obtenção de um antígeno para ensaio imunoenzimático (elisa

Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Parasitologia

Obtenção de um antígeno para Ensaio

Imunoenzimático (ELISA) a ser utilizado no

diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina pelos

órgãos de Saúde Pública no Brasil

Eloísa de Freitas

Belo Horizonte

2010

II

Eloísa de Freitas

Obtenção de um antígeno para Ensaio Imunoenzimático

(ELISA) a ser utilizado no diagnóstico da Leishmaniose

Visceral Canina pelos órgãos de Saúde Pública no Brasil

Tese apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Parasitologia do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Minas Gerais, como requisito parcial para

a obtenção do título de Doutor em Ciências

Área de Concentração: Protozoologia

Orientadora: Profª. Drª. Maria Norma Melo

Co- orientadora: Profª. Drª. Marilene Suzan Marques Michalick

Belo Horizonte

Minas Gerais - Brasil

2010

III

043 Freitas, Eloísa de.

Obtenção de um antígeno para ensaio imunoenzimático (ELISA) a ser utilizado no

diagnóstico da Leishmaniose visceral canina pelos órgãos de Saúde Pública no Brasil.

[manuscrito] / Eloísa de Freitas. – 2010.

127 f. : il. ; 29,5 cm

Orientadora: Maria Norma Melo. Co-orientadora: Marilene Suzan Marques

Michalick.

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de

Parasitologia.

1. Leishmaniose visceral canina. 2. Leishmania chagasi. 3. Calazar - Teses. 4.

Teste imunoenzimático - Teses. 5. Antígenos – Teses. 6. Diagnóstico humoral. 7.

Parasitologia – Teses. I. Melo, Maria Norma. II. Michalick, Marilene Suzan Marques.

III. Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Parasitologia. III. Título.

CDU: 576.88/.89

IV

Trabalho desenvolvido nos Laboratórios de Biologia de

Leishmania e de Sorologia do Departamento de

Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da

UFMG, Financiado em parte pelo CNPq, e em parceria

com o Setor de Pesquisas da Fundação Ezequiel Dias-

FUNED

V

A todos os cães que foram submetidos à

eutanásia vítimas da Leishmaniose Visceral,

Com todo o meu amor dedico este trabalho.

VI

Agradecimentos

A Deus, pela cumplicidade em cada momento da minha vida.

A minha família pelo apoio e amor incondicional.

Às minhas orientadoras, Profas. Dra. Maria Norma Melo e Dra Marilene Suzan

Marques Michalick, pela oportunidade oferecida na orientação deste trabalho, por

acompanharem passo a passo cada etapa, sempre otimistas e confiantes, contagiando a

todos ao seu redor e, principalmente, pela compreensão e apoio oferecidos durante meus

momentos de dificuldades, demonstrando serem, além de excelentes orientadoras,

grandes amigas e seres humanos exemplares. A vocês, minha eterna admiração.

A Profa. Hélida Monteiro de Andrade por me acolher em seu laboratório e aceitar

comigo o desafio, revelando-se uma ótima e competente orientadora, assim como uma

grande amiga. Agradeço também a Simone, pela prestatividade na transmissão de

conhecimentos, paciência e apoio técnico. Angélica, Junior e Felipe, obrigada demais!

Talita, Aliani e Jordanna, obrigada pela amizade.

Ao professor Dr.George Luiz Lins Machado Coelho pela ajuda na análise estatística dos

resultados.

As amigas de laboratório Elza Moreira da Silva, Rosálida Estevam Nazar Lopes,

Ludmila Gomes Muniz e Miriam Costa pela enorme colaboração e apoio técnico,

ofertados sempre com muita prestatividade. No início, colegas de trabalho, mas agora,

amigas para sempre!

A Rosangela Gomes e Soraia de Oliveira Silva, técnicas e amigas, sempre com um

sorriso e respostas certas e naturalmente competentes. Sem a ajuda de vocês nunca

teriam sido possível a realização deste trabalho.

A Sumara, amiga de longa data e companheira desta e outras jornadas que já se

completaram. Não tenho palavras para expressar sua bondade de coração, o apoio e

carinho a mim dedicados, que revelam sua nobreza de caráter. Obrigada por tudo!

A Elizabeth Castro Moreno, pela ajuda no momento importante, pela paciência e

transmissão de conhecimentos.

A Leonardo T. Ituassu pela gentileza na disponibilização dos animais de seu

experimento para coleta de material.

Aos professores e funcionários do Departamento de Parasitologia, pelos conhecimentos

ofertados e momentos de descontração ao longo deste período. Afonso, Sr Neri,

Joãozinho, Edna, vou sentir saudades.

A Dra Adriane Pimenta da Costa Val, companheira de jornada, amiga, mestre, irmã.

A Dra Junia Maria Cordeiro de Menezes, exemplo de pessoa e de profissional, sempre

acessível e nos ensinando com muita humildade e boa vontade. Aprendi e tenho muito a

aprender com você.

VII

A toda turma do Hospital Veterinário, companheiros nesta caminhada e com os quais

escrevemos uma estória... Elizete, Eliana, Ronaldo, Joaquim, Rubens, Gleidice, Luiz

Carlos, Creide, Bretas, Erlaine, Fábio. Vocês são a minha melhor parte nesta escola.

Aos professores Fabíola Paes Leme e Paulo Ricardo, assim como a todos os residentes

que passaram pelo LAC, todos os funcionários, estagiários e bolsistas, em especial a

querida Renata, no apoio pela causa animal. Serei sempre grata a vocês.

A Roxane Rafaela Macedo dos Santos e Evair Nunes da Costa. Obrigada pela ajuda

incessante e pelo exemplo de desprendimento, a amizade de vocês sempre levarei

comigo. Mais um ciclo se fecha, outros se iniciam. E se hoje sou mais forte, vocês me

ajudaram a crescer. Obrigada!

A Juliana Cabral Gomes, Vanessa Jareno Arão e Wylliana Gonçalves Fontes, obrigada

pelos serviços oferecidos, pelo carinho e paciência, pela amizade que se iniciou e por

acreditarem em meu potencial e na minha recuperação.

Ao Sr. Edson, D. Jane, Juliana, Eduardo e Fernanda por me acolherem de forma tão

especial e me fazerem sentir em família e entre amigos.

A Eliane Gonçalves Paiva Lopes, eterna amiga e irmã em Cristo. Sempre pronta com

um conselho e uma palavra de sabedoria. Amiga, te adoro! Obrigada!

A Daniella Naves Paglioni e Sandra Naves Paglionni. Mesmo distantes, sempre estamos

juntas, pois um sentimento muito forte nos une. Benção de Deus em minha vida.

A Sra. Terezinha Antunes Abbas e Salim Abbas, pelo carinho dedicado e a acolhida em

sua casa.

Ao Dr. Silvio Leite, parceiro pra todos os momentos, excelente profissional e grande

amigo.

A Dra Gabrielle Márcia Cury, pela confiança no empréstimo de seu patrimônio que

tanto me ajudou, pela amizade e apoio técnico constantes.

Aos amigos do bairro Jaqueline, Sandro, Leo, Kenia, Sonia, Miriam, Sidnei, Ana

Cristina, Paula, pela convivência e pelos momentos de descontração e amizade.

Aos amigos Cláudia Capistrano, Ana Paula, Angélica, Renata, Tae, Lucia (in

memoriam), Moema, Gregório, Iara, Nino, Sara, Luciana, Márcia, Aparecida, Ivonete,

Vânia, Cida, Ariane, Leoneide, que sempre me apoiaram, acreditaram e torceram por

mim.

A todos que não estão aqui citados, e que são os muitos outros mestres, com ou sem

título, que me ensinaram as diversas facetas da vida. A eles, serei sempre grata.

A Fundação Ezequiel Dias, pela parceria no desenvolvimento deste estudo

A FAPEMIG e ao CNPq, pelo suporte financeiro e disponibilização da bolsa de estudos,

sem os quais não teria sido possível a conclusão deste trabalho.

VIII

Resumo

No Brasil, dentre as medidas de controle preconizadas pelo Ministério da Saúde para

controle da Leishmaniose visceral, a identificação de cães positivos para leishmaniose

visceral canina (LVC), é recomendada, integradas com outras, visto ser este animal um

dos principais elos da cadeia epidemiológica. Os métodos sorológicos utilizados para

identificação dos animais, não são 100% eficazes que pode comprometer esta medida de

controle. Visando à padronização de um antígeno que permita separar de maneira

adequada animais acometidos ou não pela LVC, cento e três animais oriundos do

Centro de Controle de Zoonoses da cidade de Betim foram categorizados como

positivos ou negativos para LVC através de testes parasitológicos e sorológicos,

resultando em cinqüenta e quatro positivos e quarenta e nove negativos para esta

patologia. Estes animais foram doadores de soro para os ensaios de padronização de um

antígeno para o teste de ELISA. Duas cepas de Leishmania (L.) chagasi, BH46 e

BH400, isoladas de paciente humano e canino respectivamente, e uma cepa de

Leishmania (L.) amazonensis, BH6, isolada de paciente humano foram cultivadas em

meio LIT e Alfa-MEM e as massas antigênicas utilizadas para preparar antígenos para

sensibilização de placas de ELISA e lâminas de RIFI, assim como para obtenção de um

extrato antigênico a ser utilizado na eletroforese em gel bidimensional seguida de

Immunobloting. As placas de ELISA foram testadas com 24 horas, 3 meses e 6 meses

de armazenamento em freezer a -20ºC. As lâminas de RIFI foram armazenadas da

mesma forma e utilizadas após 30 dias. Em todas as fases foram determinados para

ELISA e para RIFI, os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo,

valor preditivo negativo e índice de concordância de Youden. Os resultados foram

comparados com aqueles obtidos com os kits de ELISA e RIFI de Biomanguinhos. A

cepa BH400, independente do meio de crescimento, foi a que apresentou melhor

desempenho em caracterizar corretamente animais positivos e negativos. Esta cepa

mostrou, durante o experimento, valores de sensibilidade e especificidade entre 98-

100%, valor preditivo positivo de 100%, valor preditivo negativo entre 98-100% e

índice de concordância de Youden de 98-100%. Houve reação cruzada com soros de

cães com Trypanosoma cruzi e com Leishmaniose tegumentar, mas o antígeno não

apresentou reação cruzada com Babesia canis e Ehrlichia canis. O meio Alfa-MEM foi

escolhido para cultivo desta cepa e caracterização do perfil proteômico-imunogênico,

devido à facilidade de obtenção comercial e preparo do mesmo. O Immunobloting foi

IX

realizado com pool de soros de alto e baixo títulos de anticorpos e pool de soros

negativos, e revelou mais de cinqüenta “spots” reativos sem reação com soros

negativos, mostrando alta imunogenicidade do antígeno. No gel bidimensional foram

localizados 37 “spots” que poderão futuramente ser identificados por espectrometria de

massa, visando obtenção de proteínas que possam ser utilizadas como antígenos para

ELISA e conferir aumento da sensibilidade e especificidade deste teste.

X

Abstract

In Brazil, control measures of visceral leishmaniasis (VL) recommended by the

Ministry of Health include identification of positive dogs, integrated with others

procedures, since this animal is one of epidemiological chain main links. Serological

methods used for animal identification, are not 100% effective and this fact may

compromise this control measure. Aiming at obtaining an antigen that allows separate

adequately infected animals one hundred and seven animals were categorized as

positive or negative for LV by parasitological and serological tests resulting in fifty-four

positive and forty-nine negative. These animals were serum donors for ELISA and

IFAT serological tests. Two strains of Leishmania (L.) chagasi, BH46 and BH400,

isolated from human and canine patients respectively, and one strain of Leishmania (L.)

amazonensis, BH6, isolated from human patients were grown in LIT and alpha-MEM

mediuns and used to prepare antigens for sensitization of ELISA plates and glass slides

of IFAT, as well as for obtaining an antigenic extract to be used in two-dimensional gel

electrophoresis followed by immunoblotting. ELISA plates were tested at 24 hours, 3

months and 6 months of storage at -20 ° C. IFAT slides were stored in the same way

and used after 30 days. At all stages were determined for ELISA and IFAT, sensitivity,

specificity, positive predictive value, negative predictive value and Youden index of

agreement. The results were compared with those obtained with IFAT and ELISA

Biomanguinhos commercial kits. Cultivation of BH400 strain, regardless of medium,

showed the best performance in correctly characterizes positive and negative animals.

This strain showed during the experiment, 98-100% sensitivity and specificity, 100%

positive predictive value, 98-100% negative predictive value and Youden index of

agreement of 98-100%. There was ELISA cross-reaction with sera from dogs with

Trypanosoma cruzi and cutaneous leishmaniasis, but the antigen showed no cross

reactivity with Babesia canis and Ehrlichia canis. The Alpha-MEM medium was

chosen for cultivation and proteomic -immunogenic profile characterization of this

strain due to the ease of obtaining and preparing this medium. The immunoblotting was

performed with pooled sera from high and low antibody titers and pool of negative sera

and revealed more than fifty “spots” reactive with no reaction with negative sera,

showing high antigen immunogenicity. The two-dimensional gel revealed 37 “spots”

that may be identified by mass spectrometry in order to obtain proteins that can be used

as antigens for ELISA and provide increased sensitivity and specificity of this test.

XI

Lista de Figuras

Figura 1 Curva de crescimento da cepa BH400 de Leismania (Leishmania) chagasi, (A) cultivada em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) e (B) em meio α- MEM (Minimum

Essential Medium) acrescido de 10% de SFB .................................................................. 54

Figura 2 Teste de ELISA realizado em soros de animais positivos para leishmaniose visceral

canina, com os antígenos A, B, C, D, E e F, testados 24 horas após sensibilização das placas. ............................................................................................................................. 56

Figura 3 Teste de ELISA realizado em soros de animais negativos para leishmaniose visceral

canina, com os antígenos A, B, C, D, E e F, testados 24 horas após sensibilização das placas .............................................................................................................................. 56


canina, com os antígenos A, B, C, D, E e F, testados três meses após sensibilização das placas. ............................................................................................................................. 56

Figura 5 Teste de ELISA realizado em soros de animais negativos para leishmaniose visceral

canina, com os antígenos A, B, C, D, E e F, testados três meses após sensibilização das

placas .............................................................................................................................. 56


canina, antígenos A, B, C, D, E e F, ................................................................................. 56

Figura 7 Teste de ELISA realizados em soros de animais negativos para leishmaniose visceral canina, com o antígenos A, B, C, D, E e F, testados seis meses após sensibilização das

placas .............................................................................................................................. 56

Figura 8 Comparação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo dos antígenos utilizados no teste ELISA 24 horas após a sensibilização das placas.

(A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400 (Leishmania (L) chagasi),

cultivadas em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); D e F, BH46 e BH400

Leishmania (L) chagasi, cultivadas em meio α-MEM SFB 10%) ..................................... 60

Figura 9 Comparação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e, valor preditivo

negativo dos antígenos utilizados no teste ELISA três meses após a sensibilização das

placas. (A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400 (Leishmania (L) chagasi), cultivadas em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); D e F, BH46 e

BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em meio α-MEM SFB 10%) ......................... 61

Figura 10 Comparação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e, valor

preditivo negativo dos antígenos utilizados no teste ELISA seis meses após a sensibilização das placas. A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400

(Leishmania (L) chagasi), cultivadas em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.)

amazonensis); D e F, BH46 e BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em meio α-MEM SFB 10%) ....................................................................................................................... 61

Figura 11 Teste da RIFI realizados em soros de cães portadores de leishmaniose visceral com

diferentes antígenos. (A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400 (Leishmania (L) chagasi), cultivadas em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.)

amazonensis); D e F, BH46 e BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em meio α-MEM

SFB 10%) ....................................................................................................................... 63

Figura 12 Teste da RIFI realizados em soros de cães negativos para leishmaniose visceral com diferentes antígenos. (A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400

(Leishmania (L) chagasi), cultivadas em em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.)

amazonensis); D e F, BH46 e BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em em meio α-MEM SFB 10%) ............................................................................................................. 63

XII


preditivo negativo dos antígenos utilizados na Reação de Imunofluorescência Indireta –

RIFI. ............................................................................................................................... 64

Figura 14 Teste de ELISA realizado em soros verdadeiramente positivos e negativos para

leishmaniose visceral canina com o kit Biomanguinhos, LOTE 086EL007Z .................... 65

Figura 15 Teste de RIFI realizado em amostras de soros positivos e negativos para leishmaniose visceral canina como kit Biomanguinhos, LOTE 086LC004Z. ......................................... 65


preditivo negativo dos antígenos dos kit-ELISA Biomanguinhos LOTE 086EL007Z e kit-

RIFI Biomanguinhos LOTE 086LC004Z ......................................................................... 66

Figura 17 Relação entre os valores de absorbância do ELISA, após 24 horas de sensibilização

das placas, e os títulos das diluições da RIFI e a tendência das linhas de regressão para os

antígenos A, B, C, D, E e F.............................................................................................. 67

Figura 18 Relação entre os valores de absorbância do ELISA, após três meses de sensibilização


antígenos A, B, C, D, E e F.............................................................................................. 68

Figura 19 Relação entre os valores de absorbância do ELISA, após seis meses de sensibilização


antígenos A, B, C, D, E e F ............................................................................................. 69

Figura 20 Comparação das linhas de tendência dos antígenos E e F, mostrando a relação entre os valores de absorbância do ELISA, 24 horas após a sensibilização das placas, e os títulos

das diluições da RIFI ....................................................................................................... 70

Figura 21 Comparação das linhas de tendência dos antígenos E e F, mostrando a relação entre os valores de absorbância do ELISA, três meses após a sensibilização das placas, e os

títulos das diluições da RIFI ............................................................................................ 71

Figura 22 Comparação das linhas de tendência dos antígenos E e F, mostrando a relação entre

os valores de absorbância do ELISA, seis meses após a sensibilização das placas, e os títulos das diluições da RIFI ............................................................................................ 72

Figura 23 Gel 2-DE contendo 600g de proteínas de Leishmania chagasi (cepa BH400 crescida em meio α-MEM) fracionadas em tiras de 13 cm pH 4-7 (direita para esquerda) e SDS-

PAGE a 12%. O gel foi corado por comassie (A) ou transferido para membrana de nitrocelulose e incubadas com soros de animais não infectados (B) e infectados que

apresentavam baixos títulos de anticorpos (C) e altos títulos de anticorpos (D). O

conjugado utilizado foi anti-IgG total de cão. Em cada membrana estão destacados os

“spots” detectados por cada grupo de soros. ..................................................................... 74

Figura 24 Gel 2-DE contendo 600g de proteínas de Leishmania chagasi (cepa BH400 crescida em meio α MEM) fracionadas em tiras de 13 cm pH 4-7 (direita para esquerda) e SDS-

PAGE a 12% corado por comassie. Em destaque em vermelho, os “spots” reativos frente a

soros de cães não infectados, em azul “spots” reativos frente a cães que apresentam baixos

títulos de anticorpos e em preto os “spots” reativos frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos. ............................................................................................... 76

XIII

Lista de Tabelas

Tabela 1: Categorização dos animais pré-selecionados como portadores ou não de

leishmaniose visceral, após avaliação parasitológica e sorológica. ........................ 53

Tabela 2 Codificação dos antígenos produzidos com as diferentes amostras de

Leishmania crescidas nos meios de cultura LIT (Camargo, 1966) e Alfa-MEM

acrescido de 20% de soro fetal bovino.................................................................. 55

Tabela 3 Teste de ELISA nos tempos de 24 horas, três e seis meses após a

sensibilização das placas, com os antígenos A, B, C, D, E e F, em soros caninos

padrões positivo e negativo para leishmaniose visceral. ........................................ 58

Tabela 4 Valores percentuais e absolutos de número de amostras classificadas como

Zona Cinza, acima e abaixo do ponto de corte do ELISA, durante todas as fases do

experimento. ........................................................................................................ 59

Tabela 5 Teste de ELISA em soro de cães portadores de Leishmaniose Tegumentar,

Babesiose, Erlichiose e Doença de Chagas com o antígeno F ............................... 73

Tabela 6 “spots” observados na análise proteômica do antígeno da cepa BH400 crescida

em meio Alfa-MEM. ............................................................................................ 75

XIV

LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2-DE – eletroforese bidimensional em gel 2-D

- alfa

X – vezes

® - Registrado

nm – nanômetro

µl – microlitro

µm – micrometro

mm – milímetro

n – Número de animais por grupo

g – micrograma

mg – miligrama

g – grama

g/dl – grama por decilitro

g/l – grama por litro

kg – kilograma

ml – mililitro

rpm – rotação por minuto

-MEM - -Minimum Essential Medium

CCZ – Centro de Controle de Zoonoses

CD4 - Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T auxiliares

CD8 - Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T citotóxicos

CO2 – Dióxido de carbono

DNA – Ácido desoxirribonucléico

XV

EM- espectrometria de Massa

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ensaio Imunoenzimático)

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético (anticoagulante)

IC – intervalo de confiança

ICB – Instituto de Ciências Biológicas

IFN-γ- Interferon-gama

IgA – Imunoglobulina da classe A

IgE – Imunoglobulina da classe E

IgG - Imunoglobulinas G

IgG1 – Imunoglobulinas da subclasse G1

IgG2 – Imunoglobulinas da subclasse G2

IgM – Imunoglobulina da classe M

IL-2 – Interleucina 2

IM – Intramuscular

IV – Intravenosa

K39 – Antígeno recombinante K39

LIT - Liver Infusion Tryptose

LV - Leishmaniose Visceral

LVC - Leishmaniose Visceral Canina

MG – Minas Gerais

MS – Ministério da Saúde

NNN - NICOLE, NOVY e NEAL

OMS – Organização Mundial de Saúde

PBS – Phosphate Buffer Saline

PCR - Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

pH – Potencial hidrogeniônico

XVI

PVC - Cloreto de polivinil

PVPI - Polivinil pirrolidona iodo 10%

RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta

RNA – Acido Ribonucléico

ROC - Receiver operating characteristic

SC – Subcutânea

SFB- soro fetal bovino

SFM - Sistema fagocítico mononuclear

SRD - Sem Raça Definida

Th – Célula T helper

TNF - Fator de Necrose Tumoral

UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais

UI/L - Unidade Internacional por litro

WHO – World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)

XVII

Sumário

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 15

1.1 Leishmanioses ....................................................................................................... 15

1.2 Ciclo de vida da Leishmania sp. ............................................................................ 16

1.3. Leishmanioses no Brasil ....................................................................................... 18

1.3.1 Leishmaniose Tegumentar (LT).......................................................................... 18

1.3.2. Leishmaniose Visceral....................................................................................... 20

1.3.2.1 Leishmaniose Visceral Canina .................................................................. 22

1.3.2.2 Manifestações Clínicas ............................................................................. 22

1.4 Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina ...................................................... 25

1.4.1 Diagnóstico Clínico ............................................................................................ 25

1.4.2 Diagnóstico Laboratorial .................................................................................... 26

1.4.2.1 Diagnóstico Parasitológico ....................................................................... 26

1.4.2.2 Diagnóstico Imunológico ......................................................................... 27

1.5 Controle da Leishmaniose Visceral no Brasil ........................................................ 33

2. JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 35

3. OBJETIVOS ......................................................................................................... 38

3.1.Objetivo Geral ....................................................................................................... 38

3.2. Objetivos Específicos ........................................................................................... 38

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 39

4.1 Delineamento Experimental .................................................................................. 39

4.1.2 Seleção dos Animais .......................................................................................... 39

4.1.3 Obtenção dos parasitos ....................................................................................... 39

4.2 Seleção dos Animais e Coleta de Material ............................................................. 40

4.3 Avaliação Parasitológica dos Animais ................................................................... 41

4.3.1 Esfregaço por extensão ....................................................................................... 41

4.3.2 Cultura de medula óssea ..................................................................................... 41

4.3.3 Reação em cadeia da polimerase - PCR .............................................................. 41

4.4 Preparo dos Antígenos........................................................................................... 44

4.4.1 Curva de Crescimento ........................................................................................ 44

4.4.2 Obtenção de parasitos para o Preparo dos Antígenos .......................................... 45

4.4.2.1 Preparação do Antígeno para Sensibilização das Placas de ELISA ........... 45

4.4.2.2 Obtenção de Parasitos e Preparação do antígeno para RIFI ....................... 46

4.4 2.3 Preparação do Antígeno para Eletroforese-Extração de Proteínas ............. 46

4.5 Testes dos Antígenos ............................................................................................. 47

4.5.1 Reação de Imunofluorescência Indireta- RIFI ..................................................... 47

4.5.2 Enzime Linked Immunosorbent Assay - ELISA ................................................. 48

4.5.2.1 Curva ROC - Receiver Operating Characteristic ....................................... 49

4.5.3 Eletroforese Bidimensional (2-DE) ..................................................................... 50

4.5.3.1 Focalização Isoelétrica (IEF) – ................................................................. 50

XVIII

4.5.3.2 SDS-PAGE .............................................................................................. 50

4.5.3.3 Western blot - 2D gel ............................................................................... 50

4.5.3.4 Análise dos Géis- ..................................................................................... 51

4.6 Análise Estatística ................................................................................................. 51

5. RESULTADOS ..................................................................................................... 53

5.1 Seleção dos animais .............................................................................................. 53

5.2 Curva de Crescimento e Produção dos Antígenos .................................................. 53

5.3 Teste dos Antígenos .............................................................................................. 55

5.3.1 Reação de ELISA ............................................................................................... 55

5.3.2 Reação de Imunofluorescência Indireta .............................................................. 61

5.4 Reações de RIFI e ELISA com os kits de Biomanguinhos ..................................... 64

5.5 Relação entre os títulos da RIFI e os valores de absorbância do ELISA ................. 66

5.5.1 Avaliação dos antígenos com melhor desempenho nos testes de ELISA com 24

horas, três meses e seis meses após a sensibilização das placas. ............................ 70

5.6 Teste de Reações Cruzadas .................................................................................... 73

5.7 Escolha do melhor antígeno................................................................................... 73

5.8 Western blot - 2D gel ............................................................................................ 73

6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 77

7. PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................................... 94

8. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 95

9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................. 96

10 . ANEXOS........................................................................................................... 111

10.1 Depósito da Patente do Antígeno ....................................................................... 111

10.2 Certificado do Comitê de Ética em Experimentação Animal – CETEA ............. 114

10.3 Artigo Publicado ............................................................................................... 115

1. Introdução

1.1 Leishmanioses

Leishmanioses são doenças parasitárias geralmente, de caráter zoonótico,

causadas por protozoários do gênero Leishmania, Ross, 1903, pertencentes à Família

Trypanosomatidae (Woodcock, 1906), Ordem Kinetoplastida (Honigberg, 1963;

Vickerman, 1976), Filo Sarcomastigophora (Halstead, 1965) e Subreino Protozoa. Estes

parasitos digenéticos são transmitidos ao homem pela picada da fêmea infectada do

inseto vetor, pertencente à Ordem Diptera, Família Psychodidae e Subfamília

Phlebotominae e aos gêneros Lutzomyia em países do Novo Mundo, e Phlebotomus, em

países do Velho Mundo (Lainson & Rangel, 2005).

