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PALOMA OLIVEIRA VIDAL

Estudo genético e morfológico de populações de Aedes aegypti (Culicidae) na área metropolitana de São Paulo – SP

Dissertação apresentada ao Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro Orientador: Prof. Dr. Lincoln Suesdek

São Paulo 2010

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Vidal, Paloma Oliveira.

Estudo genético e morfológico de populações de Aedes aegypti (Culicidae) na área metropolitana de São Paulo (SP) / Paloma Oliveira Vidal. -- São Paulo, 2010.

Orientador: Lincoln Suesdek. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro. Linha de pesquisa: Culicídeos de interesse médico Versão do título para o inglês: Genetic and morphological study of Aedes aegypti (culicidae) population in São Paulo (SP) metropolitan area. Descritores: 1. Aedes aegypti 2. Morfometria 3. Evolução 4. Genética 5.Insetos vetores 6. Culicidae I. Suesdek, Lincoln II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós Graduação em Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro III. Título.

ICB/SBIB0175/2010

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

_________________________________________________________________________________________________________Candidato(a): Paloma Vidal Oliveira.

Título da Dissertação: Estudo genético e morfológico de populações de Aedes aegypti (Culicidae) na área metropolitana de São Paulo (SP).

Orientador(a): Lincoln Suesdek.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada a .............../................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ......................................................................................... Nome: ................................................................................................. Instituição: ..........................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ......................................................................................... Nome: ................................................................................................. Instituição: ..........................................................................................

Presidente: Assinatura: ......................................................................................... Nome: ................................................................................................. Instituição: ..........................................................................................

Aos meus pais, Eudes e Nadja por todo apoio, dedicação e educação. Ao meu marido Jaime Henrique pelo amor, carinho e amizade. Ao meu irmão Ramon pela grande amizade.

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Doutor Lincoln Suesdek, pela orientação, confiança, oportunidade de crescimento acadêmico/científico, amizade e conhecimento transmitidos durante esses anos de convivência, os quais foram fundamentais para a minha formação.

Ao programa de Pós-graduação Biologia da Relação Patógeno Hospedeiro, do

Instituto de Ciências Biomédicas da USP. Ao laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan onde todo o trabalho foi

desenvolvido. Aos Centros de Controle de Zoonoses dos municípios de Guarulhos, Osasco e

Suzano por terem ajudado cedendo larvas coletadas nos pontos estratégicos de cada município.

Às funcionárias Ângela e Wilma do departamento de Parasitologia do ICB. Aos meus pais por serem meu exemplo de Vida, minha força, por estarem

sempre acreditando em mim e me apoiando. Ao meu amor Jaime Henrique, pela paciência, carinho, apoio, por ser um grande

companheiro, estando ao meu lado em todos os momentos. Sempre me incentivando e me encorajando a lutar pelos meus objetivos. Sem esquecer das nossas discussões científicas bastante enriquecedoras, muito obrigada!

Ao meu irmão pela amizade, momentos de diversão e por nunca me negar uma

ajuda quando eu precisava. Aos meus sogros que mesmo de longe sempre torceram pelo meu bom

desempenho. Às mestres Maria Cristina e Camila Moratore que me ajudaram a dar os

primeiros passos na área da morfometria geométrica. Aos “morfométricos” formado pelo Eduardo (Edu), Fábio (Fio), Mariana (Mari) e a

Vívian (Cidinha), por realmente ser uma equipe que trabalha unida, sempre dispostos a ajudar e proporcionando vários momentos de descontração.

Aos colegas, funcionários e pesquisadores do Laboratório de Parasitologia do

Instituto Butantan pela troca de experiências, ajuda, convívio e descontração. Ao CNPq pela concessão da bolsa. A Deus pelo dom da Vida e Saúde que possibilitaram a realização deste

trabalho.

O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada. Caminhando e semeando, no fim terás o que colher.

Cora Coralina

RESUMO

Vidal PO. Estudo genético e morfológico de populações de Aedes aegypti (Culicidae) na área metropolitana de São Paulo (SP) [dissertação (Mestrado em Parasitologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010. Aedes aegypti é uma espécie de mosquito da família Culicidae (Diptera) proveniente da região africana. Atualmente está distribuída por quase todo o mundo, com ocorrência nas regiões tropicais e subtropicais. O controle das suas populações é considerado assunto de saúde pública por ser o vetor de agentes etiológicos de doenças graves como a dengue e a febre amarela. Devido à inexistência de uma vacina para combater o vírus dengue, a alternativa atual é controlar o vetor. Estudos populacionais são de grande importância para o desenvolvimento de estratégias de controle, no entanto, no Estado de São Paulo há uma carência de estudos populacionais referente ao Ae. aegypti. Devido a esse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar a variabilidade genética e fenotípica de quatro populações de Ae. aegypti na área metropolitana de São Paulo, Butantã, Guarulhos, Osasco e Suzano. As distâncias geográficas entre essas localidades são no máximo 50 km e no mínimo 13,5 km. A assimetria bilateral alar quanto à forma foi tênue e em relação ao tamanho não se mostrou mais acentuada em nenhuma das populações analisadas. As quatro populações revelaram alto dimorfismo sexual de forma e tamanho, sendo asas de fêmeas maiores que asas de machos. As análises interpopulacionais de forma em ambos os sexos mostraram variabilidade morfológica alar que, no entanto não indica estruturação populacional. Não foi observada correlação entre valores de distância fenética alar e distância geográfica para machos (r = -0,03) e fêmeas (r= 0,34). Nas análises genéticas foram utilizados cinco loci microssatélites. Foi encontrada uma média de cinco alelos por locus. A heterozigosidade média esperada variou de 0,512 a 0,609. Dos loci analisados 65 % não se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg, devido ao déficit ou excesso de heterozigotos. Estruturação populacional foi detectada (Fst global = 0,062, p <0,05) e baixo fluxo gênico (Nm = 0,47) foi presumido nas quatro localidades. Esses resultados apontam para uma heterogeneidade genética entre essas populações, distanciadas em pequenas escalas geográficas. Foi observada correlação entre as distâncias genética e geográfica (r= 0,76). Os dois marcadores populacionais aqui empregados aparentemente têm graus de resolução distintos para eventos microevolutivos, tendo sido DNA microssatélite ligeiramente mais sensível para acusar estruturação populacional.

Palavras–chave: Morfometria geométrica alar. Microssatélites. Microevolução. Mosquitos. Culicídeos.

ABSTRACT

Vidal PO. Genetic and morphological study of Aedes aegypti (culicidae) population in São Paulo (SP) metropolitan area. [Master thesis (Parasitology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010. Aedes aegypti is a mosquito species of Culicidae family (Diptera) originary from Africa. It currently occurs in most of the world, with more frequency in tropical and subtropical regions. The control of their populations is considered a public health subject because this mosquito is the vector of etiologic agents that causes serious diseases such as dengue and yellow fever. Since vaccines are still under development, dengue prevention depends primordially on vector control. Populational studies of Ae. aegypti are important to develop control strategies, but unfortunately the State of São Paulo lacks such studies. Despite this context, the objective of this work was to evaluate genetic and phenotypic variability of population samples of Ae. aegypti from four collecting sites in the metropolitan area of São Paulo city: Butantan, Guarulhos, Osasco and Suzano. Geographic distances between locations ranged from 13.5 to 50 km. The wing asymmetry is non-significant for size and tenuous for shape from four populations analyzed. The four populations revealed strong sexual dimorphism concerning shape and size, being the wings of females larger than those of males in all populational samples. The interpopulational analysis of shape for females and males showed morphological variability in wings, but did not indicate population structure. Pairwise fenetic distances among populations were not correlated to the geographic distances for males (r = -0.03) and females (r = 0.34). For genetic analysis we used five microsatellite loci. All five loci were polymorphic (mean alleles/locus= 5). The mean expected heterozygotes ranged from 0.512 to 0.609. Of the loci analized, 65 % were not in Hardy-Weinberg equilibrium due to either deficit or excess of heterozygote. Populational structure was detected (global Fst= 0.062; p<0.05) and low gene flow (Nm= 0.41) was presumed among four locations. These results indicate a genetic heterogeneity among these populations within a small geographic scale. Pairwise genetic distances among populations were correlated to the geographic distances (r = 0.76). The two populational markers used here apparently have different degrees of resolution for microevolutionary events, being that microsatellite DNA were slightly more sensitive in revealing populational structure.

Keywords: Wing geometric morphometrics. Microsatellites. Microevolution. Mosquitoes. Culicidae.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

SSRs BUT GUA OSA SUZ FD FE MD ME CP MG pb HW Nm

microssatélites população do bairro do Butantã, município de São Paulo população do município de Guarulhos população do município de Osasco população do município de Suzano asas direitas de fêmeas asas esquerdas de fêmeas asas direitas de machos asas esquerdas de machos componente principal morfometria geométrica pares de bases de DNA Hardy-Weinberg (modelo de genética populacional) número de migrantes

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de Vida do Aedes aegypti ................................................................

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Figura 2. Mapa da área metropolitana de São Paulo ..............................................

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Figura 3. Pupas e larvas do mosquito Aedes aegypti .............................................

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Figura 4. Fêmea de Aedes aegypti realizando o repasto sanguíneo ......................

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Figura 5. Foto da asa de Aedes aegypti com os pontos anatômicos ......................

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Figura 6. Assimetria bilateral do formato alar de fêmeas de Aedes aegypti ...........

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Figura 7. Assimetria bilateral do formato alar de machos de Aedes aegypti ...........

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Figura 8. Assimetria bilateral do tamanho alar de fêmeas de Aedes aegypti ..........

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Figura 9. Assimetria bilateral do tamanho alar de machos de Aedes aegypti .........

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Figura 10. Dimorfismo sexual alar na população do Butantã ..................................

46

Figura 11. Dimorfismo sexual alar na população de Guaruhos ...............................

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Figura 12. Dimorfismo sexual alar na população de Osasco ..................................

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Figura 13. Dimorfismo sexual alar na população de Suzano...................................

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Figura 14. Dimorfismo sexual do tamanho alar .......................................................

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Figura 15. Variação geográfica do formato alar de fêmeas .....................................

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Figura 16. Variação geográfica do formato alar de machos ....................................

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Figura 17. Fenograma de distância de Mahalanobis entre fêmeas .........................

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Figura 18. Fenograma de distância de Mahalanobis entre machos ........................

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Figura 19. Fenograma de distância geográfica .......................................................

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Figura 20. Correlação entre distância geográfica e distância fenética ....................

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Figura 21. Variação geográfica de tamanho alar de machos e fêmeas ..................

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Figura 22. Locus AED19 – alelos e suas respectivas freqüências ..........................

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Figura 23. Locus T3A7– alelos e suas respectivas freqüências ..............................

62

Figura 24. Locus 38/38 – alelos e suas respectivas freqüências ............................

62

Figura 25. Locus 34/72 – alelos e suas respectivas freqüências ............................

63

Figura 26. Locus C2A8 - alelos e suas respectivas freqüências .............................

63

Figura 27. Número de homozigotos esperado e observado para os cinco loci microssatélites na população do Butantã .................................................................

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Figura 28. Número de homozigotos esperado e observado para os cinco loci microssatélites na população de Guarulhos .............................................................

69

Figura 29. Número de homozigotos esperado e observado para os cinco loci microssatélites na população do Osasco .................................................................

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Figura 30. Número de homozigotos esperado e observado para os cinco loci microssatélites na população de Suzano .................................................................

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Figura 31. Fenograma de distância genética ..........................................................

73

Figura 32. Fenograma de distância geográfica .......................................................

73

Figura 33. Correlação entre distância geográfica e distância genética para as quatro populações de Ae. aegypti.............................................................................

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Dados de coleta das amostras populacionais de Aedes aegypti ............

31

Tabela 2 - Marcadores microssatélites utilizados para caracterizar população de Ae. aegypti.................................................................................................................

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Tabela 3 - Resultados da aplicação do teste T estatístico: assimetria bilateral de tamanho alar de fêmeas ...........................................................................................

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Tabela 4 - Resultados da aplicação do teste T estatístico: assimetria bilateral de tamanho alar de machos ..........................................................................................

