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LARISSA ALVES RIBEIRO DE OLIVEIRA MACÊDO

EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS FRAÇÕES HEXÂNICA E

CLOROFÓRMICA DE Selaginella convoluta (SELAGINELLACEAE)

EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Vale do São Francisco, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido, para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais.

Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

PETROLINA

2014

LARISSA ALVES RIBEIRO DE OLIVEIRA MACÊDO

EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS FRAÇÕES HEXÂNICA E

CLOROFÓRMICA DE Selaginella convoluta (SELAGINELLACEAE)

EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Vale do São Francisco, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido, para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais.

Aprovada em: 07/03/2014.

Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida - UNIVASF (Orientador)

Prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior – UFS (Examinador externo)

Prof. Dra. Xirley Pereira Nunes – UNIVASF (Examinador interno)

Macêdo, Larissa Alves Ribeiro de Oliveira M141e Efeito antinociceptivo das frações hexânica e clorofórmica de Selaginella convoluta (Selaginellaceae) em camundongos / Larissa Alves Ribeiro de Oliveira Macêdo. – – Petrolina, 2014.

202f. : il. 29 cm. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) –

Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina. Petrolina-PE, 2014.

Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.

1. Selaginella convoluta (Selaginellaceae) - Química vegetal. 2.

Efeito antinociceptivo. 3. Matéria Médica Vegetal. 4. Plantas Medicinais. I. Título II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 581.192 Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF

Bibliotecário (a): Maria Betânia de Santana da Silva CRB4-1747.

Dedico esse trabalho aos meus amados

pais, Visêldo e Sônia, ao meu irmão, Hélio e

ao meu esposo, Carlos Henrique, pelo amor

incondicional, incentivo e compreensão

durante esta trajetória.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus por toda proteção e saúde, por guiar os

meus passos e por me presentear com pessoas maravilhosas em minha vida.

Aos meus pais, Visêldo Ribeiro de Oliveira e Sônia Maria Alves Ribeiro de

Oliveira, pelo dom da vida e principalmente por todos os ensinamentos. Os grandes

espelhos da minha vida. Exemplos de sabedoria e honestidade. Obrigada por todo

amor, dedicação, incentivo e paciência em todas as horas. Ao meu irmão Hélio, que

apesar das brigas bobas, a gente sempre acaba se entendendo. Palavras sempre

serão muito pouco para demonstrar-lhes meus sinceros agradecimentos. Amo muito

vocês!

Ao amor da minha vida, Carlos Henrique Vieira Macêdo, quem lutou todos os

dias comigo, quem sempre esteve ao meu lado. Por sacrificar nossos finais de

semana e principalmente por ter muita paciência e me amar cada dia mais. Obrigada

por cada minuto. Hoje concretizo o meu sonho e a partir de agora vamos lutar pra

realizar o nosso. O seu amor me alimenta. Eu te amo muito!

À minha família que tanto me orgulho: primos, primas, tios, tias e minhas

vozinhas amadas que tanto rezam por mim! Muito obrigada pela presença em minha

vida. Pela confiança, amor, amizade, enfim, obrigada pela existência de cada um.

Ao meu sogro Aluísio e minha sogra Vânia por serem tão importantes e por

torcerem pelo meu sucesso.

Ao Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, por me aceitar como

orientanda, por buscar o melhor em mim. Obrigada pelo incentivo, por todos os

conhecimentos compartilhados, conselhos, confiança e essencial contribuição

durante este trabalho. A quem devo o sucesso dessa trajetória.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do

Semiárido, por todos os ensinamentos compartilhados. Em especial à Profa. Xirley

Pereira Nunes, por ser uma pessoa incrível, acreditar em mim e ser acima de tudo,

muito amiga. Os meus sinceros agradecimentos!

À Profa. Rosemairy Luciane Mendes, por ceder seu laboratório para

realização dos meus experimentos e principalmente por toda paciência, atenção e

ensinamentos durante meus períodos de aperreio.

Aos componentes da banca, Prof. Raimundo Palheta, por ser tão

compreensivo e dedicado e ao Prof. Lucindo Quintans-Júnior, pela aceitação e

principalmente por me ajudar com sugestões durante os encontros em congressos.

Ao Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME), grupo

que tenho maior orgulho de fazer parte e que se tornaram grandes companheiros do

dia a dia. Agradecimento especial para os meus amigos de laboratório, Ana Paula,

Amanda, Sarah Raquel, Juliane Cabral, Camila Araújo, Tâmara Diniz, Grasielly

Rocha, Raimundo Júnior, Suzana Rabêlo e Alessandra Pacheco. Cada um teve sua

importância e sua participação, obrigada a todos por terem tornado esse trabalho

possível.

Ao Professor Dr. Emiliano de Oliveira Barreto e todos do Laboratório de

Biologia Celular e Molecular, da Universidade Federal de Alagoas que com muita

hospitalidade me receberam e ofertaram seu tempo e material para a realização dos

testes de atividade anti-inflamatória, meu respeito e admiração! Aos amigos que lá

fiz, Fernanda Aquino, João Noé, Samário Lino, Almair Araújo, Laís Agra e Rafael

Vital. Agradeço-os pela amizade, auxílio nos experimentos, conhecimentos

compartilhados diariamente e momentos de descontração. Em especial, à minha

amiga de longas datas, Jamylle Ferro, pela colaboração extremamente importante

no desenvolvimento deste trabalho e, com certeza, de muitos que estão por vir.

Obrigada por tudo!

A Henrique Saraiva, Érica Lavor e Mariana Gama pela disposição e

principalmente, parceria na realização dos meus experimentos.

Ao pessoal do biotério Leonardo, Euda, Helenildo e Jean, pelo carinho de

sempre e por me receberem tão bem a cada visita.

Aos Técnicos: Silvio Alan, Roniere A. Oliveira e Fernando pela ajuda e

compreensão.

A todos os servidores da UNIVASF, em especial Francisca, João Paulo, Sr.

Cícero, Geralda, Juliana, Maria e Neide por toda atenção e momentos de

descontração nos intervalos dos experimentos.

Aos colegas de turma pelos momentos de estudo juntos e por toda amizade.

Em especial Anne, pelo carinho e por compartilhar momentos de aflição.

Aos órgãos de fomento, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de

Pernambuco (FACEPE) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

Por último, não menos importante, a todos os animais utilizados, por terem

dado a vida para a realização deste trabalho, dedico todo o meu respeito e

agradecimento.

Agradeço, dessa forma, a todos que de alguma forma contribuíram para a

realização deste trabalho, fazendo parte deste caminho de crescimento profissional

e pessoal. Muito obrigada!

“Que os vossos esforços desafiem as

impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes

coisas do homem foram conquistadas do que

parecia impossível”.

(Charles Chaplin)

RESUMO

Larissa Alves Ribeiro de Oliveira Macêdo. Efeito antinociceptivo das frações hexânica e clorofórmica de Selaginella convoluta (Selaginellaceae) em camundongos. Petrolina, Pernambuco, 2014.

Selaginella convoluta (Arn.) Spring (Selaginellaceae), é uma planta medicinal

conhecida na região Nordeste como “jericó” e utilizada na medicina popular como

antidepressivo, diurético, afrodisíaco, analgésico e anti-inflamatório. Este trabalho

teve como objetivo avaliar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações

hexânica (Sc-Hex) e clorofórmica (Sc-CHCl3), obtidas por partição do extrato

etanólico bruto (Sc-EEB) de Selaginella convoluta em camundongos. Para tanto,

foram utilizados camundongos Swiss machos (n=6 por grupo, 25-35 g). Os animais

foram tratados 30 ou 60 minutos antes com as frações nas doses de 100, 200 e 400

mg/kg, via i.p, veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p) ou droga padrão

(i.p). Foram utilizados modelos murinos: teste de contorções abdominais induzidas

por ácido acético, teste da formalina e teste da placa quente, visando à avaliação da

atividade antinociceptiva. Além disso, foi realizado o teste do rota-rod para verificar

alguma interferência no desempenho motor. Os modelos de pleurisia induzida por

carragenina com quantificação de proteínas totais e edema de pata induzido por

carragenina foram utilizados para avaliar a atividade anti-inflamatória. A fim de

contribuir com a segurança do uso, foi realizado o estudo toxicológico conduzido

durante 14 dias, realizando administração única das frações nas doses de 400 e

2000 mg/kg, via intraperitoneal (i.p). Ao final do estudo, os animais foram

eutanasiados para avaliação de parâmetros bioquímicos, hematológicos e

histopatológicos. Foi realizado também o ensaio de viabilidade celular por MTT. No

teste de contorções abdominais, as frações induziram inibição significativa (p <

0,05). No teste da formalina, as duas frações foram ativas na fase inflamatória. Já no

teste da placa quente, nenhuma das frações aumentou de maneira estatisticamente

significativa o tempo de permanência do animal sobre a placa aquecida. Por outro

lado, no ensaio de pleurisia induzida por carragenina, somente os animais tratados

com Sc-CHCl3 apresentaram redução da migração celular bem como o

extravasamento de proteínas na cavidade pleural. Entretanto, o tratamento com as

frações não foi capaz de diminuir o edema de pata. Não houve interferência na

coordenação motora dos animais. Houve redução da viabilidade celular a partir da

dose de 250 µg/mL para Sc-Hex e 1 µg/mL para Sc-CHCl3. A administração das

frações no ensaio de toxicidade não provocou morte em nenhum dos grupos

tratados. Entretanto, alterações histopatológicas foram vistas nos rins e fígado dos

animais tratados com a maior dose. Conclui-se que Selaginella convoluta possui

atividade antinociceptiva, corroborando em parte seu uso na medicina popular.

Adicionalmente, outros estudos de toxicidade devem ser feitos com o intuito de

melhor caracterizar o perfil de segurança das frações.

Palavras-chave: Antinociceptivo, Anti-inflamatório, Plantas Medicinais, Selaginella convoluta.

ABSTRACT

Larissa Alves Ribeiro de Oliveira Macedo. Antinociceptive effect of the hexane and chloroform fractions of Selaginella convoluta (Selaginellaceae) in mice. Petrolina, Pernambuco, 2014.

Selaginella convoluta (Arn.) Spring (Selaginellaceae), is a medicinal plant known in

the Northeast of Brazil as ’jericó’ and it is used in folk medicine as an antidepressant,

diuretic, aphrodisiac, analgesic and anti-inflammatory agent. This study aimed to

evaluate the antinociceptive and anti-inflammatory activities of the hexane (Sc-Hex)

and chloroform (Sc-CHCl3) fractions, obtained from the crude ethanol extract (Sc-

EEB) of Selaginella convoluta partition in mice. For this purpose, Swiss mice (n=6

per group, 25-35 g) were used. Animals were treated 30 or 60 minutes prior to the

fractions at the doses of 100, 200 and 400 mg/kg, ip, vehicle (0.9% saline solution +

0.2% Tween 80, ip) or standard drugs (i.p.). Murine models were used: writhing-

induced by acetic acid, formalin and hot plate tests, in order to evaluate the

antinociceptive activity. In addition, the rota-rod test was performed to check for

interference with motor coordination. The model of carrageenan-induced pleurisy to

quantitation of total protein and paw edema induced by carrageenan, were used to

assess the anti-inflammatory activity. To contribute to the safety of the use, the

toxicological study conducted for 14 days, performing only fractions of administration

at doses of 400 and 2,000 mg/kg, intraperitoneally (ip) was performed. At the end of

the study, the animals were euthanized for evaluation of biochemical, hematological

and histopathological parameters. The cell viability assay by MTT was also

performed. In the writhing test the fractions induced a significant inhibition (p < 0.05).

In the formalin test, the two fractions were active in the inflammatory phase. Already

in the hot plate test, none of the fractions increased in a statistically significant way

the latency time of the animal on the hot plate. Moreover, in the the test of

carrageenan-induced pleurisy, the animals treated only with Sc-CHCl3 had reduced

cell migration and extravasation of protein in the pleural cavity. However, treatment

with the fractions was not able to reduce paw edema. There was no interference with

motor coordination of animals. There was a reduction in cell viability from the dose of

250 mg/mL for Sc-Hex and 1 mg/mL for Sc-CHCl3. The administration of the fractions

in the toxicity test did not cause death in any of the treated groups. However,

histopathological changes were seen in the kidneys and liver of animals treated with

the higher dose. We conclude that Selaginella convoluta has antinociceptive activity,

supporting in part its use in folk medicine. In addition, toxicity studies should be made

in order to better characterize the safety profile of the fractions.

Keywords: Antinociceptive, Anti-inflammatory, Medicinal plants, Selaginella

convoluta.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Transmissão do estímulo doloroso. ........................................................... 33

Figura 2. Processamento sensorial no corno dorsal da medula espinal. .................. 35

Figura 3. Ilustração dos 5 sinais da inflamação: calor, rubor, edema, dor e perda da

função. ...................................................................................................................... 36

Figura 4. Etapas do recrutamento de leucócitos para o sítio da inflamação.............38

Figura 5. Comportamento de Selaginella convoluta (Arn.) Spring (Selaginellaceae)

em período seco (A) e chuvoso (B). .......................................................................... 47

Figura 6. Tapete formado por Selaginella convoluta durante os primeiros dias de

chuva ........................................................................................................................ 47

Figura 7. Exsicata de Selaginella convoluta coletada em Petrolina-PE.. .................. 50

Figura 8. Material vegetal seco e pulverizado. ......................................................... 51

Figura 9. Processo de obtenção das frações de S. convoluta: A) Destilação do

solvente em evaporador rotativoà pressão reduzida B) Extrato etanólico bruto C)

Partição líquido-líquido. ............................................................................................. 52

Figura 10. Contorção abdominal induzida por ácido acético.. .................................. 54

Figura 11. Teste de nocicepção induzida por formalina ........................................... 55

Figura 12. Teste da placa quente ............................................................................. 56

Figura 13. Modelo de pleurisia induzida por carragenina ......................................... 57

Figura 14. Edema de pata induzido por carragenina ................................................ 58

Figura 15. Avaliação da coordenação motora no teste do rota-rod. ....................... ..59

Figura 16. Avaliação diária do peso corporal, consumo de alimento e água no teste

de toxicidade aguda. ............................................................................................... ..60

Figura 17. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-

Hex 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg), no teste

de contorções abdominais em camundongos.. ......................................................... 66

Figura 18. Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de Selaginella convoluta

(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg), indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg), no

teste de contorções abdominais em camundongos .................................................. 67


Hex 100, 200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (150 mg/kg) e morfina (10 mg/kg)

na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos.. ..................... 68


(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (150 mg/kg) e morfina (10

mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos. .......... 68


Hex 100, 200 e 400 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em 30,

60, 90 e 120 minutos após sua administração em camundongos... .......................... 69


(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em

30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração em camundongos.. ..................... 69

Figura 23. Efeito anti-inflamatório da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-

Hex 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia

induzida por carragenina em camundongos.. ........................................................... 70

Figura 24. Efeito anti-inflamatório da fração clorofórmica de Selaginella convoluta

(Sc-CHCl3 100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia

induzida por carragenina em camundongos.............................................................. 71

Figura 25. Efeito da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 100, 200 e

400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas

plasmáticas no modelo de pleurisa induzida por carragenina em camundongos...... 72

Figura 26. Efeito da fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 100, 200

e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas

plasmáticas no modelo de pleurisa induzida por carragenina em camundongos...... 72

Figura 27. Efeito anti-inflamatório das frações hexânica e clorofórmica de

Selaginella convoluta (Sc-Hex e Sc-CHCl3, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10

mg/kg) no modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos. . 72

Figura 28. Efeito da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex, 100, 200 e

400 mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod em camundongos ...... 74

Figura 29. Efeito da fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3, 100,

200 e 400 mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod em

camundongos.. .......................................................................................................... 74

Figura 30. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração hexânica

de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante

14 dias (n= 12 por grupo). ......................................................................................... 76

Figura 31. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração hexânica

de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante

14 dias (n= 12 por grupo).. ........................................................................................ 76

Figura 32. Dados da variação de peso corporal dos animais tratados com a fração

hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%

durante 14 dias (n= 12 por grupo). ............................................................................ 77

Figura 33. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração

clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina

0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ................................................................... 77

Figura 34. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração

clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina

0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).. .................................................................. 78


clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc- CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina

0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ................................................................... 78

Figura 36. Fotomicrografias representativas do histopatológico hepático dos animais

tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração hexânica de

Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração

Hematoxilina-Eosina (H.E).. ...................................................................................... 84


tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de


Hematoxilina-Eosina (H.E). ....................................................................................... 84

Figura 38. Fotomicrografias representativas do histopatológico renal dos animais

tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração hexânica de

Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração

Hematoxilina-Eosina(H.E). ........................................................................................ 84


tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de


Hematoxilina-Eosina (H.E). ....................................................................................... 85

Figura 40. Efeito da fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 1, 100, 250 e

500µg/mL) sobre a viabilidade celular.. ..................................................................... 85

Figura 41. Efeito da fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 1, 100,

250 e 500µg/mL) sobre a viabilidade celular. . .......................................................... 86

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Constituintes químicos identificados nas fases de Selaginella convoluta

através de cromatografia em camada delgada. ........................................................ 65

Tabela 2. Parâmetros hematológicos do sangue de camundongos tratados com a

fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p) e solução

salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ........................................................ 79

Tabela 3. Parâmetros bioquímicos do sangue de camundongos tratados com a


salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).. ....................................................... 80


fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg, i.p) e

solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ........................................... 81



solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo). ........................................... 81

Tabela 6. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração hexânica de

Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9% durante

14 dias (n= 12 por grupo). ......................................................................................... 83

Tabela 7. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração clorofórmica de

Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9%

durante 14 dias (n= 12 por grupo). ............................................................................ 83

LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Aα: Fibras do tipo A - alfa

Aβ: Fibras do tipo A - beta

Aδ: Fibras do Tipo A - delta

AA: Ácido araquidônico

AAS: Ácido acetilsalicílico

ACTH: Corticotropina

AINES: Anti-inflamatórios não esteroidais

ALT: Alanina aminotransferase

AMPc: Adenosina monofosfato cíclico

ANOVA: Análise de variância

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ASIC: Canais iônicos sensíveis ao ácido

AST: Aspartato aminotransferase

CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais

CHCM: Concentração de hemoglobina corpuscular média

COX: Ciclooxigenase

COX 1: Ciclooxigenase 1



C5a: Fator quimiotático 5a do sistema complemento

CRAD: Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga

DMSO: Dimetilsulfóxido

EDTA: Ácido Etilenodiaminotetraacético

EEB: Extrato Etanólico Bruto

EMA: European Medicines Agency

Enos: Óxido nítrico sintase endoltelial

E.P.M: Erro Padrão da Média

FDA: Food and Drugs Agency

HCM: Hemoglobina corpuscular média

H.E: Hematoxilina-Eosina

HVASF: Herbário Vale do São Francisco

IASP: Associação Internacional para o Estudo da Dor

IL: Interleucinas

IL 1: Interleucina 1

IL1β: Interleucina 1 beta

IL1Ra: Antagonista do receptor de Interleucina 1





INDO: Indometacina

iNOS: Óxido nítrico sintase induzível

i.p: Via intraperitoneal

i.t: Via intratorácica

LOX: Lipooxigenase

LT: Leucotrieno

LTB4: Receptor de leucotrieno B4

LTC4: Receptor de leucotrieno C4

LTD4: Receptor de leucotrieno D4

LTE4: Receptor de leucotrieno E4

MOR: Morfina

MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio

NEPLAME: Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais

NF-κB: Fator nuclear κB

NGF: Fator de crescimento do nervo

nNOS: Óxido nítrico sintase constitutiva

NO: Óxido Nítrico

NOS: Óxido Nítrico Sintase

OMS: Organização Mundial da Saúde

PAF: Fator de ativação plaquetária

PBS: Tampão fosfato salino PG: Prostaglandina

PGD2: Prostaglandina D2

PGE2: Prostaglandina E2

PGI2: Prostaglandina I2

PGF2α: Prostaglandina F2α

PLA2: Fosfolipase A2

ROS: Espécies Reativas de Oxigênio

Sc-EEB: Extrato etanólico bruto de Selaginella convoluta

Sc-Hex: Fração hexânica de Selaginella convoluta

Sc-CHCl3: Fração clorofórmica de Selaginella convoluta

SNA: Sistema Nervoso Autônomo

SNC: Sistema Nervoso Central

SNP: Sistema nervoso Periférico

s.p: Via subplantar

SP: Substância P

TGO: Transaminase glutâmico oxalacética

TGP: Transaminase glutâmico pirúvica

TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa

TRPV1: Receptor de Potencial Transitório Vaniloide 1

Tx; Tromboxano

TxA2: Tromboxano A2

UFS: Universidade Federal de Sergipe

UNIVASF: Universidade Federal do Vale do São Francisco

VCM: Volume corpuscular médio

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 24

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 28

2.1. Objetivo geral ..................................................................................................... 28

2.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 28

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................ 30

3.1. Considerações sobre dor ................................................................................... 30

3.1.1. Dor e nocicepção ............................................................................................ 30

3.1.2. Nociceptores e fibras nociceptivas .................................................................. 32

3. 2. Inflamação ......................................................................................................... 35

3.3. Produtos naturais ............................................................................................... 42

3.3.1. Considerações sobre a família Selaginellaceae e o gênero Selaginella ......... 44

3.3.2. Considerações sobre a espécie Selaginella convoluta ................................... 46

4. PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................... 50

4.1. Material vegetal .................................................................................................. 50

4.1.1. Coleta e obtenção das frações hexânica e clorofórmica de S. convoluta ....... 50

4.2. Triagem fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Sc-Hex e Sc-CHCl3

................................................................................................................................... 52

4.3. Animais ............................................................................................................... 52

4.4. Testes de atividade antinociceptiva .................................................................... 53

4.4.1. Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético ......................... 53

4.4.2. Teste de nocicepção induzida por formalina ................................................... 54

4.4.3. Teste da placa quente ..................................................................................... 55

4.5. Testes de atividade anti-inflamatória .................................................................. 56

4.5.1. Modelo de pleurisia induzida por carragenina ................................................. 56

4.5.1.2. Quantificação de proteínas totais ................................................................. 57

4.5.2. Edema de pata induzido por carragenina ........................................................ 58

4.6. Avaliação da coordenação motora (teste do rota rod) ........................................ 59

4.7. Toxicidade aguda ............................................................................................... 60

4.7.1. Triagem farmacológica comportamental ......................................................... 60

4.7.2. Análise de parâmetros bioquímicos e hematológicos ..................................... 61

4.7.3. Análise histopatológica dos órgãos ................................................................. 61

4.8. Ensaio de viabilidade celular por MTT ................................................................ 62

4.9. Análise Estatística .............................................................................................. 62

5. RESULTADOS ...................................................................................................... 65

5.1. Triagem fitoquímica ............................................................................................ 65

5.2. Resultados da atividade farmacológica das frações obtidas de Selaginella

convoluta ................................................................................................................... 65

5.2.1. Atividade antinociceptiva das frações obtidas de Selaginella convoluta ......... 65

5.2.1.1.Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético ....................... 65

5.2.1.2. Teste de nocicepção induzida por formalina ................................................ 67

5.2.1.3. Teste da placa quente .................................................................................. 68

5.2.2. Atividade anti-inflamatória das frações obtidas de Selaginella convoluta........ 70

5.2.2.1. Modelo de pleurisia induzida por carragenina .............................................. 70

5.2.2.1.2. Quantificação de proteínas totais .............................................................. 71

5.2.2.2. Edema de pata induzido por carragenina ..................................................... 73

5.3. Avaliação da atividade motora no teste do rota-rod ........................................... 73

5.4. Toxicidade aguda das frações obtidas de Selaginella convoluta ....................... 74

5.4.1 Triagem farmacológica comportamental .......................................................... 75

5.4.2. Consumo de água, ração e variação do peso dos animais ............................. 75

5.4.3. Parâmetros hematológicos e bioquímicos ....................................................... 78

5.4.4. Análise macroscópica, histológica e peso dos órgãos .................................... 82

5.5 Ensaio de viabilidade celular por MTT ................................................................ 85

6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 88

6.1. Triagem fitoquímica. ........................................................................................... 88

6.2. Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações obtidas de Selaginella

convoluta. .................................................................................................................. 88

6.3. Toxicidade aguda. .............................................................................................. 94

7. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 98

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 100

APÊNDICE .............................................................................................................. 124

ANEXOS ................................................................................................................. 200

1. INTRODUÇÃO

MACÊDO, L. A. R. O. Efeito antinociceptivo das frações hexânica e clorofórmica de Selaginella

convoluta (Selaginellaceae) em camundongos. 24

1. INTRODUÇÃO

Durante o processo de seleção natural, o homem desenvolveu diversos

mecanismos fisiológicos que permitiram sua sobrevivência. A dor, certamente ocupa

um lugar de destaque, já que é um dos sintomas que faz com que o indivíduo tenha

consciência de que sua integridade está sendo ameaçada ou que há alguma

disfunção em seu organismo (CUNHA, 2009).

Entre as diversas fontes para o desenvolvimento de fármacos com potencial

analgésico e/ou anti-inflamatório, os produtos naturais são de particular importância.

O uso desses produtos está bem documentado ao longo da história humana e sua

contribuição na indústria farmacêutica vem sendo mostrada ao longo dos anos em

diversos trabalhos (BUTLER, 2008; HARVEY, 2008; NEWMAN; CRAGG, 2007).

Dessa forma, o uso de plantas medicinais para o tratamento da dor tem sido a opção

mais econômica para a população de baixa renda (LIMA-SARAIVA, 2012a).

O manejo da dor é um aspecto essencial da medicina moderna e para a

qualidade de vida, entretanto, existe a limitação apresentada pela indústria

farmacêutica dos fármacos disponíveis no mercado quanto aos efeitos colaterais e

sua eficácia (BOURINET et al., 2005; RIBEIRO; SCHMIDT; SCHMIDT., 2002). A

terapia farmacológica ainda é o recurso clínico mais eficaz no tratamento da dor.

Dentre os medicamentos mais utilizados, têm-se os opioides, anti-inflamatórios não

esteroidais (AINES), analgésicos periféricos, miorrelaxantes e os antidepressivos

(DIONNE, 1997). No entanto, cerca de 40 a 60% dos pacientes não respondem a

farmacoterapia, pois alguns tipos de dor podem ser resistentes à analgésicos

comuns (XU et al., 2012; CLAUW; ARNOLD; MCCARBERG., 2011). Por essa razão

que a descoberta de novas terapias para o tratamento da dor é necessária,

especialmente para tratar a proporção de pacientes que não respondem aos

analgésicos disponíveis.

