oxidativo causado por cádmio e a resposta adaptativa a...

“Papel da trealose na proteção durante o estresse oxidativo causado por cádmio e a resposta adaptativa a este estresse em Saccharomyces cerevisiae”

Luciana Mara Costa Moreira

Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais

2007

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ii

Comissão Nacional de Energia Nuclear

Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear

Mestrado em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais

Papel da trealose na proteção durante o estresse oxidativo causado por cádmio

e a resposta adaptativa a este estresse em Saccharomyces cerevisiae

Luciana Mara Costa Moreira

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, com requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre em

Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais

Área de concentração: Ciências e Tecnologia das Radiações

Orientadora: Dra. Maria José Neves

Belo Horizonte 2007

iii

“Um sonho que se sonha só, é

um sonho que se sonha só, mas

um sonho que se sonha junto, é

REALIDADE”.

Raul Seixas

iv

“Aos meus avós, Maria e João, por criarem o caminho,

Aos meus pais, Clarice e João, por me ensinarem a caminhar,

Ao Túlio por caminhar ao meu lado”.

Dedico-lhes

v

À minha orientadora, Dra Maria José

Neves, que durante toda orientação

deste trabalho me fez sentir no

caminho certo.

Você fez a diferença!

vi

Agradecimentos

A Deus, por cada um dos dias vividos e por viver, pelas experiências boas e também pelas ruins que nos permitem crescer durante o curso da existência, e principalmente por colocar em minha vida, pessoas especiais que me acompanharam em cada momento dessa dissertação! À minha orientadora, Dra Maria José Neves que de chefe passou a fazer parte da minha vida, que me apresentou o lindo mundo do laboratório, me acompanhou em todo o momento me apoiando e não me deixando desistir, me dando força e principalmente me ensinando a amar o que jamais vou esquecer: a pesquisa. Muito obrigada por acreditar em mim!!!!! Aos meus pais, base da existência, luz do meu caminho, vocês não me deram apenas a vida, vocês são a minha vida!!! Obrigada por tudo, e essa vitória mais uma vez é nossa. Ao Túlio, obrigada por ser meu mundo, meu tudo e nada mais! Obrigada por me acompanhar e me apoiar em mais um momento de minha vida! Te Amo Pê! “Ainda bem que você vive comigo, por que senão como seria essa vida... sei lá! Sei lá!” Cris, irmão que eu amo, obrigada pelo silêncio que diz muito... A tia Fátima, carinho constante, apoio essencial, força nas horas tristes, sorriso certo em momentos felizes... A tia Vilma, por acreditar em mim, e ser um exemplo no mundo da pesquisa; a Dindinha Dora, apoio essencial sempre! Amo vocês! Aos tios, tias, primos e primas... Obrigada por fazerem parte de minha vida em cada momento dessa dissertação, obrigada por compreender o mau humor e sorrir em cada vitória. Família Costa eu amo todos vocês! A toda família Bacelette pala alegria contagiante; A Carol, fiel amiga nas horas alegres e difíceis, apoio essencial na hora da escrita... valeu de coração o companheirismo e a motivação!!! “E viva as leveduras” A Dani Foschetti, que aparece sempre na minha vida, seguindo os mesmos caminhos e passando pelos mesmos sufocos, dando aquela força especial... Ao Flaviano e Ariane pelo carinho, ensinamentos, e ajuda constante em todos os momentos... Adoro vocês! As três pessoas queridas da Radiobiologia, que caminharam junto comigo, compartilhando ensinamentos e principalmente sentimentos: A Estefânia, amiga fiel e alegre, que me fez sorrir, acreditar na alegria de viver, que me acompanhou em cada vitória e cada tristeza. Tetê, você mora no meu coração! À Marina por sempre ter a calma que tanto preciso, por

vii

me ouvir, me emprestar o ombro nas horas difíceis e ter alegria sempre. A Marcella pela amizade que significa muito e por conselhos financeiros sempre complexos... Ao pessoal do laboratório de Radiobilogia, que foram essenciais na realização deste trabalho, que além de amigos viraram irmãos, me acompanharam em cada vitória e em cada frustação... A Karine por me apoiar em todos os momentos lúcidos e não lúcidos, ao Fred por sobreviver a minha chatice e ser meu melhor EX estagiário, ao Edinho meu irmão de coração que me alegrou por vários momentos, ao Nino que me ensinou com seu “vasto” conhecimento, a Priscilla por entender a minha grande necessidade de falar, ao Paulo por seus diagnósticos precisos, a Ju Soprani pelo carinho, a Thaíssa por me ajudar quando o mundo está rodando, a Ju Lage pela simpatia, ao Rômulo por me alegrar sempre, a Pryscila

Rodrigues e Bárbara... “Amigos são anjos que nos levantam, quando nossas asas se esquecem como voar”

Aos sobreviventes do mestrado, a todas as pessoas especiais que estiveram ao meu lado, me apoiando, me dando força, e alegrando minha vida: Jaqueline, Nelson, Carlos Renato, Janúbia, Carol Bracinni, Karynne, Leo, Janúbia, Vanessa, Val... Ao Antero Silva Ribeiro e Raquel Gouveia dos Santos que acompanharam meu trabalho contribuindo com informações técnicas valiosas. A todos os professores da pós graduação do CDTN/CNEN A Suely Gomes Figueiredo do laboratório de Química de Proteínas da UFV por me receber de forma carinhosa. E a todos do laboratório: Manu, Ju Cassoli, Ju Carnielli, Gigi, Rafael... muito obrigada pela convivência e carinho; Ao Willian da Microanálise do ICEX/UFMG, por toda paciência e pelo excelente trabalho de analise da superfície das minhas células; A professora Jaqueline Leite, do laboratório de Bioquímica Nutricional ICB/UFMG e a Érica pela ajuda no espectrofluorímetro; Ao Zacarias, Geraldinho, Oliene e Dovenir por todo o carinho e ajuda. A equipe do reator (Fausto Moretti Junior, Amir Zacarias Mesquita, Paulo Fernandes de Oliveira, Luiz Otávio I. Sette Câmara, Wagner Souza) pela irradiação das amostras. A Maria Ângela de Barros Correia Menezes, da Radioquímica pelas determinações das concentrações de cádmio incorporadas pelas células; Ângela Maria Amaral pelas análises e também pela simpatia constante e pelos longos papos durante o almoço. Ao Adair e Noil pela grande ajuda com nossos rejeitos de cádmio; Ao Wagner pela simpatia constante e pela paciência com as fotografias das minhas placas;

viii

As bibliotecárias Lenira, Nívea e Virgínia por terem me recebido sempre com muita simpatia e atenção. Aos secretários da pós-graduação: Andréia, Roseli e Fulgêncio; A todas as pessoas do CDTN que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

ix

Resumo

A poluição por metais pesados é um dos mais sérios problemas ambientais da atualidade devido tanto ao aumento de sua aplicação, como de sua natureza imutável. A importância em se estudar os metais, deve-se aos seus intensos efeitos tóxicos para o homem e todos os outros seres vivos. O cádmio é um metal não essencial e representa um grande potencial de danos a seres humanos e ao meio ambiente. A trealose é um dissacarídeo que participa como protetor em microrganismos em diferentes condições de estresses. Neste trabalho foi analisada a influência da trealose em resposta ao estresse oxidativo induzido pelo cádmio em linhagens de Saccharomyces cerevisiae. As linhagens utilizadas neste estudo são deficientes em genes importantes no metabolismo de trealose, na síntese (S. cerevisaie tps1) e na degradação (S. cerevisaie nth1) do dissacarídeo, desta forma foi possível analisar o papel da trealose frente ao estresse induzido pelo cádmio. Inicialmente, analisou-se o crescimento das linhagens em meio líquido com diferentes concentrações de cádmio, onde observou-se inibição no crescimento. A tolerância ao CdCl2 foi realizada através do plaqueamento, verificou-se que não existe formação de colônias em concentração superior a 25ppm. A incorporação de cádmio é maior quando foram usadas células viáveis coletadas na fase logarítmica. A linhagem tps1 possui uma incorporação de cádmio 3 vezes menor quando comparada às demais linhagens. A adição de glutationa reduzida ao meio extracelular não provocou alteração de incorporação de cádmio, porém ao adicionarmos aminoácidos (que formam a glutationa) ocorreu diminuição da incorporação em todas as linhagens. Quanto a formação de radicais livres intracelulares obtivemos que a linhagem tps1, possui um alto nível de oxidação celular mesmo na condição sem cádmio e quando exposta ao mesmo, apresentou um aumento na oxidação apesar de uma incorporação menor do metal que as demais linhagens. Análise da peroxidação lipídica realizada antes e após exposição das células ao cádmio, mostraram danos aos lipídeos. Observamos que células da linhagem nth1 (excesso de trealose) também sofrem esses danos, ou seja, a presença de um excesso de trealose não impediu a presença de danos aos lipídeos. Células da linhagem tps1 apresentaram maior dano lipídico que as demais linhagens evidenciando que, a ausência da trealose deixa os lipídeos mais susceptíveis a alterações deletérias. Procedeu-se também a análise da carbonilação de proteína onde observamos que na presença de cádmio não ocorreu carbonilação de proteínas, apenas a linhagem nth1 na concentração de 800ppm apresentou proteínas carboniladas, fato este relacionado a grande quantidade de radicais livres formados. As três linhagens após exposição à concentração de 50ppm de cádmio, apresentaram um aumento nos níveis de resíduos sulfidrílicos enquanto que na concentração de 800ppm apresentaram queda dos resíduos sulfidrílicos. Os resultados apresentados neste trabalho ajudaram a compreender o papel da trealose em células de S.

cerevisiae frente ao estresse causado pelo cloreto de cádmio. Palavras-chave: Trealose; Estresse oxidativo; Saccharomyces cerevisiae; Cádmio.

x

Abstract

Pollution with heavy metals is one of the most serious environmental problems nowadays, which had in such a way to the increase of its application as, of its imutable nature. The importance of studying metals is directly related to intensive toxic effects to all living beings in our world. Cadmium is a non essential metal and represents a great danger to the human beings and also to the environmental. Trehalose is a disaccharide that participates as a protector in different conditions of stress. In this work the influence of trehalose in oxidative stress induced by cadmium was analyzed in different strains of Saccharomyces

cerevisiae. The strains used in this study were not effective in important genes of the metabolism of trehalose, in the synthesis (S. cerevisaie tps1) and also in the degradation (S.

cerevisaie nth1), so it was possible to analyze the performance of the trehalose in relation to the stress induced for cadmium. Initially the growth with different cadmium concentrations in medium liquid was analyzed, and the growth inhibition was observed. The tolerance to the CdCl2 was carried out by the growth on plates and one could observe that the formation was not present in concentrations up to 25ppm. Cells collected in the logarithmic phase had bigger cadmium incorporation. The strains tps1 presented a lower cadmium incorporation (3 times) when compared with other strains. The addition of reduced glutathione to the extracellular did not cause any alteration of in the cadmium incorporation, however, by adding amino acids, the ones which form glutathione, a reduction of the cadmium incorporation in all the strains occurred. The tps1 strains showed high level of cellular oxidation in control condition (without cadmium), and the cadmium incorporation showed an increase in the oxidation.Analyses of the lipid peroxidation carried out before and after exposition of the cells to cadmium showed damages to the lipids. We observe that cells of the strain nth1 (excess of trehalose) also suffer these damages. The presence of an excess of trehalose protected the lipids. Cells of the strain tps1 presented greater lipidic damage than the other strains, making clear that the absence of trehalose make the lipids more probable to have deleterious alterations. It was also performed a protein carbonilation analysis at cadmium presence and it did not induce a carbonilation of proteins. The stains nth1, whose concentration was 800ppm, presented carbonilated protein due to the high levels of ROS. The three strains after the exposition of 50ppm of cadmium showed an increase while on the concentration of 800ppm, it presented a drop on the levels of sulphydryl residues. The results presented in this work helped to understand the role of trehalose on Saccharomyces

cerevisiae cells during cadmium stress. Key-word: Trehalose; Oxidative stress; Saccharomyces cerevisiae; cadmium.

xi

Lista de Figuras

FIGURA 01 – Formação das espécies reativas de oxigênio. ................................................ 3

FIGURA 02 – Resultado do estresse oxidativo pelo desbalanço entre antioxidantes e ROS.

................................................................................................................................................ 4

FIGURA 03 – Ativação de vias de sinalização em resposta ao estresse oxidativo. .............. 5

FIGURA 04 – Respostas das leveduras às condições de estresses........................................ 7

FIGURA 05 – Possíveis mecanismos de indução de estresse oxidativo por metais

pesados. ................................................................................................................................ 15

FIGURA 06 – Danos aos lipídeos após contato com espécies reativas de oxigênio........... 18

FIGURA 07 – Estruturas dos derivados carbonilados produzidos através da oxidação de

resíduos de aminoácidos das proteínas. ................................................................................ 19

FIGURA 08 – Geração de proteínas carboniladas. ............................................................. 21

FIGURA 09 – Estrutura da trealose, α,α1-1-trealose. ........................................................ 23

FIGURA 10 – Papel da trealose no choque térmico............................................................ 25

FIGURA 11 – Ciclo da Trealose em Saccharomyces cerevisiae. ....................................... 28

FIGURA 12 – Células de Saccharomyces cerevisiae.......................................................... 30

FIGURA 13 – Câmara de Neubeuer.................................................................................... 41

FIGURA 14 – Sonda fluorescente 2,7-diclorofluoresceína................................................. 46

FIGURA 15 – Reagente Ellman.......................................................................................... 49

FIGURA 16 – Esquema “scavenging” do radical DPPH• pelo antioxidante. ..................... 49

FIGURA 17 – Influência de diferentes concentrações de cloreto de cádmio no crescimento

das linhagens WT (A), tps1 (B), e nth1 (C). ......................................................................... 54

FIGURA 18 – Determinação da sobrevivência das células em meio sólido em ausência de

cádmio (A) e presença de 5 ppm (B) e 10 ppm (C) e 25ppm (D) de cloreto de cádmio...... 55

xii

FIGURA 19 – Determinação do cádmio incorporado pelas células das linhagens WT, tps1 e

nth1 coletadas na fase LOGARÍTMICA (A) de crescimento celular, e na fase

ESTACIONÁRIA (B). ......................................................................................................... 58

FIGURA 20 – Determinação de cádmio incorporado pelas células viáveis e não viáveis no

período de 16 horas. Linhagens WT (A), tps1 (B) e nth1 (C)............................................... 62

FIGURA 21 – Incorporação de cádmio em tempos variáveis por células viáveis de

Saccharomyces cerevisiae, WT, tps1 e nth1. ........................................................................ 64

FIGURA 22 – Complexo formado entre cádmio e a glutationa, Bis(glutationato) de cádmio

– Cd(GH)2............................................................................................................................. 65

FIGURA 23 – Incorporação de cádmio durante 16 horas em células não tratadas, tratadas

aminoácidos (aa) e tratadas com glutationa reduzida (GSH) nas linhagens S. cerevisiae WT

(A), S. cerevisiae tps1 (B) e S. cerevisiae nth1 (C). ............................................................. 68

FIGURA 24 – Determinação de cádmio na superfície celular de Saccharomyces cerevisiae

WT em células mortas – Biosorção (A), e em células viáveis – Bioacumulação (B)........... 71


tps1 em células mortas – Biosorção (A), e em células viáveis – Bioacumulação (B).......... 72


nth1 em células mortas – Biosorção (A), e em células viáveis – Bioacumulação (B). ........ 73

FIGURA 27 – Diferença nos níveis de incorporação de cádmio em 16 horas, nos meios

YPGalactose e YPGlicose. Linhagem WT (A) e nth1 (B).................................................... 75

FIGURA 28 – Influência das concentrações de cloreto de cádmio sobre os níveis de

trealose da linhagem S. cerevisiae WT (A) e S. cerevisiae nth1 (B). ................................... 79

FIGURA 29 – Mecanismo de ação das esterases na 2,7-diclorodihidrofluoresceína

diacetato (DCFH-DA) formando 2,7- diclorohidrofluoresceína, e a futura oxidação pela

ROS formando assim a 2,7-diclorofluoresceína (DCF). ...................................................... 80

FIGURA 30 – Determinação do status antioxidante total das diferentes linhagens

Saccharomyces cerevisiae utilizando o radical DPPH•........................................................ 94

xiii

Lista de Tabelas

TABELA 01 – Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas. ...................................38

TABELA 02 – Incorporação de cádmio durante 16 horas por células viáveis de

Saccharomyces cerevisiae (µg Cd incorporado/g peso seco)...............................................63

TABELA 03 – Determinação dos níveis de oxidação intracelular em linhagens de

Saccharomyces cerevisiae ....................................................................................................83

TABELA 04 - Determinação dos níveis de peroxidação de lipídeos (picomoles MDA/mg

proteína/mL) em linhagens Saccharomyces cerevisiae........................................................86

TABELA 05 – Determinação dos níveis de carbonilação de proteínas (nanomoles/mg

proteína/mL) em linhagens de Saccharomyces cerevisiae. ..................................................89

TABELA 06 – Determinação dos níveis resíduos sulfidrílicos totais (µmoles/mg

proteína/mL) em linhagens de Saccharomyces cerevisiae. ..................................................92

xiv

Lista de Abreviaturas

µµµµg micrograma µµµµL microlitro mL mililitro mg miligrama nm Nanômetro aa Aminoácido Abs. Absorbância Al Alumínio Arg Arginina BER Base Excision repair BSA Soro albumina bovina CaCl2 Cloreto de cálcio Cd Cádmio CdCl2 Cloreto de cádmio Cd(GS)2 Complexo bis (glutationato) de cádmio CdSO4 Sulfato de cádmio CDTN Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear CNEN Comissão Nacional de Energia Nuclear Cu Cobre Cys Cisteína Da Dalton DCH diclorofluoresceína DCFH 2,7 – diclorofluoresceína DCFH-DA 2,7 – diclorohidrofluoresceína diacetato DNA Ácido desoxiribonucléico DNP 2,4 Dinitrofenilhidrazona DNPH 2,4 Dinitrofenilhidrazina D.O. Densidade óptica DPPH α,α-difenil-β-picrylladrazil DTNB 5’5-ditiobis-2-ácido nitrobenzóico ERK Kinase regulada por sinais oxidativos extracelulares EDS Espectometria por dispersão de energia (Energy Dispersive Espectrometer) EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético Fe Ferro Glu Ácido glutâmico GME glutationa monoetil éster GSH Glutationa reduzida GSH1 α-glutamilcisteína sintase GSH2 Cistenilglicina dipeptidase GSSG Glutationa oxidada HCl Ácido Clorídrico Hg Mercúrio HNE Hidroxinoneal His Histidina

xv

H2O2 Peróxido de hidrogênio HSP Proteínas de choque térmico (heat shock proteins) IPEN Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares JNK Kinase c-jun amino-terminal kJ Kilo Joule Lys Lisina MAPK Proteína kinase ativada por mitógeno MDA Malondialdeído MMR Mistmach repair

Mn Manganês MT Metalotioneína NADPH Nicotinamida Adenina Nucleotídeo Fosfato (forma reduzida) Na2CO3 Carbonato de sódio NER Nucleotide excision repair Ni Níquel nth1∆∆∆∆ Células deficientes de trealase neutra Pb Chumbo PMSF Phenylmethysulphonylfluoride

ppm Partes por milhão Pro Prolina PUFA Ácidos graxos polinsaturados O2 Molécula de oxigênio O2

- Ânion superóxido O3 Ozônio OH•••• Radical Hidroxil RNA Ácido ribonucleico ROS Espécies reativas de oxigênio (Reactive oxygen species) r.p.m Rotação por minuto Se Selênio TBA Ácido Tiobarbitúrico TBARS Espécies que reagem com ácido tiobarbitúrico (thiobarbituric acid reagent

species) TCA Ácido Tricloracético Thr Treonina tps1∆∆∆∆ células deficientes de trealose-6-fosfato sintase Zn Zinco YPGalactose Meio contendo peptona, estrato de levedura e galactose YPGlicose Meio contendo peptona, estrato de levedura e glicose

xvi

Sumário

Agradecimentos ...................................................................................................................vi

Resumo .................................................................................................................................ix

Abstract .................................................................................................................................x

Lista de Figuras ...................................................................................................................xi

Lista de Tabelas .................................................................................................................xiii

Lista de Abreviaturas........................................................................................................xiv

Sumário ..............................................................................................................................xvi

1 - Introdução........................................................................................................................ 1

1.1 – Espécies reativas de oxigênio e estresse oxidativo.................................................... 2

1.2 – Defesas Antioxidantes ............................................................................................... 8

1.3 – Bioremediação ........................................................................................................... 8

1.4 – Cádmio .................................................................................................................... 11

1.5 – Cádmio como causador de estresse oxidativo ......................................................... 13

1.6 – Danos causados pelas ROS ..................................................................................... 16

1.6.1 – Peroxidação de Lipídeos................................................................................... 16

1.6.2 – Carbonilação de proteínas ................................................................................ 19

1.6.3 – Danos ao DNA ................................................................................................. 21

1.7 – Trealose ................................................................................................................... 22

1.8 – Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo................................................ 28

2 - Justificativa .................................................................................................................... 31

3 - Objetivos ........................................................................................................................ 33

3.1 - Objetivo geral ........................................................................................................... 34

3.2 - Objetivos específicos ............................................................................................... 34

xvii

4 - Estratégia Experimental ............................................................................................... 35

5 - Materiais e Métodos ...................................................................................................... 37

5.1 - Microrganismo Utilizado ......................................................................................... 38

5.2 - Meios de cultura ....................................................................................................... 38

5.3 - Manutenção das linhagens em laboratório ............................................................... 38

5.4 – Estresse com cloreto de cádmio .............................................................................. 39

5.5 – Obtenção de extratos celulares ................................................................................ 40

5.6 - Dosagem de proteínas .............................................................................................. 40

5.7 - Curva de crescimento ............................................................................................... 40

5.8 - Tolerância ao cádmio ............................................................................................... 41

5.9 - Dosagem de Trealose ............................................................................................... 42

5.10 - Extração da trealase do Humicola grisea var. thermoidea .................................... 42

5.11 - Determinação de cádmio incorporado pelas células .............................................. 43

5.12 - Preparação das amostras para determinação do cádmio incorporado .................... 44

5.13 - Incorporação de CdCl2 na presença de Glutationa reduzida adicionada ao meio.. 44

5.14 - Determinação de cádmio na superfície celular ...................................................... 45

5.15 - Determinação da oxidação intracelular .................................................................. 45

5.16 - Carbonilação de Proteínas...................................................................................... 46

5.17 - Peroxidação de lipídeos.......................................................................................... 47

5.18 - Resíduos Sulfidrílicos Totais ................................................................................. 48

5.19 - Determinação do status antioxidante total pelo radical DPPH .............................. 49

5.20 – Descarte de Rejeitos .............................................................................................. 50

5.21 - Análise Estatística .................................................................................................. 50

6 - Resultados e Discussão.................................................................................................. 51

xviii

6.1 – Curva de crescimento e tolerância ao cádmio ......................................................... 52

6.2 - Determinação da incorporação de cádmio nas diferentes fases de crescimento

celular ............................................................................................................................... 56

6.3 - Determinação de cádmio incorporado pelas células viáveis e não viáveis .............. 59

6.4 – Determinação de incorporação de cádmio em células suplementadas com glutationa

reduzida e aminoácidos .................................................................................................... 65

6.5 – Determinação de cádmio na superfície celular........................................................ 69

6.6 - Determinação da incorporação de cádmio em meio suplementado com galactose e

glicose............................................................................................................................... 74

6.7 – Síntese de trealose em resposta à presença de cádmio ............................................ 76

6.8 – Determinação do nível da oxidação intracelular ..................................................... 80

6.9 – Determinação dos níveis de peroxidação lipídica ................................................... 84

6.10 - Carbonilação de Proteína ....................................................................................... 87

6.11 – Resíduos Sulfidrílicos Totais................................................................................. 90

6.12 - Determinação do status antioxidante total das linhagens pelo radical DPPH........ 93

7 – Conclusão ...................................................................................................................... 95

8 - Referências Bibliográficas ............................................................................................ 97

Papel da trealose na proteção durante o estresse oxidativo causado por cádmio e a resposta adaptativa a este

estresse em Sacchamoryces cerevisiae

1

1 - Introdução


estresse em Saccharomyces cerevisiae

2

1.1 – Espécies reativas de oxigênio e estresse oxidativo

As moléculas de oxigênio diatômico na atmosfera terrestre são as maiores

promotoras de reações redox nas células vivas. A molécula de O2 é a principal receptora

biológica de elétrons e desempenha importante papel nas funções celulares, incluindo o

processo de respiração aeróbica. Exceto para aqueles organismos que são especialmente

adaptados a viverem sob condições anaeróbicas todos os seres vivos, como os animais,

plantas e microrganismos requerem oxigênio para uma eficiente produção de energia. O

surgimento do oxigênio deve ter sido acompanhado pelo aparecimento da camada de

ozônio (O3) na alta atmosfera, com a conseqüente absorção da radiação ultravioleta (UV)

pela camada de ozônio, evitando assim, os efeitos nocivos da radiação UV. Tal situação

provavelmente permitiu a evolução dos organismos terrestres mais complexos.