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Tabela 5 - Estatística descritiva com valores de média, mínimo, máximo e desvio padrão para tamanhos de centróide .........................................................................

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Tabela 6 - Teste de reclassificação para as análises de dimorfismo sexual alar ....

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Tabela 7 - Resultados da aplicação do teste T estatístico: dimorfismo sexual de tamanho alar .............................................................................................................

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Tabela 8 - Teste de reclassificação para as análises de variação geográfica .........

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Tabela 9 - Resultados da aplicação do teste T estatístico: Variação geográfica de tamanho alar .............................................................................................................

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Tabela 10 - Tamanho dos fragmentos amplificados de microssatélites nas populações de Aedes aegypti ..................................................................................

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Tabela 11 - Número de alelos encontrado em cada locus .......................................

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Tabela 12 - Genótipos encontrados no locus AED19 .............................................. Tabela 13 - Genótipos encontrados no locus T3A7..................................................

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Tabela 14 - Genótipos encontrados no locus 38/38 ................................................ Tabela 15 - Genótipos encontrados no locus 34/72 ................................................ Tabela 16 - Genótipos encontrados no locus C2A8 ................................................ Tabela 17 - Fis e desvios de Hardy – Weinberg observado em cinco locus microssatélites de Ae. aegypti .................................................................................. Tabela 18 - Estimativa de valores de freqüência de alelos nulos ............................ Tabela 19 - Estimativas de valores F-estatístico de Wright .....................................

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................1.1 A espécie Aedes aegypti ...............................................................................1.2 O vetor Aedes aegypti ...................................................................................

1.3 Controle populacional versus microevolução ............................................1.4 Detectando variações populacionais com múltiplas abordagens ............

1.5 Morfometria geométrica alar .........................................................................1.6 DNA nuclear – Microssatélites ..................................................................... 1.7 Estudos de diferenciação populacional de Aedes aegypti no Brasil .......1.8 Aedes aegypti no estado de São Paulo .......................................................2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 2.1 Objetivo geral .................................................................................................2.2 Objetivos específicos ....................................................................................3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................3.1 Coleta e armazenamento dos exemplares .................................................. 3.2 Análise morfométrica alar .............................................................................3.2.1 Componentes principais ...............................................................................

3.2.2 Análises discriminantes ................................................................................

3.2.3 Distância de Mahalanobis .............................................................................

3.2.4 Tamanho de centróide ..................................................................................

3.3 Análises genéticas – Microssatélites ...........................................................3.3.1 Extração do DNA genômico ..........................................................................

3.3.2 Reação em cadeia da polimerase ................................................................

3.3.3 Análises microssatélites ................................................................................

3.4 Análises de correlação ..................................................................................

4 RESULTADOS ...................................................................................................4.1 Morfometria geométrica alar .........................................................................4.1.1 Assimetria bilateral ........................................................................................

4.1.1.1 Análise de forma ........................................................................................

4.1.1.2 Análise de tamanho....................................................................................

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4.1.2 Dimorfismo sexual ........................................................................................

4.1.2.1 Análise de forma ........................................................................................

4.1.2.2 Análise de tamanho ...................................................................................

4.1.3 Variação geográfica ......................................................................................

4.1.3.1 Análise da variação interpopulacional de forma ........................................

4.1.3.1 Análise da variação interpopulacional de tamanho ...................................

4.1.4 Teste de repetibilidade ..................................................................................

4.2 Microssatélites ...............................................................................................4.2.1 Freqüências alélicas e genotípicas ...............................................................

4.2.2 Testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg ......................................................

4.2.3 Desequilíbrio de ligação ................................................................................

4.2.4 Diferenciação populacional ..........................................................................

4.2.5 Distância genética versus distância geográfica ...........................................

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................5.1 Morfometria geométrica alar .........................................................................5.2 Microssatélites ...............................................................................................6 CONCLUSÕES ...................................................................................................REFERÊNCIAS .....................................................................................................

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1 INTRODUÇÃO 1.1 A espécie Aedes aegypti

A família Culicidae é representada por aproximadamente 3.500 espécies de

insetos. A grande importância dessa família é devida ao fato de seus representantes

estarem envolvidos na transmissão de patógenos ao homem. O Aedes (Stegomyia)

aegypti Linnaeus 1762 é natural da região afrotropical onde são encontrados os outros

membros do grupo (Belkin, 1962). Trata-se de uma espécie classicamente tida como

tropical e subtropical com sua distribuição que, beirando o cosmopolitismo, é em parte

resultante das atividades humanas. Originalmente descrito no Egito, o que lhe conferiu

seu epíteto específico (aegypti), a espécie tem acompanhado o homem em sua

permanente migração (Nelson, 1986; Christophers, 1960).

São insetos holometábolos, apresentando metamorfose completa durante o seu

desenvolvimento. Assim, como qualquer culicídeo, apresenta duas fases no seu ciclo

de vida, uma aquática (larva e pupa) e uma terrestre (ovo e o indivíduo adulto), como

ilustrado na Figura 1. As larvas se alimentam de partículas em suspensão na água e

tem duração de 4 a 8 dias, no estágio de pupa não ocorre alimentação, e tem duração

de 2 dias, o período que ocorre cada estágio depende principalmente da temperatura e

disponibilidade de alimento (Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1994; Forattini, 2002). Está

entre as espécies de mosquito que passa mais rapidamente pela fase imatura, já que

as fêmeas normalmente depositam os ovos em recipientes pequenos.

Machos e fêmeas adultas se alimentam de néctar de fluidos açucarados, mas

somente as fêmeas são hematófagas, picando durante todo o dia, apresentando hábito

diurno. O sangue é a fonte de proteínas que se fazem necessárias em sua alimentação

para a maturação dos ovos. Em geral a fêmea faz uma postura após cada repasto

sanguíneo.

Quanto à sua capacidade de dispersão, na sua forma ativa, apresenta-se

reduzida. Machos raramente atingem mais que 100 metros além do lugar de onde se

originou por isso a sua presença é um indicador seguro de criadouros próximos.

Havendo aglomeração humana e muitos criadouros disponíveis as fêmeas não

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parecem necessitar de grandes deslocamentos, cerca de 100 a 500 metros, por outro

lado na falta desses recursos elas tendem a se deslocar por distâncias maiores (Maciel-

de-Freitas e Lourenço-de-Oliveira, 2006).

Figura 1. Ciclo de vida do Ae. aegypti. Fonte: Instituto Oswaldo Cruz (2010).

Em 2003, Braks et al. demonstraram que no Rio de Janeiro a distribuição,

densidade e freqüência de Ae. aegypti estavam associadas a presença humana, sendo

este um mosquito mais abundante no domicílio e peridomicilio. Esta espécie apresenta

hábitos sinantrópicos e antropofílicos, sendo considerado o culicídeo que tem maior

interação com os seres humanos.

1.2 O vetor Aedes aegypti

O Ae. aegypti foi reconhecido como transmissor da febre amarela em 1881

(Rodriguez e Finlay, 1971). Em 1906, Brancroft publicou as primeiras evidências de que

o mosquito também era o vetor de dengue, fato posteriormente confirmado por

Agramonte, em 1906, e por Simmons, em 1931 (Centers for Disease Control, 1979). O

Ae. aegypti é um eficiente vetor do vírus dengue especialmente devido ao

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comportamento hematófago intermitente, podendo assim se alimentar em mais de um

hospedeiro durante um único ciclo gonotrófico, período que representa o tempo que

ocorre a ingestão de sangue até a postura dos ovos (Mackenzie et al., 2004). Estudo

mostrou que as fêmeas de Ae. aegypti tem preferência e freqüentemente se alimentam

de sangue humano devido à baixa concentração do aminoácido isoleucina (Harrington

et al., 2001)

Provavelmente esse vetor teve a introdução nas Américas através de barcos

vindos da Europa, que cruzavam o Atlântico durante as primeiras explorações e

colonizações européias ao Novo Mundo no século XV (Bisset, 2002). Os primeiros

registros de sua identificação em terras brasileiras foram em 1898, por Lutz, e em 1899,

por Ribas apud Franco, 1969.

A ocorrência de epidemias da febre amarela levou ao combate do vetor a partir

da década de 1940. A espécie foi erradicada em 1955, sendo encontrada mais tarde

em 1967 no estado do Pará. A segunda erradicação ocorreu em 1973. Em 1976 foi

detectado na cidade de Salvador, na Bahia e a partir dessa data nunca mais foi

eliminada totalmente do país (Tauil, 2002).

Atualmente, o Ae. aegypti é o principal vetor do vírus da dengue no Brasil,

presente nos 26 estados e no Distrito Federal (Secretaria de Vigilância em Saúde,

2010). Encontra-se em alta densidade próxima a áreas densamente povoadas por

humanos (Lourenço-de-Oliveira et al., 2004). A espécie exibe casos de resistência a

inseticidas (Luz et al., 2003; Braga et al., 2004; Da-Cunha et al., 2005; Macoris et al.,

2003) e apresenta uma alta capacidade vetorial para o vírus da dengue. Além disso, a

urbanização descontrolada e as migrações são fatores adicionais que favorecem tanto

o vetor quanto à disseminação do vírus (Gubler, 1998; Herrera et al., 2006). Esse fato

associado a péssimas condições de saneamento básico, moradia inadequada e a

fatores culturais/educacionais favorecem condições ecológicas à transmissão dos vírus

da dengue (Lines et al., 1994) pelo mosquito Ae. aegypti, seu principal vetor.

O vírus dengue e da febre amarela pertencem ao gênero Flavivirus da família

Flaviviridae, ambos transmitidos, em ciclos urbanos, pelo Ae. aegypti. O vírus da

dengue apresenta quatro sorotipos (DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4) e é o único dentro da

família Flaviviridae, gênero Flavivirus, que não necessita manutenção de ciclos em

21

ambientes silvestres. Os sorotipos são antigenicamente diferentes, porém apresentam a

mesma epidemiologia (Gubler, 2002).

A dengue é uma arbovirose que se tornou um grave problema de saúde pública

no Brasil, assim como em outras regiões tropicais do mundo (World Health

Organization, 2010). Cerca de 100 milhões de casos ocorrem em cada ano no mundo

(Monath, 1994). Segundo Braga e Valle (2007) a doença tem se destacado entre as

enfermidades reemergentes e é considerada a mais importante das doenças virais

transmitidas por artrópodes.

1.3 Controle populacional versus microevolução

Tentativas de redução populacional de Ae. aegypti constituem a principal forma

de combate à dengue, já que as vacinas ainda estão em desenvolvimento. Os

mosquitos de modo geral, apresentam grande capacidade adaptativa, evidenciada pela

existência de mutantes resistentes a diversas condições ambientais e de complexos de

espécies filogeneticamente relacionadas ou crípticas. Estratégias para o controle desse

culicídeo têm sido desenvolvidas há décadas, entre elas, aplicação de inseticidas,

controle biológico e os recentes métodos alternativos de construção de mosquitos

transgênicos (Speranca e Capurro, 2007; Yakob et al., 2008) também utilizado para

outros mosquitos (Marrelli et al., 2007; Wilke et al., 2009). Os métodos utilizados até

hoje apresentaram eficácias diversas dependendo da situação em que são

empregados, e freqüentemente enfrentam como fator limitante a microevolução dos

mosquitos.

A “microevolução” é explicada como o conjunto de alterações evolutivas

ocorridas em níveis taxonômicos infra-específicos, como por exemplo, em populações

(Futuyma, 1997; Ridley, 2003). Devido à conjunção de fatores bióticos e abióticos que

ocorrem dinamicamente em populações, os processos microevolutivos surgem como

variações alélicas quantitativas ou qualitativas e mais raramente como amplificações

gênicas ou rearranjos cromossômicos. Com o tempo, e com a influência do fluxo

gênico, esses processos podem culminar em diferenciação ou convergência desses

padrões nas entidades biológicas envolvidas (Futuyma, 1997; Ridley, 2003).