O uso de plantas medicinais e fitoterápicos compõem uma fonte de

tratamento em expansão mundial. No ano de 2000, cerca de 25% de todas as

prescrições médicas nos Estados Unidos incluem substâncias naturais como

princípio ativo, obtidas de plantas de regiões temperadas e tropicais, o que

corresponde ao valor estimado de 900 milhões de dólares na circulação comercial

(BRAZ-FILHO, 2010). Do total de 19 medicamentos baseados em produtos naturais

aprovados pela Food and Drugs Agency (FDA) e European Medicines Agency



(EMA) entre os anos de 2005 a 2010, 7 correspondem a produtos naturais, 10 são

produtos naturais semi-sintéticos e 2 são drogas derivadas de produtos naturais, o

que remete a grande importância dos produtos naturais diante da farmacêutica

mundial (BRITO, 2013).

No Brasil, temos como exemplo recente o anti-inflamatório tópico Acheflan®,

do laboratório Aché, produto produzido totalmente em território nacional e originado

a partir do óleo essencial da espécie Cordia verbenácea, sendo registrado pela

Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA) em 2004 e lançado no mercado em 2005,

onde, desde então, passou a ser o anti-inflamatório tópico mais prescrito pela classe

médica brasileira, correspondendo a cerca de 44% das prescrições (CALIXTO;

SIQUEIRA JUNIOR, 2008).

O Brasil é detentor da maior biodiversidade mundial, abrigando cerca de 50

mil espécies de plantas, distribuídas em grandes biomas (Mata Atlântica, Amazônia ,

Cerrado, Caatinga, Pampas, Pantanal e Ambientes costeiros ) com características

distintas que confere uma riqueza e diversidade de vegetação (SKORUPA; VIEIRA,

2005; BIOMAS DO BRASIL, 2012). Desta forma, o Brasil é considerado um país

com uma enorme biodiversidade vegetal e com diversas plantas com alto valor

alimentício e medicinal (SOUZA; FELFILI, 2006).

Nesse contexto, a região Nordeste brasileira ocupa aproximadamente

1.600.000 Km2, o equivalente a cerca de 18% da superfície do Brasil, estando nesta

área, a região semiárida, que ocupa uma área que abriga 63% da população

nordestina, com cerca de 900 mil Km2, correspondendo a aproximadamente 70% da

região Nordeste e 13% do território brasileiro. A existência de um bioma único torna

essa região importante ecologicamente. Esse bioma, peculiar e exclusivo, recebeu

dos índios locais o nome de Caatinga, “a mata branca”, em virtude do aspecto da

vegetação na estação seca, quando as folhas caem, e apenas os troncos brancos e

brilhosos das árvores e arbustos permanecem (PRADO, 2003).

O bioma Caatinga é o principal ecossistema dessa região brasileira,

ocupando os estados da Bahia, Ceará, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte,

Paraíba, Sergipe, Alagoas e Minas Gerais (BRASIL, 2008). Algumas espécies

endêmicas desse bioma possuem atividade antinociceptiva, como Neoglaziovia

variegata (LIMA-SARAIVA et al., 2012b) e Amburana cearensis (OLIVEIRA et al.,



2009). Além disso, outras espécies coletadas na região Nordeste também possuem

efeito antinociceptivo e anti-inflamatório (ANDRADE et al., 2012; LIMA et al., 2012).

O bioma Caatinga é ainda a região menos estudada. Portanto, merece

destaque, por ser um bioma exclusivamente brasileiro e possuir uma proporção

expressiva de plantas endêmicas, que são rotineiramente utilizadas pela população

por suas propriedades terapêuticas (LEAL et al., 2005).

Considerando a biodiversidade da região semiárida e a sua ampla extensão

territorial contrastando com os baixos níveis de condições de vida da população,

principalmente no que se refere ao acesso a medicamentos da flora regional e de

baixo custo, a espécie escolhida para o estudo, Selaginella convoluta (Arn.) Spring,

pertencente à família Selaginellaceae, é encontrada na região do Vale do São

Francisco e mesmo existindo vários estudos com plantas do gênero (HIRAI; PRADO,

2000; ANTHONY; THOMAS, 2011; NALLAIYAN; DORAISWAMY, 2011;

SETYAWAN, 2011) pouco se conhece acerca de suas propriedades farmacológicas.

A fim de contribuir e dar continuidade ao trabalho realizado com o extrato etanólico

bruto de S. convoluta por Sá et al (2012a), o objetivo desse estudo foi avaliar a

atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações obtidas por partição de S.

convoluta, bem como o perfil de toxicidade da espécie, para assegurar seu uso e

servir de parâmetros para o desenvolvimento de futuros medicamentos.

2.OBJETIVOS



2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Investigar a possível atividade antinociceptiva e/ou anti-inflamatória das

frações hexânica (Sc-Hex) e clorofórmica (Sc-CHCl3) obtidas por partição de

Selaginella convoluta (Arn.) Spring em camundongos.

2.2. Objetivos específicos

- Realizar a triagem fitoquímica nas frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 para a identificação

das principais classes de constituintes químicos;

- Avaliar o potencial antinociceptivo e anti-inflamatório das frações Sc-Hex e Sc-

CHCl3;

- Verificar possível alteração motora induzida pela administração das frações Sc-Hex

e Sc-CHCl3;

- Avaliar o perfil de segurança das frações, através do estudo de toxicidade aguda;

- Verificar o efeito das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 sobre a viabilidade celular por

MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio);

- Contribuir para o estudo farmacológico da família Selaginellaceae.

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA



3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Considerações sobre a dor

3.1.1 Dor e nocicepção

O significado da palavra “dor”, na língua portuguesa, vem do latim: dolore,

que denota sofrimento; e “pain” na língua inglesa, do grego: poiné, punição (FEIN,

2011). O organismo humano possui diversos mecanismos e sinais responsáveis

pelo controle da homeostasia, dentre eles a dor desempenha papel fisiológico

importante, uma vez que ela é um dos principais sintomas clínicos de alerta para a

detecção de algo que ameace a integridade física do organismo (CHAPMAN;

GAVRIN, 1999; JULIUS; BASBAUM, 2001).

Esse mecanismo de proteção pode ser definido como sendo uma experiência

consciente influenciada por memórias emocionais, patológicas, genéticas e fatores

cognitivos (ROY et al., 2009; ALLAN et al., 2009; NOEL et al., 2012;). Assim, a dor é

um evento altamente subjetivo, como ilustrado pela definição dada pela Associação

Internacional para o Estudo da Dor (IASP): ''uma experiência sensorial e emocional

desagradável associada a dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de

tal dano'' (TRACEY; MANTYH, 2007). Desta forma, a dor, além da experiência

emocional, está associada a um componente sensorial, denominado nocicepção, o

qual depende da ativação de receptores específicos e vias neuroanatômicas que

fazem a comunicação entre o Sistema Nervoso Periférico (SNP) e o Sistema

Nervoso Central (SNC) (RUSSO; BROSE, 1998; JULIUS; BASBAUM, 2001;

MENSE, 2009).

Sherrington (1906) denominou nocicepção, como sendo percepção de

estímulos nocivos, entretanto, isso não significa o mesmo que a sensação de dor.

Assim, enquanto a nocicepção refere-se às manifestações neurofisiológicas geradas

pelo estímulo nocivo, a dor é a desagradável experiência emocional que

normalmente acompanha nocicepção (LOESER; TREEDE, 2008). Sendo assim, os

animais não são capazes de verbalizar os componentes subjetivos da dor, neles não

se avalia dor, mas nocicepção. Logo, termos como dor e analgesia são empregados

para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e antinocicepção são mais



utilizados para estudos pré-clínicos, envolvendo animais de laboratório (KANDEL;

SCHWARTZ; JESSEL, 2003).

A dor pode ser classificada de diversas maneiras, sendo a duração da

sensação dolorosa o critério mais utilizado. Dessa forma, a dor pode ser transitória,

aguda ou crônica (FUCHS; WANNMACHER; FERREIRA, 2006). Na dor do tipo

transitória, os nociceptores da pele ou de outros tecidos do corpo podem ser

ativados sem necessariamente ocorrer injúria tecidual, sendo sua função, proteger

o organismo de um possível dano. Segundo Loeser & Melzack (1999) a dor aguda é

caracterizada pela ativação dos nociceptores locais após injúria substancial de um

tecido (traumas, intervenções cirúrgicas e algumas doenças), estando associada à

estimulação direta de nociceptores, conexões nervosas no SNC e sistema nervoso

autônomo (SNA).

Apesar dos propósitos protetores, a dor pode tornar-se crônica e perpetuar

por meses ou anos (PARK; VASKO, 2005) sendo característica de situações em que

o organismo não é capaz de produzir resolução da lesão ou quando são

estabelecidos mecanismos adaptativos inadequados (D’MELLO; DICKENSON,

2008). Por isso, apresenta-se como um grande desafio na atualidade, ocasionando

reações emocionais negativas, debilitante, redução da qualidade e expectativa de

vida, custos socioeconômicos, além de estar associada com comorbidades como

distúrbios de sono e depressão (GRIFFIS; COMPTON, DOERING, 2006; TRACEY;

DICKENSON, 2012).

A dor pode ainda ser classificada quanto à sua fisiopatologia em neurogênica,

quando ocorre lesão do tecido neuronal; neuropática, quando ocorre a disfunção de

um nervo; psicogênica, que ocorre por fatores psicológicos; nociceptiva, quando

ocorre por estimulação excessiva dos nociceptores ou inflamatória, que resulta

basicamente da interação entre o tecido danificado e os neurônios sensoriais

nociceptivos periféricos, por meio da participação de mediadores inflamatórios que

induzem modificações funcionais na excitabilidade neuronal (MILLAN, 1999; RANG

et al., 2007; BESSON, 1999). Tais mediadores são liberados diretamente pelas

células danificadas pelo trauma tecidual ou pelo reconhecimento de um elemento

estranho ao organismo por células residentes, como, por exemplo, os macrófagos

(CUNHA, 2009).



Apesar dos avanços nas áreas de conhecimento relacionadas à dor, os

resultados dos tratamentos bem como a prevenção de queixas recorrentes ainda

não são satisfatórios. Assim, a analgesia efetiva para síndromes dolorosas ainda é

um desafio, e o entendimento da neuroanatomia das vias de condução, da

fisiopatologia da dor e da farmacologia é fundamental na busca de novas

alternativas terapêuticas (ROCHA et al., 2007; TEIXEIRA, 2006).

3.1.2 Nociceptores e fibras nociceptivas

O termo nociceptor é uma abreviatura de “nocirreceptor” e significa um

receptor para estímulo nociceptivo (RANG et al., 2012). Descrito por Sherrington

(1906), foi introduzido como sendo terminações livres de neurônios aferentes

primários, que podem ser despolarizados por estímulos mecânicos, térmicos ou

químicos (KRESS; ZEILHOFER, 1999). Inervam o sistema cutâneo, músculos,

vísceras e outros órgãos, e sua função é de transmitir informações aos neurônios de

ordem superior sobre a lesão tecidual ocasionada por estímulos nocivos (FEIN,

2011). Pois, esses neurônios são ativados apenas por estímulos nocivos que

excedem um limite considerado fisiológico, sugerindo que eles possuem

propriedades biofísicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder

seletivamente a estímulos potencialmente lesivos. Quando ativados, os nociceptores

sofrem alterações na membrana, permitindo a deflagração de potenciais de ação

que serão transmitidos até o SNC através da medula espinal, o que pode ser

interpretado como sensação dolorosa no córtex cerebral (TRACEY; DICKENSON,

2012; MEYER et al., 2008).

São conhecidas quatro classes de nociceptores: mecânicos, térmicos,

polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos respondem à pressão intensa,

enquanto os nociceptores térmicos respondem às temperaturas extremas, quentes

(>45 °C) ou frias (<5 °C). A maioria dos nociceptores são polimodais, ou seja,

respondem aos diferentes tipos de estímulos mecânicos, térmicos ou químicos, e os

nociceptores silenciosos são ativados por estímulos químicos, mediadores

inflamatórios, respondendo a estímulos mecânicos e térmicos somente depois de

serem ativados (FEIN, 2011).



As fibras nociceptivas possuem duas extremidades: a primeira detecta

sensações e se projeta para regiões periféricas onde inerva pequenas porções de

tecido; já a segunda estende-se até o interior do corno da medular espinhal dorsal.

Entre esses dois segmentos ficam os corpos celulares dos nociceptores, localizados

em uma estrutura fora da medula espinal. A lesão tecidual e liberação de

mediadores químicos locais como substância P (SP), histamina, bradicinina e

prostaglandinas (PG), desencadeiam um processo de transmissão do estímulo

doloroso até níveis centrais, como ilustrado na Figura 1 (BASBAUM; JULIUS, 2006).

Figura 1. Transmissão do estímulo doloroso (Adaptado de Oaklander, 2011).

Os nociceptores estão associados a fibras aferentes de pequeno diâmetro,

que podem ser do tipo mielinizadas (fibras tipo A) ou amielinizadas (fibras tipo C).



Essas podem ser classificadas de acordo com sua estrutura, diâmetro e velocidade

de condução em três tipos: fibras C, fibras Aβ e fibras Aδ (RANG et al., 2012). Em

função da presença da bainha de mielina, as fibras Aδ e Aβ, transmitem o estímulo

doloroso de maneira rápida. Entretanto, as fibras Aδ de diâmetro médio, transmitem

a dor rápida e bem localizada, ou sinais de dor aguda pulsátil, enquanto as fibras de

maior diâmetro Aβ respondem a estímulos mecânicos inócuos como um leve toque.

Já as fibras C de pequeno diâmetro são responsáveis pela transmissão lenta da dor

(queimação) (ROCHA et al., 2007; CUELLAR et al, 2010).

Na última década, muitas moléculas de transdução da nocicepção têm sido

identificadas e o maior grupo de detectores de estímulos nocivos é a família dos

receptores de potencial transitório (TRP) (CHENG; JI, 2008; PATAPOUTIAN; TATE;

WOOLF, 2009). O receptor de potencial transitório vaniloide 1 (TRPV1),

originalmente chamado de receptor vaniloide 1 e comumente referido como receptor

da capsaicina, foi o primeiro descrito como receptor polimodal ativado por três

estímulos dolorosos; compostos vaniloides (capsaicina, resiniferatoxina), calor

nocivo (> 43 °C) e pH baixo (< 5,9) (CATERINA; JULIUS, 2001, TOMINAGA, 2007).

Outros receptores que participam da transdução da nocicepção são os canais

iônicos sensíveis ao ácido (ASICs), que são canais de cátions insensíveis à

voltagem (PETROFF et al., 2008). Os ASICs são ativados por prótons extracelulares

e alguns estudos demonstraram que a sua expressão é aumentada por mediadores

pró-inflamatórios, como fator de crescimento do nervo (NGF), serotonina,

interleucina 1 (IL-1) e bradicinina (MAMET et al., 2002; VOILLEY et al., 2001).

Diversos são os mediadores inflamatórios que, quando liberados por

macrófagos, mastócitos, células endoteliais ou nervos traumatizados, ativam as

fibras nervosas tipos Aδ e C, facilitando a transmissão dolorosa e as alterações

inflamatórias periféricas (KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006). Dentre os

mediadores inflamatórios (também denominados algogênicos) incluídos neste grupo

estão a acetilcolina, bradicinina, histamina, serotonina, leucotrieno (LT), fator de

ativação plaquetário (PAF), íons potássio, PGs, tromboxanos (TBx), interleucinas

(ILs), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), NGF e recentemente serino proteases

(VERGNOLLE, 2008).

Esses neurotransmissores ativam neurônios de segunda ordem e o sinal

nociceptivo ascende para regiões do sistema límbico para o tálamo, pelo feixe



espinotalâmico. No tálamo ocorre a somatização do estímulo nocivo onde existe o

componente emocional que discrimina a dor (Figura 2). O tálamo e o córtex são

regiões finais das projeções das vias de nocicepção, o tálamo informa que existe

sensação nociceptiva e o córtex discrimina o tipo de sensação (ROY et al., 2009).

Em resposta à estimulação nociceptiva ascendente, ocorre ativação de algumas vias

descendentes de controle da nocicepção, culminando na liberação de substâncias

como noradrenalina, serotonina e encefalinas na região do corno dorsal medular,

modulando assim o sinal nociceptivo (BASBAUM et al., 2009).

Figura 2. Processamento sensorial no corno dorsal da medula espinal (Adaptado de

Oaklander, 2011).

3. 2. Inflamação

A inflamação é uma resposta do tecido vivo e vascularizado às agressões de

diversas naturezas (física, química ou biológica) que induz a liberação de uma gama



de mediadores exógenos e endógenos. A inflamação deve conter e isolar à lesão,

destruir os microrganismos invasores e as toxinas inativas e preparar o tecido para o

reparo. Essas respostas de defesa do hospedeiro são controladas ou moduladas por

um grande número de mediadores químicos, extravasamento de líquidos, migração

celular, lesão tecidual e reparação (VANE; BOTTING, 1996; RANG et al., 2007). A

inflamação só acaba quando o agente agressor for eliminado e os mediadores

secretados inativados (MITCHELL et al., 2006).

Uma resposta tecidual inflamatória aguda é caracterizada pelos famosos

sinais cardinais: rubor, calor, edema e dor, descritos por Cornelius Celsus, um

médico romano do século I d.C. Esses sinais, de fato, justificam o termo

“inflamação”, derivado do verbo latino inflammare, o que significa incendiar. Já a

perda da função, quinto sinal clínico da inflamação, foi adicionada posteriormente

por Rudolph Virchow em 1858 (ALLER et al., 2007; SERHAN; SAVIL, 2005). A

Figura 3 ilustra os cinco sinais característicos da inflamação.

Figura 3. Ilustração dos cinco sinais da inflamação: calor, rubor, edema, dor e perda

de função (Adaptado de Dunder, 2009).



A inflamação pode ser dividida em duas fases: aguda e crônica. A primeira,

de duração relativamente curta, podendo durar minutos, horas ou mesmo alguns

dias. Sua principal característica é a presença de exsudato rico em proteínas

plasmáticas e a migração de leucócitos, principalmente os neutrófilos. Já a

inflamação crônica tem duração maior e está relacionada com alterações

histológicas, como a presença de linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos

sanguíneos, fibrose e necrose tecidual (COLLINS, 2000; RANG et al., 2007).

Na reação inflamatória aguda predominam os eventos

vasculares/exsudativos, que são fenômenos inespecíficos, isto é, constituem a fase

inicial de qualquer tipo de resposta inflamatória. São mediados principalmente por

Óxido Nítrico (NO) e PGs, e caracterizam a vasodilatação que envolve

primariamente as arteríolas, levando à abertura de novos capilares e aumento do

fluxo sanguíneo para a região, justificando os primeiros sinais cardinais: calor e

rubor (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; VERGNOLLE, 2008). De forma

simultânea, mediadores químicos como histamina, bradicinina, fator de agregação

plaquetária (PAF) e LTs provocam aumento da permeabilidade das vênulas, que

permitem a passagem de um fluido rico em proteínas plasmáticas (exsudato) para o

espaço extravascular, provocando um aumento da pressão oncótica e retenção de

água no interstício, justificando o edema. O exsudato formado facilita a liberação de

outros mediadores que amplificam a resposta inflamatória (GILROY et al., 2004). A

dor, outro sinal característico da inflamação, pode decorrer de diversos fatores:

aumento da pressão sobre tecidos e terminações nervosas, lesão das fibras

nervosas, irritação por substâncias produzidas por células lesadas ou

microorganismos e, também, pela ação de alguns mediadores inflamatórios que

intensificam a dor associada à inflamação (BHANDARI et al., 2005; ROTH et al.,

2009).

A função dos eventos vasculares descritos acima é a eliminação de

substâncias tóxicas geradas no local, a fim de facilitar a chegada de células

inflamatórias, que atraídas pelos mediadores quimiotáticos, fagocitam (neutrófilos e

macrófagos) e/ou liberam substâncias citotóxicas, presentes em grânulos,

contribuindo para a destruição do agente lesivo (SCHOR; BOIM; SANTOS, 2003).

Alinhado aos eventos vasculares, diferentes tipos de células participam do

processo inflamatório, desempenhando funções distintas, mas muitas vezes



sobrepostas. Na fase celular ocorre a transmigração de leucócitos ao longo de um

gradiente químico, esse evento celular é denominado de quimiotaxia (MEDZHITOV,

2008). Essa transmigração ocorre através da marginação (movimentação do

neutrófilo do centro para a periferia do vaso), rolamento (desaceleração do neutrófilo

através da ligação com moléculas de adesão chamadas selectinas), adesão e

diapedese (o neutrófilo atravessa o endotélio através de junções entre as células)

(Figura 4) (MARSHALL et al., 2003).

Quando os leucócitos atingem o sítio da lesão, tornam-se ativados e tentam

eliminar o patógeno liberando o conteúdo tóxico de seus grânulos, espécies reativas

de oxigênio e nitrogênio (ROS), proteinases, catepsinas, elastases, mieloperoxidase,

dentre outros (MEDZHITOV, 2008).

Tanto substâncias endógenas como exógenas podem agir como agentes

quimiotáticos. Dentre as substâncias endógenas estão os componentes do sistema

complemento como o C5a; produtos da via da lipoxigenase (LOX), em especial o

LTB4; PAF; e as citocinas, principalmente as da família das quimiocinas. Ou seja,

inúmeros mediadores químicos que se originam de proteínas plasmáticas ou de

células (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

Figura 4. Etapas do recrutamento de leucócitos para o sitio da inflamação (Disponível em:

http://www.gluegrant.org/chemotaxis.htm)

O tipo celular predominante nesta fase pode variar em função do tempo e do

tipo de lesão: nas primeiras 24 horas após o estímulo, há a predominância de

células polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos e basófilos), que são



progressivamente substituídos pelos monócitos nas próximas 24-48 horas.

Entretanto, os linfócitos podem ser as primeiras células a chegar, nas infecções

virais, e, em alguns tipos de reações de hipersensibilidade, os eosinófilos são desde

o início o principal tipo celular. Células endoteliais, macrófagos, mastócitos e

plaquetas também podem estar envolvidas (LAMANO, 2008; SCHMID-SCHONBEIN,

2006).

Essas células quando ativadas iniciam um processo de sinalização de vias

intracelulares, culminando na síntese de mediadores que participam diretamente do

processo inflamatório. Os mediadores inflamatórios são substâncias formadas e

liberadas, concomitante ou sequencialmente, no local da lesão. Atuam nos vasos

sanguíneos e células inflamatórias modulando os principais eventos relacionados à

inflamação: vasodilatação, opsonização, quimiotaxia para células inflamatórias,

obstrução tecidual e dor, como também febre e mal estar (SIQUEIRA; DANTAS,

2000). Além disso, podem, inclusive, estimular a liberação de outros mediadores

(MEDZHITOV, 2010; ZHOU et al., 2007). Dentre os mediadores mais descritos da

inflamação aguda, encontram-se histamina, bradicinina, metabólitos do ácido

araquidônico (PGs, TBxs e LTs), PAF, óxido nítrico (NO), neuropeptídeos e citocinas

(PASSOS et al., 2007).

Em resposta a estímulos mecânicos, químicos, físicos ou por meio de outros

mediadores, como a bradicinina, os fosfolipídios de membranas liberam o ácido

araquidônico, através da ativação da enzima fosfolipase A2 (PLA2). O ácido

araquidônico livre pode ser metabolizado por duas classes principais de enzimas:

cicloxigenases (COXs), sendo a isoforma COX-2 envolvida na inflamação, iniciando

a biossíntese de PGs e TBxs (prostanoides) e pelas LOXs, originando a biossíntese

de LTs (BOTTING, 2006).

Dentre as COXs, a COX-1 é constitutivamente expressa, ou seja, está

presente nas células em condições fisiológicas, principalmente nos vasos

sanguíneos, plaquetas, estômago e rins, sendo uma das responsáveis por manter as

condições de homeostase no organismo. A COX-2, por outro lado, é geralmente

ausente na maioria dos tecidos normais, mas pode ser induzida por inúmeros

estímulos, IL-1, TNF-α e demais mediadores inflamatórios. É ainda responsável pela

produção de concentrações elevadas de prostanoides durante a inflamação.

Entretanto, existe uma terceira isoforma de COX, a COX-3, que se encontra



distribuída principalmente no córtex cerebral, medula espinal e coração. Alguns

estudos sugerem que a inibição da COX-3 poderia representar o mecanismo central

primário pelo qual os fármacos analgésicos e antipiréticos, como os anti-

inflamatórios não esteroidais (AINEs), desenvolveriam suas atividades de redução

da dor e da febre (CHANDRASEKHARAN; DAI; ROOS, 2002; HIKIJI et al., 2008).

Os prostanoides mais importantes na inflamação são: PGE2, PGD2, PGF2α,

PGI2 (prostaciclina) e a Tromboxano A2 (TBxA2). As prostaglandinas PGE2, PGD2 e

PGF2α também são vasodilatadoras, além de exacerbarem o edema. Além disso, as

PGs também estão envolvidas na patogenia da dor e da febre durante a inflamação,

como a PGE2, que torna a pele hipersensível a estímulos dolorosos. A prostaciclina

possui ação vasodilatadora, além de potencializar os efeitos quimiotáticos e

aumentar a permeabilidade de outros mediadores (PECCHI et al., 2009).

Os LTs, por sua vez, são substâncias produzidas a partir do ácido

araquidônico, por ação da enzima 5-LOX, encontrada preferencialmente nos

pulmões, plaquetas, células endoteliais, monócitos, mastócitos, eosinófilos e

linfócitos B (MONTUSHI et al., 2007). Dentre os LTs, o LTB4 exerce potente

atividade quimiotática para neutrófilos, eosinófilos e monócitos, promovendo a

migração destes tipos celulares para o local afetado. Uma vez no sítio, os LTs

ativam os leucócitos, promovendo a degranulação e a produção de superóxidos, que

contribuem para os danos teciduais característicos da inflamação. Alguns LTs como

LC4, LD4 e LE4 aumentam a permeabilidade vascular (COUTINHO; MUZITANO;

COSTA, 2009; WIENECKE et al., 2008).

Outro mediador importante na vasodilatação é o NO, que é um gás solúvel

derivado do metabolismo da L-arginina por da ação da enzima óxido nítrico sintase

(NOS), que pode ser encontrada em três isoformas:, endotelial (eNOS) e neuronal

(nNOS), que são constitutivamente expressas, e a forma induzida (iNOS), que é

produzida em condições inflamatórias (VALLANCE; CHAN, 2001). O NO está

envolvido no relaxamento vascular, na inibição da agregação plaquetária e adesão

leucocitária, na neurotransmissão e nas atividades antimicrobiana e antitumoral dos

macrófagos (ZOCCALI, 2007).