Com uma estimativa de prevalência global de 14 milhões de casos, e largamente

distribuídas em cinco continentes, as leishmanioses são endêmicas em 90 países.

Destes, 72 estão em desenvolvimento e neste grupo, estão incluídos 13 com a menor

taxa de desenvolvimento mundial (Desjeux, 2004). Cerca de 90% dos casos de

leishmaniose visceral em todo mundo são registrados na Índia, Nepal, Sudão

Bangladesh e com menos evidência no Brasil, sendo as áreas suburbanas e rurais destes

países as mais afetadas.

A leishmaniose tegumentar, por sua vez, afeta principalmente sete países: Brasil,

Afeganistão, Iran, Peru, Arábia Saudita, Síria e Argélia, sendo os mesmos responsáveis

por cerca de 90% dos casos desta forma da doença (Monteiro et al., 1994; WHO, 2000;

Desjeux, 2004). A estimativa é que 12 milhões de pessoas estejam acometidas pela

doença e que 350 milhões estejam expostas ao risco de infecção. Acredita-se que, a cada

ano, surjam 1,5 milhões de casos de leishmaniose tegumentar e 500 mil novos casos de

leishmaniose visceral (WHO, 2000; Alvar et al., 2004; Desjeux, 2004).

Considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma das principais

doenças negligenciadas, as leishmanioses são endêmicas em regiões tropicais,

subtropicais e temperadas do Velho e do Novo Mundo. O Programa Especial para

Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais (TDR), que tem como foco as doenças

negligenciadas, que afetam populações pobres e marginalizadas, coloca as

leishmanioses como afecções prioritárias entre as endemias abordadas pelo programa,

16

sendo considerada a segunda doença, em importância médica, entre as doenças causadas

por protozoários, vindo logo depois da malária (WHO, 2007).

Aproximadamente 21 espécies de Leishmania, pertencentes aos subgêneros

Leishmania e Viannia (esse último presente apenas no Novo Mundo), podem infectar o

homem, dando lugar a uma ampla variedade de quadros clínicos. As manifestações

clínicas são dependentes de vários fatores, como a espécie de Leishmania envolvida, sua

virulência, vetores e aspectos ligados ao hospedeiro, como sua resposta imune e seu

estado nutricional, entre outros (Reithinger et al., 2007; Piscopo et al., 2006).

A infecção caracteriza-se pelo parasitismo das células do sistema fagocítico

mononuclear (SFM) da derme, das mucosas ou de órgãos como o fígado, baço, medula

óssea e outros órgãos do hospedeiro vertebrado, estando associada à alta morbidade na

forma tegumentar e a alta mortalidade na forma visceral. As manifestações clínicas da

infecção variam desde infecções inaparentes ou subclínicas, a um amplo espectro de

manifestações, envolvendo o tegumento (pele e mucosas) com lesões de diferentes

graus de gravidade, podendo se apresentar sob forma de lesão cutânea localizada, com

cura espontânea, até lesões mucosas desfigurantes, graves e ainda, apresentar-se sob a

forma de lesões nos órgãos internos, sobretudo as vísceras, com quadros graves muitas

vezes fatais, quando não tratados (Alvar et al., 2004).

1.2 Ciclo de vida da Leishmania sp.

O gênero é constituído por protozoários que possuem um ciclo de vida

heteroxeno, sendo encontrados no trato digestório do hospedeiro invertebrado (insetos

hematófagos da família Psychodidae da subfamília Phlebotominae), nas formas

flageladas denominadas promastigotas e paramastigotas, reproduzindo-se por divisão

binária. Estas formas passam por mudanças morfológicas, fisiológicas e bioquímicas,

diferenciando-se no final do ciclo, pelo menos em parte, em promastigotas metacíclicas

infectantes que invadem o esôfago e faringe do inseto, mas não se multiplicam e não se

ligam ao epitélio intestinal do tubo digestório dos flebotomíneos (Killick-Kendrick,

1979; Bates & Rogers, 2004; Glossage et al., 2003; Bates, 2007). A infecção da fêmea

de L. longipalpis, por exemplo, ocorre quando esta, ao exercer o repasto sanguíneo em

um hospedeiro vertebrado infectado, ingere juntamente com componentes tissulares,

formas amastigotas livres ou presentes no interior de macrófagos da derme. (Lainson &

Rangel, 2005). As fêmeas tornam-se infectantes três a quatro dias após o repasto

sanguíneo (Lainson & Rangel, 2005).

17

Os vetores são específicos, bem definidos e variações nas moléculas de

superfície dos parasitos facilitam o sucesso da infecção no vetor apropriado (Sacks,

1992). Nos hospedeiros mamíferos os parasitos são encontrados na forma aflagelada

denominada amastigota, no interior de células fagocíticas mononucleares,

principalmente macrófagos. Como hospedeiros mamíferos estão incluídos grande

variedade de animais: roedores, edentados (tatu, tamanduá, preguiça), canídeos,

marsupiais e primatas, incluindo o homem. Quando o flebotomíneo infectado com

Leishmania sp. alimenta-se por telmatofagia (sangue, líquido intersticial e restos

celulares) em um mamífero susceptível, inocula junto com sua saliva as formas

infectantes promastigotas metacíclicas presentes na probóscide. A infecção dependerá

do número de formas metacíclicas presentes nas peças bucais neste momento e da

imunocompetência do hospedeiro. A saliva de L. longipalpis, por exemplo, apresenta

importância fundamental no processo de infecção, pois contém maxidilam, que entre

outras atividades apresenta capacidade vasodilatadora e antiplaquetária, mantendo o

fluxo sanguíneo e dificultando a coagulação, facilitando desta forma a inoculação dos

parasitos (Killick-Kendrick, 2002).

Os parasitos que são então fagocitados, primeiramente, por neutrófilos, perdem o

flagelo transformando-se em amastigotas, e horas depois são fagocitados por

macrófagos, processo mediado por receptores (Cunningham, 2002; de Almeida, 2003).

Os parasitos são internalizados no vacúolo parasitóforo, que logo se fusiona com os

lisossomos, dando origem ao vacúolo fagolissosomal, onde o parasito permanece em

um ambiente hostil, contendo enzimas lisossomais e metabólitos reativos do oxigênio,

mecanismos de sinalização celular, produção de óxido nítrico e citocinas (Cunningham,

2002).

No entanto, Leishmania sp. está adaptada para sobreviver neste ambiente, pois é

capaz de inibir diversos mecanismos de defesa celular que deveriam causar sua lise, e

então se multiplicar por divisão binária, até levar a ruptura da célula infectada e liberar

formas amastigotas que são fagocitadas por outros macrófagos (Peters, 2008). Ocorre

então a disseminação linfática ou sanguínea para outros tecidos ricos em células do

sistema mononuclear fagocitário (Sacks & Noben-Trauth, 2002; Lainson & Rangel,

2005; Little, 2006). A infecção, nas formas viscerais, dissemina-se para linfonodos,

baço e medula óssea dentro das primeiras horas (Kontos, 1993; Baneth, 2006).

18

Em camundongos demonstrou-se que os macrófagos, as células dendríticas e as

células de Langerhans, infectadas por parasitas, atuam como células apresentadoras de

antígenos face às células imunocompetentes, particularmente aos linfócitos T-auxiliares

ativando linfócitos (CD4+) Th1 ou Th2. Se forem ativadas preferencialmente as células

Th1 ocorre a produção de citocinas pró-inflamatórias, as quais aumentam a eficiência

das células fagocíticas e de linfócitos citotóxicos, podendo haver controle do

parasitismo, com a eliminação da infecção. Em contraste, quando a infecção está

associada à indução de linfócitos Th2, ocorre a produção de citocinas antiinflamatórias,

proliferação de células B com subseqüente produção de imunoglobulinas, sobretudo

IgG e IgM e desenvolvimento da infecção (Wilson, 1993; Pinelli et al., 1994; Feitosa et

al., 2000; Ferrer, 2002a; Ciaramella, 2003). Potencialmente, quando há ativação de

linfócitos Th2 há uma atividade exuberante de linfócitos B com a geração de uma

grande quantidade de imunocomplexos circulantes, causando danos em vários órgãos

(Kontos, 1993; Ferrer et al., 1995; Noli, 1999; Feitosa et al., 2000; Ciaramella, 2003;

Baneth, 2006). Na enfermidade natural, estão ativados tanto os subtipos Th1 quanto

Th2, sendo que a variedade dos sintomas e a gravidade da doença dependem do

equilíbrio entre esses subtipos de linfócitos T(Pinelli et al., 1994; Feitosa et al., 2000;

Ezquerra, 2001).

1.3. Leishmanioses no Brasil

No Brasil as leishmanioses podem provocar quadros de lesões cutâneas,

mucosas, ou viscerais, e pode ser classificada em grupos, de acordo com suas

manifestações clínicas (Silveira et al., 2004).

1.3.1 Leishmaniose Tegumentar (LT)

A Leishmaniose Tegumentar (LT) é uma doença infecciosa, não contagiosa,

causada por diferentes espécies de Leishmania sp. que acometem pele e mucosas. O

número de casos no mundo tem aumentado durante as últimas décadas, e este aumento

pode ser explicado, em parte, pelos diagnósticos não confirmados, pela ausência de

notificações de casos, mas é também resultado do controle inadequado de vetores ou

reservatórios, o que aumenta a detecção da LT associada a infecções oportunistas.

Contudo, pelo fato de algumas infecções serem assintomáticas ou não diagnosticadas, o

número global de casos de LT pode estar sendo subestimado.

19

Os ciclos de transmissão têm se adaptado ao peridomicílio e expandido para

áreas não endêmicas, como resultado da urbanização e desmatamento, sendo os animais

domésticos potenciais reservatórios. Adicionalmente, problemas econômicos, desastres

naturais, conflitos entre povos e o turismo, causam migrações de populações

susceptíveis para áreas endêmicas de LT. Estas populações tornam-se expostas ao risco

de infecção, o que facilmente resulta em epidemias (Reithinger et al., 2007).

Nas Américas, a LT, globalmente conhecida como Leishmaniose Tegumentar

Americana (LTA) é primariamente, uma infecção zoonótica, afetando outros animais

que não o ser humano, o qual pode ser envolvido secundariamente. Apresenta ampla

distribuição, com registro de casos em todas as regiões brasileiras (Brasil – Ministério

da Saúde, 2007).

A LTA clinicamente, se apresenta sob diferentes formas que podem ser

subdivididas em leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose cutânea difusa

(LCD), leishmaniose cutânea disseminada (LCDs) e leishmaniose mucocutânea (LMC)

(Silveira et al., 2004).

Dentre os aspectos clínicos da LTA destacam-se lesões de pele com úlceras

localizadas ou múltiplas, o que representa a forma mais freqüente da doença. A LTA

pode ter como agente etiológico qualquer espécie dos subgêneros que podem causar

formas tegumentares no homem, no Novo Mundo. No entanto, a Leishmania (Viannia)

braziliensis é considerada como a mais prevalente, associada a esta forma de doença.

Apresenta acometimento primário da pele, com lesão única ou lesões múltiplas,

geralmente do tipo ulcerado, que algumas vezes tem tendência à cura espontânea ou

apresenta boa resposta ao tratamento.

A LCD é caracterizada por lesões nodulares disseminadas por todo o corpo, ricas

em amastigotas (Silveira et al., 2004). Constitui uma forma clínica rara, porém grave,

que ocorre em pacientes com anergia e deficiência específica na resposta imune celular

a antígenos de Leishmania (Brasil, Ministério da Saúde - 2007).

A LCDs, também é uma manifestação relativamente rara, caracterizada pelo

aparecimento de múltiplas e até centenas de lesões papulares e de aparência acneiforme,

que acometem vários segmentos corporais, envolvendo com freqüência a face e o

tronco.

20

A LMC manifesta-se por lesões destrutivas localizadas nas mucosas das vias

aéreas superiores (Silveira et al., 2004). Geralmente surge após a cura clínica da LTA e

na maioria dos casos, resulta de uma LTA de evolução crônica e clinicamente resolvida

(lesões cicatrizadas) com ou sem tratamento ou com tratamento inadequado, mas pode

aparecer concomitantemente à lesão cutânea. (Brasil, Ministério da Saúde - 2007).

Aproximadamente 30 espécies ou subespécies de flebotomíneos são vetores

comprovados de leishmanioses, e mais de 40 espécies estão provavelmente envolvidas

na transmissão (Lainson & Rangel, 2005). No Brasil, as principais espécies de

flebotomíneos envolvidas na transmissão da LTA são: Lutzomyia flaviscutellata, L.

whitmani, L. umbratilis, L. intermedia, L. wellcomei e L. migonei (Shaw, 2003).

1.3.2. Leishmaniose Visceral

A Leishmaniose Visceral (LV) ou Calazar é considerada a forma mais grave da

doença, estando associada à alta mortalidade quando não tratada. É causada por espécies

de Leishmania, pertencentes ao complexo L. (Leishmania) donovani: L. (L.) donovani,

L. (L.) infantum e L.(L.) chagasi, sendo que estas duas últimas foram consideradas por

alguns autores como sendo a mesma espécie, pois a comparação destes parasitos

utilizando-se de métodos bioquímicos e moleculares não demonstrou diferenças entre os

mesmos (Maurício et al., 2000; 2001).

No Brasil o agente etiológico da LV é a L. (L) chagasi (=L. (L.)

infantum). Os insetos vetores vivem em ambientes variados, mas suas formas imaturas

se desenvolvem em ambientes terrestres úmidos, ricos em matéria orgânica e de baixa

incidência luminosa (Rey, 2001b; Neves, 2005). Têm atividade no crepúsculo matutino

e vespertino para picar os seus hospedeiros (Little, 2006). Duas espécies estão

relacionadas com a transmissão de L. chagasi: Lutzomyia longipalpis, que é considerada

a principal transmissora e L. cruzi, descrita como vetora no Estado de Mato Grosso do

Sul (Elkhoury, 2005).

Os reservatórios estão restritos a um grupo específico de mamíferos,

particularmente os pertencentes à família Canidae, podendo ainda ter envolvimento de

outros animais reservatórios secundários. As raposas Dusicyon vetulus (=Lycalopex

vetulus), no Nordeste (Deane, 1956) e Cerdocyon thous, na Amazônia (Curi et al., 2006;

Lainson & Shaw, 1987) são os principais reservatórios silvestres. Como reservatório

doméstico, o cão (Canis familiaris) é a principal fonte de infecção para os

flebotomíneos, sendo considerado o responsável pela persistência da LV nas regiões

21

neotropicais (Melo, 2004), atribuindo-se aos demais canídeos a responsabilidade pela

transmissão e manutenção do ciclo silvestre da doença (Melo, 2004). L. chagasi já foi

descrita também em outros animais como os marsupiais (Didelphis albiventris e D.

marsuialis), roedores (Rattus rattus, Nectomys squamipes, Proechimys canicollis) e

gato doméstico (Felis catus) (Dantas-Torres & Brandão-Filho, 2006; Silva et al., 2010).

Entretanto, o papel destes animais em relação à epidemiologia da LV carece de mais

estudos, para determinar sua relevância no contexto da transmissão ao homem (Dantas-

Torres & Brandão-Filho, 2006; Silva et al., 2010).

Ao contrário do que ocorre com L. donovani na Índia, na transmissão de L.

chagasi, o homem serve apenas como fraca fonte de infecção para os flebotomíneos. Já

o cão e as raposas por apresentarem intenso parasitismo cutâneo, serem altamente

susceptíveis à infecção são os principais reservatórios, soma-se a isto, no caso dos cães

que sua convivência e proximidade ao homem, preenchem as condições necessárias

para serem considerados reservatórios da doença no ambiente peridomiciliar e urbano

(Deane & Deane, 1954; Melo, 2004; Dantas-Torres & Brandão-Filho, 2006). Outros

fatores a serem considerados, de igual importância no favorecimento da infecção dos

vetores, baseiam-se nas evidências que a LV é mais prevalente na população canina que

na humana, e também a constatação de que os casos humanos normalmente são

precedidos por casos caninos (Castro, 1996; Santa Rosa, 1997; Scott et al, 2001;

Baneth, 2006).

No passado a LV era descrita como uma doença de ambientes silvestres ou

rurais, entretanto, as transformações ambientais provocadas pelo intenso processo

migratório e o processo de urbanização crescente levaram a uma expansão das áreas

endêmicas, com o aparecimento de novos focos, apontando a enfermidade como uma

doença reemergente (Castro, 1996; Alves, 2004; Melo, 2004).

Cerca de 90% dos casos humanos de LV das Américas ocorrem no Brasil, sendo

que a doença já foi identificada em 25 unidades da Federação, em todas as regiões

geográficas. Mostra ainda, nítida expansão com crescente número de casos, resultado de

fatores como urbanização acelerada e alterações do meio ambiente. A doença

concentrou no Nordeste, na década de 1990-2000, onde ocorreram quase 90% de todos

os casos registrados no país, especialmente nos estados do Piauí, Maranhão, Bahia e

Ceará, devido a fatores climáticos favoráveis, temperatura e vegetação (Bavia et al.,

2005). Entre 2000 e 2009 foram registrados 44.440 casos em todo o país (Brasil-

22

Ministério da Saúde, 2010). Entretanto, a região Nordeste representou 47,5% dos casos,

seguida pelas regiões Norte (19,2%), Sudeste (17,4%), Centro-Oeste (7,4%) e Sul

(0,2%).

Após o registro da primeira epidemia em Terezina, no Piauí, na década de 1980,

o processo de urbanização se intensificou com a ocorrência de importantes epidemias

em várias cidades da região Nordeste, como São Luís, Natal, e Aracaju; Norte (Boa

Vista e Santarém); Sudeste (Belo Horizonte, Montes Claros e Araçatuba) e Centro

Oeste (Cuiabá e Campo Grande). Atualmente são 1235 municípios brasileiros atingidos

pela doença e em 130 a condição de transmissão é considerada intensa pela

classificação do Ministério da Saúde (Brasil-Ministério da Saúde, 2010).

Em Minas Gerais a doença ocorre desde a década de 1940, quando foram

registrados os primeiros casos humanos na região norte do estado. Nessa época a doença

era tipicamente rural. Atualmente, 75% dos casos notificados em Minas Gerais

correspondem à pacientes residentes em zonas urbanas. Em 1989 a doença foi

notificada na região metropolitana da capital mineira (Melo, 2004). Belo Horizonte

experimenta hoje duas situações epidêmicas que caracterizam a LV, a epidemia humana

e a epidemia canina. De 1994 a 2009 foram notificados 1.215 casos humanos de

leishmaniose visceral, sendo que de 2005 a 2009 ocorreram 658 casos com 85 óbitos.

Embora os dados possam não representar a realidade do município de Belo Horizonte,

dadas às dificuldades de coleta e diagnóstico, no mesmo período foram coletadas

705.592 amostras de material canino e destas, 57.570 (8,1%) estavam positivas para

leishmaniose (PBH, 2010 http//portalpbh.pbh.gov.br)

No Estado de São Paulo, a doença canina foi identificada pela primeira vez no

município de Araçatuba no ano de 1998 e, desde então, já foi descrita em 41

municípios, difundindo-se para outras regiões do estado, inclusive com casos autóctones

identificados na região metropolitana da cidade de São Paulo a partir do ano de 2005

(São Paulo, 2003; Reichman, 2006).

1.3.2.1 Leishmaniose Visceral Canina

1.3.2.2 Manifestações Clínicas

Admite-se, para a Leishmaniose Visceral Canina (LVC), um período de

incubação de três meses a vários anos e uma apresentação clínica nos animais

23

acometidos, partindo de total ausência de sinais até graves sintomas clínicos (Alvar et

al., 2004; Grima, 2005). Os animais podem ser classificados em: assintomáticos,

oligossintomáticos e sintomáticos (Mancianti et al.,1988). Uma importante

característica da doença canina é a habilidade do cão permanecer clinicamente sem

sinais da doença por longos períodos (Marzochi et al.,1986).

Cerca de 50% a 60% de todos os cães portadores de formas amastigotas não

exibem qualquer sinal clínico da doença, e 20% destes animais apresentam parasitos na

pele (Alvar et al., 2004; Baneth, 2006). Com o passar do tempo, pode haver progressão

para doença sintomática, ao menos que a replicação das amastigotas seja cessada por

mecanismos imunológicos. Aproximadamente 15% dos animais infectados são

clinicamente resistentes, ou seja, capazes de recuperar dos sintomas clínicos e eliminar

os parasitos espontaneamente (Alvar et al., 2004), enquanto outros, considerados

suscetíveis, são predispostos à desenvolverem uma infecção e doença sintomática

(Little, 2006).