(HALLIEWELL, 1989).

Normalmente, em torno de 98% do oxigênio absorvido pelos organismos aeróbicos

é reduzido através da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria, no processo

conhecido por fosforilação oxidativa, onde ocorre à redução do O2 pelo sistema citocromo

oxidase, fornecendo simultaneamente quatro elétrons para o oxigênio, que se reduz

diretamente à água (HALLIEWELL, 1989). Entretanto, juntamente com as propriedades

benéficas do O2, tem-se à formação de espécies reativas de oxigênio (do inglês Reactive

Oxygen Species, ou seja, ROS), que incluem o ânion superóxido (O2-), peróxido de

hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (OH•). A diferença das ROS, para a molécula de

oxigênio é que elas possuem um ou mais elétrons, não pareados. (Figura 01) (KILEY et al.,

2004).



3

FIGURA 01 – Formação das espécies reativas de oxigênio. Adaptado de: KILEY et al., 2004.

Os radicais livres tais como O2•-, e OH• e o não radical H2O2, são produzidos em

todos os organismos aeróbicos, e normalmente existem na célula em um balanço com

moléculas antioxidantes. De acordo com esta visão, o estresse oxidativo ocorre quando este

balanço é interrompido devido à depleção de antioxidantes ou acúmulo de ROS (Figura

02). A formação de ROS pode ser acelerada como conseqüência de várias condições de

estresse do meio, incluindo radiação UV, alta intensidade de luz, exposição a herbicidas,

temperaturas extremas, toxinas, poluentes e metais (SCANDALIOS, 2005).

Avanços nos estudos da ação das ROS levaram a uma nova definição do estresse

oxidativo que considera o papel vital das ROS como moléculas sinalizadoras, responsáveis

pela modulação de vias de transdução de sinais, do balanço redox e de seus controles

(JONES, 2006). Alterações no controle redox e na sinalização podem ocorrer com ou sem

mudança no balanço total dos oxidantes e antioxidantes. Por exemplo: agentes redox como

metais podem romper seletivamente vias de sinalização, e a adição de antioxidantes não



4

mudará este panorama, inclusive dependendo da concentração, alguns antioxidantes podem

se tornar um pro-oxidante em total antagonismo à definição antiga de desbalanço entre

oxidantes e antioxidantes (HANSEN et al., 2006)

FIGURA 02 – Resultado do estresse oxidativo pelo desbalanço entre antioxidantes e ROS. Fonte:

SCANDALIOS, 2005.

As espécies reativas de oxigênio participam também da comunicação bioquímica

das células e organismos (GHEZZI et al., 2005). As ROS atuam em vias de sinalização

especificas, localizadas tanto na resposta ao estresse, como em processos fisiológicos

normais (INOUNE et al., 2004; WU et al., 2005). Entre as principais vias de sinalização ao

estresse oxidativo estão as ERK (kinase regulada por sinais oxidativos extracelular), JNK

(kinase c-jun amino-terminal) e p38 ativada por MAPK (proteína kinase ativada por

mitógeno) e a resposta ao choque térmico. A ativação destas vias não é exclusiva do

estresse oxidativo, elas também participam na regulação das respostas celulares a outros



5

estresses, bem como da regulação do metabolismo e do crescimento normal. Em muitas

situações a resposta aos oxidantes pode envolver uma super estimulação das vias de

sinalização normais regulada pelas ROS (Figura 03) (FINKEL et al., 2000).

FIGURA 03 – Ativação de vias de sinalização em resposta ao estresse oxidativo. Fonte: FINKEL et

al., 2000.

A geração de ROS pode ocorrer através de um grande número de processos

fisiológicos e não fisiológicos, sendo um produto normal do metabolismo celular. Estudos

comprovam que a maior fonte intracelular de ROS é a mitocôndria. A produção de radicais

ocorre principalmente em dois pontos da cadeia de transporte de elétrons, chamadas de

complexo I (NADH desidrogenase) e o complexo III (ubiquitina – citocromo c redutase)

(TURRENTS, 1997). As ROS podem causar danos a vários tipos de moléculas biológicas,

são os chamados danos oxidativos às proteínas, lipídios ou DNA, que podem ser seriamente

deletérios. (DALLE-DONNE et al., 2003). Os danos causados a estes componentes

celulares causam a perda de suas funções, podendo assim levar a morte celular (PEREIRA



6

et al., 2003). Recentemente, o estresse oxidativo tem sido um grande foco de estudos

devido a sua correlação com várias doenças letais. Dentre estas encontra-se o câncer,

desordens neurodegenerativas e também o envelhecimento, considerado como um processo

normal e inevitável de acúmulo de ROS nos seres vivos (FINKEL et al., 2000).

Vários estudos demonstram que metais como ferro, cobre, cádmio, cromo,

mercúrio, níquel e vanádio possuem habilidades em produzir radicais livres de forma direta

ou indireta, resultando assim em danos celulares (VALKO et al., 2005). Brennan e

colaboradores (1996) demonstraram que a exposição de células da levedura Saccharomyces

cerevisiae ao cádmio provocava estresse oxidativo. Entretanto o mecanismo pelo qual isto

ocorria, ainda não era bem conhecido uma vez que o cádmio não gera diretamente o

estresse oxidativo. Aparentemente o metal monopoliza as defesas celulares e interfere com

os mecanismos de reparo da levedura.

Células de leveduras submetidas a diferentes condições de estresse, tais como:

choque térmico, exposição ao etanol, metais pesados, alta osmolaridade e oxidantes

apresentam um mecanismo comum de defesa (Figura 04). Atualmente, sabe-se que o

aumento da produção de ROS, devido à exposição das células a diferentes formas de

estresses, estaria envolvido com ativação da resposta celular e aquisição de tolerância

contra um eventual estresse oxidativo severo (COSTA et al., 2001). Normalmente, a

levedura Saccharomyces cerevisiae responde a diferentes fontes de estresse oxidativo com

alterações nas defesas antioxidantes, sejam enzimáticas e/ou não enzimáticas. Assim, na

presença de cádmio, ocorre um aumento de atividade das enzimas glutationa peroxidase e

superóxido dismutase, enzimas responsáveis pela detoxificação de radicais livres gerados

(LIU et al., 2005). Células expostas à menadiona, gerador de radical livre intracelular,

apresentam aumento nos níveis de superóxido dismutase e glutationa redutase (CYRNE et

al., 2003).



7

FIGURA 04 – Respostas das leveduras às condições de estresses. Fonte: COSTA et al. (2001).



8

1.2 – Defesas Antioxidantes

As células possuem sistemas de defesa antioxidantes conhecidos como: enzimáticos

e não enzimáticos que, são necessários para proteger seus constituintes celulares, e manter

o estado redox da célula. O sistema de defesa não enzimático consiste tipicamente de

pequenas moléculas que são solúveis em qualquer meio aquoso ou, em alguns casos, em

meios lipídicos. Eles agem em geral, como “scavenging” de radicais e removem os

oxidantes da solução (HALLIWELL et al., 1993).

As defesas antioxidantes enzimáticas incluem a atividade da superóxido dismutase

(SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa

S-tranferase (GTS). Para minimizar os efeitos tóxicos dos radicais livres formados, é

necessário um adequado equilíbrio das enzimas antioxidantes citadas acima

(SCANDALIOS, 2005).

Dentre as defesas não enzimáticas, o mais conhecido exemplo é a glutationa, um

tripeptídeo (L-γ-glutamil -L- cistinilglicina). A glutationa reduzida (GSH) apresenta um

grupo sulfidril com ação redox, reagindo com oxidantes para produção de glutationa

oxidada (GSSG). A glutationa é possivelmente a mais abundante molécula “scavenger” -

redox nas células (MARCHLER et al., 1993) e conseqüentemente é a substância mais

importante na manutenção do estado redox celular. Os genes envolvidos na biossíntese da

GSH já foram identificados em S. cerevisiae são: GSH1 e GSH2, que codificam a γ-

glutamilcisteína sintetase e glutationa sintetase, respectivamente (OHTAKE et al.,1991)

1.3 – Bioremediação

A poluição por metais pesados representa um importante problema ambiental

devido aos efeitos tóxicos dos metais. O acúmulo de metais nos vários elos da cadeia

alimentar pode acarretar sérios problemas ecológicos e de saúde (MALIK et al., 2004).

Existe um crescente entendimento que a contaminação por metais no meio ambiente

funcione como um agente seletivo na proliferação da resistência à antibióticos. Associação

entre tipos e níveis de contaminação metálica e vias específicas de resistência a antibióticos



9

sugerem que muitos mecanismos sofreram um processo de co-seleção. Assim, a

contaminação por metais representa a persistência por longo tempo de uma pressão seletiva

que potencialmente contribui para a manutenção e a propagação da resistência a

antibióticos (BAKER-AUSTIN et al., 2006).

Altos níveis de metais pesados no meio ambiente estão associados com atividades

antropogênicas. Este tipo de poluição geralmente diminui a biodiversidade nos

ecossistemas terrestres e aquáticos. Para sobreviver à exposição ao metal, a bactéria ou

fungo desenvolveram numerosos mecanismos de resistência. Fungos podem sequestrar,

mobilizar ou transformar vários íons. Assim, esses microrganismos podem ser usados para

reduzir o impacto ambiental causado pelos metais. Aplicações potenciais da bioremediação

tem renovado o interesse do efeito dos metais em fungos (BRAHA et al., 2007).

Para remoção de metais pesados de efluentes industriais são usados métodos

convencionais tais como precipitação, separação por membranas, filtração e extração de

íons. Esses métodos convencionais possuem significativas desvantagens, incluindo a

remoção incompleta, equipamentos de alto custo, sistemas de monitoramento, gasto de

energia, geração de lodo tóxico, entre outros. Estas desvantagens dos sistemas

convencionais, junto com a necessidade de economia e eficiência dos métodos de remoção

de metais, têm resultado no desenvolvimento de novas tecnologias de tratamento de

efluentes (GÖKSUNGUR et al., 2005). Decorrente destes problemas tornou-se necessário o

desenvolvimento de alternativas tecnológicas eficientes na remoção destes poluentes do

meio ambiente.

A bioremediação tem recebido uma grande atenção recentemente, não apenas como

novidade cientifica, mas principalmente como uma eficiente tecnologia de tratamento de

aplicação industrial. Microrganismos, incluído algas (ROMERA, et al., 2006;

KADUKOVÁ, et al., 2005), bactérias, fungos filamentosos e leveduras (KAPOOR, et al.,

1995; GÖKSUNGUR, et al., 2005) são eficientes bioremediadores, removendo metais

através de mecanismos ativos e passivos denominados respectivamente, bioacumulação e

biosorção.

A biosorção e a bioacumulação são técnicas que usam organismos biológicos

adequados para a remoção de metais de efluentes. As grandes vantagens destes métodos são



10

o baixo custo de operação, diminuição do volume de lodo biológico gerado e

principalmente a alta eficiência na detoxificação de efluentes muito diluídos, abaixo de

100ppm (KADUKOVÁ et al., 2005)

A biosorção ou bioadsorção é uma forma passiva de imobilização de metais pela

biomassa. O mecanismo de sorção na superfície celular é independente do metabolismo da

célula; eles são baseados em interações entre o metal e grupos funcionais presentes na

parede celular. A parede celular dos microrganismos consiste principalmente de

polissacarídeos, lipídeos e proteínas que são os principais sítios de ligação dos metais.

(KADUKOVÁ et al, 2005)

A bioacumulação é o acumulo intracelular dos metais. Este processo envolve a

ligação dos metais em componentes superficiais, transporte para dentro da célula e, fixação

em componentes citoplasmáticos ou, vacuolares (KADUKOVÁ et al., 2005). No interior da

célula os metais podem se ligar a várias espécies moleculares ou componentes celulares. As

ligações mais comuns são as realizadas com as metalotioneínas (proteínas com vários

resíduos SH disponíveis para a ligação com o metal) e a glutationa (tripeptídeo formado por

cisteína, ácido glutâmico e glicina). O metal também pode ser transportado e ficar

sequestrado em vacúolos.

Na bioacumulação, o acúmulo de metais pela célula depende do metabolismo desta,

portanto a célula deve estar viva. Entretanto, para a biosorção a célula pode estar morta

pois, a ligação será feita em grupamentos químicos da parede celular. Outra grande

diferença entre os processos de bioacumulação e biosorção são, as cinéticas e os valores de

energia de ativação. A energia de ativação necessária para a biosorção é cerca de 21kJ/mol,

de acordo com a natureza física do processo. A energia de ativação para bioacumulação é

cerca de 63kJ/mol, que corresponde aos processos bioquímicos (KADUKOVÁ et al, 2005).

A biosorção é um processo mais rápido, independente de nutrientes específicos, não é

necessária a regulação de pH e temperatura, enquanto a bioacumulação é lenta e

dependente de nutrientes específicos (KAPOOR et al, 1995).

Fungos e leveduras podem acumular micronutrientes, tais como Cu, Zn e Mn, e

metais não nutrientes, tais como U, Ni, Cd, Sn, Hg (KAPOOR et al, 1995). O potencial da



11

biomassa de fungos como adsorventes para a remoção de metais de efluentes poluídos tem

sido analisadas em vários estudos (GÖKSUNGUR et al., 2005; KAPOOR et al., 1995)

1.4 – Cádmio

O termo metal pesado vem sendo aplicado a um grupo heterogêneo de elementos

incluindo metais, semi-metais e não metais que possuem numero atômico maior que 20 ou,

peso específico maior que 5 g cm3. Alguns deles são nutrientes essenciais aos organismos,

como o Cu, Fe, Mn, Ni e Zn, Se, são também conhecidos por elementos traços ou, metais

traços por serem encontrados em concentrações de poucas partes por milhão. Outros metais

são considerados não essenciais ou, não apresentam funções, tais como Cd, Al, Hg e Pb

(MELO et al., 1997).

A importância de se estudar estes metais, deve-se aos seus intensos efeitos tóxicos

para o homem e, todos os outros seres vivos, associados a sua ampla liberação no ambiente.

Com o aumento das atividades industriais, a poluição do ambiente com metais pesados

tóxicos têm ocorrido em todo o mundo, levando a deterioração de vários ecossistemas

(DÖNMEZ et al., 1999). De todos os metais poluentes, o cádmio é um dos mais tóxicos

para os seres humanos, animais, plantas e tem apresentado elevadas taxas de emissão no

ambiente nas últimas décadas (KEFALA et al., 1998). O cádmio é um metal do grupo IIB

na tabela periódica e não tendo qualquer função fisiológica no organismo biológico, com a

única exceção conhecida, da enzima anidrase carbônica da alga Thalassiosira weissflogi

que é dependente do metal (LANE et al., 2005).

Em 2005, o cádmio foi o 8º classificado na lista de “Substâncias Perigosas” da

ATSDR (Agency for Toxic Susbstances and Disease Registry), do CERCLA

(Comprehensive Ennvioremental Response, Coompensation and Liability Act) juntamente

com a classificação na EPA (Ennviromental Protection Agency). As substâncias são

classificadas de acordo com sua toxidade, potencial de risco à saúde e exposição destes aos

organismos vivos (ATSDR, 2007).

Geralmente, as contaminações ambientais pelo cádmio são resultantes de atividades

como mineração, metalurgia e uso de manufaturados industriais como, baterias e pilhas de



12

níquel-cádmio, pigmentos, estabilizantes plásticos e de produtos anticorrosivos. A

intoxicação humana ocorre principalmente por fumantes, devido a altas concentrações de

cádmio em cigarros, mas também através da água, alimentos e contaminação do ar

(BERTIN et al., 2006).

Em geral, o cloreto de cádmio e o acetato de cádmio são os mais absorvidos e mais

tóxico que outros compostos (ATSDR, 2007). Como medida de segurança, nos EUA o

nível seguro de cádmio na água para consumo humano é de 10ppb (parte por bilhão). No

Brasil a concentração permitida pelo Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA)

varia de 40ppb à 1 ppb, dependendo da classe de água. Por exemplo: para a água classe 1

(água destinada ao abastecimento doméstico após tratamento simplificado, recriação de

contato, irrigação de hortaliças, criação natural e/ou intensiva de espécies destinadas à

alimentação humana) o limite permitido de cádmio é de 1ppb enquanto para água classe 3

(água destinada ao abastecimento doméstico após tratamento convencional, irrigação de

culturas arbóreas e dessendentação de animais), o limite permitido é de 10 ppb – Resolução

nº 357 – CONAMA (CONAMA, 2007)

O cádmio é um potente carcinogênico humano, sua exposição ocupacional tem sido

associada com câncer de pulmão, próstatas, pâncreas e rins. Devido a sua característica

como um carcinogênico de pulmão (WAISBERG et al., 2005), é classificado na categoria

carcinogênico 1 (carcinogenese humana) pelo International Agency for Research on Cancer

(INARC) (American Cancer Society, 2007).

O mecanismo ou mecanismos de carcinogênese do cádmio não são bem

conhecidos. Vários modelos celulares têm sido desenvolvidos para definir o potencial

carcinogênico deste metal. O cádmio não é um metal redox ativo, produzindo estresse

oxidativo de forma indireta, que pode resultar indiretamente no ataque ao DNA. Os fatores

que contribuem para oncogenicidade do cádmio incluem: ativação de genes aberrantes,

repressão da apoptose e/ou alteração dos reparos de DNA (WAALKES, 2003).

Estudos recentes comprovaram as mudanças que o cádmio causam no metabolismo

de plantas (DECKERT, 2005) e, em microrganismos como leveduras e bactérias. Estas

mudanças levam a inibição do crescimento e a síntese de vários compostos com a função de



13

combater a toxidade, tais como metalotioneinas (LIU et al., 2005), glutationa, além de

várias enzimas como superóxido dismutase e glutationa peroxidase (LIU et al., 2005).

1.5 – Cádmio como causador de estresse oxidativo

Muitos estudos têm apresentado os efeitos tóxicos e carcinogênicos induzidos em

humanos e animais expostos a certos metais (Figura 05). É bem conhecido, que vários

metais de transição tais como: zinco, ferro, cobre, cobalto e manganês participam do

controle de várias vias metabólicas e de sinalização. De acordo com suas coordenações

químicas e propriedades redox, os metais não essenciais são capazes de mimetizar metais

essenciais sendo transportados, compartimentalizados em tecidos e constituintes celulares,

promovendo alterações na homeostase celular e nos mecanismos de controle. A ruptura

desses mecanismos de controle pode levar os metais não essenciais a se ligarem à diversas

proteínas e ao DNA. O acúmulo de informação com metais não essenciais na literatura

evidencia o fato que metais tóxicos e carcinogênicos são capazes de interagir com proteínas

nucleares e DNA, causando deterioração oxidativa das macromoléculas biológicas

(VALKO et al., 2005).

De acordo com Ercal e colaboradores (2001), metais pesados causam estresse

oxidativo; metais como ferro e cobre, participam de reações redox, doando ou recebendo

elétrons e são diretamente ligados a formação de radicais livres pela reação de Harber

Weiss e Fenton. Metais como cádmio, chumbo, arsênico e mercúrio são metais não redox e

causam um aumento do estresse oxidativo de forma indireta, através dos danos causados no

sistema de defesa antioxidante.

O cádmio tem múltiplos efeitos na célula (WAISBERG et al., 2003). Os

mecanismos propostos para a indução de estresse oxidativo pelo cádmio são classificados

em quatro grupos: 1) efeitos adversos do cádmio no sistema de defesa celular e status tiol;

2) peroxidação de lipídeos; 3) efeitos deletérios do cádmio nas enzimas celulares (ERCAL

et al., 2001) e 4) alterações no DNA (BERTIN et al., 2006)

De acordo com Bertin e colaboradores (2006), a intoxicação por cádmio causa

modificação nos níveis de expressão de muitas proteínas que respondem ao estresse, tais



14

como as proteínas de choque térmico (do inglês Heat Shock Proteins, ou HSPs). As HSPs

são proteínas celulares que podem ser induzidas por alterações na temperatura e também

como resposta à várias situações de estresse, incluindo a exposição ao cádmio. A indução

da HSPs é geralmente considerada como uma resposta adaptativa das células ao estresse,

assim como a sobrevivência celular, ou seja, a indução de HSPs após exposição ao cádmio

está ligado ao aumento do estresse oxidativo.

