de outros estudos com amostras tolerantes em
curvas de morte, para avaliar a sua utilidade como ferramenta de
prognóstico nos casos de criptococose.
Quanto à farmacodinâmica de AMB, estudos por curva de morte
revelam atividade fungicida dependente de concentração contra C.albicans e
71
C.neoformans. Entretanto, sua atividade fungicida é organismo-dependente.
É altamente eficaz contra C.albicans, mas não atua contra Trichosporon
asahii, patógeno emergente causador de infecções urinárias e pulmonares,
em pacientes imunodeprimidos, por exemplo. Consistente com o seu modo
de ação, ela exerce prolongado EPA in vitro, variando de 0,5 a 10,6 h e de
2,8 a 10,4 h para C.albicans e C.neoformans, respectivamente. Dados mais
recentes com os mesmos fungos mostram EPAs > 12 h com concentração
de AMB acima da CIM e EPAS menores de 0-2 h para concentrações abaixo
da CIM. Estudos farmacodinâmicos experimentais in vivo mostram que pico
sérico/CIM é o parâmetro que melhor prediz a evolução, seguido pelo tempo
acima da CIM (Ttau/CIM) e fração AUC/CIM. Esses estudos, feitos em
modelos animais com infecção fúngica invasiva, mostram, através de efeito
fungicida concentração-dependente e do efeito pós-antibiótico (EPA)
prolongado, que doses diárias maiores devem ser mais efetivas, e que
atingir o ótimo pico de concentração é importante (Groll e Kolve, 2004).
Em estudo de curva de morte, Nooney et al. (2005) verificaram que
24h foi o tempo para ação fungicida de 1 µg/mL de anfotericina B frente a
isolados clínicos de C.neoformans. Neste estudo, foi também usada
concentração de AMB de 1 µg/mL que representou até quatro vezes a CIM
dos isolados. Mesmo expondo a valor alto (aproximado ao da dose sérica)
não foi observada diferença do efeito fungicida entre os distintos isolados.
No presente estudo, a taxa de morte não se correlacionou com a CIM do
isolado. Isto indicou, novamente, que a CIM, obtida pelo método de
microdiluição, não é útil para separar isolados com sensibilidades distintas à
AMB, como foi sugerido, previamente em outros estudos (Rex et al., 1995;
Ernst et al., 2000).
A concentração do inóculo é um parâmetro de reação que, em testes
de eficácia de droga, tem grande influência nos resultados. Burgess e
Hastings (2000) comparando diversas concentrações de AMB e dois tipos de
inóculos: 103 ufc/mL (menor) e 105 ufc/mL (maior). Os autores
demonstraram efeito fungicida maior para o inóculo menor se a
concentração for quatro vezes a da CIM e, para o inóculo maior, se oito
72
vezes maior que a CIM. Utilizou-se, neste estudo um inóculo para os testes
de curva de morte, considerado alto (105 ufc/mL) e isto poderia explicar o
achado de endpoints apenas em 24 h, até 48 h de exposição à anfotericina
B. Ainda assim, este estudo in vitro demonstrou alta eficácia de anfotericina
B, pela morte entre 6h e 12h da maioria (70,6%) dos 41 isolados clínicos de
C. neoformans.
A concentração de anfotericina B, assim como o tamanho do inóculo,
é fator importante para os testes de curva de morte. Klepser et al. (1997b)
relataram atividade fungistática de anfotericina B contra Candida albicans,
em concentrações equivalentes à metade do valor da CIM, e efeito fungicida,
em concentrações ao dobro da CIM. Burgess e Hastings (2000) e Keele et
al. (2001) concluíram que AMB é fungistática para C. neoformans em
concentrações menores ou igual à CIM, enquanto concentrações maiores
que a da CIM tornam o polieno fungicida para cepas clínicas de
C.neoformans.
Neste estudo, foi avaliada AMB na concentração de 1µg/mL, valor
que representou quatro vezes o valor da CIM (0,12 µg/mL) frente a duas
amostras, duas vezes para 16 amostras (CIM de 0,5 µg/mL) e equivaleu à
CIM em 23 das quarenta e uma amostras avaliadas.
Burgess e Hastings (2000) relataram re-crescimento (regrowth) de
colônias, definido como crescimento após tempo necessário para efeito
fungicida (endpoint), quando a concentração de anfotericina B usada na
curva de morte era de até quatro vezes mais o valor de CIM para o isolado.
Os autores levantaram a possibilidade da ocorrência desse fenômeno devido
a vários fatores, entre eles, a degradação da droga ou desenvolvimento de
resistência in vitro. O re-crescimento também foi observado por Rodero et al.
(2000a) em teste de curva de morte com uma (1/5; 20%) amostra clínica de
C.neoformans obtida de paciente com aids.
Nesta pesquisa, houve crescimento de colônias, após o endpoint
fungicida, em taxa similar (14,6%) à encontrada por Rodero et al. (2000a),
em amostras de quatro pacientes. O fenômeno foi observado nas amostras
127, 128 e 129, obtidas de p20 , nos isolados 154 e 158, obtidos de p6, na
73
amostra 178 (p21) e afg1 (p3). A CIM de todas estas amostras foi avaliada
novamente, a partir das colônias observadas no fenômeno de re-
crescimento, demonstrando os mesmos valores inicialmente obtidos. Desde
que o método de microdiluição, conforme já mencionado, não tem bom
poder discriminatório para detectar cepas resistentes à AMB, esse resultado
era esperado. Os 4 pacientes evoluiram para a cura. Esses dados sugerem
que pesquisas com AMB e curva de morte devem ser mais bem exploradas
no tratamento e seguimento de infecções causadas pelo C.neoformans,
tanto em estudos animais quanto em humanos.
Em relação à sensibilidade a drogas azólicas, de modo geral, os
relatos de resistência primária a azóis são poucos em Cryptococcus
neoformans. O amplo uso de azóis como profilaxia primária para micoses
invasivas, utilização indiscriminada e automedicação para micoses
superficiais e, mesmo, o emprego de agrotóxicos contendo drogas dessa
natureza para combater fungos fitopatógenos, aumentou a exposição de
cepas de leveduras e, possivelmente, do agente da criptococose, a essas
substâncias. Desse modo, é quase impossível afirmar se a resistência é
primária ou secundária. Não é necessário determinar o valor de CIM frente à
primeira cepa isolada do paciente antes do tratamento, se ele não recebeu
azol previamente. Entretanto, o consenso brasileiro de criptococose
recomenda que todos os isolados de um mesmo paciente sejam guardados
e comparados com isolados de recaídas, para avaliar o aparecimento de
resistência antifúngica como fator de falha terapêutica (Kon et al., 2008).
Como ocorre com Candida krusei e Candida glabrata, resistência
primária de leveduras ao FCZ pode ser um fenômeno emergente (Odds,
1993). Alteração na sensibilidade de Cryptococcus spp. ao FCZ pode ser
devida ao fenômeno do efluxo, no qual a perda da droga do interior da célula
ocorre por transporte ativo mediado pela proteína P ou outras proteínas,
como MFS (superfamília dos facilitadores maiores). Outros mecanismos
possíveis são: - permeabilidade reduzida da membrana resultando em
alterações na composição do esterol, com consequente menor captura da
droga pelos fungos; - mutação na enzima alvo-14 α demetilase-do citocromo
74
P 450, resultando em diminuição da ligação com azóis; - superprodução da
enzima-alvo através da ação do gene CYP 51 ou ERG-11, entre outros
responsáveis pela produção da enzima-alvo (Odds, 1993; Vanden Bossche
et al., 1994). Pode ocorrer mutação na enzima-alvo do FCZ, levando à
resistência (Rodero et al., 2003; Posteraro et al., 2003; Almeida et al., 2007).