22

Os Culicídeos em geral apresentam flutuações populacionais amplas e

freqüentes, e seu ciclo de vida é influenciado por condições ambientais instáveis como

temperatura, regime pluviométrico, disponibilidade de coleções hídricas e pela presença

humana (Hayes, 1975; Mouchet e Carnevale, 1997; Kovats, 2000; Forattini, 2002;

Ahumada et al., 2004). Devido ao conjunto desses fatos eles apresentam reprodução

rápida, podendo completar um ciclo de vida em poucos dias. Essas propriedades em

conjunto resultam freqüentemente em rápida evolução de suas populações. Um

exemplo é o culicídeo Culex quinquefasciatus e a evolução de sua resistência a

inseticida ao longo de poucos anos (Yebakima et al., 2004).

Outra questão importante na evolução de populações de mosquitos é a

diferenciação de populações geograficamente isoladas. É comum encontrar variações

geográficas entre populações de culicídeos cuja distribuição geográfica é ampla e

descontínua a ponto de constituir barreiras ao intenso fluxo gênico. Um exemplo de tal

situação é a variabilidade genética encontrada nas diversas populações de Ae. aegypti

ao redor do mundo (Powell et al., 1980).

Para estudo da microevolução, em geral, adota-se como passo inicial à

caracterização de populações, as quais são descritas quanto a padrões genéticos,

morfológicos, comportamentais e comparadas ao longo de transectos geográficos ou

temporais. Em um primeiro momento, o conjunto de dados permite o reconhecimento

de padrões microevolutivos, enquanto que com o acúmulo de informações ao longo dos

anos, existe a possibilidade de observar processos microevolutivos.

1.4 Detectando variação populacional com múltiplas abordagens

A utilização de múltiplos parâmetros comparativos pode fornecer maior robustez

aos testes de hipóteses em caracterização populacional que vise descrever padrões e

processos microevolutivos. Uma vez que os caracteres em uma espécie evoluem em

taxas e velocidades diversas, a utilização de múltiplos parâmetros permite encontrar o

marcador cujo nível de resolução é próximo do desejado, aumentando as chances de

serem detectadas variações fenotípicas e genotípicas (Sene et al., 1988; Reinert et al.,

1997; Rocha, 2005; Savard et al., 2006).

23

Um estilo de estudo populacional multiparamétrico que tem sido recentemente

valorizado e encorajado na entomologia médica é a combinação de genética

populacional e morfometria corporal (revisão em Dujardin, 2008). Tanto a morfometria

tradicional como a geométrica tem capacidade de detectar variação populacional

(Falconer, 1981; Dujardin e Slice et al., 2007). Com isso, informações necessárias

podem ser fornecidas para criar-se um mapa preliminar, apontando áreas em que se

devem aprofundar os estudos e investir na utilização de métodos moleculares. Além

disso, podem ser obtidas informações importantes para a entomologia médica.

Na Província de Barinas (Venezuela), a geometria alar de Rhodnius prolixus foi

utilizada recentemente para compreender a reinfestação das casas e do peridomicílio

após aplicação de inseticidas (Feliciangeli et al., 2007). As conclusões deste estudo

foram plenamente apoiadas por um posterior estudo genético (Fitzpatrick et al., 2008).

Estudo realizado em Niakhar, Senegal por Paupy et al. (2010) utilizou

marcadores microssatélites e análise do padrão abdominal para avaliar a variabilidade

genética e morfológica de populações de Ae. aegypti. Temu e Yan (2005) estudaram a

diferenciação de populações de Anopheles arabiensis, importante vetor da malária que

coexiste com outros vetores da malária em toda África, ao longo da costa do Kênia

através de marcadores microssatélites e da seqüência do gene mitocondrial ND5. Para

testar a variabilidade genética de populações de Anopheles darlingi em uma escala

microgeográfica (cerca de 100 km) no oeste da Colômbia, Gutiérrez et al. (2010)

utilizaram o gene mitocondrial COI e marcadores microssatélites para entender melhor

a contribuição genética potencial das populações locais aos programas de controle da

malária. A seguir serão descritos os marcadores utilizados no desenvolvimento do

presente trabalho.

1.5 Morfometria geométrica das asas

Espécies e populações podem eventualmente apresentar variações morfológicas

não notáveis à observação direta, como variações na razão entre múltiplas dimensões

de uma determinada estrutura corporal. Por isso torna-se necessário recorrer a

abordagens alternativas, como as análises morfométricas. A morfometria é a

24

formalização matemática das dissimilaridades entre formas geométricas de objetos,

uma ferramenta de alto poder de resolução que permite a comparação de padrões

corporais a partir de caracteres multivariados, ou seja, considerando-se

simultaneamente várias características de uma estrutura corporal complexa (Rohlf,

1993; Monteiro e Reis, 1999).

A partir dos dados gerados por morfometria podem-se efetuar estudos

estatísticos da variação morfométrica, comparar a magnitude das variações, entre

outras abordagens (Bookstein, 1997; Rohlf, 1993; Monteiro e Reis, 1999). As principais

propriedades da morfometria geométrica são as possibilidades de análises

multivariadas, com múltiplas variáveis simultaneamente e a possibilidade de recuperar

informações de forma e tamanho independentemente. Conseqüentemente seu poder

de resolução é alto e permite gerar diversos marcadores taxonômicos ou populacionais.

Em insetos, asas são preferenciais por se tratar de uma estrutura bidimensional,

evitando erros de posicionamento e deformação, além disso, as asas apresentam

características potencialmente herdáveis e assim sendo sujeita a evolução. Existem

trabalhos em que a morfometria geométrica demonstrou o caráter herdável e

presumivelmente poligênico do formato alar em Ae. aegypti mantidos em cativeiro

(Jirakanjanakit, 2008; Dujardin, 2008).

Estudo realizado por Morais et al. (2010) com populações de Culex

quinquefasciatus do Brasil e de La Plata, Argentina, utilizando morfometria geométrica,

observaram que as amostras brasileiras são morfologicamente diferentes da amostra

da Argentina quanto ao formato alar. Foi observada diferença em relação às

populações do Norte e do Sul do Brasil, sugerindo que a morfologia das asas pode ser

utilizada para uma avaliação preliminar da estrutura populacional de Cx.

quinquefasciatus no Brasil.

A forma da asa tem sido cada vez mais utilizada na identificação e

caracterização de espécies. Estudo realizado com vetores da dengue, Ae. aegypti e Ae.

albopictus coletados em várias parte do mundo, mostrou que a microevolução da forma

alar não produz sobreposição interespecífica significativa, independentemente da

origem geográfica da espécie (Henry et al., 2010). Naquele estudo, tanto a forma como

o tamanho das asas exibiram-se espécie-específicos. Exemplos como esse mostram a

25

utilidade da MG como complemento para diagnosticar exemplares desses mosquitos

quando não estão bem preservados.

1.6 DNA nuclear - Microssatélites

Os marcadores microssatélites também conhecidos como SSRs (sequências

simples repetidas) estão entre os marcadores mais polimórficos encontrados hoje nos

genomas de animais e plantas. São caracterizados por uma sequência de 1-6

nucleotídeos repetidos em tandem espalhados em todo o genoma (Weber e May, 1989;

Schlötterer, 2000). Por serem freqüentes, os loci microssatélites podem estar

intimamente associados a loci conservados que contêm regiões codificadoras. O

polimorfismo alélico ocorre em um locus SSR devido a mudanças no número de

repetições, que pode ser devido a mutações, permutação desigual e erros da

polimerase.

Os SSRs apresentam numerosas vantagens quando comparados com outros

marcadores moleculares, pois são altamente polimórficos e informativos, a herança é

codominante permitindo a discriminação entre homozigotos e heterozigotos. Além

disso, são multialélicos e possuem alta reprodutibilidade, características importantes

para análise baseada em marcadores moleculares. Esses marcadores são baseados

em PCR (amplificação pela reação da polimerase em cadeia) e, portanto, necessitam

de pequena quantidade de DNA, são abundantes e neutros.

Marcadores SSRs têm sido usados com sucesso para estudos genéticos

populacionais de insetos vetores de importância médica como Anopheles (Muturi et al.,

2010; Scarpassa e Conn, 2007), Glossina (Bouyer et al., 2007; Solano et al., 2000),

Culex (Venkatesan e Rasgon, 2010; Huang et al., 2009) e Ae. aegypti (Hlaing et al.,

2010; Paupy et al., 2008; Slotman et al., 2007; da Costa-Ribeiro et al., 2006; Herrera et

al., 2002; Ravel et al., 2001). A utilização desses marcadores em estudos genéticos

populacionais ajuda a investigar a base genética do vetor avaliando a variação

populacional e com isso desenvolver estratégias de controle genético.

Variações baseadas em análises SSRs têm fornecido evidências de que o

armazenamento de água e os hábitos humanos podem afetar na diferenciação genética

26

do Ae. aegypti (Huber et al., 2002). Além disso, marcadores SSRs fornecem uma

medida de divergência sensível e, portanto, podem distinguir populações que tenham

divergido recentemente (Lanzaro et al., 1995), já que essas regiões de microssatélites

evoluem rapidamente.

1.7 Estudos de diferenciação populacional de Aedes aegypti no Brasil

Devido ao fato de o Ae. aegypti ser vetor de doenças graves como a dengue e a

febre amarela vários estudos relacionados a genética populacional tem sido

desenvolvido no Brasil. Mais de 300 trabalhos já foram publicados endereçados ao

estudo populacional de Ae. aegypti (base de dados ISI Web of Science, 2010).

Citaremos alguns deles: Da Costa-Ribeiro et al. (2007) através de marcadores

isoenzimáticos observaram baixo fluxo gênico entre populações localizadas na região

sudeste e região sul não havendo evidência de dispersão passiva de Ae. aegypti por

veículos entre as diferentes rotas ligando as áreas metropolitanas analisadas. O

trabalho de Ayres et al. (2004) também utilizando isoenzimas, analisaram a estrutura

genética de populações naturais de Ae. aegypti em níveis micro e macrogeográfico no

Brasil, observando grande diferenciação genética populacional. No ano anterior, Ayres

et al. (2003) mostraram diferenciação genética micro e macrogeográfica no Brasil

utilizando marcadores RAPD (Random amplified polymorphic DNA).

Sousa-Polezzi e Bicudo (2005) analisaram a variação genética de duas

populações de Ae. aegypti em duas cidades brasileiras São José do Rio Preto (SP) e

Goiânia (GO) detectados através de alterações nos padrões de esterase ao longo do

tempo. Esses autores presumiram que, alterações nos padrões de esterase fossem

resultado de fatores como a seleção por condições ambientais e deriva genética. O

elevado uso de inseticidas causa alterações no padrão de esterase. Dados obtidos no

mesmo período pelas autoridades responsáveis para controlar o mosquito revelaram

uma crescente resistência dos mosquitos em São José do Rio Preto.

No Rio de Janeiro, Da Costa-Ribeiro et al. (2006), realizaram um trabalho

populacional comparando a variabilidade genética de populações separadas por uma

distância linear mínima de 8,2 km e máxima de 32,4 km utilizando marcadores

27

microssatélites e comparando com marcadores isoenzimáticos. Quando comparado

com polimorfismo, os microssatélites se mostraram mais eficientes que as isoenzimas,

mostrando uma grande variação genética.

1.8 Aedes aegypti no Estado de São Paulo

Considerado erradicado do Brasil em 1955, o Ae. aegypti foi reintroduzido

posteriormente. A reinfestação no estado de São Paulo foi identificada no período de

1980 e 1981, sendo os focos eliminados. Em 1985 através de um levantamento feito

em pontos estratégicos para instalação e desenvolvimento deste vetor (borracharias,

depósitos de pneus, ferros-velhos, etc.) foi detectada a presença do mosquito em 12

municípios do Estado. No final de 1985 já existiam 09 municípios com infestação

domiciliar pelo Ae. aegypti.

Entre 1986 e 1996, verificou-se contínua, rápida e ampla dispersão de Ae.

aegypti, ocupando principalmente as regiões Oeste, Norte e Central do Estado. Em

1995, o número de municípios que apresentavam infestação pela espécie era de 416,

distribuídos em áreas nas quais residiam aproximadamente 8 milhões de pessoas.

Desde então, a expansão geográfica desse vetor continua ocorrendo (Superintendência

do Controle de Endemias, 2009).