Estresse oxidativo em sistemas biológicos exclui a formação de diferentes espécies

reativas do oxigênio. Devidos às suas propriedades redox alguns metais como Fe+2 e Cu+2

catalisam a formação de ROS. Em contraste, metais sem esta capacidade redox como o

Cd+2 agem principalmente influenciando o status redox da célula reduzindo os níveis de

glutationa. Tióis são essenciais para a sinalização redox das células e são submetidos a

grandes controles em animais, plantas e fungos (POCSI et al., 2004).

De acordo com Baudouin-Cornu e colaboradores (2006), outra hipótese para a

toxidade do cádmio é a depleção de glutationa do citosol. A via de detoxificação do cádmio

envolve a quelação de glutationa e subseqüentemente, o transporte do complexo Cd(GS)2

para o vacúolo, assim contribuindo para a diminuição da glutationa livre no citosol. Como

conseqüência pode haver redução da atividade de enzimas dependentes de glutationa, tais

como glutationa peroxidase, glutationa S-tranferase e glutaredoxinas, que são envolvidas na

defesa do estresse oxidativo e outras funções essenciais das células.

A peroxidação de lipídeos tem sido bastante proeminente na exposição ao cádmio.

Reações de peroxidação de lipídeos após a exposição ao Cd não são totalmente conhecidas,

mas acredita-se que distúrbios nas concentrações de GSH (glutationa) e MT

(metalotioneina) permitam que radicais livres, tais como radical HO• e O2•, ataquem a

“dupla ligação” dos lipídeos de membrana e resultem assim em um aumento na

peroxidação de lipídeos. Esses trabalhos concluíram que o cádmio causa estresse oxidativo

de forma indireta, por meio da diminuição das defesas antioxidantes enzimáticas e não

enzimáticas.



15

FIGURA 05 – Possíveis mecanismos de indução de estresse oxidativo por metais pesados. Fonte:

ERCAL, et al., 2001.

Metal Tóxico

Danos as defesas

antioxidantes

Depleção dos grupamentos

tiois

ROS

Peroxidação de

Lipídeos

Oxidação de Ácidos

Nucleicos

Oxidação de proteínas

Danos na

membrana

Perda da função das proteínas

MORTE

CELULAR

CARCINOGENESE

MUTAGENICIDADE

LIPÍDEOS DNA PROTEÍNAS



16

1.6 – Danos causados pelas ROS

A exposição de células a fontes geradoras de radicais livres, provoca danos muitas

vezes irreparáveis ao DNA e às membranas, neste caso tornando-se letal para as células.

Estes radicais também pode atacar moléculas de DNA, RNA, lipídeos e proteínas (FARR et

al., 1991). Os danos causados a estes componentes celulares causam a perda de suas

funções, podendo assim levar a morte celular (PEREIRA et al., 2003). Abaixo são descritos

de maneira breve a peroxidação de lipídeos, carbonilação de proteínas e alterações no

DNA.

1.6.1 – Peroxidação de Lipídeos

A peroxidação de lipídeos ocorre quando um componente pró-oxidante reage com

um ácido graxo insaturado da membrana biológica; sua modificação causa mudança nas

propriedades físicas e químicas das membranas, alterando assim a fluidez e a

permeabilidade com conseqüente aumento no risco de ruptura da membrana. Desta forma, a

determinação dos níveis de lipídeos peroxidados das membranas celulares também é

considerada uma forma de monitoramento do estresse oxidativo sofrido pela célula. As

modificações no estado redox do lipídeo podem também afetar propriedades específicas da

membrana, tais como transdução de sinais e alterações na permeabilidade íonica (Figura

06) (VENDEMIALE et al, 1999).

O processo de peroxidação de lipídeos é uma reação em cadeia dirigida por um

radical livre que pode induzir a oxidação de um grande número de moléculas lipídicas

(LH), principalmente fosfolipídeos contendo ácidos graxos polinsaturados (PUFA). Os

ácidos graxos monoinsaturados e saturados são menos reativos, mas também podem sofrer

oxidação.

O processo de peroxidação lipídica é iniciado por um radical (R•), com a abstração

de um elétron do átomo de hidrogênio de um PUFA (reação a).



17

LH + R• → L•+ RH (Reação a)

Rapidamente uma molécula de oxigênio adiciona-se a este radical lipídico formando um

radical livre centrado no carbono (L•) levando posteriormente, a formação de um radical

peróxi-lipídico (reação b).

L• + O2 → LOO• (Reação b)

Este por sua vez, pode abstrair um hidrogênio de outra PUFA, similar a equação (a)

LH + LOO• → L• + LOOH (Reação c)

A reação c, chamada de propagação, resulta na conversão de vários moléculas de

PUFA à lipídeos hidroperóxidos. O lipídeo hidroperóxido (LOOH) é o primeiro produto da

reação de peroxidação de lipídeo. Sob condições onde a peroxidação de lipídeo é

continuamente iniciada, a terminação da reação leva a formação de produtos não radicais

(PNR) e destruição de dois radicais ao mesmo tempo. Estes produtos (PNR), conhecidos

como produtos secundários, não são inócuos, pelo contrário, são bem reativos e podem

atacar outras proteínas, lipídeos e o DNA.

LOO• + LOO• → PNR (Reação d)

Na presença de metais de transição, o LOOH pode aumentar a geração de radicais

capazes de reiniciar a peroxidação de lipídeos pelo ciclo redox de alguns metais. Os

lipídeos hidroperóxidos, na ausência ou presença de metais também podem gerar uma

grande variedade de produtos, incluindo aldeídos de cadeias curtas e longas (CATALÁ,

2006).

Uma vez formado, o radical peroxil (ROO•) pode também se rearranjar via reação

de ciclização com endoperóxidos (precursores do malondialdeído) com o produto final do



18

processo de peroxidação, formando o malondialdeído (MDA), que pode causar danos ao

reagir com as bases de DNA (MARNETT, 1999). Outro aldeído produzido através do

processo de peroxidação de lipídeos é o 4 hidroxi-2-noneal (HNE) que é um mutagênico

fraco mas, aparece como o principal produto tóxico da peroxidação de lipídeos (VALKO et

al., 2006).

Os produtos formados pela peroxidação de lipídeos são altamente reativos, e

disseminam e intensificam os efeitos dos radicais livres por meio de danos ao DNA e

proteínas (COSTA et al., 2001).

FIGURA 06 – Danos aos lipídeos após contato com espécies reativas de oxigênio. Fonte: VALKO

(2006).



19

1.6.2 – Carbonilação de proteínas

As proteínas podem ser modificadas por um grande número de reações envolvendo

espécies reativas de oxigênio (ROS) que estão presentes em poluentes na atmosfera, tais

como metais ou, geradas como um produto de um metabolismo celular normal formados

durante a exposição a agentes como radiação ultravioleta (STADTMAN et al., 2003). As

ROS podem causar graves e irreversíveis danos às biomoléculas, sendo as proteínas os

principais alvos dos danos oxidativos (DALLE-DONNE et al., 2003).

Grupos carbonilas (aldeídos e cetonas) são gerados nas proteínas pela oxidação dos

grupamentos laterais, principalmente os resíduos prolina, arginina, lisina e treonina. Os

derivados gerados pela oxidação destes aminoácidos são quimicamente estáveis, são de

fácil detecção e possuem um fácil armazenamento para as amostras (Figura 07) (DALLE-

DONNE et al., 2003).

FIGURA 07 – Estruturas dos derivados carbonilados produzidos através da oxidação de resíduos

de aminoácidos das proteínas. Adaptado: DALLE-DONE et al., 2003

A oxidação por radicais livres de vários aminoácidos resulta da formação de grupos

carbonil nas proteínas. Devido a extensão desta reação, os grupos carbonilas são

comumente usados como indicadores para avaliação da intensidade do ataque de ROS nas

proteínas (STADTMAN et al., 2000)

O aumento de proteínas carboniladas em resposta ao estresse oxidativo não ocorre

ao acaso, muitas proteínas são mais susceptíveis a carbonilação do que outras (DALLE-



20

DONNE et al., 2006). Segundo Standman (2000, 2003), a presença de metais de transição

nestas proteínas são a chave para uma maior susceptibilidade e portanto, podem sofrer

maior carbonilação via oxidação catalisada por metais. Os metais de transição em proteínas,

são fontes de radicais livres que iniciam a cascata de reações resultando na adição de

grupos carbonil aos resíduos de aminoácidos da cadeia proteica. Acredita-se ainda que

muitas proteínas, como por exemplo, enzimas que atuam no ciclo de Krebs e na cadeia de

transporte de elétrons, podem também ser susceptíveis à oxidação principalmente por

estarem localizadas na mitocôndria, um dos principais sítios geradores de espécies reativas

de oxigênio (NYSTRÖM, 2005).

Além da reação das ROS especificamente com resíduos dos aminoácidos das

proteínas, os grupos carbonil (CO) podem também ser introduzidos nas proteínas através de

reações secundárias dos sítios de cadeias nucleofílicas de resíduos Cys, His e Lys, com

produtos da peroxidação de lipídeos (4-hidroxi-2-noneal, malondialdeído), com a reação de

redução de açúcares ou ainda, os produtos da redução de açúcares podem se ligar aos

resíduos de lisina das proteínas (Figura 08) (DALLE-DONNE et al., 2003).

Os grupos carbonilas são utilizados como um indicador da intensidade dos ataques

dos radicais livres nas proteínas. Existem vários métodos de dosagens dos níveis de

carbonilação de proteína, todos são baseados na interação da dinitrofenilhidrazina (DNPH)

com as proteínas carboniladas, resultando na formação da dinitrofenilhidrazona (DNP) que

é dosado espectofotometricamente (LUSHCHAK, 2006).



21

FIGURA 08 – Geração de proteínas carboniladas. Fonte: SINGER, 1998.

1.6.3 – Danos ao DNA

A exposição das células às espécies reativas de oxigênio e à radiação ionizante,

resulta em diversas lesões na molécula de DNA, tanto nas bases nitrogenadas como nas

moléculas de açúcar constituintes do DNA (COSTA et al., 2001).

A integridade do genoma é essencial para a manutenção das funções celulares

corretas, principalmente para replicação, expressão gênica e síntese protéica. A indução de

danos ao DNA pode gerar uma parada no ciclo celular, mutagênese, instabilidade

genômica, câncer e também morte celular programada (apoptose).

Dentre os danos oxidativos mais perigosos, as alterações nas bases nitrogenadas

possuem uma posição de destaque pois são freqüentemente associados à formação de

mutações e a perda da integridade do DNA. Observa-se ainda que durante os danos

oxidativos ao DNA, ocorre formação de sítios abásicos (sítios com perda de bases

nitrogenadas) e também quebra de fitas simples. Recentes estudos relacionam a perda da



22

integridade genômica de células humanas com o processo de envelhecimento, doenças

degenerativas e câncer (HALLIELL et al., 1993).

Em S. cerevisiae, o peróxido de hidrogênio e superóxidos geram compostos que

induzem a oxidação das bases, gerando quebra das fitas simples e o aumento da frequência

de recombinação intracromossomal (FRANKENBERG et al., 1993; LEE et al., 1998). As

células possuem mecanismos capazes de remover e substituir as bases oxidadas através de

um sistema secundário de defesa antioxidante (COSTA, et al., 2001).

Os efeitos do cádmio na instabilidade genômica surgem de forma indireta

principalmente via o aumento do estresse oxidativo, podendo assim levar à danos ao DNA.

Vários estudos indicam que o cádmio inibe o reparo do DNA. Assim, tem sido

demonstrado que o cádmio causa alterações em diferentes sistemas de reparo do DNA,

sistemas de reparo envolvidos com danos em quebra de fita simples (HOEIJMAKERS,

2001), como por exemplo: no sistema de reparo Mistmatch repair (MMR), que se trata do

reparo do pareamento incorreto das bases nas fitas de DNA, quando o MMR é inibido não

pode haver a correção ou troca da base adicionada errada na fita que está sendo sintetizada

e assim, não pode haver a interação com a fita molde de DNA através das ligações

hidrogênio; NER - Nucleotide excision repair, que consiste na retirada de alguns

nucleotideos erroneamente adicionados ao DNA que causam uma distorção no mesmo;

BER - Base excision repair, ou seja, é o reparo onde a base errada é retirada através da

quebra da ligação glicosídica entre a base e a ribose formando um sítio abásico ocorrendo a

substituição da base (GIAGINIS et al., 2006; BERTIN et al., 2006). Se esses sistemas de

reparos são inibidos ou impedidos de funcionar, dado a presença do cádmio, diversas

alterações no DNA ocorreram e assim o cádmio pode exercer seu papel mutagênico e

genotóxico

1.7 – Trealose

A trealose (α-D-glicopiranosil-1,1-α-glicopiranosídio) é um dissacarídeo não

redutor formado por dois resíduos de D-glicose que são ligadas por átomos do carbono alfa

reduzidos (Figura 09). É encontrado em bactérias, fungos, plantas e invertebrados, e



23

ausente em mamíferos (BENARDOUJ et al., 2001). As leveduras acumulam grande

quantidade de trealose, tornando-se assim, excelentes modelos para o estudo da resposta

das células eucarióticas a diversos estresses (PANEK et al., 1995).

FIGURA 09 – Estrutura da trealose, α,α1-1-trealose. Fonte: ELBEIN et al., 2003.

Elbein (1974) descreveu o papel da trealose como fonte de armazenamento de

glicose para energia e/ou para síntese de componentes celulares. Porém, o papel da trealose

não se limita apenas a reserva de carboidratos, está relacionado principalmente, à proteção

contra estresse como: desidratação (FRANÇA et al., 2007), dessecação (LIU, et al., 2005),

congelamento, estresse térmico (ATTFIELD et al., 1987), estresse osmótico (HOUNSA, et

al., 1998), produtos químicos como metanol e peróxido de hidrogênio (BENAROUDJ et al,

2001), metais pesados. Estudos in vitro e in vivo demonstram a extraordinária propriedade

desta molécula na proteção biológica de membranas e proteínas desta maneira, a trealose

apresenta um duplo papel: como reserva de carbono e energia mas, principalmente, como

um protetor a diferentes estresses em células da Saccharomyces cerevisiae (SINGER et

al.,1998).

O aumento nos níveis de tolerância às várias formas de estresse, conferido pelo

aumento da concentração da trealose, pode ser explicado não somente pela estabilização de

estruturas proteicas e manutenção das atividades enzimáticas, como também pela

estabilização das biomembranas (CROWE et al., 1984). Existem outros fatores

responsáveis pela resistência ao estresse, entre eles, as proteínas de choque térmico e,



24

outros mais específicos a determinados estresses tais como níveis glutationa, tioredoxina,

glutaredoxina, metalotioneinas, glicerol dentre outros.

Estudos sobre o mecanismo protetor da trealose durante o choque térmico

mostraram que a presença de trealose é fundamental na proteção a este estresse, entretanto,

quando é feita a recuperação do choque térmico (volta das células à temperatura normal) a

trealose deve ser rapidamente degradada para permitir o acesso das proteínas de choque

térmico (HSPs) às proteína e assim, as HSP contribuem para a manutenção da estrutura

proteica normal, impedindo que as proteínas sofram desnaturação pelo calor (Figura 10).

Estudos com mutantes tps1, (mutantes que possuem deleção no gene que codifica para a

enzima de síntese de trealose, a trealose-6-fostato sintase) evidenciam o grande papel da

trealose no choque térmico, estas linhagens não sintetizam trealose, comprometendo assim

sua termotolerância e prejudicando também a síntese de proteínas de choque térmico (DE

VIRGILIO et al., 1994).



25

FIGURA 10 – Papel da trealose no choque térmico - (A) altas temperaturas causam desnaturação

de proteínas, que podem se associar e para formar agregados. (B) S. cerevisiae sintetizam grandes

quantidades de trealose durante o choque térmico. Este dissacarídeo estabiliza proteínas em seu

estado nativo sobre estas condições, e também suprime a agregação de proteínas que estão

desnaturadas. (C) Células de leveduras normalmente degradam trealose rapidamente após choque

térmico, prevenindo a agregação de proteínas. (D) A persistência de altos níveis de trealose,



26

interferem com a reativação de substratos desnaturados, explicando assim a necessidade de

degradar a trealose após o retorno da temperatura (SINGER et al., 1998).



27

Embora o possível envolvimento da trealose na proteção contra radicais livres não

tenha sido inteiramente demonstrado, vários trabalhos sugerem a hipótese de seu papel na

defesa aos ataques das ROS (ELBEIN et al., 2003). O único trabalho que claramente

demonstra o importante papel que a trealose desempenha na defesa contra radicais livres foi

o de BENAROUDJ (2001). O autor mostrou que a presença de trealose protegeu as

proteínas contra os radicais livres gerados após tratamento com peróxido de hidrogênio.

Na levedura S. cerevisiae, a trealose é formada no citosol por uma reação em duas

etapas (CABIB & LELOIR., 1958). Essa reação é conduzida por um complexo de três

subunidades: (1) uma subunidade catalítica de 56 kDa que é a trealose-6-fosfato sintase

codificada por TPS1 (ou C1F1) (BELL et al., 1992) (EC2.4.1.15), (2) uma subunidade de

102,8 kDa que é a trealose-6-fosfato fosfatase codificada por TPS2 (DE VIRGILIO et al.,

1993) (EC.3.1.3.12), (3) a maior subunidade de 123-kDa codificada redundantemente por 2

genes, TSL1 (trealose sintase de cadeia longa) e TPS3 (homologo a TSL1) com atividade

regulatória (VUORIO et al., 1993). Os mutantes com dupla deleção, TSL1 e TPS3, exibem

uma grande desestabilização no complexo de síntese da trealose (BELL et al., 1998).

Na primeira etapa de formação da trealose ocorre a condensação da uridina 5’-α-D-

glicopiranosil pirofosfato (UDP glicose) e glicose-6-fosfato pela ação da trealose-6-fosfato

sintase (tps1). Essa enzima transfere o resíduo glicosil do UDGP para a glicose-6-fosfato

formando a trealose-6-fosfato. Na segunda etapa, a trealose-6-fosfato é defosforilada por

uma fosfatase específica (trealose-6-fosfato-fosfatase/tps2) para produzir a trealose (Figura

11). A quebra da trealose gera duas moléculas de glicose sendo realizada pelas enzimas

trealases neutra ou ácida. Em S. cerevisiae a síntese da trealose é feita no citoplasma pelo

complexo trealose-6-fosfato sintase/fosfatase (TPS) que contem trealose-6-fosfato sintase

(Tps1p), trealose-6-fosfato fosfatase (Tps2p) e várias subunidades, tais como: Tps3p e

Tsl1p, que aparecem tanto para estabilizar quanto para regular o complexo TPS

(SAMPEDRO & URIBE, 2004).

Três enzimas são capazes de degradar trealose: duas trealases neutra ou intracelular,

e a trealase ácida, ou extracelular. As enzimas neutra e ácida diferem em função da sua

localização celular, propriedades catalíticas e, regulação. (PARROU et al., 2005;

SAMPEDRO & URIBE 2004). A trealase neutra, sintetizada pelo gene NTH1 é uma



28

enzima citoplasmática com atividade ótima em pH 7,0, o gene NTH2 sintetiza a outra

trealase neutra que não se sabe na realidade qual a sua função. A trealase ácida, parece ser

uma enzima encontrada na superfície celular, possui atividade ótima em pH 4,5, é

responsável pela utilização da trealose externa como fonte de carbono (PARROU, et al.,

2005; TERESHINA, 2005).

FIGURA 11 – Ciclo da Trealose em Saccharomyces cerevisiae. Os sinais representam (-) inibição

e (+) ativação. Fonte: VOIT (2003).

1.8 – Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo

As células de S. cerevisiae (Figura 12) têm diversas similaridades com as células de

mamíferos nas suas macromoléculas e organelas e, diversas proteínas destas leveduras, têm

sido funcionalmente capaz de substituir proteínas homólogas humanas. Outros fatores que

colaboraram para que as leveduras se tornassem um modelo experimental interessante

foram: a facilidade de obtenção de mutantes por meio de técnicas de genética e biologia

molecular, o fácil cultivo em um meio de cultura de composição simples, o pequeno tempo



29

de geração, quando comparada com outras células, o completo seqüenciamento do seu

genoma e, ao fato desta levedura não estar associada a características patogênicas como as

bactérias. Assim, a levedura Saccharomyces cerevisiae é um modelo relevante que, tem

contribuído para o entendimento de mecanismos bioquímicos e moleculares de diversos

problemas desafiadores da ciência atual, entre eles, os ligados ao estresse oxidativo

(COSTA & MORADAS-FERREIRA, 2001).

As concentrações de Fe, Mg e Zn, Cu e outros metais de importância fisiológica é

finamente regulada em células vivas. O maior determinante da homeostase dos metais é a

atividade dos transportadores de membrana. Metais tóxicos como Cd, Pb, Hg e Ni, não

possuem qualquer função benéfica conhecida mas, competem com os transportadores dos

metais biológicos essenciais. Assim, a atividade e, especificidade dos transportadores

fisiologicamente importantes de metais também controlam a letalidade dos metais tóxicos.

Em todas as espécies vivas, numerosas proteínas transportam metais através de todas as

membranas celulares. A levedura S. cerevisiae tem sido o organismo de escolha para

investigar o papel dos transportadores de metais na homeostase em eucariotos.

Além de todos os fatores relacionados acima, outra grande vantagem que a levedura

S. cerevisiae possui é o seu uso em vários processos de fermentação industrial sendo capaz

de gerar abundante matéria prima. Esta matéria prima está sendo submetida à várias

investigações para ser usada como material absorvente para metais e, tem sido estudada em

diferentes propostas de pesquisa, como por exemplo, células vivas/ células mortas

(KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995), células imobilizadas e células livres (VEGLIO

et al., 1997); células pré tratadas por processos físico-químicos e não tratadas (MARQUES

et al., 1999), células laboratoriais e, células obtidas de diferentes processos industriais

fermentativos (PARK et al., 2003).



30

FIGURA 12 – Células de Saccharomyces cerevisiae. Fonte: www.bath.ac.uk/bio-sci/wheals2.htm



31

2 - Justificativa

Justificativa

32

As atividades industriais, a agropecuária e a mineração contaminam o solo, ar e a

água devido à liberação de metais pesados no ambiente, este fato tem intensificado os

problemas da poluição ambiental com vários reflexos na saúde humana. A remoção de

metais pesados dos efluentes industriais normalmente realizada por métodos químicos é

eficiente, porém, no caso de efluentes diluídos, tem custo elevado, é ineficaz e, leva a

geração de lodo tóxico. Novas alternativas têm sido estudadas, entre elas, a bioremediação.