As manifestações clínicas da LVC geralmente são classificadas como sendo do

tipo visceral ou cutânea, sendo que em alguns casos há sobreposição destas

manifestações (Amusategui et al., 2003; Baneth, 2006).Os sintomas variam em

decorrência dos mecanismos imunológicos ativados pelo hospedeiro, e também em

relação aos órgãos acometidos. O período inicial da infecção, geralmente cursa como

uma síndrome geral inespecífica, que pode passar despercebida (Grima, 2005). Os sinais

clínicos no cão e no homem são muito parecidos e, freqüentemente, incluem alterações

inespecíficas tais como, apatia, emagrecimento progressivo, hiporexia ou anorexia,

linfoadenomegalia, hepatoesplenomegalia e hipertermia (Feitosa et al, 2000).

Linfoadenomegalia generalizada e esplenomegalia são alterações bastante comuns

causadas por uma proliferação intensa de linfócitos B, histiócitos e macrófagos em

resposta à presença do parasito (Kontos, 1993; Strauss-Ayali et al., 2000; Ciaramella,

2003). O aumento da produção de imunoglobulinas não é protetor e potencialmente

pode ser prejudicial para o animal, sendo um dos resultados da hipergamaglobulinemia,

a formação de grande quantidade de imunocomplexos circulantes que, uma vez

depositados na parede dos vasos sanguíneos, resulta em vasculites e predispõe a eventos

hemorrágicos e alterações da função do órgão (Lopez et al., 1996). Estas manifestações

são acompanhadas por alterações hematológicas e bioquímicas como anemia

normocítica e normocrômica com caráter regenerativo ou arregenerativo,

24

trombocitopenia, leucopenia. Uma leucocitose por neutrofilia, quando presente está

normalmente associada a um quadro de infecção bacteriana secundária. As alterações

em linfócitos são mais raras, porém a presença de monocitose é comum, muitas vezes

acompanhada de grande ativação de monócitos. As alterações da urinálise ou de

avaliações bioquímicas refletem, normalmente, um comprometimento renal ou hepático

em decorrência da doença. O aumento das proteínas totais do soro com inversão da taxa

albumina/globulina é um achado freqüente. Eletroforese de proteínas revela um

decréscimo significante na concentração de albumina e um aumento combinado de e

globulinas (Burillo et al., 1994; Campino, 2003; Baneth, 2006).

A perda de peso está quase sempre relacionada ao envolvimento visceral,

podendo ocorrer mesmo em cães com normorexia (Feitosa et al, 2000). Os cães podem

ainda apresentar uma atrofia muscular proeminente, particularmente em musculatura

facial e temporal (Kontos, 1993). É comum a ocorrência de hipertermia intermitente,

com valores de temperatura variando entre 40,5ºC e 41ºC (Feitosa et al, 2000).

As alterações dermatológicas são de variável extensão e caracterização. A

maioria dos autores afirma que em entre 60% e 90% dos cães infectados apresentam

algum tipo de lesão dermatológica (Amusategui et al., 2003; Alvar et al., 2004; Baneth,

2006). O cão pode apresentar tanto um pêlo seco como uma seborréia oleosa,

acompanhada ou não de prurido e, muitas vezes, com contaminação bacteriana

secundária quanto excessiva descamação cutânea que pode, eventualmente, tornar-se

disseminada por todo o corpo. É comum a observação de áreas de rarefação pilosa e

alopecia, associadas ou não à ocorrência de úlceras cutâneas (Slappendel, 1988; Feitosa

et al, 2000; Scott et al., 2001). Em locais correspondentes a saliências ósseas pode-se

observar tanto áreas de hiperqueratose e lignificação como áreas ulceradas, as quais

estão, freqüentemente, relacionadas a uma ação direta do parasita ou a uma vasculite

necrosante causada pela deposição de imunocomplexos (Ciaramella et al., 1997).

Alguns cães apresentam despigmentação cutânea, principalmente no plano nasal. A

onicogrifose é um achado relativamente comum e é causada pela presença do parasita

estimulando a matriz ungueal (Slappendel, 1988; Feitosa et al., 2000; Scott et al., 2001).

As alterações oftálmicas acometem preferencialmente o segmento anterior do

globo ocular, sendo mais comum a blefarite associada à dermatite facial, embora não

seja raro observar ceratoconjuntivite seca (Ciaramella et al., 1997; Noli, 1999). A

uveíte, geralmente bilateral, pode ser observada em associação com edema de córnea e

25

formação de sinéquias devido à presença de Leishmania ou como conseqüência da

deposição de imunocomplexos na íris e corpo ciliar (Feitosa, 2006). Em Belo Horizonte,

Fulgêncio (2006) encontrou uma prevalência de manifestações oculares e perioculares

em 48% de 100 cães recolhidos pelo Centro de controle de Zoonoses da Prefeitura

Municipal de Belo Horizonte, com diagnóstico de LV.

Muitos cães com LV apresentam epistaxe, normalmente unilateral, moderada e

intermitente. A provável causa é uma combinação de lesões ulcerativas e inflamatórias

na mucosa nasal (Kontos, 1993; Ciaramella & Corona, 2003). É possível ainda,

observar animais com quadro de diarréia crônica devido à presença de ulcerações de

mucosa gástrica e intestinal, resultando em fezes aquosas acompanhadas de

hematoquezia ou melena (Ciaramella & Corona, 2003).

A deposição de imunocomplexos nos rins eventualmete resulta em

glomerulonefrite membranoproliferativa e nefrite tubulointersticial, podendo evoluir

para uma insuficiência renal crônica (Kontos, 1993; Ferrer, 2002b).

Dentre os sintomas neurológicos já observados em cães naturalmente

acometidos por leishmaniose visceral destacam-se as convulsões, as alterações em pares

de nervos cranianos (estrabismo, ptose facial e disfagia), alterações de locomoção tais

como andar compulsivo e em círculos, lesões vestibulares evidenciadas por ataxia e

nistagmo e, alterações cerebelares com ocorrência de tremor de intenção. Tais sintomas

podem ser decorrentes da deposição de imunocomplexos ou por infecções oportunistas

no sistema nervoso central (Ciaramella et al., 1997; Feitosa et al., 2005).

1.4 Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina

1.4.1 Diagnóstico Clínico

O diagnóstico da LVC só deve ser estabelecido após uma combinação da

sintomatologia clínica apresentada pelo animal com o resultado de exames

parasitológicos, sorológicos e moleculares (Ferrer, 1999; Alvar et al., 2004). O

diagnóstico puramente clínico da LVC torna-se impossível devido ao fato de que os

sinais clínicos, quando presentes, podem ser confundidos com os de outras doenças

(Feitosa et al., 2000; Gradoni, 2002; Singh et al., 2003; Feitosa, 2006). Embora a

prevalência da infecção em áreas endêmicas possa chegar a mais de 50%, a prevalência

da doença varia entre 3 e 10%, demonstrando que a maioria dos cães infectados não

26

desenvolve sintomas, dificultando mais ainda o diagnóstico (Ferrer, 2002a). Esses

animais podem permanecer assintomáticos por toda a vida ou desenvolver sintomas

após períodos que variam de três meses a alguns anos (Ferrer et al., 1995). Assim o

diagnóstico laboratorial torna-se necessário para confirmar a suspeita clínica, sendo que

fatores como a agilidade e confiabilidade dos resultados são importantes para as

medidas de controle, por ser o cão um elo importante da cadeia epidemiológica,

sobretudo, em áreas urbanas de LV.

1.4.2 Diagnóstico Laboratorial

1.4.2.1 Diagnóstico Parasitológico

Embora haja discordância entre alguns autores, o exame parasitológico é ainda

considerado, o padrão ouro no diagnóstico da doença (Dye et al., 1993; Leontides et al.,

2002; Singh et al., 2003). Podem ser observadas formas amastigotas do parasita em

esfregaços de linfonodos, medula óssea, aspirado esplênico, biópsia hepática e

esfregaços sangüíneos corados com corantes de rotina derivados de Romanowsky,

Giemsa ou Leishman, como o Wright e Panótico. Na dependência do tempo despendido

procurando o parasita, a sensibilidade passa a ser de, no máximo, 80% em cães

sintomáticos e menor em cães assintomáticos. A sensibilidade depende do grau de

parasitismo e seu valor relativo dificilmente pode ser analisado devido à falta de

uniformidade no critério de escolha do tipo de material biológico coletado e do tempo

de leitura da lâmina (Wolschrijn et al., 1996). Em alguns pacientes a visualização de

parasitas é muito laboriosa e os resultados negativos não são incomuns, especialmente

nos casos crônicos (Slappendel, 1988; Ikeda-Garcia et al, 2006). A semeadura, em meio

de cultura apropriado para o crescimento de Leishmania, é capaz de aumentar a

sensibilidade destes testes em até 20%. Estes exames permitem, diante da positividade,

o diagnóstico de certeza da infecção (Alvar et al., 2004). A inoculação de amostras de

tecidos em animais de laboratório, sobretudo em hamsters (Mesocricetus auratus),

necessita de longo tempo para a positividade (na nossa experiência 1 a 4 meses).

O exame histopatológico de fragmentos da pele e linfonodos pode ser usado

como método de diagnóstico, mas deve-se considerar que o infiltrado inflamatório

encontrado não é específico de LVC e que apenas o encontro das formas amastigotas dá

o diagnóstico de positividade (Costa Val, 2004). As técnicas de imunohistoquímica

(IHQ) podem melhorar os problemas relacionados à evidenciação do parasito, pois

27

anticorpos específicos marcados detectam com maior sensibilidade e especificidade as

formas amastigotas nos cortes de tecidos (Tafuri et al., 2004).

O xenodiagnóstico é uma técnica aplicada para detecção e isolamento do

parasito utilizando-se o vetor artrópode natural (Guarga et al., 2000). Embora não possa

ser considerada como uma técnica de rotina no diagnóstico da Leishmania ela

representa grande papel na resolução de questões epidemiológicas relacionadas ao

quadro clínico e evolução no tratamento de cães acometidos por LV (Gradoni, 2002;

Alvar et al., 2004).

Uma vez que a sensibilidade das técnicas sorológicas e de demonstração do

parasita, geralmente empregadas no diagnóstico da LV canina em áreas endêmicas é

geralmente insuficiente (Fisa et al., 2001), e que os métodos sorológicos necessitam de

níveis elevados de anticorpos e não fazem distinção entre as fases da doença quando os

níveis de imunoglobulinas estão próximo ou no ponto de corte (Aisa et al., 1998), os

testes que identificam o antígeno por métodos que empregam a biologia molecular

assumem grande importância (Tavares et al, 2003). Dentre as técnicas existentes, a

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem se mostrado muito útil, tanto no

diagnóstico quanto no acompanhamento de cães com LV (Ferrer, 1997), pelo aumento

da sensibilidade associado á grande especificidade (Fisa et al., 2001).

A PCR que se baseia na amplificação de uma seqüência conhecida de

oligonucleotídeos específicos do patógeno (DNA genômico ou do cinetoplasto), mostra

sensibilidade e especificidade que podem variar dependendo de fatores como tipo de

iniciadores, número de cópias do alvo dos iniciadores, método de extração do DNA,

natureza do material biopsiado, densidade parasitária da amostra e protocolo escolhido

para a reação. Apresenta como vantagem sua realização em grande variedade de

materiais clínicos, como sangue, aspirados de medula ou linfonodos, biópsias de pele,

urina, material colhido na conjuntiva do animal com swab (swab conjuntival), dentre

outros (Alvar et al., 2002; Tavares et al, 2003; Alvar et al, 2004).

1.4.2.2 Diagnóstico Imunológico

A hipergamaglobulinemia, principalmente de IgG, apresentada pelos animais

permite que técnicas menos invasivas identifiquem sorologicamente o animal acometido

por LV através da detecção de anticorpos anti-Leishmania (Bray, 1980; Tavares et al.,

28

2003). A soroconversão ocorre aproximadamente três meses após a infecção e os títulos

permanecem elevados por, pelo menos, dois anos. Entretanto, os testes sorológicos

devem ser interpretados com cautela, uma vez que não são 100% sensíveis e falham em

detectar cães infectados no período pré-patente e, portanto, antes da soroconversão, cães

que nunca farão soroconversão e cães soropositivos que se convertem em soronegativos,

mas ainda permanecem infectados (Ferrer et al., 1995; Ferrer, 2002a; Leontides et al.,

2002; Ikeda-Garcia et al, 2006;). Animais com menos de três meses de idade não devem

ser avaliados através de métodos sorológicos, pois podem apresentar resultados

positivos pela presença de anticorpos maternos (Braga et al., 1998).

Várias técnicas podem ser utilizadas para o diagnóstico do calazar, tais como, a

Reação de Fixação do Complemento (Hockmeyer et al., 1984), Hemaglutinação Direta

(Harith et al., 1988 Harith et al., 1996), Hemaglutinação Indireta (Bray & Lainson,

1967), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) (Badaró et al.,1983 e 1986),

Enzyme Linked Imunosorbent Assay (ELISA) (Ho et al., 1983; Badaró et al.,

1986).Com o uso de diferentes antígenos nas mais variadas técnicas sorológicas, o que

se observa em vários trabalhos é uma grande variação de resultados. A técnica

sorológica mais utilizada é o teste de ELISA, que é altamente sensível e a especificidade

depende do antígeno utilizado, o antígeno mais comumente utilizado é o bruto, derivado

de um lisado de promastigotas de Leishmania spp. Este teste apresenta, no entanto

reatividade cruzada com outras patologias causadas por tripanosomatídeos, como

leishmaniose tegumentar e Doença de Chagas e mesmo com outras espécies

geneticamente distintas de tripanosomatídeos.

Nos últimos anos têm surgido vários "kits" comerciais para diagnóstico rápido

da LVC, sobretudo no mercado veterinário europeu. A maioria desses "kits" consiste de

ensaios imunocromatográficos que empregam anti imunoglobulinas monoclonais (IgG)

caninas marcadas com ouro coloidal e antígeno de diferentes fontes. Eles são atrativos

porque são testes simples de serem realizados, fáceis de utilizar e a resposta é obtida

rapidamente, em aproximadamente 10 minutos. Entretanto, há informações de vários

autores que estes "kits" são usualmente limitados, mostrando resultados que carecem de

maiores evidências científicas para sua utilização (Bern et al., 2000; Grandoni,2002;

Reithinger et al., 2002; Sundar et al., 2002; Carvalho et al., 2003). Por exemplo, a

sensibilidade e a especificidade destes testes, utilizando o antígeno recombinante rK39

para o diagnóstico da LV humana variam, de acordo com a literatura, de 90 a 100% e de

29

93 a 100%, respectivamente (Bern et al., 2000; Sundar et al., 2002; Carvalho et al.,

2003).

Na avaliação do teste de imunocromatografia para detecção de LVC, enquanto

alguns autores descreveram valores de sensibilidade entre 84 e 92,1% e de

especificidade entre 99 e 100% (Melo, 2004; Laurenti et al., 2005), outros observaram

uma sensibilidade de 100% e especificidade de 75% (Reithinger et al., 2002). Embora

os relatos de que os testes de imunocromatografia possam levar a uma grande proporção

de diagnósticos falso positivos, existem discordâncias quanto à ocorrência de reação

cruzada do antígeno rK39 com Leishmania braziliensis ou Trypanosoma cruzi

(Reithinger et al., 2002).

A RIFI e o ELISA são as técnicas mais utilizadas para avaliação da

soropositividade canina, além de serem também recomendadas pelo Ministério da

Saúde do Brasil em inquéritos caninos amostrais e censitários, devido à alta

sensibilidade e especificidade das mesmas, em comparação às demais (Badaró, 1983;

Guimarães et al., 1990; Brasil-Ministério da Saúde, 2003).

A RIFI utiliza como antígeno promastigotas de Leishmania spp., podendo ser

inclusive de espécies tais como L. mexicana e L. braziliensis (Costa et al., 1991). A

preparação do antígeno exige pessoal qualificado (Tavares et al., 2003) e, além disto,

quando da análise de um grande número de amostras, o tempo despendido pelo

profissional para a leitura das lâminas é muito grande (Rachamin et al., 1991). Embora

existam “kits” comerciais, as lâminas preparadas nos próprios laboratórios onde os

diagnósticos são realizados, produzem resultados melhores e mais repetitivos (Ferrer,

1997). Como teste diagnóstico a RIFI demonstra sensibilidade variando de 83% a

100%, e especificidade, dependendo da região geográfica em que o teste é aplicado,

entre 74% a 100% (Almeida et al., 2005; Da Silva et al., 2006). A especificidade desta

prova é prejudicada devido à ocorrência de reações cruzadas com doenças causadas por

outros tripanosomatídeos, tais como o agente etiológico da Doença de Chagas. Portanto,

seus resultados não devem ser utilizados como indicadores de infecção leishmaniótica

específica, particularmente em áreas onde a Doença de Chagas é endêmica (Costa et al.,

1991; Alves et al, 2004;). Existem inúmeros relatos da ocorrência de reação sorológica

cruzada entre os membros da família Trypanosomatidae, envolvendo principalmente, os

protozoários L. chagasi, L. braziliensis e Trypanosoma. cruzi, os quais possuem uma

relação filogenética muito estreita. No entanto, a ocorrência de reação cruzada entre

30

LVC e outros agentes etiológicos, quando se utilizam métodos sorológicos, ainda é

motivo de discordâncias na medicina veterinária. Antígenos de superfície e antígenos

dos microtúbulos do citoesqueleto do protozoário são comuns a todos os

tripanosomatídeos o que justifica a ocorrência de reação cruzada entre eles (Badaró et

al., 1986).

Já, com relação à ocorrência de reação cruzada com outras enfermidades,

Vercammen et al. (1997), utilizando amostras de soro de três cães infectados por

Babesia sp. e de um cão infectado por Ehrlichia sp., não observaram resultados

positivos quando da realização da RIFI para LV.

A técnica de RIFI é adotada como padrão ouro pelo Ministério da Saúde,

portaria nº 1943, que determina que a Leishmaniose como uma das doenças de

notificação obrigatória em todo território nacional. O kit diagnóstico oficial, produzido

por Biomanguinhos, para a reação de RIFI recomenda como resultado positivo o título

igual ou superior a 1:40 (Instituto Adolfo Lutz, 2003).

Os antígenos brutos utilizados no ELISA são derivados de promastigotas

cultivadas in vitro, geralmente rompidas por ultrasom, expondo cerca de 30 antígenos

somáticos e inúmeros componentes de superfície (Tavares et al., 2003). O teste, possui

sensibilidade de 97% a 100% (Laurenti et al., 2005) e especificidade de 88% a 100%,

quando são usados antígenos brutos (Rosário et al., 2005). Há, contudo, discordâncias

entre alguns autores, os quais descreveram valores de sensibilidade e especificidade de

80 e 81%, respectivamente (Ashford et al., 1995) e outros que observaram valores de

100% para ambos os índices (Vercammen et al., 1997) .Quando se utilizam antígenos

totais as técnicas tornam-se limitadas em termos de especificidade, apresentando

reações cruzadas não somente com outras espécies da família Trypanosomatidae, mas

também com organismos filogeneticamente distantes (Rachamin et al., 1991; Tavares et

al., 2003; Melo, 2004). Enquanto alguns trabalhos apontam para a ocorrência de reação

cruzada entre LV e babesiose canina ou Doença de Chagas por meio da técnica de

ELISA (Rosário et al., 2005), outros afirmam não existir reação cruzada com erlichiose

e babesiose (Lima et al., 2005; Vercammen et al.,1997), toxoplasmose (Lima et al.,

2005) e Doença de Chagas (Vercammen et al.,1997).

A sensibilidade e especificidade do ELISA podem também variar dependendo

do tipo de antígeno empregado (espécie ou forma evolutiva do parasita) e de mudanças

31

no protocolo experimental padrão (tempo de incubação ou tipo de microplacas

utilizadas) (Reinthinger et al., 2002).

O teste de ELISA é recomendado para a triagem de cães sorologicamente

negativos, e a RIFI para a confirmação dos cães sororeagentes, ou como uma técnica

diagnóstica de rotina (Brasil-Ministério da Saúde, 2003). Para melhorar a especificidade

do método tem-se buscado a caracterização molecular dos componentes do antígeno de

Leishmania (Gradoni, 2002).

O Immunoblotting ou Western blotting é uma técnica mais sensível que a RIFI e

o ELISA, porém como o processo de extração de antígenos ainda não é padronizado e a

necessidade laboratórios especializados para a sua realização fazem com que não seja

usado como ferramenta primária de diagnóstico (Alvar, 2004).

A busca para superar as limitações destas técnicas tem como principal desafio a

preparação do antígeno. Como fonte de produção de antígenos tem sido usado o parasita

completo ou extratos solúveis dos mesmos. Com isso, observa-se nos diversos

trabalhos, uma grande variedade de resultados e uma dificuldade de padronização dos

métodos. Geralmente, métodos que usam os parasitas íntegros oferecem maior

sensibilidade, reprodutibilidade e resultados mais confiáveis em relação aqueles que

usam antígenos solúveis (Ferrer, 1997; Alvar, 2004). A tendência é a utilização de

antígenos purificados e/ou recombinantes para assegurar uma maior sensibilidade e

especificidade dos testes (Kar, 1995, Ferreira et al., 2003, Tavares et al., 2003).

As espécies de Leishmania apresentam homologia gênica que varia de 69 a 90%

(Maurício et al., 2001). Os parasitos possuem na sua membrana mais de quarenta

moléculas distintas, com pesos variando de 12 a 220 kDa, das quais aproximadamente

30 são glicoproteínas (Dwyer, 1974; Mukherjee et al., 2002). A preparação de antígenos

de glicoproteínas purificadas de membrana como gp63, gp72, gp70 específicas do

gênero Leishmania têm sido utilizada na tentativa de elevar a sensibilidade e a

especificidade das provas sorológicas. Entretanto, ainda assim podem ocorrer reações

cruzadas com outros tripanosomatídeos (Badaró et al., 1986; Vexenat et al., 1996;

Scalone et al., 2002; Alves et al, 2004).

Alguns antígenos recombinantes, como o rK39, o rK9 e o rK26, são antígenos

recombinantes desenvolvidos para conferir grande sensibilidade quando da realização

da sorologia (Bhatia et al., 1999; Rosati et al., 2003).O antígeno ligante fucose manose

32

(FML) é uma glicoproteina de superfície, isolada de promastigotas de L. donovani,

necessária para interações com macrófagos in vitro. Quando este antígeno foi utilizado

no diagnóstico sorológico de cães de área endêmica do Rio Grande do Norte, Cabrera et

al. (1999) demonstraram taxas de sensibilidade e de especificidade de 100% para o

ELISA, enquanto que a sensibilidade da RIFI foi de apenas 2,9%. O FML também

demonstrou valor preditivo de 100%, pois dos 27 animais assintomáticos que foram

positivos ao ELISA FML, 21 morreram de leishmaniose em um período de seis meses.

O antígeno recombinante K39 (rK39), derivado purificado de epítopo

imumodominante repetitivo de uma região altamente conservada entre as espécies

viscerotropicas de Leishmania, foi validado em estudo multicêntrico na Itália. Cerca de

5.500 soros de cães foram utilizados por Scalone et al. (2002) neste estudo, que

demonstrou maior especificidade e maior sensibilidade do ELISA rK39, quando

comparado ao RIFI e ao ELISA de antígeno convencional. Os autores concluem que o

ELISA rK39 pode ser usado como alternativa ao RIFI, especialmente em estudos com

grande quantidades de amostras.