Nos últimos anos o Estado de São Paulo tem revelado grandes ocorrências de

dengue, só no primeiro semestre de 2010 ocorreram mais de 150.000 casos de dengue

autóctone (Centro de Vigilância Epidemiológica, 2010). Devido à falta de uma vacina

para combater a doença, o que precisa ser feito atualmente é controlar o vetor. Para

isso trabalhos referentes ao estudo populacional do Ae. aegypti são de grande

importância para entender o processo de evolução e dispersão desses mosquitos.

Apesar disso, as populações de Ae. aegypti no Estado de São Paulo ainda são pouco

estudadas.

Tendo em vista a questão do Ae. aegypti no Estado de São Paulo e as

problemáticas populacionais, propomos um estudo de caracterização populacional de

Ae. aegypti combinando marcadores moleculares do tipo microssatélites com

morfometria geométrica alar. A exemplo dos trabalhos já citados acreditamos que esses

28

métodos poderão ser úteis também aqui no estado de SP. Além disso, a correlação da

genética populacional com morfometria alar poderá trazer mais informações para os

métodos estimativos de estrutura populacional de Ae. aegypti.

29

2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Avaliar a estruturação populacional de Aedes aegypti na “Grande São Paulo”

amostrando-se quatro localidades: Bairro do Butantã (município de São Paulo) e

municípios vizinhos Guarulhos, Osasco e Suzano, mediante utilização de marcadores

genéticos e morfológicos reconhecidamente informativos do ponto de vista

microevolutivo.

2.2 Objetivos específicos

- Investigar o grau de polimorfismo dos loci microssatélites 38/38, 34/72, C2A8,

T3A7 e AED19 nas populações de Aedes aegypti;

- Analisar diferenciação morfológica alar entre as populações por meio da

morfometria geométrica;

- Estimar fluxo gênico e outros parâmetros de estrutura populacional,

verificando se há correlação entre os diferentes marcadores.

30

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Coleta e armazenamento dos exemplares

Amostras de Ae. aegypti foram coletadas em quatro locais diferentes no estado

de São Paulo: Butantã (BUT) que é um distrito localizado na Zona Oeste do município

de São Paulo (23º 32’ 52’’ S 46º 38’ 09’’ W) e três municípios localizados na área

metropolitana da capital paulista, Guarulhos (GUA) (23º 27’ 46’’ S 46º 31’ 58’’ W),

Osasco (OSA) ( 23 º 31’ 58’’ S 46º 47’ 31’’ W) e Suzano (SUZ) (23º 32’ 33’’ S 46º 18’

39’’ W) (Figura 1). Os dados das coletas referentes a MG estão listados na Tabela 1.

Para as análises genéticas foram utilizados 30 indivíduos adultos de cada população,

exceto a população de SUZ, que foram analisados somente 26 indivíduos. A menor

distância em linha reta entre as populações analisadas é de 13,5 km entre BUT e OSA

e a maior distância de 50 km entre OSA e SUZ (Figura 2).

Figura 2. Mapa da área metropolitana de São Paulo. Os retângulos em vermelho representam

os locais em que foram feitas as coletas. O bairro do Butantã está assinalado “São Paulo”). Fonte modificada de Google maps (2010).

31

Tabela 1 - Dados relacionados às coletas das populações de Ae. aegypti utilizados nas análises de Morfometria Geométrica.

Procedência Sigla Sexo Nº de Nº de Data da coleta

espécimes asas Butantã BUT F 30 42 Abril/Maio/Junho

M 34 53 2009

Guarulhos GUA F 38 64 Maio M 37 61 2009

Osasco OSA F 25 35 Maio

M 27 40 2009

Suzano SUZ F 10 13 Junho/Julho M 9 13 2009

O esforço da coleta foi realizado por nós mesmos no bairro do Butantã, porém

nas demais localidades deveram-se à ajuda dos Centros de Controle de Zoonoses de

cada município. Naqueles municípios, as coletas de larvas e pupas (Figura 3) foram

realizadas em pontos estratégicos designados por cada CCZ (borracharias, ferros-

velhos, entre outros). Essas larvas foram transportadas vivas em recipiente com água

para o laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan e mantidas a 20 ºC com

fotoperíodo natural até a forma adulta (Figura 4).

Figura 3. Larvas e pupas do mosquito Ae. aegypti. Fonte: Instituto Oswaldo Cruz (2010).

32

Figura 4. Fêmeas de Ae. aegypti realizando o repasto sanguíneo. Fonte: Encyclopedia Britannica Online ([2010]).

Assim que os adultos emergiam, eles eram colocados em tubos eppendorf e

armazenados em nitrogênio líquido a -196 ºC para preservação do material genético.

Antes do processo de extração do DNA de cada mosquito as asas eram retiradas para

as análises da morfometria alar.

3.2 Análise morfométrica alar Os métodos de MG seguiram em linhas gerais os empregados por Morais et al.

2010. As asas direitas e esquerdas de machos e fêmeas foram montadas com resina

sintética Entellan entre lâmina-lamínula. Imagens dessas asas foram capturadas

através de câmera fotográfica digital Leica 320 acoplada a um microscópio

estereoscópico Leica S6. Mais de 50 indivíduos de cada localidade foram utilizados

para as análises morfométricas, com exceção de SUZ que só foram utilizados 19

exemplares (Tabela 1). A população de SUZ só foi utilizada na análise de dimorfismo

sexual devido ao pequeno número amostral. Isso aconteceu porque alguns indivíduos

foram tentativamente acondicionados em nitrogênio líquido antes da remoção das asas.

Durante a manipulação dos mosquitos congelados, muitas asas dessa população

ficaram deformadas, impossibilitando de realizar as análises morfométricas.

33

Sobre as imagens das asas, com o auxílio do “software” TpsDig V.1.40 (QSC –

James Rohlf), foram tomadas as coordenadas posicionais de cada um dos 18 pontos

anatômicos sobre um plano cartesiano (Figura 5). Sobre esse dados foram analisados o

tamanho alar através do tamanho de centróide (TC) e o formato alar através das

variáveis canônicas (VC), com o auxílio dos programas de computador TpsUtil 1.26,

TpsRelw 1.36 (QSC - James Rohlf) e Statistica 7.0 (StatSoft) e componentes principais

(CP), com o auxílio dos programas BAC e PAD (JP Dujardin -

http://www.mpl.ird.fr/morphometrics/).

Figura 5. Asa de uma fêmea de Ae. aegypti. Acima, asa digitalizada com 18 pontos de encontro

das nervuras marcados em vermelho e numerada. Abaixo, conformação alar imaginária obtida com a ligação dos pontos.

3.2.1 Componentes Principais

Os Componentes Principais foram obtidos com os auxílios dos programas

tpsRelw 1.36 e BAC e empregados em comparações intra e interpopulacionais. Os

valores posicionais de cada ponto anatômico foram gerados no programa tps Relw

1.36, e através do programa BAC foram feitas às análises de CP. Dentre os

Componentes Principais gerados em cada comparação, apenas a primeira e a segunda

34

(CP1 e CP2) foram consideradas para interpretação, já que essas são as mais

informativas.

Consenso alar de cada população para ambos os sexos foram feitos através do

programa tps RelW. Agregados a esses consensos, para representar a distribuição dos

indivíduos em função dos CPs foram feitos gráficos de dispersão de pontos. Estes

gráficos ilustram as características biológicas avaliadas: assimetria alar bilateral,

dimorfismo sexual e diferenciação populacional.

3.2.2 Análises discriminantes

Testes de reclassificação foram realizados nas análises de dimorfismo sexual e

na diferenciação populacional, utilizando o programa PAD. O teste de reclassificação é

um teste com validação, pois se trata de um teste cego. Nesse tipo de teste cada

indivíduo é removido da análise, uma nova classificação é realizada com os outros

indivíduos e em seguida o indivíduo é reinserido para verificar em que grupo ele é

classificado. Nesse teste, a acurácia de reclassificação é representada em valor

percentual.

3.2.3 Distância de Mahalanobis

Comparações entre as amostras foram efetuadas mediante o cálculo das

distâncias de Mahalanobis seguindo o método de Ligação Completa, utilizando o

programa Statistica 7.0, conforme empregado por Moratore (2009) e Peruzin (2009). As

distâncias de Mahalanobis geradas entre as amostras populacionais foram organizadas

em tabelas e em seguida convertidas em fenogramas construídos pelo algoritmo de

neighbour-joining com o auxílio do software Phylip. Foi utilizada a distância de

Mahalanobis por ser adequada para comparações multivariadas, pois embora seja uma

distância linear, semelhante à distância Euclideana, é medida entre pontos através de

um espaço multidimensional.

35

3.2.5 Tamanho de Centróide

Os tamanhos de centróide e a construção dos gráficos de caixa (Box Plots)

foram obtidos com o auxílio dos programas de computador TpsRelw 1.36 e Statistica

7.0 e utilizados nas comparações intra e interpopulacionais das amostras. Com o auxílio

do programa de computador Graph Pad InsStat, análises estatísticas bicaudais ao nível

de rejeição 0,05 foram utilizadas nas comparações baseadas nos tamanhos dos

centróides.

Para testar a normalidade das distribuições amostrais, foi verificado se as

amostras analisadas apresentavam distribuição Gaussiana, empregando o teste de

Kolmogorov-Smirnov e, para as amostras de distribuição normal e variâncias não-

homogêneas, utilizou-se o Teste T paramétrico com correção de Welch, que é o

adequado para esse tipo de distribuição.

3.3 Análises genéticas – Microssatélites

3.3.1 Extração do DNA genômico

Trinta indivíduos das populações do BUT, GUA e OSA e vinte seis indivíduos da

população de SUZ foram utilizados para a extração do DNA genômico. A extração foi

feita isoladamente para cada indivíduo, segundo o método de Jowett (1986) com

algumas modificações que serão descritas a seguir.

Os indivíduos foram retirados do nitrogênio líquido e macerados em tubos

eppendorf de 1,5 mL contendo 100 µL de solução de homogeneização (Tris-HCl 10 mM

(pH= 7,5), NaCl 60 mM, EDTA 50 mM). Sobre o homogeneizado foi adicionado 100 µL

de solução de lise (SDS 1,25%, Tris-HCl 0,3 M (pH = 9,0), EDTA 0,1 M, sacarose 5%,

proteinase K a 100 µg/ml). A mistura foi incubada em banho-maria a 65 ºC por 1 hora

para “lise” das células e clivagem das proteínas em peptídeos menores pela proteinase

K.

Em seguida as amostras foram retiradas do banho maria e encubadas a 4 ºC por

45 minutos. Terminando a encubação os tubos foram centrifugados por 10 minutos a

36

12.000g na temperatura de 4 ºC. Após a centrifugação foram formadas duas fases na

mistura. O precipitado, que contém peptídeos, foi descartado e o sobrenadante

contendo ácidos nucléicos e sais foram transferidos para outro microtubo de 1,5 mL e

misturado com o dobro de seu volume de etanol 100% para a precipitação do DNA.

Após cinco minutos de incubação à temperatura ambiente, as amostras foram

novamente centrifugadas a 12.000 g à temperatura ambiente, por 5 minutos. O

sobrenadante foi descartado e ao precipitado foi adicionado 1 mL de etanol 70%, e

assim as amostras foram submetidas a uma última centrifugação à temperatura

ambiente e 12.000 g por 5 minutos.

O precipitado foi seco e cada amostra foi ressuspendida em 20 µL de H2O milli-

Q (Millipore). Para eliminar o RNA, as amostras de DNA recém-extraídas foram tratadas

com RNAse-free (Ribonuclease A, Sigma) a uma concentração final 100 µg/mL por 1

hora a 37 ºC em banho-maria. Em seguida as amostras foram armazenadas em freezer

a -20 ºC.

