PADRONIZAÇÃO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA AIDENTIFICAÇÃO DE FITOPLÂNCTON E ENFERMIDADES VIRAIS E

BACTERIANAS EM TILÁPIAS CRIADAS NO SISTEMA MAVIPI

Autores : Gustavo BACHMANN1, Daniela GOETEN2, Cecília de Souza VALENTE3, Maria Risoleta FreireMARQUES4, Isabel Cristina MÜLLER5, Cesar Ademar HERMES6

Identificação autores: 1 Estudante de Graduação em Bacharelado em Engenharia Agronômica, Instituto FederalCatarinense – Campus Rio do Sul, bolsista PIBITI/CNPq; 2 Estudante de Graduação em Bacharelado em EngenhariaAgronômica, Instituto Federal Catarinense – Campus Rio do Sul; 3 Doutoranda na Universidade Federal de SantaCatarina; 4 Universidade Federal de Santa Catarina; 5 Doutora em Biotecnologia UFSC, professora e orientadora doInstituto Federal Catarinense – Campus Rio do Sul; 6 Engenheiro de Pesca - Dr. em Aquicultura, professor doInstituto Federal Catarinense – Campus Rio do Sul.

Introdução

O I.F. Catarinense/Câmpus Rio do Sul está localizado na cidade polo doModelo Alto Vale de Piscicultura Integrada (MAVIPI), tendo sido desenvolvido eimplantado na região do Alto Vale do Itajaí pela EPAGRI-SC (Empresa de PesquisaAgropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina); este modelo de produção consiste naprodução de peixes, em sistema que prioriza e estimula a produção primária comoprincipal fonte alimentar dos peixes, com utilização de fertilizantes orgânicos (estercode suínos), sem troca de água (somente manutenção de nível) e com utilização depolicultivo (criação de várias espécies de peixes num mesmo viveiro, cada umaocupando níveis tróficos diferentes no ecossistema do viveiro de criação).

A piscicultura em geral, possui um risco potencial de enfrentar problemas comenfermidades. Patógenos em potencial podem se manter e proliferar no ambienteexterno (água) (HANSEN; OLAFSEN, 1999; VERSCHUERE et al., 2000). Ofitoplâncton apresenta papel essencial na quebra de matéria orgânica e ciclagem denutrientes (NIU et al., 2011). O controle biológico tem se mostrado uma ferramenta útilcom bom potencial na aquicultura de modo geral, envolvendo o uso de bactériasprobióticas, capazes de estimular o crescimento e melhorar o estado de saúde dosanimais. Os efeitos desta estratégia envolvem mecanismos de ação variados, como aestimulação da resposta imune, possíveis efeitos antivirais, melhora da função digestivae da nutrição, via o fornecimento de nutrientes essenciais e melhora na qualidade deágua (SCHULZE et al., 2006; VERSCHUERE et al., 2000).

Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo padronizar asmetodologias para extração de DNA de amostras de peixe e fitoplâncton e dedesenvolver iniciadores de genes constitutivos (tilápias e fitoplâncton) e de algumasenfermidades virais e bacteriológicas de tilápias, assim como para a identificação demicrorganismos com potencial probiótico.

Material e Métodos As amostras de fitoplâncton foram coletadas em um sistema de policultivo

integrado à suinocultura localizado no município de Lontras – SC. As amostras foramfixadas em etanol 95% e mantidas a 4º C para extração de DNA.

Foram coletadas duas tilápias por mês para a retirada de brânquias, pele,músculo e intestino. No momento da coleta, os animais foram medidos e pesados, alémde observado os aspectos gerais dos exemplares coletados e a presença de sinais clínicosde patologias. As carcaças dos peixes foram armazenadas a -20º C.

O DNA das amostras de peixes foi extraído, segundo o procedimento descritopor Maciel (2002), modificado por Moser (2005). A integridade das amostras foiavaliada pelo perfil eletroforético em gel de agarose 1% e a concentração de DNA (ng)determinada em espectrofotômetro (DO260).