Sanguinetti et al. (2006) descreveram, recentemente, a participação do gene
AFR1, não somente na resistência, mas também na virulência do agente
dentro de macrófagos. A exposição ao fluconazol é, em teoria, um fator de
risco para o desenvolvimento de resistência. Resistência em cepas de
C.neoformans, assim como em outras leveduras, ainda é tema controverso.
De fato, os índices de resistência no agente de candidemia, a forma clínica
mais estudada entre as micoses invasivas, mostra que o uso amplo do azol
na América do Norte deveria ter provocado um aumento significativo da
resistência, fato não observado.
Para o agente da criptococose, ainda não há dados suficientes para
essas conclusões. A emergência de resistência em pacientes com aids e
CSNC , submetidos à terapêutica com FCZ por longos períodos, é relatada
em poucos trabalhos (Birley et al., 1995; Armengou et al., 1996; Berg et al.,
1998). Outros estudos não evidenciaram o mesmo fato em amostras
seriadas, descrevendo, claramente, o surgimento de resistência ao azol
(Casadevall et al., 1993; Brandt et al., 1996; Witt et al., 1996). Coutinho, em
2006, estudando amostras brasileiras de C.neoformans, verificou que a
exposição in vitro a doses de 8 µg de FCZ, induzem o aparecimento de
colônias com CIM superior ao da colônia inicial. Essa resistência, no
entanto, foi transitória, desde que, após remoção da droga, a grande maioria
dos isolados (89%) voltou a apresentar o perfil de sensibilidade da amostra
original. Isolados analisados por Mondon et al. (1999) e Yamazumi et al.
(2003) também reverteram ao fenótipo sensível inicial, após passagem em
meio de cultura sem fluconazol.
A presença de isolados com perfis distintos de sensibilidade ao
fluconazol foi, neste trabalho, confirmada em amostras seriadas de quatro
pacientes (19,05%) com 1º episódio de criptococose dos 21 pacientes
75
estudados (p6,p10,p18,p19). Não se pode afirmar que tenha ocorrido o
fenômeno de resistência adquirida pós-exposicional por vários motivos. O
primeiro deles é que apenas o caso p10 (25%) recebeu 800 mg/dia de
fluconazol. O primeiro isolado obtido deste paciente, tinha perfil inicial de
CIM de 0,5µg/mL e após exposição à droga por 30 dias , o segundo isolado
apresentou perfil de 8 µg/mL. Os outros três casos com cepas
heterorresistentes não usaram fluconazol durante a coleta das amostras. O
segundo motivo é que não foi realizado estudo molecular das cepas, o que
permitiria analisar a correlação genética entre elas, indicando se eram da
mesma linhagem ou não. A explicação mais razoável é que o agente da
criptococose não seja único, mas composto de várias linhagens.
Vale ressaltar que os valores de breakpoints para fluconazol foram
propostos pelo comitê CLSI, após diversos estudos de correlação clínica em
casos de candidíase de orofaringe, em geral, em pacientes com aids, com
avaliação de CIM para os agentes etiológicos. A correlação clínico-
laboratorial foi bem descrita, isto é, pacientes com cepas de Candida
albicans isoladas de cavidade oral que são resistentes in vitro ao FCZ (CIM
> 64 µg/mL), não respondem satisfatoriamente ao uso clínico desse triazol
(Ghannoum, 1996; Ghannoum et al., 1996).
O consenso brasileiro em criptococose considera que o uso
prolongado de FCZ, como profilaxia secundária, pode levar à emergência de
resistência do C.neoformans ao FCZ (i.e.CIM > 64) e ao ITZ (CIM > 0,5). O
primeiro isolado deve ser guardado por um ano, para que em caso de
recaída, a CIM possa ser comparada. Se houver aumento de CIM em 4
vezes para os isolados subseqüentes, falha clínica ou terapêutica pode ter
ocorrido pela resistência ao antifúngico, recomendando-se a troca de
medicamento.
Talvez mais importante que a habilidade de um teste antifúngico
predizer sucesso clínico quando a CIM é baixa, seja a sua habilidade em
predizer falha quando a CIM é alta (resistência). Nesse sentido, o teste in
vitro para FCZ cumpre o seu papel frente às infecções por Candida spp.:
somente 42% dos eventos são tratados com sucesso quando a CIM para o
76
isolado é > 64 µg/mL e, segundo Pfaller et al. (2006) independe se a
infecção é superficial ou invasiva. Há ainda, no entanto, pouca informação
nos estudos sobre a utilidade clínica desses testes em candidíase invasiva
e, muito menos, em casos de criptococose. Deste modo, a validação desses
breakpoints não pode ser feita para pacientes com criptococose (NCCLS,
2002).
Embora resistência in vitro de C.neoformans frente a FCZ tenha sido
associada à falência terapêutica durante o curso da doença em alguns casos
(Perfect e Cox, 1999; Dannanoui et al., 2006), somente poucos estudos
falam sobre a potencial relação entre os resultados in vitro obtidos no
momento do diagnóstico e a evolução clínica da doença (Menichetti et
al.,1996; Witt et al., 1996; Jessup et al., 1998; Aller et al., 2000; Rodero et
al.(2000a;2000b). Além disso, a maioria desses trabalhos avaliou a eficácia
depois de 10 semanas de tratamento; portanto, estamos longe de saber se a
CIM das drogas usadas no início do tratamento pode ser usado como
preditor de eficácia clínica recente (avaliação na 2ª semana de tratamento).
Apesar das modificações da técnica do CLSI (Ghannoum et al.,1992;
Lozano-Chiu et al., 1998), Rex et al. (2001) ainda consideram que os testes
não são bons para C.neoformans.
Menichetti et al. (1996) demonstraram que Cryptococcus spp. não era
mais isolado de LCR quando a CIM da cepa para FCZ estava abaixo de 4
µg/mL; de modo contrário, quando a CIM frente ao agente etiológico era
maior do que esse valor, as cepas continuavam a ser isoladas em meio de
cultura.
Aller et al. (2000) sugeriram que cepas de Cryptococcus spp. que são
inibidas por FCZ em CIM > 16 mg/mL são resistentes à droga, após verificar
certa correlação desses valores com falência clínica. Yildiran et al.(2002)
estudaram 213 isolados de C.neoformans de LCR frente a fluconazol,
voriconazol e posaconazol em período de dez anos, e encontraram CIM50 e
CIM90 de 2 µg/mL a 8 µg/mL, < 0,125 µg/mL(ambos) e < 0,015µg/mL e 0,06
µg/mL, respectivamente. Hsueh et al. (2005) descreveram 3 (4%) de
isolados de C.neoformans com CIMs de FCZ > 16 µg/mL e 2(3%) que não
77
foram inibidos por 1 µg/mL de AMB. Bii et al. (2006) detectaram 11,2% de
resistência a FCZ no Kenia.
Para avaliar os resultados obtidos com o método EUCAST, existe
apenas proposta de breakpoint para testes executados com Candida e
fluconazol. A proposta do grupo europeu foi feita após estudo clínico-
laboratorial com casos de candidemia em que foram levados em conta
muitos fatores, incluindo parâmetros farmacocinéticos da droga e
distribuição de CIM em população de cepas não-expostas, denominadas
“selvagens” (wild-population MIC). Para esse comitê, valores de CIM de FCZ
maiores de 8 µg/mL indicam cepas resistentes ao azol.