3.3.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para cada população foram utilizados cinco loci microssatélites (C2A8, 34/72,

T3A7, AED19 e 38/38) os mesmos utilizados em trabalhos anteriores por Costa-Ribeiro

et al. (2006) e Huber et al. (2002) (Tabela 2). As regiões SSRs foram amplificadas por

PCR a partir das amostras de DNA genômico nas seguintes condições: O volume da

reação final foi de 20 µL. Os reagentes foram misturados na forma de coquetel,

separadamente do DNA genômico. Para cada reação foi utilizado 1x buffer (tampão de

reação) (Fermentas); 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM de cada dNTP; 20 pmol de cada primer;

0,25 U/ µL Taq DNA polimerase (Fermentas) e água mili-Q totalizando 18 µL. Em

seguida foi adicionado 2 µL de DNA genômico em cada reação, totalizando 20 µL finais.

As condições para serem utilizadas no termociclador foram as seguintes: O

processo inicia com 5 ciclos consistindo em uma etapa de desnaturação (96 ºC por

2min), uma etapa de anelamento (T.A. por 30s) e uma etapa de extenção (72 ºC por

1min 15s ) em seguida a quantidade aumenta para 25 ciclos, com uma etapa de

desnaturação com o tempo menor (95 ºC por 30s), uma etapa de anelamento (T.A. por

37

30s) e uma etapa de extensão (72 ºC por 1min 15s ) no final foi adicionado uma etapa

de alongamento de 72 ºC por 5 minutos. Um primer de cada locus analisado foi

marcado no sentido 5’ com fluorescência (FAM, HEX ou TAMRA) apropriada para o

seqüenciador ABI 3730.

Após a amplificação, foram realizadas as diluições dos produtos de PCR. Como

eram 5 loci diferentes, uma diluição foi feita adicionando 3 µL de cada um dos produto

de PCR dos primers AED19, T3A7 e 38/38 adicionando 21 µL de água ultrapura para

um volume final de 30 µL. Outra diluição foi feita separadamente adicionando 2 µL dos

produtos de PCR referentes aos primers C2A8 e 34/72 e completando para um volume

final de 20 µL com água ultrapura. Depois de realizado as diluições, 2 µL da PCR

diluída foram ressuspendidas em 7,5 µL de Formamida HI-DI (Applied Biosystems). Em

seguida foi adicionado 0,5 µL do marcador de peso molecular GeneScan 500 ROX

(Applied Biosystems) para um volume final de 10 µL. As amostras eram encaminhadas

em microtubos de 0,2 mL para o Centro de Estudos do Genoma Humano da

Universidade de São Paulo onde era realizada a eletroforese das amostras no

seqüenciador automático ABI 3730.

3.3.3 Análises microssatélites

Para cada uma das quatro populações analisadas de Ae. aegypti foi calculado a

variação genética primeiramente através da proporção de loci polimórficos, número de

alelos por locus e heterozigosidade (Nei, 1973). Diferenças entre os valores estimados

para esses parâmetros foram analisadas estatisticamente pelo teste T de Student. Para

determinar se as populações analisadas estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg foi

feito o teste do Qui-quadrado para verificar se a distribuição das freqüências de

heterozigotos observadas desviava significativamente das freqüências de heterozigotos

esperadas. Para o processamento dessas estatísticas foi utilizado o software

GENEPOP v. 4.0 (Raymond e Rousset, 1995).

Diferenças entre as populações por F-statistics foram computadas de acordo

com Weir e Cockerham (1984). O desequilíbrio genotípico entre loci (comparados aos

pares) foi estimado utilizando um coeficiente de correlação comum (Weir, 1990) e

38

testado utilizando o teste exato de Fisher através de uma tabela de contigência

utilizando o software GENEPOP v. 4.0.

Estimativas de fluxo gênico foram obtidas a partir das estatísticas de Fst, onde

Nm é o número de migrantes por geração, assumindo um modelo de ilha infinita

(Wright, 1965) onde Nm = ((1 / Fst) - 1) / 4.

Isolamento genético por distância geográfica foi testado por estimar correlações

entre FST/ (1-FST) calculadas entre pares de amostras e as distâncias geográficas

logaritmizadas.

3.4 Análises de correlação Foi testada a existência de correlação entre distâncias geográficas e distâncias

fenéticas e entre as distâncias geográficas e distâncias genéticas. Usando-se o

programa Statistica 7.0. foi calculado o coeficiente de correlação de Pearson, o qual é

uma medida do grau de relação linear entre duas variáveis quantitativas. O intervalo de

confiança utilizado foi de 0,90.

39

Tabela 2 - Marcadores microssatélites utilizados para caracterizar população de Ae. aegypti da área metropolitana de São Paulo.

Temperatura de anelamento = Ta (°C).

Locus primer 5’ - 3’ Ta (°C) Tamanho do Acesso produto (pb) GenBank

38/38 CGG.TGG.ACG.AAT.CAT 56 85 AF338655 TAMRA -CGG.TGG.ACG.AAT.CAT

34/72 FAM - CGT.AGT.GAT.TCT.GTG.ATA 50 91 AF338656 TGG.CAT.CAG.ATT.CAG.TAA

C2A8 HEX - GGT.GTG.GAC.AAC.TGG.AGC 58 226 U91682 CGG.AAG.GAA.TCC.ATC.CAA.C

T3A7 GTC.CCG.CTC.CAA.AAA.TGC.CC 64 228 U66869 HEX - CGA.CAG.ATG.GTT.ACG.GAC.GG

AED19 FAM - GTA.TGA.CAA.CTC.TGG.AAT.GG 56 175 U91680 TTA.TGG.AAC.TGG.TAA.GCC.C.AGC

40

4 RESULTADOS 4.1 Morfometria geométrica alar 4.1.1 Assimetria bilateral

4.1.1.1 Análise de forma

As comparações multivariadas de forma entre asas direitas e esquerdas de

machos e fêmeas das populações do BUT, GUA e OSA geraram componentes

principais, os quais estão representados em morfo-espaços (Bond et al., 2003)

ilustrados nas Figuras 6 e 7. A análise de assimetria bilateral alar de machos e fêmeas

em todas as populações analisadas mostrou uma elevada similaridade entre asas

esquerdas e direitas, não sendo possível diferenciá-las.

4.1.1.2 Análise de tamanho

Os estudos de assimetria bilateral de tamanho isométrico alar mostraram não

haver diferença significativa entre asas direitas e esquerdas de machos e fêmeas das

três populações amostradas (Tabelas 3 e 4). Os tamanhos de centróide das populações

do BUT, GUA e OSA encontram-se estatisticamente descritos nas Figuras 8 e 9 e

Tabela 5.

41

A- Butantã

B- Guarulhos

C- Osasco

Figura 6. Assimetria bilateral alar nas fêmeas da população de Ae. aegypti do BUT, GUA e

OSA, comparações entre asas esquerdas e direitas. Os diagramas acima são referentes às análises de componentes principais. Eixo X: Componente principal 1. Eixo Y: Componente principal 2. FD: fêmea asa direita, FE: fêmea asa esquerda. Valores entre parênteses representam a contribuição percentual de cada componente principal na variação global.

42

A- Butantã

B- Guarulhos

C- Osasco

Figura 7. Assimetria bilateral alar nos machos da população de Ae. aegypti do BUT, GUA e

OSA, comparações entre asas esquerdas e direitas. Os diagramas acima são referentes às análises de componentes principais. Eixo X: Componente principal 1. Eixo Y: Componente principal 2. FD: fêmea asa direita, FE: fêmea asa esquerda. Valores entre parênteses representam a contribuição percentual de cada componente principal na variação global.

43

BU

T FD

BU

T FE

GU

A F

D

GU

A F

E

OSA

FD

OSA

FE1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

Tam

anho

( m

m )

Média Média ± Erro Padrão Média ± Desvio Padrão

Figura 8. Assimetria bilateral de tamanho alar de fêmeas das populações de Ae. aegypti do

BUT, GUA e OSA. FD= fêmeas asas direitas, FE= fêmeas asas esquerdas. Não houve discrepâncias significativas (ver Tabela 3).

Tabela 3 - Assimetria bilateral de tamanho alar. Resultados da aplicação do teste T estatístico

com correção de Welch. Comparação entre asas direitas e esquerdas de fêmeas de Ae. aegypti.

Comparações de Valor de p tamanho alar

BUT FD X BUT FE 0,054

GUA FD X GUA FE 0,152

OSA FD X OSA FE 0,418

44

BU

T M

D

BU

T M

E

GU

A M

D

GU

A M

E

OSA

MD

OSA

ME1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

Tam

anho

( m

m)

Média Média ± Erro Padrão Média ± Desvio Padrão

Figura 9. Assimetria bilateral de tamanho alar de machos das populações de Ae. aegypti do

BUT, GUA e OSA. MD= machos asas direitas, ME= machos asas esquerdas. Não houve discrepâncias significativas (ver Tabela 4).

Tabela 4 - Assimetria bilateral de tamanho alar. Resultados da aplicação do teste T estatístico

com correção de Welch. Comparação entre asas direitas e esquerdas de machos de Ae. aegypti.

Comparações de Valor de p

tamanho alar

BUT MD X BUT ME 0,057

GUA MD X GUA ME 0,278

OSA MD X OSA ME 0,281

45

Tabela 5 - Estatística descritiva com valores de média, mínimo, máximo e desvio padrão para tamanhos de centróide de cada conjunto amostral indicado. Valores em milímetros.

Amostra N Média Mínimo Máximo Desvio Padrão

BUT FD 19 2,54 1,97 3,02 0,37 BUT FE 22 2,51 1,67 3,08 0,47 BUT MD 25 1,82 1,35 2,15 0,23 BUT ME 26 1,74 1,28 2,17 0,24 GUA FD 31 2,42 1,51 2,91 0,32 GUA FE 31 2,48 1,91 2,91 0,29 GUA MD 32 1,78 1,23 2,10 0,23 GUA ME 29 1,84 1,25 2,12 0,22 OSA FD 18 2,40 1,56 2,89 0,34 OSA FE 17 2,19 1,54 2,87 0,41 OSA MD 22 1,93 1,57 2,23 0,15 OSA ME 16 1,92 1,81 2,04 0,07

4.1.2 Dimorfismo sexual

4.1.2.1 Análise de forma

Os gráficos de morfo-espaço gerados por CP mostram que as populações de

GUA e SUZ não apresentaram nenhuma intersecção entre os agrupamentos de

machos e fêmeas, havendo, entretanto uma pequena intersecção entre os sexos nas

populações do BUT e OSA.

A sobreposição dos consensos alares de machos e fêmeas evidenciou os

marcos anatômicos cujo posicionamento é sexualmente dimórfico (Figuras 10-13).

Análise discriminante dos componentes de forma alar resultou em valores de

reclassificação altos, conforme listados na Tabela 6.

46

Butantã

A

B

Figura 10. Dimorfismo sexual alar na população do BUT: machos (M) e fêmeas (F). A: Morfo-

espaço dos componentes principais 1 e 2. Valores entre parênteses representam a contribuição percentual de cada componente principal na variação global. B: Sobreposição dos consensos alares de machos e fêmeas.

47

Guarulhos

A

B

Figura 11. Dimorfismo sexual alar na população do GUA: machos (M) e fêmeas (F). A: Morfo-


48

Osasco

A

B

Figura 12. Dimorfismo sexual alar na população de OSA: machos (M) e fêmeas (F). A: Morfo-


49

Suzano

A

B

Figura 13. Dimorfismo sexual alar na população de SUZ: machos (M) e fêmeas (F). A: Morfo-


50

Tabela 6 - Teste de reclassificação para as análises de dimorfismo sexual alar referente às populações do BUT, GUA e OSA. Não foi possível fazer o teste de reclassificação para a população de SUZ devido ao reduzido número amostral (n=13).

Reclassificação

Local Fêmeas Machos

Butantã 97% 94%

Guarulhos 100% 100%

Osasco 90% 100% 4.1.2.2 Análise de tamanho

Existe dimorfismo sexual significativo de tamanho isométrico alar. Foram

utilizadas asas direitas e esquerdas. Todos os valores apresentaram distribuição

normal. As asas de fêmeas são maiores que as asas de machos nas quatro populações

e essa diferença de tamanho é significativa (Figura 14 e Tabela 7). O valor médio do

tamanho de centróide para machos variou de 1,74 mm em BUT a 1,96 mm em SUZ.

Para fêmeas a média variou de 2,19 mm em OSA a 2,63 mm em SUZ. A população de

SUZ apresentou uma média de tamanho de centróide maior do que as outras

populações analisadas, para machos e fêmeas.