Outro antígeno recombinante a proteína A2 , expressa na forma amastigota de L.

donovani, composta predominantemente por um elemento conservado altamente

repetitivo, foi investigada por Carvalho et al. (2002). O autor pesquisou anticorpos

antiproteína A2 em soros de cães positivos para LV, previamente diagnosticados por

RIFI ou por diagnóstico parasitológico, usando este antígeno recombinante em reações

de ELISA. O método forneceu 87% de concordância com RIFI, porém não foram

observadas reações cruzadas com doenças comuns dos cães, bem como com cães

portadores de Doença de Chagas. Os autores concluíram que a presença de anticorpos

anti A2 pode ser considerada como marcador de doença ativa nos cães e que o método

per si será de grande aplicabilidade no Brasil, onde localidades distantes ou rurais não

dispõem de laboratórios ou equipamentos próprios para o diagnóstico preciso da

doença.

Os antígenos recombinantes até agora desenvolvidos, pelo menos no Brasil,

ainda não são utilizados na rotina do diagnóstico da LVC em inquéritos sorológicos

censitários, que têm como objetivo ações de controle.

A proteômica representa o desafio do futuro para aumentar nosso conhecimento

da composição molecular da célula e, a eletroforese bi-dimensional (2-DE), é uma das

ferramentas para estudar a expressão de proteínas em larga escala (Haseloff et al.,

33

2003). A análise das proteínas utilizando 2-DE envolve a separação sistemática,

identificação e quantificação de muitas proteínas simultaneamente a partir de uma única

amostra. Essa técnica também é capaz de detectar modificações traducionais e pós-

traducionais, as quais não podem ser observadas por seqüenciamento do genoma. A 2-

DE é uma ferramenta poderosa e amplamente utilizada para análise de misturas

complexas de proteínas extraídas de células, tecidos ou outras amostras biológicas e é

complementada pela espectrometria de massa (EM) para identificação das proteínas

(Haseloff et al. 2003). As proteínas mais imunogênicas, responsáveis por maior

antigenicidade, podem ser seqüenciadas e empregadas, por exemplo, na sensibilização

de placas de ELISA visando uma maior sensibilidade e especificidade deste ensaio

Estudos do proteoma de Leishmania foram realizados principalmente para

comparação dos diferentes estágios do ciclo de vida de L. donovani (Thiel & Bruchhaus

2001; Avila et al. 2003), L. infantum (El Fakhry et al., 2002), L. (Viannia) guyanensis e

L. (V.) panamensis (Gongora et al., 2003). Recentemente, um estudo utilizando 2-DE de

extrato de promastigotas de L. infantum, seguido de Western Blot com soro de coelhos

imunizados e análise por espectrometria de massa, permitiu a identificação de várias

proteínas antigênicas relevantes (Dea-Ayuela et al., 2006). Numa abordagem

semelhante, foram identificados vários antígenos de L. donovani utilizando soros e

parasitos isolados de pacientes indianos permitindo concluir que a abordagem

proteoma-sorologia produz uma compreensiva e altamente resolvida representação da

antigenicidade de L. donovani e da especificidade da resposta imune anti-Leishmania

em pacientes com LV (Forgber et al. 2006).

Em síntese, estudos proteômicos com Leishmania já demonstraram a diferença

de expressão protéica entre as formas amastigotas e promastigotas e a possibilidade de

utilização da sorologia proteômica como uma abordagem adequada para mapeamento

da antigenicidade na leishmaniose. Entretanto, os trabalhos utilizando soros de cães,

principais reservatórios, são ainda inéditos, apesar da potencial aplicação.

1.5 Controle da Leishmaniose Visceral no Brasil

Em virtude das características epidemiológicas e do conhecimento, ainda

insuficiente, sobre os vários elementos que compõem a cadeia de transmissão da LV no

Brasil, sobretudo nas áreas urbanas, as estratégias de controle desta endemia têm sido

pouco efetivas. Estão centradas no diagnóstico e tratamento precoces dos casos

34

humanos, redução da população de flebotomíneos vetores, eliminação dos reservatórios

domésticos positivos para leishmaniose e atividades de educação em saúde (Brasil-

Ministério da Saúde, 2003).

Embora o programa brasileiro de controle de Leishmanioses exista desde a

década de 1960, a incidência da LVH permanece alta. A ausência de impacto na

aplicação destas medidas tem sido atribuída principalmente, a baixa sensibilidade dos

testes diagnósticos, a demora na retirada dos animais soropositivos e na desconfiança no

diagnóstico, e conseqüente resistência dos proprietários em entregar os cães

sororeagentes nas últimas décadas (Romero & Boelaert, 2010)

O diagnóstico dos animais sororeagentes tem sido realizado pelos serviços de

controle utilizando “kits” de diagnóstico para as técnicas de RIFI e de ELISA

produzidos por Biomanginhos/Fiocruz/ Ministério de Saúde.

As divergências entre os exames sorológicos realizados pelos laboratórios

públicos, privados e naqueles existentes em universidades consistem em grande

problema para a execução das ações de controle da LV. Esta dificuldade em relação ao

diagnóstico da LVC está diretamente relacionada, entre outros fatores, a diferentes

técnicas de produção dos antígenos pertencentes aos kits diagnósticos comerciais.

35

2. Justificativa

A leishmaniose visceral é uma protozoose que determina uma alta taxa de

mortalidade, quando não tratada, e está em expansão geográfica, principalmente no

Brasil, invadindo áreas antes livres da doença. Um conjunto de fatores contribuiu para o

aumento da ocorrência de leishmaniose visceral nos centros urbanos, já assinalada por

Deane em 1956, dentre eles, as mudanças que ocorreram nos últimos anos na estrutura

agrária do país, o aumento das migrações internas da área rural para grandes centros, as

pressões econômicas ou sociais, a adaptação do vetor ao ambiente modificado pelo

homem, as alterações climáticas, investimentos precários na saúde e as ações de

controle pouco eficientes (Gontijo e Melo, 2004).

A urbanização da leishmaniose visceral tem decorrido tanto devido às condições

precárias de vida existentes nas periferias das cidades, para onde vieram grandes

deslocamentos de populações de áreas rurais. As cidades tiveram suas periferias

expandidas, sem que este crescimento tenha sido acompanhado da consolidação de sua

estrutura de serviços urbanos. Estas periferias mantiveram algumas características de

áreas rurais de origem dos migrantes, como a presença de mosaicos de vegetação em

áreas ainda não completamente ocupadas, a criação de animais domésticos nos

peridomicílios e as condições precárias das habitações, permitindo, em certas áreas do

país, a presença da leishmaniose no espaço urbano.

O cão é o principal reservatório urbano da doença. Normalmente verifica-se que

o maior número de casos humanos ocorre naqueles municípios ou áreas com as maiores

prevalências de LVC. Há uma relação espaço temporal na qual a doença canina, na

grande maioria das vezes, precede a detecção de casos humanos.

O processo de expansão geográfica e urbanização da LV levaram à necessidade

de se estabelecer medidas eficazes de controle, hoje focadas no diagnóstico e tratamento

dos casos humanos, diagnóstico e eliminação dos cães positivos e controle dos

flebotomíneos vetores, baseado no uso de inseticida de ação residual, direcionado para

as formas adultas, uma vez que os criadouros da espécie são pouco conhecidos. Neste

contexto, a correta identificação dos cães infectados constitui uma medida

estrategicamente importante num programa de saúde pública.

36

O diagnóstico sorológico da LV, tanto humano quanto canino tem sido realizado

no Brasil de acordo com orientações do Ministério da Saúde, através dos testes de RIFI

e ELISA. O teste de ELISA é usado para uma triagem inicial, principalmente nos

inquéritos epidemiológicos caninos, devido a sua maior especificidade e sensibilidade, e

a confirmação é feita pela RIFI. Por utilizarem antígenos brutos, podem apresentar

reações cruzadas com outras espécies da família Trypanosomatidae e mesmo com

organismos filogeneticamente distantes.

As divergências existentes entre os exames realizados pelos laboratórios

públicos e privados e a falta de integração entre os diversos órgãos envolvidos direta ou

indiretamente com o controle desta zoonose, fez com que em julho de 2005 se

reunissem representantes do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento,

Ministério da Saúde e Conselho Regional de Medicina Veterinária, com o propósito de

ajustar condutas que pudessem otimizar a detecção da doença canina e

conseqüentemente interferir na ocorrência da doença humana. Foi determinada uma

uniformização de condutas, padronizando entre outras medidas, o diagnóstico

sorológico da LVC realizado pela rede pública e privada. Esta padronização define que

somente “kits” diagnósticos devidamente registrados pelo Ministério da Agricultura

Pecuária e Abastecimento poderão ser utilizados no diagnóstico da doença canina e

propõem que o diagnóstico sorológico para LVC fosse acompanhado pela FUNED,

respaldado na Portaria 2.031 de 23 de setembro de 2004/Ministério da Saúde.

Os serviços de diagnóstico laboratorial da Leishmaniose Visceral realizados pela

rede pública são possíveis, através de uma ação integrada com a Fundação Ezequiel

Dias (FUNED), referência nacional para o diagnóstico da leishmaniose canina e

humana. Esta instituição é quem monitora e controla a qualidade tanto dos “kits”

produzidos para o diagnóstico, quanto dos exames realizados, por meio de amostragem

previamente estabelecida. Os “kits” diagnósticos utilizados pela rede pública são

produzidos pela Biomanguinhos/Ministério da Saúde e registrados na Agência Nacional

de Vigilância Sanitária (ANVISA) e Mistério da Agricultura Pecuária e Abastecimento.

Este órgão não tem até o presente momento capacidade para atender a demanda oficial

de produção de “kits” diagnósticos exigida tanto pelas secretarias estaduais e municipais

de saúde, quanto pela rede de laboratórios particulares.

Tendo em vista esta dificuldade, a FUNED estabeleceu uma parceria com o

Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade

37

Federal de Minas Gerais, para um programa de cooperação técnico-científica na

realização de estudos, testes e ensaios direcionados na produção de um antígeno que

permitisse diagnóstico precoce da doença, fosse estável, apresentasse reprodução de

resultados em qualquer local que fosse utilizado e que pudesse ser produzido em escala

industrial para atender a demanda nacional. Assim, espera-se eliminar a divergência de

resultados sorológicos decorrentes da utilização de “kits” diagnósticos confeccionados

com diferentes cepas de Leishmania e por diferentes métodos, e contribuir para atender

a demanda nacional de diagnóstico. A produção deste antígeno seria feita segundo as

normas internacionais de Good Manufacturation Practice (GMP), pela FUNED.

A Universidade Federal de Minas Gerais através do Departamento de

Parasitologia do ICB tem, desde o início do ano 2000, buscado a obtenção do um

antígeno que apresentasse estabilidade, reprodutibilidade de resultados, além de

sensibilidade e especificidade, que pudesse ser incorporado a um “kit” diagnóstico para

suprir a demanda de Minas Gerais e talvez, implementar a dinâmica do diagnóstico da

LVC no país. A FUNED através de suas atividades de pesquisa e desenvolvimento,

produção e de vigilância sanitária, epidemiológica e ambiental e principalmente, por sua

tradição na produção de soros hiperimunes, tem uma estrutura de produção industrial de

medicamentos e soros que lhe permite a produção, em escala do antígeno, o

desenvolvimento, teste e produção de um “kit” de diagnóstico de LVC. Como o

Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN/FUNED) é referência nacional para

muitas doenças negligenciadas e de grande impacto econômico, incluindo a

leishmaniose, esse apresenta a capacitação para certificação e validação dos métodos.

Os testes sorológicos realizados com os diferentes antígenos produzidos e

descritos neste projeto foram realizados no Departamento de Parasitologia do

ICB/UFMG. A seguir o antígeno escolhido neste trabalho será encaminhado à FUNED

para testes multicêntrico. A meta a ser atingida é a produção do antígeno em escala

industrial pela FUNED, para fornecimento ao Ministério da Saúde, de “kit” diagnóstico

para LVC, validado pela LACEN.

38

3. Objetivos

3.1.Objetivo Geral

Obter um antígeno bruto, a partir de promastigotas de Leishmania spp.de cultura

"in vitro", para composição de um "kit" diagnóstico para Leishmaniose Visceral

Canina a ser utilizado na técnica de ELISA

3.2. Objetivos Específicos

Testar as cepas (MHOM/BR/1972/BH46) e (MHOM/BR/2004/BH400) de

Leishmania (Leishmania) chagasi e (MHOM/BR/1960/BH6) de L. (L.)

amazonensis cultivadas em meio LIT e em meio α-MEM, na produção de

antígenos para o teste de ELISA;

Determinar a reatividade de soros de animais comprovadamente positivos e

negativos para LV frente aos antígenos produzidos;

Testar a estabilidade da preparação antigênica nos tempos de 24 horas, 3 e 6

meses após a sensibilização das placas de ELISA com os antígenos;

Testar os antígenos produzidos em RIFI para diagnóstico de LVC;

Avaliar ocorrências de reações cruzadas pelo teste de ELISA com outras

patologias, empregando o antígeno considerado de melhor desempenho nas

reações;

Determinar o perfil proteômico imunogênico do melhor antígeno.

.

39

4. Materiais e Métodos

4.1 Delineamento Experimental

4.1.2 Seleção dos Animais

4.1.3 Obtenção dos parasitos

110 animais provenientes CCZ Prefeitura Municipal de Betim:

20 mL de sangue

RIFI e ELISA

Coleta de medula óssea sob anestesia

Esfregaço em lâmina de vidro

Semeadura em meio de cultura

PCR

Cepas

BH 46 BH 400 BH 6

Meios LIT e -MEM

Curva de Crescimento

Massa de parasitos para a obtenção de ANTÍGENOS

Ultrassonicação e Dosagem de Proteínas

ELISA

Dosagem de Proteína e Eetroforese 2D

Imunoblotting

RIFI

40

4.2 Seleção dos Animais e Coleta de Material

Os cães doadores do soro para os testes de avaliação dos antígenos produzidos

para este trabalho foram oriundos do projeto “Estudo clínico para avaliação de vacinas

contra as leishmanioses em cães usando antígenos recombinantes de Leishmania

definidos pela resposta imune humana”, que teve como responsável o professor Evaldo

Nascimento na orientação do aluno de mestrado Leonardo T. Ituassu do Departamento

de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Os animais eram

trazidos do Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Betim e

alojados no canil do ICB/UFMG. No momento da coleta de material destes cães,

amostras foram cedidas para nosso projeto. O projeto foi certificado pelo Comitê de

Ética em Experimentação Animal – CETEA- sob protocolo 140/2006, em anexo.

Como critério de inclusão do soro animal para os testes, estabeleceu-se positivo

o animal que se apresentasse positividade em um dos testes parasitológicos associado ao

resultado, também positivo, de pelo menos um dos testes sorológicos. O critério de

amostra negativa implicava na negatividade de todos os testes sorológicos e

parasitológicos realizados.

Os animais foram sedados e pré-anestesiados com Xilazina®

– 2,2 mg/kg,

Ketamina® - 11mg/kg e Diazepam® – 1mL/10kg, por via intramuscular. Quando o cão

apresentou discreta sedação, foram coletados de cada animal 20mL de sangue total

através de punção da veia jugular. Ainda com o animal sob anestesia foi realizada a

depilação da região esternal, numa área suficiente para garantir assepsia da coleta e

após, uma agulha de 40 gauges, acoplada a uma seringa de 10mL foi introduzida na

região do manúbrio, seguindo-se a aspiração da medula óssea.

A amostra de sangue foi centrifugada a 1500g durante dez minutos para

obtenção de soro. Os soros foram divididos em alíquotas de 100mL, codificadas e

armazenadas a -20ºC. O aspirado de medula óssea foi utilizado para a avaliação

parasitológica, sendo colocado em meio de cultura NNN/Alfa-MEM (GIBCO-BRL,

USA).

Os soros foram avaliados em relação à positividade ou negatividade para LVC

pelos testes de Enzime Linked Immunosorbent Assay-ELISA (Voller et al, 1979) e

41

Reação de Imunofluorescência Indireta-RIFI (Camargo, 1966), segundo rotina

diagnóstica já estabelecida no Laboratório de Sorologia de Leishmania, do

Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG.

4.3 Avaliação Parasitológica dos Animais

Para a comprovação parasitológica da infecção animal, o material puncionado da

medula óssea, foi submetido a esfregaço por extensão em lâmina de vidro, semeadura

em meio de cultura e aplicado em papel de filtro próprio para extração de DNA.

4.3.1 Esfregaço por extensão

Uma gota de material puncionado de medula óssea foi colocada em cada uma de

duas lâminas de vidro limpas e desengorduradas (Invicta®, Brasil). A extensão do

material foi realizada com outra lâmina de vidro, e as mesmas deixadas para secar em

temperatura ambiente, sendo posteriormente armazenadas, para coloração através do

método Panótico Rápido (Bioclin, Brasil). Cada amostra foi imersa por 20 segundos em

cada solução (fixador, corante básico e corante ácido, respectivamente), sob discreta

agitação, seguindo-se posterior lavagem em água corrente. A secagem foi realizada em

temperatura ambiente. As lâminas foram examinadas em microscópio ótico no aumento

ocular de 10X e objetiva de 100X, em imersão.

4.3.2 Cultura de medula óssea

Para o isolamento do parasito, parte da amostra da medula óssea foi semeada em

2 tubos contendo meio de cultura bifásico NNN (Novy, McNeal e Nicolle) enriquecido

com meio Alfa-MEM (Minimum Essential Medium, Gibco, USA) acrescido de 10% de

Soro Fetal Bovino, que foram mantidos a 24+1oC em estufa biológica (FANEM,

Brasil). A cada sete dias todas as culturas eram examinadas em câmara asséptica e

repicadas, num total de três repiques, para a avaliação da possível presença e

crescimento de parasitos. Ao final de trinta dias, o diagnóstico foi concluído e, todos os

tubos, foram examinados e descartados.

4.3.3 Reação em cadeia da polimerase - PCR

42

As amostras de medula óssea depositadas em papel de filtro próprio para

extração de DNA (FTA®

Classic Card) e deixadas para secar a temperatura ambiente,

foram armazenadas a 4ºC e utilizadas como recurso para confirmação da

positividade/negatividade sorológica de cada animal avaliado.

A extração do DNA foi realizada pela técnica descrita por da Silva et al. (2001)

com modificações. Cinco fragmentos do papel de filtro embebido com material de

medula óssea foram obtidos, de forma aleatória, com auxílio de um “punch” de dois

milímetros de diâmetro (Punch para Biópsia®, Kolplastci LTDA, Brasil). As amostras

foram transferidas para tubos de microcentrífuga de 1,5L de capacidade contendo

200L de solução tampão de lise (FTA® Purification Reagent, Whatman, EUA) e foram

submetidas à agitação com auxílio de um aparelho vórtex por 20 segundos, sendo

homogeneizadas por cinco minutos à temperatura ambiente, em movimentos constantes

com auxílio de um roteador (Lab Rotator®), sendo posteriormente descartado o

sobrenadante. Este procedimento foi repetido por mais duas vezes. Após a terceira

lavagem, 200L de solução tampão TE (10 mM Tris-HCL, 1mM EDTA, pH 7.5) foi

adicionada ao tubo de microcentrífuga contendo os discos de papel, seguido por nova

agitação em vórtex por vinte segundos e incubação à temperatura ambiente por mais

cinco minutos com posterior descarte do sobrenadante. Este procedimento foi repetido

duas vezes. Os discos de papel de filtro contendo DNA foram estocados a -4oC para

serem utilizados na realização da técnica de PCR.

A amplificação do K-DNA através da PCR específica, o desenho dos iniciadores

da reação bem como o protocolo da PCR foram realizados segundo a técnica descrita

por Piarroux et al. (1993), com modificações. A amplificação do DNA foi realizada em

termociclador (PTC-100®, M.J. Research Inc., EUA), utilizando-se o par de iniciadores

LV1 e LV2 (Quadro 1) específicos para o complexo Leishmania donovani (Invitrogen,

Brasil).

43

QUADRO 1

Iniciadores utilizados nas amplificações pela reação em cadeia da polimerase (PCR)

Iniciador Seqüência Número de nucleotídeos

LV1 5’ ACGAGGTCAGCTCCACTCC 3’ 19

LV2 5’ CTGCAACGCCTGTGTCTACG 3’ 20

Para a amplificação, 1,5L de DNA ou um disco de papel de filtro contendo

DNA, foi adicionado a uma mistura contendo 1,5L de iniciador LV1; 1,5l de

iniciador LV2; 7L de “Go Taq® Green Master Mix”; 3,5L de H20 deionizada

“nuclease free” (Kit Go Taq® Green Master Mix, Promega, EUA). Em todas as reações

foram utilizados controles positivos e negativos. Os controles da reação foram papel de

filtro sem medula óssea e papel de filtro embebido com medula óssea de cão

sabidamente positivo para L. chagasi. Foram ainda utilizados como controle 1ng de

DNA de L. chagasi, cepa MOHM/BR/1967/BH46, obtida de promastigotas de cultura, e

um controle com todos os reagentes utilizados na reação exceto o DNA. A amplificação

foi realizada a partir de um passo inicial de desnaturação por cinco minutos a 95C;

anelamento por 30 segundos a 59C (ligação dos iniciadores); extensão a 72C por

trinta segundos e desnaturação a 94C por 30 segundos, seguidos por 33 ciclos iguais; a

extensão final ocorrerá a 72C por dois minutos.

Os produtos amplificados pela PCR foram analisados através de eletroforese em

gel de poliacrilamida 5% (Sigma Aldrich, EUA) não desnaturante em TBE (89mM

TRIS-BORATO, 2mM EDTA, pH 8,0) por aproximadamente duas horas, ou até que o

corante xileno-cianol utilizado no marcador de peso molecular tivesse percorrido dois

centímetros. Foi utilizado como marcador de peso molecular de 100pb (Promega,

USA). Foram aplicados 4L do produto amplificado por canaleta do gel o qual foi

submetido à uma tensão de 120 volts. Após a eletroforese, os fragmentos amplificados,

foram visualizados por coloração do gel pelo nitrato de prata (Synth, Brasil). O gel foi

fixado à temperatura ambiente por cinco minutos em solução contendo 10% de etanol

44

absoluto (v/v) (Merck, Alemanha) e 0,5% de ácido acético (v/v) (Merck, Alemanha),

seguida de incubação por 5 minutos em 150mL de solução contendo 0,7% de nitrato de

prata (p/v) (Synth, Brasil), e de nova incubação com uma solução reveladora contento

3% de NaOH (p/v) (Merck, Alemanha) e 0,1% de formaldeído 37% (v/v) (Merck,

Alemanha), por 10 minutos ou até o aparecimento das bandas, sempre sob agitação

suave (Orbit Shaker

, Lab-Line). Posteriormente o gel foi transferido para a solução

fixadora e documentado por fotografia para análise. A contaminação da reação por

amplicons foi evitada pelo uso de diferentes ambientes para o processamento das

amostras, além dos processos rotineiros de descontaminação das áreas de trabalho.

4.4 Preparo dos Antígenos

Os antígenos foram preparados a partir das promastigotes das cepas de

Leishmania, que se encontravam criopreservadas em nitrogênio líquido no Laboratório

de Biologia de Leishmania do Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, descritas a seguir.

Cepa BH46: Leishmania (Leishmania) chagasi (MHOM/BR/1972/BH46) isolada

de um paciente com leishmaniose visceral, natural de Mantena, Minas Gerais,

Brasil, em 07/06/1972;

Cepa BH6: Leishmania (L.) amazonensis (MHOM/BR/1960/BH6) isolada de um

paciente com leishmaniose cutânea, no Estado do Ceará, Brasil, 1960.

Cepa BH400: Leishmania (L.) chagasi (MCAN/BR/2002/BH400): isolada de um

cão com LVC, na metropolitana de Belo Horizonte, Brasil, em 2002.