A histamina, mediador armazenado e liberado por mastócitos e basófilos,

exerce ação sobre células musculares lisas e células endoteliais, provocando

vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular. É encontrado em vários



tecidos, destacando-se os pulmões, pele e trato gastrointestinal. Na pele, a

histamina acarreta uma resposta tripla, ocasionando vermelhidão, edema e dilatação

associada à vasodilatação indireta via estimulação por reflexos axonais. Já no trato

gastrointestinal a histamina é essencial para a secreção ácida (THURMOND;

GELFAND; DUNFORD, 2008).

A bradicinina, outro mediador importante no processo inflamatório, é um

peptídeo vasoativo que provoca vasodilatação e aumento da permeabilidade

vascular. Entretanto, exerce outros efeitos, como a indução da liberação de

mediadores inflamatórios como os prostanoides, a partir de diversos tipos celulares,

citocinas (IL-1 e TNF-α) de macrófagos, além do NO liberado das células endoteliais

vasculares (ELIIS; FOZARD, 2002). Trata-se, também, de um potente mediador

álgico, ação que é potencializada pelas PGs (LEEB-LUNDBERG et al., 2005).

As citocinas são liberadas por uma variedade de células envolvidas na

resposta inflamatória, incluindo macrófagos, neutrófilos e células endoteliais,

possuindo diferentes efeitos dependentes do tipo de citocina liberada e da célula

envolvida. De um modo geral, as citocinas influenciam a ativação, divisão, apoptose

e quimiotaxia celular (PECCHI et al., 2009; HANADA; YOSHIMURA, 2002). As

citocinas são classificadas em subgrupos, como: ILs, fatores de crescimento,

quimiocinas, interferons e fatores estimuladores de colônia, ou ainda, podem ser

classificadas conforme sua atividade biológica como, por exemplo: pró-inflamatórias

(IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-1Ra, IL-4 e IL-10) (WONG; FISH,

2003).

Alguns exemplos importantes de citocinas incluem a IL-8, que atua como fator

quimiotático em atrair o neutrófilo e outras células para a o local da inflamação.

Estão também envolvidas nesse processo, as quimiocinas, que são fundamentais

para os leucócitos, pois atuam em seu crescimento, diferenciação e ativação,

imprescindíveis para que ocorra quimiotaxia (TOWNSEND; MCKENZIE, 2000).

Outro fator bastante importante é o TNF-α, que inibe a apoptose do neutrófilo,

elevando sua sobrevida no sítio de ação. Adicionalmente, citocinas pró-inflamatórias,

como TNF-α e IL-1β, são importantes no processo da dor por aumentarem a

excitabilidade neuronal e a força sináptica (STELLWAGEN; MALENKA, 2006).

Considerando a complexa relação existente entre a lesão e o aparecimento

da dor, não é surpreendente que o controle farmacológico efetivo ainda seja um



desafio para a comunidade médico-científica, uma vez que esta síndrome mostra-se

resistente a uma série de fármacos com propriedades analgésicas marcadas em

quadros de dor aguda (ATTAL et al., 2010).

Diversas pesquisas vêm sendo realizadas ao longo dos últimos anos para o

estudo dos mecanismos e dos mediadores envolvidos na inflamação e dor

(NAPIMOGA et al., 2007; TRACEY; MANTYH, 2007; BITENCOURT et al., 2008;

BASBAUM et al., 2009; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2013; BRITO et al., 2012;

ALENCAR et al., 2010; GRIS et al., 2010; HUA; CABOT, 2010; MEDZHITOV, 2010;

MELO et al., 2010; ALMEIDA et al., 2013).

Embora existam diversos produtos, de origem natural ou sintética, utilizados

para o tratamento desses processos, até o momento, não foi identificado ainda o

anti-inflamatório ou analgésico ideal, devido à limitação de sua eficácia ou até

mesmo pela amplitude dos seus efeitos adversos (GRIS et al., 2010). Assim,

diversos modelos in vivo têm sido utilizados na pesquisa de compostos com

atividade anti-inflamatória/antinociceptiva (VERGNOLLE, 2008). Dessa forma, a

pesquisa de substâncias que possam intervir na complexidade das injúrias citadas, é

de grande valor, uma vez que essas são oriundas de produtos naturais que são de

fácil acesso e baixo custo.

3.3. Produtos naturais

Ao longo dos anos, o homem buscou na natureza meios para atender suas

necessidades básicas, muitos dos quais serviram de remédio para o tratamento de

várias doenças. Os primeiros registros documentam o uso de aproximadamente

1000 preparações derivadas de plantas na Mesopotâmia. No Egito, o Papiro de

Ebers, datado de 1500 a.C., documenta mais de 700 medicamentos, a maioria

oriunda de plantas. Existem evidências que praticamente todos os povos utilizavam

preparados à base de plantas para assegurar sua sobrevivência (LORENZI;

MATOS, 2002; NEWMAN; CRAGG; KINGSTON, 2008).

Durante a Idade Média, a propriedade terapêutica das plantas era atribuída à

existência de substâncias presentes nelas. Com o desenvolvimento e o avanço da

química orgânica, houve a possibilidade de isolamento e purificação, a partir de

extratos brutos, da(s) substância(s) responsável (eis) pelo(s) efeito(s) biológico(s)



predominante(s). Esse grupo de substâncias, derivado do metabolismo secundário,

denominou-se “princípios ativos” (LORENZI; MATOS, 2002; NORTON, 2005;

ITOKAWA et al., 2008). Dessa forma, os estudos dessas substâncias auxiliam

principalmente na compreensão da fisiologia das plantas, da quimiotaxonomia e na

investigação de protótipos para novos fármacos (GABIUS et al., 2002)

Por ser ainda o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos

étnicos, as plantas medicinais são encontradas em feiras livres, mercados populares

e em quintais residenciais nas regiões mais pobres do país e até mesmo nas

grandes cidades brasileiras (MACIEL et al., 2002). Muitas destas plantas são usadas

baseadas apenas no conhecimento popular e repassado de uma geração para outra

(CUNHA et al., 2003). Esse conhecimento popular deu origem aos fitoterápicos, que

foi posteriormente definido pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e em

documento publicado recentemente pela ANVISA como sendo medicamentos

obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e

segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de

utilização, documentações técnico-científicas ou evidências clínicas. São

caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como

pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade (CALIXTO, 2003; BRASIL,

2010). Assim, a OMS estipula que devido à pobreza e a falta de acesso a

medicamentos industrializados, cerca de 80% da população mundial dependem da

atividade terapêutica das plantas no que se refere à atenção primária à saúde, e

85% dessa parcela utiliza plantas ou preparações à base de vegetais. Ressalte-se

ainda que 67% das espécies vegetais medicinais do mundo são originadas dos

países em desenvolvimento (BRASIL, 2006).

Os medicamentos apresentam, em sua quase totalidade, um único princípio

ativo que é responsável pelo seu efeito farmacológico, já os extratos vegetais são

constituídos por misturas multicomponentes de substâncias ativas, parcialmente

ativas e inativas, que, muitas vezes, atuam em alvos farmacológicos diferentes

(FERREIRA; PINTO, 2010; ULRICH-MERZENICH et al., 2010). Os extratos vegetais

servem ainda como ponto de partida para a obtenção de compostos sintéticos ou

biossintéticos. Existem aqueles que exibem uma atividade biológica maior ou

diferente de seus componentes isolados (VILLAS-BÔAS; GADELHA, 2007).



É importante mencionar que a disponibilidade de princípios ativos

quimicamente puros, aliada aos avanços obtidos na fisiologia experimental no século

XIX, possibilitou a descoberta e investigação de várias substâncias que ainda hoje

são utilizadas na prática clínica, bem como a descrição de seus mecanismos de

ação. Por exemplo, a atropina, princípio ativo isolado da planta Atropa belladona,

que contribuiu para a fundamentação da neurotransmissão colinérgica e para a

teoria dos receptores farmacológicos; a reserpina, princípio ativo extraído da planta

Rauwolfia serpentina, que propiciou o embasamento da neurotransmissão

adrenérgica, serotoninérgica e dopaminérgica. Outros princípios ativos que seguem

a linha da atropina e reserpina são: o curare (isolado de Chondodendron

tomentosum), nicotina (espécies de Nicotiana), ergotamina (espécies do Ergot),

cocaína (espécies de Erythroxylum), morfina (Papaver somniferum), glicosídeos

cardíacos (espécies de Digitalis), efedrina (Ephedra sinica); além de uma

diversidade de outros princípios ativos isolados de plantas (FARNSWORTH, 1966;

GILANI; RAHMAN, 2005; NEWMAN; CRAGG; KINGSTON, 2008).

O Brasil, detentor da maior floresta tropical equatorial e tropical úmida do

planeta, constituído de uma grandeza de seu litoral e de sua flora, não pode abdicar

de sua vocação para os produtos naturais (PINTO et al., 2002).

3.3.1 Considerações sobre a família Selaginellaceae e o gênero Selaginella

A família Selaginellaceae Willk é uma família distinta, incluindo um único

gênero, Selaginella. São conhecidas cerca de 750 espécies (TRYON; TRYON, 1984;

JUDD et al., 1999), mas com distribuição mundial. Espécies do gênero estão

amplamente distribuídas nas Américas, África e Europa, a leste até o estreito de

Bering, Kamchatka e Japão na Ásia, Nova Guiné e Austrália na Oceania. Ocorrem

também no leste do Pacífico até as ilhas do Havaí, Marquesas, Tahiti e Rapa. Nas

Américas, os limites de distribuição são, ao norte, o Alasca, a leste a Groenlândia e

ao sul Mendonza e Buenos Aires na Argentina, e também na Ilha Cocos da Costa

Rica. Certamente estão mais bem representadas na bacia Amazônica com 31

espécies (TRYON; TRYON, 1984).

No Brasil, poucos trabalhos envolvem a família Selaginellaceae. O primeiro

deles foi realizado por Spring (1840) e está incluído na “Flora Brasiliensis”. As 23



espécies descritas pelo autor são tratadas em duas seções, sendo Homoeophyllae

com folhas monomorfas dispostas em várias fileiras, com uma única espécie

Selaginella rupestris (L.) Spring e Heterophyllae com folhas dimorfas dispostas em

quatro fileiras, compreendendo as demais espécies (HIRAI; PRADO, 2000).

Os membros da família Selaginellaceae são principalmente terrestres, plantas

herbáceas e perenes e variam muito em tamanho. Algumas pequenas espécies têm

hastes de aproximadamente 3 cm de comprimento, enquanto as espécies maiores

têm hastes de 50 cm a cerca de 1 m de comprimento, mas com menos de 2 cm de

altura (TRYON; TRYON, 1984; JUDD et al., 1999).

Estas plantas geralmente crescem em ambientes mesófilos de florestas

sombreadas, são terrestres, mas também podem ser encontradas sobre rochas

úmidas, próximas de rios ou cachoeiras, ou sobre penhascos úmidos e sombreados.

Algumas espécies crescem em turfeiras no ártico alpino, rochas de desertos ou

arbustos de ambientes xerófilos; outras crescem ainda em matas de bosques secos,

locais pantanosos ou florestas secundárias (TRYON; TRYON 1984).

Segundo Anthony & Thomas (2011) várias espécies do gênero Selaginella

são utilizadas como alimento (vegetais crus), plantas ornamentais e materiais para

artesanato. Entretanto, a utilização de Selaginella como planta medicinal é muito

limitada em comparação com o número de espécies e os benefícios potenciais da

medicina, por isso exige mais pesquisas etnobotânicas e fitoquímicas.

Os metabólitos secundários de Selaginella podem variar a depender de

fatores climáticos, localização e solo, bem como a colheita e procedimento de

extração (NAHRSTEDT; BUTTERWECK, 1997). Estudos anteriores envolvendo

algumas espécies de Selaginella revelou que este gênero é uma rica fonte de

esteroides, biflavonoides, alcaloides, secolignanas, neo-lignanas e derivados cafeoil.

Outros compostos, tais como alcaloides glicosídeos, fenilpropanonas e lignanas,

também foram relatados em algumas espécies do gênero (SÁ et al., 2012b).

Diferentes atividades de preparações obtidas de Selaginella spp. têm sido

relatadas: anti- inflamatória (HAN et al., 1972), antiespasmódica (ITOKAWA et al,

1983), atividade antimutagênica (MENG et al., 1990), atividade citotóxica, imuno-

estimulante e agente inibidor da RNA transcriptase reversa (ONO et al., 1989; LIN et

al., 1994), potente atividade antiviral (MA et al., 2001), atividade anti-hemorrágica

(WINTER; JANSEN, 2003); atividade antioxidade (SAH et al., 2005). Ainda em 2005,



Dai e colaboradores observaram a diminuição da expressão de histamina após

indução alérgica em animais tratados com S. tamariscina. E, mais recentemente, um

estudo publicado por nosso grupo, demonstrou efeito antinociceptivo do extrato

etanólico bruto (EEB) de Selaginella convoluta (SÁ et al., 2012a) em camundongos.

Várias espécies de Selaginella são utilizadas de forma tradicional em vários

países para o tratamento de uma variedade de doenças como o câncer, problemas

cardiovasculares (LIN et al., 1994), diabetes (DARIAS et al., 1989), gastrite (HAN;

LEE; LEE,1984), hepatite (LIN; KAN, 1990) , doenças da pele (MACFOY; SAMA,

1983) e infecções do trato urinário (WINKELMAN, 1986).

No entanto, apenas alguns estudos sobre os componentes bioativos de

espécies deste gênero foram realizados. Setyawan (2011), em trabalho recente,

estudou a diversidade de compostos de Selaginella, especialmente biflavonoides e

compostos de trealose.

3.3.2 Considerações sobre a espécie Selaginella convoluta

Selaginella convoluta (Arn.) Spring é popularmente conhecida na região do

Vale do São Francisco como "jericó", e em outras localidades do Nordeste brasileiro

como “mão-fechada” ou “mão-de-papagaio” (SÁ et al., 2012b). Citada em alguns

trabalhos ao longo das décadas (RAWITSCHER et al., 1952; BARROS; SILVA;

SILVA, 1989; AMBRÓSIO; DE MELO, 2001) S. convoluta é sempre destacada como

uma das plantas mais bem adaptadas ao clima semiárido da região da Caatinga,

especialmente pela sua capacidade evidente de padrão sazonal poiquilohídrico,

sendo facilmente reconhecida pelo seu hábito em roseta, enrolando suas folhas no

período seco e assim protegendo-se da dessecação (Figura 5A) e nos primeiros

sinais de chuva reaparece verde entre as demais plantas da Caatinga (Figura 5B).

Dessa forma, se torna a pteridófita mais representativa do cenário nordestino

(XAVIER, 2007).



Figura 5. Comportamento de Selaginella convoluta (Arn) Spring Selaginellaceae em

período seco (A) e chuvoso (B).

Porembski (2007) descreveu que, ao contrário de outras espécies da família

Selaginellaceae, S. convoluta é, geralmente, rupícola, crescendo sobre uma fina

camada de solo nas encostas de morros e paredões rochosos, formando “tapetes”

(Figura 6).

Figura 6. Tapete formado por S. convoluta durante os primeiros dias de chuva.

(Disponível em: http://fatosefotosdacaatinga.blogspot.com.br/2011/11/o-verde-do-

jerico-na-caatinga-seca.html).

Um estudo realizado por Agra e colaboradores (2007a, 2007b) sobre

informações etnomedicinais de plantas do Cariri Paraibano revelou que S. convoluta

A B



é utilizada na forma de chá através do decocto ou macerado da planta inteira como

afrodisíaco, distúrbios da amenorreia e também como diurético, três vezes ao dia. Já

Roque e colaboradores (2010) afirmam que, na comunidade de Laginha, no

município de Caicó, no Rio Grande do Norte é feito o chá das folhas por infusão para

tratamento de icterícia.

A fim de contribuir com a descoberta de fármacos, a busca contínua do nosso

grupo com plantas da Caatinga já rendeu bons resultados, como a comprovação dos

efeitos antinociceptivos do extrato etanólico de Amburana cearensis em

camundongos (OLIVEIRA et al., 2009), atividade antinociceptiva de Neoglaziovia

variegata (LIMA-SARAIVA et al., 2012b), atividade antiulcerogênica do extrato

etanólico de Encholirium spectabile em roedores (CARVALHO et al., 2010),

atividade antinociceptiva do extrato etanólico de S. convoluta (SÁ et al., 2012a) e

mais recentemente, atividade antinociceptiva e anti-inflamatória de Annona

vepretorum (SILVA, 2013).

.

2. PARTE EXPERIMENTAL



4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Material vegetal

4.1.1. Coleta e obtenção das frações hexânica e clorofórmica de S. convoluta

O material vegetal foi coletado e identificado pelo Engenheiro Florestal Dr.

Visêldo Ribeiro de Oliveira em março de 2012 (período seco) no Campo

Experimental da Embrapa Semiárido, município de Petrolina (09º 03’ 54.2” S, 40º 19’

11.7” W), Estado de Pernambuco, Brasil. Uma exsicata da espécie foi codificada sob

o número #19203 (Figura 7) e depositada no Herbário Vale do São Francisco

(HVASF) no Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD)

na UNIVASF.

Figura 7. Exsicata de S. convoluta coletada em Petrolina-PE. Foto: Larissa A. R de

Oliveira Macêdo.



Após coleta e identificação, o material vegetal foi lavado e separado de outras

espécies. Em seguida, foi dessecado em estufa com circulação e renovação de ar à

temperatura média de 40 °C durante três dias. Após a secagem, o material vegetal

foi pulverizado (Figura 8).

Figura 8. Material vegetal seco e pulverizado. Foto: Larissa A. R de Oliveira

Macêdo.

O material vegetal seco e pulverizado (1935 g) foi submetido à maceração

exaustiva com etanol 95% em um recipiente de aço inoxidável. Foram feitas várias

extrações num intervalo de 72 horas entre cada extração até esgotamento da droga.

A solução extrativa obtida passou por um processo de destilação do solvente em

evaporador rotativo à pressão reduzida a uma temperatura não superior a 50 °C

(Figura 9A).

Após este processo de evaporação do solvente, obteve-se o Extrato Etanólico

Bruto (EEB- Figura 9B). E a partir desse, foi feita uma partição líquido-líquido (Figura

9C) com solventes em gradientes de polaridade crescente (hexano e clorofórmio)

para obtenção das respectivas fases Sc-Hex (21,2591g) e Sc-CHCl3 (15,142g), as

quais foram utilizadas para estudo das atividades farmacológicas. Estes

procedimentos de preparação e obtenção das frações foram realizados no Núcleo

de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME).



Figura 9. Processo de obtenção das frações de S. convoluta: A) destilação do

solvente em evaporador rotativo à pressão reduzida, B) Extrato etanólico bruto e C)

Partição líquido-líquido. Fotos: Larissa A. R de Oliveira Macêdo.

4.2. Triagem fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Sc-Hex e Sc-CHCl3

A triagem fitoquímica procura rastrear os principais grupos de constituintes

químicos que compõem um extrato vegetal. É um exame rápido e superficial através

de reagentes de coloração ou precipitação que irão revelar ou não a presença de

metabólitos secundários em um extrato. A triagem fitoquímica preliminar, com vistas

ao estabelecimento da possível natureza química dos compostos existentes foi

realizada com as fases obtidas através do particionamento do EEB. As frações

foram avaliadas em placas cromatográficas de sílica gel com suporte de alumínio,

aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de solventes segundo

metodologia descrita por Wagner & Bladt (1996).

Os testes foram realizados de acordo com as classes de metabólitos

secundários compreendidas pelo gênero (alcaloides, antocianinas, cumarinas,

derivados antracênicos, flavonoides, lignanas, mono/diterpenos, naftoquininas,

saponinas e triterpenos/esteroides).

4.3. Animais

Foram usados camundongos Swiss, machos (25-35 g), provenientes do

Biotério Setorial da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF). Os

animais foram mantidos em grupos de seis, em gaiolas de polipropileno, à

A B C



temperatura ambiente controlada (22 ± 2 ºC) com comida e água ad libitum,

acondicionadas em estantes isoladoras. Os animais foram transferidos e

aclimatizados 48 horas antes do início dos experimentos para o laboratório

experimental de Fisiologia da mesma Universidade. Durante este período, os

animais foram manipulados apenas para limpeza das caixas. Quando necessário, os

animais foram privados de alimento 12 horas antes dos experimentos.

Todos os experimentos foram realizados às 6 h da manhã. Os protocolos

experimentais e procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de

Animais (CEUA) da UNIVASF sob o protocolo de n° 0003/17072012. Os

experimentos foram conduzidos de acordo com as normas internacionais para

estudo com animais de laboratório (ZIMMERMANN, 1983).

4.4 Testes de atividade antinociceptiva

4.4.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético

O protocolo experimental utilizado nesse ensaio foi semelhante ao proposto

originalmente por Collier e colaboradores (1968), com pequenas modificações.

Nesse método, a nocicepção foi induzida por ácido acético 0,9% via intraperitoneal

(i.p) em um volume de 0,1 mL/10 g. A resposta do animal ao estímulo é

representada por uma sequência de contrações da musculatura abdominal

juntamente com a extensão dos membros inferiores (Figura 10).

Os animais (n = 6 por grupo) foram tratados com as frações Sc-Hex ou Sc-

CHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg), ou com veículo (salina + tween 80) administrados

via i.p 30 minutos antes do estímulo álgico.

Indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) foram usadas como drogas

padrões, sendo administradas por via i.p 30 minutos antes do agente indutor da dor.

Cinco minutos após a administração do agente álgico foi registrado o número de

contorções abdominais produzidas pelo animal durante 10 min.



Figura 10. Contorção abdominal induzida por ácido acético. Fotos: Larissa A. R. de

Oliveira Macêdo.

4.4.2 Teste de nocicepção induzida por formalina

O protocolo experimental utilizado nesse ensaio foi semelhante ao proposto

originalmente por Hunskaar & Hole (1987). Para isso, os camundongos receberam

uma injeção subplantar (s.p) de 20 µL de formalina - formaldeído diluído em solução

salina (2,5%) na face dorsal da pata direita traseira. Esse ensaio é considerado um

modelo de dor persistente e caracterizado por duas fases distintas: uma fase

neurogênica (1ª fase) e outra inflamatória (2ª fase).

Os animais (n = 6 por grupo) foram tratados com as frações Sc-Hex ou Sc-

CHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg), ou com veículo (salina + tween 80) administrados via

i.p 1 hora antes do estímulo álgico. Ácido acetilsalicílico (150 mg/kg) e morfina (10

mg/kg) foram usados como drogas padrões, sendo administradas por via i.p 30

minutos antes do agente indutor da dor.



Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho

montado em três lados para permitir a visão das patas, e o tempo (em segundos)

gasto lambendo e mordendo a pata injetada foi medido como um indicador de dor

(Figura 11). Esta resposta foi mensurada durante 5 minutos (primeira fase, dor

neurogênica) e entre 15 - 30 minutos após a injeção da formalina (segunda fase, dor

inflamatória) (ALMEIDA et al., 2011).

Figura 11. Teste de nocicepção induzida por formalina. Fotos: Larissa A. R. de

Oliveira Macêdo.

4.4.3 Teste da placa quente

A atividade antinociceptiva central das frações foi avaliada utilizando o modelo

da placa quente, descrito por Kuraishi e colaboradores (1983). Os animais (n = 6 por

grupo) foram pré-selecionados no aparelho de placa quente (Insight®, Brasil), na



temperatura de 55 ± 0,5 °C. Animais que apresentaram um tempo de reação

(definido como latência para levantar ou lamber as patas) maior que vinte segundos

foram excluídos para proteger o tecido da pata e também por indicar completa

analgesia. Os animais selecionados foram pré-tratados com Sc-Hex ou Sc-CHCl3

(100, 200 e 400 mg/kg, i.p), veículo (salina + tween 80) ou morfina (10 mg/kg, i.p).

Cada animal foi colocado sobre a placa quente mantida a 55 ºC (Figura 12) e

a latência foi medida nos tempos de 30, 60, 90 e 120 min após a administração das

frações, veículo ou morfina (ALMEIDA et al., 2011).

Figura 12. Teste da placa quente. Fotos: Larissa A. R. de Oliveira Macêdo.

4.5 Testes de atividade anti-inflamatória

4.5.1. Modelo de pleurisia induzida por carragenina

O protocolo experimental utilizado foi semelhante ao proposto originalmente

por Moore (2003), com pequenas modificações. Os animais (n = 6 em cada grupo)

foram pré-tratados por via intraperitoneal (ip) com Sc-Hex ou Sc-CHCl3 (100, 200 e

400 mg/kg) 30 minutos antes da indução da pleurisia. A inflamação foi induzida pela

injeção intrapleural (i.t) de 100 µL de uma solução de carragenina a 1%. Uma agulha

especialmente adaptada de 13x5 mm foi introduzida no lado direito da cavidade



torácica dos camundongos para injetar a solução de carragenina (Figura 12) e um

volume igual de solução salina estéril, foi injetado nos controles. Às 4 h após o

estímulo, os animais foram sacrificados numa câmara de gás de CO2 e a cavidade

torácica foi aberta e lavada com 1 mL de PBS contendo EDTA (10 mM). As amostras

da lavagem pleural foram diluídas em fluido Turk (ácido acético a 2%) para a

contagem total de leucócitos, utilizando câmara de Neubauer. Indometacina (10

mg/kg) foi utilizada como droga de referência.

Figura 13. Modelo de pleurisia induzida por carragenina. Fotos: Fotos: Larissa A. R.

de Oliveira Macêdo.

4.5.1.2 Quantificação de proteínas totais

Os fluidos recuperados a partir da cavidade pleural dos animais tratados com

Sc-Hex e Sc-CHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg) foram centrifugados durante 10 min a

1500 x g, e o teor total de proteína foi quantificado no sobrenadante, em 640 nm,

utilizando a técnica de Folin-Lowry (STAUFFER, 1975).



4.5.2. Edema de pata induzido por carragenina

A atividade anti-inflamatória das frações foi avaliada através do modelo de

edema de pata induzido por carragenina 1% (Figura 14), administrada no volume de

0,1 mL na região subplantar (s.p) da pata de cada animal (n = 6 por grupo)

(WINTER; RISLEY; NUSS, 1962). A inflamação foi mensurada medindo o volume da

pata imergindo-a até a altura do tornozelo, utilizando o aparelho pletismômetro

(PanLab, Itália) 4 horas após a indução do edema. Os extratos de Sc-Hex e Sc-

CHCl3 (200 e 400 mg/kg), dexametasona (DEXA 1 mg/kg) e o controle (solução

salina) foram administrados via i.p 30 minutos antes do estímulo. Os resultados

foram expressos através da porcentagem de inibição do edema, sendo determinada

pra cada grupo experimental.

