FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS

DOUTORADO EM PESQUISA CLÍNICA EM DOENÇAS

INFECCIOSAS

ELIAME MOUTA CONFORT

ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO COM ANTÍGENO DE

Leishmania (Viannia) braziliensis NO DIAGNÓSTICO

E ACOMPANHAMENTO DE PACIENTES COM

LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA

RIO DE JANEIRO

2009

ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO COM ANTÍGENO DE

Leishmania (Viannia) braziliensis NO DIAGNÓSTICO E

ACOMPANHAMENTO DE PACIENTES COM

LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA

ELIAME MOUTA CONFORT

Rio de Janeiro

2009

Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas para obtenção do grau de Doutor. Orientadores: Prof. Dr. Armando de Oliveira Schubach Prof. Dr. Mauro Célio de Almeida Marzochi

iii

. .

A meus pais, Carlos (em memória) e Sylia, aos meus filhos Mariana, Carlos e netas Maria Clara e Gabriela pela compreensão, carinho, alegrias e amor que trazem à

minha vida.

iii

AGRADECIMENTOS

Aos Drs. Armando de O. Schubach e Mauro C. de Almeida Marzochi, pela

orientação científica, incentivo e apoio recebidos durante a realização deste

trabalho.

A todos os profissionais do laboratório que contribuíram direta ou

indiretamente para a realização das análises, especialmente dos exames

sorológicos e levantamento de dados de prontuários, Andreia Alves da Silva, Elaine

Mota Costa Flávia Coelho Ribeiro, Lílian Dias Nascimento, Marta Santiago,

Fernanda Puga.

À Dra. Fátima Madeira e equipe, pela realização dos exames diretos e

isolamentos realizados, pelo incentivo e compreensão nas ausências do laboratório,

necessárias ao desenvolvimento deste trabalho.

À Dra Aline Fagundes, pelos resultados da PCR e contribuição com inúmeros

dados relativos aos pacientes.

Ao Dr. Leonardo Quintella pelos resultados de histopatologia.

À Dra. Sônia Lambert, pela valiosa contribuição dada em introdução à

estatística e epidemiologia, e por conseguir tornar quase amigável a minha relação

com alguns “softwares” estatísticos.

Aos médicos do ambulatório do Laboratório de Vigilância em Leishmanioses

(Vigileish) – IPEC, pelas contribuições de caráter clínico dos pacientes, e aos

demais profissionais por suas participações quando necessário.

À Dra. Fátima da Conceição-Silva, pelo trabalho de revisão, críticas,

sugestões e incentivo constante recebidos.

iv

Aos pacientes, pela permissão e sua indispensável colaboração para

realização deste trabalho.

Aos órgãos financiadores de pesquisa, Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico (CNPq), Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do

Rio de Janeiro (FAPERJ) e à FIOCRUZ, pela possibilidade de desenvolvimento

deste trabalho.

v

“Procurar significa: ter uma meta. Mas achar significa:

estar livre, abrir-se a tudo, não ter meta alguma”.

Hermann Hesse

vi

Mouta-Confort, E. Ensaio Imunoenzimático com Antígeno de Leishmania (Viannia) braziliensis no Diagnóstico e Acompanhamento de Pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana. Rio de Janeiro 2009. xxx f. [Tese de Doutorado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas.]. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