4.4.1 Curva de Crescimento

Cada cepa foi cultivada em 10 mL de cada um dos meios de cultivo Liver

Infusion Triptose (LIT) (Camargo, 1966) e Minimum Essential Medium (Alfa-MEM)

acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino, a partir de um inóculo de 106 promastigotas,

em fase log de crescimento, provenientes do mesmo meio.

Quando adicionadas ao meio de cultivo, as Leishmania inicialmente se adaptam,

fase lag, período onde, embora os parasitos estejam metabolicamente ativos, supõe-se

não ocorrer divisão binária. A seguir, os parasitos iniciam uma fase de crescimento

logarítmico ou exponencial, na qual se dividem por fissão binária e ocorre o pico de

45

suas atividades metabólicas e fisiológicas, chamada fase log. Entretanto, quando os

nutrientes são utilizados e/ou quando os produtos de excreção metabólica se acumulam

em quantidade no ambiente, isto parece intervir no crescimento estabelecendo-se uma

fase estacionária. Esta fase é seguida de morte parasitária, diminuição dos parasitos

viáveis de forma exponencial e caracteriza a fase de declínio ou de morte. As cepas

foram caracterizadas quanto ao crescimento nos diferentes meios através da contagem

diária de promastigotes em câmara de Neubauer e foi delineada uma curva gráfica para

visualização das diferentes fases de crescimento.

4.4.2 Obtenção de parasitos para o Preparo dos Antígenos

Para obtenção de uma massa de promastigotas, visando o preparo dos antígenos,

foram distribuídos em garrafas Roux de 1000 mL, contendo 50mL de meio LIT ou

50mL do meio Alfa-MEM, acrescido de 10% soro fetal bovino, 10mL de cultura de

cada cepa na fase logarítmica de crescimento. As culturas foram mantidas em estufa

biológica (FANEM –Brasil) a 24º±1ºC. Após 4 dias, foi avaliada a viabilidade dos

parasitos, a ausência de contaminantes e 10mL de cada cultura foram repassados para

mais quatro garrafas de Roux contendo 50mL de meio LIT ou Alfa-MEM. As culturas

foram mantidas nas mesmas condições descritas. Decorridos quatro dias as

promastigotas foram examinadas, lavadas por centrifugação a 1000g por 10 minutos a

4ºC, o sedimento foi ressuspenso em solução salina 0,85% e foram realizadas mais três

centrifugações nas mesmas condições. A massa de parasitos foi então dividida em três

alíquotas em tubos Falcon com capacidade para 50mL, uma destinada à produção de

antígenos para sensibilização de placas de ELISA, outra para realização de eletroforese

bidimensional em gel 2-D (2-DE) e a terceira para o preparo do antígeno de RIFI. Até o

momento do processamento as alíquotas foram mantidas em freezer a -80 ºC, exceto

aquelas destinadas ao preparo de lâminas para a reação de RIFI, que foram utilizadas no

preparo do antígeno imediatamente, como descrito no item 4.4.2.2.

4.4.2.1 Preparação do Antígeno para Sensibilização das Placas de ELISA

Considerando uma relação de 100mg de massa úmida, para 10mg de massa seca,

foram utilizados 10mL de PBS 15M, pH 7,2, com mertiolate na concentração final de

1:10.000, contendo ainda 130 mg de iodoacetamida por 5mL de antígeno. O antígeno

foi ultrassonicado 3 vezes por 1 minuto a 40 Hertz com intervalo de 1 minuto entre as

46

ultrassonicações,em banho de gelo, em tubo Falcon. Em seguida foi agitado lentamente

durante 12 horas a 4ºC. Seguiu-se centrifugação a 5000g a 4

ºC. A concentração de

proteínas foi dosada pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951) e ajustada para 2mg

por mL. O antígeno foi adicionado de Tioglicolato de Sódio na concentração final de

0,01% e aliquotado em tubos Eppendorf em volumes de um 1mL e armazenado a -20ºC

até o momento do uso. As placas de ELISA planas com fundo plano (Inlab®) foram

sensibilizadas diluindo o antígeno em tampão carbonato, segundo metodologia já

descrita.

4.4.2.2 Obtenção de Parasitos e Preparação do antígeno para RIFI

A preparação do antígeno para a Reação de Imunofluorescência Indireta seguiu

o Protocolo do Laboratório de Sorologia do Departamento de Parasitologia do Instituto

de Ciências Biológicas da UFMG, resumido a seguir:

Os parasitos foram cultivados em meio de cultura LIT ou Alfa-MEM. Quando as

Leishmania atingiram a fase logarítmica de crescimento, colocou-se diretamente no

meio de cultura, solução de formaldeído em PBS a 10% na razão de 1:1. Após

centrifugação a 400g durante 10 minutos, o sobrenadante foi desprezado e adicionado

de 10mL de tampão fosfato pH 7,4 , homogeinizado e centrifugado a 400g para a

lavagem dos parasitos. Este procedimento foi executado por três vezes. Após o último

procedimento, a suspensão foi homogeneizada com pipeta de Pasteur estéril, e uma gota

(0,25 mL) foi colocada em lâmina de vidro para observação ao microscópio óptico em

objetiva de 40X. A suspensão foi ajustada para se obter em um campo microscópico o

número de 30 a 50 formas promastigotas. Estando em número satisfatório, a solução foi

homogeneizada e uma gota (0,25mL) foi colocada em cada campo previamente

marcado nas lâminas de vidro especiais para a RIFI. As lâminas foram deixadas para

secar à temperatura ambiente, sendo posteriormente enroladas em papel absorvente e a

seguir em papel alumínio, para estocagem a -20ºC até o momento do uso.

4.4 2.3 Preparação do Antígeno para Eletroforese-Extração de Proteínas

A massa de parasitas foi homogeneizada em tampão de lise (8M uréia, 2M

tiouréia, 4% CHAPS, 65 mM dithiothreitol - DTT, 40mM Tris-base e coquetel de

inibidor de protease da GE Healhtcere) na proporção de 500 μL de tampão de lise para

109 parasitas. A amostra foi incubada por 2 horas a temperatura ambiente sob agitação

47

lenta, e posteriormente passada em seringa de insulina por 20 vezes. Seguiu-se

centrifugação a 20.000g por 30 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante

(extrato protéico) foi aliquotado em volume de 100µL e mantido a -80°C. A proteína

foi quantificada por 2D-Quant kit (GE Healthcare, USA) de acordo com as instruções

do fabricante.

4.5 Testes dos Antígenos

Foram realizados pelas reações de ELISA e Imunofluorescência Indireta. Os

antígenos foram testados em três momentos: 24 horas, 3 meses e 6 meses após o

armazenamento das placas de ELISA em freezer a -20C. Na reação de ELISA, para

cada momento foram sensibilizadas 16 placas com cada antígeno. Na RIFI foram

sensibilizadas 50 lâminas de cada antígeno, cada uma com capacidade de teste de

dezesseis soros, e dois controles, positivo e negativo. Da mesma forma as lâminas

foram armazenadas em freezer a -20ºC.

Os soros dos animais foram testados na diluição de 1:400, sempre em duplicata

nas placas de ELISA. Na RIFI o título inicial foi de 1:40, executando-se diluições

sucessivas até a obtenção da negatividade (diluição total). Os testes foram realizados

com as amostras de soro e dos antígenos codificados de forma que apenas um indivíduo

que não fazia parte do trabalho tinha a codificação.

Finalizando o período de teste, foram realizadas as análises estatísticas para

escolha do melhor antígeno. A seguir, todos foram decodificados e, apenas com o

antígeno que demonstrou melhor desempenho, foram realizados testes de reação

cruzada com soros de animais sabidamente positivos para Doença de Chagas (fase

crônica), Leishmaniose Tegumentar, Babesiose e Erliquiose caninas. Os soros positivos

para realização dos testes de reação cruzada foram gentilmente cedidos pelos

professores Dr. George Luiz Lins Machado Coelho – UFOP (Doença de Chagas), Dr.

Múcio Flávio Barbosa Ribeiro – UFMG (Babesiose e Erliquiose) e Prof. Dr. Ricardo

Fujiwara – UFMG (Leishmaniose Tegumentar).

4.5.1 Reação de Imunofluorescência Indireta- RIFI

Os soros testados foram diluídos na razão dois, a partir de 1:40 e até a diluição

final, em solução tampão fosfato (PBS, pH 7,4) . Foram colocados 25μL da diluição

48

obtida sobre cada região demarcada de uma lâmina onde o antígeno, constituído por

formas promastigotas íntegras de Leishmania, havia sido previamente fixado. Após a

incubação das lâminas em câmara úmida por 30 minutos em estufa a 37oC, estas foram

lavadas com PBS, cobertas com o tampão fosfato por 5 minutos, lavadas em água

destilada e secadas sob ventilação artificial (Ventilador Britânia B20, Brasil). A seguir,

em cada região demarcada da lâmina foram acrescentados 25μL do conjugado diluído a

seu título em PBS com Tween 2% (Tween®

20, Merck, Alemanha). O conjugado

utilizado foi anti IgG de cão, marcado com Isotiocianato de Fluoresceína (Bethyl Lab.

Inc., EUA) na proporção de 1:1500, acrescido de Azul de Evans 1% (EVANS BLUE®,

Sigma Aldrich, EUA). Após nova incubação, lavagem e secagem, a lâmina foi então

coberta com glicerina (Merck PA, Alemanha) tamponada, pH 7,4 e sobreposta por uma

lamínula. A leitura foi procedida em microscópio de luz ultravioleta (Olympus BX 41®,

Japão). Soros conhecidamente positivos e negativos foram usados em cada lâmina,

como controle positivo e negativo da reação.

4.5.2 Enzime Linked Immunosorbent Assay - ELISA

Foram utilizadas microplacas para ELISA de polietileno (Inlab®) de 96 orifícios

e fundo plano. Cada orifício foi sensibilizado com 2μg de antígeno, diluídos em 100μL

em tampão carbonato, durante um período mínimo de 24 horas. Para a realização do

teste, o excesso de antígeno foi retirado da placa pela lavagem de cada orifício por duas

vezes com solução de lavagem contendo 0,9% (p/v), de cloreto de sódio e 0,05% (v/v),

de Tween 20®. A seguir, para bloqueio dos sítios inespecíficos, foram adicionados

150μL solução de PBS-Caseína 2% contendo 2% (p/v) de caseína (Sigma Aldrich,

USA) em PBS, por orifício. A placa foi incubada por 60 minutos em estufa a 37°C. O

excesso de solução de bloqueio foi então retirado por duas lavagens sucessivas. Em

seguida as placas foram colocadas para secar por inversão à temperatura ambiente e

posteriormente congelada em freezer a -20ºC. No momento do uso, após a retirada do

freezer, 100μL dos soros, diluídos em tampão de incubação e na razão de 1:400, foram

aplicados em cada orifício e a placa novamente colocada em estufa a 37ºC por 60

minutos. O excesso do soro diluído foi retirado logo após por uma série de cinco

lavagens. Foi utilizado como conjugado, anti-imunoglobulina de cão IgG, marcada com

Peroxidase VI (Bethyl Lab. Inc., USA). O conjugado foi previamente titulado e após ser

diluído ao seu título, 100μL da diluição foi acrescentado a cada orifício, e a placa

49

deixada em incubação por mais 60 minutos a 37°C. Posteriormente, esta solução foi

retirada por nova série de cinco lavagens e em seguida, foram adicionados a cada

orifício 100μL de solução de OPD - Orto-Fenilenediamino dihidrocloridro (Sigma

Aldrich, USA). A reação ocorreu em estufa à 37ºC durante 8-10 minutos, e

interrompida por adição de 25μL de H2SO4 4N (Merck,PA,Alemanha). Em qualquer

etapa, após as lavagens, as placas foram secadas por inversão sobre papel absorvente. A

leitura foi efetuada em leitor de ELISA (Bio-Rad 2550®

, USA), a 495nm. O ponto de

corte ou “cut off” foi determinado pela curva ROC (Receiver Operating Characteristic)

para cada placa.

4.5.2.1 Curva ROC - Receiver Operating Characteristic

Pela possibilidade de definir um ponto de corte, ou um limiar de decisão para se

classificar e contabilizar o número de predições positivas e negativas na comparação

relativa da fração de verdadeiros positivos (FVP), fração de falsos positivos (FFP),

fração de verdadeiros negativos (FVN) e fração de falsos negativos (FFN) foi escolhida

a curva ROC na obtenção do ponto de corte do teste de ELISA.

A curva ROC facilita o entendimento entre a relação de sensibilidade e

especificidade de um teste diagnóstico quantitativo ao longo de valores contínuos de um

ponto de corte (Martinez, et al., 2003).

Esta situação pode ser descrita graficamente pela curva ROC apresentada a

seguir.

50

4.5.3 Eletroforese Bidimensional (2-DE)

Para realizar a caracterização do perfil proteômico Imunogênico do antígeno de

melhor desempenho foram utilizadas as técnicas de Eletroforese Bidimensional (2-DE)

e Western Blot. A 2-DE foi feita em triplicata experimental, sendo que, em cada

experimento foram produzidos 4 géis simultaneamente, um deles era destinado a

coloração e os demais à realização de western blot.

4.5.3.1 Focalização Isoelétrica (IEF) –

As tiras IPG (gradiente de pH imobilizado) de 13 cm, pH 4-7 (GE Healthcare)

foram hidratadas com 600µg de amostra protéica em tampão de re-hidratação IEF

(Uréia 8M, Tiuréia 2M, CHAPS 4%, azul de bromofenol 0,0025%) e anfólitos IPG

Buffer pH 4-7, 1% v/v em um volume final de 250L. Em seguida as tiras foram

focalizadas usando o aparelho IEF Cell System (GE Healthcare), com os seguintes

passos: 250V por 15 minutos; 300V por 4 horas; 1000V até acumular 300Vh; 5000V

até acumular 4000Vh; 5000V até 1250Vh e 500V por 1 hora. Finalizada a focalização

isoelétrica, as strips foram submetidas à redução e alquilação por incubação

consecutiva, por 15 minutos, em 5 mL de DTT 125 mM primeiro e Iodacetamida 125

mM depois, em tampão de equilíbrio (50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M uréia, 30% glicerol,

2% SDS e 0.002% bromophenol blue).

4.5.3.2 SDS-PAGE

Para separação na segunda dimensão foi realizada eletroforese desnaturante em

gel de poliacrilamida a 12% usando o sistema Ettan DALT 6 unit (GE Healthcare)

conectado a um sistema de resfriamento. As strips foram posicionadas horizontalmente

no topo dos géis e foi adicionado 1mL de agarose 0,5% contendo azul de bromofenol.

Após a corrida, os géis eram corados por comassie colloidal - CBB G-250 (Neuhoff, et

al., 1988) ou transferidos para membrana de nitrocelulose.

4.5.3.3 Western blot - 2D gel

As proteínas de géis 2-DE foram transferidas para a membrana de nitrocelulose

(Amersham Biosciences) utilizando o “semidry transfer Unit” (GE Healthcare) e

incubadas com uma solução de bloqueio (5% de leite desnatado Molico em 20mM Tris,

51

500mM NaCl, pH 7.4) a 4C por 16 a 18h. Cada experimento foi feito com três

membranas simultaneamente, sendo uma incubada com “pool” (n=10) de soros de cães

naturalmente infectados com altos títulos de anticorpos (RIFI > 1:1.280), outra com

“pool” (n=10) de soro de cães naturalmente infectados com baixos títulos de anticorpos

(RIFI 1:160), e a terceira com “pool” (n=10) de soros de cães não infectados por L.

chagasi. O anticorpo primário foi utilizado em diluição 1:500 em solução de bloqueio,

por 2 horas, à temperatura ambiente. Após 3 lavagens com 0.05% PBS–Tween por 15

minutos, as membranas foram incubadas com anti-IgG total, conjugados com

peroxidase (Sigma) na diluição de 1:10.000. Para revelação da reação foi utilizada a

mistura de duas soluções: 6 mg de 3,3'-diaminobenzidina DAB (D-5637, Sigma) em 12

ml do tampão PBS e 12mL da solução contendo 10mL de PBS, 2mL de metanol e 10 μl

de peróxido de hidrogênio (Towbin, H. & Gordon, J., 1984).

4.5.3.4 Análise dos Géis-

Os géis corados e membranas provenientes do WB foram digitalizados utilizando o

equipamento ImageScanner (GE Healthcare) e as imagens foram analisadas com o

programa Image Master 2D Platinum 6 (GE Healthcare).

As imagens das membranas foram analisadas para seleção dos “spots” que são

reconhecidos por soros com baixos e altos títulos de anticorpos individualmente e

simultaneamente, descartando-se aqueles que são reconhecidos por soros de animais

não infectados (reações inespecíficas).

Dessa forma foi possível localizar nos géis 2-DE as proteínas do antígeno que

apresentou melhor performance e que são imunogênicas para soros caninos com baixos

e altos títulos de anticorpos individualmente e simultaneamente. Os “spots”

selecionados como imunogênicos e sem reações inespecíficas serão posteriormente

retirados dos géis para identificação por EM.

4.6 Análise Estatística

Os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor

preditivo negativo foram obtidos através do programa Open Epi, com intervalo de

confiança de 95%. A concordância entre os resultados das reações de cada um dos

52

antígenos com o verdadeiro estatus (positivo ou negativo) da amostra foi feita através

do índice de Youden (J).

Para as reações de RIFI e ELISA/RIFI de Biomanguinhos, os valores de

sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo foram

obtidos também através do programa Open Epi, com intervalo de confiança de 95%. A

concordância entre os resultados das reações de cada um dos antígenos com o

verdadeiro estatus (positivo ou negativo) da amostra foi feito pelo Índice Kappa de

Cohen.

As curvas de variação das absorbâncias obtidas na ELISA em função dos títulos

de anticorpos detectados na RIFI foram analisadas individualmente pela regressão linear

simples, assumindo como significativas aquelas com p<0,05.

Em cada um dos gráficos foi realizada a comparação das linhas de tendência da

variação da absorbância da ELISA em função do título obtido na RIFI de cada antígeno,

utilizando a análise de variância (ANOVA), assumindo como diferenças significativas

aquelas com valor p<0,05.

Foi calculado também o Coeficiente de Determinação (R2) para evidenciar o

quanto da variação total é comum aos elementos que constituem os pares analisados.

53

5. Resultados

5.1 Seleção dos animais

Cento e dez cães com testes sorológicos convencionais (ELISA e RIFI) positivos

e negativos para LV foram pré-selecionados como doadores de soro para o experimento.

Após esta avaliação sorológica, foi realizada a parasitológica, e considerando os

critérios estabelecidos para a inclusão da amostra como verdadeiramente positiva ou

verdadeiramente negativa, foram descartados os soros de sete animais, por apresentarem

resultado parasitológico positivo no PCR e negativo nos testes de ELISA e RIFI. Assim,

foram incluídos 54 doadores de soro positivo e 49 doadores de soro negativo. A

caracterização final dos animais está descrita na Tabela 1.

Tabela 1: Categorização dos animais pré-selecionados como portadores ou não de

leishmaniose visceral, após avaliação parasitológica e sorológica.

Testes Parasitológicos Testes

Sorológicos

Número

de

amostras

Categorização

Crescimento em

meio NNN/Alfa

MEM

PCR

Exame do

Esfregaço de

Medula Óssea

ELISA RIFI

Neg Pos Neg Neg Neg 07 Excluído

Pos Pos Pos Pos Pos 54 Positivo

Neg Neg Neg Neg Neg 49 Negativo

Pos – Positivo Neg – Negativo

5.2 Curva de Crescimento e Produção dos Antígenos

Os gráficos obtidos com os dados das contagens reproduzem o já descrito na literatura e

apontam padrões diferentes de crescimento para a mesma amostra em cada um dos dois

meios de cultura. A Figura 1 mostra, como representativo, as curvas de crescimento

obtidas nos dois meios de cultura com a amostra BH400. As características do

crescimento foram observadas para a obtenção dos parasitos em fase exponencial e

início da fase estacionária, segundo rotina já pré-estabelecida na preparação de

antígenos.

54

Figura 1 Curva de crescimento da cepa BH400 de Leishmania (Leishmania) chagasi, (A)

cultivada em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) e (B) em meio α- MEM

(Minimum Essential Medium) acrescido de 10% de SFB

55

Os antígenos produzidos para os testes de ELISA e RIFI foram codificados e

testados como tal, conforme o apresentado na Tabela 2.

Tabela 2 Codificação dos antígenos produzidos com as diferentes amostras de

Leishmania crescidas nos meios de cultura LIT (Camargo, 1966) e Alfa-

MEM acrescido de 20% de soro fetal bovino.

5.3 Teste dos Antígenos

5.3.1 Reação de ELISA

Para a realização da reação de ELISA, os soros e os antígenos foram testados

codificados, sem o conhecimento de quais eram os negativos e positivos. Para cada

placa testada foram utilizados soros, como controle positivo e negativo, e a

determinação do ponto de corte positivo/negativo de leitura foi realizado através da

Curva ROC. A zona cinza foi estabelecida para todas as placas como as leituras

compreendidas entre 10% acima e abaixo do ponto de corte. Os resultados são

mostrados por teste dos soros positivos e negativos, nos tempos 24 horas, três e seis

meses após a sensibilização das placas. As Figuras, 2 e 3, 4 e 5, 6 e 7 mostram

respectivamente, os resultados obtidos para os soros positivos e negativos testados 24

horas, três e seis meses após a sensibilização das placas.

ESPÉCIE DE Leishmania CÓDIGO DO

ANTÍGENO Meio de Cultura

Leishmania ( Leishmania)

amazonensis

(MHOM/BR/1960/BH6)

A

MEIO LIT Leishmania (Leishmania) chagasi

(MHOM/BR/1972/BH46) C

Leishmania (Leishmania) chagasi

(MCAN/BR/2002/BH400 E

Leishmania (Leishmania)

amazonensis

(MHOM/BR/1960/BH6)

B

MEIO ALFA MEM Leishmania (Leishmania) chagasi

(MHOM/BR/1972/BH46) D

Leishmania (Leishmania) chagasi

(MCAN/BR/2002/BH400) F

56

Figura 2 Teste de ELISA realizado em soros

de animais positivos para

leishmaniose visceral canina, com

os antígenos A, B, C, D, E e F, testados 24 horas após

sensibilização das placas.



leishmaniose visceral canina, com os antígenos A, B, C, D, E e F,

testados três meses após

sensibilização das placas.



leishmaniose visceral canina,

antígenos A, B, C, D, E e F, testados seis meses após

sensibilização das placas


de animais negativos para


os antígenos A, B, C, D, E e F, testados 24 horas após



de animais negativos para


os antígenos A, B, C, D, E e F, testados três meses após


Figura 7 Teste de ELISA realizados em

soros de animais negativos para leishmaniose visceral canina, com

o antígenos A, B, C, D, E e F,

testados seis meses após sensibilização das placas

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

s

POSITIVO

NEGATIVO

ZONA CINZA

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

s

POSITIVO

NEGATIVO

ZONA CINZA

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

s

POSITIVO

NEGATIVO

ZONA CINZA

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

s

POSITIVO

NEGATIVO

ZONA CINZA

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

sPOSITIVO

NEGATIVO

ZONA CINZA

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

s POSITIVO

NEGATIVO

ZONA CINZA

A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400 (Leishmania (L) chagasi), cultivadas em em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.)

amazonensis); D e F, BH46 e BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em em meio Alfa-MEM SFB 10%)

57

Os resultados mostraram que os todos os antígenos apresentam alto indice de

concordância com a categoria verdadeiro positivo e negativo para LVC dos soros

testados, quando o teste de ELISA foi realizado 24 horas após sensibilização das placas.