Bioremediação é um processo que utiliza microrganismos na remoção de metais pesados do

ambiente.

Entre os metais pesados poluentes, o cádmio é um dos mais tóxicos para seres

humanos, animais, plantas sendo seus efeitos visíveis mesmo à baixas concentrações. Em

geral, no interior dos organismos, os metais induzem um forte estresse oxidativo. O estresse

oxidativo é causado pela excessiva produção de radicais livres. Os radicais livres estão

relacionados ao processo fisiológico de envelhecimento e, a doenças tais como: Alzheimer,

câncer, arteriosclerose, doença de Parkinson, doenças cardiovasculares, doenças

autoimunes e diabetes.

O estudo dessas adaptações bioquímicas é de grande utilidade para um possível uso

dessas células na incorporação de metais de efluentes líquidos e, para o conhecimento dos

mecanismos de proteção intracelulares uma vez que, várias doenças que afetam a

humanidade, são causadas ou, são agravadas pelo estresse oxidativo. Além dos efeitos

deletérios na saúde humana, um dos grandes efeitos biológicos da radiação ionizante é o

efeito indireto das radiações, ou seja, a geração de radicais livres que leva ao estresse

oxidativo fato de grande interesse no âmbito da instituição em que foi realizada esta

dissertação.



33

3 - Objetivos

Objetivos

34

3.1 - Objetivo geral

Avaliar a influência da trealose na resposta ao estresse oxidativo induzido pelo cádmio na

levedura Saccharomyces cerevisiae.

3.2 - Objetivos específicos

Usar linhagens de Saccharomyces cerevisiae com diferentes níveis de trealose para

verificar:

• a influência da exposição à concentrações crescentes de cloreto de cádmio sobre o

crescimento;

• a tolerância das linhagens às concentrações crescentes de cádmio;

• a influência da exposição à concentrações crescentes de cloreto de cádmio nos níveis de

trealose;

• a influência da fonte de carbono na incorporação de cádmio;

• a influência das diferentes fases de crescimento celular na incorporação de cádmio;

• a incorporação de cádmio em células viáveis e células mortas;

• a influência da glutationa reduzida e de aminoácidos formadores de glutationa na

incorporação ao cádmio;

• a influência do cádmio oxidação intracelular;

• a influência do cádmio na peroxidação de lipídeos;

• a influência do cádmio na carbonilação de proteína;

• a influência do cádmio no conteúdo de resíduos sulfidrílicos totais;

• o status antioxidante total de cada linhagem.



35

4 - Estratégia Experimental

Estratégia Experimental

36

Foram utilizadas três linhagens para observação da influência da trealose no estresse

oxidativo induzido pelo cádmio. A linhagem selvagem possui todas as enzimas necessárias

para a síntese e degradação da trealose. A linhagem tps1 não possui o gene que codifica a

enzima trealose-6-fosfato sintase, portanto, não pode, sob qualquer circunstância, sintetizar

o carboidrato. A linhagem nth1 não possui o gene que codifica a enzima trealase neutra 1

portanto, acumula a trealose sintetizada.

As células das três linhagens foram incubadas na presença ou, ausência (controle)

de cloreto de cádmio. Foi determinada a influência que a incorporação de cádmio teve no

crescimento celular, na tolerância das células ao metal e, a quantidade de cádmio

incorporado pelas diferentes linhagens. Foi verificado se a presença de trealose tem

influência na incorporação de cádmio e, na resposta ao estresse oxidativo. A indução do

estresse oxidativo devido à geração de radicais livres formados após a exposição ao metal

foi avaliada pela incorporação de uma sonda fluorescente e, analisado os efeitos deletérios

dos radicais livres em lipídeos, proteínas e conteúdo de resíduos sulfidrílicos totais.

Papel da trealose na proteção durante o estresse oxidativo causado por cádmio e a resposta adaptativa a

este estresse em Saccharomyces cerevisiae

37

5 - Materiais e Métodos

Materiais e Métodos

38

5.1 - Microrganismo Utilizado

As linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas e os genótipos em estudo estão

apresentados na tabela abaixo:

Tabela 01 – Linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas.

LINHAGENS GENÓTIPO CARACTERÍSTICAS W303-1A (WT) Can1-100 leu2-3trp1-1ura3-

1ade2-1his3-11,15 Linhagem laboratorial

W303-829 (tps1∆) W303-1A tps1�::TRP1 Linhagem com deleção no gene da trealase neutra

W303-648 (nth1∆) W303-1A nth1�::URA3 Linhagem com deleção no gene da trealose-6-fosfato sintase

Fonte: Stefan Hohmann

5.2 - Meios de cultura

O crescimento das células foi realizado nos seguintes meios: YPGlicose (2%

glicose, 2% peptona e 1% extrato de levedura) para as linhagens WT e nth1∆, e

YPGalactose (2% galactose, 2% peptona, 1% extrato) para a linhagem tps1. A linhagem

mutante tps1 não pode crescer na presença de glicose por isso, para o crescimento desta

linhagem, foi usada a galactose como fonte de carbono.

5.3 - Manutenção das linhagens em laboratório

A manutenção das linhagens foi realizada utilizando três técnicas diferentes para

armazenagem de leveduras em laboratório:

• Armazenamento das células em óleo mineral na geladeira:

Uma alça contendo células foi inoculada em tubos com meio YPGlicose ou, YPGalactose

sólido, previamente inclinado. Após 48 horas a 30ºC, acrescenta-se à superfície das

leveduras, óleo mineral devidamente esterilizado. Os tubos foram estocados a 4ºC.


39

• Manutenção em placa de petri:

As leveduras foram mantidas em placa de petri contendo meio sólido YPGlicose ou,

YPGalactose e, repicadas periodicamente, a partir do original mantido em tubo inclinado

com óleo mineral. As placas também foram mantidas a 4ºC.

• Manutenção em meio glicerol:

As linhagens foram pré-crescidas em meio YPGlicose ou, YPGalactose sob agitação a

30ºC, coletadas em fase estacionária, por centrifugação e, ressuspensas em meio contendo

1% extrato de leveduras, 2% peptona, 25% glicerol. 1000 µL deste meio contendo as

células foi transferido para tubos criogênicos, e estocados em freezer a –70ºC.

5.4 – Estresse com cloreto de cádmio

As células foram pré incubadas a uma temperatura de 30ºC, agitadas a 160 rpm

(rotação por minuto) por um período de aproximadamente 16 horas, em meio líquido

YPGlicose ou YPGalactose, dependendo da linhagem utilizada. Após este período, o meio

foi centrifugado por 5 minutos em 3000 rpm, o sobrenadante descartado e, as células eram

transferidas para um novo meio líquido YPG, por um período de 4 horas, para que assim as

células entrassem em fase exponencial de crescimento. A fase exponencial do crescimento

foi verificada pela presença de glicose no meio, utilizando fitas indicadoras de glicose na

urina (UROFITA G – Biobrás Diagnóstico). De acordo com a necessidade experimental, as

células foram incubadas em meio YPG acrescido de concentrações pré-estabelecidas de

cloreto de cádmio (50ppm e 800ppm) e também na condição controle (ausência de cádmio).

O cloreto de cádmio foi autoclavado isoladamente, em solução aquosa concentrada e,

adicionado ao meio YPG. Posteriormente, as células foram incubadas em meio YPG a

30ºC, sob agitação a 160 rpm, durante períodos de tempo preestabelecidos. O tempo de

incubação e a concentração de cloreto de cádmio foram variáveis, de acordo com a

necessidade de cada experimento. Após o tempo estabelecido, as células foram coletadas

por filtração a vácuo usando filtros de nitrocelulose de 0,45 µm de porosidade, 47 mm de

diâmetro. As células foram lavadas três vezes com água destilada fria. A massa celular foi

removida do filtro com espátula e, transferida para papel alumínio, congeladas em


40

nitrogênio líquido e, estocadas em freezer – 20ºC. Posteriormente, esta massa de células

congelada foi utilizada para as determinações experimentais desejadas.

5.5 – Obtenção de extratos celulares

Após a realização da incubação descrita no item 5.4, onde as células foram

coletadas em fase logarítmica e, incubadas em meio YPGlicose novo, na ausência

(controle) e presença de 50 e 800 ppm de cloreto de cádmio, as células foram ressuspensas

em tampão de lise (Tampão de Fosfato de Sódio 50mM, pH 7,0; EDTA 1 mM e PMSF 1

mM), adicionou-se, a seguir, pérolas de vidro. O rompimento das células foi realizado por

seis ciclos de 30 segundos de agitação vigorosa em vórtex, intercalados com períodos de

repouso em gelo. Após a lise celular, a suspensão foi centrifugada a 3000 rpm por 5

minutos. Utilizou-se este sobrenadante (extrato bruto) para a realização das dosagens

necessárias.

5.6 - Dosagem de proteínas

O conteúdo protéico dos extratos brutos de cada amostra foi determinado de acordo

com o método descrito por Lowry e colaboradores (1951), utilizando uma solução de

soroalbumina bovina (BSA) como padrão.

5.7 - Curva de crescimento

Para curva de crescimento das linhagens WT e nth1, um pré inoculo foi crescido por

cerca de 16 horas a 30ºC, a 160 rpm, em meio YPGlicose. Para a linhagem tps1, um pré

inoculo foi crescido nas mesma condições acima citadas em meio YPGalactose. Após este

período, foi verificada a densidade óptica da cultura em espectrofotômetro, a 600 nm. Os

experimentos foram iniciados com uma D.O. de 0,15. Nos tempos pré estabelecidos, uma

alíquota, usualmente 100µl, foi retirada e, colocada em 900µl de água. O crescimento foi


41

seguido pela medida da turbidez da suspensão a 600 nm, em espectrofotômetro. Caso

necessário, foram feitas diluições em água para registro da turbidez.

5.8 - Tolerância ao cádmio

A análise de sobrevivência das células ao cloreto de cádmio foi feita por

plaqueamento em meio YPGalactose acrescido de ágar. Foram preparados pré inóculos das

linhagens S. cerevisiae WT, S. cerevisiae nth1 e S. cerevisiae tps1 em meio YPGalactose e,

após 48 horas de crescimento foi feita contagem do número de células, com uso da câmara

de Neubeuer (Figura 13). Foram coletados 100µL de cada pré-inóculo e, realizadas

diluições sucessivas em água destilada estéril, obtendo assim as concentrações de 10-3, 10-4,

10-5, 10-6, 10-7, 10-8 células/ml. Em seguida, foram inoculados 5µL de cada suspensão em

placas contendo YPGalactose + ágar com concentrações de cádmio de 5, 10 e 25ppm e, na

ausência do metal, como controle. Após 72 horas de incubação a 300C as placas foram

fotografadas.

FIGURA 13 – Câmara de Neubeuer (Fonte: MANNHEIM, 1998)


42

5.9 - Dosagem de Trealose

A quantificação de trealose acumulada pelas células foi realizada utilizando a

metodologia descrita por NEVES e colaboradores (1994).

As células foram coletadas em fase logarítmica e, incubadas em meio YPGlicose

novo, na ausência (controle) e presença de 50 e 800 ppm de cloreto de cádmio.

Posteriormente, a massa celular congelada foi transferida para tubos cônicos, pesados e

mantidos em gelo. Em seguida, acrescentou-se 1000µL de 0,25 M Na2CO3. Imediatamente,

a suspensão foi fervida durante 20 minutos, centrifugada 5 minutos a 3000 rpm. Após esta

etapa, 200µL do sobrenadante foi acidificado com ácido acético 1,2 N (Concentração final

de 0,30 N) até que o pH 5,0 – 5,5 fosse atingido (verificado com fita indicadora de pH) e,

tamponado com 75 mM de acetato de sódio contendo 7,5 mM de CaCl2. A solução foi

misturada em vórtex e, 100µL da mistura foi usada para determinação da trealose. A

trealose foi determinada enzimaticamente com uma preparação de trealase extraída do

fungo Humicola grisea var. thermoidea. A reação foi processada incubando o extrato

tamponado e a preparação de enzima por 2 horas a 40ºC. Após este período, usou-se 50µL

desta solução para a dosagem de glicose formada. A glicose formada foi determinada com

auxílio de um kit comercial da Bioclin (Glicose GOD- Clin). A reação desenvolveu-se a

37ºC, durante 15 minutos. O produto colorido formado foi determinado

espectofometricamente a 505 nm. Para cada amostra foram realizadas incubações paralelas,

na presença de trealase desnaturada, para verificação de possível contaminação por glicose

do meio.

Uma unidade de trealase foi definida como a quantidade de enzima que liberou um

µmole de glicose por minuto nessas condições. O acúmulo de trealose foi expresso em

µmoles de glicose liberada por grama de peso úmido (µmoles glicose liberada / g peso

úmido).

5.10 - Extração da trealase do Humicola grisea var. thermoidea


43

A trealase foi extraída do fungo Humicola grisea var. thermoidea, cultivado em

ágar aveia (4% farinha de aveia, 1,8% ágar), durante 20 dias a 40ºC. Após esse período, os

frascos foram deixados durante 5 dias a temperatura de 4ºC, procedimento que aumenta a

quantidade de trealase a ser extraída. Adicionou-se aos erlemeyers, 10 ml de água destilada

e, raspou-se a superfície do ágar com bastão de vidro. A suspensão formada foi filtrada em

funil contendo gaze em seu interior. Posteriormente, a suspensão foi centrifugada a 3000

rpm por 40 minutos. Adicionou-se ao sobrenadanete 1% de Kaolin (silicato de alumínio

hidratado/Sigma) e a mistura foi deixada a temperatura ambiente durante 20 minutos com

agitação esporádica. A solução foi centrifugada por 20 minutos a 3000 rpm e, o

sobrenadante foi dialisado toda noite contra H2O à 4ºC. A suspensão foi distribuída em

tubos e, congelada. Para cada lote de enzima preparada, foram realizados testes de

atividade, utilizando como padrões a trealose comercial (Sigma) nas concentrações de 2, 5

e 10 mM.

5.11 - Determinação de cádmio incorporado pelas células

Foi utilizada a análise por ativação neutrônica para determinação do cádmio

incorporado pelas células. A análise por ativação neutrônica tem sido reconhecida como

uma das mais importantes ferramentas analíticas na determinação da composição química

elementar em teores traços. A técnica tem como princípio à indução de radioatividade

artificial, em uma amostra, através da irradiação com nêutrons e, posterior medida da

atividade induzida mediante a detecção da radiação gama. Os fenômenos físicos, na qual

está fundamentada esta análise são, as propriedades do núcleo, radioatividade e a interação

da radiação com a matéria, via reação de neutrons-gama (n, γ). Os raios gama emitidos,

denominados de raios gama de decaimento, possuem energias que são características de

cada radionuclídeo. Assim, quando detectados por espectroscopia gama, podem ser

utilizados para identificar e, quantificar os elementos químicos presentes em uma amostra.

A técnica tem capacidade de análise de matrizes no estado sólido, líquido e gasoso:

a reação nuclear (n, γ) independe do estado físico da matriz. O método é não destrutivo, a

amostra não é visivelmente ou, quimicamente alterada.


44

A ativação neutrônica é realizada em reatores de pesquisa. No Brasil, apenas dois

Centros de Pesquisa utilizam a ativação neutrônica. O Centro de Desenvolvimento de

Tecnologia Nuclear (CDTN) em Belo Horizonte e, o Instituto de Pesquisas Energéticas e

Nucleares (IPEN), em São Paulo, ambos pertencentes à Comissão Nacional de Energia

Nuclear (CNEN).

O Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear possui o reator TRIGA IPR-

1, dotado de mesa giratória e dispositivo de irradiação especialmente apropriado para esta

técnica analítica. Durante a irradiação, a mesa gira em torno do núcleo do reator a uma

velocidade constante, de modo a garantir um fluxo de nêutrons uniforme nas amostras.

Atualmente, a potência do reator é de 110 kW, nesta potência o fluxo de nêutrons atinge um

valor em torno 1,65 x 1012n/cm2 s. a meia-vida do 115Cd é de 12,2 dias (MENEZES et al.,

2003)

5.12 - Preparação das amostras para determinação do cádmio incorporado

Após realização do item 5.4, a massa celular foi coletada e transferida para tubos

apropriados para a Ativação Neutrônica. Os tubos permaneceram por três dias a 70ºC. Após

este período, toda água presente no material evaporou-se e assim foram pesadas para

determinação do peso seco, e enviadas ao Reator Triga (CDTN/CNEN) para irradiação. A

irradiação foi realizada durante 8 horas, nas condições do reator acima especificadas.

Posteriormente, as amostras foram submetidas à espectrometria gama e, os picos

característicos do cádmio foram determinados e, usados para a determinação da quantidade

do metal presente na célula. Os valores são expressos em µgrama de Cd incorporado/grama

de peso seco.

5.13 - Incorporação de CdCl2 na presença de Glutationa reduzida adicionada

ao meio

Para determinar a influência da glutationa na incorporação do cádmio nas linhagens

estudadas, foram realizados dois experimentos independentes: primeiramente, foi


45

observado se a adição de glutationa reduzida (concentração final de 80µM) influenciaria a

incorporação de cádmio. O segundo experimento foi realizado da mesma forma, apenas

que, no lugar da glutationa, foi adicionado aminoácidos (10Mm ácido glutâmico, 18mM

glicina e 3,35mM cisteína). Estes aminoácidos (aa) são os formadores da glutationa.

O experimento foi realizado na situação controle (ausência de cádmio) e exposição

ao cádmio (50ppm e 800ppm). As células primeiramente cresceram em meio

YPGlicose/YPGalactose suplementado com GSH e com aminoácidos, por cinco horas.

Após este tempo, foi ressuspendido em novo meio e realizado o estresse com cádmio

(procedimento descrito no item 5.4). As amostras foram preparadas de acordo com o item

5.12.

5.14 - Determinação de cádmio na superfície celular

A presença de metal na superfície celular foi determinada utilizando a técnica de

espectrometria por dispersão de energia (do inglês, Energy Dispersive Spectrometer –

EDS), o equipamento consiste de uma detetor, uma fonte polarizadora de alta-voltagem

para o detetor, um amplificador, um analisador multicanal, um reservatório de nitrogênio e

uma fonte de força. Este sistema proporciona análises rápidas, precisas e não destrutivas de

elementos químicos presentes nas amostras que estão sendo analisadas.

Após a realização do procedimento descrito no item 5.4, as células foram incubadas

por três dias a 70ºC para obtenção do peso seco e, enviadas ao Laboratório de Microanálise

do Instituto de Ciências Exatas (ICEX/UFMG), para determinação do cádmio presente na

superfície celular.

5.15 - Determinação da oxidação intracelular

A sonda fluorescente 2,7-diclorofluoresceína (Figura 14) é uma molécula que

penetra na membrana celular por difusão passiva. Em seu interior, ela sofre sucessivos

ataques pelos radicais livres, produzindo assim um composto fluorescente. Os níveis de

fluorescência podem ser monitorados e relacionados com os níveis de oxidação intracelular

(GOMES, et al., 2002).


46

A fluorescência foi determinada utilizando espectrofluorímetro, calibrado com os

comprimentos de onda para excitação de 504 nm e, comprimento de onda para emissão de

524 nm. As células foram pré incubadas durante 48 horas na temperatura de 30ºC, agitadas

a 160 rpm em meio líquido YPGlicose/ YPGalactose. As células foram transferidas para

um novo meio YPGlicose ou YPGalactose e, após 4 horas nestas condições, adicionou-se a

sonda fluorescente ao meio (concentração final 10µM de solução preparada em etanol

absoluto). As amostras foram incubadas com a sonda fluorescente durante 20 minutos para

permitir sua absorção por difusão passiva. Em seguida, adicionou-se cádmio e, a incubação

prosseguiu por 16 horas, tanto na situação controle, como nas que tiveram adição do metal

(50ppm e 800ppm).

Após as 16 horas de incubação, as células foram centrifugadas, lavadas três vezes

com água estéril gelada e, ressuspensas em 1000µL de água estéril gelada. Foram então

lisadas com pérolas de vidro (10 ciclos de 30 segundos em vórtex seguidos por

resfriamento em gelo). Após o rompimento das células, a amostra foi centrifugada (13000

rpm x 5 min) e transferido para tubo eppendorf. O pellet contendo as pérolas de vidro foi

lavado em 400µL de água estéril gelada e esta suspensão foi adicionada ao sobrenadante

reservado e usado para determinar a fluorescência após diluição em água. Os resultados

foram expressos como uma relação entre a fluorescência de células tratadas com cádmio

(50ppm e 800 ppm) e, a fluorescência das células não submetidas a situação de estresse

(controle).

FIGURA 14 – Sonda fluorescente 2,7-diclorofluoresceína

5.16 - Carbonilação de Proteínas


47

A determinação da carbonilação de proteína foi realizada utilizando o método

descrito em Luschchak e colaboradores (2005). A carbonilação das proteínas foi

determinada utilizando dinitrofenilhidrazina (DNPH). A dinitrofenilhidrazina reage com os

grupos carbonil das proteínas para formar dinitrofenilhidrazonas (DNP). Este composto

formado possui cor característica que pode ser determinada espectrofotometricamente a 370

nm.

Os extratos foram preparados de acordo com o item 5.5. Após centrifugação (13000

rpm por 5 minutos) utilizou-se o pellet para análise de carbonilação de proteínas. O pellet

foi ressuspenso em solução 10mM de DNPH preparada em 2M HCl e deixado em

temperatura ambiente durante 1 hora. Logo após foi adicionado TCA (concentração final de

10%) e deixado em gelo durante 15 minutos. Após este período, a suspensão foi

centrifugada à 10.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e, adicionado ao

pellet Etanol/Butila Acetato (1:1) esse procedimento foi repetido três vezes, com

centrifugações nas mesmas condições acima descritas. O pellet foi então ressuspenso em

6M Guanidina-HCl e centrifugado (3 minutos a 10.000 rpm) para remoção das partículas

insolúveis. O sobrenadante foi usado para determinação da dinitrofenilhidrazona formada,

usando um comprimento de onde de 370 nm. Os cálculos de carbonilação de proteínas

foram realizados usando um coeficiente de extinção molar de 22 x 103 M-1 cm-1 para o

DNPH (LUSCHCHAK, et al., 2005) e os resultados foram expressos como nanomoles/mg

proteína/ mL.

5.17 - Peroxidação de lipídeos

A determinação da peroxidação lipídica foi feita pelo método TBARS (do inglês

Thiobarbituric Acid Reactive Species) ou, substâncias reativas com o ácido tiobarbiturico.