Figura 14. Edema de pata induzido por carragenina. Fotos: Larissa A. R. de Oliveira

Macêdo.



4.6 Avaliação da coordenação motora (teste do rota-rod)

O protocolo experimental foi semelhante ao proposto originalmente por

Dunham & Miya (1957), com algumas modificações. O aparelho do rota-rod

(Insight®, Brasil) é constituído de uma barra, subdividida em quatro compartimentos.

Esse teste permite avaliar se os tratamentos promovem incoordenação motora nos

animais por sedação e/ou relaxamento muscular (LAPA et al., 2003).

Os animais (n = 6 por grupo) foram pré-selecionados antes do teste (24

horas) e foram escolhidos aqueles que permaneceram na barra por 60 segundos em

pelo menos uma de três tentativas (Figura 10) (ALMEIDA et al., 2006). Grupos de 6

animais receberam veículo (salina), diazepam (2,5 mg/Kg) e as frações Sc-Hex e Sc-

CHCl3 nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg em relação ao peso corporal dos animais.

Os extratos foram administrados por via i.p assim como a droga de referência 30

minutos antes da observação. Após a administração, os animais foram colocados

individualmente na barra giratória (sentido contrário ao movimento da barra) e foi

registrado o tempo de permanência do animal na barra (SANTOS-JUNIOR et al.,

2005). Os animais foram observados em diferentes intervalos de tempo (30, 60 e

120 minutos) após a administração.

Figura 15. Avaliação da coordenação motora no teste do rota-rod. Fotos: Larissa A.

R. de Oliveira Macêdo.



4.7. Toxicidade aguda

Na investigação da toxicidade aguda, os camundongos foram divididos em três

grupos de 6 machos e 6 fêmeas (n = 12). O grupo controle recebeu veículo (salina +

tween 80). Os demais receberam o pré-tratamento em dose única de 400 mg/kg e

2000 mg/kg por via intraperitoneal de ambas as frações, SC-Hex e Sc-CHCl3. Em

seguida, os animais foram observados durante 14 dias para avaliar a presença de

morte e sinais de toxicidade. Outros parâmetros tais como: peso corporal, consumo

de alimento e água foram avaliados diariamente, durante todo o estudo.

Figura 16. Avaliação diária do peso corporal, consumo de alimento e água no teste

de toxicidade aguda. Fotos: Larissa A. R. de Oliveira Macêdo.

4.7.1. Triagem farmacológica comportamental

A triagem comportamental (Anexo B) dos camundongos foi realizada

seguindo o protocolo descrito por Almeida et al. (1999). Foram analisados alguns

parâmetros específicos, como, piloereção, ptose palpebral, contorções abdominais,

convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras, sedação, ambulação

aumentada, resposta ao toque diminuída, movimentação intensa das vibrissas,

agressividade, estereotipia e analgesia, após a administração em dose única de 400



mg/kg e 2000 mg/kg por via via intraperitoneal de ambas as frações. O grupo

controle recebeu veículo (salina + tween 80). No primeiro dia, tais parâmetros foram

avaliados nos tempos de 30, 60, 120, 180 e 240 minutos após o pré-tratamento. A

avaliação comportamental foi feita diariamente até o último dia da toxicidade aguda.

4.7.2. Análise de parâmetros hematológicos e bioquímicos

Para a avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos do sangue, foi

utilizada a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e Araújo et al. (2008)

com modificações. O sangue foi retirado através do plexo braquial para análise

laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de eritrócitos (106/mm3),

hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular médio (VCM, μ3),

hemoglobina corpuscular média (HCM, g), concentração de hemoglobina

corpuscular média (CHCM, %), leucócitos (103/mm3), linfócitos (%), monócitos (%) e

plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos analisados em amostras de soro

foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL), triglicérides (mg/dL), AST/TGO (U/L),

ALT/TGP (U/L) e creatinina (mg/dL). Para a determinação dos parâmetros

hematológicos foi utilizado analisador de hematologia (Horiba, ABXPentra 60), já

para os parâmetros bioquímicos foi utilizado um analisador semiautomático Bioplus

(BIO-200).

4.7.3 Análise histopatológica dos órgãos

Após a coleta do sangue, com os animais ainda em anestesia profunda, foram

feitas análises macroscópicas (forma, tamanho, coloração e consistência) dos

seguintes órgãos: pulmão, coração, rim, baço, fígado, pâncreas e estômago e

comparados aos órgãos do grupo controle. Logo após, foram lavados em solução

fisiológica e mergulhados em solução de formol a 10%, (tampão fosfato, 0,1 M, pH

7,2) por 18 horas. Decorrido esse tempo, os fragmentos foram lavados em água

corrente e em seguida imersos em álcool a 70% e transportados para o Laboratório

de Imunologia da UNIVASF. Posteriormente, os órgãos foram desidratados em

ordem crescente de álcool (80, 90, 95 e 100%,) seguida de diafanização em xilol,



impregnação e inclusão em parafina para a formação dos blocos histológicos. Cada

bloco foi submetido à microtomia e as secções tissulares de 5 µm de espessura

foram estiradas em banho histológico e em seguida montadas em lâminas de vidro.

Foram analisadas as alterações histopatológicas somente nos fígados e rins dos

camundongos sob tratamento agudo com as frações. Assim, as lâminas foram coradas

com Hematoxilina e Eosina (H.E) e examinados em microscópico óptico (Olympus®,

Modelo BX41, Japão).

4.8. Ensaio de viabilidade celular por MTT

Para verificar o efeito das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 sobre a viabilidade

celular, foi utilizado o ensaio de viabilidade in vitro por MTT (brometo de 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) utilizando macrófagos peritoneais (MOSMANN,

1983). Macrófagos peritoneais foram coletados com PBS/EDTA 10 mM,

centrifugados em centrifuga refrigerada (Herolab®, Modelo Unicer MR, Alemanha) e

ressuspensos em 1 mL de meio RPMI/SFB 10%. Em seguida, as células viáveis

(verificadas utilizando-se o método de exclusão por azul de Tripan, que cora em azul

as células não viáveis) foram plaqueadas na densidade de 2,5 x 105 células/poço,

em placas de 96 poços e incubadas em estufa de dióxido de carbono (CO2) por 37

°C por 2 horas para adesão dos macrófagos. As frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 foram

incubadas em diversas concentrações (1, 100, 250 e 500 µg/mL) por 24 h. Como

grupos controles, foram utilizados apenas células e meio de cultura ou células

tratadas com Tween (0,2%). Decorridas as 24, horas as células foram incubadas

com MTT por 4 horas. Após a incubação, os poços foram lavados e adicionou-se

150 µl de DMSO (Dimetilsulfóxido) por 15 minutos, e foi realizada a leitura em

espectrofotômetro (Thermo Plate, Modelo RS 232) no comprimento de onda de 540

nm.

4.9. Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m),

conforme indicado nas legendas das tabelas e figuras e as diferenças estatísticas

entre os grupos experimentais e controle foram verificadas por Análise de Variância



(ANOVA) seguida pelo teste de Dunnet ou teste t, conforme exigência do protocolo

experimental. Os valores foram considerados significativos quando *p < 0,05. As

análises foram realizadas no tutorial GraphPad Prism® versão 5.0.

3. RESULTADOS



5. RESULTADOS

5.1. Triagem fitoquímica

A análise fitoquímica preliminar (Tabela 1) demonstrou reação positiva para a

presença de derivados antracênicos, flavonoides, naftoquinonas e

triterpenos/esteroides.

Tabela 1. Constituintes químicos identificados nas fases de Selaginella convoluta

através de cromatografia em camada delgada.

Constituintes químicos Sc-Hex Sc-CHCl3

Alcaloides - -

Antocianinas - -

Cumarinas - -

Derivados antracênicos + +

Flavonoides ++ ++

Lignanas - -

Mono/Diterpenos - -

Naftoquinonas + +

Saponinas - -

Triterpenos/Esteroides ++ +++

(-): ausência do constituinte, (+) leve presença do constituinte, (++): moderada presença do constituinte, (+++): intensa presença do constituinte.

5.2 Resultados da atividade farmacológica das frações obtidas de S. convoluta

5.2.1 Atividade antinociceptiva das frações obtidas de S. convoluta

5.2.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético



No modelo de nocicepção induzida por ácido acético, ambas as frações

estudadas de S. convoluta (Sc-Hex e Sc-CHCl3), administradas nas doses de 100,

200 e 400 mg/kg, via i.p induziram redução significativa no número de contorções

abdominais (* p < 0,05). O grupo controle de Sc-Hex, tratado apenas com o veículo,

apresentou 25,67 ± 3,31 contorções abdominais e 20,33 ± 3,42 para Sc-CHCl3,

enquanto os grupos tratados apresentaram 9,00 ± 1,46 (64,94%); 5,66 ± 1,99

(77,95%) e 0,16 ± 0,16 (99,38%) para 100, 200 e 400 mg/kg de Sc-Hex com as

respectivas porcentagens de inibição. Aqueles tratados com Sc-CHCL3 nas mesmas

doses reduziram em 2,00 ± 1,12 (90,16%); 2,00 ± 0,51 (90,16%) e 0,83 ± 0,40

(95,92%) o número de contorções abdominais.

A indometacina (INDO), reduziu o número de contorções com porcentagem

de inibição de 90,92% para Sc-Hex e 88,54% para Sc-CHCl3, enquanto os animais

tratados com morfina (MOR) houve redução de 100% quando comparado ao

controle. Estes resultados são mostrados nas Figuras 17 e 18.

Controle 100 200 400 INDO MOR0

10

20

30

40

**

**

*

Sc-Hex (mg/kg)

No

de c

on

torç

ões a

bd

om

inais

Figura 17 - Efeito antinociceptivo da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,

200 e 400 mg/kg), indometacina (INDO, 20 mg/kg) e morfina (MOR, 10 mg/kg), no

teste de contorções abdominais em camundongos. Valores são expressos em média

± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).



Controle 100 200 400 INDO MOR0

5

10

15

20

25

***

*

*

Sc-CHCl3 (mg/kg)

No

de c

on

torç

ões a

bd

om

inais

Figura 18 - Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3

100, 200 e 400 mg/kg), indometacina (INDO, 20 mg/kg) e morfina (MOR, 10 mg/kg),

no teste de contorções abdominais em camundongos. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo


5.2.1.2 Teste de nocicepção induzida por formalina

O tratamento com as frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 nas doses de 100, 200 e

400 mg/kg (i.p) produziu uma atividade antinociceptiva significante comparada ao

grupo controle na segunda fase deste teste (p<0,05). Sc-Hex (100, 200 e 400

mg/kg.) reduziu em 64,51; 67,79 e 73,90%, respectivamente, o tempo de lambida de

pata dos animais (Figura 19).

Houve redução desse tempo na primeira fase, com porcentagem de inibição

de 35,46% apenas na dose de 100 mg/kg dos animais tratados com Sc-CHCl3

(Figura 20). Já na segunda fase esses percentuais foram 82,06, 74,96 e 92,77%. A

droga de referência utilizada nesse teste foi o ácido acetilsalicílico (AAS) que reduziu

somente na segunda fase do teste, enquanto a morfina inibe ambas as fases de

estímulo da dor (p<0,05).



Controle 100 200 400 AAS MOR0

20

40

60

*

Sc-Hex (mg/kg)

Primeira FaseT

em

po

de l

am

bid

a (

s)


50

100

150

* * *

**

Sc-Hex (mg/kg)

Segunda Fase

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Figura 19. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,

200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS,150 mg/kg) e morfina (MOR,10 mg/kg)

na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos. Valores são

expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente

diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).


20

40

60

*

*

Sc-CHCl3 (mg/kg)

Primeira Fase

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)


50

100

150

**

* **

Sc-CHCl3 (mg/kg)

Segunda Fase

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Figura 20. Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3

100, 200 e 400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS, 150 mg/kg) e morfina (MOR, 10

mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina em camundongos. Valores

são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05

significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de

Dunnet).

5.2.1.3 Teste da placa quente

No teste da placa quente o tratamento com as frações de S. convoluta, nas

doses de 100, 200 e 400 mg/kg via i.p, não aumentou o tempo de permanência do



animal sobre a placa quente (Figura 20 e 21). Entretanto, a morfina (10 mg/kg),

utilizada como fármaco padrão, foi ativa de maneira significativa (p < 0,05) no

tempos de 60, 90 e 120 minutos.

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Sc-Hex 100 mg/kg

Sc-Hex 200 mg/kg

Sc-Hex 400 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

*

*

*

Tempo (min)

Tem

po

de L

atê

ncia

(s)

Figura 21. Efeito antinociceptivo da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,

200 e 400 mg/kg), morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120

minutos após sua administração em camundongos. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo


30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Sc-CHCl3 100 mg/kg

Sc-CHCl3 200 mg/kg

Sc-CHCl3 400 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

*

*

*

Tempo (min)

Tem

po

de L

atê

ncia

(s)

Figura 22. Efeito antinociceptivo da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-Hex

100, 200 e 400 mg/kg), morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e

120 minutos após sua administração em camundongos. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo




5.2.2 Atividade anti-inflamatória das frações obtidas de S. convoluta

5.2.2.1 Modelo de pleurisia induzida por carragenina

No modelo de pleurisia, somente os animais tratados com Sc-CHCl3 na dose

de 200 mg/kg (i.p) apresentaram redução significativa na inibição da migração

celular induzida por carragenina (*p < 0,05). Os animais estimulados com

carragenina apresentaram um aumento no influxo de leucócitos para a cavidade

inflamada de 6,53 ± 1,45 x 106 células. Apenas o pré-tratamento na dose de 200

mg/kg com a Sc-CHCl3 foi capaz de reduzir esse infiltrado para 1,19 ± 0,25 x 106

células (81,78% de inibição – Figura 23). A indometacina, utilizada como fármaco

padrão, inibiu em 89,89% a migração celular para a cavidade pleural.

- Cg 100 200 400 100

5

10

15

Indometacina (mg/kg)

Sc-Hex (mg/kg)

*

Carragenina 1% (300 g/cavidade)

Carragenina (Cg)

Controle

Le

ucó

cito

s t

ota

is

(10

6cé

lula

s/c

avid

ad

e)

Figura 23. Efeito anti-inflamatório da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100,

200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia induzida por

carragenina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão da

média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA

seguido pelo teste de Dunnet).



- Cg 100 200 400 100

2

4

6

8

10


Sc-CHCl3 (mg/kg)

*


Carragenina(Cg)

*

ControleL

eu

có

cito

s t

ota

is

(10

6cé

lula

s/c

avid

ad

e)

Figura 24. Efeito anti-inflamatório da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3

100, 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no modelo de pleurisia induzida

por carragenina em camundongos. Valores são expressos em média ± erro padrão

da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA


5.2.2.1.2 Quantificação de proteínas totais

A quantificação de proteínas totais confirma os dados no modelo anterior,

onde somente os animais tratados com Sc-CHCl3 na dose de 200 mg/kg (i.p)

apresentaram redução significativa do extravasamento de proteínas para a cavidade

pleural (p < 0,05). Os animais estimulados apresentaram 1,22 ± 0,18 μg/mL

enquanto o pré-tratamento reduziu esse valor para 0,32 ± 0,06 μg/mL (73,77%)

(Figura 25) assim como o fármaco dexametasona com porcentagem de inibição de

86,88%.



- Cg 100 200 400 100.0

0.5

1.0

1.5Controle


*

Sc-Hex (mg/kg)


Carragenina (Cg)

Pro

teín

as t

ota

is (g/m

L)

Figura 25. Efeito da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 100, 200 e 400 mg/kg)

e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas plasmáticas no

modelo de pleurisa induzida por carragenina. Valores são expressos em média ±

erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle

(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).

- Cg 100 200 400 100

2

4

6

8

10

**


Controle

Carragenina (Cg)


Sc-CHCl3 (mg/kg)

Pro

teín

as t

ota

is (g/m

L)

Figura 26. Efeito da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3 100, 200 e 400

mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) sobre o extravasamento de proteínas plasmáticas

no modelo de pleurisa induzida por carragenina. Valores são expressos em média ±

erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle

(ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).



5.2.2.2 Edema de pata induzido por carragenina

No modelo de edema de pata induzido por carragenina, o tratamento com as

frações de S. convoluta (Sc-Hex e Sc-CHCl3), nas doses testadas 100, 200 e 400

mg/kg via i.p, não foi capaz de diminuir de maneira significativa o exsudato formado

após o estímulo álgico. Entretanto, a indometacina (10 mg/kg), utilizada como

fármaco padrão, foi ativa de maneira significativa (p < 0,05) após 4 horas da sua

administração, reduzindo o edema em 74,45%. A figura 27 expõe os dados na forma

de % de inibição do volume da pata, sendo o volume do edema da pata dos animais

tratados com carragenina (controle) aqueles que exibiram 100% de edema.

1% 10 200 400 200 4000

50

100

150

Sc-Hex (mg/kg)

Sc-CHCl3 (mg/kg)


Tratamento (mg/kg)

Carragenina (Cg)

% Inib

ição d

o v

olu

me (L)

Figura 27. Efeito anti-inflamatório das frações hexânica e clorofórmica de S.

convoluta (Sc-Hex ou Sc-CHCl3; 200 e 400 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) no

modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos. Valores são

expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente

diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnet).

5.3. Avaliação da atividade motora no teste de rota-rod

No teste do rota-rod, os animais tratados com as frações Sc-Hex e Sc-CHCl3

não apresentaram alteração significativa no desempenho motor nas doses de 100,

200 e 400 mg/kg. Entretanto, como já esperado, o diazepam, fármaco depressor do

SNC, reduziu o tempo em que os animais permaneceram no rota-rod quando

comparado ao grupo controle (Figuras 28 e 29).



0

50

100

150

200Controle

Sc-Hex 100 mg/kg

Sc-Hex 200 mg/kg

Sc-Hex 400 mg/kg

Diazepam 2,5 mg/kg

0.5 h 1 h 2 h

*

*

*

Tem

po

(s)

no

ro

ta-r

od

Figura 28. Efeito da fração hexânica de S. convoluta (Sc-Hex, 100, 200 e 400

mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod. Valores são expressos em



0

50

100

150

200Controle

Sc-CHCl3 100 mg/kg

Sc-CHCl3 200 mg/kg

Sc-CHCl3 400 mg/kg

Diazepam 2,5 mg/kg

0.5 h 1 h 2 h

**

*

Tem

po

no

ro

ta-r

od

(s)

Figura 29. Efeito da fração clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3, 100, 200 e 400

mg/kg, i.p) e diazepam (2,5 mg/kg) no teste do rota-rod. Valores são expressos em



5.4. Toxicidade aguda das frações obtidas de S. convoluta A administração das frações de S. convoluta nas doses de 400 e 2000 mg/kg,

por via intraperitoneal em dose única não ocasionou mortes, indicando baixa

toxicidade do extrato. Em relação ao peso corporal, consumo de água e ração,



houve diferença estatística quando comparados com o grupo controle. Neste

experimento foi observado que, tanto Sc-Hex quanto Sc-CHCl3 têm DL50 > 2000

mg/kg quando administrado por via intraperitoneal.

5.4.1. Triagem farmacológica comportamental

A triagem comportamental dos camundongos foi realizada nos tempos de 30,

60,120, 180 e 240 minutos após a administração via intraperitoneal das frações Sc-

Hex e Sc-CHCl3 nas doses de 400 e 2000 mg/kg. Os animais demonstraram

aumento no número de grooming (comportamento característico de auto limpeza) e

contorções abdominais.

5.4.2. Consumo de água, ração e variação do peso dos animais

O consumo de água pelos camundongos tratados com as fração Sc-Hex nas

doses de 400 e 2000 mg/kg não mostrou alterações significativas, assim como no

consumo de ração por esses animais. Ao final do experimento, o consumo de água

foi de 61,43 ± 1,07 mL para o grupo controle de Sc-Hex, enquanto os animais

tratados com 400 mg/kg foi de 71,21 ± 1,14 mL e 67,71 ± 1,92 g para aqueles

tratados com 2000 mg/kg. O consumo de alimento para os mesmos grupos foi de

54,79 ± 1,62 g, 54,36 ± 1,02 g e 57,50 ± 0,87g, respectivamente. Já em relação ao

ganho de peso dos animais, apenas aqueles tratados com a maior dose

demonstraram menor ganho de peso, mas não o suficiente para detectar diferenças

significativas quando comparados ao grupo controle. No final do experimento, a

média do grupo controle foi de 34,77 ± 0,13 g, enquanto para os animais tratados

com a dose de 400 mg/kg foi de 35,10 ± 0,20 g e 33,89 ± 0,19 g para os animais

tratados com a maior dose. O consumo de água e ração pelos animais tratados com

Sc-CHCl3 mostrou alterações significativas (p < 0,05), principalmente nos 5 primeiros

dias daqueles tratados com a dose de 2000 mg/kg. Assim, ao final do experimento, a

quantidade de água consumida pelos animais do grupo controle de Sc-CHCl3 foi de

68,14 ± 0,97 mL de água e os animais tratados com 400 mg/kg 61,00 ± 2,39 mL e

49,43 ± 2,51 mL para aqueles tratados com 2000 mg/kg. O consumo de alimento

para os mesmos grupos foi de 50,57 ± 1,20 g, 48,43 ± 2,44 g e 42,29 ± 3,00 g,

respectivamente. Entretanto, essas diferenças não afetaram no ganho de peso dos



animais, não sendo possível observar diferenças significativas. A média de peso do

grupo controle foi de 33,33 ± 0,15 g, 31,79 ± 0,22 g para os animais tratados com

400 mg/kg e 31,01 ± 0,18 g para os animais tratados com 2000 mg/kg.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1525

50

75

100

125Controle

Sc-Hex 400 mg/kg i.p.


Dias

Co

nsu

mo

de á

gu

a (

mL

)

Figura 30. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração hexânica

de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante 14 dias

(n= 12 por grupo).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1530

40

50

60

70Controle



Dias

Co

nsu

mo

de r

ação

(g

)

Figura 31. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração hexânica

de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante 14 dias

(n= 12 por grupo).



0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1530.0

32.5

35.0

37.5Controle

Sc-Hex 400 mg/kg i.p

Sc-Hex 2000 mg/kg i.p

Dias

Peso

co

rpo

ral

(g)


hexânica de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9% durante

14 dias (n= 12 por grupo).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1525

50

75

100

125Controle

Sc-CHCl3 400 mg/kg i.p.

Sc-CHCl3 2000mg/kg i.p.

Dias

Co

nsu

mo

de á

gu

a(m

L)

Figura 33. Dados do consumo de água dos animais tratados com a fração

clorofórmica de S. convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%

durante 14 dias (n= 12 por grupo).



0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 150

20

40

60Controle


Sc-CHCL3 2000 mg/kg i.p.

Dias

Co

nsu

mo

de r

ação

(g

)

Figura 34. Dados do consumo de ração dos animais tratados com a fração

clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%


0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1530.0

32.5

35.0

37.5Controle


Sc-CHCL3 2000 mg/kg i.p.

Dias

Peso

co

rpo

ral

(g)


clorofórmica de S. convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000 mg/kg) e solução salina 0,9%


5.4.3 Parâmetros hematológicos e bioquímicos

É possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos

(eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio (VCM),

hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular

média (CHCM), leucócitos, linfócitos, eosinófilos e plaquetas) após a administração



de 400 mg/kg e 2000 mg/kg i.p, de Sc-Hex e Sc-CHCl3 não apresentaram diferenças

significativas. Os resultados estão expressos nas Tabelas 2 e 3.

Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados mostraram um

aumento em todos os parâmetros do grupo tratado com Sc-Hex, entretanto essas

diferenças não foram consideradas estatisticamente significativas quando

comparadas com o grupo controle. Da mesma forma, os animais tratados com Sc-

CHCl3 apresentaram um aumento nos mesmos parâmetros, mas sem diferenças

significativas quando comparadas ao grupo controle, exceto o parâmetro

transaminase glutâmico oxalacética AST/TGO.



salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).

Parâmetros Controle Sc-Hex

400 mg/kg

Sc-Hex

2000 mg/kg

Hemácias (mm3) 8,31 ± 0,2 8,75 ± 0,18 8,37 ± 0,34

Hemoglobina (g/dL) 13,89 ± 89 15,13 ± 0,22 14,08 ± 0,50

Hematócrito (%) 40,73 ± 1,25 43,32 ± 0,72 41,16 ±1,50

VCM (fL) 48,91 ± 0,8 49,64 ± 0,88 49,17 ± 0,79

HCM (pg) 16,78 ± 0,26 17,35 ± 0,32 17,08 ± 0,25

CHCM (g/dL) 34,25 ± 0,27 34,94 ± 0,17 34,76 ± 0,22

Leucócitos totais (mm3) 8,77 ± 1,41 11,85 ± 0,73 10,79 ± 0,86

Linfócitos (%) 92,25 ± 0,65 93,33 ± 0,52 92,38 ± 0,53

Eosinófilos (%) 0.06 ± 0,02 0,07 ± 0,04 0,08 ± 0,04

Plaquetas (mm3) 685,00 ± 76,90 665,00 ± 58,29 672,40 ± 66,41

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student *p<

0,05, comparado ao controle.





solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).

Parâmetros Controle Sc-CHCl3

400 mg/kg

Sc-CHCl3

2000 mg/kg

Hemácias (mm3) 8,47 ± 0,16 8,32 ± 0,14 7,96 ± 0,17

Hemoglobina (g/dL) 13,89 ± 0,59 13,82 ± 0,33 13,99 ± 0,34

Hematócrito (%) 40,77 ± 1,59 39,39 ± 1,59 39,57 ± 1,51

VCM (fL) 49,91 ± 0,64 48,73 ± 0,64 50,40 ± 0,37

HCM (pg) 17,04 ± 0,22 16,90 ± 0,22 17,39 ± 0,23

CHCM (g/dL) 34,07 ± 0,28 34,60 ± 0,19 34,69 ± 0,20

Leucócitos totais (mm3) 9,87 ± 1,11 9,87 ± 0,89 9,78 ± 1,28

Linfócitos (%) 92,08 ± 0,91 92,33 ± 0,76 91,41 ± 0,97

Eosinófilos (%) 0.18 ± 0,07 0,12 ± 0,05 0,14 ± 0,06

Plaquetas (mm3) 742,30 ± 74,27 752,50 ± 66,15 769,60 ± 84,16







salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).