Se o breakpoint de 16 µg/mL (Aller et al., 2000) for usado neste
estudo, cinco (5/41; 12,2 %) isolados são resistentes a FCZ. Essas amostras
foram todas sensíveis ao ITZ, com exceção de uma delas, obtida de p2, que
foi S-DD para ITZ. Importante frizar que nenhum paciente usou ITZ para o
tratamento de CSNC, portanto, pode-se aventar a hipótese de
multiresistência entre os azóis, desde que p2 fez uso de fluconazol.
O fenômeno de multiresistência é descrito por outros autores e pode
ser explicado pelo sítio de ação único das drogas azólicas (Johnson et al.,
1995).
Nos quatro (4/21; 19,1%) casos (p2,p8,p14,p16) com amostras
resistentes a FCZ, houve falha clínica em apenas um (1/4; 25%) deles (p2),
demonstrando a baixa correlação clínico-laboratorial obtida com os
parâmetros usados neste estudo.
Alguns autores acreditam que determinados pacientes, com infecções
fúngicas deveriam ser tratados com combinação de drogas:-aqueles com
infecções invasivas devido a fungos oportunistas filamentosos e prognóstico
ruim;-com infecção aguda e fulminante ou infecções refratárias;-com
infecção em locais como o cérebro. Barchiesi et al. (2004) citam que a
terapêutica antifúngica combinada pode ser uma alternativa promissora em
algumas circunstâncias, pois ela pode aumentar a taxa de morte
microbiológica, diminuir a duração do tratamento, evitar o aparecimento de
resistência a drogas, e aumentar o espectro de atividade. Por outro lado, a
78
combinação pode aumentar o custo financeiro e a interação entre drogas
pode ter conseqüente aumento de toxicidade. Mesmo assim, Wheat (2003)
considera que, na próxima década, a combinação antifúngica deverá ser o
padrão para manejo de infecções difíceis de tratar.
A avaliação da eficácia das combinações antifúngicas é realizada
através de estudos in vitro, em modelos animais ou, ainda, em estudos
clínicos (Serena et al., 2005). O paradigma deste enfoque é o uso de AMB
com 5FC, que é sinérgica em Cryptococcus neoformans, tanto em modelos
animais quanto em testes in vitro, sendo também observada em pacientes
com CSNC. Existe interação positiva contra Cryptococcus neoformans com
as seguintes combinações de drogas:- AMB e 5-FC ; - AMB e azóis;- AMB e
rifampicina ;- azol e 5FC, além da tripla combinação de AMB, 5FC e azol
(Medoff et al., 1972; Polak et al., 1982; Diamond et al., 1998). Para Sugar
(1995), os trabalhos in vivo geralmente mostram sinergismo entre distintas
drogas, e estudos in vitro, geralmente, mostram antagonismo. A combinação
in vitro de AMB e ITZ permanece controversa, e estudos pré-clínicos não
evidenciam antagonismo (Lewis e Kontoyiannis, 2001).
Estudos experimentais em animais usando AMB em associação com
FCZ têm, na maioria das vezes, efeitos aditivos ou sinérgicos (Sugar et al.,
1995), com poucas exceções (Schaffner e Bohler, 1993). Em 1994, Scheven
e Self demonstraram antagonismo do FCZ sobre a AMB. Sob a ação do
FCZ, há depleção do ergosterol e acúmulo do esterol metilado na célula
fúngica. Anfotericina B e esse esterol têm baixa afinidade e, assim, em
teoria, a potência de AMB contra a célula ficaria diminuída. Para Vazquez et
al. (1996), as razões para os resultados conflitantes dos diversos estudos
que estudam combinação de AMB com azóis em infecções por Candida
albicans devem-se a diferenças no meio usado, no pH, temperatura e
tamanho do inóculo, bem como a extrapolação dos resultados de um
determinado azol para outros. Os autores observaram que ITZ foi mais
efetivo que FCZ em gerar células fúngicas fenotipicamente resistentes à
AMB e que a tolerância a doses, usualmente letais, de AMB, depende se a
exposição ao fármaco é transitória ou contínua.
79
O uso terapêutico associado de AMB com FCZ não é rotina no IIER,
mas sim o uso seqüencial (400-800 mg/dia de FCZ). Neste estudo, o teste
de tabuleiro de xadrez mostrou efeito aditivo para a minoria das amostras
(9/41;22%), obtidas de seis (6/21;29%) pacientes . Para os quinze pacientes
restantes, demonstrou-se interação indiferente entre AMB e FCZ . Efeito
antagônico não foi observado no conjunto de amostras estudado. Os dados
obtidos mostram que antagonismo deve ser raro, na associação de AMB e
FCZ. Em estudo anterior, relatamos dez pacientes em uso associado de
AMB e FCZ (Pappalardo et al., 2007).
As drogas podem ser divididas, segundo o seu modo de ação, em
duas categorias: concentração-dependente e tempo-dependente. O
conhecimento da categoria da droga administrada ao paciente com
criptococose é importante para entender a dinâmica de interação entre o
agente e a medicação e estimar o efeito in vivo.
Drogas tempo-dependentes têm ação fungistática ou fungicida,
conforme o tempo que atuam sobre o agente etiológico. Fluconazol é um
exemplo de droga tempo-dependente com EPA elevado, pois inibe o
crescimento fúngico nos intervalos das doses. Assim, é grande a importância
do total de FCZ administrado. O fármaco penetra no humor aquoso, vítreo,
cérebro , saliva , escarro, urina, próstata e outros fluidos corpóreos. Depois
de sua ingestão, mais de 80% da droga é encontrada na circulação.
Somente 11% de FCZ sérico liga-se às proteínas plasmáticas. As
concentrações esperadas de FCZ no sítio sistêmico de infecção podem ser
estimadas pelos níveis sanguíneos, pelo rápido equilíbrio entre níveis de
FCZ no sangue e em tecidos, e pelo fato de que a porcentagem de
distribuição entre tecidos ou fluidos corpóreos e plasma é de
aproximadamente 1, o que constitui vantagem terapêutica significante
(Wildfeuer et al., 1997).
Dose de 100 mg/dia (1,5 mg/kg/dia) produz pico sérico da droga de
6µg a 7 µg/mL; 400 mg/dia (6 mg/kg/dia) produz pico sérico de 20µg a 30
µg/mL e sua FC linear pode predizer níveis de pico sérico de 40µg a 60
µg/mL em dose de 800 mg/dia (12 mg/kg/dia). Com doses diárias, os níveis
80
plasmáticos poderiam ser, aproximadamente, metade do pico sérico. Assim,
uma dose diária de 400 mg/dia poderia prover níveis séricos de FCZ acima
de 10 µg/mL entre os intervalos das doses (Andes 2003a;2003b).
A concentração da droga no LCR é cerca de 70% do nível sanguíneo,
com ou sem meninges inflamadas, segundo Catalán e Montejo (2006).
O valor de AUC em pacientes saudáveis em uso de FCZ é quase
exatamente igual à dose diária, em miligramas. Assim, uma pessoa de 70
kg, usando 400 mg/dia de FCZ, terá uma AUC de 400 mg. h/litro.