Os níveis de peroxidação lipídica foram determinados de acordo com as substâncias que

reagiram com o ácido tiobarbitúrico. As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS) são compostas de diversos produtos finais de baixo peso molecular formados via

decomposição de certos produtos primários e secundários da peroxidação lipídica. A

análise da quantidade de TBARS é utilizada como um índice de estresse oxidativo. O


48

cálculo foi realizado usando-se uma curva padrão de malondialdeído (MDA) um dos

produtos da peroxidação lipídica.

Os extratos celulares foram preparados de acordo com item 5.5. Ao sobrenadante

previamente separado adicionou-se ácido tricloracético (TCA concentração final de 10%) e,

a suspensão foi deixada em gelo durante 30 minutos. Após este período, foi centrifugada

(3000 rpm por 5 minutos) e, retirou-se 600µL do sobrenadante ao qual se adicionou a

solução de TBA (0,5% de ácido tiobarbitúrico preparado em TCA 20%), aqueceu-se por 60

minutos a 100ºC. Em seguida, a amostra foi deixada a temperatura ambiente para

resfriamento. Após esta etapa, a absorbância foi determinada espectofotometricamente a

532nm As medidas foram corrigidas para turbidez inespecífica pela subtração da

absorbância a 600nm. O índice de peroxidação lipídica foi expresso em picomoles de

malondialdeído (produto da reação) por miligrama de proteína por mL (picomoles MDA/

mg proteína/ mL).

5.18 - Resíduos Sulfidrílicos Totais

Os resíduos sulfidrílicos totais foram determinados pelos métodos de ELLMAN

(1959) e DAVIDSON e colaboradores (2001), usando 5-5´dithio-bis 2-ácido-nitrobenzoico

- DTNB. Na presença de grupamento tiol a solução de DTNB forma 5-Mercapto-2-

Nitrobenzoico, produzindo uma coloração amarela característica que pode ser determinada

espectrofotometricamente a 412 nm. (Figura 15).

Os extratos celulares foram preparados de acordo com o item 5.5. Utiliza-se 0,5 mg

de proteína diluída em tampão 0,1M de fosfato de sódio com pH 7,0. Retirou-se 200µL de

cada preparação e, adicionou-se tampão 0,01M fosfato de sódio, p.H. 8,0 e 7µL de reagente

Ellman (0,01M DTNB em 10mL de tampão 0,1M de fosfato de sódio pH 7,0). A

absorbância foi determinada a 412nm após 20 minutos de incubação à temperatura

ambiente. O coeficiente de extinção molar para o DTNB é 13.600 M-1 cm-1, e foi usado

para determinar a concentração de resíduos sulfidrílicos totais.

Os resultados foram expressos em micromoles de resíduos sulfidrílicos por

miligrama de proteína por mL (µmoles/ mg proteína/ mL)


49

FIGURA 15 – Reagente Ellman

5.19 - Determinação do status antioxidante total pelo radical DPPH••••

A determinação da capacidade antioxidante total das linhagens foi realizada a partir

dos métodos adaptados de DORDEVIC e colaboradores (2007) e JAYAPRAKASHA e

colaboradores (2006). A determinação foi testada utilizando uma solução metanólica do

radical livre estável DPPH•. A solução de DPPH• apresenta uma cor púrpura forte com uma

absorção máxima de 517nm, que perde a cor quando um antioxidante está presente no

meio. Desta maneira as moléculas antioxidante podem se ligar ao radical DPPH• e

modificando a cor, resultando em uma diminuição da absorbância. Portanto, quanto maior a

diminuição na absorbância, maior é a capacidade antioxidante do extrato (Figura 16).

FIGURA 16 – Esquema “scavenging” do radical DPPH• pelo antioxidante. Fonte: YAMAGUCHI

et al., 1998.


50

Os extratos celulares foram preparados de acordo com o item 5.5. Utilizou-se 2 mg

de proteína diluída em metanol absoluto e 0,1mM de DPPH• dissolvido em solução

metanólica preparada na hora. A preparação foi agitada vigorosamente e, mantida no escuro

por 30 minutos a temperatura ambiente. A leitura foi feita usando 1000µL do sobrenadante.

A absorbância controle foi determinada usando DPPH• 0,1 mM em solução metanólica

diluído em 4000µL de metanol.

A inibição do radical DPPH foi calculada utilizando a equação:

controleaAbsorbânci

padrãoaAbsorbâncicontroleaAbsorbânciInibição

)(100

−×=

5.20 – Descarte de Rejeitos

Todos meios de cultivo foram estocados no laboratório, em bombonas plásticas

colocadas dentro de caixas plásticas, com etiquetas identificando rejeito químico contendo

cádmio e, quando repletas, foram enviadas ao Serviço de Gerência de Rejeitos do CDTN

que o manterá sob sua guarda até a destinação final do rejeito.

5.21 - Análise Estatística

Os resultados foram expressos como média e ± desvio padrão de pelo menos três

experimentos diferentes. A diferença estatística dos resultados foi realizada utilizando o test

T (T Student) com níveis de significância de < 0,05.

Papel da trealose na proteção durante o estresse oxidativo causado por cádmio e a resposta adaptativa a

este estresse em Saccharomyces cerevisiae

51

6 - Resultados e Discussão

Resultados e Discussão

52

6.1 – Curva de crescimento e tolerância ao cádmio

A presença de metais no interior das células, sua incorporação e seu acúmulo, são

fenômenos submetidos à intensa regulação, mesmo para os metais essenciais como Zinco e

Ferro. Em concentrações que ultrapassem aqueles limites considerados normais, os metais

essenciais são nocivos para as células, que precisam se adaptar à sua presença, ativando

mecanismos de defesa para se tornarem mais resistentes e viáveis. Se tal fato ocorre para

metais essenciais, para os metais não essenciais como cádmio por exemplo, esta regulação

também deve ser altamente controlada, assim metais não essenciais são considerados

tóxicos para as células, mesmo em baixas concentrações.

A análise do crescimento das células das diferentes linhagens na presença de

concentrações crescentes de cloreto de cádmio (ppm) foi comparada com a situação

controle (ausência de cloreto de cádmio) em cada linhagem. De acordo com os resultados

apresentados na Figura 17, as linhagens WT, tps1 e nth1, na situação controle, apresentam

perfil de crescimento esperado, ou seja, aumento do número de células à medida que o

tempo progrida enquanto que todas as linhagens suplementadas com aumentos gradativos

da concentração de cádmio (10, 25, 50, 75 e 100ppm), apresentaram um crescimento

reduzido ou inibição do crescimento, quando comparadas à situação controle no período de

tempo estudado (8 horas).

Após a realização das curvas de crescimento em meio líquido foi analisada a

tolerância das linhagens WT, tps1 e nth1 ao CdCl2 através do plaqueamento das células em

meio sólido (YPGalactose) suplementado com 0, 5, 10 e 25 ppm de cloreto de cádmio e a

posterior observação das colônias formadas.

Analisando o crescimento das colônias em placas com concentrações crescentes de

cloreto de cádmio (Figura 18), observa-se que as células das três linhagens apresentam o

mesmo perfil de crescimento. Na situação controle e nas concentrações de 5ppm e 10ppm,

não foi observado qualquer influência no crescimento, enquanto na concentração de 25ppm

a célula apresentou uma inibição do crescimento.

Gharieb (2001) trabalhando com o fungo Fusarium sp mostrou que a inibição do

crescimento aumenta com a elevação da concentração de cádmio no meio (0, 0, 25, 0,5 e

1,0 mmol l-1) (0,005 – 0,020ppm). Todas as concentrações testadas no presente trabalho


53

levaram ao bloqueio do crescimento, durante o período estudado, entretanto, as

concentrações usadas neste trabalho foram superiores aos citados. De acordo com Momose

e colaboradores (2001), o efeito inibitório do cádmio sobre o crescimento celular, se deve a

vários fatores, todos eles ligados ao bloqueio de grupos funcionais de moléculas

importantes tais como: enzimas, polinucleotídeos, sistema de transporte de íons ou

nutrientes e, substituição de íons essenciais em sítios ativos, os autores observaram em

estudos com S. cerevisiae submetido a 0,3 mM de cloreto de cádmio (0,06ppm) durante 2

horas, uma diminuição na taxa de crescimento. Romandini e colaboradores (1992) usando

três linhagens de S. cerevisiae observaram queda no crescimento das células em meio

líquido na presença de 40µM de CdSO4 (0,01ppm), mostrando que mesmo em baixas

concentrações o cádmio pode causar inibição do crescimento celular.

No presente trabalho foi observado que o cádmio pode prejudicar o crescimento das

células de S. cerevisiae em meio líquido, a sua tolerância ao metal em meio sólido e, que o

metal pode diminuir a sobrevivência celular. Interessou-nos também saber se as células de

S. cerevisiae W303-WT (linhagem laboratorial) tinham capacidade de incorporar cádmio e

qual seria a influência das fases de crescimento na incorporação do cádmio pelas diferentes

linhagens. É conhecido que os níveis de trealose intracelulares sofrem forte influência da

fase de crescimento, são baixos na fase logarítmica e altos na fase estacionária

(THEVELEIN, 1984). Optamos por usar as concentrações de 50ppm e 800ppm de cádmio

como forma de submeter a levedura a um estresse sob concentração moderada de cádmio

(50 ppm) e estresse em alta concentração de cádmio (800 ppm). Utilizando duas

concentrações de cádmio (50 e 800 ppm) nosso objetivo foi detectar e acompanhar

mudanças bioquímicas e fisiológicas importantes que pudessem ocorrer dependendo da

concentração usada e da linhagem estudada.


54

A

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8

Tempo (horas)

D.O

. 600

nm

Controle 10ppm 25ppm

50ppm 75ppm 100ppm

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8Tempo (horas)

D.O

. 600

nm


50ppm 75ppm 100ppm

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8Tempo (horas)

D.O

. 600

nm


50ppm 75ppm 100ppm

FIGURA 17 – Influência de diferentes concentrações de cloreto de cádmio no crescimento das

linhagens WT (A), tps1 (B), e nth1 (C).

B

C


55

FIGURA 18 – Determinação da sobrevivência das células em meio sólido em ausência de cádmio

(A) e presença de 5 ppm (B) e 10 ppm (C) e 25ppm (D) de cloreto de cádmio.


56

6.2 - Determinação da incorporação de cádmio nas diferentes fases de

crescimento celular

As células de leveduras possuem duas fases de crescimento: logarítmica (ou

exponencial) e estacionária quando crescem em glicose, como fonte de carbono. Na

primeira fase, a fase exponencial do crescimento, as células usam glicose para produção de

energia através da via glicolítica. Na fase diauxica (ou pré-estacionária) há o início da

carência de alguns nutrientes e a célula se prepara para respirar. Nesta etapa, as enzimas da

cadeia respiratória encontram-se sintetizadas, a taxa de crescimento diminui e a célula

passa a utilizar o etanol ou outra fonte de carbono disponível para obtenção de energia.

Durante esta fase, glicogênio e trealose são sintetizados e estocados, assim as células se

tornam muito mais resistentes a qualquer forma de estresse. Na total carência de nutrientes,

as células de leveduras entram na verdadeira fase estacionária. Não há mais divisão celular

e a taxa metabólica diminui. As células podem sobreviver nesta situação de semanas a

meses (LONGO et al., 1996).

Inicialmente, foi determinada a influência da fase de crescimento na incorporação

de cádmio. Para tanto realizamos o experimento onde as células da linhagem WT, tps1 e

nth1 foram coletadas em fase logarítmica e estacionária, incubadas com diferentes

concentrações de cádmio (50 e 800ppm). Em todas as linhagens estudadas observa-se que

com o aumento da concentração de cádmio (50ppm para 800ppm), ocorre um aumento da

incorporação, tanto na fase logarítmica quando na fase estacionária.

Na linhagem WT observa-se que não há diferença na incorporação de cádmio na

concentração de 50ppm entre as fases logarítmica e estacionária. Porém, quando se

compara a incorporação na concentração de 800ppm tanto no tempo de duas horas quanto

no tempo de 4 horas, observa-se que na fase logarítmica a incorporação é 51% e 70% maior

do que na fase estacionária. O mesmo ocorre na linhagem com excesso de trealose (nth1),

onde se observa que apenas na concentração de 800ppm ocorre um aumento significativo

de 27% e 20% (duas e 4 horas, respectivamente) de incorporação do metal entre a fase

logarítmica e estacionária (Figura 19).

A linhagem tps1 não apresentou diferença significativa de incorporação de cádmio

entre as fases de crescimento, em nenhuma das concentrações estudadas (50 e 800ppm).


57

Em comparação com as outras duas linhagens, incorpora menos cádmio, conforme pode ser

observado nos resultados apresentados na figura 19.

De maneira geral, as células coletadas em fase logarítmica incorporam maior

quantidade de cádmio do que células coletadas em fase estacionária, este resultado não foi

observado na linhagem tps1. Observa-se pela análise da figura 19, que existe uma

correlação entre o aumento da quantidade de cádmio incorporado pelas células e o aumento

da concentração de cádmio na qual as células foram expostas. Este resultado indicaria que

em efluentes muito diluídos, a incorporação do metal pela levedura seria menor. Outro

resultado que se deve ressaltar é que o mutante tps1 incorpora pequena quantidade de

cádmio quando comparado às outras duas linhagens. Nossa hipótese para esta diferença de

incorporação entre as linhagens WT, tps1 e nth1 é que a trealose exerceria alguma função

na captação e/ou transporte do cádmio para o interior da célula. É bem conhecido que

mutantes com deleção do gene TPS1 apresentam diversas alterações fisiológicas e

bioquímicas entre elas, uma série de alterações na regulação do transporte da glicose e na

metabolização desta molécula (VAN AELST et al., 1993). Assim, não é de todo

improvável que a ausência de trealose tenha reflexos na captação e/ou transporte do

cádmio. Entretanto, para confirmação desta suposição, outros experimentos deverão ser

realizados.

Os resultados apresentados na figura 19 indicaram que a incorporação de metais

depende do microrganismo utilizado (ou seja, da linhagem utilizada), e da fase do

crescimento celular em que as células se apresentam. Condições como fase de coleta das

células (logarítmica ou, estacionária), e tempo de exposição ao metal influenciam na

capacidade das células em incorporar os metais. Assim, em todos os experimentos

subsequentes foram utilizadas células coletadas na fase logarítmica do crescimento, uma

vez que, estas apresentaram uma maior capacidade de incorporação de cádmio do meio

extracelular.


58

0

5000

10000

15000

20000

50ppm (2hrs) 50ppm (4hrs) 800ppm (2 hrs) 800ppm (4hrs)

µµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g pe

so s

eco

WT tps1 nth1

0

5000

10000

15000

20000

50ppm (2hrs) 50ppm (4hrs) 800ppm (2 hrs) 800ppm (4hrs)

g C

d in

corp

orad

o/ g

pes

o se

co

WT tps1 nth1

FIGURA 19 – Determinação do cádmio incorporado pelas células das linhagens WT, tps1 e nth1

coletadas na fase LOGARÍTMICA (A) de crescimento celular, e na fase ESTACIONÁRIA (B).

A

B


59

6.3 - Determinação de cádmio incorporado pelas células viáveis e mortas

De acordo com os dados apresentados na figura 20, usando-se a concentração de

50ppm não foram observadas diferença na incorporação de cádmio. Na concentração de

800ppm observou-se que existe uma maior incorporação de cádmio utilizando células

vivas. Houve um aumento de 45%, 17% e 52% na incorporação de cádmio usando células

vivas das linhagens WT, tps1 e nth1 respectivamente, quando comparado com a

incorporação pelas células mortas por autoclavação. Muito provavelmente, a diminuição na

incorporação do cádmio em células mortas ocorre devido aos seguintes fatores: em células

mortas a incorporação ocorre somente na superfície celular, devido a dificuldade de

penetração do metal, causada pelos danos aos complexos celulares responsáveis pelo

transporte; os sítios de adsorção podem ter sido desnaturados devido ao choque da alta

temperatura durante o processo de autoclavação.

Em estudos realizados por Suh e colaboradores (1998), células de S. cerevisiae

vivas incorporam 10 vezes mais Pb2+, do que células mortas por autoclavação. Utilizando a

técnica de microscopia eletrônica os autores observaram que células vivas incorporam Pb2+

tanto na superfície celular quanto nos componentes intracelulares. Enquanto que, em

células mortas observa-se a presença do metal apenas na membrana da célula. Desta forma

os autores concluíram que o acúmulo de Pb2+ em células mortas de S. cerevisiae é menor

devido à diminuição do número de sítios ligantes do metal, causados pela autoclavação.

Adamis e colaboradores (2003), trabalhando com a levedura S. cerevisiae,

observaram que células mortas não incorporam cádmio. Esses resultados são contrários aos

encontrados neste trabalho. De fato, foi observado que as células mortas têm uma menor

incorporação de cádmio quando comparadas as células viáveis, porém o fato das células

estarem mortas não implica na incapacidade de incorporação do cádmio (Figura 20).

A figura 19, mostra que havia uma dependência do tempo de incubação das células

com o metal. Para certificar que o fato ocorria, aumentou-se o tempo de exposição das

células ao metal para 8 e 16 horas. Os resultados, apresentados na figura 21, mostraram que

o aumento do tempo de exposição ao metal aumenta a quantidade de cádmio incorporado.

Após a verificação que células viáveis apresentam uma maior incorporação de

cádmio que células mortas por autoclavação, todos os experimentos subseqüentes foram


60

realizados com células viáveis. O protocolo usado na obtenção das células se manteve

constante: células viáveis coletadas em fase logarítmica, expostas por 16 horas ao cádmio,

adicionado no meio extracelular. A opção por 16 horas se deveu ao fato que, quanto maior

o tempo de exposição ao metal, maior é a incorporação de cádmio pelas células e o

protocolo de estresse com cloreto de cádmio neste tempo era exeqüível, permitindo que as

células fossem obtidas após entrarem em fase logarítmica do crescimento.

De acordo com os resultados apresentados na tabela 02, a incorporação de Cd

durante 16 horas por células viáveis, incubadas na concentração de 50ppm, não apresenta

diferença significativa entre as três linhagens estudadas. Na concentração de 800 ppm

observou-se que a célula com excesso de trealose (nth1) não apresentou diferença na

incorporação de cádmio, quanto comparada com a linhagem WT. Porém, observa-se que

quando não existe a presença do dissacarídeo (linhagem tps1), as células têm uma queda na

incorporação de cádmio de 59%, comparada à incorporação obtida nas células da linhagem

WT na presença de 800 ppm. Este resultado mostra que a falta de trealose tem uma

importante participação na incorporação do metal sob altas concentrações.

Martínez-Esparza e colaboradores (2007), usando mutante que apresenta deleção do

gene que codifica a enzima trealose-6-fosfato sintase (tps1/tps1) na levedura Candida

albicans, observaram a existência de modificações estruturais e/ou químicas na parede

celular destas células. Da mesma forma, é possível considerar que tais alterações também

ocorram na linhagem tps1 de S. cerevisiae, de modo a dificultar a incorporação de cádmio,

ou ainda que exista uma diminuição do transporte deste metal para o interior das células

(hipótese já considerada anteriormente). Situações estas que poderiam justificar a

diminuição da incorporação do cádmio pela mutante tps1. Além do mais, a presença de um

excesso de trealose intracelular (linhagem nth1) não promove uma maior incorporação de

cádmio, quando comparados com os resultados obtidos na linhagem selvagem. Em

conjunto, pode-se considerar que na ausência de trealose, as células incorporam menos

cádmio, e que a presença de um excesso de trealose não tem qualquer efeito na

incorporação do metal. Esse resultado parece estar em acordo com resultados bem

conhecidos sobre o papel desempenhado pela trealose na proteção ao choque térmico: a

trealose parece ser importante durante o choque térmico, mas, sua permanência na

recuperação do estresse térmico atrapalha a ação das proteínas do choque térmico (SINGER


61

et al.,1998). Nos resultados aqui apresentados não foi observado que o excesso de trealose

prejudica a incorporação do metal, entretanto, não foi observado aumento na incorporação

de cádmio proporcionado pelo excesso do carboidrato.


62

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

50ppm 800ppm

µµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g pe

so s

eco

BIOSORÇÃO BIOACUMULAÇÃO

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

50ppm 800ppmµµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g p

eso

seco


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000


Cd

inco

rpor

ado/

g p

eso

seco


FIGURA 20 – Determinação de cádmio incorporado pelas células viáveis e não viáveis no período

de 16 horas. Linhagens WT (A), tps1 (B) e nth1 (C).

A

C

B


63

TABELA 02 – Incorporação de cádmio durante 16 horas por células viáveis de Saccharomyces

cerevisiae (µg Cd incorporado/g peso seco)

WT tps1 nth1

50ppm CdCl2 1100(a) ± 173(b) 1100 ± 173 1210 ± 420

800ppm CdCl2 24666 ± 2041 10233 ± 680 25500 ± 2121

a – média de experimento realizado em triplicata

b – desvio padrão


64

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

50ppm (2hrs)

50ppm (4hrs)

50ppm (8hrs)

50ppm(16 hrs)

800ppm(2 hrs)

800ppm(4 hrs)

800ppm(8 hrs)

800ppm(16 hrs)

µµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g p

eso

seco

WT tps1 nth1

FIGURA 21 – Incorporação de cádmio em tempos variáveis por células viáveis de Saccharomyces

cerevisiae, WT, tps1 e nth1.


65

6.4 – Determinação de incorporação de cádmio em células suplementadas com

glutationa reduzida e aminoácidos

Para verificar se, além da presença da trealose, outro composto conhecido como

importante na defesa ao papel nocivo desencadeado por metais em altas concentrações teria

influência na incorporação do cádmio, foi realizado a incorporação do metal na presença de

glutationa, e dos aminoácidos formadores de glutationa, adicionados previamente ao meio

de incubação.

De acordo com a literatura, a glutationa (GSH) é a principal molécula implicada no

seqüestro de metais, dentre eles o cádmio. Glutationa é um tripeptídeo formado pelos

aminoácidos: L-ácido glutâmico, L-cisteina e glicina, é provavelmente o mais importante

grupo tiol de baixo peso molecular encontrado em sistemas biológicos. Está envolvido em

numerosas reações bioredutoras, processos de transporte, proteção contra os radicais livres

prejudiciais e, detoxificação de diferentes xenobióticos (PENNINCKX et al., 1993).