Tabela 7 - Dimorfismo sexual de tamanho alar. Resultados da aplicação do teste T estatístico

com correção de Welch. Comparação entre machos e fêmeas das populações do BUT, GUA, OSA e SUZ.


tamanho alar

BUT F X BUT M < 0,0001

GUA F X GUA M < 0,0001

OSA F X OSA M < 0,0001

SUZ F X SUZ M < 0,0001

51

But Gua Osas Suz But Gua Osas SuzFêmeas Machos

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

3,2Ta

man

ho (m

m)

Média Erro padrão Desvio padrão

Figura 14. Dimorfismo sexual alar em relação ao tamanho do centróide das populações do BUT, GUA, OSA e SUZ. Teste T: p < 0,0001 diferença significativa para os pares de comparações (ver Tabela 7).

4.1.3 Variação geográfica

4.1.3.1 Análise da variação interpopulacional de forma

A comparação entre as amostras do BUT, GUA e OSA reveladas em morfo-

espaço bidimensional dos componentes principais e realizadas separadamente para

machos e fêmeas, mostra baixa dissimilaridade de formato alar entre essas populações

(Figuras 15 e 16). Os resultados dos testes de reclassificação gerados por análise

discriminante confirmam a baixa dissimilaridade interpopulacional e estão listados na

Tabela 8.

Fenogramas das distâncias de Mahalanobis revelaram que a população do BUT

é mais próxima morfologicamente da de GUA do que da população de OSA, para

52

fêmeas e para machos (Figuras 17 e 18). Para enriquecer essas análises de distância

fenética foi adicionado um grupo externo, uma população de Aedes albopictus que foi

coletada em março de 2009 no bairro do Butantã. No fenograma de distância

geográfica a população do BUT é mais próxima da população de OSA do que da

população de GUA (Figura 19). Teste de correlação entre distância geográfica e

distância fenética foram realizados e apresentaram um coeficiente de correlação de

Pearson de r = 0,3363 para fêmeas e r = - 0,0313, para machos, ambos sem

significância estatística (p>0,1) (Figura 20).

Fêmeas

Figura 15. Variação geográfica através da geometria alar das populações de fêmeas do BUT,

GUA e OSA. O morfo-espaço é referente às análises de componentes principais. Eixo X: Componente principal 1. Eixo Y: Componente principal 2.

53

Machos

Figura 16. Variação geográfica através da morfometria geométrica alar das populações de

machos do BUT, GUA e OSA. O morfo-espaço é referente às análises de componentes principais. Eixo X: Componente principal 1. Eixo Y: Componente principal 2.

Tabela 8 - Teste de reclassificação para as análises de variação geográfica referente às

populações do BUT, OSA e OSA.

Reclassificação

Local Fêmeas Machos

Butantã 38% 49%

Guarulhos 58% 51%

Osasco 66% 65%

54

Figura 17. Fenograma proveniente da matriz de dissimilaridade com valores de distância de

Mahalanobis entre fêmeas das populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e da população de Ae. albopictus do BUT.

Figura 18. Fenograma proveniente da matriz de dissimilaridade com valores de distância de

Mahalanobis entre machos das populações de Ae. aegypti de BUT, GUA, OSA e da população de Ae. albopictus do BUT.

55

Figura 19. Fenograma feito a partir da matriz de dissimilaridade com valores de distância

geográfica entre os locais de coleta, BUT, GUA e OSA.

56

A- Fêmeas

10 15 20 25 30 35 40 45Distância geográfica

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0D

istâ

ncia

fené

tica

r = 0,3363; p = 0,7816

B- Machos

10 15 20 25 30 35 40 45Distância geográfica

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

Dis

tânc

ia fe

nétic

a

r = -0,0313; p = 0,9801

Figura 20. Correlação entre distância geográfica e distância fenética para as quatro populações

de machos e fêmeas de Ae. aegypti.

57

4.1.3.2 Análise da variação interpopulacional de tamanho

As comparações interpopulacionais de tamanho alar revelaram que a população

de OSA possui maior tamanho médio alar, 1,92 mm, que as populações de BUT e GUA

para os machos. No caso das fêmeas, entretanto, o menor tamanho médio alar é da

população de OSA, 2,3 mm (Figura 21).

Em todas as comparações pareadas entre as populações (separadamente para

cada sexo) somente as que incluíram machos de OSA acusaram diferença significativa.

(Tabela 9).

But Gua Osa But Gua Osa Fêmeas Machos

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

Tam

anho

(mm

)

Média Erro padrão Desvio padrão

Figura 21. Variação geográfica de tamanho alar de machos e fêmeas das populações do BUT,

GUA e OSA. Resultados de teste T na Tabela 9.

58

Tabela 9 - Variação geográfica de tamanho alar. Resultados da aplicação do teste T estatístico com correção de Welch. Comparação entre as populações de BUT, GUA e OSA em relação ao tamanho alar. Diferenças significativas indicadas por *.


tamanho alar Fêmeas Machos

BUT X GUA p = 0,353 p = 0,985

BUT X OSA p = 0,241 p < 0,0001*

GUA X OSA p = 0,491 p < 0,0001* 4.1.4 Teste de repetibilidade

Foi realizado teste de repetibilidade das medidas utilizadas na coleta de dados

para análise morfométrica alar. Foram realizadas seis repetições de marcação de

pontos anatômicos. A única parte dessa análise que envolve interferência manual.

Uma única asa foi escolhida, de forma aleatória, e foram marcados dois pontos

anatômicos em cada repetição. Os pontos escolhidos foram o 2 e o 8, sendo o primeiro

de maior dificuldade de marcação correta devido às volumosas cerdas ao redor dele

(ver figura 5) . A análise de repetibilidade foi realizada no programa Statistica 7.0.

A análise de repetibilidade resultou em mais de 90 % de confiança nas medidas

realizadas, que de acordo com ASQC/AIAG (1991) p. 127, indica que o desempenho do

sistema de medidas aqui utilizado é aceitável. 4.2 Microssatélites Todos os cinco loci microssatélites (AED19, T3A7, 38/38, 34/72 e C2A8)

amplificaram em todas as populações de Ae. aegypti (BUT, GUA, OSA e SUZ) e foram

polimórficos. Os tamanhos dos fragmentos amplificados em cada locus estão

representados na Tabela 10.

O número de alelos observados para cada locus diferiu entre as populações

(Tabela 11). O locus que apresentou maior quantidade de alelos foi o 38/38, 6 alelos e

o locus que apresentou menor quantidade de alelos foi o AED19, 4 alelos.

59

Tabela 10 - Tamanho dos fragmentos de DNA amplificados (expressos em pares de bases)

nas populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e SUZ.

Loco Tamanho dos fragmentos encontrados (pb)

AED19 160 - 177 T3A7 222 - 240

38 / 38 75 - 90 34 / 72 82 - 90 C2A8 220 - 230

Tabela 11 - Número de alelos encontrado em cada locus nas populações de BUT, GUA, OSA e

SUZ.

Total de alelos Locus Nº de alelos BUT GUA OSA SUZ 4 AED19 3 4 3 3 5 T3A7 4 5 4 4 6 38/38 4 2 5 3 5 34/72 5 5 5 4 5 C2A8 4 4 4 5

4.2.1 Freqüências alélicas e genotípicas

- Locus AED19

O locus AED19 apresentou 4 alelos. O alelo de tamanho 160 pb só foi

encontrado na população de GUA com uma freqüência baixa 3,3%. O alelo mais

freqüente em todas as populações foi o de tamanho 174 pb (Figura 22). Um total de 5

genótipos diferentes foi encontrado nesse locus. O genótipo mais freqüente em todas

as populações foi o homozigoto 174/174 (Tabela 12).

60

- Locus T3A7

O locus T3A7 apresentou 5 alelos. O alelo de tamanho 237 pb só foi encontrado

na população de GUA com uma freqüência baixa 1,7%. Os outros 4 alelos foram

encontrados em todas as quatro populações analisadas (Figura 23). Foi encontrado um

total de 10 genótipos diferentes para esse locus. O genótipo 222/237 foi observado em

um único indivíduo da população de GUA. O genótipo 222/225 foi encontrado nas

populações do BUT e GUA. Os genótipos 225/225 e o 222/240 foram encontrados em

BUT, GUA e SUZ. Os outros 6 genótipos foram encontrados em todas as quatro

populações analisadas (Tabela 13).

- Locus 38/38

O locus 38/38 apresentou 6 alelos. O alelo de tamanho 90 pb só foi encontrado

na população de SUZ com uma freqüência alta de 44,2%. O alelo de tamanho 88 pb só

foi encontrado na população de OSA com freqüência baixa de 6,7%. Os alelos de

tamanho 75 pb e 85 pb só foram encontrados nas populações de BUT e OSA. O alelo

mais freqüente em todas as populações foi o de tamanho 82 pb (Figura 24). Doze

genótipos foram encontrados nesse locus. O genótipo homozigoto 82/82 foi o único

encontrado em todas as populações com uma freqüência alta. O genótipo 82/90 só foi

observado na população de SUZ em 16 indivíduos (Tabela 14).

- Locus 34/72

O locus 34/72 apresentou 5 alelos. O alelo de tamanho 82 pb foi encontrado nas

populações do BUT, GUA e OSA. Os outros 4 alelos foram observados em todas as

quatro populações analisadas. O alelo de tamanho 88 pb foi o mais freqüente em todas

as populações (Figura 25). Foi observado um total de 11 genótipos nesse locus. Os

genótipos 86/88 e o 88/88 foram os mais comuns. Os genótipos 82/86 e o 86/86 só

foram encontrados em GUA. Os genótipos 82/90, 84/90 e o 90/90 só foram encontrados

no BUT (Tabela 15).

61

- Locus C2A8

O locus C2A8 apresentou 5 alelos. O alelo de tamanho 225 pb só foi encontrado

na população de SUZ na freqüência de 3,8%. Os outros alelos foram encontrados em

todas as quatro populações analisadas, sendo os de tamanho 220 pb e 223 pb os mais

freqüentes (Figura 26). Um total de 10 genótipos foi observado nesse locus. Os

genótipos mais freqüentes foram o 220/223 e o 220/230 (Tabela 16).

160 165 174 177alelos (pb)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Freq

uênc

ia (

% )

BUT GUA OSA SUZ

Figura 22. Locus AED19 – alelos e suas respectivas freqüências em Ae. aegypti.

62

222 225 227 237 240alelos (pb)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0Fr

equê

ncia

( %

) BUT GUA OSA SUZ

Figura 23. Locus T3A7 – alelos e suas respectivas freqüências em Ae. aegypti.

75 80 82 85 88 90alelos (pb)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Freq

uênc

ia (

% )

BUT GUA OSA SUZ

Figura 24. Locus 38/38 – alelos e suas respectivas freqüências em Ae. aegypti.

63

82 84 86 88 90

alelos (pb)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0Fr

equê

ncia

( %

)

BUT GUA OSA SUZ

Figura 25. Locus 34/72 – alelos (pb) e suas respectivas freqüências em Ae. aegypti.

220 223 225 227 230

alelos (pb)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Freq

uênc

ia (

% )

BUT GUA OSA SUZ

Figura 26. Locus C2A8 – alelos e suas respectivas freqüências em Ae. aegypti.

64

Tabela 12 - Genótipos encontrados no locus AED19 nas populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e SUZ.

População Genótipos Nº de

165/165 160/174 165/174 174/174 174/177 indivíduosBUT - - 2 24 4 30

GUA 1 2 5 18 4 30

OSA 2 - - 10 18 30

SUZ 2 - 1 18 5 26

Total 5 2 8 70 31 116

- ausência de indivíduos

65

Tabela 13 - Genótipos encontrados no locus T3A7 nas populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e SUZ.

População Genótipos Nº de 222/222 222/225 225/225 222/227 227/227 222/237 222/240 225/240 227/240 240/240 indivíduos

BUT 4 4 6 1 3 - 7 1 1 3 30

GUA 5 1 4 2 4 1 5 2 5 1 30

OSA 3 - 11 1 3 - 8 1 1 2 30

SUZ 2 - - 9 5 - - 2 7 1 26

Total 14 5 21 13 15 1 20 6 14 7 116

- ausência de indivíduos Tabela 14 - Genótipos encontrados no locus 38/38 nas populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e SUZ.