400 mg/kg

Sc-Hex

2000 mg/kg

Glicose (mg/dL) 89,73 ± 8,89 94,10 ± 10,37 89,75 ± 6,33

Colesterol (mg/dL) 130,00 ± 13,51 132,5 ± 14,79 126,70 ± 11,81

Triglicerídeos (mg/dL) 203,80 ± 38,43 210,00 ± 18,03 222,50 ± 19,42

AST/TGO (U/L) 139,90 ± 9,13 145,30 ± 9,04 147,00 ± 11,55

ALT/TGP (U/L) 42,63 ± 5,04 45,20 ± 10,21 47,68 ± 8,43

Creatinina (mg/dL) 0,83 ± 0,09 1,01 ± 0,18 0,85 ± 0,13





solução salina 0,9% durante 14 dias (n= 12 por grupo).


400 mg/kg

Sc-CHCl3

2000 mg/kg

Glicose (mg/dL) 93,22 ± 7,13 85,91 ± 4,06 92,11 ± 5,94

Colesterol (mg/dL) 130,00 ± 14,14 179,00 ± 10,89 135,00 ± 11,55

Triglicerídeos (mg/dL) 195,80 ± 9,95 198,3 ± 15,90 192,00 ± 27,41

AST/TGO (U/L) 154,40 ± 9,19 155,70 ± 19,08 162,50 ± 23,75*

ALT/TGP (U/L) 48,00 ± 8,39 31,01 ± 6,21 47,64 ± 7,39

Creatinina (mg/dL) 0,87 ± 0,12 1,05 ± 0,13 0,98 ± 0,09





5.4.4 Análise macroscópica, histológica e peso dos órgãos

Não foram identificadas alterações macroscópicas ou histológicas nos grupos

tratados com o veículo (controle) em ambos os sexos e frações de S. convoluta. A

avaliação hepática revelou estrutura e coloração lobular preservadas e nos rins,

arquitetura normal com corpúsculo renal e túbulos contorcidos distais e proximais

regularmente distribuidos. O córtex apresentou glomérulos regularmente distribuídos

(Figuras 36A e 38A). Entretanto, para os animais tratados com Sc-Hex na dose de

400 mg/kg, os fígados apresentaram processo inflamatório difuso. Normalmente, os

infiltrados apresentaram maior densidade celular próxima às veias centro-lobulares,

mas não houve destruição do parênquima hepático. Já aqueles tratados com a

maior dose (2000 mg/kg) apresentaram hepatócitos com múltiplas vesículas no

citoplasma, sugestiva de esteatose além de um aumento no número de células

inflamatórias (Figuras 36B e 36C).

Nos animais tratados com Sc-CHCl3, na dose de 400 mg/kg os fígados

apresentaram pequenos focos inflamatórios e vasos hiperêmicos (Figura 38B) .

Entretanto, na maior dose, foram observadas extensas áreas de fibrose e discretas

regiões de necrose (Figura 38C). Em relação à avaliação renal, não houve

alterações dignas de nota, nos animais tratados com Sc-Hex (Figura 37B e 37C)..

Aqueles animais tratados com a maior dose de Sc-CHCl3 apresentaram um

pequenoprocesso inflamatório ao redor dos túbulos contorcidos (Figura 39C). Na

análise macroscópica, não houve observação quanto à coloração ou consistência

dos órgãos dos animais tratados com a fração hexânica (Sc-Hex) nas doses de 400

e 2000mg/kg via i.p. Entretanto, aqueles tratados com a fração clorofórmica na maior

dose (Sc-CHCl3, 2000mg, i.p), apresentaram fígado com lóbulos fundidos,

consistência alterada com pontos.

Em relação ao peso dos órgãos, não foram constatadas alterações

significativas entre os grupos tratados com Sc-Hex quando comparados ao controle

(Tabela 6), somente nos animais que receberam a maior dose de Sc-CHCl3

apresentaram aumento significativo no tamanho do baço e diminuição no tamanho

do estômago dos animais tratados com as duas doses em relação ao grupo controle

(Tabela 7).



Tabela 6. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração hexânica de

Selaginella convoluta (Sc-Hex 400 e 2.000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9% durante

14 dias (n= 12 por grupo).


400 mg/kg

Sc-Hex

2000 mg/kg

Pulmão (g) 0,22 ± 0,01 0,24 ± 0,00 0,24 ± 0,02

Coração (g) 0,15 ± 0,01 0,17 ± 0,01 0,17 ± 0,01

Rim (g) 0,21 ± 0,01 0,21 ± 0,02 0,21 ± 0,01

Baço (g) 0,14 ± 0,03 0,14 ± 0,01 0,16 ± 0,02

Fígado (g) 1,63 ± 0,11 1,59 ± 0,12 1,53 ± 0,09

Pâncreas (g) 0,13 ± 0,02 0,21 ± 0,02 0,21 ± 0,01

Estômago (g) 0,41 ±0,03 0,40 ± 0,02 0,42 ± 0,02



Tabela 7. Peso dos órgãos de camundongos tratados com a fração clorofórmica de

Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2.000 mg/kg, i.p) e solução salina 0,9%



400 mg/kg

Sc-CHCl3

2000 mg/kg

Pulmão (g) 0,25 ± 0,01 0,23 ± 0,00 0,23 ± 0,02

Coração (g) 0,16 ± 0,01 0,15 ± 0,00 0,16 ± 0,00

Rim (g) 0,19 ± 0,02 0,18 ± 0,01 0,18 ± 0,01

Baço (g) 0,13 ± 0,00 0,14 ± 0,01 0,17 ± 0,02*

Fígado (g) 1,47 ± 0,09 1,45 ± 0,08 1,41 ± 0,07

Pâncreas (g) 0,24 ± 0,02 0,21 ± 0,01 0,25 ± 0,02

Estômago (g) 0,45 ±0,03 0,37 ± 0,01* 0,35 ± 0,02*






tratados com veículo (salina+ tween 80) e extratos da fração hexânica de S.

convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração

Hematoxilina-Eosina (H.E),


tratados com veículo (salina+ tween 80) e extratos da fração hexânica de S.

convoluta (Sc-Hex 400 e 2000 mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração

Hematoxilina-Eosina (H.E), Aumento 200x.


tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de S.

convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração

Hematoxilina-Eosina (H.E).

A B

B

B A C

C

C A




tratados com veículo (salina + tween 80) e extratos da fração clorofórmica de S.

convoluta (Sc-CHCl3 400 e 2000mg/kg, i.p), respectivamente. Coloração

Hematoxilina-Eosina (H.E).

5.5. Ensaio de viabilidade celular por MTT

Após a incubação dos macrófagos com Sc-Hex, houve uma redução

significativa da viabilidade das células a partir da concentração de 250 μg/mL para

27,07 ± 0,9%. Já a incubação com Sc-CHCl3 provocou uma redução de 74,32 ±

4,2% já na concentração de 1 μg/mL. Entretanto, o uso do diluente reduziu por si só

a viabilidade das células. Já as células tratadas apenas com salina se mantiveram

viáveis (100%).

- 1 100 250 5000

50

100

150

**

Sc- Hex + Tween 0,2%

Controle

Sc-Hex (g/mL)

% C

élu

las v

iáve

is

Figura 40. Efeito fração hexânica de Selaginella convoluta (Sc-Hex 1, 100, 250 e

500 µg/mL) sobre a viabilidade celular. Valores são expressos em média ± erro

padrão da média, * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA


B A C



- 1 100 250 5000

50

100

150

*

*

* *

Controle

Sc-CHCl3 + tween 0,2%

Sc-CHCl3 (g/mL)

% C

élu

las

viáve

is

Figura 41. Efeito fração clorofórmica de Selaginella convoluta (Sc-CHCl3 1, 100, 250

e 500 µg/mL) sobre a viabilidade celular. Valores são expressos em média ± erro

padrão da média, * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA


4. DISCUSSÃO



6. DISCUSSÃO

6.1. Triagem fitoquímica preliminar das frações obtidas de Selaginella convoluta.

Os dados reportados nesse estudo indicam, pela primeira vez, que as frações

obtidas de Selaginella convoluta, apresentam perfil de resposta antinociceptiva

frente a diferentes modelos que utilizam estímulos químicos e térmicos. Esse padrão

de atividade provavelmente está relacionado com a presença de constituintes

químicos que foram identificados na análise fitoquímica preliminar (Tabela 1, página

63).

Dentre os produtos de origem vegetal, os terpenos, quinonas, catequinas,

alcaloides e flavonoides destacam-se por apresentarem potencial farmacológico no

tratamento de inflamações (KHANNA et al., 2007).

Os flavonoides são compostos da família dos polifenóis abundantes no reino

vegetal e estão presentes em vários alimentos. Em relação às suas propriedades

anti-inflamatórias, os flavonoides atuam na inibição da enzima 5-lipoxigenase,

conversora do ácido araquidônico em leucotrienos, que são mediadores da asma,

alergias e inflamação, bem como causam a inibição da via da COX. Adicionalmente,

estudos têm mostrado que flavonoides exercem um efeito inibitório na exsudação de

proteínas e na migração de leucócitos para o sítio inflamatório, bem como sua ação

na liberação de ácido araquidônico dos fosfolipídeos, presentes nas membranas

celulares, por ação da PLA2 (LANDOLFI; MOWER; STEINER, 1984). Além do

potencial anti-inflamatório, os flavonoides também apresentam atividade

gastroprotetora (CARVALHO, 2004).

6.2. Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das frações obtidas de Selaginella

convoluta.

Diversos modelos de nocicepção e inflamação são utilizados em animais de

laboratório para avaliar a possível atividade analgésica e anti-inflamatória de

extratos e compostos obtidos de fontes naturais (BASBAUM; JULIUS, 2006).

Embora mensurar o nível de dor em animais não seja fácil, quando submetidos a um

estímulo nociceptivo os animais são capazes de exibir respostas comportamentais



motoras e fisiológicas semelhantes às observadas em humanos. Assim, essas

respostas quando estudadas e comparadas na presença de fármacos

reconhecidamente analgésicos que interferem no processo fisiológico da dor,

permitem inferir que o animal está experimentando uma resposta álgica (LAPA et al.,

2003; PERAZA et al., 2007).

Para avaliação da atividade antinociceptiva, foram utilizados modelos

clássicos de nocicepção: contorções abdominais induzidas por ácido acético

(COLLIER et al, 1968) e nocicepção induzida por formalina (HUNSKAAR; HOLE,

1987), bem como por estímulo térmico como o teste da placa quente (KURAISHI et

al., 1983). Esses métodos foram selecionados com base em sua capacidade de

avaliar a resposta analgésica tanto em nível central como periférico.

O modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético é descrito

como um modelo de nocicepção simples, pouco específico, mas com boa

sensibilidade, permitindo avaliar a atividade de várias substâncias que atuam tanto

em nível central como periférico (IKEDA et al., 2001; PARVEEN et al., 2007). Nesse

modelo, a administração de um agente irritante, como o ácido acético, quando

injetado por via intraperitoneal induz nocicepção característica de espasmos,

redução e incoordenação da atividade motora que são traduzidos em contorções

(LAPA et al., 2003; CUNHA et al., 2003; MIRANDA et al., 2008). Estes movimentos

são considerados reflexos e evidenciam a dor inflamatória visceral (LE BARS;

GOZARIUM; CADDEN, 2001). Isso ocorre porque o ácido acético atua de forma

indireta, causando a liberação de mediadores endógenos que estimulam neurônios

nociceptivos sensíveis tantos a anti-inflamatórios não esteroidais como analgésicos

opioides (FISCHER et al., 2008). A sensibilização de nociceptores ocorre por

liberação e/ou produção de mediadores como histamina, serotonina, bradicinina,

citocinas, NO e, principalmente, prostaglandinas. Nesse modelo há também indução

da liberação de TNF-α, IL-1β e IL-8, por macrófagos e basófilos residentes na

cavidade peritoneal (VERRI et al., 2006). Além de ser influenciada por esses

mediadores inflamatórios, a nocicepção promovida pelo ácido acético também pode

ser mediada pela dissociação dos prótons presentes nesse agente, que estimulam

os canais TRPV1 e ASICs localizados nos neurônios aferentes primários (JULIUS;

BASBAUM, 2001).



Entretanto, as PGs são os principais mediadores inflamatórios causadores da

algesia, por tornar as fibras aferentes nociceptivas potencialmente sensível aos

diversos mediadores, resultando em contorções abdominais nos animais (SANTOS;

VEDANA; FREITAS, 1998). Dessa forma, esse modelo está associado à liberação

de prostanoides de maneia geral, ao aumento dos níveis de PGE2 e PGF2α nos

fluidos peritoneais, assim como, produtos da via das lipoxigenases (PARVEEN et al.,

2007), podendo relacionar a atividade nesse modelo a uma maior inibição da COX

periférica, como demonstrado por diversos autores (BALLOU et al., 2000).

Dessa forma, a estimulação dos nociceptores periféricos e neurônios

sensitivos, por esses mediadores, possibilitam a deflagração do potencial de ação,

caracterizando a sensação dolorosa (LE BARS; GOZARIUM; CADDEN, 2001).

Os resultados obtidos nesse teste mostraram que as frações Sc-Hex e Sc-

CHCl3 (100, 200 e 400 mg/kg, i.p), apresentam atividade antinociceptiva no teste de

contorção abdominal induzida por ácido acético em camundongos. Os resultados

apresentados nas Figuras 17 e 18 demonstram que o grupo controle apresentou

25,67 ± 3,31 contorções 10 minutos após a aplicação do ácido acético. Quando os

animais foram tratados com 100, 200 e 400 mg/kg de Sc-Hex, o número de

contorções abdominais foi reduzido de maneira estatisticamente significante (p <

0,05), cujos percentuais de inibição foram de 64,93, 77,91 e 99,35%,

respectivamente. De maneira similar os animais tratados com Sc-CHCl3 (100, 200 e

400 mg/kg) o grupo controle apresentou 20,33 ± 3,42, as porcentagens de inibição

foram 90,16, 90,16, e 95,92%, sugerindo que Sc-Hex e Sc-CHCl3 provavelmente

apresentem em sua constituição substâncias com propriedades antinociceptivas.

Após a primeira triagem para saber se as frações possuíam ou não atividade,

foi realizado o teste de nocicepção induzida por formalina para distinguir entre ação

periférica ou central. O teste de nocicepção induzida por formalina é um modelo

químico de nocicepção que fornece uma resposta mais específica quando

comparado ao modelo de contorção abdominal induzida por ácido acético

(SHIBATA, 1989). A formalina administrada pela via sub plantar produz dor intensa,

revelada por respostas motoras bem caracterizadas (vigorosas lambidas, mordidas e

batidas na pata), cuja quantificação permite que se avalie a intensidade da resposta

nociceptiva (DUBUISSON; DENNIS, 1997; TJØLSEN et al. 1992).



A vantagem desse método em relação aos outros é a possibilidade de avaliar

dois tipos diferentes de dor ao longo de um período prolongado de tempo e, assim,

permite avaliar agentes antinociceptivos com diferentes mecanismos de ação (LE

BARS; GOZARIUM; CADDEN, 2001; RANDOLPH; PETERS, 1997). Esse teste

possui uma característica marcante por possuir duas fases distintas. A primeira é

chamada de fase neurogênica, a qual se inicia imediatamente após a injeção de

formalina, dura cerca de 5 min e, provavelmente, resulta do efeito irritante direto

sobre os nociceptores, ativando as fibras aferentes primárias (principalmente C),

acarretando na liberação de neuropeptídeos como a substância P (SP) entre outros

em terminais centrais e mediadores periféricos como a bradicinina em terminações

periféricas (GONÇALVES et al., 2008, MURNO, 2009). Após a primeira fase, há um

período de 5 a 10 min no qual os animais apresentam um reduzido comportamento

sugestivo de nocicepção, devido à ativação da via inibitória descendente

(SWEITZER et al., 2004). A segunda fase, dita inflamatória, é iniciada

aproximadamente 15 min após a injeção de formalina e dura cerca de 15 min. Nessa

fase tardia, são formados os mediadores inflamatórios nos tecidos periféricos,

induzindo mudanças funcionais nos neurônios do corno dorsal que, ao longo do

tempo, promovem sensibilização da transmissão em nível espinal (OLIVEIRA;

SOUZA; ALMEIDA, 2008).

Nesse teste, Sc-Hex não foi ativo na fase neurogênica, enquanto Sc-CHCl3

teve resultado significativo apenas na dose de 100 mg/kg com percentual de inibição

de 35,46%. Por outro lado, tanto Sc-Hex, quanto Sc-CHCl3 reduziram o tempo de

lambida da pata na fase inflamatória do teste. Sc-Hex nas doses de 100, 200 e 400

mg/kg inibiram em 64,51, 67,79, e 73,90%, respectivamente, enquanto Sc-CHCl3

nas mesmas doses inibiu 82,06, 74,96 e 92,77% esse tempo. Assim, é possível

sugerir que o efeito das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 na fase inflamatória pode estar

relacionado à inibição de COX e/ou da produção de serotonina, de citocinas

inflamatórias ou outros mediadores inflamatórios.

Para proceder com a avaliação do efeito antinociceptivo, o teste da placa

quente foi realizado. O modelo experimental foi descrito inicialmente por Woolfe &

Macdonald (1944) como modelo específico para a detecção de substâncias

analgésicas de efeito central. Um dos principais motivos para essa busca é o

objetivo de se chegar a um fármaco com propriedades terapêuticas semelhantes às



da morfina, mas sem os efeitos adversos indesejáveis que limitam seu uso na

terapêutica, como a tolerância e a dependência (GRIS et al., 2010; WILLIAMS et al.,

2004). O ensaio de placa quente é usado para avaliação de dor em nível

supraespinal (MARCHIORO et al., 2005). A reposta produzida pelo estímulo nocivo

é rápida, sendo mediada pela ativação dos nociceptores, o impulso é conduzido ao

corno dorsal da medula espinal e posteriormente para os centros corticais, da

mesma forma agem os agentes opioides que exercem efeitos analgésicos via

receptores espinal e supra espinal (NEMIROVSKY et al., 2001). A resposta

observada neste ensaio resulta da ativação direta de nociceptores térmicos

cutâneos que transmitem informação nociceptiva aguda a regiões específicas no

SNC. A integração do estímulo ocorre devido à estimulação de fibras C não

mielinizadas de condução lenta, produzindo uma resposta nociceptiva organizada.

No ensaio de placa quente, o estímulo térmico induz dois tipos de comportamento

no camundongo: retirada ou lambida da pata. Ambos são resultantes da ativação

direta dos nociceptores pelo calor, que irão conduzir o estímulo doloroso ao corno

dorsal da medula espinal e posteriormente aos centros corticais (LE BARS;

GOZARIUM; CADDEN, 2001).

Nesse teste nenhuma das frações foi capaz de aumentar de forma

estatisticamente significativa o tempo de permanência do animal sobre a placa

quando comparado ao grupo controle, tratado apenas com veículo, ao contrário da

morfina (10 mg/kg, i.p), utilizado como fármaco padrão que causou um aumento

significativo nos tempos de 60, 90 e 120 minutos, como já era de esperar se tratando

de um analgésico opioide.

A fim de avaliar se o efeito analgésico das frações de S. convoluta provocam

sedação e/ou incoordenação motora, foi realizado o teste do rota-rod. Os testes de

coordenação motora são métodos utilizados na triagem de fármacos com possível

atividade miorrelante/neurotóxica, pois são testes adaptados para detectar o efeito

relaxante muscular e incoordenação motora de agentes com propriedades

farmacológicas (PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006). Nesse teste foi verificado que

o tratamento dos animais com as frações não alterou a coordenação motora,

eliminando-se assim, a possibilidade de existência de um efeito relaxante muscular

inesperado (BRITO, 2012).



Uma vez que as frações de Selaginella convoluta apresentaram atividade

significativa na fase inflamatória do modelo de nocicepção induzida por formalina foi

investigada também a atividade anti-inflamatória dos mesmos utilizando o modelo de

pleurisia induzida por carragenina. Esse é um modelo experimental de inflamação

aguda, bem caracterizado pela presença de exsudato rico em proteínas e infiltração

de leucócitos polimorfonucleares na cavidade pleural (MIKAMI; MIYASAKA, 1983). A

carragenina é uma mistura de polissacarídeos extraída de algas marinhas do gênero

Rhodophyceae que, quando injetada na cavidade pleura,l induz uma resposta

inflamatória caracterizada por intensa exsudação plasmática e migração de células,

particularmente de neutrófilos. Essa migração é decorrente da grande estimulação e

liberação de mediadores inflamatórios como as prostaglandinas, histamina,

bradicinina, neuropeptídeos e NO (DI ROSA, 1972; PAULINO et al., 2008).

Nesse experimento, os animais estimulados com carragenina apresentaram

um aumento no influxo de leucócitos para a cavidade inflamada de 6,53 ± 1,45 x 106

células e apenas o pré-tratamento na dose de 200 mg/kg com Sc-CHCl3 foi capaz de

reduzir esse infiltrado para 1,19 ± 0,25 x 106 células (78,56% de inibição). Assim,

procedeu-se a avaliação das frações sobre o extravasamento de plasma para a

cavidade estimulada através da quantificação de proteínas totais. Verificamos que,

de maneira semelhante ao recrutamento de células, apenas a dose de 200 mg/kg de

Sc-CHCl3 foi capaz de reduzir esse extravasamento de 1,22 ± 0,18 para 0,32 ± 0,06

μg/mL, quando comparado ao grupo controle. Entretanto, esse resultado não é

suficiente para afirmar uma atividade anti-inflamatória das frações obtidas de S.

convoluta.

Outro modelo utilizado foi o edema de pata induzido por carragenina. Éste é

um modelo experimental amplamente utilizado para triagem de substâncias ou

extratos vegetais de caráter anti-inflamatório e tem sido frequentemente utilizado

para avaliar o efeito antiedematogênico de produtos naturais, como plantas

medicinais, exibindo um elevado grau de reprodutibilidade (THOMAZZI et al., 2010).

A injeção subcutânea de carragenina na pata de camundongos provoca um aumento

agudo e progressivo do volume da pata injetada. Este edema é proporcional à

intensidade da resposta inflamatória, sendo um parâmetro útil na avaliação da

atividade anti-inflamatória de novos compostos (SILVA, 2013). O edema produzido a

partir da administração intraplantar da carragenina é um evento bifásico, que é

avaliado durante 1-5 horas. A primeira fase (1 ou 1,5 horas) é predominantemente



caracterizada pela formação de um edema não fagocítico, enquanto que a segunda

fase (2-5 horas) é caracterizada por um aumento da formação do edema, que

permanece por até 5 horas (KHAN et al., 2009). Entretanto, após o tratamento dos

animais com as frações não houve diferenças significativas da diminuição do edema

formado após o estímulo com carragenina. Portanto, nesse modelo nenhuma das

frações foram ativas. Esse resultado corrobora com os anteriores obtidos no modelo

de pleurisia, indicando a ausência de efeito anti-inflamatório das frações obtidas de

S. convoluta.

6.3. Toxicidade aguda

A fim de avaliar o perfil de segurança, a toxicidade aguda das frações Sc-Hex

e Sc-CHCl3 foi avaliada durante 14 dias após a administração em dose única nas

doses de 400 e 2000 mg/kg.

Embora seja amplo o uso de plantas medicinais para o tratamento de várias

doenças, pouco é conhecido sobre a toxicidade e segurança (JOTHY et al., 2011).

Assim, para determinar a segurança dos medicamentos e dos produtos vegetais

para uso humano, a avaliação toxicológica é realizada em vários modelos

experimentais para prever a toxicidade e fornecer diretrizes para a seleção de uma

dose segura (OLSON et al., 2000).

Durante a fase pré-clínica em modelos com animais de experimentação, a

toxicidade pode ser avaliada através da realização de estudos histopatológicos, para

determinação de lesões celulares e teciduais. Esse estudo é de fundamental

importância, pois caracteriza os efeitos deletérios decorrentes da administração em

concentração capaz de provocar efeitos tóxicos (EATON; KLAASSEN, 1996). Nos

estudos com finalidade farmacotoxicológica, o fígado e os rins são órgãos

constantemente avaliados, pois além de serem vitais, são órgãos envolvidos na

metabolização e excreção da maioria dos compostos experimentalmente

administrados, sendo assim, alvos de toxicidade induzida por xenobióticos. Os

modelos animais são necessários para identificar as possíveis lesões provocadas

pela ação direta ou de produtos gerados por biotransformação após administração

dessas substâncias (FOLGUEIRA; BRENTANI, 2004). Além disso, esses estudos

toxicológicos têm a finalidade de avaliar a ideia errônea de que produtos de origem



natural, como os fitoterápicos, são isentos de efeitos tóxicos ou adversos (LAPA,

1999; LAPA et al., 2001; CRAVEIRO et al., 2008; MARLIÉRE et al., 2008).

O presente estudo mostra que a administração em dose única das frações

Sc-Hex e Sc-CHCl3 administrado por via intraperitoneal provocou alguns sinais de

toxicidade, como contorções e aumento no grooming até 4 horas depois da

administração. Entretanto, ambas as frações não ocasionaram mortes durante os 14

dias de tratamento.

Uma vez que as alterações no peso corporal têm sido utilizadas como um

indicador de efeitos adversos de fármacos e produtos químicos (TOFOVIC,

JACKSON, 1999; RAZA et al., 2002, TEO et al., 2002), todos os dias foi feita a

análise do peso corporal, não havendo diferença estatística quando comparados

com o grupo controle. Entretanto, houve alterações significativas no consumo de

água e ração nos grupos tratados com Sc-CHCl3 quando comparados ao controle

principalmente nos primeiros dias após o tratamento.

O sistema hematopoiético é um dos sistemas mais sensíveis para avaliar a

toxicidade das drogas em seres humanos e animais (RAHMAN; SIDDIQUI; JAMIL,

2001). É possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos

(eritrócitos, hemoglobina, hematócritos, HCM, CHCM, VCM, eosinófilos, leucócitos,

linfócitos, e plaquetas) após a administração das frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 não

apresentaram variação significativa.

Em relação aos parâmetros bioquímicos, somente os animais tratados com a

maior dose de Sc-CHCl3 mostraram diferenças significativas nos níveis de AST/TGO

em relação ao grupo controle. A avaliação desses parâmetros é indispensável, uma

vez que resultados elevados de ALT/TGP e AST/TGO no sangue indicam alterações

nas funções hepáticas, sendo o primeiro sinal de lesões no fígado, a concentração

de ALT aumentada no soro (HILALY; ISRAILI; LYOUSS, 2004). As enzimas AST e

ALT podem indicar dano celular em curto ou longo prazo. ALT, uma enzima

citoplasmática, é mais prevalente na fase aguda e é liberada principalmente em

situações de lesão hepatocelular leve (LIMA et al., 1985; GELLA,1994; KEW, 2000).