A via para a detoxificação do cádmio pela levedura S. cerevisiae envolve sua

quelação pelas moléculas de glutationa e a formação de complexos chamados bis-

glutationato de cádmio - Cd(GS)2 e seu transporte para o vacúolo (Figura 22)

(BAUDOUIN-CORNU et al., 2006). Algumas leveduras têm a habilidade de acumular

glutationa intracelular e certos aminoácidos têm um importante papel no efeito da

acumulação de glutationa pelas leveduras (WEN, 2005).

FIGURA 22 – Complexo formado entre cádmio e a glutationa, Bis(glutationato) de cádmio –

Cd(GH)2. Fonte: LI et al. (1997).


66

Com o intuito de verificar a influência da glutationa e, dos aminoácidos que

constituem a mesma, na incorporação de cádmio, nas linhagens de S. cerevisiae,

adicionado, em uma série, glutationa reduzida e, em outra, os aminoácidos (cisteína, ácido

glutâmico e glicina) ao meio externo. Após cinco horas de incubação as células foram

transferidas para um novo meio e expostas ao cádmio durante 16 horas.

Analisando os resultados apresentados na figura 23, foi observado que as células

tratadas com glutationa reduzida suplementada ao meio externo, não apresentaram

alteração na incorporação de cádmio quando comparada com as células não suplementadas.

De acordo com a literatura, a glutationa adicionada ao meio não é capaz de ser transportada

pelas células efetivamente (ANDERSON et al., 1989). Em estudo realizado por Meister e

colaboradores (1983) foi observado que a administração de glutationa exógena leva a um

pequeno aumento nos níveis intracelulares de glutationa, porém esse aumento não é

resultado de um transporte da glutationa, mas sim, de sua degradação extracelular, seguida

pelo transporte dos produtos e, posterior síntese intracelular. Para uma melhor incorporação

de glutationa, a literatura recomenda o uso de um derivado da glutationa, a glutationa

monoetil éster (GME), que atravessa a membrana celular por difusão passiva, dentro da

célula sofre uma hidrólise por esterases e, assim, aumenta os níveis de glutationa

intracelular (ANDERSON et al., 1989).

Após constatar que a presença de glutationa reduzida ao meio externo não alterou a

incorporação de cádmio, optou-se por verificar se, os aminoácidos que formam a

glutationa, (10mM ácido glutâmico, 18 mM glicina e 3,35 mM cisteína) seriam capazes de

influenciar na incorporação do metal pelas células. Em estudo realizado por Wen e

colaboradores (2005), após a incubação de Saccharomyces cerevisiae com as concentrações

acima citadas de aminoácidos, o nível de glutationa intracelular aumentou em 72,2% em

relação ao controle.

De acordo com a figura 23 observa-se que nas três linhagens estudadas, as células

tratadas com aminoácidos, tiveram diminuição significativa na incorporação de cádmio,

tanto na concentração de 50ppm quanto, na concentração de 800ppm. Gomes e

colaboradores (2002) formularam a hipótese que a concentração do complexo cádmio-

glutationa pode controlar a incorporação do metal pela célula. O estudo concluiu que,


67

quanto maior for a concentração do complexo Cd(GS)2 no citoplasma menor é a

incorporação de cádmio, por outro lado, quando a concentração do complexo for baixa a

célula incorpora uma maior quantidade do metal. Está hipótese foi confirmada pelos

autores utilizando uma linhagem de S. cerevisiae que apresenta deleção no gene GSH1

(linhagem incapaz de sintetizar glutationa, portanto, não pode formar o complexo cádmio-

glutationa). Esta linhagem incorporou duas vezes mais Cd que a linhagem controle, porém

ao tratar essas células com GME (glutationa monoetil éster), o nível de glutationa no

interior da célula foi restaurado e, observou-se que a capacidade de incorporação do metal

diminuía aos mesmos níveis da linhagem controle. Estes dados confirmam os resultados

obtidos na figura 23, após a incorporação dos aminoácidos responsáveis pela formação da

glutationa, o nível de cádmio absorvido pelas linhagens diminuiu significativamente,

provavelmente, ocorreu um aumento nos níveis de glutationa e assim, um aumento na

formação do complexo Cd(GS)2 que resultaram no controle da entrada do metal pela célula.


68

A

05000

100001500020000250003000035000


Cd

inco

rpor

ado/

g p

eso

seco

Ausência de GSH e aa Presença de aa Presença de GSH

B

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

50ppm 800ppm

µµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g pe

so s

eco


C

05000

100001500020000250003000035000

50ppm 800ppm

µµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g p

eso

seco


FIGURA 23 – Incorporação de cádmio durante 16 horas em células não tratadas, tratadas

aminoácidos (aa) e tratadas com glutationa reduzida (GSH) nas linhagens S. cerevisiae WT (A), S.

cerevisiae tps1 (B) e S. cerevisiae nth1 (C).


69

6.5 – Determinação de cádmio na superfície celular

O papel da parede dos microrganismos no processo de biosorção é adsorver os

metais em sua parede ou transportar os metais através de sua membrana celular. Volesky e

colaboradores (1993) observaram que o cádmio não pode ser adsorvido na superfície da

parede celular de S. cerevisiae, mas sim acumulado em vacúolos no interior das células. No

entanto, Suh e colaboradores (1998) mostraram que o cádmio foi adsorvido na parede

celular de S. cerevisiae e também acumulado dentro da célula, e que o chumbo foi

acumulado apenas na superfície da célula de Aureobasidium pullulans devido a influencia

de polímeros extracelulares.

A determinação de cádmio na superfície celular foi realizada utilizando do uso da

técnica de espectometria por dispersão de energia (EDS) que permite análise na superfície

da amostra e a determinação da presença ou não de cádmio na parede celular das células

vivas (bioacumulação) e das células mortas (biosorção). A técnica de espectometria é capaz

de determinar a composição de materiais em volumes de até no mínimo 1µm cúbico

aproximadamente.

Os resultados apresentados nas figuras 24, 25 e 26, mostram que nas linhagens WT,

tps1 e nth1, na concentração de 50ppm de cádmio, o metal é encontrado apenas na

superfície de células mortas. Enquanto que na concentração de 800ppm, o metal é

encontrado tanto na superfície das células mortas quanto em células viáveis. Esta mesma

técnica foi utilizada no trabalho de PARK (2003), onde duas linhagens de S. cerevisiae

foram analisadas por EDS e, o autor verificou que o cádmio tem a capacidade de se ligar na

superfície celular.

Em células mortas o metal se liga a componentes presentes na parede celular,

enquanto em células vivas o metal é incorporado pelas células por processos ativos. Foi

observado que na concentração de 50ppm, as células viáveis não apresentam o pico

característico de cádmio, mas nas células não viáveis este pico foi detectado. Na

concentração de 800ppm, os picos de cádmio foram identificados nas células viáveis e nas

células mortas. Quando foi empregada a técnica da ativação neutrônica foi determinado

cádmio nas células vivas, na concentração de 50 ppm (vide figura 16). Usando a técnica

EDS o cádmio não pode ser determinado (Ver figura 24B). Como o EDS é uma técnica que


70

permite somente detectar o que está ligado na superfície, pode-se considerar que em células

viáveis, na concentração de 50 ppm, não existe fixação de cádmio na parede celular. Desta

forma, conclui-se que, nesta concentração, as células são capazes de incorporar todo o

metal e depositá-lo no interior.

O mesmo perfil dos resultados descritos para a linhagem WT (Figura 24) foi

observado nas linhagens tps1 e nth1 (vide Figura 25 e 26)


71

FIGURA 24 – Determinação de cádmio na superfície celular de Saccharomyces cerevisiae WT em

células mortas – Biosorção (A), e em células viáveis – Bioacumulação (B).


72

FIGURA 25 – Determinação de cádmio na superfície celular de Saccharomyces cerevisiae tps1 em



73

FIGURA 26 – Determinação de cádmio na superfície celular de Saccharomyces cerevisiae nth1 em



74

6.6 - Determinação da incorporação de cádmio em meio suplementado com

galactose e glicose

O acúmulo intracelular de trealose além de ser muito importante na proteção às

diferentes condições de estresse, sua presença está relacionada com a capacidade da célula

em crescer em meios contendo açúcares rapidamente fermentáveis (THEVELEIN et al.,

1995). A linhagem mutante tps1 de S. cerevisiae (linhagem que não sintetiza trealose) é

incapaz de crescer em fontes de carbono fermentáveis como glicose e frutose. Sabe-se que

os níveis mínimos de trealose-6-fosfato sintase são necessários para o controle do influxo

de glicose.

Estudos comprovam que a linhagem tps1 não é capaz de crescer em glicose devido

a uma desregulação no influxo do açúcar, culminando com um grande acúmulo de glicose

livre intracelular (glicose na forma não fosforilada), uma rápida depleção no ATP e em

particular, uma diminuição acentuada na concentração dos fosfatos livres (HOHMANN et

al., 1993).

A linhagem tps1 utilizada neste estudo teve como fonte de carbono para seu

crescimento galactose, as demais linhagens (WT e nth1) tiveram como fonte de carbono a

glicose. Para avaliar se a fonte de carbono influenciaria na incorporação do metal pelas

leveduras, as linhagens WT e nth1 foram crescidas em meio com galactose e incubadas com

cádmio durante 16 horas.

Como pode ser observado nas figuras 27A e B, o crescimento das linhagens usando

como fonte de carbono galactose ou glicose, não influenciou na incorporação do metal.

Portanto, prosseguiram-se os experimentos utilizando a glicose como fonte de carbono para

o crescimento das linhagens WT e nth1, e galactose para a linhagem tps1.


75

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

50ppm 800ppm

µµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g pe

so s

eco

Galactose Glicose

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

50ppm 800ppm

µµ µµg

Cd

inco

rpor

ado/

g pe

so s

eco

Galactose Glicose

FIGURA 27 – Diferença nos níveis de incorporação de cádmio em 16 horas, nos meios

YPGalactose e YPGlicose. Linhagem WT (A) e nth1 (B).

A

B


76

6.7 – Síntese de trealose em resposta à presença de cádmio

Em várias espécies de leveduras as células respondem à presença de estresses no

meio com um grande acúmulo de trealose. Este acúmulo de trealose intracelular parece ser

uma forma importante para a proteção da integridade da célula e se correlaciona com uma

maior possibilidade de sobrevivência das mesmas (ARGÜELES, 2000; SINGER et al.,

1998). No escopo deste trabalho, era de grande importância conhecer se a presença de

cádmio no meio extracelular induziria o acúmulo de trealose pelas células. Para tanto

realizou-se o experimento apresentado na figura 28-A. Deve-se ressaltar que as células

foram coletadas em fase logarítmica, fase em que os níveis de trealose são muito baixos,

isto pode ser observado pelos níveis de trealose determinado nas células na situação

controle (ausência de cádmio). Observa-se na linhagem WT, que com o aumento gradativo

das concentrações de cádmio (50, 100, 350 e 800ppm) ocorre uma elevação significativa

nos níveis de trealose quando comparados aos níveis apresentados pelas células na situação

controle. Este acúmulo de trealose foi obtido na fase logarítmica, significando que as

células responderam a presença de cádmio com o acúmulo de trealose. Observa-se ainda

que quando as células foram incubadas por 2 horas na presença de 800ppm de cádmio,

houve um aumento na síntese de trealose maior que o determinado para as outras

concentrações. O aumento do tempo de incubação de 2 para 4 horas faz com que os níveis

de trealose fossem altos, semelhantes aos valores obtidos com 800 ppm em 2 horas.

Aparentemente, este valor máximo de trealose intracelular acumulada, obtido à 800ppm,

parece ser a capacidade máxima da célula em acumular trealose intracelular na presença de

CdCl2 nas condições deste estudo.

Os resultados obtidos usando-se a linhagem nth1 foram bastante diferentes daqueles

observados para a linhagem WT. Inicialmente, notou-se que os níveis de trealose na

ausência de cádmio (situação controle) são em média 5 vezes maiores do que os

apresentados pela linhagem selvagem na ausência de estresse. Este alto valor obtido é

facilmente compreendido pelo fato da linhagem nth1 não apresentar o gene que codifica a

enzima trealase neutra (NTH1) responsável pela quebra da trealose. Quando as células

foram expostas por 2 horas às concentrações aumentadas de cloreto de cádmio, não

apresentaram alterações na síntese de trealose quando comparado aos seus controles. Este


77

resultado pode indicar que o tempo de 2 horas foi curto para esta linhagem identificar a

presença de cádmio no meio como uma situação nociva, que deveria ser combatida com o

aumento na síntese de moléculas que possam ajudar a sua proteção. Este resultado foi o

mesmo obtido na linhagem WT, excetuando o resultado obtido a 800 ppm, e ao fato dos

níveis de trealose sintetizados serem menores. Com o aumento do tempo de exposição das

células nth1 ao metal para 4 horas, observa-se que houve um aumento significativo de

síntese do dissacarídeo em todas as concentrações de cádmio quando comparados aos seus

controles (ausência de cádmio). Este resultado indica que o tempo de 4 horas de exposição

ao metal, foi suficiente para a célula conseguir detectá-lo e responder com um pequeno

aumento na síntese de trealose (pequeno se comparado com o aumento verificado na

linhagem WT na mesma situação).

Outro fato que chama a atenção nos resultados obtidos com a linhagem nth1 é que

na situação controle (ausência de cádmio), verifica-se uma diminuição nos níveis de

trealose tanto no tempo de 2 horas como no tempo de 4 horas. Deve-se ressaltar que apesar

desta diminuição, os níveis de trealose acumulados são 4 vezes maiores que os obtidos na

situação controle para a linhagem WT. Acredita-se que isto se deva ao fato da linhagem

nth1 apresentar apenas deleção no gene NTH1, e conservar intacto o gene NTH2. Dados na

literatura mostram que S. cerevisiae possui 2 genes que codificam para a trealase neutra

NTH1 e NTH2. Estes genes codificam duas proteínas isoformas com 77% de identidade.

Tem sido notado que a deleção no gene NTH1 em leveduras é associado com a ausência da

dosagem “in vitro” da atividade trealásica (NWAKA et al., 1995). Recentemente, foi

detectada atividade residual trealásica com degradação de trealose “in vivo”, na fase

estacionária de crescimento, usando glicose ou trealose como fonte de carbono (PARROU

et al., 2005). Esta atividade residual foi atribuída a expressão do gene NTH2 uma vez que,

os autores usaram a mesma linhagem utilizada em nosso estudo. Assim, acredita-se que a

diminuição dos níveis de trealose obtidos na situação controle, nesta linhagem, se deva à

presença do gene NTH2.

O acúmulo de trealose intracelular aparece na literatura como sendo importante na

defesa de células de S. cerevisiae submetidas a diferentes condições de estresse

(ATTFIELD, 1987; VAN LAERE, 1989). Entretanto, existem poucos trabalhos que

demonstram o papel da trealose na proteção contra o estresse oxidativo. Uma exceção é o


78

trabalho de Benaroudj e colaboradores (2001). Estes autores demonstraram a importância

deste carboidrato em células de S. cerevisiae expostas ao peróxido de hidrogênio. Neste

trabalho os autores também trabalharam com mutante tps1, entretanto, devemos ressaltar

que são bem conhecidos os fatores de transcrição ativados pelo peróxido de hidrogênio

(YAP1 e SKN7) enquanto para o cádmio apenas um fator de transcrição é ativado (YAP1)

(LEE et al., 1999; VIDO et al., 2001). Outros trabalhos sugerem a importância deste

carboidrato no estresse oxidativo, mas não demonstram o papel da trealose neste estresse,

por exemplo, Elbein e colaboradores (2003). Já tinha sido demonstrado por Brennan (1996)

que o cádmio é um indutor de estresse oxidativo na levedura S. cerevisiae, assim, decidiu-

se verificar o papel da trealose no estresse oxidativo induzido pelo cádmio.

Para melhor entender o papel da trealose no quadro do estresse oxidativo induzido

pelo cádmio, foi determinado os níveis de oxidação intracelular gerados pelo metal com o

auxílio de uma sonda fluorescente. Foram usadas células em situação controle (ausência de

cádmio), células expostas a 50ppm e 800ppm de cádmio e, linhagens que apresentam níveis

diferenciados de trealose.


79

0

5

10

15

20

25

30

35

Controle 50ppm 100ppm 350ppm 800ppm

Tre

alos

e ( µµ µµ

g/m

oles

glic

ose

libe/

mg

peso

úm

ido)

0 Horas 2 Horas 4 Horas

0

5

10

15

20

25

30

35

Controle 50ppm 100ppm 350ppm 800ppmTre

alos

e ( µµ µµ

g/m

oles

glic

lib/

mg

peso

úm

ido)

0 Horas 2 Horas 4 Horas

FIGURA 28 – Influência das concentrações de cloreto de cádmio sobre os níveis de trealose da

linhagem S. cerevisiae WT (A) e S. cerevisiae nth1 (B).

A

B


80

6.8 – Determinação do nível da oxidação intracelular

Para determinar o aumento da quantidade de ROS gerados nas células, após a

incorporação de cádmio, foi utilizada a sonda fluorescente 2´,7`- diclorodihidrofluoresceína

diacetato (DCFH-DA). Esta sonda é absorvida e transformada no interior das células após

clivagem dos diacetatos por esterases intracelulares, perdendo assim a capacidade de ser

exteriorizada da célula. No interior das células o produto resultante, a 2´,7´-

diclorofluoresceína, se torna mais fluorescente quanto mais oxidante for o ambiente

intracelular, assim o aumento na fluorescência se correlaciona com o aumento da oxidação

intracelular (FIGURA 29) (DAVIDSON et al., 1996). A sonda fluorescente adicionada ao

meio é capaz de detectar qualquer tipo de oxidação presente na solução. O excesso da

sonda fluorescente, que não foi absorvida pelas células, foi eliminado pela lavagem do

extrato, antes da ruptura da membrana celular, realizado com o auxílio de pérolas de vidro.

FIGURA 29 – Mecanismo de ação das esterases na 2,7-diclorodihidrofluoresceína diacetato

(DCFH-DA) formando 2,7- diclorohidrofluoresceína, e a futura oxidação pela ROS formando assim

a 2,7-diclorofluoresceína (DCF). Fonte: GOMES et al. (2005).


81

O monitoramento da fluorescência obtido nas linhagens WT, tps1 e nth1 foi usado

para estimar o nível de oxidação intracelular das células e está apresentado na tabela 3.

Observa-se na tabela 03 que as linhagens WT e nth1 não apresentam diferença nos níveis de

oxidação intracelular na concentração de 50ppm, quando comparado às suas situações

controle (ausência de cloreto de cádmio). Apenas na concentração de 800ppm ocorreu um

aumento de 2,9 (WT) e 6,6 (nth1), nos níveis da oxidação intracelular, quando comparados

à condição controle de cada linhagem. Estes dados são parcialmente coerentes com o

resultado de incorporação de cádmio, apresentado na tabela 02, (página 62), onde

observou-se que as linhagens WT e nht1 apresentam a mesma incorporação de cádmio.

Porém, obtivemos níveis de oxidação intracelular, em 800 ppm, muito maior na nth1. No

presente caso, os níveis de trealose são altos devido a uma mutação e não devido à presença

de estresse, assim, a resposta nestas duas situações seria diferente. Na célula nth1 o nível

endógeno natural de trealose é muito alto, sendo pouco aumentados pela presença de 800

ppm de cádmio (Figura 28), sendo assim, não pode contrabalançar a grande indução de

radicais livres muito alta nestas condições.

Observa-se ainda na tabela 03 que a linhagem tps1 possui um alto nível de oxidação

na condição controle, quando comparados com os controles das linhagens WT e nth1.

Verifica-se um aumento de 61% e 74% em relação às linhagens WT e nth1,

respectivamente. Este resultado mostra que, na ausência de qualquer estresse, existe um

aumento na produção e/ou geração de radicais livres determinados na linhagem tps1.

Acredita-se que isto se deva ao fato das células serem incubadas em presença de oxigênio e

os radicais livres gerados pela redução ineficiente desta molécula. O fato desta linhagem

não apresentar trealose parece proporcionar aumento na geração de radicais livres em

ausência de estresse. Observa-se ainda que na linhagem tps1 houve um aumento

significativo de 47% e 83% nos níveis de oxidação intracelular, tanto a 50ppm quanto a

800ppm, comparados com o resultado obtido na ausência de cádmio. Correlacionando este

resultado com a incorporação do cádmio (Tabela 02, página 62), observa-se que a linhagem

tps1 incorpora menos cádmio que as linhagens WT e nth1, porém, a geração de radicais

livres é maior.

Concluiu-se que na linhagem que não apresenta trealose ocorreu uma diminuição da

incorporação de cádmio e um aumento nos níveis oxidativos intracelulares. Na linhagem


82

com excesso de trealose (nth1), a incorporação de cádmio é a mesma verificada na

linhagem selvagem (Tabela 02), porém, a geração de radicais livre é muito maior (tabela

03).

Em estudo realizado por ADAMIS e colaboradores (2003) observou-se que o

aumento dos níveis de oxidação intracelular é diretamente relacionado com a quantidade de

cádmio incorporado pelas células de S. cerevisiae. Neste estudo não foi obtido esta

correlação, o fato da tps1 incorporar menos cádmio não implicou em menores níveis de

oxidação, e o fato da nth1 incorporar a mesma quantidade de cádmio que a WT não

implicou na mesma determinação de radicais livres gerados.

Após verificar os níveis oxidativos das linhagens estudadas, foram avaliados os

danos causados pelos radicais livres usando alguns biomarcadores do estresse oxidativo. A

peroxidação de lipídeos, a carbonilação de proteínas e o conteúdo de resíduos sulfidrílicos

totais.


83

TABELA 03 – Determinação dos níveis de oxidação intracelular em linhagens de Saccharomyces

cerevisiae

WT tps1 nth1

Controle 84,9(a) ± 10,06(b) 137,0 ± 9,83 78,7 ± 5,51

50ppm CdCl2 98,6 ± 15,66 202,2 ± 13,65 89,2 ± 4,97

800ppm CdCl2 247,5 ± 60,68 251,9 ± 33,30 518 ± 31,71




84

6.9 – Determinação dos níveis de peroxidação lipídica

Um dos principais alvos dos radicais livres formados durante o estresse oxidativo

são os ácidos graxos poli insaturados (PUFA – Poli Unsaturated Fat Acid) que compõem a

bicamada lipídica das membranas celulares (VALKO et al., 2005). Apesar das células de S.

cerevisiae possuírem pouco PUFA, é possível determinar os danos lipídicos, conforme

trabalho realizado por Howllet e colaboradores (1997), que demonstraram que a

peroxidação de lipídeos foi induzida por diferentes concentrações dos metais cádmio e

cobre em linhagem de S. cerevisiae.