População Genótipos Nº de 75/75 75/80 80/80 75/82 82/82 80/85 82/85 82/88 88/88 80/90 82/90 90/90 indivíduos

BUT 1 1 - 2 21 2 3 - - - - - 30

GUA - - 1 - 29 - - - - - - - 30

OSA 4 - 1 4 17 - 1 2 1 - - - 30

SUZ - - - - 6 - - - - 1 16 3 26

Total 5 1 2 6 73 2 4 2 1 1 16 3 116

- ausência de indivíduo

66

Tabela 15 - Genótipos encontrados no locus 34/72 nas populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e SUZ. População Genótipos Nº de

82/86 86/86 82/88 84/88 86/88 88/88 82/90 84/90 86/90 88/90 90/90 indivíduos BUT - - 1 1 4 8 1 1 3 9 2 30

GUA 1 1 - 15 6 5 - - 1 1 - 30

OSA - - 4 1 9 8 - - 4 4 - 30

SUZ - - - 1 4 18 - - - 1 2 26

Total 1 1 5 18 23 39 1 1 8 15 4 116

- ausência de indivíduos Tabela 16 - Genótipos encontrados no locus C2A8 nas populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e SUZ.

População Genótipos Nº de 220/220 220/223 223/223 225/225 220/227 223/227 227/227 220/230 223/230 227/230 indivíduos

BUT - 12 4 - 1 1 1 6 4 1 30

GUA 1 4 4 - 3 - - 12 3 3 30

OSA 1 10 4 - 1 - - 9 4 1 30

SUZ - 4 7 1 8 - - 5 1 - 26

Total 2 30 19 1 13 1 1 32 12 5 116

- ausência de indivíduos

67

4.2.2 Testes de equilíbrio de Hardy- Weinberg

Equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado para cada locus em cada população

usando teste de probabilidade (Haldane, 1954). Dos loci analisados, 65%

apresentaram desvio significativo do equilíbrio de HW.

A população do BUT apresentou desvio do equilíbrio de HW em dois loci

(T3A7 e 38/38), ambos devido ao déficit de heterozigotos. A população de GUA não

apresentou equilíbrio de HW em quatro loci, dois loci devido ao déficit de

heterozigotos (T3A7 e 38/38), e dois loci devido ao excesso de heterozigotos (34/72

e C2A8). A população de OSA apresentou três loci com desvio do equilíbrio de HW,

um loci devido ao excesso de heterozigotos (AED19) e dois loci devido ao déficit de

heterozigotos (T3A7 e 38/38). A população de SUZ apresentou quatro loci com

desvio do equilíbrio de HW, três deles devido ao déficit de heterozigotos (AED19,

34/72 e C2A8) e um loci devido ao excesso de heterozigotos (T3A7) (Tabela 17 e

Figuras 27-30). O locus T3A7 apresentou desvio do equilíbrio de HW em todas as

populações analisadas. Do total de loci que não apresentou equilíbrio de HW,

69,23% foi devido ao déficit de heterozigotos e 30,77% devido ao excesso de

heterozigotos. Estimativas de freqüência de alelos nulos nos cinco loci

microssatélites estão mostrados na tabela 18.

68

Tabela 17 - Fis e desvios de Hardy – Weinberg observado em cinco locus microssatélites de Ae. aegypti nas amostras do BUT, GUA, OSA e SUZ.

AED19 T3A7 38/38

População Fis P Fis P Fis P

BUT -0,067 1 0,374 0,0007 a 0,295 0,005 a

GUA 0,0185 0,658 0,303 0,0031 a 1 0,018 a

OSA -0,173 0 a 0,502 0 a 0,5333 0,0005 a

SUZ 0,317 0,013 a -0,06 0,046 a -0,2537 0,171

34/72 C2A8

População Fis P Fis P

BUT -0,046 1 -0,199 0,449

GUA -0,267 0,0065 a -0,149 0,0093 a

OSA -0,187 0,5095 -0,2175 0,0907

SUZ 0,323 0,0343 a 0,06 0 a Fis: coeficiente de endogamia P: probabilidade de rejeitar o equilíbrio de Hardy – Weinberg a : valor significativo P < 0,05

Tabela 18 - Estimativa de valores de freqüência de alelos nulos nos cinco loci microssatélites.

Locus População

BUT GUA OSA SUZ AED19 0 0,04 0,17 0,16 T3A7 0,38 0,35 0,42 0,19 38/38 0,06 0,12 0,19 0,36 34/72 0,29 0 0,03 0,22

C2A8 0,1 0,23 0,13 0,12

69

AED19 T3A7 * 38/38 * 34/72 C2A8

Locus

0

5

10

15

20

25

30

Núm

ero

de in

diví

duos

Observado Esperado

a

a

Figura 27. Número de heterozigotos observado e esperado para os cinco locus microssatélites de Ae. aegypti na população do Butantã. * não está em equilíbrio de Hardy – Weinberg. a déficit de heterozigotos.

AED19 T3A7 * 38/38 * 34/72 * C2A8 *

Locus

0

5

10

15

20

25

30

Núm

ero

de in

diví

duos

Observado Esperado

a

a

bb

Figura 28. Número de heterozigotos observado e esperado para os cinco locus microssatélites de Ae. aegypti na população do Guarulhos. * não está em equilíbrio de Hardy – Weinberg. a déficit de heterozigotos. b excesso de heterozigotos.

70

AED19 * T3A7 * 38/38 * 34/72 C2A8

Locus

0

5

10

15

20

25

30

Núm

ero

de in

diví

duos

Observado Esperado

a

b

a

Figura 29. Número de heterozigotos observado e esperado para os cinco locus microssatélites de Ae. aegypti na população do Osasco. * não está em equilíbrio de Hardy – Weinberg. a déficit de heterozigotos. b excesso de heterozigotos

AED19 * T3A7 * 38/38 34/72 * C2A8 *Locus

0

5

10

15

20

25

30

Núm

ero

de in

diví

duos

Observado Esperado

a

a

a aa

b

Figura 30. Número de heterozigotos observado e esperado para os cinco locus

microssatélites de Ae. aegypti na população do Suzano. * não está em equilíbrio de Hardy – Weinberg. a déficit de heterozigotos. b excesso de heterozigotos.

71

4.2.3 Desequilíbrio de ligação

Das 40 análises possíveis em relação ao desequilíbrio de ligação, apenas 4

foram significativos (AED19-C2A8, C2A8-T3A7, T3A7-34/72, AED19-T3A7) com p <

0,01 na população de Osasco.

4.2.4 Diferenciação populacional

Foram determinados valores F-estatístico de Wright (Fis, Fst e Fit) para os

cinco loci polimórficos. Heterogeneidade genética (Fst) refletiu altos níveis de

diferenciação genética entre as populações de Ae. aegypti da área metropolitana de

São Paulo, apresentando um valor médio de 0,0622, estatisticamente significativo p

< 0.05. O locus C2A8 foi o que apresentou menor valor de Fst. Desvio do equilíbrio

de HW nas subpopulações apresentou um valor médio de 0, 057 refletindo um déficit

de heterozigotos. O desvio de HW no total das populações também refletiu em

déficit de heterozigotos, com um valor médio de 0, 1159 (Tabela 19).

O fluxo gênico (Nm) estimado para as quatro populações estudadas foi de

0,47 indivíduos, valor relativamente baixo, o que é compatível com a hipótese de

estruturação populacional.

Tabela 19 - Estimativas de valores F-estatístico de Wright calculado em cada locus em

quatro populações de Ae. aegypti.

Locus Fis Fst Fit AED19 -0,0013 0,0568 0,0555

T3A7 0,3012 0,0456 0,3331

38/38 0,2364 0,1834 0,3765

34/72 -0,0998 0,0653 -0,028

C2A8 -0,1305 0,0051 -0,1247

Total 0,0572 0,0622 0,1159 Fis: Desvio de HW nas subpopulações; Fst: heterogeneidade genética; Fit: desvio de HW no total das populações.

72

4.2.4 Distância genética versus distância geográfica

Variações nos valores de Fst foram avaliadas de acordo com a distância

geográfica. Uma semi-matriz de Fst foi calculada para estimar a distância genética

entre as populações do BUT, GUA, OSA e SUZ. Fenogramas de distância

mostraram que as populações mais próximas geneticamente (Figura 31) também

são mais próximas geograficamente (Figura 32). Correlação entre distância genética

e geográfica mostrou um índice de correlação de r = 0,76, indicando uma alta

correlação positiva (Figura 33).

73


genética gerada a partir de dados de Fst entre as populações de Ae. aegypti do BUT, GUA, OSA e SUZ


geográfica em Km entre os locais de coleta, BUT, GUA, OSA e SUZ.

74

2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0Distância geográfica (Log)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

Dis

tânc

ia g

enét

ica

(Fst

/ (1

-Fst

) )

r = 0,7618; p = 0,0783

Figura 33. Correlação entre distância geográfica e distância genética para as quatro

populações de Ae. aegypti. Com p < 0.1, significativo.

75

5 DISCUSSÃO 5.1 Morfometria geométrica alar

Análises intra e interpopulacionais foram realizadas com as quatro

populações de Ae. aegypti da área metropolitana de São Paulo. Dentro das

comparações intrapopulacionais, a assimetria bilateral de forma foi tênue e de

tamanho foi estatisticamente não-significativa. Há casos de insetos em que a

assimetria bilateral está associada a condições ambientais adversas, algumas delas

próprias de ambientes urbanos (Souza et al., 2007; Mpho et al., 2002; Mpho et al.,

2001). Isso poderia nos levar a subestimar as possíveis influências de eventual

estresse ambiental nessa espécie. Entretanto, antes de formular conclusões

prematuras, seria mais indicado avaliar a real exposição dos indivíduos a fatores de

stress, bem como a influência de pressão seletiva na manutenção da simetria alar.

O alto dimorfismo sexual alar detectado na análise de forma e tamanho de

todas as populações analisadas corrobora a suspeita levantada em estudos

taxonômicos tradicionais realizados em culicídeos (Lien, 1968) e com outras

observações de diversos autores sobre as diferentes funções que as asas podem

assumir para ambos os sexos. Os machos podem usar as asas na produção de

sons de corte sexual e as fêmeas para vôos precisos durante a busca de alimento,

dispersão e oviposição (revisão em Forattini, 2002). O tamanho das asas foi maior

em fêmeas do que em machos, o que é observado em alguns culicídeos (Agnew et

al., 2000; Jirakanjanakit et al., 2007).

Nas comparações interpopulacionais nota-se uma grande variabilidade

morfológica alar intrapopulacional. Foi possível reconhecer um ligeiro distanciamento

entre as populações que, no entanto não acusa diferenciação marcante e, portanto

não indica estruturação populacional evidente. Ausência de correlação foi observada

entre distâncias geográficas e fenéticas nas populações analisadas, indicando que a

distância geográfica não foi majoritariamente influente na evolução desses padrões

alares.

Foi observado nos fenogramas de distância de Mahalanobis o mesmo padrão

para ambos os sexos de Ae. aegypti. A população de Ae. albopictus utilizada como

grupo externo foi coletada no mesmo local e época que a população de Ae. aegypti

76

do BUT. Quando foi adicionada essa população como grupo externo, observou-se

que populações da mesma espécie se agruparam e a população de Ae. albopictus

ficou distanciada. Esses dados estão de acordo com o de Henry et al. (2010) em que

a forma da asa mostrou-se espécie-específica, independentemente da origem

geográfica da espécie.

Enquanto vários estudos mostram que a MG pode discriminar espécies

diferentes, estudos têm demonstrado que a morfometria geométrica alar tem

capacidade de discriminar populações de Culex quinquefasciatus em escalas

macrogeográficas (Peruzin, 2009; Morais et al., 2010). As populações de Ae. aegypti

de São Paulo utilizadas no estudo estão distanciadas no máximo de 50 km, por esse

motivo não era esperado uma diferenciação morfológica alar muito acentuada, além

disso são populações entre as quais o fluxo gênico ainda não foi totalmente

interrompido. Sendo assim, os resultados foram surpreendentes ao mostrar uma

diferenciação tênue. Isso indica que as asas são realmente marcadores sensíveis e

devem acusar evolução rápida como descrito anteriormente por Dujardin (2008).