A utilização de parâmetros FD e FC, como Cmax/CIM, AUC/CIM e
tempo que a concentração sérica da droga fica acima do MIC (Ttau/CIM)
está sendo cada vez mais recomendada. O interesse científico dessas
relações começou apenas recentemente para os antifúngicos (Groll et al.,
2001; Andes,2003a;2003b) , e a incorporação de breakpoints
farmacodinâmicos permanece um importante objetivo de trabalhos clínico-
laboratoriais (Groll e Kolve, 2004).
Nos últimos anos, a evidência de que considerações
farmacodinâmicas podem aumentar a habilidade dos médicos na otimização
do uso de FCZ no tratamento de candidemias é cada vez maior (Clancy et
al., 2005; Rodriguez-Tudela et al., 2007a). A razão entre a dose de FCZ e
CIM pode ser mais eficaz que o breakpoint da CIM isoladamente, pois
quantifica os efeitos do aumento da dosagem do fármaco (aludidos na
designação S-DD). Desde que FCZ é bem tolerado em doses até maiores
que 2000 mg/dia, e desde que a maioria das candidemias é causada por
cepas sensíveis ou S-DD ao azol, os achados do estudo podem propor o
uso de doses maiores do antifúngico, pelo menos até que se tenha o
resultado dos testes in vitro.
Rodriguez-Tudela et al. (2007a), estudaram a correlação entre CIM de
FCZ, dose/CIM de FCZ e a resposta clínica em pacientes com candidemia e
candidíase orofaríngea tratados com várias doses de FCZ. Os autores
referiram que dose de FCZ /CIM > 50 foi associada a uma taxa maior de
sucesso terapêutico; aconteceu o contrário quando o resultado da fração foi
< 50. Do mesmo modo, o estudo de Lee et al., 2000, em candidemia
81
humana, revelou cura de 79% (11/14) entre pacientes com fração dose/CIM
> 50, comparado à falência de 57% (4/7) em pacientes nos quais essa
fração era < 50.
A relação AUC/CIM também foi citada por outros autores como bom
preditor de resposta ao fluconazol, com outro valor. Quando a razão
AUC/CIM foi > 25, o sucesso clínico foi observado em 91% a 99% dos
pacientes; quando esse valor FD foi menor que 25, a falha terapêutica
ocorreu em 26% a 35% dos casos (Rex et al., 2001; Pfaller et al. 2006).
Outros estudos in vivo com cepas de Candida albicans com aumento
significativo de CIMs (64 vezes), encontraram que AUC/CIM ~25 predizia
eficácia. Andes e van Ogtrop (1999) também confirmaram sucesso
terapêutico com razão AUC/CIM~25 ,estudando cepas de C.albicans com
variação de até 500 vezes no valor da CIM inicial .
Os valores de AUC/CIM situaram-se entre 12,5 e 1600 para
fluconazol, nesta pesquisa. De doze pacientes
(p1,p2,p3,p5,p7,p8,p9,p10,p13,p15,p17,p20), em uso diário de FCZ (200
mg/dia a 800 mg/dia) na época da coleta de plasma, dez apresentaram a
relação AUC/CIM acima ou igual a 50, valor considerado como preditivo de
sucesso terapêutico. Os pacientes 1 e 17 (ambos com AUC/CIM>50)
morreram, por outra causa que não a criptococose. O caso P8 evoluiu para
cura, apesar da razão AUC/CIM ser menor do que 50; para Clancy et al.
(2005) valor de >25 seria preditivo de sucesso. Nos três (p2, p6, p12) casos
com óbito por criptococose, em apenas um deles foi possível aplicar este
parâmetro, pela existência dos dados. Neste paciente (p2) a relação
AUC/CIM foi de 12,5, indicando mau prognóstico. Convém ressaltar que os
valores de 25 e 50, respectivamente, recomendados por Clancy et al. (2005)
e Rodriguez-Tudela et al. (2007a) foram estabelecidos em estudos de
candidemia. Em nosso estudo, foi adotado esse padrão, frente à ausência
de propostas específicas para criptococose.
Com base nos resultados obtidos, concluiu-se que a penetração do
fluconazol mostrou-se adequada. A relação entre pico plasmático teórico
esperado e CIM variou entre 0,6 e 120; a relação plasma e CIM situou-se
82
entre 1,9 e 216 e a relação nível de LCR sobre a CIM ficou entre 0,52 a 132
para os 12 casos. Apesar dos testes in vivo do presente estudo mostrarem
que FCZ penetra bem no cérebro, a diretriz norte-americana indica que o
tratamento da fase de maior mortalidade de CSNC (duas primeiras semanas
de tratamento) seja feita com associação entre anfotericina B e flucitosina.
Para a maioria dos autores, o sucesso terapêutico da CSNC depende
mais da imunidade do hospedeiro do que do agente infeccioso. O local da
infecção também precisa ser levado em conta. Rodriguez-Tudela et al.
(2007a) propuseram recentemente, em candidemia, que valores de CIMs
menores ou igual a 2µg/mL indicam cepas de Candida sensíveis ao FCZ,
CIMs de 4µg/mL são relacionados à sensibilidade intermediária e CIMs
maiores ou igual a 8 µg/mL classificam cepas resistentes ao azol. Os
autores estudaram pacientes com candidemia causada por distintas
espécies de Candida spp.
É, ainda, indeterminado o breakpoint exato para a sensibilidade ao
fluconazol no tratamento da criptococose (Perfect e Casadevall, 2002).
Burgess e Hastings (2000) propuseram CIM de 16 µg/mL de FCZ frente às
cepas de C. neoformans, para separar isolados sensíveis de resistentes in
vitro ao azol, valor também considerado por Aller et al. (2000) em estudo
clínico. Nos casos com amostras com CIM nesse patamar ou acima dele ,
pode-se considerar a administração de doses altas ou troca de medicação
(Perfect e Casadevall, 2002). Infelizmente, os trabalhos sobre correlação
clínico-laboratorial em humanos com CSNC são bem mais escassos do que
os de candidemia. É mais fácil coletar sangue do que líquor, e o estudo de
resistência de C.neoformans a FCZ e AMB em sítio de difícil acesso como
SNC requer coletas seriadas do material. O fato adicional de CIM não ter
valor preditivo na evolução clínica de CSNC, também serve para explicar a
escassez de trabalhos desse tipo. Assim, a exemplo de Rodriguez-Tudela et
al. (2007a), que sugeriram CIM de FCZ de 8 µg/mL para cepas resistentes
de Candida spp isoladas de corrente sanguínea, valor igual ou menor de
CIM deveria ser proposto para cepas de C.neoformans isoladas de líquor.
83
Anfotericina B é droga concentração-dependente, e quanto maior sua
concentração, maior sua atividade e maior EPA. A farmacocinética de AMB
no plasma é estudada desde a década de 70, e, ainda, recentemente, é alvo
de pesquisas. A cinética da droga nos tecidos, em particular no cérebro, foi
relativamente bastante estudada em animais de experimentação. Apesar
disso, os achados são contrastantes e de difícil avaliação, desde que, os
dados obtidos são ora de tecido cerebral e ora de LCR. A correlação da
concentração de AMB nesses materiais e a do plasma varia de 3% a 70% e
essa disparidade de resultados deve-se, em parte, à diversidade
metodológica empregada nos ensaios analíticos. Até o momento, os estudos
encontrados na literatura não contribuem para desvendar o mistério de sua
farmacocinética no líquido cefalorraquideano e no parênquima cerebral.