A formação de peróxidos lipídicos causam grandes prejuízos ao organismo, pois

promove uma alteração na capacidade seletiva das membranas, favorecendo a entrada e a

saída indiscriminada de metabólitos e detritos da célula, fato este freqüentemente associado

à morte celular (PEREIRA et al., 2003). É importante mencionar que a manutenção da

integridade da membrana citoplasmática ou das organelas, é vital para o funcionamento

celular

Os níveis de peroxidação lipídica foram determinados de acordo com a quantidade

de malondialdeído (MDA), produto final do aquecimento de peróxidos lipídicos. Cada

molécula de MDA reage com duas moléculas de ácido tiobarbitúico, formando uma

substância cromófora que é passível de ser determinada espectrofotometricamente

(ESTEUBAUER et al., 1991). Os resultados obtidos foram expressos na forma de relação

entre os níveis de MDA de células expostas a 50ppm e 800ppm de cádmio e células

controles (ausência de cádmio).

A análise dos resultados da tabela 04 mostra que na linhagem WT, na concentração

de 50ppm não ocorre aumento dos danos lipídicos quando comparado a situação controle,

porém na concentração de 800ppm foi determinado um aumento de dano lipídico em 1,6

vezes em relação ao seu controle. Assim, pode-se considerar que altas concentrações do

metal causam danos aos lipídeos.

A linhagem nth1 na situação controle apresenta um nível de peroxidação de lipídica

maior que a situação controle da linhagem WT, ou seja, as células da linhagem com excesso

de trealose, mesmo sem estresse tem um alto nível de danos lipídicos. Porém, comparando

as concentrações de 50ppm e 800ppm com seu controle (ausência de cádmio), não


85

apresentam diferença significativa entre si. Aparentemente, um excesso de trealose não

permite um aumento nos danos lipídicos quando a célula está exposta ao cádmio.

A linhagem que não apresenta síntese de trealose (tps1) mostra um alto nível de

danos aos lipídeos já na situação controle, ou seja, ausência de qualquer estresse quando

comparado com a linhagem WT também na situação controle. A presença do cádmio

promove um aumento de 1,2 e 1,4 vezes nos danos lipídicos, nas concentrações de 50ppm e

800ppm quando comparada a sua situação controle. Observa-se ainda que a linhagem (tps1)

incorpora menos Cd (Tabela 02) que as demais linhagens, porém mesmo com uma menor

incorporação de Cd, os danos aos lipídeos são maiores (Tabela 04). Observa-se assim que a

ausência desse dissacarídeo causa um aumento nos danos lipídicos e demonstra o

importante papel protetor da trealose aos lipídeos.

Comparando-se as linhagens tps1 e nth1 em ausência de cádmio, verificou-se que as

duas linhagens possuem duas vezes mais lipídeos peroxidados que os determinados na

linhagem WT, na mesma situação (controle). Possivelmente, as células na ausência do

cádmio (situação controle) necessitam de um nível normal de trealose, níveis esse

encontrados em situações normais de células sem deleções, para modularem os ataques de

radicais livres provenientes da respiração celular e, conseguirem proteger seus lipídeos. A

total ausência de trealose (tps1) ou, o excesso (nth1), deixam a célula exposta as ROS

verificando-se assim, um maior dano aos lipideos.

De acordo com dados da literatura, a trealose tem o papel de estabilizar membranas

durante exposição ao estresse oxidativo (HERDEIRO et al., 2006). Estudos realizados por

Pereira e colaboradores (2003) mostraram que sob situação de desidratação, a tolerância

das leveduras é altamente influenciada pela presença de trealose, que em muitos casos

protege a membrana plasmática contra os danos. Oku e colaboradores (2003) demonstraram

em estudos in vitro que parte da molécula de trealose, interage especificamente com uma

dupla ligação cis de um ácido graxo insaturado, por meio de ligações de ponte de

hidrogênio, que envolve grupos hidroxilas OH-6 e OH-3 ou OH-2 com a trealose.


86

TABELA 04 - Determinação dos níveis de peroxidação de lipídeos (picomoles MDA/mg

proteína/mL) em linhagens Saccharomyces cerevisiae.

WT tps1 nth1

Controle 28,1(a) ± 5,93(b) 51,4 ± 1,34 49,03 ± 1,46

50ppm CdCl2 23,8 ± 1,65 63,3 ± 3,28 50,70 ± 1,14

800ppm CdCl2 45,6 ± 3,35 77,8 ± 1,31 53,10 ± 1,59




87

6.10 - Carbonilação de Proteína

As proteínas são as maiores indicadoras de danos causados pelas ROS e dos

processos de estresse oxidativos que ocorrem in vivo, seja nos meios intracelulares ou

extracelulares. De acordo com Davis e colaboradores (1999), durante o estresse oxidativo

cerca 50-75% das proteínas podem ser danificadas. Como as proteínas são os maiores

componentes dos sistemas biológicos, elas são as macromoléculas que mais sofrem com o

ataque das espécies reativas de oxigênio.

Os danos causados pelos radicais livres às proteínas levam a formação de

grupamentos carbonilas. A carbonilação de proteína é produzida por meio da oxidação de

grupos funcionais presentes em cadeias laterais. Os grupos carbonilados podem ser

formados em proteínas por uma reação secundária entre grupamentos da cadeia lateral

(cisteína, lisina e histidina) com aldeídos (malondialdeído e hidroxinoneal) produzidos

durante a peroxidação lipídica ou derivados carbonilados reativos, produzidos pela redução

de açúcares (BERLLET et al., 1997).

Os resultados apresentados na tabela 05 mostraram que a linhagem selvagem na

condição controle, apresentou maior quantidade de proteínas carboniladas que o observado

na mesma situação para as outras linhagens. As linhagem tps1 e nth1, na situação controle,

apresentaram menor dano às proteínas (1,6 e 2,2 vezes respectivamente) quando,

comparadas a situação controle da linhagem WT. A presença de cádmio (nas concentrações

de 50 e 800 ppm) não alterou significativamente os danos às proteínas. Na concentração de

800 ppm, na linhagem nth1, houve um aumento das proteínas carboniladas quando

comparadas ao seu controle. Estes resultados são compatíveis com os resultados obtidos

com a técnica que usa diclorofluoresceína (níveis de oxidação intracelular), vide tabela 03.

Acredita-se que os altos níveis de ROS gerados com 800 ppm na linhagem nth1 foram

responsáveis pelos danos verificados às proteínas.

As proteínas carboniladas determinadas nas três linhagens em ausência de estresse

(condição controle) mostraram que a linhagem com excesso de trealose (nth1) apresentou

uma menor carbonilação de proteínas quando comparada a linhagem WT. Verificou-se

assim, o papel protetor da trealose contra os radicais livres normalmente formados na


88

célula, porém na ausência de trealose não foi verificado aumento na carbonilação de

proteínas.

Singer e colaborador (1998) demonstraram o importante papel da trealose no

estresse térmico. Com o aumento da temperatura, foi observado um aumento nos níveis de

trealose e seu papel fundamental na estabilização das proteínas no seu estado natural,

reduzindo a agregação e desnaturação proteica. No caso do estresse induzido pelo cádmio,

as proteínas não parecem ser o alvo principal. Apesar da literatura (Singer e colaborador,

1998) considerar que as proteínas são os alvos mais vulneráveis aos ataques pelas ROS,

neste trabalho pode-se observar, que os danos a proteínas são causados apenas quando, os

níveis de ROS são excessivamente altos (vide tabela 03, linhagem nth1, 800ppm).


89

TABELA 05 – Determinação dos níveis de carbonilação de proteínas (nanomoles/mg proteína/mL)

em linhagens de Saccharomyces cerevisiae.

WT tps1 nth1

Controle 2,67(a) ± 0,39(b) 1,68 ± 0,39 1,19 ± 0,040

50ppm CdCl2 3,17 ± 0,46 1,76 ± 0,62 0,99 ± 0,36

800ppm CdCl2 3,18 ± 0,021 2,24 ± 0,34 1,35 ± 0,21




90

6.11 – Resíduos Sulfidrílicos Totais

Os resíduos sulfidrilicos representados principalmente pela glutationa são

abundantes em células e podem ser oxidados pelas espécies reativas de oxigênio, podendo

ser facilmente utilizado como indicador de estresse oxidativo (DEMASI et al., 2006). Um

dos mecanismos da toxicidade ao cádmio em leveduras é sua ligação às proteínas,

resultando na inibição de enzimas essenciais. O cádmio tem afinidade pelo grupo tiol, o que

resulta em sua fácil ligação com resíduos cisteínas em proteínas. Grande parte dos

grupamentos sulfidrílicos da célula se refere à presença de glutationa, que pode ser

encontrada em concentrações de até 10mM em leveduras. A glutationa oxidada (GSSG)

não apresenta grupamentos SH livres, somente quando está na forma reduzida (GSH) que

apresenta os grupamentos SH livres que podem ser usados para se ligar em algumas

substâncias, como por exemplo o cádmio, fazendo o completo cádmio-glutationa –

Cd(GS)2 (BAUDUIN-CORNU et al., 2006). Assim, na presença de algum ligante neste

grupo SH, os resíduos sulfidrílicos determinados serão menores. O reagente Ellman pode

reagir com todos os grupos tiois livres presentes no extrato celular, sendo o mais abundante

a forma reduzida de glutationa (DAVIDSON et al., 2001).

De acordo com os resultados apresentados na tabela 06, pode-se observar que a

linhagem WT possui um aumento de 12% nos níveis de resíduos sulfidrílicos totais, após

tratamento com 50ppm de cádmio, quando comparada com a situação controle. Após

exposição a 800ppm foi determinado uma diminuição de 39% nos resíduos sulfidrílicos. A

linhagem nth1 apresenta o mesmo comportamento observado na linhagem WT, após o

tratamento com 50ppm de cádmio obteve um aumento de 35% nos resíduos sulfidrilicos e,

uma queda de 36% na concentração de 800 ppm

A linhagem tps1 apresentou um aumento de 41% nos níveis de resíduos sulfidrílicos

quando tratada com 50ppm de cádmio comparado com o seu controle. E uma diminuição

de 25% em relação ao seu controle, quando tratada com 800ppm de cádmio. Observa-se

ainda que a linhagem com deleção no gene responsável pela síntese de trealose (tps1), na

situação controle, apresenta um baixo nível de resíduos sulfidrílicos quando comparada

com as linhagens WT e nth1 entretanto, os níveis de resíduos após incorporação de cádmio

se tornam semelhantes às demais linhagens. Pode-se ainda observar que esta linhagem


91

incorpora menos cádmio quando comparada as linhagens WT e nth1 (Tabela 02), porém

seus níveis de resíduos sulfidrílicos não apresentam diferença nas células tratadas com

cádmio (50 e 800ppm) (Tabela 06).

As células quando tratadas com concentração de 50ppm, apresentaram um aumento

nos níveis de resíduos sulfidrílicos nas três linhagens enquanto, na concentração severa de

cloreto de cádmio (800ppm) provocou diminuição significativa dos resíduos sulfidrílicos

totais, quando comparadas a situação controle (ausência de CdCl2). Observou-se que altas

concentrações de trealose (nth1) ou, ausência de trealose (tps1) não interfere no conteúdo

de resíduos sulfidrílicos em presença de cloreto de cádmio. Na situação controle verifica-se

uma alteração quando as três linhagens são comparadas: os níveis de resíduos sulfidrílicos

totais é bem menor na linhagem tps1, provavelmente, isto se deva ao fato de que na

ausência de trealose a célula deva usar muito do seu estoque de glutationa reduzida na

defesa contra os radicais livres, normalmente formados na célula. Desta forma quando esta

determinação é realizada na linhagem tps1, obteve-se níveis bem menores que nas

linhagens que não têm a mutação apresentada pela linhagem tps1.

Segundo Brennan (1996), baixas concentrações de cádmio podem aumentar a

resistência, e consequentemente, induzir os mecanismos de defesa. Assim, quando as

células são incubadas com 50 ppm de cádmio, o metal deve induzir um aumento nas

defesas antioxidantes não enzimáticas, determinando assim, uma maior concentração de

grupos tiois livres. A incubação das células com 800 ppm de cádmio, considerada

excessivamente tóxica implica nas células não conseguirem manter uma resposta

antioxidante (não enzimática) suficiente e continuada para combater esta concentração.

Assim, não foi observada a indução das defesas antioxidantes sendo portanto determinado

uma menor concentração de resíduos sulfidrílicos totais. O mesmo efeito foi observado por

Davidson e colaboradores (2001) em células de S. cerevisiae exposta ao estresse térmico,

onde observaram queda de 50% nos níveis de resíduos sulfidrílicos totais, mostrando assim

os danos provocados pelo choque térmico nas defesas antioxiadantes não enzimáticas.


92

TABELA 06 – Determinação dos níveis resíduos sulfidrílicos totais (µmoles/mg proteína/mL) em

linhagens de Saccharomyces cerevisiae.

WT tps1 nth1

Controle 9,16(a) ± 0,41(b) 6,54 ± 1,04 9,46 ± 1,15

50ppm CdCl2 10,33 ± 0,62 9,25 ± 1,32 12,86 ± 2,72

800ppm CdCl2 5,63 ± 0,32 4,94 ± 0,61 5,96 ± 1,15




93

6.12 - Determinação do status antioxidante total das linhagens pelo radical

DPPH

Recentemente, vários trabalhos sugerem que alguns biopolimeros como glucanos

possuem atividade antioxidante (Jaehrig et al., 2007). A parede celular de S. cerevisiae

consiste de aproximadamente 29-64% -glucanos, 31% manose, 13% proteínas, 9% lipideos,

e 1-2% quitina. Se de fato os glucanos têm atividade antioxidantes, este fato poderia indicar

que estes compostos poderiam proteger os organismos vivos dos ataques das ROS.

Saccharomyces cerevisiae possuem várias substâncias que agem como antioxidantes

enzimáticos (SOD, catalase, glutationa redutase) ou, não enzimáticos (glutationa

ubiquinona, aminoácidos com resíduos sulfirilicos e selênio). Em adição aos antioxidantes

que estão dentro das células, potencialmente, a parede da levedura poderia também exercer

atividade antioxidante. O interesse ao realizar este experimento foi determinar a capacidade

antioxidante das linhagens, WT, tps1 e nth1 usando uma solução metanólica do radical

livre estável DPPH•. O objetivo de usar este método foi verificar se, a ausência ou, excesso

de trealose, promoveria alteração no status antioxidante total das linhagens.

A essência do método DPPH• consiste na reação dos antioxidantes presentes na

amostra com o radical livre estável α,α-difenil-β-picrylladrazil - DPPH• (com forte cor

violeta) e se converte a α,α-difenil-β-picriladrazina com descoloração, o grau de

descoloração indica o potencial “scavenging” da amostra. Os antioxidantes presentes nas

amostras reduzem e descolorem o DPPH através da doação de elétrons. A solução

metanólica de DPPH foi preparada na hora e apresenta uma cor púrpura com uma absorção

máxima de 517 nm (JAYAPRAKASHA et al., 2006).

Segundos os resultados obtidos na figura 30, observa-se que não há diferença

significativa entre as três linhagens quanto aos níveis de defesas antioxidantes. A linhagem

nth1 apresenta um pequeno aumento em relação à linhagem controle, porém não é

significativo. Pode-se observar assim que a diferenças obtidas neste trabalho não parecem

ser devidas às diferenças nos níveis de defesas antioxidantes totais como determinado pelo

radical DPPH•, e sim pelo excesso ou ausência da trealose avaliado pelas linhagens nth1 e

tps1, respectivamente.


94

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

WT tps1 nth1

% In

ibiç

ão

do

rad

ical D

PP

H

FIGURA 30 – Determinação do status antioxidante total das diferentes linhagens Saccharomyces

cerevisiae utilizando o radical DPPH•.



95

7 – Conclusão

Conclusão

96

• A presença de cádmio (10, 25, 50, 75 e 100ppm) inibe o crescimento das células de S.

cerevisiae;

• Em meio sólido observou-se a formação de colônias até a concentração de 25ppm;

• Células coletadas em fase logarítmica incorporaram maior quantidade de cádmio;

• Células viáveis incorporaram mais cádmio que células mortas;

• A presença de glutationa reduzida, no meio extracelular, não interferiu na incorporação

de cádmio

• A presença de aminoácidos formadores da glutationa, no meio extracelular,

proporcionaram diminuição da incorporação de cádmio;

• As células respondem à presença de cádmio no meio extracelular com o acúmulo de

trealose intracelular;

• A linhagem com ausência de trealose (tps1) possui uma maior oxidação intracelular; as

linhagens WT e nth1 apresentaram níveis de oxidação intracelular aumentados apenas na

concentração de 800ppm;

• A presença de cádmio induz a peroxidação de lipídeos;

• Na presença de cádmio não foi verificado o aumento de proteínas carboniladas;

• Altas concentrações de cádmio causaram diminuição dos resíduos sulfidrílicos

enquanto que baixas concentrações causaram aumento;

• Nas três linhagens não foi verificado alteração no status antioxidante total determinado

pelo método DPPH•.

Papel da trealose na proteção durante estresse oxidativo causado por cádmio e a resposta adaptativa ao


97

8 - Referências Bibliográficas

Referências Bibliográficas

98

ADAMIS, P. D. B.; PANEK, A. D.; LEITE, SELMA, G. F.; ELEUTHERIO, ELIS, C. A.

Factores involved with cadmium absorption by a wild-type strain of Saccharomyces

cerevisiae. Brazilian Journal of Microbiology, v. 34, p. 55-60, 2003.

American Cancer Society. Lista dos prováveis carcinorgênicos e suas categorias.

Disponível em:http://www.cancer.org> acesso em 14 de Maio de 2007

ANDERSON, M. E.; MEISTER, A. Glutathione Monoester. Analytical Biochemistry, v.

183, p. 16-20, 1989.

ARGÜELLES, J. C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeast: a comparative

analysis. Archives of Microbiology, v. 174, p. 217-224, 2000.

ATTFIELD, P. V. Trehalose accumulates in Saccharomyces cerevisiae during exposure to

agents that induce heat shock response. FEBS Letters, v. 225, n. 1, p. 259-263, 1987.

ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Lista de substâncias

perigosas classificadas de acordo com sua toxidade, potencial de risco a saúde e exposição

aos organismos vivos. Disponível em: <http://www.atsdr.cdc.gov/cercla/05list.html>

Acesso em 14 de maio de 2007.

BAKER-AUSTIN, C.; WRIGHT, M. S.; STEPANAUSKAS, R. McARTHUR, J. V. Co-

selection of antibiotic and metal resistance. TRENDS in Microbiology, v. 14, n. 4, p.176-

182, 2006.

BAUDOUIN-CORNU, P.; LABARRE, J. Regulation of the cadmium stress response

through SCF-like ubiquitin ligases: comparison between Saccharomyces cerevisiae,

Schizosaccharomyces pombe and mammalian cells. Biochimie, v. 88, n. 11, p. 1673-1685,

2006.


99

BELL, W.; SUN, W.; HOHMANN, S.; WERA, S.; REINDERS, A.; DE VIRGILIO, C.;

WIEMKEN, A.; THEVELEIN, J. M. Composition and functional analysis of

Saccharomyces cerevisiae trehalose synthase complex. The Journal of Biological

Chemistry, v. 273, n. 50, p. 33311-33319, 1998.

BELL, W.; KLAASSEN, P.; OHNACKER, M.; BOLLER, T.; HERWEIJER, M.;

SCHOPPINK, P.; VAN DER ZEE, P.; WIEMKEN, A. Characterization of 56-kDa subunit

of yeast trehalose-6-phosphatate synthase and clonig of its gene reveal its identity with the

product of CIF1, a regulator of carbon catabolite inactivation. Europen Journal of

Biochemistry, v. 209, p. 951-959, 1992.

BENARDOUJ, N.; LEE, D. H.; GOLDBERG, A. L. Trehalose accumulation during

cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals. The

Journal of Biological Chemistry, v. 276, n. 26, p. 24261-24267, 2001.

BERLETT, B. S.; STADTMANT, E. R. Protein Oxidation in Aging, Disease, and

Oxidative Stress. The Journal of Biological Chemistry, v. 272, n. 33, p. 20313-20316,

1997.

BERTIN, G.; AVERBECK, D. Cadmium: cellular effects, modifications of biomolecules,

modulation of DNA repair and genotoxic consequences (a review). Biochimie, v. 88, p.

1549-1559, 2006.

BRAHA, B.; TINTEMANN, H.; KRAUSS, G.; EHRMAN, J.; BÄRLOCHER, F.;

KRAUSS, G-J. Stress response in two strains of the aquatic hyphomycete Heliscus

lugdunensis after exposure to cadmium and copper ions. BioMetals, v. 20, p. 93-105, 2007.

BRENNAN, R. J.; SCHIESTL, R.H. Cadmium is an induce of oxidative stress in yeast.

Mutation Research. v. 356, p. 171-178, 1996.


100

CABIB, E.; LELOIR, L. F. The biosynthesis of trehalose phosphate. The Journal of

Biological Chemistry, v. 231, p. 259-275, 1958.

CATALÁ, A. An overview of lipid peroxidation with emphasis in outer segments of

photoreceptors and the chemiluminescence assay. The International Journal of

Biochemistry & Cell Biology, v. 38, p. 1482-1495, 2006.

CONAMA. Conselho Nacional do Meio Ambiente. Resolução CONAMA nº357:

estabelece a classificação das águas e os níveis de qualidade exigidos. Disponível em:

<http://www.mma.gov.br/port/conama/res/res86/res2086.html.> Acesso em 14 de maio de

2007.

COSTA, V.; MORADA-FERREIRA, P. Oxidative stress and signal transduction in

Saccharomyces cerevisiae: insights into ageing, apoptosis and disease. Molecular Aspects

of Medicine, v. 22, p. 217-246, 2001.

CROWE, J. H.; CROWE, L. M.; CHAPMAN, D. Preservation of membranes in

anhydrobiotic organisms: the role of trehalose. Science, v. 223, p. 701-703, 1984.

CYRNE, L. et al. Regulation of antioxidant enzymes gene expression in the yeast

Saccharomyces cerevisiae during stationary phase. Free Radical Biology & Medicine, v.

34, n. 3, p. 385-393, 2003.

DALLE-DONNE, I.; ROSSI, R.; GIUSTARINI, D.; MILZANI, A.; COLOMBO, R.

Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clinica Chimica Acta;

International Journal of Clinical Chemistry, v. 329, p. 23-38, 2003.

DALLE-DONNE, I.; ALDINI, G.; CARINI, M.; COLOMBO, R.; ROSSI, R.; MILZANI,

A. Protein carbonylation, cellular dysfunction, and disease progression. Journal of

Cellular and Molecular Medicine, v. 10, n. 2, p. 389-406, 2006.