5.2 Microssatélites

Vários tipos de marcadores moleculares têm sido utilizados para diversos

propósitos, tais como, estudos de estruturação populacional, identificação de

espécies, separação de espécies crípticas, reconstrução da história evolutiva de

organismos, etc. Os marcadores microssatélites utilizados no presente estudo estão

entre os marcadores mais polimórficos encontrado em genomas de animais.

As regiões SSRs selecionadas para serem utilizadas no estudo populacional

de Ae. aegypti na área metropolitana de São Paulo foram as mesmas utilizadas em

trabalhos anteriores com a mesma espécie (Da Costa-Ribeiro et al., 2006; Huber et

al., 2002). Os resultados mostraram que todos os loci amplificaram e foram

polimórficos, isso evidencia uma das vantagens de utilizar primers específicos. Bello

e Becerra, 2009 estudando a variabilidade genética de populações de Ochlerotatus

taeniorhynchus na Colômbia selecionaram oito primers que tinham sido

desenvolvidos para Ae. aegypti e Och. caspius, já que não tinha primers específicos

para a espécie que eles estavam estudando. Os resultados que eles obtiveram foi

77

que três primers que correspondiam ao Ae. aegypti não amplificaram, e os que

correspondiam ao mesmo gênero todos amplificaram.

O número de alelos por locus encontrados nas populações de Ae. aegypti na

área metropolitana de São Paulo foi menor (média de 5 alelos por locus), quando

comparados com populações de Ae. aegypti na Ásia (média de 10 alelos por locus)

(Huber et al., 2002; Paupy et al., 2004). Isso provavelmente acontece por essas

populações estarem mais próximas ao centro de origem do Ae. aegypti, a África.

Quando comparado com o trabalho realizado no Rio de Janeiro - Brasil, por Da

Costa-Ribeiro et al. (2006), utilizando os mesmos primers (média de 3 alelos por

locus), o número de alelos por locus foi maior. As populações de Ae. aegypti

estudadas em São Paulo foram mais polimórficas que populações de Ae. aegypti do

Rio de Janeiro.

Trabalho feito anteriormente com populações de Ae. aegypti de várias partes

do Mundo utilizando o gene mitocondrial NADH observaram que haplótipos

presentes na África central, Ásia, América do norte e central estão presentes em

cidades brasileiras com importantes portos comerciais como Santos, Belém, Manaus

e São Sebastião (Bracco et al., 2007). As análises feitas naquele estudo mostram a

existência de duas linhagens de DNA mitocondrial, nas populações de Ae. aegypti

do Brasil, uma relacionada com populações do Oeste Africano e a outra relacionada

com populações do leste Africano e Ásia. Segundo os autores a linhagem 1

apresentou menor polimorfismo quando comparado com a linhagem 2. No estado de

São Paulo foi encontrada as duas linhagens reconhecidas por Bracco et al. (2007),

enquanto que no estado do Rio de Janeiro foi encontrado somente a linhagem 1. A

presença das duas linhagens mitocondriais no estado de São Paulo condiz com o

maior polimorfismo de loci microssatélites nas populações de São Paulo quando

comparado com populações do Rio de Janeiro.

Os resultados obtidos entre pares de genótipos dos loci microssatélites

mostraram que só ocorreu desvio do equilíbrio de ligação em algumas comparações

dentro da população de Osasco, sugerindo a independência dos loci utilizados neste

estudo e portando a ausência de combinações alélicas entre os cromossomos do

inseto em subpopulações analisadas. É pouco provável que essa ligação foi

causada pelo enlace físico desses loci, já que só foi observado na população de

Osasco. Assim, as informações da variabilidade genética e heterozigosidade obtida

78

a partir de cada um dos marcadores polimórficos utilizados neste estudo são

relevantes.

As análises feitas para determinar se havia desvios em relação ao Equilíbrio

de Hardy-Weinberg nas populações analisadas mostraram que todas as populações

de Ae. aegypti não estavam em equilíbrio de HW, devido ao déficit ou excesso de

heterozigotos, embora a favor de genótipos homozigotos. Esta situação foi refletida

também pelo desvio do equilíbrio de HW em nível intrapopulacional que tinha um

valor positivo (Fis=0,0572). O mesmo foi observado ao nível da população total, um

valor positivo (Fit=0,1159) indicando desvio do equilíbrio de HW devido ao déficit de

heterozigotos. A situação geral indica que o desvio do equilíbrio de HW nas

populações de Ae. aegypti de São Paulo, não é igualmente afetado, por genótipos

heterozigoto ou homozigoto.

Desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado nas populações do

BUT, OSA e SUZ devido principalmente ao déficit de heterozigotos, mas não em

todos os loci, o que permite inferir a existência de eventos evolutivos naturais que

influenciam essa conclusão. Provavelmente, a subdivisão da população (efeito

Wahlund) seria uma das explicações mais coerente, desde outras causas como a

deriva genética, endogamia e a presença de alelos nulos. As hipóteses que

afetariam um marcador de forma igual foram descartadas, pois não foi observado

nessas populações, já que a presença de loci em desvio do equilíbrio de HW

também ocorreu devido ao excesso de heterozigotos. A existência simultânea de

déficit e excesso de heterozigotos na, com dominância de déficits nestas populações

são altamente compatíveis com o efeito de subdivisão genética presente em alguns

loci, mas não necessariamente em todos os loci, o mesmo foi observado em

trabalho anterior feito por Bello e Becerra (2009) utilizando marcadores

microssatélites em populações de Och. taeniorhynchus.

Os loci T3A7 e 38/38 apresentaram déficit de heterozigotos em três das

quatro populações analisadas. Isso pode estar relacionado devido a quatro fatores:

1- o locus está sob seleção; 2- presença de alelos nulos; 3- consangüinidade nas

populações; 4- a presença de populações subestruturadas que leva a um efeito

Wahlund. Da Costa Ribeiro et al. (2006) observaram em cinco populações de Ae.

aegypti do Rio de Janeiro déficit de heterozigotos no locus T3A7 e os dados do loci

38/38 não foram determinados. Esses loci provavelmente foram submetidos à

79

mutação nas regiões flanqueadoras resultando na inibição do anelamento do primer

com a seqüência complementar do DNA. As falhas na detecção dos produtos de

PCR de microssatélites geram alelos nulos e, portanto, déficit de heterozigotos

(Lanzaro et al., 1995). A endogamia não poderia ser a explicação do déficit de

heterozigotos já que não foi observado em todos os loci. O efeito Wahlund que

descreve os desvios devido à partilha de subpopulações em equilíbrio de HW

também poderia ser uma explicação.

A média do índice de Fst total correspondeu a um valor de 0,0622 indicando

uma diferenciação genética moderada entre as populações do BUT, GUA, OSA e

SUZ. Segundo Wright (1978), valores de Fst entre 0,05 e 0,15 indicam uma

moderada diferenciação genética entre as populações. Estudos populacionais

anteriores com Aedes aegypti utilizando marcadores microssatélites também

indicaram diferenciação genética populacional em escala microgeográfica. Da Costa

Ribeiro et al. (2006), analisando cinco populações no Rio de Janeiro com distâncias

variando de 8,2 a 32,4 km encontraram um Fst de 0,3304 significativo, mostrando

uma diferenciação genética alta. Ravel et al. (2002), estudando populações de Ae.

aegypti observaram a existência de populações geneticamente distintas ao longo de

um transecto norte-sul em Costa do Marfim (África) .

Fêmeas de Ae. aegypti tendem a colocar ovos em recipientes artificiais nas

proximidades de habitações humanas, assim a dispersão varia de acordo com a

distribuição dos locais de reprodução e disponibilidade de alimento (Tsuda et al.,

2001). O fluxo gênico contribui para homogeneizar as populações e, portanto reduz

a diferença genética entre as populações. O presente estudo indicou baixo fluxo

gênico (Nm = 0,47), ou seja, um número pequeno de migrantes por geração entre as

populações analisadas de Ae. aegypti na área metropolitana de São Paulo,

sugerindo uma diferenciação genética entre as populações desse mosquito,

apresentando alta estruturação de Ae. aegypti nas populações analisadas.

Os municípios onde foram realizadas as coletas (BUT, GUA, OSA e SUZ) são

intensamente urbanizados. Nesses centros urbanos existem vários habitats

importantes para o desenvolvimento do Ae. aegypti, como vaso de plantas, garrafas

plásticas, pneus, panelas e muitos outros. O número e a proximidade dos locais de

reprodução (para as fêmeas colocar os ovos) e densas populações humanas (para

80

alimentação sanguínea das fêmeas) tendem a limitar a dispersão dos mosquitos,

contribuindo assim para a diferenciação genética.

A distribuição da variabilidade genética de uma população subdividida

depende principalmente da distribuição espacial das populações, da sua dimensão,

do fluxo gênico e dos processos de extinção e recolonização (Slatkin, 1985; Wade e

Mccauley, 1988; Mccauley,1991).

Foi observada correlação entre distância genética e distância geográfica entre

as populações analisadas, indicando que os níveis de diferenciação genética são

dependentes da distância geográfica. Em trabalhos anteriores com populações de

Ae. aegypti utilizando microssatélites não foi observado correlação entre distância

genética e distância geográfica (Da Costa Ribeiro et al., 2006; Huber et al., 2002;

Ravel et al., 2002). A distância geográfica não é sempre um bom indicador de

distância genética entre as populações, embora o reduzido fluxo de alelos gênicos

contribua para reduzir as diferenças entre populações separadas por distâncias

compatíveis com a distância de migração da espécie.

A diferenciação de populações através do formato alar tem mostrado ser

possível até o momento para escalas macrogeográficas ou populações com

estruturação mais acentuada, já os microssatélites são capazes de diferenciar

populações em escalas micro e macrogeográficas. Os marcadores moleculares

utilizados no presente trabalho são de grande interesse para a caracterização

genética de várias populações de Ae. aegypti. A capacidade de discriminar

populações em escala microgeográficas é de grande importância em estudos que

envolvem taxonomia molecular e investigação epidemiológica de Ae. aegypti. Esse

estudo provavelmente será estendido a outras regiões do estado de São Paulo, e

possivelmente abrirá ainda mais os horizontes da aplicabilidade desses métodos.

Futuras investigações científicas ou trabalhos de vigilância epidemiológica poderão

fazer uso do método de MG em âmbito macrogeográfico e usar os microssatélites no

âmbito microgeográfico para entender a dispersão e a prevalência do vírus dengue.

81

6 CONCLUSÕES - Há acentuado dimorfismo sexual alar de forma e tamanho em Ae. aegypti;

- Fêmeas de Ae. aegypti apresentam tamanhos alares maiores que os machos;

- Assimetria bilateral alar foi tênue para ambos os sexos;

- Existe variabilidade morfológica alar que indica ligeira diferenciação mas não acusa

evidente estrutuação populacional;

- Todos os loci microssatélites foram polimórficos para as populações de Ae. aegypti

do BUT, GUA, OSA e SUZ;

- Há uma diferenciação genética moderada entre os grupos geográficos

considerados (Fst = 0,0622), indicando que essas populações estão estruturadas;

- Baixo fluxo gênico foi encontrado entre as populações analisadas de Ae. aegypti na

área metropolitana de São Paulo (Nm= 0, 47);

- Distância geográfica é um bom indicador de distância genética para as populações

de Ae. aegypti da área metropolitana de São Paulo, porém não se correlacionou

com distância fenética.

- Possivelmente as velocidades de evolução dos caracteres alares e das regiões

microssatélites são diferentes.

- A MG provavelmente poderá ser útil para estudos populacionais em níveis

macrogeográficos;

- Os resultados gerados no presente trabalho demonstraram que os marcadores

microssatélites são mais adequados para avaliar estrutura genética de amostras

coletadas em um pequeno espaço geográfico.

82

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