RESUMO Avaliou-se o ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) com antígeno de Leishmania (V.) braziliensis para a investigação diagnóstica da leishmaniose tegumentar americana (LTA) em suas modalidades cutânea (LC) e cutâneomucosa (LCM) e avaliação da resposta terapêutica a partir de amostras de soro de pacientes atendidos no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). O grupo I, LTA (n=153) foi formado com amostras de soros de pacientes com pelo menos um resultado positivo nos exames parasitológicos ou na reação em cadeia da polimerase (PCR), e o grupo II, controle (n=103), com amostras de indivíduos representativos da população do estudo, com suspeita inicial de LTA, mas com outro diagnóstico confirmado. As seguintes informações foram obtidas dos prontuários: avaliação clínica, dermatológica e otorrinolaringológica; intradermorreação de Montenegro IDRM; pesquisa de Leishmania por exame direto e histopatológico, isolamento em meio de cultura, PCR e exames diretos com colorações especiais, inoculação em meios de cultura para fungos e micobactérias. As amostras foram obtidas nas fases de investigação diagnóstica e pós-tratamento em períodos definidos até dois anos. Comparou-se a sensibilidade do ELISA com a de cada um dos métodos parasitológicos, PCR e com a IDRM. Para avaliação da resposta terapêutica, amostras de 75 pacientes que se mantiveram com as lesões cicatrizadas durante o período do estudo constituíram o subgrupo cura terapêutica (ICT) e aquelas de 31 pacientes com recidivas constituíram o subgrupo recidiva pós-terapêutica (IRT). A confiabilidade do teste avaliado pelo coeficiente de correlação intraclasse foi de 0,953 (IC 95%). Encontrou-se sensibilidade de 94,7%, especificidade de 95,1% e valores preditivos, positivo e negativo de 96,6% e 92,4% respectivamente. Não houve diferença com significância estatística entre as sensibilidades encontradas no ELISA, na PCR e na IDRM (CI= 95%, qui-quadrado p-valor=0,140 e p-valor=0,498). O mesmo não ocorreu com os demais métodos parasitológicos (p-valor<0,001). A análise da resposta humoral à terapia demonstrou haver redução da resposta de anticorpos nos pacientes do subgrupo ICT significativamente menor aos seis meses após o tratamento (Wilcoxon; p-valor=0,016) com 51,8% de pacientes não reatores ao final de dois anos após a terapia. Os demais se encontravam fracamente reatores. Ao contrário, no subgrupo IRT, houve pequena redução seguida de elevação dos valores de densidade otica atingindo patamares mais elevados na ocasião da recidiva. Comparando-se estes subgrupos (ICT e IRT) quanto à intensidade das reações e frequencia de reatores, em cada ponto do acompanhamento, encontraram-se diferenças a partir do sexto mês após a terapia e a cura clínica (Mann-Whitney; p-valor=0,046 e p-valor 0,009). Os resultados demonstram um bom desempenho do ELISA no diagnóstico diferencial de LTA e na avaliação da resposta terapêutica.

Palavras chaves: leishmaniose tegumentar Americana, ELISA, controle de cura, controle pós-terapia, Leishmania (Viannia) braziliensis.

vii

Mouta-Confort, E. Enzyme immunoassay with Leishmania (Viannia) braziliensis antigen in the Diagnosis and Monitoring of Patients with Cutaneous Tegumentar Leishmaniasis. Rio de Janeiro 2009 [Tese de Doutorado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas.]. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

ABSTRACT

Indirect Enzyme Immunoassay (ELISA) was evaluated with Leishmania (V.) braziliensis antigen to the diagnostic workup of American Tegumentary Leishmaniasis (American Tegumentary Leishmaniasis - ATL) in their cutaneous (CL) and mucocutaneous (MCL) modalities, and about the therapeutic response from samples of serum from patients at the Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). Group I, ACL (n = 153) was formed with sera samples of patients with at least one positive result in parasitological examinations or in polymerase chain reaction (PCR), and group II, control (n = 103), with samples of individuals representative of the study population, with initial suspicion of ACL, but with other confirmed diagnosis. The following information was obtained from medical records: clinical, dermatological, and otorrinolaringology evaluation; measure in mm of Montenegro intradermoreaction (IDRM); search for Leishmania by direct examination and histopathology, isolation in culture media, PCR and direct examination with special staining and inoculation in culture media for fungi and mycobacteria. Samples were obtained during the diagnostic workup and after treatment, in periods defined as up to two years. We compared the sensitivity of the ELISA with each of the individual parasitological methods, the PCR, and the IDRM. To evaluate the therapeutic response, samples of 75 patients who remained with the lesions healed during the study period were the therapeutic healing subgroup (ICT) and those 31 patients with recurrences were the post-therapy relapse subgroup (IRT). The reliability of the test assessed by the intraclass correlation coefficient was 0.953 (95% CI). We found a sensitivity of 94.7% and 95.1% specificity, and positive and negative predictive values of 96.6% and 92.4%, respectively. There was no statistically significant difference between the sensitivities found in ELISA, PCR and IDRM (95% CI, Chi-square p-value = 0.140 and p-value = 0.498). The same did not happen with the remainder parasitological methods (p-value <0.001). The analysis of the humoral response to therapy have demonstrated a decrease of the antibody response in patients of subgroup ICT, significantly lower at six months after treatment (Wilcoxon; p-value = 0.016), with 51.8% of patients non reactors at the end of two years after the therapy. The others remained mild reactors. Contrarily, in subgroup IRT, a small reduction of the intensity of the reactions, was followed by the increase in the values of optical density that reached higher levels during recidive. Analyzed together, the results of samples from the IRT subgroup were significantly higher than those from the ICT subgroup (Mann-Whitney; p-value <0.0001). The intensity of reactions and the frequency of reactors there were reduce from the six months after the therapia sustaining this thendency afther the clinical cure. When comparing the intensity of reactions and frequency of reactors in each point of follow-up there were differences from the sixth month of therapy and clinical cure (Mann-Whitney; p-value = 0.046 and p-value 0.009). The results show a good performance of the ELISA in the differential diagnosis of ACL and the assessment of therapeutic response. Key-words: American Cutaneous Leishmaniasis, ELISA, control, cure and controls post-therapy, Leishmania (Viannia) braziliensis.

viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Grupos do estudo para determinação da acurácia do ELISA ...................... 37

Tabela 2. Resultados de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN), razão de verossimilhança positiva (RVP) e negativa (RVN, intervalo de confiança, (IC). ............................................................................................. 39

Tabela 3. Médias de densidade óptica (DO), desvio padrão (dp) e medianas das unidades arbitradas (UA) obtidas no ELISA com as amostras analisadas. (LTA) leishmaniose tegumentar americana), (LC) leishmaniose cutânea, (LCM) leishmaniose cutaneomucosa.......................................................................................... 41

Tabela 4. Comparação entre a sensibilidade do ELISA e IDRM, PCR e métodos parasitológicos. .................................................................................................................. 42

Tabela 5. Concordância de resultados do ELISA com IDRM. ...................................... 43

Tabela 6. Concordância de resultados do ELISA com PCR. ....................................... 43

Tabela 7. Resultados de associações do ELISA e da IDRM em paralelo e em série com os respectivos desvios padrão para o diagnóstico de LTA. ................................. 43

Tabela 8. Número de pacientes, de amostras analisadas e mediana das unidades arbitradas (UA) do ELISA. Grupos: ICT – amostras de pacientes com cura após tratamento; grupo IRT – amostras de pacientes com reativação da lesão após tratamento. Med- mediana; IIQ- intervalo interquartil. ................................................... 45

Tabela 9. Comparação das medianas (med) das unidades arbitradas obtidas com as amostras do subgrupo I CT (cura após tratamento) no período avaliado. .................. 46

Tabela 10. Medianas (med) das unidades arbitradas (UA) no ELISA das amostras de pacientes com reativação (IRT) coletadas antes e após tratamento. .......................... 47

Tabela 11. Soroprevalência de IgG detectada por ELISA e mediana das unidades arbitradas (UA) em amostras de pacientes com reativação coletadas antes e após: o tratamento inicial (I RT1), o segundo tratamento (I RT2) ou o terceiro tratamento (I RT3). ................................................................................................................................... 50

Tabela 12. Percentuais de amostras com unidades arbitradas maiores que 2 (%UA>2) nos subgrupos (ICT) pacientes com lesão cicatrizada e (IRT1) pacientes antes da reativação. (N), número de amostras analisadas. ......................................... 53

Tabela 13. Razão de chances (odds ratio; OR) de recidiva em pacientes com unidades arbitradas no ELISA maior que 2 (UA>2) comparado aos que não recidivaram (subgrupo ICT) no período acompanhado................................................. 55

ix

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Confiabilidade do ELISA, leitura de densidade óptica (DO) em duas análises estimado pelo coeficiente de correlação intraclasse de 0,953; Intervalo de confiança de 95% = 0,939 - 0,963. .................................................................................. 38

Gráfico 2. Área sob a curva ROC obtida com o ELISA, 0,967 Intervalo de confiança de 95% = 0,943 a 0,992). ................................................................................................. 38

Gráfico 3. Distribuição dos valores de unidades arbitradas (UA) obtidas no ELISA com amostras dos grupos I (LC-leishmaniose cutânea e LCM - leishmaniose cutâneo-mucosa) e II (controles). .................................................................................... 40

Gráfico 4. Comparação entre as sensibilidades do ELISA, IDRM, PCR e métodos parasitológicos. .................................................................................................................. 42

Gráfico 5. Distribuição dos valores de unidades arbitradas (UA) de IgG no ELISA no grupo com cura até dois anos após tratamento (subgrupo grupo ICT) avaliados: no diagnóstico (D), imediatamente após tratamento (pt) 1mês (1m), 3 meses (3m), 6 meses (6m), 1 ano (1a) e 2 anos (2a) após o tratamento e nos (C) controles. .......... 46

Gráfico 6. Resultados da reatividade, em unidades arbitradas (UA), do ELISA em amostras de pacientes com reativações coletadas antes, durante e após: (A) tratamento inicial (IRT1), (B) segundo tratamento (IRT2) terceiro tratamento (IRT3) . ............................................................................................................................................ 49