Por outro lado, a AST, que está predominantemente localizada na mitocôndria

(KEW, 2000), prevalece na fase crônica tóxica e a sua liberação é provocada por um

dano grave, elevando a relação de AST/ ALT (LIMA et al., 1985).

A avaliação histopatológica evidenciou alterações morfológicas em maior grau

nos animais tratados com a maior dose experimental (2000 mg/kg). Essa dose



corresponde a 5 vezes a maior dose terapêutica do estudo de Sá et al. (2012a). Tal

fato aponta para um significado clínico que pode ser compreendido mais como

resultado de uma sobrecarga dos órgãos que como consequência de uma ação

tóxica significativa do extrato. Dessa forma, as frações de S. convoluta podem ser

utilizados em doses inferiores a 400 mg/kg devido ao menor grau e extensão das

lesões em fígado e rins. Ainda assim, ressalta-se a importância de estudos

toxicológicos de longa duração com as frações de S.convoluta para melhor

caracterizar o perfil de segurança dessa espécie.

Em relação ao peso dos órgãos, só foram evidenciadas alterações nos

animais tratados com Sc-CHCl3. Houve diminuição do estômago dos dois grupos

tratados quando comparados ao controle, esse dado pode ser explicado pelo

consumo de comida que foi menor para os mesmos grupos, entretanto, isso não

ocasionou alteração no ganho de peso dos animais. Outra alteração foi o aumento

do baço (esplenomegalia) dos animais tratados com a maior dose.

A esplenomegalia geralmente é secundária a uma doença sistêmica, mas

poder ser um dado isolado, sem causa conhecida. O baço tem quatro funções

principais: filtração dos elementos indesejados contidos no sangue, resposta

imunitária, produção de células linfo-hematopoéticas e reservatório sanguíneo. A

filtração do sangue é a mais importante função do órgão, eliminando substâncias

estranhas da corrente circulatória, incluindo células do sangue obsoletas e

lesionadas, materiais particulados como bactérias, restos celulares e

macromoléculas provenientes de erros inatos do organismo. Também participa da

resposta imune contra antígenos provenientes do sangue. É um importante

reservatório de células fagocíticas na polpa vermelha e da série linfoide na polpa

branca (SOARES; VASSALO; PAES, 2006). Esse dado ainda está sendo

investigado, pois não houve relação com os parâmetros hematológicos.

Adicionalmente, foi realizado o ensaio de viabilidade celular por MTT, que

consiste na verificação da atividade e integridade mitocondrial, interpretada como

uma medida de viabilidade celular (MOSMANN, 1983). Assim, esse ensaio avalia o

potencial citotóxico in vitro, onde os macrófagos peritoneais dos animais normais

têm contato direto com as frações. Nesse ensaio, foi verificado que as células

peritoneais são sensíveis ao potencial das frações testadas, sendo que a

sensibilidade varia com a concentração das amostras, demonstrando um caráter

mais tóxico para a fração Sc-CHCl3.



O mais importante axioma da toxicologia é “a dose faz o veneno”, ou seja,

qualquer substância química pode ser tóxica se a dose ou exposição se tornar

suficientemente altas, de modo que as alterações observadas foram atribuídas às

altas doses utilizadas (SIPES; DART, 1997; DINIZ, 2000).

Em resumo, nossos resultados mostram que as frações obtidas por partição

de Selaginella convoluta possuem atividade antinociceptiva e não afetam os eventos

da inflamação aguda, justificando, em parte, o uso dessa espécie pela medicina

popular no tratamento da dor.

7. CONCLUSÃO7. CONCLUSÃO


convoluta (Selaginellaceae) em camundogos. 99

7. CONCLUSÃO

É possível concluir que os resultados obtidos no presente trabalho

demonstram que as frações Sc-Hex e Sc-CHCl3 de Selaginella convoluta

apresentam atividade antinociceptiva periférica. Tais atividades podem ser mediadas

por inibição da COX periférica e/ou inibição direta de mediadores inflamatórios. É

possível atribuir essas atividades à presença de metabólitos secundários presentes

nesses extratos, que possivelmente estão atuando de forma sinérgica. Algumas

classes desses metabólitos já foram identificadas e algumas de suas atividades

biológicas já foram descritas, como visto anteriormente. Entretanto, nos modelos de

inflamação as frações obtidas de Selaginella convoluta não foram efetivas

significativamente. Adicionalmente, foi verificado que as frações, nas doses

testadas, não provocam incoordenação motora nos animais.

Em relação ao perfil de segurança de S. convoluta, dados obtidos na

investigação de toxicidade aguda, demonstraram que nos camundongos Swiss, as

doses máximas exigidas nos experimentos, não induziram mortes, mas

evidenciaram alterações, principalmente histopatológicas, provavelmente

decorrentes da administração de doses suficientemente altas para tal (5 vezes

maior). O resultado da viabilidade celular por MTT revelou um maior potencial

citotóxico da fração Sc-CHCl3. Ainda assim, ressalta-se a importância de estudos

toxicológicos de longa duração com as frações de S. convoluta para melhor

caracterizar o perfil de segurança das frações. Essa espécie pode ser considerada,

a priori, de baixa toxicidade, o que respalda a continuidade de estudos

farmacológicos, toxicológicos e fitoquímicos.

Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para a espécie

em estudo, destacando-se a contribuição do mesmo para o estudo farmacológico e

toxicológico de plantas do bioma Caatinga, em especial às espécies da família

Selaginellaceae. Além disso, os resultados apresentados nesse estudo corroboram,

em parte, a utilização da espécie na medicina popular, no entanto, outros estudos

são necessários para identificar os mecanismos de ação desses extratos.

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123

APÊNDICE

124

APÊNDICE A – Artigo 1

Artigo 1: PHYTOCHEMISTRY OF THE GENUS SELAGINELLA

(SELAGINELLACEAE)

Publicação: Journal of Medicinal Plants Research

Fator de impacto: 0,820

125

RESUMO

The Selaginellaceae family includes the single genus Selaginella, which is found

worldwide and comprises approximately 700-750 species. A number of species have

been traditionally used for medicinal purposes in the whole world, and the

phytochemistry of some has been investigated. For this review, the search was

carried out using Web of Sciences, Chemical Abstracts and the data bank

NAPRALERT (acronym for NAtural PRoducts ALERT), updated to October 2012.

The references found in the search were then studied in detail. This review refers to

32 species and 130 compounds isolated from plants of the genus Selaginella, which

are classified in appropriate chemical groups. The compounds isolated have been

identified belonging to the classes of alkaloids, benzenoids, carbohydrates,

chromones, coumarins, flavonoids, lignans, oxygen heterocycle, phenylpropanoids,

pigments, quinoids and steroids. Some aspects of bioactivity of the secondary

metabolites produced are discussed. For this purpose 75 references were consulted.

Keywords: Selaginellaceae, Selaginella, phytochemistry, review.

126

INTRODUCTION

The family Selaginellaceae Willk. is a distinctive family including the single genus

Selaginella. Selaginella is a nearly worldwide genus of about 700 species (Tryon and

Tryon, 1982) or 750 species (Judd et al., 1999), with about 270 of them in America.

This genus is widely distributed in America, Africa and Europe, east to the Bering

Straits, to Kamchatka, Japan, and to New Guinea and Australia also in the Pacific

east to the Hawaiian Islands, the Marquesas, Tahiti and Rapa. In America,

Selaginella occurs from northern Alaska east to Greenland, and south to Mendoza

and Buenos Aires in Argentina. It is certainly better represented in the Amazon basin,

for 31 species are known from that region (Tryon and Tryon, 1982).

Members of the Selaginellaceae occurs mostly terrestrial, herbaceous and

perennial plants under 2 cm tall. Roots dichotomously branching; rhizophores usually

produced from the stem, dichotomously branching. Stems erect or creeping. Leaves

about 0.5-1 cm long, spirally arranged and often 4-ranked on the secondary and

ultimate branches. Distribution of these plants is mainly tropical regions, with a few

species extending into arctic regions of both hemispheres, occupying a wide range of

habitats. The family has a nearly cosmopolitan distribution, but is not significant

economically (Judd et al., 1999). Plants of Selaginella vary greatly in size. Some

small species have stems about 3 cm long, while larger ones have stems 50 cm to

ca. 1 m long (Tryon and Tryon, 1982).

Several Selaginella species are used in traditional medicine in various

countries to treat a variety of diseases such as cancer, cardiovascular problems (Lin

et al., 1994), diabetes (Darias et al., 1989), gastritis (Han et al., 1984), hepatitis (Lin

and Kan, 1990), skin diseases (McFoy and Sama, 1983) and urinary tract infections

(Winkelman, 1986). Extracts from some Selaginella species have shown activity as

127

antinociceptive (Sá et al., 2012), anti-inflammatory (Han et al., 1972), antimutagenic

(Meng et al., 1990), antispasmodic (Itokawa et al., 1983), cytotoxic, imunnostimulant

and RNA reverse transcriptase inhibitory agents (Ono et al., 1989).

Previous studies involving some species of Selaginella revealed that this

genus is a rich source of steroids, biflavonoids, alkaloids, secolignans, neo-lignans

and caffeoyl derivatives. Other compounds, such as alkaloidal glycosides,

phenylpropanones and lignans, were also reported in some Selaginella species (Sá

et al., 2012). However, only a few studies on the bioactive components of species in

this genus have been performed. In a recent work, Setyawan (2011) studied the

diversity of natural products from Selaginella, especially biflavonoid and trehalose

compounds; and biological activity of Selaginella’s biflavonoid in modern medication.

The present study is a compilation of recent literature reports on

phytochemistry and pharmacological importance of plants of the Selaginellaceae

family.

MATERIALS AND METHODS

With the objective of contributing to these studies, a literature search on the natural

products from the genus Selaginella was carried out. The keywords used for the

literature search for this review were Selaginella, Selaginellaceae, natural products,

phytochemistry and medicinal plants. The search was carried out using Web of

Sciences, Chemical Abstracts, and the data bank of the University of Illinois in

Chicago NAPRALERT (acronym for NAtural PRoducts ALERT), updated to October

2012. The references found in the search were then studied in detail.

RESULTS AND DISCUSSION

128

Consultation of various literature sources resulted in the elaboration of a list of

natural products that have been grouped into appropriate chemical classes, as well

as a list of species where these compounds were isolated (Table 1). It should be

noted that most of the references cited are not first-hand observations, but

compilations copied from other sources. For details, the original references should be

consulted.

In this review is reported the study of 32 species of the genus Selaginella. We

founded 130 chemically defined natural products reported in the literature from

species of this genus. The compounds isolated have been identified belonging to the

classes of alkaloids (14), benzenoids (4), carbohydrates (3), chromones (3),

coumarins (3), flavonoids (60), lignans (13), oxygen heterocycle (1),

phenylpropanoids (8), pigments (9), quinoids (4) and steroids (8).

Phytochemistry of the genus Selaginella

The extensive use of species in this genus to treat a variety of diseases in traditional

medicine in several countries, coupled with the fact that only limited literature

information on the pharmacological activity of its constituents was available, had

suggested the phytochemical investigation of species of this family (Silva et al.,

1995).

Bioactivity of metabolites

In this section, the biological activities of the metabolites from species of the

Selaginellaceae are considered. The intention is to compare these properties

attributed to the medicinal plants to determine the degree of correspondence and,

possibly, provide leads for biological testing, on the one hand, and to individuate

129

species whose phytochemistry could be investigated further, on the other. Chemical

structures of some bioactive compounds are shown in Figure 1.

Chromones

Uncinoside A (1) and B (2) showed potent antiviral activities against respiratory

syncytial virus (RSV) with IC50 value of 6.9 and 1.3 μg/ml, moderate antiviral activities

against parainfluenza type 3 virus (PIV 3) with value of 13.8 and 20.8 μg/ml,

respectively (Ma et al., 2003).

Lignans

A previous investigation on S. doederleinii demonstrated that its cytotoxic activity

against L929 murine carcinoma cells was correlated to its lignan constituents (Lin et

al., 1994), although several biflavones also isolated from this species were found to

be inactive in this same assay. Thus, the folkloric use of many of these species to

treat cancer may not be entirely explained by the presence of lignans, since such

compounds have been isolated thus far from only the above-mentioned Selaginella

species.

Flavonoids

Selaginellaceae is a family rich in biflavonoids, these compounds shows potent

activity such as antimalarial, anti-inflammatory, antibacterial, antioxidant and antiviral.

The biflavonoids isolated from S. delicatula were tested against a panel of human

cancer cell lines according to established protocols. With the exception of

compounds 4’-methylether-robustaflavone (3) and 2”,3”-dihydro-4’,7-dimethylether-

robustaflavone (4), no inhibitory activity on tumor cells whose IC50 values higher than

130

100 μM. Both the compounds significantly inhibited Raji and Calu-1 cell growth in a

concentration-dependent manner. By contrast, the compounds had no supressory

activity on K562, HeLa, Vero and Wish tumor cell lines. These results show that S.

delicatula biflavonoids possess mainly the C-3’-C-6” interflavonoid linkage instead of

the C-3’-C-8” interflavonoid linkage, which is common for most of the biflavonoids in

the genus of Selaginella. S. delicatula, similar to other Selaginella species, contained

biflavonoid substances that exhibited the cytotoxic activities against cancer cells in

cultures (Sun et al., 1997; Silva et al., 1995).

Among the active and inactive biflavonoids obtained from Selaginella

willdenowii was the novel compound 2”,3”-dihydro-isocryptomerin (5), the cytotoxic

biflavones 4’,7”-di-O-methyl-amentoflavone (6) and isocryptomerin (7), bilobetin (8),

7”-O-methyl-robustaflavone (9), amentoflavone (10), robustaflavone (11). All of the

isolated biflavonoids were tested against a panel of human cancer cell lines

according to established protocols. Although the biflavonoid 2”,3”-dihydro-

isocryptomerin was inactive, the parent molecule, isocryptomerin (7), displayed

significant activity against the HT-1080 and Lu1 cell lines. Among the remaining

biflavone isolates, amentoflavone was found to be inactive, consistent with previous

assay data, and bilobetin displayed only marginal activity against the HT-1080 cell

line (Silva et al., 1995). However, the presence of two methoxyl groups, as in 4’,7”-di-

O-methylamentoflavone was observed to enhance the cytotoxicity of the compound,

as in case of the Col2 and U373 cell lines. Although there was a tendency to

increase the activity with increasing numbers of methoxyl groups in the molecule,

7,7”-di-O-methylamentoflavone (12) and 7,4’,7”,4’”-tetra-O-methyl-amentoflavone

(13) have been found by others to be inactive against L929 murine cells (Lin et al.,

1994). Only two compounds of the robustaflavone series were isolated and tested.

131

Consistent with earlier literature (Lin et al., 1989), robustaflavone showed a lack

significant cytotoxicity, but its monomethyl derivative, 7”-O-methylrobustaflavone was

found to be a potent cytotoxic agent against the HT-8080, Lu1 and U373 cell lines. Its

in vitro potency is comparable to that of calycopterone, a new type of biflavonoid

isolated by Wall et al. (1994).

Amentoflavone is a dimmer of apigenin, has several known pharmacological

activities which includes anti-inflammatory (Kim et al., 1994) and antioxidative effects

(Huguet et al., 1990). Amentoflavone also inhibits phospholipase C1 (Lee et al.,

1996) and cAMP-dependent phosphodiesterase (Saponara and Bosisio, 1998),

which could be associated with its diverse physiological activities. Amentoflavone

inhibited the production of nitric oxide in a concentration-dependent manner and also

blocked the lipopolysaccharide (LPS)-induced expression of inducible nitric oxide

synthase (iNOS). These findings suggest that the inhibition of LPS-induced NO

formation by amentoflavone is due to its inhibition of NF-κB by blocking I-κBα

degradation, which may be the mechanistic basis of the anti-inflammatory effects of

amentoflavone (Woo et al., 2005).

Bioassay-directed fractionation of an ethanolic extract of S. moellendorfii has

led to the isolation of a known biflavone, ginkgetin (14). A dose-dependent inhibition

was observed on the growth of OVCAR-3 (human ovarian adenocarcinoma) cells

with 50% inhibition occurring at 1.8 μg/ml. Nonbioactive fractions yielded four

additional known biflavones, 7,4’,7”,4’”-tetramethylether-amentoflavone, kayaflavone,

podocarpusflavone A and amentoflavone (Sun et al., 1997).

An ethyl acetate-soluble extract of S. tamariscina was found to exhibit

distinctive vasorelaxant activity. Further purifications of the extract as guided by in

vitro vasorelaxant assay afforded an active biflavonoid, amentoflavone.

132

Amentoflavone induced concentration-dependent relaxation of the phenylephrine-

precontracted aorta, which disappeared by removal of functional endothelium.

Amentoflavone-induced relaxations were also markedly attenuated by addition of

tetraethylammonium (TEA) or verapamil. However, the relaxant effect of

amentoflavone was not blocked by pretreatment with indomethacin, glibenclamide,

atropine, or propranolol. Incubation of endothelium-intact aortic rings with

amentoflavone increased the production of cGMP, but this effect was blocked by

endothelium-denudation or pretreatment with L-NAME or ODQ. These results

suggest that amentoflavone relaxes vascular smooth muscle via endothelium-

dependent nitric oxide-cGMP signaling, with possible involvement of non-specific K+

and Ca2+ channels (Kang et al., 2004).

CONCLUSION

The present work shows that species of the genus Selaginella are a rich source of

bioactive compounds. The flavonoids are the major compounds isolated from these

species. In particular, the chemical constituents belonging to class of biflavonoids,

such as amentoflavone, ginkgetin, isocryptomerin and robustaflavone presented

several biological activities in experimental models. More research is needed to

further explore the actions of these compounds. Selaginella research exhaustively

needs to be conducted to explore all natural products constituents and their

bioactivities (Setyavan, 2011).

133

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors wish to express their sincere thanks to the College of Pharmacy, The

University of Illinois at Chicago, Chicago, Illinois 60612-7231, U.S.A., for helping with

the computer-aided NAPRALERT search and Brazilian agencies CNPq and FACEPE

for financial support.

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Chemical Compounds Class Species References

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Hordenine-[6-O-(4-hydroxy-cinnamoyl)-β-D-glucosyl]-(1,3)-

α-L-rhamnoside Alkaloid S. doederleinii Chao et al., 1990

Hordenine-O-(6”-O-trans-cinnamoyl)-4’-O-β-D-

glucopyranosyl-α-L-rhamnopyranoside Alkaloid S. doederleinii Chao et al., 1987

Hordenine-O-α-L-rhamnopyranoside Alkaloid S. doederleinii Chao et al., 1987

N-methyltyramine-O-α-L-rhamnoside Alkaloid S. doederleinii Chao et al., 1987

Selaginellic acid Alkaloid S. moellendorfii Wang et al., 2009

5-Hydroxyselaginellic acid Alkaloid S. moellendorfii Wang et al., 2009

5-Hydroxy-N8,N8-dimethylpseudophrynaminol Alkaloid S. moellendorfii Wang et al., 2009

N-Selaginelloyl-L-phenylalanine Alkaloid S. moellendorfii Wang et al., 2009

N-(5-Hydroxyselaginelloyl)-L-phenylalanine Alkaloid S. moellendorfii Wang et al., 2009

Neoselaginellic acid Alkaloid S. moellendorfii Wang et al., 2009

N-(5-Hydroxyneoselaginelloyl)-L-phenylalanine Alkaloid S. moellendorfii Wang et al., 2009

Table 1 - continues

143

Table 1 - continued

Adenosine Alkaloid S. tamariscina Zheng et al., 2004b

Guanosine Alkaloid S. tamariscina Zheng et al., 2004b

Arbutin Benzenoid S. tamariscina Zheng et al., 2004

4-Hydroxy-benzoic acid Benzenoid S. pulvinata Zheng et al., 2001

Vanillic acid Benzenoid S. tamariscina Bi et al., 2004

Syringic acid Benzenoid S. tamariscina Bi et al., 2004

Selaginose Carbohydrate S. adunca Fischer and Kandler, 1975

S. asperula Fischer and Kandler, 1975

S. epirrhizos Fischer and Kandler, 1975

S. galeotti Fischer and Kandler, 1975

S. geniculata Fischer and Kandler, 1975

S. kraussiana Fischer and Kandler, 1975

S. marginata Fischer and Kandler, 1975

S. parkeri Fischer and Kandler, 1975

S. plumosa Fischer and Kandler, 1975

Table 1 - continues

144

Table 1 - continued

S. sanguinolenta Fischer and Kandler, 1975

S. stellata Fischer and Kandler, 1975

S. sulcata Fischer and Kandler, 1975

2-Carboxy-arabinitol Carbohydrate S. mertensii Moore et al., 1993

Mycose Carbohydrate S. pulvinata Zheng et al., 2001

8-Methyl-eugenitol Chromone S. uncinata Ma et al., 2002 ; Ma et al., 2003

Uncinoside A Chromone S. uncinata Ma et al., 2002 ; Ma et al., 2003

Uncinoside B Chromone S. uncinata Ma et al., 2002 ; Ma et al., 2003

Isopimpinellin Coumarin S. doederleinii Chen et al., 1995

S. moellendorfii Che and Yu, 1986

Umbelliferone Coumarin S. tamariscina Bi et al., 2004

3-(4-Hydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy coumarin Coumarin S. tamariscina Liu et al., 2010

Amentoflavone Flavonoid S. braunii Ma et al., 2001

S. davidii Ma et al., 2001

S. delicatula Lin et al., 2000a

Table 1 - continues

145

Table 1 - continued

S. denticulata Lopez-Saez et al., 1994a

S. kraussiana Qasim et al., 1985

S. moellendorfii Sun et al., 1997

S. pulvinata Ma et al., 2001

S. rupestris Chanravarthy et al., 1981

S. sanguinolenta Huneck and Khaidav, 1985

S. selaginoides Lopez-Saez et al., 1994b

S. sinensis Ma et al., 2001

S. stauntoniana Ma et al., 2001

S. tamariscina Lee et al., 1992

S. uncinata Ma et al., 2003

S. willdenowii Silva et al., 1995

2,3-Dihydroamentoflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

2”,3”-Dihydroamentoflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Table 1 - continues

146

Table 1 - continued

Tetrahydro-amentoflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Amentoflavone-7,4,7,4-tetramethylether Flavonoid S. moellendorfii Cao et al., 2010a

4’,7”-Di-O-methyl-amentoflavone Flavonoid S. sinensis Ma et al., 2001


7,7”-Di-O-methyl-amentoflavone Flavonoid S. doederleinii Lin et al., 1994

4’,4”’,7,7”-Tetra-O-methyl-amentoflavone Flavonoid S. doederleinii Lin et al., 1994

S. moellendorfiii Sun et al., 1995

7,4’,7”,4”-tetramethylether-amentoflavone Flavonoid S. moellendorfii Sun et al., 1997

Apigenin Flavonoid S. doederleinii Chen et al., 1995

Apigenin-7-O-β-neohesperidoside Flavonoid S. moellendorfii Feng et al., 2011

Apigenin-8-C- β-D-glucopyranoside Flavonoid S. moellendorfii Feng et al., 2011

6,8-Di-C-β-D-glucopyranosyl-apigenin Flavonoid S. moellendorfii Zhu et al., 2008

6-C-β-D-Glucopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranosyl-apigenin Flavonoid S. moellendorfii Zhu et al., 2008

6-C-β-D-Xylopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranosyl-apigenin Flavonoid S. moellendorfii Zhu et al., 2008

6-(2-Hydroxy-5-acetylphenyl)-apigenin Flavonoid S. tamariscina Liu et al., 2009; Liu et al., 2010

Table 1 - continues

147

Table 1 - continued

6-(5-Carboxyl-2-methoxyphenyl)-apigenin Flavonoid S. uncinata Zheng et al., 2008

2’,8”-Biapigenin Flavonoid S. tamariscina Lee et al., 2008

2”,3”-Dihydro-3’,3”’-biapigenin Flavonoid S. labordei Xu et al., 2009

Bilobetin Flavonoid S. willdenowii Silva et al., 1995

Chamaecyparin Flavonoid S. difusa Meurer-Grimes et al., 1999

S. jungermannioides Meurer-Grimes et al., 1999

S. stellata Meurer-Grimes et al., 1999

Chrysoeriol Flavonoid S. moellendorfii Cao et al., 2010a

Cryptomerin B Flavonoid S. denticulata Lopez-Saez et al., 1994a

S. tamariscina Shin and Kim, 1991

Delicaflavone Flavonoid S. delicatula Lin and Chou, 2000b

Genistin Flavonoid S. sinensis Dai et al., 2001

Ginkgetin Flavonoid S. moellendorfii Sun et al., 1997

S. sinensis Dai et al., 2001

Heveaflavone Flavonoid S. doederleinii Lin et al., 1994

Table 1 - continues

148

Table 1 - continued

S. lepidophylla Qasim et al., 1985

Hinokiflavone Flavonoid S. denticulata Lopez-Saez et al., 1994a

Lopez-Saez et al., 1995

S. kraussiana Qasim et al., 1985


S. uncinata Ma et al., 2003

2,3-Dihydrohinokiflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

2”,3”-Dihydrohinokiflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Tetrahydro-hinokiflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Tetra-O-methyl-hinokiflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Isocryptomerin Flavonoid S. denticulata Lopez-Saez et al., 1994a

S. tamariscina Shin and Kim, 1991


2,3-Dihydro-isocryptomerin Flavonoid S. delicatula Lin and Chou, 2000b

2”,3”-Dihydro-isocryptomerin Flavonoid S. willdenowii Silva et al., 1995

Table 1 - continues

149

Table 1 - continued

Kayaflavone Flavonoid S. moellendorfii Sun et al., 1997

Sun et al., 1995

Lanaroflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Podocarpusflavone A Flavonoid S. moellendorfii Sun et al., 1995

Sun et al., 1997

Robustaflavone Flavonoid S. delicatula Lin et al., 2000

S. denticulata Lopez-Saez et al., 1994a

S. lepidophylla Qasim et al., 1985


S. sinensis Ma et al., 2001


2,3-Dihydro-robustaflavone Flavonoid S. lepidophylla Aguilar et al., 2008

2,3-Dihydro-5-methylether-robustaflavone Flavonoid S. lepidophylla Aguilar et al., 2008

2”,3”-Dihydro-4’,7,7”-trimethylether-robustaflavone Flavonoid S. delicatula Lin et al., 2000

Table 1 - continues

150

Table 1 - continued

2,3-Dihydro-4’,7,7”-trimethylether-robustaflavone Flavonoid S. delicatula Lin and Chou, 2000b