101

DAVIDSON, J. F.; WHITE, B.; BISSINGER, P. H.; SCHIESTL, R. H. Oxidative stress is

involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, v. 93, p. 5116-5121,

1996.

DAVIDSON, J. F.; SCHIESTL, R. H. Cytotoxic and Genotoxic consequences of heat stress

are dependent on the presence of oxygen in Saccharomyces cerevisiae. Journal of

Bacteriology, p. 4580 – 4587, 2001.

DAVIS, M. J.; FU, S.; WANG, H.; DEAN, R. T. Stable markers of oxidant damage to

proteins and their application in study of human disease. Free Radical Biology &

Medicine, v, 27, p. 1151-1161, 1999.

DECKERT, J. Cadmium toxicity in plants: Is there any analogy to its carcinogenic effect in

mammalian cells? BioMetals, v. 18, p. 475-481, 2005.

DEMASI, A. P. D.; PEREIRA, G. A. G.; NETTO, A. E. S. Yeast oxidative stress response

– Influences of cytosolic thioredoxin peroxidase I and of the mitochondrial functional state.

FEBS Journal, v. 273, p. 805-816, 2006.

DE VIRGILIO, C.; BÜRCKERT, N.; BELL, W.; JENO, P.; BOLLER, T.; WIEMKEN, A.

Disruption of TPS2, the gene encoding the 100-kDa subunit of the trehalose-6-phosphate

synthase/phosphatase complex in Saccharomyces cerevisiae, causes accumulation of

trehalose-6-phosphate and loss of trehalose-6-phosphate phosphatase activity. European

Journal of Biochemistry, v. 212, p. 315-323, 1993.

DE VIRGILIO, C.; HOTTIGER, T.; DOMINGUEZ, J.; BOLLER, T.; WIEMKEN, A. The

role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast. I. Genetic

evidence that trehalose is a thermoprotectant. European Journal of Biochemistry, v. 219,

p. 179-186, 1994.


102

DÖNMEZ, G.; AKSU, Z. The effects of copper (II) ions on the growth and

bioaccumulation properties of some yeast. Process Biochemistry, v. 35, p. 135-142, 1999.

DORDEVIC, S.; PETROVIC, S.; DOBRIC, S.; MILENKOVIC, M.; VUCICEVIC, D.;

ZIZIC, S.; KUKIC, J. Antimicrobial, anti-inflammatory, anti-ulcer and antioxidant

activities of Carlina acanthifolia root essential oil. Journal of Ethnopharmacology, v.

109, n. 3, p. 458-463, 2007.

ELBEIN, A. D. The metabolism of α, α Trehalose. Advances in Carbohydrate

Chemistry and Biochemistry, v. 30, p. 227,256, 1974.

ELBEIN, A.D.; PAN, Y.T.; PASTUSZAK,I.; CARROLL, D. New insights on trehalose: a

multifunctional molecule. Glycobiology, v. 13, n.4, p. 17-27, 2003.

ELLMAN, G. L. Tissue Sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophycisc, v.

82, p. 70-77, 1959.

ERCAL, N.; GURER-ORHAN, H.; AYKIN-BURNS, N. Toxic Metals and oxidative stress

Part I: Mechanisms Involved in Metal induced Oxidative Damage. Current Topics in

Medicinal Chemistry, p. 529-539, 2001.

ESTERBAUER, H.; SCHAUR, R. J.; ZOLLNER, H. Chemistry and biochemistry of 4-

hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology &

Medicine, v.11, n.1, p. 81-128, 1991.

FARR, S.; KOGOMA, T. Oxidative stress response in Escherichia coli and Salmonella

typhimurium. Microbiology and Molecular Biology Review, v. 55, p. 561-585, 1991.

FINKEL, T.; HOLBROOK, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.

Nature, v. 408, p. 239-241, 2000.


103

FRANÇA, M. B. M; PANEK, A. D.; ELEUTHERIO, E. C. A. Oxidative stress and its

effects during dehydration. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 146, p. 621-

631, 2007.

FRANKENBERG, D.; FRANKENBERG-SCHWAGNER, M.; HARBICH, R.

Mechanisms of oxygen radiosensitization in irradiated yeast. I. DNA double-strand

breakage. International Journal of Radiation Biology, v. 64, p. 511-521,1993.

GHARIEB, M. M.; Pattern of cadmium accumulation and essential cations during growth

of cadmium-tolerant fungi. Biometals, v. 14, p. 143-151, 2001.

GHEZZI, P.; BONETTO, V.; FRATELLI, M. Thiol-disulfite balance: from the concept of

oxidative stress to that of redox regulations. Antioxidants and Redox Signaling, v.7, p.

964-972, 2005.

GIAGINIS, C.; GATZIDOU, E.; THEOCHARIS, S. DNA repair systems as targets of

cadmium toxicity. Toxicology and Applied Pharmacology, V. 213, n. 3, p. 282-290,

2006.

GÖKSUNGUR, Y.; ÜREN, S.; GÜVENÇ, U. Biosorption of cadmium and lead ions by

ethanol treated waste baker’s yeast biomass. Bioresource Technology, v. 96, p. 103-109,

2005.

GOMES, A.; FERNANDES, E.; LIMA, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection

of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, v. 65,

p.45-80, 2005.

GOMES, D.S.; FRAGOSO, L.C.; RIGER, C.J.; RIGER, A.; ELEUTHERIO, E.C.A.

Regulation of cadmium uptake by Saccharomyces cerevisae. Biochimica et Biophysica

Acta, v. 1573, p. 21-25, 2002.


104

HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free radicals in Biology and Medicine.

Oxford: Clarendon Press, p. 543, 1989.

HALLIWELL, B.; ARUOMA, O. I. DNA and Free Radicals. Ellins Horwood, London

(1993)

HERDEIRO, R.S.; PEREIRA, M. D.; PANEK, M.A. D.; ELEUTHERIO, E.C.A. Trehalose

protects Saccharomyces cerevisiae from lipid peroxidation during oxidative stress.

Biochimica et Biophysica Acta, v. 1760, p. 340-346, 2006.

HOEIJMAKERS, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature,

v. 411, p. 366-347, 2001.

HOHMANN, S.; NEVES, M. J.; KONING, W.; ALIJO, R.; RAMOS, J.; THEVELEIN, J.

M. The growth and signalling defects of the ggs1 (fdp1/byp1) deletion mutant on glucose

are suppressed by a deletion of the gene encoding hexokinase PII. Current Genetics, v. 23,

p. 281-289, 1993.

HOUNSA, C. G.; BRANDT, E. V.; THEVELEIN, J.; HOHMANN, S.; PRIOR, B. A. Role

of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress. Microbiology,

v. 144, p. 671-680, 1998.

HOWLETT, N. G.; AVERY, S. V. Induction of Lipid peroxidation during heavy metal

stress in Saccharomyces cerevisiae and influence of plasma membrane fatty acid

unsaturation. Applied and Environment Microbiology, p. 2971-2976, 1997.

INOUE, M.; SATO, E. F.; NICHIKAWA, M.; HIRAMOTO, K. KASHIWAGI, A.

UTSUMI, K. Free radicals theory of apoptose and metamorphosis. Redox Report, v. 9, p.

238-248, 2004.


105

JAYAPRAKASHA, G. K.; NEGI, P. S.; JENA, B. S. Antioxidative and antimutagenic

actives of the extracts from the rinds of Garcinia pedunculata. Innovative Food Science

and Emerging Technologies, v. 7, p. 246 – 250, 2006.

JAEHRIG, S. C.; ROHN, S.; KROH, L. W.; FLEISCHER, L.; KURZ, T. In Vitro Potential

Antioxidant Activity of (13),(16)- D-Glucan and Protein Fractions from Saccharomyces

cerevisiae cell walls. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.55, n. 12, p. 4710-

4716, 2007.

JONES, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidantes & Redox signaling, v. 8, n. 9,

p. 1865-1879, 2006

KADUKOVÁ, J.; VIRCIKOVÁ, E. Comparison of differences between copper

bioaccumation and biosorption. Environment International, v. 31, p. 227-232, 2005.

KAPOOR, A.; VIRARAGHAVAN T. Fungal Biosorption – an alternative treatment option

for heavy metal bearing wasters: a Rewiew. Bioresource Technology, v. 55, p. 195-206,

1995.

KEFALA, M. I.; ZOURBOULIS, A. I.; MATIS, K. A. Biosorption of cadmium ions by

Actinomycetes and separation by flotation. Environmental Pollution, v. 104, p. 283-293,

1998.

KILEY, P. J; STORZ, G. Exploiting thiol modifications. Plos Biology, v. 2; p. 1714-1717,

2004.

KOPP, M.; MÜLLER, H.; HOLZER, H. Molecular analysis of the neutral Trehalases gene

from Saccaromyces cerevisiae. The Jounal of Biological Chemistry, v. 268, n. 7, p. 4766-

4774, 1993.


106

LANE, W. T.; SAITO, A. M.; GEORGE, N, G.; PICKERING, J. I.; PRINCE, C. R.;

MOREL, M. M. F. Biochemistry: A cadmium enzyme from a marine diatom. Nature, v.

435, p.42-42, 2005.

LEE, J.; GODON, C.; LAGNIEL, G.; SPECTOR, D.; GARDIN, J.; LABARRE, J.;

TOLEDANO, M. B. Yap1 and Skn7 Control Two Specialized Oxidative Stress Response

Regulators in Yeast. The Journal of Biological Chemistry, v. 274, p. 16040-16046, 1999.

LEE, S. M.; PARK, J. W. A yeast mutant lacking thiol-dependent protector protein in

hypersensitive to menadione. Biochimica Biophysica Acta, v. 1382, p. 167-175, 1998.

LI, Z. S.; Lu Y.P.; Zhen R.G.; Szczypka M.; Thiele D.J.; Rea P.A.; A new pathway for

vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae: YCF1 – catalyzed transport

of bis (glutathinato) cadmium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America., v. 94, p. 42-47, 1997

LIU, H-J.; LIU, D-H.; ZHONG, J-J. Interesting physiological response of the osmophilic

yeast Candida krusei to heat shock. Enzyme and Microbiol Technology, v. 36, p. 409-

416, 2005.

LIU, JIANGHAI; ZHANG, YINGMEI; HUANG, DEJUN; SONG, GANG. Cadmium

induced MTs synthesis via oxidative stress in yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular

and Cellular Biochemistry, v. 280, p. 139-145, 2005.

LONGO, V. D.; GRALLA, E. B.; VALENTINE, J. S. Superoxide dismutase activity is

essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of

Biological Chemistry, v. 271, n. 21, p. 12275-12280, 1996.

LOWRY, O. H.; ROSEBROUGH, N. J.; FARR, A. L.; RANDALL, R. J. Protein

measurement with the Folin reagent. The Journal of Biological Chemistry, 193, p. 265-

275, 1951.


107

LUSHCHAK, V. I. Budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model to study oxidative

modification of proteins in eukaryotes. Acta Biochimica Polonica, v. 53, n. 4, p. 679-684,

2006.

LUSHCHAK, V.; GOSPODARYOV, D. V. Catalases protect cellular proteins from

oxidative modification in Saccharomyces cerevisiae. Cell Biology International, v. 29, p.

187-192, 2005.

MALIK, A. Metal Bioremediation through growing cells. Environment International, v.

30, p. 261-278, 2004.

MANNHEIM B. Cell death – Cell proliferation and viability. In: Apoptosis and cell

proliferation. Biochemica, 1998.

MARCHLER, G.; SCHÜLLER, C.; ADAM, G.; RUIS, H. A. Saccharomyces cerevisiae

UAS element controlled by protein kinase A activates transcription in response to a variety

of stress conditions. The EMBO Journal, v. 12, p. 1997-2003, 1993.

MARNETT, L. J. Chemistry and biology of DNA damage by malondialdehyde. IARC

Scientific Publications, v. 150, p. 17-27, 1999.

MARQUES, P. A.; PINHEIRO, H. M. TEIXEIRA, J. A.; ROSA, M. F. Removal efficiency

of Cu2+, Cd2+ and Pb2+ by waste brewery biomass: pH and cation association effects.

Desalination, v. 124, p. 137-144, 1999.

MARTÍNEZ-ESPARZA, M.; AGUINAGA, A.; GONZÁLES-PÁRRAGA, P.; GARCÍA-

PEÑARRUBIA, P.; JOAULT, T.; ARGÜELLES, J. C. Role of trehalose in resistance to

macrophage killing: study with a tps1/tps1 trehalose-deficient mutant of Candida albicans.

Clinical Microbiology and Infection, v. 13, p. 384-394, 2007.


108

MEISTER, A.; ANDERSON, M. E. Glutathione. Annual Review of Biochemistry, v. 52,

p. 711-760, 1983.

MENEZES, M. A. B. C.; SABINO, C. V. S.; FRANCO, M. B.; KASTNER, G. F.;

MONTOYA, E. H. R. K0-intrumental neutron activation establishment at CDTN, Brazil: a

successfum story. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, v. 257, n. 3, p.

627-632, 2003. EU NÃO TENHO ESSE

MELO, L. C.; DOS SANTOS, J. B.; RAMALHO, M. A. P. Choice of parents to obtain

common bean (Phasealus vulgaris) cultivars tolerance to low temperatures at the adult

stage. Brazilian Journal of Genetics, v. 20, p. 283-293, 1997.

MOMOSE, Y.; IWAHASHI, H. Biossay of cadmium using a DNA microarray: genome-

wide expression patterns of Saccharomyces cerevisiae response to cadmium.

Environmental Toxicology and Chemistry, v. 20, n. 10, p. 2353-2360, 2001.

NEVES, M. J.; TERENZI, H. F.; LEONE, F. A; JORGE, J. A. Quantification of trehalose

in biological samples with conidial trehalase from thermophilic fungus Humicola grisea

var. thermoidea. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 10, p. 17-19, 1994.

NWAKA, S.; MECHLER, B.; DESTRUELLE, M.; HOLZER, H. Phenotypic features of

trehalase mutants in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters, v. 360, p. 286-290, 1995.

NYSTRÖM, T. Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence.

The EMBO Journal, v. 24, p. 1311-1317, 2005.

OHTAKE, Y.; YABUUCHI, S. Molecular cloning of the gamma-glutamylcysteine

synthetase gene of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, v. 7, p. 953-961, 1991.

OKU, K.; WATANABE, H.; KUBOTA, M.; FUKUDA, S.; KURIMOTO, M.;

TSUJISAKA, Y. KOMORI, M.; INOUE, Y. SAKURAI, M. NMR e quantum chemical


109

study on the OH…pi and CH…O interaction between trehalose and unsaturated fatty acids:

implication for the mechanism of antioxidant function of trehalose. Journal of the

American Chemical Society, v. 125, p. 12739-12748, 2003.

PANEK, A. D. Trehalose metabolism – new is in technological applications. Brazilian

Journal of Medical and Biological Research, v. 28, p. 169-181, 1995.

PARK, J. K.; LEE, J. W.; JUNG, J. Y. Cadmium uptake capacity of two strains of

Saccharomyces cerevisiae cells. Enzyme and Microbial Technology, v. 33, p. 371-378,

2003.

PARROU, J. L.; JULES, M.; BELTRAN, G.; FRANÇOIS, J. Acid trehalase in yeast and

filamentous fungi: Localization, regulation and physiological function. FEMS Yeast

Research, v.5, p.503-511, 2005.

PENNINCKX, M. J.; ELSKENS, M. T. Metabolism and functions of glutathione in

microorganisms. Advances in Microbiology and Physiology, v. 34, p. 239-301, 1993.

PEREIRA, E. J.; PANEK, A. D.; ELEUTHERIO, E. C. A. Protection against oxidation

during dehydrationof yeast. Cell Stress & Chaperones, v. 8, p. 120-124, 2003.

PEREIRA, M. D.; HERDEIRO, R. S.; FERNANDES, P. N.; ELEUTHERIO, E. C. A.;

PANEK, A. D. Targets of oxidative stress in yeast sod mutants. Biochimica et Biophysica

Acta, v. 1620, p. 245-251, 2003.

POCSI, I.; PRADE, R.A.; PENNINCHKX, M. J. Glutathione, altruistic metabolite in fungi.

Advances in Microbial Physiology, v. 49, p. 1-76, 2004.

ROMANDINI, P. , TALLANDINI, L.; BELTRAMINI, M.; SALVATO, B.; MANZANO,

M.; BERTOLDI, M.; ROCCO, G. P. Effects of copper and cadmium on growth, superoxide


110

dismutase and catalase activities in different yeast strains. Comparative Biochemistry and

Physiology, v. 103, n. 2, p. 255-262, 1992.

ROMERA, E.; GONZALEZ, F.; BALLESTER, A.; BLAZQUEZ, M. L.; MUNOZ, J. A.

Biosorption with algae: a statistical review. Critical Reviews in Biotechnology, v. 26, n. 4,

p. 223- 235, 2006.

SAMPEDRO, J. G.; URIBE, S. Trehalose-enzyme interactions result in structure

stabilization and activity inhibition. The role of viscosity. Molecular and Cellular

Biochemistry, v. 256/257, p. 319-327, 2004.

SCANDALIOS, J. G. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals

triggering antioxidant gene defense. Brazilian Journal of Medical and Biological

Research, v. 38, p. 995-1014, 2005.

SINGER, M.A.; LINDQUIST, S. Multiple of trehalose on protein folding in vitro and in

vivo. Molecular Cell, v. 1, p. 639-648, 1998.

SINGER, M.A.; LINDQUIST, S. Thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae: the yin

and yang of trehalose. Trends in Biotechnology, v. 16, p. 460-468, 1998.

STANDMAN, E. R.; LEVINE, R. L. Protein Oxidation. Annals New York Academy of

Sciences, v. 899, p. 191-208, 2000.

STANDMAN, E. R.; LEVINE, R. L. Free radical-mediated oxidation of free amino acids

and amino acid residues in proteins. Amino Acids, v. 25, p. 207-218, 2003.

SUH, J. H.; YUN, J. W.; KIM, D. S. Comparison of Pb2+ characteristics between live and

dead cells of Saccharomyces cerevisiae and Aureobsidium pullulans. Biotechnology

Letters, v. 20, p. 247-251, 1998.


111

SUH, J.H.; YUN, J.W.; KIM, D.S. Cátion (K+, MG2+, Ca2+) exchange in Pb2+ accumulation

by Saccharomyces cerevisiae. Bioprocess Engineering, v. 21, p. 383-387, 1999.

THEVELEIN, J. M. Regulation of trehalose mobilization in fungi. Microbiological

Review, v.48, p. 42-59, 1984.

THEVELEIN, J. M.; HOHMANN, S. Trehalose synthase: guard to the gate of glycolysis in

yeast? Trends in Biochemical Sciences, v. 20, p. 3-10, 1995.

TERESHINA, V. M. Thermotolerance in Fungi: The role of heat proteins and Trehalose.

Microbiology, v. 74, p. 247-257, 2005.

TURRENS, J. F. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Bioscience

Reports., v. 17, p. 3-8, 1997.

VALKO, M.; RHODES, C. J.; MONCOL, J.; IZAKOVIC, M.; MAZUR, M. Free radicals,

metals and antioxidant in oxidative stress-induced cancer. Chemical Biological

Interactions, v. 160, p. 1-40, 2006.

VALKO, M.; MORRIS, H.; CRONIN, M. T. D. Metals, toxicity and oxidative stress.

Current Medicinal Chemistry, v. 12, p. 1161-1208, 2005.

VAN AEIST, L.; HOHMANN, S.; BULAYA, B.; KONIN W.; SIERKSTRA, L.; NEVES,

M. J.; LUYTEN, K.; ALIJO, R.; RAMOS, J.; COCCETTI, P. Molecular cloning of a gene

involved in glucose sensing in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular

Microbiology, v. 8, p. 927-943, 1993.

VAN LAERE, A. Trehalose, reserve and/or stress metabolite? FEMS Microbiological

Review, v. 63, p. 201-210, 1989.


112

VEGLIO, F.; BEOLCHINI, F. Removal of metals by biosorption: a review.

Hidrometallurgy, v. 44, p. 301-316, 1997.

VENDEMIALE, G.; GRATTAGLIANO, I.; ALTOMARE, E. An uptake in the role of free

radicals and antioxidant defense in human disease. International Journal of Clinical &

Laboratory Research, v. 29, p. 49-55, 1999.

VIDO, K.; SPECTOR, D.; LAGNIEL, G.; LOPEZ, S.; TOLEDANO, M. B.; LABARRE, J.

A Proteome Analysis of the Cadmium Response in Saccharomyces cerevisiae. The

Journal of Biological Chemistry, v. 276, n. 11, p. 8469-8474, 2001.

VOIT, E. O. Biochemical and genomic regulation of the trehalose cycle in yeast: review of

observations and canonical model analysis. Journal of Theoretical Biology, v. 223, p. 55-

78, 2003.

VOLESKY, B.; MAY, H.; HOLAN, G. R. Cadmium biosorption by Saccharomyces

cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering, v. 41, p. 826-829, 1993.

VUORIO, O. E.; KALKKINEN, N.; LONDESBOROUGH, J. Cloning of two related genes

enconding the 56-kDa and 123-kDa subunits of trehalose synthase from the yeast

Saccharomyces cerevisiae. European Journal of Biochemistry, v. 216, p. 849-861, 1993.

WAALKES, M. P. Cadmium carcinogenesis. Mutation Research, v. 533, p. 107-120,

2003.

WAISBERG, M.; JOSEPH, P.; HALE, B.; BEYERSANN, D. Molecular and cellular

mechanisms of cadmium carcinogenesis. Toxicology, v. 192, p. 95-117, 2003.

WANG, J.; CHEN, C. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae: A

review. Biotechnology Advances, v. 24, p. 427-451, 2006.


113

WEN, S.; ZHANG, T.; TAN, T. Optimization of the amino acid composition in glutathione

fermentation. Process Biochemistry, v. 40, p. 3474-3479, 2005.

WU, R. F.; XU, Y. C.; MA, Z.; NWARIAKU, F. E.; SAROSI, J. G. A.; TERADA, L. S.

Subcellular targeting of oxidants during endothelial cell migration. Journal of Cell

Biology, v. 171, p. 893-904, 2005.

YAMAGUCHI, T.; TAKAMURA, H.; MATOBA, T.; TERAO, J. HPLC Method for

evaluation of the free radical-scavenging Activity of foods by using 1,1-Diphenyl-2-

picrylhydrazyl. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, v. 62, n.6, p. 1201-1204,

1998.

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







oxidativo causado por cádmio e a resposta adaptativa a...

Documents