Apesar dos 50 anos de uso, para AMB ainda há falta de dados para
determinar a melhor dose, duração da terapêutica, técnicas de
administração, assim como os distintos padrões farmacocinéticos em
populações variadas de pacientes (Gallis et al., 1990). A razão pico
sérico/CIM é um parâmetro útil nos casos de infecção em que podem
emergir subpopulações resistentes à AMB, sendo a mais indicada para
avaliar a eficácia do polieno. Para garantir eficácia clínica e prevenir
emergência de mutantes resistentes, valor de dois ou mais, nessa relação,
parece ser significativo no sucesso de tratamento de criptococose (Andes et
al., 2001).
A droga é largamente distribuída, com volume de distribuição de
cerca de 4L/kg; liga-se fortemente (91% a 95%) às duas maiores proteínas
plasmáticas, albumina e α1-glicoproteína ácida (Hartsel et al., 2001,
Bekersky et al., 2002a). Os órgãos-alvo mais importantes são o fígado (14 a
41% da dose), pulmões (1,2% a 6%) e rins (0,3 a 2%), mas existem
variações individuais. Até agora, a relação entre concentração sérica,
tissular, eficácia clínica ou toxicidade permanecem inexplicadas. Somente a
fração livre da droga é biologicamente ativa, e isso explica porque o sucesso
terapêutico é, diretamente, dependente da sua concentração no local da
infecção fúngica (Christiansen et al., 1985).
84
Depois da infusão venosa de AMB em dose de 1 mg/kg, a
concentração sérica máxima, usualmente, é de 1,5 e 2,0 mg/L, caindo para
0,36 ug/mL em 24 h e 0,3 µg/mL em 48 h. A meia vida inicial é de,
aproximadamente, 24 h; a fase beta de meia vida (meia vida terminal)
alcança 15 dias. A segunda fase da meia vida foi confirmada por Hoeprich
(1990), que encontrou meia vida de 21 h, medida entre 2 e 36 horas depois
de uma infusão venosa.
Concentrações séricas podem ser detectadas, no mínimo até sete
semanas após o término da terapêutica, refletindo liberação do fármaco por
membranas celulares. Se a dose ultrapassar 50 mg/dia, a proporcionalidade
não é mais linear, sendo a concentração sérica menor que a prevista
(Atkinson e Bennett, 1978; Catalán e Montejo, 2006). É metabolizada
parcialmente no fígado e eliminada pela bile (<15%). Anfotericina B penetra
pouco em meninges normais, cérebro, pâncreas, músculos, ossos, humor
vítreo e líquido amniótico normal e apresenta-se em baixos níveis em saliva
e secreções brônquicas.
Três formulações novas de AMB são usadas desde a década de 90:
dispersão coloidal, complexo lipídico e lipossomal. Essas formulações são
associadas à menor nefrotoxicidade, quando comparadas à forma de sal
desoxicolato. Anfotericina B lipossomal produz níveis maiores da droga no
plasma e tecidos, com marcada redução da excreção da droga inalterada na
urina e fezes (Bekersky et al., 2002a). O complexo lipossoma-AMB tem alto
tropismo pela parede celular do fungo, alta afinidade pelos hepatócitos e
sistema reticuloendotelial e baixo tropismo pelas células renais, diminuindo a
nefrotoxicidade. Embora lipossomos de distribuição lenta, como os
existentes na forma lipossomal de AMB, possam seqüestrar a droga em
compartimentos plasmáticos e teciduais, eles também liberam a droga, de
modo a permitir a coexistência de agregados de droga ligada e não ligada a
proteínas, aderida a lipossomos. Pelo menos uma semana após o uso de
AMB lipossomal, níveis da droga foram mais altos do que os da droga não-
lipossomal, demonstrando a habilidade dessa formulação para fornecer
reservatório de droga encapsulada em compartimentos do plasma. Em geral,
85
admite-se que a biodisponibilidade das novas formulações seja inferior à da
AMB convencional, tendo em vista a possibilidade da anfotericina B ficar
agregada à emulsão lipídica. Recomenda-se o uso de doses maiores (três a
seis vezes) para garantir efeito terapêutico (Rex e Stevens, 2005). Por outro
lado, alguns autores consideram que o encapsulamento de AMB em
lipossomos ou sua ligação a lipídios, pode aumentar sua eficácia, pois essas
formulações podem ser administradas em dosagens maiores do que a forma
de sal desoxicolato, resultando em índice terapêutico melhor (Lopez-
Berestein et al.,1985). A favor desse ponto de vista, a concentração máxima
de AMB lipossomal, após a administração de 2 mg/Kg, é cerca de oito vezes
maior que a concentração de AMB desoxicolato.
O acúmulo tissular parece ser responsável pela maior parte da
disponibilidade da droga. A droga atinge órgãos que são sítios comuns de
infecção fúngica. Com doses convencionais, níveis sanguíneos e tissulares
da droga excedem as concentrações que são inibitórias ou fungicidas in
vitro. Esses achados sugerem que AMB deveria ser mais efetiva
terapêuticamente do que o é. Atividade terapêutica pobre pode indicar que a
biodisponibilidade do fármaco é limitada devido à sua avidez aos
componentes dos tecidos (Christiansen et al., 1985).
Em pequenas concentrações, o polieno liga-se de modo reversível à
célula fúngica, sem gasto energético, exercendo apenas efeito fungistático.
Em altas concentrações, a ligação é irreversível e com gasto de energia, e
AMB atua como fungicida (Sarosi, 1969). Portanto, a droga pode ter efeito
fungistático ou fungicida, na dependência de sua concentração. Por ser
droga concentração-dependente, isso poderia explicar as recidivas após a
sua suspensão. Para Andes et al. (2001), dada a estreita janela terapêutica
de AMB e os frequentes insucessos clínicos, os regimes terapêuticos
deveriam ser revistos. Os autores sugeriram doses maiores, duas a três
vezes por semana, ao invés de doses menores diárias, para menor
toxicidade e maior ação da droga.
Alguns antifúngicos têm peso molecular alto, dificultando sua
penetração na barreira hematoencefálica e diminuindo as concentrações
86
terapêuticas no LCR. Flucitosina, fluconazol e voriconazol possuem a melhor
penetração liquórica, cada um deles resultando em, pelo menos, 50% da
concentração alcançada no soro (Arndt et al.,1988; Lutsar et al., 2003). O
conceito de que a concentração no LCR prevê a eficácia de agentes
antifúngicos é um engano, e o melhor exemplo disso é AMB, droga
essencialmente indetectável no LCR, e que ainda é a âncora do tratamento
de CSNC (Atkinson e Bennett ,1978; Saag et al., 2000).Postula-se que a
concentração tecidual desses agentes seja adequada o suficiente,
permitindo sua eficácia.
Embora a penetração de AMB no cérebro tenha sido descrita (Lee et
al., 1994), as concentrações observadas foram próximas ao limite da
quantificação de técnicas cromatográficas usadas para monitorar
concentrações tissulares. Comparada à observada em outros tecidos, a
penetração de AMB no cérebro foi mais lenta e reduzida. A concentração
máxima cerebral foi observada depois da hepática e esplênica e seus níveis
foram de até vinte vezes menores. Contaminação do tecido cerebral por
AMB presente nos capilares sanguíneos não pode ser excluída; porém sua
importância deve ser minimizada, desde que, estudos com animais de
experimentação mostram que a concentração no cérebro é menos que 3%
da sanguínea. O fármaco penetra mal no LCR (2-4%), mas há aumento de
sua penetração quando há inflamação meníngea (Catalán e Montejo, 2006).