O antígeno E foi capaz de identificar 100% dos soros positivos (54/54). Já os

antígenos A, C, D e F identificaram 98% (52/54) das amostras positivas, e o antígeno B

96% (52/54). Estes valores foram observados em decorrencia de resultados falso

negativos. Com os soros negativos o diagnóstico foi confirmado em todos os antígenos

testados, sem resultados falsos.

Após três meses de conservação das placas, os resultados mostraram que os

antígenos E e F identificaram 100% (54/54) dos soros verdadeiramente positivos e

nenhum deles apresentou resultados falso negativos. Os demais antígenos A 92,6%

(50/54), B 87% (47/54), C 96,2% (52/54), e D 89% (48/54) identificaram dezenove

soros como falso negativos (4; 7; 2 e 6 respectivamente). Exceto o antígeno B, todos os

outros mostraram leituras na zona cinza. Nos testes com os soros negativos, os

antígenos A, C e D identificaram falso positivos (4, 2 e 1 amostras, respectivamente).

Os antígenos A, C, D, E e F mostraram leituras na zona cinza.

Após seis meses, os testes se mostraram muito semelhantes aqueles apresentados

pelos antígenos após os 3 meses de conservação das placas para os soros positivos.

Dentre os soros positivos, os antígenos A e F identificaram 100% (54/54) das amostras

corretamente e nenhum deles presentou resultados falso negativos. Os antígenos D e E

identificaram 98% (53/54) com 1 resultado falso negativo cada. O antígeno C

identificou 96,2% (52/54) e o antígeno B 91% (49/54). Todos apresentaram resultado

em zona cinza (Tabela 4).

Em relação aos soros negativos D, E e F apresentaram concordancia total de

100% (49/49). Os demais apresentaram A 96% (47/49), B 92% (45/49) e C 98%

(48/49). Houve 7 resultados falso positivos detectados pelos antígenos A, B e C. Todos

apresentaram leituras em zona cinza.

A Tabela 3 mostra um consolidado dos resultados dos testes realizados nos três

tempos.

58

Tabela 3 Teste de ELISA nos tempos de 24 horas, três e seis meses após a

sensibilização das placas, com os antígenos A, B, C, D, E e F, em soros

caninos padrões positivo e negativo para leishmaniose visceral.

Antígeno A

24 horas 3 meses 6 meses

Positivo Negativo Total de

Soros Positivo Negativo

Total de


Total de

Soros

Positivo 53 0 53 50 4 54 54 2 56

Negativo 1 49 50 4 45 49 0 47 47

Total de Testes 54 49 103 54 49 103 54 49 103

Antígeno B




Total de


Total de

Soros

Positivo 52 0 52 47 0 47 49 4 53

Negativo 2 49 51 7 49 56 5 45 50

Total de Testes 54 50 103 54 49 103 54 49 103

Antígeno C




Total de


Total de

Soros

Positivo 53 0 53 52 2 54 52 1 53

Negativo 1 49 50 2 47 49 2 48 50

Total de Testes 54 49 103 54 49 103 54 49 103

Antígeno D




Total de


Total de

Soros

Positivo 53 0 53 48 1 49 53 0 53

Negativo 1 49 50 6 48 54 1 49 50

Total de Testes 54 49 103 54 49 103 54 49 103

Antígeno E




Total de


Total de

Soros

Positivo 54 0 54 54 0 54 53 0 53

Negativo 0 49 49 0 49 49 1 49 50

Total de Testes 54 49 103 54 49 103 54 49 103

Antígeno F




Total de


Total de

Soros

Positivo 53 0 53 54 0 54 54 0 54

Negativo 1 49 50 0 49 49 0 49 49

Total de Testes 54 49 103 54 49 103 54 49 103

59

Os resultados apresentados na Tabela 3 mostram que o antígeno E e F

mostraram resultados mais coerentes com a condição positivo ou negativo do soro

testado, uma vez que apresentaram apenas um resultado falso, entretanto 17 soros

mostraram resultados de leitura na zona cinza para cada um. Os antígenos B, e D

apresentaram menos resultados de leitura na zona cinza, porém, mostraram resultados

falsos, tanto negativos quanto positivos. Os antígenos A e C apresentaram 32 e 20

resultados em zona cinza respectivamente e da mesma forma que os anteriores,

mostraram testes falsos positivos e negativos.

Tabela 4 Valores percentuais e absolutos de número de amostras classificadas como

Zona Cinza, acima e abaixo do ponto de corte do ELISA, durante todas as

fases do experimento.

Antígenos A (%) B (%) C (%) D (%) E (%) F (%)

Tempo

24 horas

ZC+ 9 (5/54) 7 (4/54) 4 (2/54) 2 (1/54) 6 (3/54) 7 (4/54)

ZC- 2 (1/49) 2 (1/49) 0 (0/49) 2 (1/49) 0 (0/49) 0 (0/49)

Total 6 (6/103) 5 (5/103) 2 (2/103) 2 (2/103) 3 (3/103) 4 (4/103)

3 meses

ZC+ 15 (8/54) 0 (0/54) 9 (5/54) 6 (3/54) 6 (3/54) 7 (4/54)

ZC- 12 (6/49) 0 (0/49) 4 (2/49) 0 (0/49) 6 (3/49) 4 (2/49)

Total 14 (14/103) 0 (0/103) 7 (7/103) 3 (3/103) 6 (6/103) 6 (6/103)

6 meses

ZC+ 11 (6/54) 7 (4/54) 13 (7/54) 9 (5/54) 7 (4/54) 7 (4/54)

ZC- 12 (6/49) 10 (5/49) 8 (4/49) 4 (2/49) 8 (4/49) 6 (3/49)

Total 12 (12/103) 9 (9/103) 11 (11/103) 7 (7/103) 8 (8/103) 7 (7/103)

Total

Geral 10 (32/309) 5 (14/309) 6 (20/309) 4 (12/309) 6 (17/309)

6

(17/309)

ZC+ amostras situadas acima do ponto de corte ZC- amostras situadas abaixo do ponto de corte

A maior porcentagem dos animais em ZC ficou representada em todos os tempos pelo

antígeno A (10%). Valores menores foram encontrados, nas 24 horas após a

sensibilização das placas pelos antígenos C e D, nos três meses de sensibilização com o

antígeno B e aos seis meses pelos antígenos D e F.

60

Nas reações realizadas com 24 horas, nas amostras em zona cinza não houve soros

falsos positivos ou negativos. Já nos três meses ocorreram resultados falsos positivos

nas zonas cinzas dos antígenos A (uma amostra) e C (duas amostras). Nas placas

conservadas por seis meses, todos os antígenos com exceção do F apresentaram

resultados falsos, sendo dois falso positivos para o antígeno A e um falso negativo para

cada um dos antígenos B, C, D e E.

Os valores da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor

preditivo negativo do teste ELISA nos três tempos foram avaliados com intervalo de

confiança de 95% e os resultados estão mostrados nas figuras 8, 9 e 10, a seguir:

Figura 8 Comparação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor

preditivo negativo dos antígenos utilizados no teste ELISA 24 horas após a

sensibilização das placas. (A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400

(Leishmania (L) chagasi), cultivadas em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); D e

F, BH46 e BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em meio α-MEM SFB 10%)

61


preditivo negativo dos antígenos utilizados no teste ELISA três meses após a

sensibilização das placas. (A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400




preditivo negativo dos antígenos utilizados no teste ELISA seis meses após a

sensibilização das placas. A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400


F, BH46 e BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em meio α-MEM SFB 10%

Nas 24 horas após a sensibilização das placas, todos os antígenos apresentaram

valores muito próximos para sensibilidade, especificidade, valores preditivo positivo e

62

preditivo negativo, variando de 96-100% (Figura 8). O índice de concordância de

Youden foi de 0,96 (antígeno B); 0,98 (antígenos A, C, D e F) e 1,00 (antígeno E).

Após três meses os antígenos E e F apresentaram valores de 100% para todos os

quesitos avaliados. Para os outros antígenos a sensibilidade variou de 87 a 96%, a

especificidade de 92 a 100%, o valor preditivo positivo de 93 a 100% e o valor preditivo

negativo de 88 a 96% (Figura 9). O índice de concordância de Youden variou de 0,85

(antígeno A); 0,87 (antígenos B e D); 0,98 (antígeno C) e 1,00 (antígeno E e F).

Aos seis meses o antígeno F foi o único que mostrou valor de 100% para todas

as variáveis avaliadas. Para os outros antígenos a sensibilidade variou de 91 a 100%, a

especificidade de 92 a 100%, o valor preditivo positivo de 92 a 100% e o valor preditivo

negativo de 96 a 96% (Figura 10). O índice de concordância de Youden foi de 0,81

(antígeno B); 0,96 (antígeno C) e 1,00 (antígeno A, D, E e F).

5.3.2 Reação de Imunofluorescência Indireta

A Reação de Imunofluorescência Indireta foi realizada com cada um dos

antígenos em apenas um momento do experimento, 30 dias, após a preparação dos

antígenos. Quando reagente, o soro foi diluído até o limite para a negatividade Os

resultados estão expressos nas figuras 11 e 12.

63

Figura 11 Teste da RIFI realizados em soros de cães portadores de leishmaniose visceral com diferentes antígenos. (A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400



Figura 12 Teste da RIFI realizados em soros de cães negativos para leishmaniose visceral

com diferentes antígenos. (A, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis); C e E, BH46 e BH400

(Leishmania (L) chagasi), cultivadas em em meio LIT; B, BH6 (Leishmania (L.) amazonensis);

D e F, BH46 e BH400 Leishmania (L) chagasi, cultivadas em em meio α-MEM SFB 10%)

Nas reações realizadas com os soros verdadeiramente positivos foram

observados sete soros falso negativo quando o teste foi realizado com os antígenos C e

D. Para aos soros verdadeiramente negativos os resultado do teste foi coincidente para

100% dos soros com todos os antígenos.

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

s

POSITIVO

NEGATIVO

0 20 40 60 80 100

A

B

C

D

E

F

%

An

tíge

no

s

POSITIVO

NEGATIVO

64

A comparação entre a sensibilidade, especificidade, valores preditivo negativo e

positivo está apresentada na figura 13.

Figura 13 Comparação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e, valor preditivo negativo dos antígenos utilizados na Reação de Imunofluorescência

Indireta –RIFI.

Os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor

preditivo negativo, que foram de 100% para os antígenos A, B, E, F. Os antígenos C e

D, por apresentarem sete resultados falsos negativos, apresentaram valores de

sensibilidade e valor preditivo negativo de 87%. Para especificidade e valor preditivo

positivo estes valores foram de 100%. O índice de concordância Kappa foi de 0,87 para

os antígenos C e D e de 1,00 para os demais.

5.4 Reações de RIFI e ELISA com os kits de Biomanguinhos

Os soros selecionados para o experimento foram também testados pelo kit

ELISA de Biomanguinhos (LOTE 086EL007Z). Este kit é atualmente utilizado por

laboratórios da rede pública para o diagnóstico da LVC. Os resultados são mostrados na

Figura14

80%

85%

90%

95%

100%

A B C D E F

Sensibilidade 100% 100% 87% 87% 100% 100%

Especificidade 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Valor Preditivo Positivo 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Valor Preditivo Negativo 100% 100% 87% 87% 100% 100%

%

Antígenos

Sensibilidade Especificidade Valor Preditivo Positivo Valor Preditivo Negativo

65

Figura 14 Teste de ELISA realizado em soros verdadeiramente positivos e negativos para

leishmaniose visceral canina com o kit Biomanguinhos, LOTE 086EL007Z

Não houve resultados falso negativos entretanto, entre os soros negativos 10

amostras foram identificadas como falso positivos e 5 mostraram valores de leitura

dentro da zona cinza.

Estes soros foram testados também com o kit de RIFI de Biomanguinhos (LOTE

086LC004Z), que utiliza como antígeno a cepa BH6 - Leishmania (L.) amazonensis

(MHOM/BR/1960/BH6), crescida em meio LIT. Os resultados são mostrados na

Figuras 15.

Figura 15 Teste de RIFI realizado em amostras de soros positivos e negativos para

leishmaniose visceral canina como kit Biomanguinhos, LOTE 086LC004Z.

Os resultados mostraram um soro falso negativo entre aqueles comprovadamente

positivos para LVC. Os soros comprovadamente negativos mostraram doze resultados

falso positivos com o kit RIFI de Biomanguinhos.

0

20

40

60

80

100

Soros positivos Soros Negativos

%

Zona Cinza

Negativo

Positivo

0

20

40

60

80

100

Soros Positivos Soros Negativos

% Negativo

Positivo

66

Os valores da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo

negativo das reações sorológicas realizadas com os kits ELISA e RIFI Biomanguinhos

são mostrados na Figura 16 O índice de concordância Kappa foi de 0,80 para o ELISA e

de 0,90 para a RIFI.

Figura 16 Comparação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e, valor preditivo negativo dos antígenos dos kit-ELISA Biomanguinhos LOTE

086EL007Z e kit- RIFI Biomanguinhos LOTE 086LC004Z

5.5 Relação entre os títulos da RIFI e os valores de absorbância do

ELISA

Nos gráficos a seguir (Figuras 17, 18 e 19) são mostradas as linhas de regressão

representando as médias de absorbância do ELISA em relação aos títulos da RIFI. Foi

realizada para cada tempo a Análise de Variância (ANOVA) para evidenciar possíveis

diferenças significativas entre as médias de absorbância do ELISA, mostradas com cada

um dos antígenos, e calculado o Coeficiente de Determinação (R2) para evidenciar o

quanto da variação total é comum aos elementos que constituem os pares analisados, ou

seja, se quando um dos pares varia o outro também sofre variação. Quando o valor de

R2 é maior do que 0,60 indica uma boa correlação.

0

20

40

60

80

100

ELISA RIFI

Sensibilidade 100 98

Especificidade 80 76

Valor Predetivo Positivo 84 82

Valor Preditivo negativo 100 97

Sensibilidade Especificidade Valor Predetivo Positivo Valor Preditivo negativo

67

Figura 17 Relação entre os valores de absorbância do ELISA, após 24 horas de

sensibilização das placas, e os títulos das diluições da RIFI e a tendência das

linhas de regressão para os antígenos A, B, C, D, E e F.

1-Negativo 2-1:40 a 1:80 3-1:160 a 1:320

4-1:640 a 1:1280 5-1:2560 a 1:5120 6-1:10240 a 1:20480

Considerando-se um valor de diluição da RIFI e correlacionando-se com o valor

correspondente do ELISA, percebe-se que as absorbâncias são bem maiores para os

antígenos E e F. Isto é particularmente interessante na RIFI para os soros negativos e

para os primeiros títulos positivos (códigos 1 e 2 respectivamente), o que significa que

estes dois antígenos são capazes de apresentar valores baixos de absorbância para

amostras negativas e valores altos para positivas e desta forma, diferenciam melhor os

soros. O gráfico mostra também que as absorbâncias do ELISA estão positivamente

correlacionadas com os títulos da RIFI, com exceção dos antígenos B e F para títulos de

RIFI maiores que 1:2560 (p=0,000 e R2= 0,685).

68

Figura 18 Relação entre os valores de absorbância do ELISA, após três meses de sensibilização das placas, e os títulos das diluições da RIFI e a tendência das


1-Negativo 2-1:40 a 1:80 3-1:160 a 1:320

4-1:640 a 1:1280 5-1:2560 a 1:5120 6-1:10240 a 1:20480

Nos três meses, a ANOVA também mostrou que as diferenças das médias de

absorbância do ELISA são significativas no nível de 5% (p=0,000 e R2=0,692). Os

antígenos que mostraram melhor desempenho em diferenciar resultados positivos dos

negativos foram C e E, apresentando para leituras de RIFI entre 1:40-1:80 valores de

ELISA acima de 0,300. As absorbâncias de ELISA estão diretamente correlacionadas

com os títulos da RIFI, com exceção do antígeno F, para títulos acima de 1:2560.

69

Figura 19 Relação entre os valores de absorbância do ELISA, após seis meses de

sensibilização das placas, e os títulos das diluições da RIFI e a tendência das


1-Negativo 2-1:40 a 1:80 3-1:160 a 1:320

4-1:640 a 1:1280 5-1:2560 a 1:5120 6-1:10240 a 1:20480

Após os seis meses a ANOVA mostrou ainda significância entre médias de

absorbância do ELISA obtidas com os antígenos C, D, E e F (p=0,000 e R2=0,697). Já

para os antígenos A e B não foram encontradas diferenças (p=0,266 e R2=0,692).

Os antígenos C e E apresentaram melhor capacidade para distinguir soros

positivos e negativos, porém, considerando-se o título dos negativos, o antígeno C

apresenta maiores valores de absorbância, tornando-se inferior ao antígeno E.

Independente do antígeno, as absorbâncias aumentam significativamente com o

aumento dos títulos da RIFI.

Considerando-se que os antígenos E e F apresentaram uma melhor performance

em relação aos demais, demonstrada por seus valores de sensibilidade, especificidade,

valores preditivos positivos e negativos e índice de concordância de Youden, foi

realizada uma análise isolada dos mesmos em relação aos títulos de RIFI, mostradas nas

Figuras 20 e 21 e 22.

70

5.5.1 Avaliação dos antígenos com melhor desempenho nos testes de

ELISA com 24 horas, três meses e seis meses após a sensibilização das

placas.

Considerando-se que os antígenos E e F apresentaram uma melhor performance

em relação aos demais, demonstrada por seus valores de sensibilidade, especificidade,

valores preditivos positivos e negativos e índice de concordância de Youden, foi

realizada uma análise isolada dos mesmos em relação aos títulos de RIFI., mostradas

nas Figuras 20 e 21 e 22.

Figura 20 Comparação das linhas de tendência dos antígenos E e F, mostrando a relação entre os valores de absorbância do ELISA, 24 horas após a sensibilização das

placas, e os títulos das diluições da RIFI

Nas reações do ELISA, realizadas 24 horas após a sensibilização das placas,

quando comparadas com os resultados da RIFI observou-se que as médias das

absorbâncias são significativamente diferentes (ANOVA p=0,000; R2

2=0,671) para

ambos os antígenos, com valores maiores para o antígeno E, que apenas nos títulos mais

altos da RIFI discrimina melhor os positivos dos negativos (Códigos 4 e 6). A tendência

do aumento da absorbância em função dos títulos da RIFI é semelhante para os dois

antígenos. Portanto, baseados neste resultado, poderia ser escolhido o antígeno E ou F.

1-Negativo 2-1:40 a 1:80 3-1:160 a 1:320

4-1:640 a 1:1280 5-1:2560 a 1:5120 6-1:10240 a 1:20480

71

Figura 21 Comparação das linhas de tendência dos antígenos E e F, mostrando a relação entre os valores de absorbância do ELISA, três meses após a sensibilização das

placas, e os títulos das diluições da RIFI

1-Negativo 2-1:40 a 1:80 3-1:160 a 1:320

4-1:640 a 1:1280 5-1:2560 a 1:5120 6-1:10240 a 1:20480

A Figura 21 mostra resultados semelhantes aos da Figura 20 para a

significância da diferença das médias de absorbâncias do ELISA, realizado três meses

após a sensibilização das placas, (ANOVA p=0,000; R2

2=676). O antígeno F discrimina

menos os negativos dos positivos nos códigos 2 e 6 da RIFI, e nestes pontos observa-se

também que a tendência do aumento da absorbância em função dos títulos da RIFI é

diferente. Em vista deste resultado, a escolha deve ser do antígeno E. Entretanto, não

deve ser descartada a possibilidade de erro ou interferência de um fator externo, uma

vez que esta etapa apresenta perfil diferente do mostrado para a reação nas 24 horas.

72

Figura 22 Comparação das linhas de tendência dos antígenos E e F, mostrando a relação

entre os valores de absorbância do ELISA, seis meses após a sensibilização das placas, e os títulos das diluições da RIFI

1-Negativo 2-1:40 a 1:80 3-1:160 a 1:320

4-1:640 a 1:1280 5-1:2560 a 1:5120 6-1:10240 a 1:20480

Seis meses depois de sensibilizadas as placas de ELISA, na comparação das

médias de absorbância do ELISA entre os dois antígenos os resultados mostraram

significância (ANOVA p=0,000; R2=710), e tendências semelhantes do aumento da

absorbância em função dos títulos da RIFI. A capacidade de diferenciação de positivos e

negativos também foi igual e, portanto, pode-se escolher entre os antígenos E ou F.

Como a literatura descreve que não existe regra de similaridade para aumento da

absorbância do ELISA em função dos títulos da RIFI, este fator não foi considerado

como desclassificatório para o antígeno F em relação ao antígeno E, uma vez que

obteve excelente desempenho quando calculados os valores de sensibilidade,

especificidade, valores preditivos positivos e negativos e índice de concordância de

Youden nas técnicas de ELISA e de RIFI.

73

5.6 Teste de Reações Cruzadas

As reações com soros de cães portadores de outras patologias, para testar a

presença de reações cruzadas foram realizadas com o antígeno F e os resultados estão

expressos na Tabela 5.

Tabela 5 Teste de ELISA em soro de cães portadores de Leishmaniose Tegumentar,

Babesiose, Erlichiose e Doença de Chagas com o antígeno F

Soro de Cães/ Patologia

Número de Amostras

Resultados Positivos

% Resultados Negativos

%

Leishmaniose Tegumentar 18 18/18 100 0 0

Babesiose 7 0/7 0 7 100

Erlichiose 8 0/8 0 8 100

Doença de Chagas 18 15/18 83 3 17

Ocorreram reações cruzadas com os soros de cães portadores de Doença de

Chagas (15/18) e Leishmaniose Tegumentar (18/18). Os soros de animais portadores de

Erlichiose e Babesiose não mostraram reações positivas nos teste frente ao antígeno F.

5.7 Escolha do melhor antígeno

Tendo em vista que a cepa BH400 foi considerada como a de melhor

desempenho em todas as análises realizadas, seja crescida no meio LIT ou no alfa -

MEM, a mesma foi escolhida como candidata a ser utilizada em kit diagnóstico

utilizando de ELISA para LVC. O perfil proteômico imunogênico da mesma foi feito na

cepa crescida em meio de cultura Alfa-MEM, que foi escolhido pela maior facilidade de

preparo e praticidade na obtenção os componentes. A análise proteômica-imunogênica é

de fundamental importância na identificação da proteína majoritária responsável por

maior antigenicidade, sendo que em estudos futuros a mesma pode ser seqüenciada e

empregada na sensibilização de placas de ELISA visando uma maior sensibilidade e

especificidade deste ensaio.

5.8 Western blot - 2D gel

As proteínas do antígeno obtido do crescimento da cepa BH400 em meio alfa -

MEM foram fracionadas em gel bidimensional que após corado por comassie, foi

74

transferido para membrana de nitrocelulose e posteriormente, incubado com um“pool”

de soros de cães com baixos títulos de anticorpos (RIFI 1:160) e outro “pool” de soros

com altos títulos de anticorpos (RIFI > 1:1280), assim como, um “pool” de soros de

animais não infectados. Após a incubação com conjugado anti IgG total de cão,

marcado com peroxidase (Sigma®), foi realizada uma sobreposição das membranas e

dos géis e feitas as comparações mostradas na Figura 23.

Figura 23 Gel 2-DE contendo 600g de proteínas de Leishmania chagasi (cepa BH400 crescida em meio α-MEM) fracionadas em tiras de 13 cm pH 4-7 (direita para esquerda) e SDS-PAGE a 12%. O gel foi corado por comassie (A) ou

transferido para membrana de nitrocelulose e incubadas com soros de animais

não infectados (B) e infectados que apresentavam baixos títulos de anticorpos

(C) e altos títulos de anticorpos (D). O conjugado utilizado foi anti-IgG total de cão. Em cada membrana estão destacados os “spots” detectados por cada grupo

de soros.