Para o diagnóstico molecular de enfermidades, inicialmente realizou-se umapesquisa bibliográfica dos principais patógenos bacterianos e virais associados aocultivo de tilápias e foram desenhados os iniciadores para um gene constitutivo. Alémdisso, foram desenhados iniciadores para o gene 16 S para uma identificação mais geraldos microrganismos. A enzima RUBISCO foi utilizada para a identificação dofitoplâncton. A mesma metodologia está sendo aplicada para outros primers, como o deArthrospira platensis, buscando identificar algumas espécies de fitoplâncton de maneiramais específica. Para a amplificação do gene de interesse utilizou-se o método de PCR eos produtos de PCR amplificados foram visualizados por eletroforese em gel de agarose2%. O tamanho dos fragmentos obtidos foi comparado com marcadores de pesomolecular conhecido (1 kb e 100 bp).

Resultados e discussão

A Figura 1 representa um gel de agarose (1%), com amostras de DNAextraídas de brânquias, e intestino de peixes. Observa-se que a amostra A1 retirada dotecido intestinal apresenta DNA íntegro, enquanto as amostras A2 retirado do tecido dasbrânquias e amostra A3 retirada também de tecido intestinal presentam o DNAdegradado.

Figura 1 – Eletroforese em gel agarose 1% de amostras de DNA

Na Figura 2 podemos observar a eletroforese da PCR do gene 16S, utilizando-se dos iniciadores estipulados por Muyzer (1993). Pode-se notar que houveamplificação de material genético nas amostras 8,9,10 e em ambos os negativos, o quepode significar que em alguma etapa houve contaminação. No entanto, a figura 3representa uma eletroforese do mesmo gene, porém com iniciadores de Baker eHarayama (2004). É possível notar que houve amplificação em quase todas as amostras.Sendo assim, pode-se deduzir que iniciadores de um mesmo gene mas que amplificamregiões diferentes podem produzir resultados diferentes.

Para a identificação do fitoplâncton nas amostras de água utilizou-se oiniciador da enzima RUBISCO (Figura 4), pois é um iniciador universal para tecidosvegetais e algas (considerando que a RUBISCO só é encontrada nestes organismos).Este iniciador também foi utilizado nas amostras de peixe, pois poderia ser possívelencontrar DNA de algas em regiões como brânquias e pele, no entanto, não houveamplificação nos tecidos animais, caracterizando a ausência de algas.

Figura 2 – Eletroforese em gel de agarose 2% de PCR do gene 16S pelo métodoproposto por Muyzer. Sendo as amostras 1 à 6 são de tecido animal e 7 à 10 amostras de

água.

Figura 3 – Eletroforese em gel de agarose 2% de PCR do gene 16S pelométodo proposto por Baker e Harayama (2004). Sendo as amostras 1 à 6 são de tecido

animal e 7 à 10 amostras de água.

Figura 4 - Eletroforese em gel agarose 2% PCR RUBISCO, onde A1 à A6,amostras de tecido animal e A7 à A10, amostras de água.

Conclusão Após a padronização da PCR utilizando os iniciadores para identificação de patógenos,esta metodologia poderá ser utilizada como ferramenta para a identificação de doençasem cultivos de tilápia. Além disso, pretendemos relacionar a presença demicrorganismos com potencial probiótico com o sistema de produção MAVIPI.

Referências

HANSEN, G.H., OLAFSEN, J.A. Bacterial interactions in early life stages of marinecold water fish. Microbial Ecology 38, 1–26, 1999.NIU, Y.; SHEN, H.; CHEN, J.; XIE, P.; YANG, X.; TAO, M.; MA, Z.; QI, M.Phytoplankton community succession shaping bacterioplankton communitycomposition in LakeTaihu, China. Water Research 45, 4169 – 4182, 2011.SCHULZE, A.D.; ALABI, A.O.; TATTERSALL-SHELDRAK, A.R. et al. Bacterialdiversity in a marine hatchery: balance between pathogenic and potentially probioticbacterial strains, Aquaculture, v.256, p.50-73, 2006.MUYZER, G., DE WAAL, E.C., UITTERLINDEN, A.G. Profiling of complexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerasechain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and EnvironmentalMicrobiology, v. 59 (3), p. 695-700, 1993.VERSCHUERE, L., ROMBAUT, G., SORGELOOS, P., VERSTRAETE, W., Probioticbacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology and MolecularBiology Review 64, 655–671, 2000.

AgradecimentosAo Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imonoquímica(LABCAI) – UFSC, por ceder espaço para realização de parte das atividades. Ao IFC/CNPq pela bolsa PIBITI (edital 502/2015).Ao CNPq (editais MDA 81 2013, MPA/CNPq 2012).À PROPI (edital 270/2015).Ao IFC – Rio do Sul pela bolsa de pesquisa (edital 13/2015).