Este valor (2-4%) LCR/plasma é muito distinto daquele descrito por Machard
et al. (2000) para a fração cérebro/plasma (3%-70%). Um argumento para
explicar isso é que a cinética no plasma e no cérebro não é linear, ao menos
no início do tratamento. Mas, de qualquer modo, não há estudos sobre essa
questão.
O conhecimento sobre a distribuição de AMB nos tecidos é limitado,
devido à baixa sensibilidade das técnicas analíticas usadas nos estudos. O
fármaco é eliminado mais rapidamente do plasma e pulmão, do que de
outros tecidos, indicando que, depois da distribuição nos tecidos, ele pode
ser liberado em taxas e períodos distintos. Altas concentrações no fígado e
baço e menores concentrações nos pulmões foram verificadas em estudo
87
farmacocinético de 72h (Machard et al., 2000). A concentração urinária é
semelhante à concentração sérica. Os níveis séricos, raramente,
ultrapassam 2 µg/mL, independente da dose ou da velocidade de infusão,
podendo refletir a saturação do sistema carreador sérico ligado à β-
lipoproteína (Drutz, 1987).
Bekersky et al. (2002a; 2002b) também demonstraram a característica
incomum concentração-dependência da AMB no plasma humano. Para a
maioria das drogas, a porcentagem de droga ligada diminui com o aumento
da concentração da droga no plasma, como resultado da saturação do ponto
de ligação protéica. Em contraste, a ligação de AMB no plasma aumenta
com o aumento de sua concentração de, aproximadamente, 95% de ligação
a 0,6 µg/mL, para 99% a 65 µg/mL. O mecanismo pelo qual AMB faz isso,
ainda permanece indeterminado. Comparando-se a forma lipossomal e a de
sal desoxicolato de AMB, a análise de biodisponibilidade da droga, medida
na AUC, mostra ser de 171 µg/mL para a forma lipossomal e de 18 µg/mL,
para desoxicolato. Geralmente, nas duas apresentações, à medida que
aumentamos a concentração sérica de anfotericina B, ao contrário do
esperado, com a saturação às proteínas, teríamos mais droga livre.
Entretanto, o fármaco continua ligado à proteína. Uma possível explicação
para isso é que a concentração de AMB não ligada é limitada pela sua baixa
solubilidade, enquanto a capacidade das proteínas plasmáticas de se
ligarem a ela é muito maior. Essas proteínas (albumina, α-1 glicoproteína
ácida e lipoproteínas) juntas, constituem mais de 5% da massa plasmática,
sugerindo que a ligação permanece insaturada nas concentrações testadas.
Pacientes com risco de desenvolver infecções fúngicas geralmente são
malnutridos, e, provavelmente, possuem níveis baixos de albumina sérica.
Isso poderia resultar em maiores concentrações de droga ativamente livre.
Entretanto, o assunto ainda não foi suficientemente estudado.
A concentração de AMB em fluídos biológicos é medida,
geralmente, por bioensaio, mas cromatografia líquida de alta pressão
(HPLC), imunoensaio e respirometria radiométrica são métodos também
88
usados. Apesar dos vários métodos, a determinação rotineira de AMB em
sangue, urina e LCR, não têm valor clínico definido.
Interferentes como bilirrubinas em altas concentrações podem atuar
no equipamento de HPLC, alterando dosagens de AMB (Hosotsubo et al.,
1988). Altas doses de AMB-desoxicolato podem ser, acuradamente
mensuradas até 5µg/mL,e valores acima disso ainda não são validados,
segundo a literatura consultada (Egger et al., 2001). A linearidade do
experimento com valores de até 80 µg/ mL foi avaliada somente para AMB
lipossomal e coloidal (Hong et al., 2007).
Lee et al. (2001), propuseram o método de cromatografia líquida
associada à espectrofotometria de massa (LC-MS), para melhorar a
performance da análise in vivo de AMB. Os autores utilizaram o método para
quatro matrizes biológicas: plasma, ultrafiltrado de plasma, urina e fezes, e
afirmaram que o método usado para pequenos volumes de urina poderia ser
facilmente adaptado para líquido cefalorraquideano. Hong et al., em 2007,
utilizaram o método LC-MS para estudar 39 casos tratados com AMB
lipossomal, demonstrando o perfil farmacocinético distinto dessa formulação,
quando comparada à AMB convencional.
A validação metodológica dos ensaios bioanalíticos para anfotericina
B, utilizados nesta tese foi, previamente, realizada (Perez et al., 2006).
Valores de CIMs de AMB para C.neoformans necessitam de
profunda avaliação e questionamento. Talvez, em breve, possa se decidir
pelo abandono desta técnica laboratorial como arma isolada para
acompanhar casos de criptococose.
Um dos principais focos de terapêutica antimicrobiana é a
caracterização da relação entre dose, intervalo de dose, concentração sérica
no corpo humano, CIM e efeito das drogas. Ao analisarmos a relação
farmacocinética e farmacodinâmica da droga, podemos entender o seu
modo de ação. Isso pode se tornar uma boa ferramenta para o
estabelecimento de breakpoints e um guia para orientação de dosagens
mais adequadas (Craig, 1998). Na prática clínica, a amostra biológica
estudada durante a evolução clínico-laboratorial de CSNC é o LCR. É
89
desalentador saber o quão pouco é conhecido desse material e que os
resultados de dosagens de AMB no LCR podem ser, ou não, representativos
da concentração real do polieno no parênquima cerebral, sítio da
criptococose.
Outros fatores, não somente o manejo da HIC e da meningoencefalite
criptocóccica, mas o controle da imunodeficiência, são mais importantes que
os resultados dos testes in vitro como preditores de eficácia terapêutica
(Dannanoui et al., 2006). De qualquer modo, este é ainda um tema
controverso, daí a importância da continuidade das pesquisas de correlação
clínico-laboratorial em criptococose.
90
6. Conclusões
1. O uso de HAART foi alto (86%), mas não total, no grupo estudado.
2. A letalidade foi baixa (14,3%), mas CSNC foi causa de 60% dos
óbitos, ressaltando a gravidade da sua associação à infecção pelo
HIV.
3. Incidência baixa (9,5%) de SRI; de 2 casos, um evoluiu para óbito por
CSNC.
4. Taxa alta de resistência de C. neoformans in vitro ao FCZ (19% dos
pacientes), determinada por duas metodologias equivalentes, CLSI e
EUCAST; baixa correlação com falha clínica (25%); no entanto, CIM
não foi relacionada a óbito por criptococose.
5. Sensibilidade a FCZ in vitro teve alta correlação(85,7%) com sucesso
6. Sensibilidade à AMB por CIM foi completa (100% das amostras de
C.neoformans);o efeito fungicida mostrou isolados com perfis distintos
de sensibilidade em 90% de 10 casos com amostras seriadas.
7. O estudo por curvas de morte mostrou isolados de C. neoformans
tolerantes à AMB , sem, no entanto, haver correlação com óbito por
criptococose.
8. O parâmetro farmacodinâmico AUC/CIM para fluconazol foi preditor
de sucesso clínico em 91,7% dos pacientes,e de falha clínica no único
paciente em que essa análise foi possível ser realizada ; esse
resultado, porém, não teve significância estatística.