Observou-se que cerca de 350 “spots” foram visualizados nos géis (Figura 23A),

32 foram detectados nas membranas incubadas com soros negativos (Figura 23B) e nas

membranas incubadas com soros positivos, após exclusão das reações comuns ao

controle negativo, 41 “spots” foram reconhecidos por soros com baixos títulos de

A B

C D

MM

(kDa)

216

132

78

65

45

32

18

7.6

4 7 4 7

75

anticorpos (Figura 23C) e 52 com soros com altos títulos de anticorpos (Figura 23D).

Destaca-se que os soros com altos títulos de anticorpos reconheceram os mesmos

“spots” dos soros com baixos títulos além de outros 11 “spots”.

Inicialmente observa-se nas membranas uma região de baixa definição,

localizada nos pIs mais ácidos (entre 4 e 5,5) e na faixa de peso molecular mais alto

(acima de 45 kDa). Nessa região a reação de western blot não mostrou “spots”

individualizados, impossibilitando a contagem e localização dos mesmos nos géis. Após

a análise das membranas para seleção dos “spots” característicos de cada grupo de

soros, tentou-se localizá-los também nos géis. Dos 32 “spots” do grupo controle, 18

foram visualizados nos géis, do grupo de baixo título, foram visualizados 41 nas

membranas e 27 localizados nos géis, do grupo de alto título, foram visualizados 52 nas

membranas e 37 localizados nos géis, sendo que dos 11 “spots” exclusivamente

reconhecidos por soros de alto título, 10 foram vistos nos géis. Esses dados estão

resumidos na Tabela 5 e podem ser visualizados na Figura 24.

Tabela 6 “Spots” observados na análise proteômica do antígeno da cepa BH400 crescida

em meio Alfa-MEM.

MEMBRANA “spots” observados nas

membranas

“spots” localizados nos

géis

Controle negativo 32 18

Soros com baixos títulos de

anticorpos 41 27

Soros com altos títulos de

anticorpos 52 37

76

Figura 24 Gel 2-DE contendo 600g de proteínas de Leishmania chagasi (cepa BH400

crescida em meio α MEM) fracionadas em tiras de 13 cm pH 4-7 (esquerda para

direita) e SDS-PAGE a 12% corado por comassie. Em destaque em vermelho,

os “spots” reativos frente a soros de cães não infectados, em azul “spots” reativos frente a cães que apresentam baixos títulos de anticorpos e em preto os

“spots” reativos frente a soros de cães que apresentam altos títulos de

anticorpos.

MM

(kDa)216132

78

65

45

32

18

7.6

4 7

77

6. Discussão

Levando em consideração as características epidemiológicas da leishmaniose

visceral, onde faltam conhecimentos fundamentais sobre os fatores de risco, sobretudo

relacionados às mudanças no meio ambiente naturais ou introduzidas pelo homem, a

resposta imune protetora e ao aumento de casos resistentes ao tratamento de primeira

escolha (antimoniais pentavalentes), a LV é um problema preocupante no que diz

respeito à Saúde Pública, principalmente quando se trata das formas zoonóticas, como

as que ocorrem na América

Um dos principais fatores de risco da LV são os fenômenos da urbanização da

doença, sobretudo na América. No Brasil as estratégias de controle da doença estão

focadas no diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos, redução da população

de flebotomíneos vetores, eliminação do reservatório canino e atividades de educação

em saúde, lembrando sempre que o diagnóstico e tratamento dos doentes é prioritário,

ao lado das atividades de educação em saúde, mas estas medidas devem estar sempre

integradas para que possam ser efetivas.

O reservatório nos ambientes doméstico e peridoméstico é o cão (Canis

familiaris) que é um dos elos mais importantes da cadeia epidemiológica, para o ciclo

de manutenção da doença. Uma das ferramentas recomendadas oficialmente pelo

Ministério da Saúde nos inquéritos epidemiológicos para diagnóstico dos animais

positivos são os testes de ELISA e RIFI. Portanto, a precocidade do diagnóstico tem

grande importância no sucesso das medidas de controle, que devem ser aplicadas

integradas.

O cão, como o homem, pode apresentar um espectro de manifestações clínicas

variadas, condicionadas à imunocompetência individual. Muitos animais podem

permanecer sem sinais clínicos por longo período de tempo (Deane 1956; Marzochi,

1994, Almeida et al., 2005). O diagnóstico da LVC, em especial, se apresenta como um

problema para os serviços de saúde pública, principalmente devido à inexistência de um

teste diagnóstico 100% específico e sensível. O diagnóstico clínico é difícil, os médicos

veterinários têm muitas vezes problemas, pois há um amplo espectro de sinais clínicos e

muitos sinais são comuns a várias doenças prevalentes nos cães. Atualmente, testes

sorológicos, exames parasitológicos e técnicas moleculares que possuem sensibilidade e

especificidade distintas, ajudam na elucidação da positividade para LVC (Feitosa et al.,

78

2000; Singh et al., 2003; Feitosa, 2006). Avanços têm ocorrido nos últimos anos, e há

uma série de métodos sorológicos para avaliação “in vitro” de anticorpos presentes em

humanos e cães, mas estes ainda requerem melhoramentos, sobretudo quanto à

reatividade cruzada com outros tripanossomatídeos e no caso do homem, sorologia

residual pós-terapêutica.

A utilização de testes sorológicos para detecção de anticorpos circulantes para

Leishmania spp. vem sendo utilizada principalmente em estudo soro-epidemiológicos,

evitando assim os métodos parasitológicos, que são invasivos e de pouca praticidade

(Gontijo e Melo, 2004).

No Brasil, o diagnóstico sorológico canino era realizado com a técnica de RIFI,

considerando-se reagentes todos os soros com positividade a partir da diluição 1:40. Em

2002, o Ministério da Saúde recomendou a introdução do teste de ELISA para a triagem

inicial e da RIFI para a confirmação dos resultados positivos (Ministério da Saúde,

2003). Estes métodos nem sempre alcançam sensibilidades e especificidades

satisfatórias, já que muitos animais infectados apresentam testes sorológicos negativos.

Além disso, esses dois testes podem apresentar, em alguns casos, resultados divergentes

no diagnostico da LVC (Zanette, 2006). Sabe-se que os resultados de qualquer prova

sorológica são influenciados por inúmeros fatores como o tipos de antígeno utilizado, a

coexistência de infecções que propiciam reações cruzadas e a magnitude da resposta

imune individual (Lainson & Rangel 2005). De maneira geral, o maior obstáculo para a

interpretação de dados sorológicos é a ausência de informações parasitológicas

(Madeira et al., 2006).

A RIFI apresenta como principais limitações diagnósticas a reatividade cruzada

com outras doenças, como leishmaniose tegumentar, doença de Chagas, malária,

esquistossomose e tuberculose pulmonar, além de exigir muito tempo para a leitura das

lâminas quando da análise de um grande número de amostras, além da subjetividade dos

examinadores na leitura de reações fracamente positivas. Possui também sensibilidade

reduzida para detecção de cães assintomáticos (Braga et al., 1998; Sundar et al., 2002;

Almeida et al., 2004)

A técnica de ELISA pode apresentar em alguns casos reações cruzadas e

inespecíficas, mas possui certas vantagens como leitura automatizada não dependente

do observador, necessita de apenas uma diluição do soro, é de fácil execução e permite

que vários testes possam ser processados rapidamente ao mesmo tempo, possui baixo

79

custo e sensibilidade e especificidade adequadas quando comparada a outros métodos

(Dantas-Torres et al., 2006; Ikeda-Garcia e Marcondes, 2007). Estes facilitadores

contribuem para que esta técnica venha sendo utilizada em levantamentos

epidemiológicos (Sundar et al., 2002).

Métodos de ELISA utilizando o antígeno total do parasito são descritos para o

diagnóstico da doença canina e humana (Mohammed et al., 1985; Martin et al., 1998;

Lima et al., 2003). A preparação de antígeno total é simples, grandes quantidades são

produzidas sob condições padronizadas e apresenta determinados epítopos antigênicos

que não estão presentes no antígeno solúvel. (Evans et al., 1990). Recentemente, vários

antígenos recombinantes de Leishmania têm sido testados como ferramentas para

melhorar o diagnóstico da LV em cães. Rosário (2005) recomenda a associação de

antígenos brutos e recombinantes como uma estratégia interessante a ser utilizada em

programas de controle da doença. Gontijo e Melo (2004) afirmam que deve ser dada

ênfase à pesquisa de componentes antigênicos purificados que possam ser utilizados

como ferramenta de diagnóstico específico, assegurando maior sensibilidade e

especificidade aos testes sorológicos. Os antígenos purificados têm mostrado maior

sensibilidade que os antígenos brutos, mas sua preparação muitas vezes demorada pode

requerer métodos sofisticados de purificação, além de mostrar muitas vezes problema na

reprodução dos resultados. Antígenos recombinantes são mais fáceis de obter e alguns

já se encontram disponíveis para o diagnóstico da LV humana e canina (Gontijo e Melo,

2004).

Em nosso estudo, para a padronização de um antígeno a ser utilizado no

diagnóstico da LVC pelos órgãos de saúde pública, decidiu-se trabalhar com ELISA e

RIFI por serem os métodos recomendados pelo Ministério da Saúde em inquéritos soro-

epidemiológicos (Brasil-Ministério da Saúde, 2003).

Na seleção inicial dos animais doadores de soro, para melhor categorizar as

amostras, nós utilizamos a própria sorologia RIFI e ELISA, além da pesquisa direta do

parasito em esfregaços por extensão de material de medula óssea, semeadura da medula

óssea em meio alfa - MEM acrescido de 10% de soro fetal bovino, e ainda a PCR. Só

consideramos positivas ou negativas as amostras com concordância entre os testes

sorológicos e parasitológicos. Sete cães apresentaram-se positivos no exame

parasitológico pela técnica de PCR, mas negativos sorologicamente nas reações de

ELISA e RIFI e tiveram que ser excluídos do experimento, pois a padronização de um

80

antígeno só permite trabalhar com animais devidamente categorizados como positivos

ou negativos. Estes dados corroboram com os observados por Moreira et al. (2002),

Brasil (2003) e Barrouin-Mello et al.(2006), que evidenciam a existência de animais

portadores do parasito mas ainda negativos sorologicamente. De acordo com estes

autores tratam-se de indivíduos na fase inicial da doença e, portanto, com títulos de

anticorpos baixos que não podem ser detectados sorologicamente. Com o passar do

tempo e de acordo com a magnitude da resposta imune individual, estes animais

poderão soroconverter-se ou progredir pra autocura, ou ainda permanecerem neste

estado indefinidamente (Neves, 2005).

Desde o início dos anos 1990, o Departamento de Parasitologia, através do setor

de Leishmanioses, que abriga vários laboratórios, iniciou um estudo para obtenção de

um antígeno bruto, que pudesse ser utilizado nas reações de ELISA e que mostrasse ser

mais específico e sensível que o então empregado no laboratório de Sorologia de

Leishmania. O antígeno inicialmente empregado era obtido a partir da cepa BH6,

mesma que foi depois empregada pelo laboratório de Biomanguinhos na confecção dos

kits diagnósticos de ELISA e RIFI para os inquéritos epidemiológicos. Mesmo sendo

uma cepa de L. amazonensis ela foi utilizada, pois há uma reação cruzada das

Leishmaniae entre si nestas duas técnicas utilizando antígeno bruto. Já as cepas BH46 e

BH400 não são utilizadas na confecção dos kits diagnósticos de saúde pública, mas seu

uso neste estudo se explica pelo fato de se tratarem de Leishmania chagasi (sinômino de

L. infantum), agente específico da LV humana e canina, respectivamente.

Nesses estudos ao longo do tempo as cepas BH6 e BH46 começaram a ser

testadas no preparo de antígenos, com diferentes concentrações dos mesmos, diferentes

concentrações de conjugados e diferentes conservantes, mertiolate 1:10.000,

iodacetamida 1:10.000 e o acréscimo de tioglicolato de sódio em pequenas

concentrações, abaixo de 0,5%, como adjunto para a conservação. Foram ainda testadas

diferentes concentrações de soros, 1:80, 1:100, 1:200 e 1:400 (dados não mostrados).

Desses estudos não resultaram publicações, porque o setor de leishmanioses não tinha

interesse de publicar resultados incompletos, além de tratar-se de um trabalho técnico na

busca de um antígeno para ELISA, que não mostrasse reações cruzadas com outras

patologias caninas e que fosse capaz de indicar com segurança os cães realmente

positivos e negativos para LVC. Esses trabalhos contribuíram para mostrar, por

exemplo, que a cepa BH46, que também é utilizada nesta tese, na diluição do soro

81

1:400, com o antígeno na concentração de 2µg/ml mostrava melhores resultados em

discriminar cães com LVC positivos e negativos na reação de ELISA (dados não

mostrados). Utilizando este antígeno publicamos recentemente um trabalho, anexado a

esta tese: “Humoral Immunological profile and Parasitological Statuses of Leishmune®

Vaccinated and Visceral Leishmaniasis Infected Dogs from an Endemic Area” onde

foram utilizados antígenos de BH46 nos testes comparativos entre cães vacinados com

Leishmune®

e cães naturalmente infectados.

Este antígeno passou a ser utilizado nos trabalhos de Sorologia de Leishmania

no setor de Leishmanioses do Departamento de Parasitologia. A literatura já havia

mostrado que testes de ELISA com antígenos homólogos apontavam, usualmente, uma

sensibilidade mais alta (revistos por Romero & Boleart, 2010).

No presente trabalho nós incorporamos a cepa BH400 também de L. chagasi,

isolada de um cão com LVC no município de Belo Horizonte, área endêmica para LV

humana e canina. Esta cepa foi testada porque na nossa rotina de manutenção, já

havíamos observado que ela cresce bem em meios de cultura e mostrava maior

infecciosidade para hamsters, em relação a cepa BH46.

Nós testamos os antígenos com promastigotas das cepas escolhidas em dois

diferentes meios de cultura “Liver Infusion Tryptose”-LIT e meio Alfa-MEM acrescido

de 10% de Soro Fetal Bovino. Nos últimos anos diferentes meios de cultura têm sido

desenvolvidos para cultivo de Leishmania sp. e podem ser classificados em duas

grandes categorias: bifásicos semi-sólidos e monofásicos líquidos. Assim, o meio Novy-

MacNeal-Nicolle (NNN) (Nicolle, 1908) e outros do tipo bifásico são habitualmente

usados para manutenção inicial de formas promastigotas de Leishmania (Schuster e

Sullivan, 2002; Chouihi et al., 2009; Rodrigues 2010). A relativa facilidade com que

formas promastigotas de Leishmania sp. podem ser cultivadas axenicamente in vitro,

em uma série de meios de cultura bifásicos ou monofásicos, levou ao conhecimento

aprofundado sobre os mecanismos metabólicos e moleculares de promastigotas de

Leishmania sp.(Somanna et al. 2002). Diversos autores descrevem o comportamento de

cepas de Leishmania sp. em diferentes meios de cultura e mostram que pode ocorrer

expressão de diferentes epítopos antigênicos quando os parasitos são cultivados em

meios com formulações diferentes, e que isto se dá devido à composição química do

meio que vai favorecer ou não esta expressão (Schuster e Sullivan, 2002; Somanna et al.

2002; Muniaraj et al., 2007; Cuervo et al., 2009; Rodrigues, 2010).

82

Decidimos trabalhar com os meios de cultura LIT e Alfa-MEM, que já são

utilizados nas rotinas laboratoriais de isolamento e crescimento de Leishmania sp., no

Setor de Leishmanioses do Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências

Biológicas da UFMG, e com efetividade comprovada em diversos trabalhos de pesquisa

(comunicação pessoal, M.N.Melo).

O meio LIT é tradicionalmente usado para identificação, isolamento e

crescimento de Leishmania sp. por diversas instituições de pesquisa inclusive pelo

laboratório de Biomanguinhos na confecção de kits diagnósticos de ELISA e RIFI. O

preparo do meio envolve uma série de etapas, como a utilização de componentes do

sangue bovino, ajuste de pH para a faixa situada entre 7,2 e 7,4 e inserção de

antibióticos. É composto de triptose, infuso de fígado, soro e hemoglobina bovina

(Camargo 1964), substâncias de origem biológica que nem sempre são passíveis de

padronização bioquímica, uma vez que são provenientes de diferentes animais que

podem ser de raças diferentes, diferentes idades e sexo, embora da mesma espécie. É

um meio artesanal, que consome muito tempo na sua preparação, e não estando

disponível comercialmente.

O meio α-MEM é um meio disponível no comércio na forma de uma mistura

seca, contém ribonucleosídeo, deoxiribonucleosídeo, sais minerais, aminoácidos,

vitaminas e bicarbonato de sódio, e para sua confecção basta ser dissolvido e adicionado

de soro fetal bovino, também disponível comercialmente. Este meio é muito mais

simples e fácil de ser preparado quando se quer crescer Leishmania sp. em larga escala.

Da mesma forma que o meio de LIT, é também largamente utilizado por diversas

instituições de pesquisa.

A sensibilidade e a especificidade do teste de ELISA são diretamente

influenciadas pela qualidade do antígeno empregado na sensibilização das placas

(Liberal et al.,1992; Tully, 1996). Placas sensibilizadas com um maior número de

antígenos, como os presentes em antígenos brutos, proporcionam bons resultados,

especialmente em testes de triagem, dando oportunidade de identificação de diferentes

indivíduos que respondem de maneira individual a um mesmo agente, ou seja, as

variedades antigênicas determinam as diferentes avidezes dos anticorpos. Porém, a

baixa estabilidade do tipo de antígeno pode comprometer seu uso (Brown et al., 1996).

Em nosso trabalho, as placas de ELISA foram sensibilizadas com antígenos alcalinos de

promastigotas de diferentes cepas adicionados de um inibidor de proteases, sendo

83

bloqueadas para posterior estocagem em freezer a -20ºC. Esta estocagem foi feita

segundo o protocolo desenvolvido neste projeto para produção de antígenos para ELISA

e os diferentes tempos de uso das placas permitiram realizar considerações sobre a

reprodutibilidade dos ensaios.

Não foram feitos neste projeto avaliações periódicas do antígeno ao longo do

tempo de estocagem para verificar se houve mudanças na estrutura física do mesmo.

Testes bioquímicos e moleculares poderão futuramente ser conduzidos como

continuidade do estudo destas cepas para melhor compreensão deste processo.

Existem inúmeros trabalhos na literatura comparando a sensibilidade e

especificidade das reações de ELISA utilizando diferentes antígenos. Além do tipo de

antígeno empregado (espécie ou forma evolutiva do parasita) estes índices podem variar

também com mudanças no protocolo experimental padrão (tempo de incubação ou tipo

de microplacas utilizadas) (Reinthinger et al., 2002).

Como a maioria das preparações antigênicas para o teste de ELISA perde na

especificidade, em inquéritos sorológicos costuma-se usar este teste como triagem e a

RIFI como confirmatório. Entretanto, os testes sorológicos devem ser interpretados com

cautela, uma vez que não são 100% sensíveis e falham ao detectar cães infectados no

período pré-patente e, portanto, antes da soroconversão, cães que nunca farão

soroconversão e cães soropositivos que se convertem em soronegativos, mas ainda

permanecem infectados (Ferrer et al., 1995; Ferrer, 2002a; Leontides et al., 2002; Ikeda-

Garcia, 2006).

O teste de ELISA para pesquisa de anticorpos anti-Leishmania sp. apresenta,

dependendo do antígeno empregado, uma sensibilidade que varia entre 95% e 99,5% e

uma especificidade entre 97,1% a 100% (Laurenti et al., 2005; Mancianti et al., 1995).

Há, contudo, discordâncias entre alguns autores, os quais descreveram valores de

sensibilidade e especificidade de 80 e 81%, respectivamente (Ashford et al., 1995) e

outros que observaram valores de 100% para ambos os índices (Vercammen et al.,

1997).

Barbosa-de-Deus et al.(2002) utilizou antígeno bruto de L. major-like para o

teste de ELISA tendo a RIFI como padrão ouro. A análise de 188 soros caninos

positivos e 1582 negativos para LVC, além de 55 soros de animais portadores de

doenças que podem potencialmente acusar reação cruzada com LV apresentou uma

84

sensibilidade de 98%, especificidade de 95%, valor preditivo positivo de 66%, valor

preditivo negativo de 100% e uma taxa de concordância de 93%. Não houve número

significante de reações falso positivas e falso negativas nem reações cruzadas com

tumor venéreo transmissível, erliquiose, riquetsiose e Doença de Chagas. Concluiu-se

que o ELISA é um pouco mais sensível do que a RIFI, mas esta parece ser mais

específica.

Machado et al. (2006) trabalhando com antígeno bruto de Leishmania major e

utilizando imprint de baço dos animais soropositivos como padrão ouro, testou 86 soros

positivos e 57 negativos, encontrando 98,84% de sensibilidade e 100% de

especificidade para o ELISA. A concordância do ELISA com o padrão ouro foi ótima,

de acordo com os critérios do teste de Kappa. Os resultados demonstraram que a técnica

de ELISA, utilizando a L. major, apresentou valores elevados de sensibilidade e

especificidade, constituindo uma ferramenta importante para o diagnóstico e controle da

doença. Estes valores concordam com Oliveira et al. (2005) que encontraram

sensibilidade e a especificidade de 90% e 100% respectivamente utilizando antígeno

bruto de L. chagasi. Valores menores foram encontrados por Zanette (2006) usando

antígeno bruto de L. chagasi em área endêmica para LVC. O método de ELISA

apresentou 94% de sensibilidade e 84,4% de especificidade, além de boa concordância

com o método parasitológico (Kappa = 0,788).

Nossos resultados mostraram sensibilidade de 96 a 100% para todos os

antígenos testados na primeira fase do experimento (24 horas após sensibilização das

placas). Na segunda fase (três meses após sensibilização das placas), este parâmetro

variou de 87 a 100% e na terceira fase (seis meses após sensibilização das placas)

variou de 91 a 100%. Todos os dados foram calculados com 95% de intervalo de

confiança. De maneira geral, todos os antígenos testados revelaram uma boa

sensibilidade nos tempos testados, sendo que estes valores caíram de uma forma mais

significativa ao longo do tempo para os antígenos da cepa BH6. Os antígenos das cepas

BH400 crescidas nos meios LIT e α-MEM respectivamente mostraram sensibilidade de

98 a 100% em todas as fases do experimento evidenciando boa estabilidade ao tempo de

estocagem. Esta é a nosso ver uma característica que é desejável, quando se quer

produzir um kit para ser usado em inquéritos epidemiocensitários e epidemiológicos

pelos órgãos de Saúde Pública, quando os antígenos devem ter estabilidade para serem

85

transportados e usados por um tempo maior, sobretudo num país como o Brasil que tem

dimensões continentais.

A especificidade, calculada com 95% de intervalo de confiança, variou de 98 a

100% nos testes realizados 24 horas depois de sensibilizadas as placas e de 92 a 100%

após três e seis meses de conservação a -20°C. O antígeno da cepa BH400 crescida em

meio LIT e alfa - MEM mostrou especificidade de 100% em todos os momentos do

experimento.

Assim, a cepa BH400, Leishmania chagasi isolada de cão, independente do

meio de cultivo, foi considerada como a de melhor desempenho e escolhida como

candidata a ser utilizada em kit diagnóstico utilizando a técnica de ELISA para LVC.

Resolvemos trabalhar esta cepa crescida em meio alfa - MEM para a caracterização do

perfil proteômico-imunogênico, devido à praticidade de preparo da solução e da

facilidade de obtenção comercial da mistura solúvel. A análise proteômico-imunogênica

desta cepa crescida em meio LIT será uma das perspectivas de continuidade deste

trabalho.