2”,3”-Dihydro-4’,7,-dimethylether-robustaflavone Flavonoid S. delicatula Lin et al., 2000

4’,7-Dimethylether-robustaflavone Flavonoid S. delicatula Lin et al., 2000

4’-Methylether-robustaflavone Flavonoid S. delicatula Lin et al., 2000

S. doederleinii Lee et al., 2008

7’’-O-Methyl-robustaflavone Flavonoid S. sinensis Ma et al., 2001


2,2'',3,3''-Tetrahydro-4',7,7''-trimethylether-robustaflavone Flavonoid S. doederleinii Lee et al., 2008

4,7,7''-Trimethylether-robustaflavone Flavonoid S. doederleinii Lee et al., 2008

Sciadopitysin Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Sequoiaflavone Flavonoid S. bryopteris Kunert et al., 2008

Sotetsuflavone Flavonoid S. denticulata Lopez-Saez et al., 1994a

Sumaflavone Flavonoid S. tamariscina Yang et al., 2006

2,3-Dihydro-5,5”,7,7”,4’-pentahydroxy-6,6”-dimethyl-[3’-O-

4”’]-biflavone Flavonoid S. labordei Xu et al., 2009

Table 1 - continues

151

Table 1 - continued

2”,3”-Dihydroochnaflavone Flavonoid S. labordei Xu et al., 2009

5-Carboxymethyl-4’-hydroxyflavone-7-O-β-D-

glucopyranoside Flavonoid S. moellendorfii Zhu et al., 2008

Taiwaniaflavone Flavonoid S. tamariscina Lee et al., 2008

5-Carboxymethyl-4′,7-dihydroxyflavone Flavonoid S. moellendorfii Cao et al., 2010a

[7-Hydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-4-oxo-4H-chromen-5-

yl]-acetic acid ethyl ester Flavonoid S. moellendorfii Cao et al., 2010a

[7-Hydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-4-oxo-4H-chromen-5-

yl]-acetic acid butyl ester Flavonoid S. moellendorfii Cao et al., 2010a

5-Acethyl-dihydro-2-(3’,5’-dimethoxy-4’-hydroxy-phenyl)-7-

methoxybenzofuran Lignan S. tamariscina Zheng et al., 2004b

(-)-Lirioresinol A Lignan S. doederleinii Lin et al., 1994

(-)-Lirioresinol B Lignan S. doederleinii Lin et al., 1994

(+)-Matairesinol Lignan S. doederleinii Lin et al., 1994

Moellenoside A Lignan S. moellendorfii Zheng et al., 2008

Table 1 - continues

152

Table 1 - continued

Moellenoside B Lignan S. moellendorfii Feng et al., 2011

(-)-Nortracheloside Lignan S. doederleinii Lin et al., 1994

Pinoresinol diglucoside Lignan S. sinensis Dai et al., 2001

Sinesiol A Lignan S. sinensis Wang et al., 2007

Syringaresinol Lignan S. tamariscina Bi et al., 2004

Tamariscinoside B Lignan S. tamariscina Zheng et al., 2004b

Tamariscinoside C Lignan S. tamariscina Zheng et al., 2004b

(+)-Wilkstromol Lignan S. doederleinii Lin et al., 1994

2,4-Dihydroxy-3-methylenehydroxy-5-methoxy-

tetrahydrofuran

Oxygen

heterocycle S. lepidophylla Perez et al., 1994

Caffeic acid Phenylpropanoid S. tamariscina Bi et al., 2004

Ferulic acid Phenylpropanoid S. tamariscina Bi et al., 2004

Isochlorogenic acid A Phenylpropanoid S. delicatula Lin et al., 2000

Isochlorogenic acid B Phenylpropanoid S. delicatula Lin et al., 2000

Isochlorogenic acid C Phenylpropanoid S. delicatula Lin et al., 2000

Table 1 - continues

153

Table 1 - continued

3-Hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-propan-1-one Phenylpropanoid S. doederleinii Lin et al., 1994

3-Hydroxy-1-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-propan-1-one Phenylpropanoid S. doederleinii Lin et al., 1994

Tamariscine ester A Phenylpropanoid S. tamariscina Bi et al., 2004

Selaginellin Pigments S. sinensis Zhang et al., 2007

Selaginellin A Pigments S. tamariscina Cheng et al., 2008

Selaginellin B Pigments S. tamariscina Cheng et al., 2008

Selaginellin C Pigments S. pulvinata Tan et al., 2009

Selaginellin D Pigments S. pulvinata Cao et al., 2010b

Selaginellin E Pigments S. pulvinata Cao et al., 2010b

Selaginellin F Pigments S. pulvinata Cao et al., 2010b

Selaginellin G Pigments S. pulvinata Cao et al., 2010c

Selaginellin H Pigments S. pulvinata Cao et al., 2010c

Chrysophanic acid Quinoid S. stauntoniana Liu et al., 2004

Emodin Quinoid S. stauntoniana Liu et al., 2004

1-Methoxy-3-methylanthraquinone Quinoid S. tamariscina Liu et al., 2010

Table 1 - continues

154

Table 1 - continued

Physcion Quinoid S. stauntoniana Liu et al., 2004

Cholesterol Steroid S. delicatula

S. doederleinii Chiu et al., 1988

22-Dehydrocampesterol Steroid S. delicatula


3β-16α-Dihydroxy-(5α)-cholestan-21-oic acid Steroid S. pulvinata Zheng et al., 2007

24α-Ethyl-cholest-5-en-3β-ol Steroid S. delicatula


24α-Methyl-cholest-5-en-3β-ol Steroid S. delicatula


24β-Methyl-cholest-5-en-3β-ol Steroid S. delicatula


24α-Ethyl-cholesta-5,22-dien-3β-ol Steroid S. delicatula


β-Sitosterol Steroid S. doederleinii Chen et al., 1995

Table 1 - continues

155

Table 1 - continued

S. moellendorfii Che and Yu, 1986

S. pulvinata Zheng et al., 2001

156

O

O

CH3

OR1

H3C

R2O

(1) R1= H; R2= Glc

(2) R1= Ac; R2=Glc

O

OOR1

R2O

OR3

O

OOR4

R5O

OR6

2

35

7

4'

5''

7''

4'''

2''

3''

(3) R1= H; R2= H; R3= CH3; R4= H; R5= H; R6= H

(9) R1= H; R2= H; R3= H; R4= H; R5= CH3; R6= H

(11) R1= H; R2= H; R3= H; R4= H; R5= H; R6= H

O

OOH

H3CO

OCH3

O

OOH

HO

OH

2

35

7

4'

5''

7''

4'''

2''

3''

(4)

O

OOH

HO

O

O

OOH

H3CO

OH

2

345

7

1'

4'

2''

3''5''

7'' 1'''

4'''

(5)

157

4'''

1'''7''

5''3''

2''

4'

1'

7

5 43

2O

OOR1

R2O

OR3

O

OOR4

R5O

OR6

(6) R1= H; R2= H; R3= CH3; R4= H; R5= CH3; R6= H

(10) R1= H; R2= H; R3= H; R4= H; R5= H; R6= H

(12) R1= H; R2= CH3; R3= H; R4= H; R5= CH3; R6= H

(13) R1= H; R2= CH3; R3= CH3; R4= H; R5= CH3; R6= CH3

(14) R1= H; R2= CH3; R3= CH3; R4= H; R5= H; R6= H

4'''

1'''7''

5''3''

2''

4'

1'

7

5 43

2O

OOH

HO

O

O

OOH

H3CO

OH

(7)

O

OOH

HO

OCH3

O

O

HO

OH2

345

7

1'

4'

2''

3''5''

7''1'''

4'''

(8)

Figure 1. Chemical structures of some bioactive compounds in Selaginella.

158

APÊNDICE A – Artigo 2

Artigo 2:

SELAGINELLA CONVOLUTA (SELAGINELLACEAE) ATTENUATES THE

NOCICEPTIVE BEHAVIOR BUT NOT THE ACUTE INFLAMMATORY

EVENTS IN MICE

Submissão: BMC Complementary & Alternative Medicine

Fator de impacto: 2.08

159

Selaginella convoluta (Selaginellaceae) attenuates the nociceptive behavior but

not the acute inflammatory events in mice

Larissa Alves Ribeiro de Oliveira Macêdo1, Alessandra Gomes Marques Pacheco2,

Sarah Raquel Gomes de Lima-Saraiva3, Juliane Cabral Silva1, Raimundo Gonçalves

de Oliveira-Júnior1, Grasielly Rocha Souza1, Jamylle Nunes Souza Ferro4, Emiliano

Barreto4, Visêldo Ribeiro de Oliveira5, Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida1,*

1Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME), Universidade

Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.

2Laboratório de Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana, 44.036-

900, Feira de Santana, Bahia, Brazil.

3Laboratório de Produtos Naturais, Universidade Federal de Pernambuco, 50.740-

521, Recife, Pernambuco, Brazil.

160

4Laboratório de Biologia Celular, Universidade Federal de Alagoas, 57.072-970,

Maceió, Alagoas, Brazil.

5Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), 56.302-970, Petrolina,

Pernambuco, Brazil.

*Correspondence: [email protected]

1Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do

Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.

Tel/Fax + 55-87-21016863

Full list of author information is available at the end of the article.

Abstract

Background: Selaginella convoluta is a medicinal plant popularly known in

Northeastern Brazil as “jericó”, and is used in folk medicine as analgesic and anti-

inflammatory. This study aimed to investigate the antinociceptive and anti-

inflammatory activities of the fractions obtained by partition of crude ethanol extract

from S. convoluta in mice using experimental models of pain and inflammation.

Methods: The hexane (Sc-Hex) and chloroform (Sc-CHCl3) fractions from S.

convoluta were used at doses of 100, 200 and 400 mg/kg. Antinociceptive activity

was evaluated by writhing, hot-plate and formalin tests. Anti-inflammatory activity was

evaluated using carrageenan-induced pleurisy in mice. Additionally, the rota-rod test

was used to evaluate motor coordination.

161

Results: Inhibition of writhing was observed for fractions tested. The Sc-Hex at all

doses tested was effective in reducing the nociceptive behavior produced by formalin

only in the second phase. However, the Sc-CHCl3 decreased the paw licking time in

the first and second phases of this test. In the hot plate no significant effect was

observed for any fraction. Using the rota-rod test, mice treated did not demonstrate

any significant motor performance changes, while diazepam significantly increased

the number of falls. In carrageenan-induced pleurisy, both fractions did were not able

to reduced cell migration to the pleural cavity.

Conclusion: These results reveal the antinociceptive properties of S. convoluta,

which support, in part, its traditional use, since the fractions did not presented

significant activity in the inflammatory response profile. We further verify that this

antinociceptive effect showed linked with activation of nociceptive peripheral

pathway.

Keywords: Selaginella convoluta; Selaginellaceae, pain, inflammation, nociception

Background

Pain and inflammation is a body defense reaction, in order to eliminate or limit the

spread of injurious organisms, toxic chemical substances, and physical injuries from

living mammalian tissues [1, 2]. Narcotic drugs, non-steroidal anti-inflammatory drugs

(NSAIDs), steroidal and immunosuppressant drugs have been usually used in the

relief of pain and inflammatory diseases by the people of the world for a long time [3].

Furthermore, these drugs may have various and severe adverse side effects, such

as gastric lesions caused by NSAIDs, tolerance and dependence induced by opiates,

use of these drugs as anti-inflammatory and analgesic agents have not been

successful in all cases [4-6].

162

Medicinal plants have been used since ancient times as medicines for the

treatment of diseases and still play a key role in world health [7]. According to

Kumara (2001), plant based drugs in traditional medicine are being paid much

attention because of their minimal side effects, cheapness and also the fact that 80%

of the world population still rely on them [8]. The chemical diversity of plants has

made them one of the main sources for the isolation of bioactive organic compounds

[7]. Brazil is privileged because it ranks first among the richest countries in

biodiversity in the world, accounting for 22% of the higher plant species on the planet

[9].

The family Selaginellaceae Willk. is a distinctive family including the single

genus Selaginella which is a nearly worldwide genus of about 700 species [10] to

750 species [11], with about 270 of them in America. Members of the

Selaginellaceae occurs mostly terrestrial, herbaceous and perennial plants. Vary

greatly in size, some small species have stems about 3 cm long, while larger ones

have stems 50 cm to aproximatelly 1 m long, under 2 cm tall [11].

Pharmacological and phytochemical studies on genus Selaginella led to

identification of numerous bioactive molecules, including alkaloids, phenols

(flavonoids, tannins, saponins),

and terpenoids (triterpenes and steroids) [12, 13], with broad biological activities,

including antivirus, antifungal, antibacterial, cytotoxic, anticancer, antioxidant,

antiplasmodial, leishmanicidal and anti-inflammatory properties [14-25].

Selaginella convoluta is a medicinal plant found in Northeastern Brazil

commonly know as “jericó”, “mão-de-sapo” and “mão-fechada” and it is used in folk

medicine as antidepressant [26, 27], aphrodisiac, diuretic, against amenorrhea [28],

163

cough, bleeding, increases female fertility [29] as well as analgesic and anti-

inflammatory [30].

In our continuing search of the pharmacological properties of S. convoluta, in

the present paper we demonstrate the antinociceptive and anti-inflammatory effects

of the fractions obtained by partition of the crude ethanol extract of S. convoluta in

experimental models in mice. Previous study carried out by our research group

demonstrated the antinociceptive effect of ethanolic extract in mice [31].

Methods

Plant material

Selaginella convoluta was collected in the city of Petrolina (Coordinates: S 09º03’54”;

W 40º19’12”) State of Pernambuco, Brazil, in March of 2012. A sample was identified

by Viseldo Ribeiro de Oliveira, a researcher from Embrapa Semiárido. A voucher

specimen (19203) was deposited at the Herbarium Vale do São Francisco (HVASF)

of the Federal University of San Francisco Valley (UNIVASF).

Preparation of plant extract

The dried and pulverized plant (1935 g) was macerated with ethanol 95% at room

temperature for 72 h. The extractive solution was filtered and concentrated under

reduced pressure in a rotatory evaporator at 50 °C, producing 146.55 g of crude

ethanol extract (Sc-EEB). The Sc-EEB was suspended in a mixture of MeOH: H2O

(3:7) and extracted successively with hexane and chloroform in crescent order of

polarity to obtain the fractions Sc-Hex (21.26 g) and Sc-CHCl3 (15.14 g), respectively.

164

Animals

Male adult albino Swiss mice (25-35 g) were used in this study. The animals were

randomly housed in appropriate cages at 22 2 oC on a 12 h light/ dark cycle with

free access to food and water. When necessary, animals were deprived of food 12 h

prior to the experiments. They were used in groups of six animals each, according to

the experiments realized. Experiments were performed during the light phase of the

cycle. All tests were carried out by the same visual observer. Experimental protocols

and procedures were approved by the Universidade Federal do Vale do São

Francisco Animal Care and Use Committee by number 0003/17072012.

Pharmacological tests

Acetic acid-induced writhing test

This test was done using the method described by Koster et al. [32]. Mice (25-35 g)

were divided into six groups of six mice each. Acetic acid (0.9% v/v) was

administered i.p. in a volume of 0.1 ml/10 g. Vehicle (saline), morphine (MOR, 10

mg/kg), Indomethacin (INDO, 20 mg/kg) and fractions (100, 200 and 400 mg/kg),

were administered i.p. 30 min before acetic acid injection. The number of abdominal

constrictions produced in each group for the succeeding 10 min was counted and

compared to the response in the control group. Antinociceptive activity was

calculated as the percentage inhibition of abdominal constriction.

Formalin test

The method used was similar to the described by Hunskaar and Hole [33] and

Vianna et al. [34]. 20 µl of 2.5% formalin (in 0.9% saline, subplantar) was injected

subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds) spent in licking

165

and biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain response.

Responses were measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic)

and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory). Vehicle (saline),

morphine (MOR, 10 mg/kg), acetylsalicylic acid (ASA, 150 mg/kg) and fractions (100,

200 and 400 mg/kg), were administered i.p. 60 min before formalin injection. Mice

were observed in the chambers with a mirror mounted on three sides to allow view of

the paws. Antinociceptive activity was calculated as the percentage inhibition of

licking time.

Hot plate test

Mice were divided into five groups of six mice each. Mice were pre-selected on the

hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the parameters of observation.

Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or jumping) greater

than 20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline, 0.1

ml/10 g), morphine (MOR, 10 mg/kg) and fractions (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p.

Latency time (in seconds) for each mice was determined on the hot plate during the

maximum period of 20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min after the

administration of the vehicle, extract and morphine [35].

Carrageenan-induced pleurisy

The animals (n=6 in each group) were pre-treated by intraperitoneal route (i.p.) with

fractions (100, 200 and 400 mg/kg) 30 min prior to the induction of pleurisy. Pleurisy

was induced by the intrapleural injection (i.t.) of 100 μl of a 1% (v/v) carrageenan

solution. A specially adapted 13×5 syringe was introduced into the right side of the

thoracic cavity of mice to inject the carrageenan solution, and an equal volume of

sterile saline was injected into the controls. At 4 h after the i.t. injection, the animals

166

were sacrificed in a CO2 gas chamber and the thoracic cavity was opened and

washed with 1 ml PBS containing EDTA (10 mM). These pleural washes were

recovered and their volume measured. Pleural wash samples were diluted in Turk

fluid (2% acetic acid) for total leukocyte counts using Neubauer chambers.

Indomethacin was used as reference drug. Thus, parallel groups of animals were

pre-treated (30 min before pleurisy induction) with indomethacin (10 mg/kg, i.p.) and

4 h later the same inflammatory parameters were evaluated [36]

Measurement of total protein content

The fluids recovered from the pleural cavity of the animals treated with the fractions

Sc-Hex and Sc-CHCl3 at 100, 200 and 400 mg/kg were centrifuged for 10 min at

1,500 × g, and the total protein content was quantified in the supernatant, at 640 nm,

using the Folin-Lowry technique [37].

Motor coordination test (rota-rod test)

A rota-rod treadmill device (Insight, Brazil) was used for the evaluation of motor

coordination [38]. Initially, 24 h before the test, mice capable of remaining on the

rota-rod apparatus longer than 180 s (7 rpm) were selected. Thirty minutes after the

administration of fractions (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.), vehicle (saline, 0.1 ml/10

g); control group) or diazepam (2.5 mg/kg, i.p.), each animal was tested on the rota-

rod apparatus at 30 min, 1 and 2 h post-treatment, and the time(s) the mice were

able to remain on top of the bar was (were) recorded for up to 180 s.

Statistical analysis

The data were expressed as mean ± S.E.M. and the statistical significance was

determined using an analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test.

167

Values were considered significantly different at p < 0.05. All analysis was performed

using by GraphPad Prism 4.0 program.

Results

Acetic acid-induced writhing test

The intraperitoneal administration of Sc-Hex (100, 200 and 400 mg/kg) showed

dose-dependent antinociceptive effect and decreased significantly (p < 0.05) the

number of writhing movements induced by the i.p. administration of the acetic acid

compared with the control group. The percentages of inhibition were 64.93, 77.91

and 99.33 %, respectively (Figure 1). The Sc-CHCl3 produced inhibition of the

abdominal writhing response by 90.16, 90.16 and 95.92% (Figure 2). Indomethacin

caused a 90.92 and 88.53% reduction in writhing movements for animals treated

with Sc-Hex and Sc-CHCl3, respectively. Morphine abolished all of the nociceptive

responses in all treated groups.

INSERT FIGURE 1

INSERT FIGURE 2

Formalin test

The results of the formalin test are shown in Figures 3 and 4. Sc-CHCl3 showed a

significant antinociceptive effect to inhibit the licking time in both phases (neurogenic

and inflammatory pain) of the test, but the result was most significative in the second

168

phase. Sc-CHCl3 (100 mg/kg, i.p.) decreased by 35.46%, the paw licking time in the

first phase, as well as 82.06, 74.96 and 92.77%, respectively, in the second phase of

the formalin test. However, the Sc-Hex decreased the paw licking time only the

second phase by 64.51, 67.80 and 73.90%. The reference drug acetylsalicylic acid

was effective only in the second phase for both fractions (87.63% - Sc-Hex and

88.89% - Sc-CHCl3). Morphine decreased the licking time during the two phases.

INSERT FIGURE 3

INSERT FIGURE 4

Hot plate test

In this test, no significant effect was observed for any fraction. The effect of morphine

(10 mg/kg) was significantly higher. Figures 5 and 6 show these results.

INSERT FIGURE 5

INSERT FIGURE 6

Carrageenan-induced pleurisy

Treatment with the Sc-CHCl3 only at dose of 200 mg/kg (i.p), caused a significant

decrease the volume of the exudates to 1.19 ± 0.25 x 106 cells ml/cavity compared

with the control group (6.53 ± 1.40 x 106 cells ml/cavity) and in total protein

extravasations when it was administrated 30 min before carrageenan (Fig. 7 and 8).

As expected, the reference drug, indomethacin caused a significant inhibition of

volume of the exudates to 0.66 ± 0.14 ml/cavity.

169

INSERT FIGURE 7

INSERT FIGURE 8

Motor coordination test (rota-rod test)

In this test, the fractions did not impair motor coordination at 0.5, 1 and 2 h post

administration. Diazepam (2.5 mg/kg) caused a significant decrease in time that the

animals remained on the rota-rod apparatus, compared to the control group (Fig. 9

and 10).

INSERT FIGURE 9

INSERT FIGURE 10

Discussion

The present study reported for the first time the evaluation of antinociceptive and

anti-inflammatory effects of S. convoluta it different extractive fractions employing

various experimental models. Although the plant is widely used in the folk medicine in

the semi-arid region of Brazil, no report about this activity is recorded in the literature.

Furthermore, current treatments used to fight pain and inflammation are usually

insufficient for having severe side effects and limited effectiveness [39]. Therefore,

the continuous search for new molecules that are more effective with reduced side

adverse is needed.

The antinociceptive activities of fractions, all given intraperitoneally at the

doses of 100, 200 and 400 mg/kg, were evaluated using chemical (acetic acid and

formalin) and thermal (hot plate test) stimuli. The writhing test has long been used as

a screening tool for assessing the analgesic properties of new substances [40].

Intraperitoneal administration of acetic acid induce abdominal writhing and involves

170

the increase in cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LOX), prostaglandins (PGs),

histamine, serotonin, bradykinin, substance P, IL-1β, IL-8, TNF-α in the peritoneal

cavity [41]. These agents provoke a very stereotyped behavior in the mice which is

characterized by abdominal contractions, movements of the body as a whole and

twisting of dorso-abdominal muscles. However, it is a non-specific method for

evaluation of pain [42].

Sc-Hex and Sc-CHCl3 significantly reduced the acetic acid-induced writhing in

mice. The results support the hypothesis that the extracts have antinociceptive effect

on the abdominal constrictions. Additionally, different flavonoids have been found to

be antinociceptive and anti-inflammatory agents due to their ability to inhibit the

arachidonic acid metabolism [43-45]. The presence of flavonoids in the fractions of S.

convoluta (data of preliminary phytochemical screening not shown) may be

responsible for the antinociceptive effect.

In order to extend the studies on the antinociceptive and anti-inflammatory

effects, we used the model of nociception induced by formalin. The formalin-induced

paw linking test is a model comprising two distinct phases. The first phase

(neurogenic pain) occurs about 3 min after the injection, and then after a quiescent

period, a second phase (inflammatory pain) between 20 and 30 minutes [46]. The

first phase results essentially from chemical stimulation of nociceptive afferent fibers,

particularly C-fibers, which can be suppressed by opiates like morphine [47].

However, the involvement of substance P and bradykinin has also been reported.

The second phase (inflammatory pain) is induced due to action of inflammatory

mediators such as prostaglandins, serotonin and bradykinin in peripheral tissues and

functional changes in the dorsal horn of the spinal cord [48, 49]. The Sc-Hex

demonstrated that the number of paw licking was significantly reduced only in second

171

phase (p < 0.05) in a dose-dependent manner. However, the Sc-CHCl3 showed

significant effect in both neurogenic and inflammatory pain phases (p < 0.05).

In this experiment, Sc-CHCl3 decreased the licking time in both phases, but

the effect was more significant in the second phase. The inhibition in both phases is

characteristic of drugs that act centrally, and indicates a possible interaction with

opioid receptors. Opioid analgesics seem to be antinociceptive for both phases,

although the first is more sensitive to these substances. In contrast, non-steroidal

anti-inflammatory drugs such as indomethacin and acetylsalicylic acid seem to

suppress only the second phase [33].

In order to confirm the antinociceptive activity and to investigate the

involvement of the central mechanisms of the effects of the fractions, the hot plate

test was used. In this test, the intraperitoneal administration of fractions didn´t affect

mice´s reactivity at the thermal stimulus, demonstrating that the antinociceptive effect

in the abdominal constriction (writhing) test do not involve central mechanisms.

To evaluate the anti-inflammatory effect of the fractions, the model of

carrageenan-induced pleurisy in mice was used. The pleurisy induced by phlogistic

agents is a widely accepted model for the evaluation of the anti-inflammatory effect of

compounds from plants.

Inflammation is a protective process that is essential for the preservation of the

integrity of the organism in the event of chemical, physical and infectious damage.

Often, the inflammatory response to severe lesions erroneously damages normal

tissue [36].

Recruitment of cells to inflammatory sites is dependent on the release of

vasoactive and chemotactic factors that increase the local blood flow and

172

microvascular permeability and promote the migration of leukocytes from the

intravascular space into the tissues [36]. In this study, intrapleural injection of

carrageenan induced an acute inflammatory reaction, characterized by marked

accumulation of exudates rich in protein and intense migration of polymorphonuclear

in the pleural cavities. Treatment of the animals with 200 mg/kg of Sc-CHCl3

attenuated the number of total leukocytes and total protein concentration in the

exudate after carrageenan stimulus [50]. However, this result is not sufficient to affirm

that the plant has anti-inflammatory activity, because this effect was observed only in

one dose of fractions.

Finally, to assess whether fractions produces a loss of motor coordination in

animals, the rota-rod test was performed. The result revealed that the extract did not

produce changes in motor coordination of treated animals.

Conclusion

In conclusion, this study indicates that the hexane and chloroform fractions of

Selaginella convoluta exhibit antinociceptive activity. Our results support previous

claims of its traditional use. The mechanism of action these fractions showed linked

with activation of nociceptive peripheral pathway. In addition, we have demonstrated

that the fractions from S. convoluta have not any anti-inflammatory effect in the

pleurisy model induced by carrageenan. Further studies are necessary to identify the

biologically active constituents and to define the underlying of molecular mechanisms

of the inhibitory effects of these fractions.