9. O monitoramento das concentrações de fluconazol no plasma e no
LCR permitiu estimar a penetração do antifúngico no SNC,
concluindo-se que foi adequada e que níveis plasmáticos ficaram
dentro do previsto; de modo contrário, para anfotericina B, o
monitoramento foi insatisfatório, justificando outros estudos.
10. Os seguintes parâmetros laboratoriais de líquido cefalorraquidiano:
celularidade, glicose, proteína, contagem de célula fúngica, título de
antígeno de C. neoformans, assim como, idade, sexo, contagem de
linfócitos CD4, níveis plasmáticos e liquóricos de fluconazol, não foram
correlacionados com óbitos por criptococose.
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APÊNDICES
C,tomografia computadorizada de crânio; HIC,hipertensão intracraniana;M,masculino;F,feminino; nc,não consta # síndrome de reconstituição imunológica; AMB,anfotericina B; FCZ,
fluconazol; D4T,estavudina; 3TC,lamivudina; EFV,efavirenz; AZT,zidovudina; NFV,nelfinavir; LPN/RTN,lopinavir+ritonavir; TNF,tenofovir; IDN,indinavir; ATZ,atazanavir; Sítio
extraneural: 1=hemocultura e urocultura negativas; 2=medula óssea e hemocultura positivas; 3=urocultura positiva,hemocultura negativa; 4=hemocultura e urocultura negativas,
com trato gastrointestinal positivo; 5=gânglio positivo, medula óssea negativa; 6=hemocultura e medula óssea negativas; 7=hemocultura negativa; 8= urocultura negativa.
APÊNDICE 1. Dados de 21 pacientes com criptococose de sistema nervoso central associada à aids, IIER, 2004-2005
Terapia antifúngica
Caso
Sexo
Idade Antifúngico Antiretroviral
Insuficiência
Renal
HIC Sítio
Extraneural
TC
Outra
Infecção Oportunista
1 M 41 AMB e FCZ d4t,3tc,efv sim não 1 sim neurotoxoplasmose
2# M 28 AMB e FCZ azt,3tc,efv não nc 4 sim tuberculose
3# M 35 AMB e FCZ azt,3tc,efv sim sim 1 sim não
4 M 37 AMB e FCZ azt,3tc,efv não sim 3 sim não
5 M 50 AMB e FCZ azt,3tc,efv não sim nc sim Não
6 M 35 AMB azt,3tc,efv nc sim nc nc não
7 F 51 AMB e FCZ d4t,3tc,lpn/rtn não sim 2 sim micobacteriose SNC
8 F 36 AMB e FCZ tnf,3tc,lpn/rtn não sim nc sim Tuberculose
9 M 44 AMB e FCZ azt,3tc,idn,rtn não não 8 sim não
10 M 54 AMB e FCZ nenhum sim sim 7 sim Neurotoxoplasmose
11 M 38 AMB azt,3tc,efv não nc 7 nc não
12 M 38 AMB e FCZ azt,3tc,efv sim nc nc sim Tuberculose
13 M 37 AMB e FCZ nenhum não não 7 sim Tuberculose
14 M 31 AMB d4t,3tc.lpn/rtn sim sim nc sim Neurotoxoplasmose
15 M nc AMB e FCZ d4t,3tc,efv não não nc nc tuberculose
16 M 33 AMB e FCZ azt,3tc,efv sim sim nc sim não
17 M nc FCZ tnf,3tc,atz,rtn não nc nc sim neurotoxoplasmose
18 M 38 AMB e FCZ tnf,3tc,efv sim nc 1 sim não
19 F nc AMB e FCZ nc nc não 6 sim neurotoxoplasmose
20 F 28 FCZ tnf,3tc,d4t,atz,rtn não não nc nc não
21 M 34 AMB e FCZ azt,3tc,efv não não 5 nc Tuberculose
(Continuação)
APÊNDICE 1. Dados de 21 pacientes com criptococose de sistema nervoso central associada à aids, IIER, 2004-2005
Exame LCR
pesquisa leveduras Caso
Evolução
Clínica CSNC
Carga Viral
(cópias/mL) CD4
(cel/mm3)
células proteínas
glicose
Qualitativa cél/mm3 IG (%)
Título
Ag
1 óbito (NC) Nc nc 3 80 41 positiva 27 1 nc
2# óbito (C) <400 29/276 (*) 31 274 16 negativa nc nc + soro + LCR
3# cura 424 7/184(*) 3 126 46 positiva 325 6 nr
4 cura Nc 37 254 281 14 positiva 248 4 nr
5 cura <400 94 1 67 36 positiva 49 12 nr
6 óbito(C) Nc 23 6 27 64 positiva 4400 nc nr
7 cura Nc 10 1 43 46 positiva 1216 20 nc
8 cura 11300 47 7 30 64 positiva nc nc positivo
9 cura Nc nc 2 39 41 positiva 652 8 nc
10 cura Nc 226 32 75 38 positiva 115 9 nc
11 cura 373000 4 1 43 46 negativa nc nc nr
12 óbito (C) 2760 369 300 156 53 positiva 8 nc nr
13 cura 506000 12 455 369 41 positiva 95 8 nc
14 cura 400000 32 19 90 50 positiva 20 3 nc
15 cura Nc 12 3 101 52 positiva 3 nc nc
16 cura Nc nc 48 58 42 positiva 780 0,3 nc
17 Óbito (NC) Nc 4 10 230 63 nc nc nc positivo
18 cura Nc 32 15 395 31 positiva 104 11 nc
19 cura Nc 19 3 110 44 negativa nc nc positivo
20 cura Nc 8 5 116 40 negativa nc nc 64
21 cura Nc 85 8 53 46 positiva 3 nc nr
(*) antes/após síndrome reconstituição imunológica; CSNC, criptococose de sistema nervoso central; óbito (NC), óbito por outra causa que não criptococose; óbito (
C ), óbito por criptococose; nc= não consta; IG, índice de gemulação; Ag, antígeno; +, positivo; LCR, líquido cefaloraquidiano; nr, não reagente
Apêndice 2. Testes de sensibilidade para fluconazol, itraconazol e anfotericina B, para 41 amostras de 21 casos de aids e CSNC,
IIER, 2004-2005.