A RIFI demonstra sensibilidade que varia entre 90 e 100% e especificidade entre

80 e 100% (Mancianti et al., 1996; Alves et al., 2004; Mettler et al., 2005). Mancianti et

al. (1995), trabalhando com L. infantum, encontrou valores de sensibilidade e

especificidade de 98,4% e 100%, respectivamente e afirma que a variação destes valores

depende do antígeno empregado e das condições da RIFI. A especificidade dessa prova

apresentou reações cruzadas com outras doenças, principalmente aquelas causadas por

tripanosomatídeos, como o agente causador da doença de Chagas. Portanto, seus

resultados não devem ser utilizados como indicadores de infecção leishmaniótica

específica, particularmente em áreas onde a Doença de Chagas é endêmica ao lado das

leishmanioses (Mancianti et al.,1995; Mancianti et al.,1996).

Zanette (2006), trabalhando com 50 cães parasitologicamente positivos, mostrou

sensibilidade de 98% e especificidade de 91% para a RIFI utilizando como antígeno

promastigotas de L. chagasi, além de ótima concordância com o diagnóstico

parasitológico (Kappa=0,893). Oliveira et al. (2005) encontrou sensibilidade e

especificidade de 40% e 98,6 respectivamente e valores preditivos positivos e negativos

de 92,3% e 79,5% pra este teste. Esta autora relata que os valores encontrados ficaram

muito aquém do que normalmente é citado na literatura e discorda de alguns autores que

86

afirmam a semelhança de desempenho entre os testes de ELISA e RIFI (Mancianti et

al., 1995; Scalone et al., 2002; Vercammen et al., 2002).

Figueiredo et al. (2010) sugere que a maior precisão do ELISA faz com que este

método de diagnóstico seja o mais adequado para as campanhas de controle da LV,

reduzindo dois grandes problemas que aparecem quando se usa apenas o teste de RIFI:

o número de cães infectados que permanecem após a identificação dos soropositivos e a

eutanásia desnecessária de cães identificados erroneamente como positivos, devido ao

grande número de reações falsos-positivos neste teste.

Na RIFI os antígenos da cepa BH6 crescida em meio LIT e α-MEM, assim como

da cepa BH400 crescida nos mesmos meios, apresentaram 100% de concordância com a

classificação dos animais para LVC. Os valores de sensibilidade, especificidade, valor

preditivo positivo e valor preditivo negativo para as reações de imunofluorescência

indireta foram de 100% com 95% de intervalo de confiança (kappa=1). Os antígenos da

cepa BH46 crescida em meio LIT e α-MEM por apresentarem sete resultados falsos

negativos, mostraram 87% de sensibilidade, 100% de especificidade, valor preditivo

positivo de 100% e valor preditivo negativo de 87% (IC=95%, Kappa=0,87).

As reações de RIFI foram realizadas em apenas um momento do experimento,

30 dias após a confecção das lâminas, pois nossa intenção foi apresentar um antígeno

alternativo para ser utilizado na produção dos kits de ELISA pela rede pública. A

realização da RIFI com os diferentes antígenos estudados reforçou a caracterização das

cepas e escolha de uma delas como uma excelente opção na melhoria da qualidade do

kit diagnóstico.

Os dados apresentados neste trabalho sobre o desempenho dos testes de ELISA e

RIFI foram obtidos em laboratórios de pesquisa e referem-se a um número reduzido de

amostras de soro canino examinadas. Essas condições ideais de execução da técnica

nem sempre podem ser reproduzidas na rotina dos laboratórios da rede pública de saúde,

em virtude do fornecimento irregular de materiais de consumo, da dificuldade na

realização da técnica em laboratórios, muitas vezes inadequados, e da subjetividade na

interpretação dos resultados, freqüentemente agravada pela urgência no processamento

de um número elevado de amostras coletadas durante os inquéritos sorológicos caninos

nas áreas endêmicas.

87

Tendo em vista a possibilidade de utilização do antígeno da cepa BH400 como

componente de kit diagnóstico para ELISA, outro fator que deve ser considerado, como

perspectiva de continuidade de nosso estudo, é a realização de testes para se observar o

comportamento do antígeno, quando o sangue for colhido em papel filtro. A literatura

relata a diminuição dos índices de sensibilidade e especificidade quando as amostras são

coletadas em papel de filtro, o que é a prática mais comum nos inquéritos soro-

epidemiológicos. Esta observação foi confirmada em um estudo realizado por

Figueiredo et al. (2009) na região de Carapiá no Rio de Janeiro, na qual 34,9% de cães

positivos foram identificados pela RIFI utilizando-se soro, entre 146 amostras

soronegativas previamente testadas utilizando-se amostras de sangue coletadas em papel

de filtro. Aspectos relacionados à coleta, transporte e armazenamento das amostras,

podem explicar, em parte, o baixo desempenho dos eluatos quando comparado a

amostras de soro, mas outros problemas não estudados podem estar influindo nos

resultados.

De acordo com a literatura, os testes sorológicos de RIFI e ELISA realizados

com os kits produzidos por Biomanguinhos apresentam menor sensibilidade e

especificidade quando comparados com testes in house. Em nosso experimento as

reações com estes kits foram realizadas em um só momento, respeitando a data de

validade dos mesmos, pois nossa intenção era apenas verificar como nossos soros

seriam classificados nestes kits.

Quaresma (2007) mostrou que houve concordância ruim entre o PCR e a

sorologia (ELISA e RIFI de Biomanguinhos), utilizando este método parasitológico

como padrão ouro. O animal era considerando sorologicamente positivo se apresentasse

reatividade em pelo menos uma das técnicas sorológicas. A autora trabalhou com 147

(68%) cães positivos e 70 (32%) cães negativos pelas técnicas sorológicas, mas quando

estes resultados foram comparados com o PCR, evidenciou-se índices de 65,4% de

verdadeiros positivos, 0,92% de verdadeiros negativos, 2,3% falso positivos e 31,34%

falso negativos.

Em outro trabalho, Ferreira et al., (2007) trabalhando com 112 cães positivos

verificou para o ELISA e RIFI de Biomanguinhos valores de sensibilidade de 95 e 72%,

e especificidade de 64 e 52% respectivamente. Os autores relatam ainda que ambos os

testes apresentaram reação cruzada com soros de cães infectados por T. cruzi, L.

braziliensis e E. canis.

88

Silva (2005) trabalhou com amostras de soro e papel de filtro coletadas de cães

de área endêmica para LVC, com diagnóstico clínico e parasitológico positivos. A RIFI

foi avaliada utilizando-se o kit comercial produzindo por Biomanguinhos e um ensaio in

house utilizando promastigotas de L. (L.) chagasi. O ensaio in house com os soros

mostrou-se capaz de separar todos os verdadeiros negativos dos verdadeiros positivos e

apontou para uma eficiência de 60% a 76% para o kit comercial. Quando comparados

os resultados da RIFI do kit comercial empregada em soros e papel de filtro, observou-

se que o melhor ponto de corte para o papel de filtro seria a diluição de 1/80, o que

seguramente diminuiria o número de falsos positivos.

Távora et al. (2007) usando os kits RIFI e ELISA de Biomanguinhos mostrou

que em 370 amostras de soros coletadas de cães errantes, 6 (1,6%) foram positivas e

355 (95,9%) negativas para ambos os testes, 2 (0,5%) obtiveram positividade para RIFI

e negatividade para ELISA e 7 (1,9%) negatividade para RIFI e positividade para

ELISA. A relação de co-positividade ELISA/RIFI foi de 46,2%, e a de co-negatividade

ELISA/RIFI foi de 99,4%; a co-positividade RIFI/ELISA foi de 75% e a co-

negatividade RIFI/ELISA foi de 98,1%. Através destes resultados pode-se realizar o

teste de Kappa, para avaliar a concordância entre as duas técnicas diagnósticas, onde se

verificou uma concordância observada de 97,6% e esperada 94,5%, altamente

significativa (p<0,01) entre os resultados positivos e negativos, sendo esta concordância

classificada como forte (0,8 ≤ kappa < 1).

Queiroz et al. (2010) avaliou pelos kits de Biomanguinhos 34 cães naturalmente

infectados e dentre estes o ELISA detectou 64,7% e a RIFI 55,9%. Figueiredo et al.

(2010) encontraram valores mais altos de sensibilidade e especificidade com os kits de

Biomanguinhos, pois o ELISA mostrou sensibilidade de 100% e especificidade de

96,6%. Já para a RIFI utilizando-se como ponto de corte a diluição de 1:40, estes

valores foram de 100% e 65,5%, e com ponto de corte 1:80, 100% e 83,4%,

respectivamente.

Em nosso estudo, nas reações sorológicas realizadas com o kit de

Biomanguinhos, quando comparados aos nossos resultados, o ELISA não mostrou

resultados falso negativos, porém o kit detectou dez resultados falso positivos. Cinco

soros permaneceram na zona cinza, todos negativos para LVC. Já na RIFI foram

detectados doze soros falsos positivos e um falso negativo..

89

Para o kit de Biomanguinhos foi encontrado valor de sensibilidade de 100% para

ELISA e 98% para RIFI. A especificidade foi de 80% para o ELISA e 76% para a RIFI.

O valor preditivo positivo foi de 84% para ELISA e 82% para RIFI. O valor preditivo

negativo foi de 100% para o ELISA e de 97% para RIFI. O teste de concordância Kappa

foi de 0,8 para o ELISA e 0,9 para a RIFI. Todos os índices foram calculados com 95%

de intervalo de confiança.

Em nosso experimento, houve uma boa correlação entre tendências do aumento

da absorbância do ELISA em função do aumento dos títulos da RIFI, com exceção de

alguns casos onde esta correlação foi contrária. O fato de uma amostra possuir altos

valores de absorbância no ELISA e títulos baixos ou negativos na RIFI vem sendo

demonstrado na literatura e se justifica pela alta sensibilidade do teste ELISA, que pode

detectar precocemente animais infectados (Barbosa-de-Deus et al.,2002; Laurenti et al.,

2005; Oliveira et al., 2005; Machado et al., 2006; Zanette, 2006; Figueiredo et al.,

2010). Aliado a este fato está a individualidade da resposta imune de cada animal e a

antigenicidade dos diferentes antígenos testados.

No início da infecção natural pode ocorrer produção de altas taxas de anticorpos

contra antígenos somáticos, em detrimento de baixas taxas contra antígenos de

superfície, e desta forma, o ELISA é o primeiro teste a sinalizar a doença. A avidez dos

anticorpos também se explica, considerando a expressão antigênica de cada cepa

utilizada nos diferentes meios de cultura, favorecendo ou não o reconhecimento das

proteínas.

A Erliquiose e Babesiose são doenças transmitidas aos cães por carrapatos e que

são muito comuns no Brasil e segundo alguns autores podem dar reações cruzadas na

ELISA e RIFI com LVC (Mancianti et al, 1996;. Gomes, 2004). Babesiose é uma

doença hemolítica causadas por Babesia canis, parasitas intraeritrocitários (Lobetti,

1998) e Ehrlichia canis é uma riquétsia intracitoplasmática obrigatória que se replica

nos linfonodos, no interior dos macrófagos mononucleares, como a Leishmania (Guillén

Llera et al., 2002). Sinais clínicos e hematológicos destas três doenças são semelhantes,

e a sorologia pode ser essencial para se realizar o diagnóstico diferencial. Algumas

pesquisas têm relatado que os anticorpos contra E. canis e B. canis apresentam reação

cruzada com Leishmania sp. nos testes sorológicos para detecção de cães infectados por

Leishmania sp. (Mancianti et al, 1996;. Gomes, 2004).

90

A reação cruzada de Leishmania sp. com Doença de Chagas e leishmaniose

tegumentar já tem sido descritas na literatura e se explicam pela relação filogenética

entre estes parasitos. Já o cruzamento com Babesiose, Erliquiose e outras doenças como

Toxoplasmose e Neosporose tem sido objeto de pesquisa e ainda apresentam resultados

divergentes quando se utilizam diferentes técnicas sorológicas e diferentes antígenos

(Vercammen et al., 1997; Rosário et al., 2005; Lima et al., 2005).

Barbosa de Deus (2002) testou pelo método de ELISA soros de cães com

diagnóstico clínico e sorológico e também animais com diagnóstico clínico e

parasitológico de LVC. O antígeno bruto utilizado foi L major e não houve reatividade

cruzada com soros de cães sadios e de cães com tumor venéreo transmissível, doença de

Chagas, erliquiose, ou rickettsioses.

Zanette (2006) testou amostras de cães portadores de doenças que

potencialmente possam acusar reação cruzada com leishmaniose visceral. Foram

testados 14 animais com Doença de Chagas e destes, 9 (64,3%) apresentram reações

positivas no teste ELISA e 6 (42,9%) na RIFI. Para erliquiose canina, de 13 animais

avaliados, apenas 1 (7,7%) foi reativo pelo teste ELISA. O mesmo não ocorreu para

babesiose, que não acusou reatividade em nenhuma das técnicas. Já para 6 animais com

infecção concomitante por Ehrliquia sp e Babesia sp, foi encontrada reatividade cruzada

apenas pelo teste de ELISA em 5 (83,3%) animais.

O mesmo autor testou com kit próprio para diagnóstico sorológico de doença de

Chagas, erliquiose e babesiose, 50 animais positivos para LVC e encontrou positividade

em 28 animais (56%) no teste sorológico para erliquiose e em 42 animais (85,7%) no

teste sorológico para babesiose.

Ferreira et al., (2007) testou pelos métodos de ELISA e RIFI soros de cães com

doenças parasitárias incluindo os de 7 cães com T. cruzi, , 5 cães com L. braziliensis e 3

cães com E. canis. No teste de ELISA os valores de reatividade foram de 57,14% (4

amostras) para T. cruzi, 60% (3 amostras) para L. braziliensis e 33,33% (1 amostra)

para E. canis. Já no teste de RIFI estes valores foram de 100% (7 amostras), 40% (2

amostras) e 66,67% (2 amostras) respectivamente. Os kits diagnósticos utilizados

foram produzidos pelo laboratório de Biomanguinhos, sendo o antígeno de ELISA

parasitas pertencentes ao complexo L. donovani e da RIFI formas promastigotas de L.

infantum.

91

Oliveira et al.( 2008) demonstraram a não reatividade cruzada pelos métodos de

ELISA e RIFI de soros de cães positivos para L. (L.) chagasi utilizando como antígeno

E. canis e B. canis. Porém, testando para as três patologias 62 soros de cães com LV

naturalmente infectados encontrou positividade na RIFI de 51% para Babesiose e 43%

para Erliquiose, evidenciando a presença de anticorpos contra as três doenças nos cães

e não reatividade cruzada, e desta forma chama a atenção para a co-infecção entre B.

canis, E. canis e L. chagasi nas áreas endêmicas.

No presente trabalho, nossos resultados mostraram que em dezoito cães com

Leishmaniose Tegumentar experimentalmente inoculados, dezoito com doença de

Chagas, sete com babesiose e oito com erliquiose, a reatividade cruzada ocorreu apenas

para os 18 animais com leishmaniose tegumentar e 15 animais com Doença de Chagas.

Nossos dados concordam com Vercammen et al. (1997), Barbosa de Deus (2002) que

afirmam não existir reação cruzada entre leishmaniose visceral e erliquiose, mas estes

autores avaliaram o soro de um único cão, o que certamente prejudica a confiabilidade

dos resultados. Por outro lado, Lima et al. (2005) testaram amostras de soro de 15 cães

com erliquiose, um número um pouco maior que o testado no presente experimento, e

não obtiveram reações cruzadas.

A ausência de reação cruzada com soros de animais infectados por Babesia sp.

também não foi observada em nosso estudo, discordando de Vercammen et al.(1997),

Lima et al. (2005) e Zanette (2006), Ferreira et al., (2007) e concordando com Barbosa

de Deus (2002), Rosário et al (2005) e Oliveira et al., 2008.

É importante ressaltar, no entanto, que nos nossos resultados, a maioria das

reações cruzadas era fracamente positivas, com valores de absorbância de ELISA

próximos ao ponto de corte estabelecido e muito inferiores aos demonstrados pelos

controles positivos. Algumas amostras de soro positivas para doença de Chagas

atingiram valores elevados de absorbância pelo método de ELISA, fato este justificado

pela relação filogenética entre L. chagasi e T. cruzi, confirmando os relatos de Badaró et

al. (1986). Segundo Melo (2004), o emprego de antígenos totais nos métodos de ELISA

e RIFI, aparentemente, prejudica a especificidade e predispõe à ocorrência de reação

cruzada com o T. cruzi. Uma desvantagem do uso de antígeno total é que ele pode

compartilhar epítopos comuns com outros antígenos microbianos e pode reagir com

soros positivos para outras doenças infecciosas.

92

A ocorrência de reações cruzadas é um fato que gera preocupação, pois estas

duas enfermidades apresentam sintomas que, freqüentemente, assemelham-se aos

observados na leishmaniose visceral canina, além de coexistirem em grande parte do

país. Por este motivo, devemos atentar aos resultados positivos para o calazar canino e

quando houver suspeita de co-infecções com B. canis e E. canis estas devem ser

descartadas por meio da pesquisa de mórulas de Ehrlichia sp. ou pela presença de

Babesia sp. em esfregaços de sangue periférico antes de se firmar o diagnóstico

sorológico.

Uma vez que não existe um método para o diagnóstico da LVC, que ofereça

100% de especificidade e sensibilidade, a escolha da técnica empregada deve depender

do objetivo da investigação (Ferreira et al., 2007). Gomes et al. (2008) afirmam que as

dificuldades em obter um teste altamente confiável ilustra a necessidade de uma melhor

compreensão e padronização de procedimentos e reagentes moleculares, para garantir

níveis adequados de sensibilidade e especificidade que são particularmente desejáveis.

O acúmulo de informação de genomas de patógenos, acompanhado de avanços

na área de química de proteínas e tecnologia recombinante, certamente revolucionaram

o campo de desenvolvimento de testes diagnóstico. O uso dessas novas tecnologias

facilita a identificação e a caracterização estrutural e ainda, permite a produção de

grandes quantidades e vários testes destes antígenos no laboratório. No entanto, extrato

protéico bruto ainda consiste no antígeno mais utilizado no diagnóstico sorológico da

LVC. No presente trabalho, caracterizamos antígenos imunodominantes de Leishmania

chagasi utilizando técnicas proteômicas e de ensaios imunológicos, que poderão

contribuir com a melhoria do antígeno.

Semelhante a outros autores (Dea-Ayuela et al., 2006) observamos baixa

definição dos “spots” no western blot na faixa de pI 4 a 5,4 e acima de 45 kDa, o que

impossibilitou a análise detalhada dessa região, e esse tipo de reação ocorreu também

com soros negativos. Para nós isso pode indicar a provável localização de proteínas que

diminuem a especificidade do antígeno. Dessa forma, futuramente, uma pré-purificação

do antígeno bruto excluindo proteínas de massa molecular acima de 45 kDa pode levar a

obtenção de um antígeno de alta especificidade. Esse tipo de purificação é simples, de

baixo custo e mantém uma grande quantidade de proteínas imunogênicas, direcionando

também a obtenção de um teste sensível.

93

Outro resultado interessante da análise proteômica, foi a observação que os soros

de cães com baixo títulos de anticorpos reconhecem os mesmo antígenos dos soros de

cães com altos títulos, e estes por sua vez, reconhecem outros 11“spots a mais. Os

“spots” mais interessantes para estudos posteriores são aqueles comuns a ambos os

grupos. A identificação desses “spots” indicará proteínas que deverão ser produzidas de

forma recombinante e testadas juntas ou separadamente para o desenvolvimento de

novos ensaios imunológicos.

Dos 52 “spots” selecionados como reconhecidos somente por soros de cães

infectados, 37 deles foram localizados no gel e as proteínas correspondentes poderão ser

identificadas por espectrometria de massa. O fato de terem sido observados no western

blot “spots” que não foram detectados no gel, pode ser explicada porque a detecção de

antígeno no Western blotting é mais sensível que a detecção da proteína pela coloração

por comassie. Esse mesmo fato foi também relatado por Forgber et al, (2006) que

utilizaram coloração pela prata nos géis.

Estudos do proteoma de Leishmania foram realizados principalmente para

comparação dos diferentes estágios do ciclo de vida de L. donovani (Thiel et al., 2001;

Avila et al., 2003), L. infantum (El Fakhry et al, 2002), L. (Viannia) guyanensis e L. (V.)

panamensis (Gongora et al, 2003). Recentemente, um estudo utilizando 2-DE de extrato

de promastigotas de L. infantum, seguido de Western Blot com soro de coelhos

imunizados e análise por EM, permitiu a identificação de várias proteínas antigênicas

relevantes (Dea-Ayuela et al, 2006). Gupta et al., (2007), utilizaram abordagem

proteômica para identificação e caracterização de novas proteínas imunoestimuladoras

de antígenos solúveis de promastigotas de Leishmania donovani. Numa abordagem

semelhante a nossa, foram identificados vários antígenos de L. donovani utilizando

soros e parasitos isolados de pacientes indianos permitindo concluir que a abordagem

proteoma-sorologia produz uma compreensiva e altamente resolvida representação da

antigenicidade de L. donovani e da especificidade da resposta imune anti-leishmania em

pacientes com LV (Forgber et al, 2006).

94

7. Perspectivas Futuras

O antígeno escolhido para a produção do kit será testado em experimentos

multicêntricos em diferentes instituições, antes de sua produção em larga escala.

Também serão completados os estudos com a proteína predominante na identificação

através do Immunoblotting, utilizando maior número de soros de cães com LVC,

sintomáticos e assintomáticos, na identificação da proteína majoritária que será

seqüenciada e empregada como antígeno para sensibilizar as placas de ELISA.

95

8. Conclusões

Dentre as cepas utilizadas, a BH400 (Leishmania (L.) chagasi

MCAN/BR/2002/BH400) isolada de cão, apresento um melhor desempenho em

todas as etapas do estudo e foi a cepa escolhida para o preparo de antígeno bruto

para o teste de ELISA, a ser utilizado no diagnóstico da LVC;

Os antígenos produzidos para o teste de ELISA com a cepa BH400 não mostraram

diferenças significativas de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e

valor preditivo negativo independente do meio de cultura utilizado;

As reações de ELISA realizadas com os antígenos produzidos com a cepa BH400,

em qualquer meio de cultura, identificou de maneira mais eficiente os animais

verdadeiramente positivo e negativo, quando comparada as reações realizadas com

o kit de ELISA de Biomanguinhos;

O antígeno produzido com a cepa BH400 não apresentou reações cruzadas com

Babesia canis e Ehrlichia canis nas reações de ELISA;

O antígeno produzido com a cepa BH400 apresentou reações cruzadas com

leishmaniose tegumentar canina e doença de Chagas canina experimental;

No extrato de antígeno total da cepa BH400 cultivada em meio Alfa-MEM foram

detectados mais de 50 “spots” reativos e sem reação com soros negativos,

mostrando alta imunogenicidade do antígeno;

Foi possível na análise proteômica da cepa BH400 cultivada em meio Alfa-MEM

observar que antígenos de alto peso molecular (70 Kd) e pH entre 4 e 5,5 parecem

ser o de menor especificidade;

No gel bidimensional do extrato de antígeno da cepa BH400 cultivada em meio

Alfa-MEM foi possível localizar 37 “spots” que deverão ser identificados por

espectrometria de Massa para melhor caracterização do antígeno;

Os “spots” reconhecidos ao mesmo tempo pelos soros de alto e baixo título são os

mais interessantes para estudos de futura produção de antígenos.

96

9. Referencias Bibliográficas

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111

10 . Anexos

10.1 Depósito da Patente do Antígeno

114

10.2 Certificado do Comitê de Ética em Experimentação Animal –

CETEA

115

10.3 Artigo Publicado

obtenção de um antígeno para ensaio imunoenzimático (elisa

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