173

Acknowledgements

The authors are grateful to Brazilian agencies CNPq, FAPEAL and FACEPE for

financial support.

Author details

1Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do

Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil. 2Laboratório de

Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana, 44.036-900, Feira de

Santana, Bahia, Brazil. 3Laboratório de Produtos Naturais, Universidade Federal de

Pernambuco, 50.740-521, Recife, Pernambuco, Brazil. 4Laboratório de Biologia

Celular, Universidade Federal de Alagoas, 57.072-970, Maceió, Alagoas, Brazil.

5Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), 56.302-970, Petrolina,

Pernambuco, Brazil.

Author’s contributions

VRO were responsible for collection and botanical identification of the species.

LAROM were responsible for preparation of the extract. LAROM, AGMP, SRGLS,

JCS, RGOJ and GRS were responsible for antinociceptive study of the fractions.

LAROM, JNSF, JRGSA and EB conducted the anti-inflammatory activity assays,

analyze and interpretation of data, and drafted the manuscript. All authors read and

approved the final manuscript.

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

174

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Control 100 200 400 INDO MOR0

10

20

30

40

**

**

*

Sc-Hex (mg/kg)

Nu

mb

er

of

wri

thin

gs

Figure 1. Antinociceptive effect of the hexane fraction from Selaginella convoluta (Sc-

Hex), indomethacin (INDO, 20 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on acetic acid-

181

induced writhing in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0.05 significantly different

from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).

Control 100 200 400 INDO MOR0

5

10

15

20

25

***

*

*

Sc-CHCl3 (mg/kg)

Nu

mb

er

of

wri

thin

gs

Figure 2. Antinociceptive effect of the chloroform fraction from Selaginella convoluta

(Sc-CHCl3), indomethacin (INDO, 20 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on acetic

acid-induced writhing in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0.05 significantly

different from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).

182

Control 100 200 400 ASA MOR0

20

40

60

*

Sc-Hex (mg/kg)

First phase

Lic

kin

g t

ime (

s)


50

100

150

* * *

**

Sc-Hex (mg/kg)

Second phase

Lic

kin

g t

ime (

s)

Figure 3. Antinociceptive effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex),

acetylsalicylic acid (ASA, 150 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on formalin (first

and second phase) in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0. 05 significantly

different from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).

183


20

40

60

*

*

Sc-CHCl3 (mg/kg)

First phase

Lic

kin

g t

ime (

s)


50

100

150

**

* **

Sc-CHCl3 (mg/kg)

Second phase

Lic

kin

g t

ime (

s)

Figure 4. Antinociceptive effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (Sc-

CHCl3), acetylsalicylic acid (ASA, 150 mg/kg) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on

formalin (first and second phase) in mice. Values are mean ± S.E.M, n = 6, *p < 0.05

significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett´s test).

184

30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Sc-Hex 100mg/kg

Sc-Hex 200mg/kg

Sc-Hex 400mg/kg

Morphine 10 mg/kg

*

*

*

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)

Figure 5. Antinociceptive effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex)

and morphine (MOR, 10 mg/kg) on hot plate test in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p <

0.05, significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).

30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Sc-CHCl3 100 mg/kg

Sc-CHCl3 200 mg/kg

Sc-CHCl3 400 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

*

*

*

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)

Figure 6. Antinociceptive effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (Sc-

CHCl3) and morphine (MOR, 10 mg/kg) on hot plate test in mice. Values are mean ±

S.E.M.; *p < 0.05, significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).

185

- Cg 100 200 400 100

5

10

15

Indomethacin (mg/kg)

Sc-Hex (mg/kg)

*

Carrageenan 1% (300 g/cavity)

Carrageenan (Cg)

Control

Tota

l le

ukocyte

s

(x10

6cells/c

avity)

- Cg 100 200 400 100.0

0.5

1.0

1.5Control


*

Sc-Hex (mg/kg)


Carrageenan (Cg)

Tota

l pro

tein

(g/m

l)

Figure 7. Effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex) and

indomethacin (10 mg/kg) on total leukocyte (A) and protein extravasation (B) on

pleurisy-induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05,

significantly different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).

B

A

186

- Cg 100 200 400 100

2

4

6

8

10


Sc-CHCl3 (mg/kg)

*


Carrageenan (Cg)

*

Control

Tota

l le

ukocyte

s

(x10

6cells/c

avity)

- Cg 100 200 400 100

2

4

6

8

10

**


Control

Carrageenan (Cg)


Sc-CHCl3 (mg/kg)

Tota

l pro

tein

(g/m

l)

Figure 8. Effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (Sc-CHCl3) and

indomethacin (10 mg/kg) on total leukocyte (C) and protein extravasation (D) on

pleurisy-induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05,


C

D

187

0

50

100

150

200Control

Sc-Hex 100 mg/kg

Sc-Hex 200 mg/kg

Sc-Hex 400 mg/kg

Diazepam 2,5 mg/kg

0.5 h 1 h 2 h

*

*

*

Tim

e (

s)

on

Ro

ta-r

od

Figure 9. Effect of the hexane fraction of Selaginella convoluta (Sc-Hex) and diazepam

(2.5 mg/kg) on rota-rod test in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, significantly

different from control (ANOVA followed by Dunnett’s test).

0

50

100

150

200Control

Sc-CHCl3 100 mg/kg

Sc-CHCl3 200 mg/kg

Sc-CHCl3 400 mg/kg

Diazepam 2,5 mg/kg

0.5 h 1 h 2 h

**

*

Tim

e (

s)

on

Ro

ta-r

od

Figure 10. Effect of the chloroform fraction of Selaginella convoluta (Sc-CHCl3) and

diazepam (2.5 mg/kg) on rota-rod test in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05,


188

APENDICE C – Certificado

189

APENDICE D – Certificado

190

APENDICE E– Certificado

191

APENDICE F – Certificado

192

APENDICE G – Certificado

193

APENDICE H – Resumo

INFLUÊNCIA DA VIA DE ADMINISTRAÇÃO NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE

Selaginella convoluta (SELAGINELLACEAE)

Macêdo LARO1, Barreto VNS1, Gomes LMA1, Sá PGS1, Oliveira-Junior RG1, Silva JC1,

Souza GR1, Lima-Saraiva SRG2, Lima JT1, Almeida JRGS1.

1: Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina-PE, Brasil.

2: Universidade Federal de Pernambuco, 50.740-521, Recife-PE, Brasil.

Introdução: Selaginella convoluta (Selaginellaceae) é uma planta medicinal encontrada no Nordeste do Brasil, popularmente conhecida como "jericó”, sendo utilizada na medicina popular como antidepressivo, diurético, afrodisíaco, analgésico e anti-inflamatório. Investigações anteriores de algumas espécies de Selaginella revelaram que este gênero é uma rica fonte de esteroides, biflavonoides e alcaloides. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antinociceptivo do Extrato Etanólico Bruto (EEB-Sc) e das fases obtidas por partição, hexano (Sc-Hex), clorofórmio (Sc-CHCl3) e acetato de etila (Sc-AcOEt), no teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos, através de duas diferentes vias de administração. Método: Foram utilizados grupos de camundongos (n=6) Swiss, machos, pesando entre 30 e 40 gramas. A atividade antinociceptiva do EEB e das fases (100; 200 e 400 mg/kg v.o e i.p) foi avaliada através do teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético [1]. Indometacina (20 mg/kg i.p.), morfina (10 mg/kg i.p.) foram utilizadas como drogas padrão. Os grupos controle receberam solução salina. Resultados e Discussões: Após a administração por via i.p dos EEB-Sc, bem como de suas frações, Sc-Hex, Sc-CHCl3 e Sc-AcOEt diminuíram significativamente (p<0,001) o número de contorções abdominais em relação ao grupo controle. Os efeitos foram maiores nas doses de 400 mg/kg (82,23% de inibição), 400 mg/kg (99,4% de inibição), 400 mg/kg (95,17% de inibição) e 200 mg/kg (84,47% de inibição), respectivamente. Com relação à administração v.o, os melhores resultados foram obtidos nas doses de 200 mg/kg (56,56% de inibição), 100 mg/kg (48,08% de inibição), 400 mg/kg (36,68% de inibição) e 400 mg/kg (50,82% de inibição), respectivamente. Conclusão: Os resultados obtidos esclarecem que, houve variação na resposta antinociceptiva de acordo com a mudança da via de administração. A diminuição no percentual de inibição pela via oral poderá ser devido a não absorção efetiva do extrato pelo trato gastrintestinal, ou ainda, pela metabolização de seus princípios ativos por vias alternativas do metabolismo. Sendo assim, é necessário que outros estudos sejam feitos para avaliar a possível atividade antinociceptiva do extrato e das fases de Selaginella convoluta quando administrado por via oral ou intraperitoneal [2].

Agradecimentos: CNPq / FACEPE Referências: 1. Almeida JRGS, Lima JT, Oliveira HR, Oliveira MR, Meira PRM, Lucio ASSC, Barbosa-Filho JM (2011). Natural Product Research. 25: 1908-1915. 2. Soares CC, Marques TM, Rigolin GG, Neis E, Friaça AMV, Silva AS, Barreto GS, Lopes L (2009). Revista Brasileira de Farmacognosia. 19(1A): 77-81. Sessão Científica: Etnofarmacologia, Farmacologia e Toxicologia.

194

APENDICE I – Resumo

AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DE SELAGINELLA CONVOLUTA

(SELAGINELLACEAE)

LARISSA ALVES RIBEIRO DE OLIVEIRA MACÊDO1; JAMYLLE NUNES SOUZA FERRO2;

SAMÁRIO LINO DOS SANTOS2; JOÃO PAULO NOÉ DA SILVA2; EMILIANO DE OLIVEIRA

BARRETO2; JACKSON ROBERTO GUEDES DA SILVA ALMEIDA1

1NEPLAME, Universidade Federal do Vale do São Francisco.

2Universidade Federal de Alagoas

Introdução: Selaginella convoluta (Selaginellaceae) é uma planta medicinal encontrada no

Nordeste do Brasil utilizada na medicina popular como antidepressivo, analgésico e anti-

inflamatório. Objetivos: Avaliar o efeito anti-inflamatório das fases hexânica (FH) e

clorofórmica (FC) de S. convoluta. Métodos: Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas

(n= 6, 25-35 g). Para verificar o efeito das fases FH e FC (100; 200 e 400 mg/kg i.p) sobre o

recrutamento de células foi utilizado o modelo de pleurisia induzida por carragenina. O efeito

sobre a formação do edema foi avaliado no modelo do edema de pata induzido por

carragenina. Adicionalmente, macrófagos peritoneais foram incubados por 24h com as FH e

FC (1, 100, 250 e 500 μg/mL) para avaliar a viabilidade celular pelo método do MTT.

Resultados: Os animais estimulados com carragenina apresentaram um aumento no influxo

de leucócitos para a cavidade inflamada, 6,53 ± 1,45 x 106 células. No entanto, somente o pré-

tratamento com a FC na dose de 200 mg/kg foi capaz de reduzir esse infiltrado para 1,92 ±

0,25 x 106 células. No modelo do edema de pata induzido por carragenina, no entanto,

observamos que o pré-tratamento com FH e FC nas doses de 400 mg/kg não foram capazes de

reduzir a formação do edema (80,02 ± 8,21 e 83,88 ± 13,21 μL, respectivamente), quando

comparado ao grupo controle (88,88 ± 7,03 μL) 4 h após o estímulo. No ensaio de viabilidade

celular, FH provocou uma redução significativa da viabilidade das células a partir da

concentração de 250 μg/mL (27,07 ± 0,9%), já FC provocou uma redução na concentração de

1 μg/mL (74,32 ± 4,2%), apresentando uma redução de 21,11 ± 0,33% na viabilidade das

células na concentração de 250 μg/mL. Conclusões: A fase clorofórmica (FC) obtida de S.

convoluta apresentou atividade anti-inflamatória no modelo de pleurisia induzida por

carragenina. Sob condições agudas de exposição à FH e FC, os animais apresentaram sinais

de toxicidade, dependendo da dose administrada. Dessa forma, mais estudos são necessários

para identificar os mecanismos responsáveis pelos efeitos observados.

Palavras-chave: Efeito anti-inflamatório; Selaginella convoluta, pleurisia.

Apoio Financeiro: CNPq/FACEPE

195

APENDICE J – Resumo

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DAS FASES OBTIDAS POR PARTIÇÃO DE

SELAGINELLA CONVOLUTA (SELAGINELLACEAE)

1L.A.R.O. MACÊDO,

1J.C. SILVA,

1R.G.O.OLIVEIRA- JÚNIOR,

1L.M.A. GOMES,

1G.R. SOUZA,

1T.C. DINIZ

2, S.R.G. LIMA-SARAIVA,

3A.G.M.PACHECO,

1J.R.G.S.

ALMEIDA

1 Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do Vale do São

Francisco (UNIVASF); [email protected] 2

Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Federal de Pernambuco;

3 Laboratório de Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).

Introdução: Selaginella convoluta, popularmente conhecida como “jericó”, é utilizada na

medicina popular como analgésico e anti-inflamatório. O objetivo do trabalho foi avaliar a

atividade antinociceptiva das fases obtidas de S.convoluta, hexano (FH) e clorofórmica (FC).

Métodos: Foram realizados os testes de contorções abdominais induzidas por ácido acético

(0,9%), formalina (2,5%) e placa quente. Os animais foram tratados com FH e FC (100, 200 e

400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (200 mg/kg) e a morfina (10 mg/kg). Utilizou-se

camundongos Swiss (n=6, 25-35 g). Adicionalmente foi avaliada atividade motora dos

animais. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética sob o número 0003/17072012.

Resultados: No teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético, as fases

reduziram o número de contorções em todas as doses. No teste da formalina, os animais

tratados com FH e FC apresentaram resultados significativos na segunda fase. Entretanto, na

dose de 100 mg/kg de FC houve redução do tempo de lambida da pata na primeira fase. Em

relação a placa quente, os animais tratados com FH e FC não apresentaram, em todas as

doses, aumento no tempo de latência. No teste de rota rod não houve interferência motora.

Conclusão: As fases demonstraram atividade antinociceptiva em todos os ensaios

experimentais. Contudo, novos estudos são necessários para melhor elucidação do mecanismo

de ação pelos quais os constituintes químicos presentes nas fases exercem a atividade

antinociceptiva.

Apoio: CNPq, FACEPE.

Palavras-chave: Atividade antinociceptiva, Selaginella convoluta, Selaginellaceae.

INOVAÇÃOpara

BRASILEIRO ERAPÊUTICAT

21 a 25 de novembro de 2011UFPE Recife & Mar Hotel

Programa de Pós-Graduação

em Inovação Terapêutica

Realização

Ministério da Saúde

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E-mail: @gmail.com

segundoebit/ufpe

contato2ebit

Inscrições e Contatos

II3º Encontro Brasileiro para Inovação Terapêutica

196

APENDICE K – Resumo

AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM CAMUNDONGOS

TRATADOS COM AS FASES OBTIDAS POR PARTIÇÃO DE Selaginella convoluta

1L.A.R.O. MACÊDO,

1E.M. LAVOR,

1M.G. SILVA,

1R.L. MENDES,

1J.C. SILVA,

1H.C.C. SARAIVA,

2S.R.G. LIMA-SARAIVA,

3A.G.M. PACHECO,

4F.L.T. AQUINO,

4

J.N.S. FERRO, 4E.O. BARRETO,

1J.R.G.S. ALMEIDA

1 Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do Vale do São Francisco.

[email protected] 2 Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de

Pernambuco. 3 Laboratório de Fitoquímica, Universidade Estadual de Feira de Santana.

4 Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Universidade Federal de Alagoas.

RESUMO

Foram analisadas as alterações histopatológicas nos fígados e rins dos camundongos

sob tratamento agudo com as Frações Hexânica (FH) e Clorofórmica (FC), obtidas por

partição de Selaginella convoluta. Foram utilizados 36 camundongos Swiss, para cada fração,

subdivididos em 3 grupos, nos quais se administrou por via intraperitoneal (i.p), soro

fisiológico à 0,9%, e os extratos nas doses de 400 mg/kg e 2.000 mg/kg. Após 14 dias, os

animais foram eutanasiados e os órgãos foram seccionados e processados conforme os

métodos habituais. Foram observadas alterações hepáticas e renais caracterizadas por resposta

inflamatória e fibrose tissular nos animais tratados. Estes resultados ressaltam a importância

de estudos toxicológicos de longa duração com os extratos obtidos da espécie.

INTRODUÇÃO

Os produtos naturais de origem vegetal são importantes fontes de substâncias

potencialmente ativas. Nesse contexto, Selaginella convoluta (Selaginellaceae) é uma planta

medicinal encontrada no Nordeste do Brasil, popularmente conhecida como "jericó", sendo

utilizada na medicina popular como antidepressivo, diurético, afrodisíaco, analgésico e anti-

inflamatório. Entretanto, não há estudos que comprovem a segurança de seu uso (ALMEIDA

et al, 2013).

Durante a fase pré-clínica em modelos com animais de experimentação, a toxicidade

pode ser avaliada através da realização de estudos histopatológicos, para determinação de

lesões celulares e teciduais. Esse estudo é de fundamental importância pois caracteriza os

efeitos deletérios decorrentes da administração em concentração capaz de provocar efeitos

tóxicos (EATON; KLAASSEN, 1996).

INOVAÇÃOpara

BRASILEIRO ERAPÊUTICAT

21 a 25 de novembro de 2011UFPE Recife & Mar Hotel

Programa de Pós-Graduação

em Inovação Terapêutica

Realização

Ministério da Saúde

Patrocínio Apoio

NCONTROE

I Jornada para o Desenvolvimento da Economia da Saúde de Pernambuco

&

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contato2ebit

Inscrições e Contatos

II3º Encontro Brasileiro para Inovação Terapêutica

197

Nos estudos com finalidade farmacotoxicológica, o fígado e os rins são órgãos

constantemente avaliados, pois além de serem vitais, são órgãos envolvidos na metabolização

e excreção da maioria dos compostos, experimentalmente administrados, sendo assim alvos

de toxicidade induzida por xenobióticos. Os modelos animais são necessários para identificar

as possíveis lesões provocadas pela ação direta ou de produtos gerados por biotransformação

após administração dessas substâncias (FOLGUEIRA; BRENTANI, 2004)

OBJETIVOS

Com o intuito de conhecer uma eventual toxicidade e contribuir com o perfil de

segurança da espécie, o objetivo do estudo foi avaliar histopatologicamente o efeito da

administração aguda das frações obtidas por partição (FH e FC) de S.convoluta sobre fígado e

rim de camundongos albinos Swiss.

MATERIAIS E MÉTODOS

O material vegetal foi coletado em março de 2012 (09º 03’ 54.2”S, 40º 19’ 11.7”W)

no Campo Experimental da Embrapa Semiárido, município de Petrolina-PE. Uma exsicata da

espécie foi codificada (19203) e depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) no

Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) na UNIVASF. O

processamento do material vegetal foi feito através de metodologia habitual (OLIVEIRA

JUNIOR et al, 2012)para obtenção do Extrato Etanólico Bruto e a partir deste foi feita a

partição com solventes em gradientes de polaridade crescente (hexano e clorofórmio).

Os animais foram fornecidos pelo Biotério Setorial da Univasf, mantidos sob

condições ambientais padronizadas (22 ± 2° C e ciclo claro/escuro de 12 horas) e alimentados

com ração e água potável à vontade. Os protocolos experimentais obedeceram aos atuais

preceitos éticos e técnicos tendo sido aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais

(CEUA) mediante certidão № 0003/17072012.

Foram utilizados 72 camundongos (n=36 para cada fração) subdivididos em 3 grupos

(n=6, para cada sexo, 25-35g), nos quais se administrou via intraperitoneal, soro fisiológico à

0,9%, e (FH ou FC) nas doses de 400 mg e 2.000 mg/kg, em dose única, sendo observados

durante 14 dias. A coleta das vísceras (fígado e rins) ocorreu no décimo quinto dia após o

tratamento e foi feita pela eutanásia de dois dos animais sobreviventes de cada grupo. As

secções teciduais foram fixadas em formalina tamponada e após 24 horas, resseccionadas para

processamento histopatológico: desidratação com séries crescentes de álcool (70 a 100%)

seguida de diafanização em xilol, impregnação e inclusão em parafina. Em micrótomo, os

fragmentos tissulares foram seccionados a uma espessura de 5m com subsequente coloração

por hematoxilina-eosina para exame microscópico.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foram identificadas alterações histológicas nos grupos tratados com o veículo em

ambos os sexos e fases de S. convoluta. A avaliação hepática revelou estrutura e coloração

lobular preservadas e nos rins, arquitetura normal com pirâmides medulares recobertas por

198

tecido cortical. O córtex apresentou glomérulos regularmente distribuídos. Nos animais

tratados com FH na dosagem de 400 mg/kg, os fígados apresentaram processo inflamatório

difuso e com discretas regiões necróticas. Normalmente, os infiltrados apresentam maior

densidade celular próximas as veias centro-lobulares, mas não houve destruição do

parênquima hepático. Já aqueles tratados com a maior dose (2.000 mg/kg) apresentaram

hepatócitos com múltiplas vesículas no citoplasma, sugestiva de esteatose além de um

aumento no número de células inflamatórias. Nos animais tratados com FC, na dose de 400

mg/Kg os fígados apresentaram pequenos focos inflamatórios e vasos hiperêmicos.

Entretanto, na maior dose, foram observadas extensas áreas de fibrose e discretas regiões de

necrose. Em relação a avaliação renal, não houve alterações dignas de nota, nos animais

tratados com FH. Aqueles tratados com FC apresentaram processo inflamatório e pequena

região de destruição tecidual com infiltrado inflamatório cortical bem como presença de

microvesículas no citoplasma das células ao redor dos túbulos contorcidos.

Figura1: Fotomicrografias representativas do histopatológico de rim e fígado de animais tratados com extratos

na dose de 2.000 mg/ Kg. A seta indica um discreto infiltrado inflamatório em corte de rim (A) e fígado (B).

CONCLUSÕES

A avaliação histopatológica evidenciou alterações morfológicas em maior grau nos

animais tratados com a maior dose experimental (2.000 mg/kg). Essa dose corresponde a 5

vezes a maior dose terapêutica do estudo de Sa et al. (2012). Tal fato aponta para um

significado clínico que pode ser compreendido mais como resultado de uma sobrecarga dos

órgãos que como consequência de uma ação tóxica significativa do extrato. Dessa forma,

extratos de S. convoluta podem ser utilizados em dosagens inferiores a 400 mg/Kg devido ao

menor grau e extensão das lesões em fígado e rins Ainda assim, ressalta-se a importância de

estudos toxicológicos de longa duração com as fases de S.convoluta para melhor caracterizar

o perfil de segurança dessa espécie.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado pelas agências de fomento CNPq e FACEPE. Os autores

desejam expressar seus agradecimentos ao Centro de Referência e Recuperação de Áreas

Degradadas (CRAD/UNIVASF) e a Embrapa Semiárido pela coleta e identificação da planta.

A B

199

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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OLIVEIRA, V. R. ; BARBOSA FILHO, J. M. . Phytochemistry of the genus Selaginella

(Selaginellaceae). Journal of Medicinal Plant Research, v. 7, p. 1858-1868, 2013.

EATON, D.L.; KLAASSEN, C.D. Principles of toxicology. In: Klaassen, C.D.; Amdur,

M.O.; Doull, J. (eds.). Cesarett and Doull’s Toxicology. The basic science of poisons. 5.ed.

New York: McGraw-Hill, 1996, p.13-34, 1996.

FOLGUEIRA, M. A. A. K; BRENTANI, M. M. Câncer de mama. In: FERREIRA, C. G.;

ROCHA, J. C. Oncologia molecular. Editora Atheneu, São Paulo, p. 135-144, 2004.

MIDDENDORF, P.J.; WILLIAMS, P.L. Nephrotoxicity: Toxic Responses of the Kidney. In:

WILLIAMS, P.L.; JAMES, R.C.; ROBERTS, S. M. Principles of toxicology:

environmental and industrial applications. A Wiley-Interscience

Publication, Second Edition. New York, cap. 5, p. 120- 25, 2000.

OLIVEIRA JUNIOR, R. G. ; ARAÚJO, C. S. ; SANTANA, C. R. R. ; SOUZA, G. R. ;

LIMA-SARAIVA, S. R. G. ; GUIMARAES, A. L. ; OLIVEIRA, A. P. ; SIQUEIRA FILHO,

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Neoglaziovia variegata (Bromeliaceae). Journal of Chemical and Pharmaceutical

Research, v. 4, p. 4489-4494, 2012

SA, P. G. S. ; NUNES, X. P. ; LIMA, J. T. ; SIQUEIRA FILHO, J. A. ; FONTANA, A. P. ;

QUINTANS, J. S. S. ; QUINTANS-JUNIOR, L. J. ; DAMASCENO, P. K. F. ; BRANCO, C.

R. C. ;BRANCO, A. ; ALMEIDA, J. R. G. S. . Antinociceptive effect of ethanolic extract of

Selaginella convoluta in mice. BMC Complementary and Alternative Medicine, v. 12, p.

1-7, 2012.

200

ANEXO A – Folha de aprovação do Comitê de Ética

ANEXOS

201

ANEXO A – Folha de aprovação do Comitê de Ética

202

ANEXO B – Tabela de triagem comportamental

Triagem Farmacológica (Modelo retirado de Almeida et al., 1999)

PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_____________DATA:____/_____/_____

VIA DE ADMINISTRAÇÃO:_____________________ANIMAIS:______________________________

RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________ GRUPOS:________________________

ATIVIDADE FARMACOLÓGICA

Quantificação dos efeitos

(0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso

até 30` 1h 2h 3h 4h

1 - SNC

a - Estimulante

Hiperatividade

Irritabilidade

Agressividade

Tremores

Convulsões

Piloereção

Movimento intenso das vibrissas

Outras_____________________

b - Depressora

Hipnose

Ptose

Sedação

Anestesia

Ataxia

Reflexo do endireitamento

Catatonia

Analgesia

Resposta ao toque diminuído

Perda do reflexo corneal

Perda do reflexo auricular

c - Outros comportamentos

Ambulação

Bocejo excessivo

Groming

Rearing

Escalar

Vocalizar

Sacudir a cabeça

Contorções abdominais

Abdução das patas do trem posterior

Pedalar

Estereotipia

2 - SN AUTÔNOMO

Diarréia

Constirpação

Defecação aumentada

Respiração forçada

Lacrimejamento

Micção

Salivação

Cianose

Tono muscular

Força para agarrar

3 - MORTE

obs.:_________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________

orientador: prof. dr. jackson roberto guedes da silva almeida€¦ · macêdo, larissa alves...

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