MIC (µg/mL), antifúngico e método
FIC (µg/mL) FICI
FCZ FCZ ITZ AMB AMB
Caso Isolado
Data
Coleta EUCAST CLSI EUCAST EUCAST CLSI FCZ AMB valor Interpretação
Efeito
fungicida
tempo
(h)
1 177 01/09/2004 0,25 0,25 0,06 0,25 0,5 0,25 0,5 2 indiferença 6
2 173 01/09/2004 8 16 0,25 0,5 0,5 0,25 0,25 0,5 adição 6
3 Afg 1 20/01/2005 0,5 0,5 0,06 0,25 1 0,25 1 1,5 indiferença 24*/***
4 Afg 2 14/09/2004 4 8 0,06 0,5 0,5 0,25 0,5 1,03 indiferença 6
5 141 28/01/2004 4 8 0,12 0,12 0,5 0,25 0,5 1,03 indiferença 6
5 142 15/09/2004 4 4 0,03 0,12 0,5 0,25 0,5 1,25 indiferença 6
6 # 154 12/09/2004 8 4 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 1,13 indiferença 6****
6 155 13/09/2004 0,5 0,5 0,12 0,5 1 0,5 0,5 1,5 indiferença 12
6 156 16/09/2004 4 4 0,12 0,5 0,5 0,5 0,5 1,13 indiferença 12
6 157 17/09/2004 4 4 0,12 1 1 0,5 0,5 0,63 adição 12
6 158 20/09/2004 2 2 0,12 0,5 0,5 0,5 0,5 1,25 indiferença 12*
6 159 22/09/2004 4 4 0,25 0,12 0,5 0,5 0,5 1,13 indiferença 12
6 160 24/09/2004 4 4 0,12 0,25 0,5 0,5 0,5 1,13 indiferença 6
7 488 16/09/2004 0,25 0,5 0,015 0,12 1 0,25 1 1,5 indiferença 12
7 489 23/09/2004 0,25 0,5 0,015 0,12 1 0,25 1 1,5 indiferença 24
CONTINUAÇÃO DO APENDICE 2
MIC (µg/mL), antifúngico e método
FCZ FCZ ITZ AMB AMB FIC (µg/mL) FICI
Caso Isolado
Data
Coleta EUCAST CLSI EUCAST EUCAST CLSI FCZ AMB valor Interpretação
Efeito
fungicida
tempo
(h)
8 Afg 3 13/10/2004 8 16 0,12 0,12 1 0,25 1 1,02 indiferença
12
9 143 24/10/2004 8 8 0,015 0,12 1 0,25 1 1,03 indiferença 48
9 144 08/11/2004 8 8 0,015 0,12 1 0,25 1 1,03 indiferença 6
10 # 145 19/10/2004 0,25 0,5 0,015 0,25 1 0,25 1 1,5 indiferença 6
10 146 19/10/2004 0,25 0,5 0,015 0,25 1 0,25 1 1,5 indiferença 12
10 147 18/11/2004 4 8 0,06 0,25 1 0,25 1 1,03 indiferença 6
11 152 23/10/2004 8 4 0,5 0,25 1 0,25 0,5 0,56 adição 48
12 172 26/10/2004 4 8 0,25 0,12 0,5 0,25 0,5 1,03 indiferença 6
13 174 29/09/2004 4 4 0,25 0,25 0,5 0,25 0,25 0,56 adição 48
13 175 22/11/2004 4 4 0,25 0,5 0,5 0,25 0,25 0,56 adição 12
14 140 05/11/2004 8 16 0,12 0,25 1 0,25 1 1,02 indiferença 6
15 Afg 4 08/11/2004 4 8 0,06 0,12 0,25 0,25 0,25 1,02 indiferença 12
16 135 10/11/2004 8 16 0,06 0,25 1 0,25 1 1,02 indiferença 48
16 139 12/11/2004 8 16 0,06 0,12 1 0,25 1 1,02 indiferença
12
CONTINUAÇÃO DO APENDICE 2
MIC (µg/mL), antifúngico e método
Caso Isolado
Data
Coleta FCZ FCZ ITZ AMB AMB
FIC
(µg/mL) FICI
Efeito
fungicida
tempo
(h)
EUCAST CLSI EUCAST EUCAST CLSI FCZ AMB valor Interpretação
17 Afg 5 18/11/2004 1 0,5 0,06 0,5 1 0,25 0,5 1 indiferença 6
18 149 13/10/2004 4 8 0,12 0,25 0,5 0,25 0,5 1,03 indiferença 12
18 151 23/11/2004 1 2 0,06 0,25 0,5 0,5 0,5 1,25 indiferença 48
19 # 130 22/11/2004 0,5 0,5 0,015 0,25 1 0,25 0,5 1 indiferença 12
19 131 23/11/2004 4 8 0,015 0,25 1 0,25 0,5 1,03 indiferença 6
19 132 25/11/2004 8 8 0,06 0,12 1 0,25 0,5 1,03 indiferença 48
19 133 03/02/2005 8 8 0,06 0,25 1 0,25 0,5 0,53 adição 48
19 134 03/02/2005 4 8 0,015 0,25 0,25 0,25 0,25 1,03 indiferença 6
20 127 27/06/2004 8 8 0,03 0,25 0,5 0,25 0,25 0,53 adição 12 **
20 128 30/11/2004 8 8 0,06 0,25 1 0,5 0,5 0,56 adição 48***
20 129 01/02/2005 4 8 0,015 0,12 1 0,25 0,5 0,63 adição 24*
21 178 06/01/2005 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,25 1 1,5 indiferença 48 ***
# Pacientes com amostras com heterorresistência para FCZ; MIC, concentração inibitória mínima; FCZ, fluconazol; AMB, anfotericina B; ITZ,
itraconazol; FIC: concentração inibitória fracionada para combinação FCZ-AMB; FICI: índice de FIC, onde: sinergismo se < 0,5; adição se > 0,5 e
< 1; indiferença se > 1 e < 4 e antagonismo se > >4;*re-crescimento com 48 h de exposição; **re-crescimento com 24 h de exposição; ****re-
crescimento com 12 h de exposição; ***re-crescimento com 72 h de exposição
Apêndice 3. Parâmetros farmacodinâmicos para avaliação de sensibilidade de 13 amostras de Cryptococcus neoformans,
obtidas de 12 pacientes, com aids e criptococose de sistema nervoso central, sob uso de fluconazol, IIER, 2004-2005.
(*) paciente sem FCZ na coleta da amostra; (**) valor teórico previsto, pois não foi feita dosagem em plasma; (***) AUC: área sob a curva calculada teoricamente, segundo dose
administrada, sendo 5 a 6µg/mL, se 100 mg/d; 20 a 30 µg/mL, se 400 mg/d e 50 a 60µg/mL, se 800 mg/d;.nc: nada consta; nr: não realizado
Nível (µµµµg/mL)
Medido por HPLC (%)
Caso Amostra
Data
da Coleta
MIC por CLSI
(µµµµg/mL)
Dose
Diária
(mg) LCR Plasma Nível LCR/plasma NívelLCR/MIC Nível Plasma/MIC
Pico Plasmático
Teórico/MIC AUC/MIC
1 177 01/09/2004 0,25 200 33 54 61 132 216 10-15/0,25=40-50 800
2 173 01/09/2004 16 200 8,3 48,2 17,1 0,5 3,01 10-15/16=0,6-0,9 12,5
3 Afg 1 20/01/2005 0,5 800 45,6 75,2 66,5 91 150 50-60/0,5=10-120 1600
5 142 15/09/2004 4 400 19,9 nc 66-99** 4,9 nc 20-30/4=5-7,5 100
7 489 23/09/2004 0,5 800 6,6 14,3 25 13 28,6 50-60 / 0,5=100-120 1600
8 Afg 3 13/10/2004 16
200 a
400 15,8 nc 52,7-100** 1 nc 10-30 / 16=0,6-1,9 12,5 – 25
9 143 24/10/2004 8 800 nr nr nc nc nc 50-60 / 8=6,5-7,5 100
9 144 08/11/2004 8 800 16,6 15,3 100 2,1 1,9 50-60 / 8=6,5-7,5 100
10 147 18/11/2004 8 800 30 61,2 50 3,8 7,7 50-60 / 8=6,5-7,5 100
13 175 22/11/2004 4 800 15,8 19,9 79,4 4 4,97 50-60 / 4=12,5-15 200
15 Afg 4 08/11/2004 8 400 0 23,7 0 nc 2,96 20-30/8=2,5-3,8 50
17 Afg 5 18/11/2004 0,5 400 nr 0 nc nc 0 20-30/0,5 =40-60 800
20 129 01/02/2005 8 800 nr 54,6 nc nc 6,8 50-60 / 8=6,5-7,5 100