Gráfico 7. Médias e desvios padrão das unidades arbitradas (UA) de soros de pacientes do subgrupo IRT (IRT1, IRT2 e IRT3) avaliados por ELISA. ...................... 51

Gráfico 8. Medianas das unidades arbitradas (UA) no ELISA de amostras de soros de pacientes que se mantiveram com lesões cicatrizadas após tratamento (subgrupo ICT) e do subgrupo com reativação das lesões (IRT), após o primeiro (IRT1), segundo (IRT2) ou terceiro tratamentos (IRT3). ............................................................ 53

Gráfico 9. Percentual de soros com unidade arbitrada maior que dois (% de UA > 2) nos subgrupos (ICT) com cura das lesões e (IRT1) antes da reativação. .................. 54

Gráfico 10. Reatividade no ELISA em unidade arbitrada (UA), de soros de sete pacientes com leishmaniose cutâneomucosa distribuídos nos subgrupos ICT (cicatrização das lesões) e IRT (com reativação de lesões). ....................................... 56

x

LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS AUC – (Area under the ROC curve) Área sob a curva ROC

BHI – Brain Heart Infusion

C - controles

CEP – Comitê de Ética em Pesquisa

CN – Controle Negativo

CP – Controle Positivo

DNA – Ácido desoxirribonucléico

DO – Densidade óptica

ELISA – (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Ensaio imunoenzimático indireto

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana

HRP – Peroxidase

IC – Intervalo de Confiança

ICC – (Intraclass Correlation Coefficient) Coeficiente de Correlação Intraclasse

ICT – amostras do grupo I que apresentou cura clínica após o tratamento

IDRM – intradermorreação de Montenegro

IFNγ – Interferon gama

IgA – Imunoglobulina A

IgG – Imunoglobulina G

IgG1 – Imunoglobulina G1

IgG2 – Imunoglobulina G2

IgG3 – Imunoglobulina G3

IgG4 – Imunoglobulina G4

IgM – Imunoglobulina M

IL – Interleucina

IL-10 – Interleucina -10

IL-12 – Interleucina -12

IL-2 – Interleucina 2

IL-4 – Interleucina-4

IPEC – Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

IRT – amostras de pacientes do grupo I que apresentou recidiva após o tratamento

IRT1 – amostras do grupo I após o primeiro tratamento

xi

IRT2 – amostras do grupo I após o segundo tratamento

IRT3 – amostras do grupo I após o terceiro tratamento

IIQ – intervalo interquartil

LC - Leishmaniose cutânea

LCD - Leishmaniose cutânea difusa

LCL – Leishmaniose cutânea localizada

LCM – Leishmaniose cutaneomucosa

LD – Leishmaniose cutânea disseminada

LM – Leishmaniose mucosa

LT – Leishmaniose tegumentar

LTA – Leishmaniose tegumentar americana

LV – Leishmaniose visceral

L (V) braziliensis – Leishmania (Viannia) braziliensis

Med – mediana

MedCalc vs 8 – versão 8 programa estatístico MedCalc

mL – mililitro

MS – Ministério da Saúde

NK – natural killer

NNN – meio de cultivo McNeal, Novy & Nicolle

ODP – Outro diagnóstico provável

OMS – Organização Mundial de Saúde

OPD – 1, 2-Ortofenilenodiamino

OR – (Odds ratio) – Razão de chances

PBS – Salina tamponada com fosfatos

PBS-T – Salina tamponada com fosfatos com Tween

PBS-TL – Salina tamponada com fosfatos com Tween e com leite desnatado

PCR – Reação em cadeia da polimerase

pH – Potencial Hidrogeniônico

RR – risco relativo

R1 – Primeira reativação

R2 – Segunda reativação

RFC – Reação de fixação de complemento

RIFI – Reação de imunofluorescência indireta

RJ – Rio de Janeiro

xii

RNA – Ácido ribonucleico

ROC – (Receiver Operator Characteristic) – Curva ROC

RVN – Razão de verossimilhança negativa

RVP – Razão de Verossimilhança positiva

SFB – Soro fetal bovino

SPSS – Statistical Package for the Social Science

SUS – Sistema Único de Saúde

DAT – (direct aglutination test) Teste de aglutinação direta

Th1 – Células TCD4+ secretoras do padrão um de citocinas

Th2 – Células TCD4+ secretoras do padrão dois de citocinas

TMB – 3, 3’, 5, 5’-Tetrametilbenzidina

Treg – Células T regulatórias

TT – grupo teste terapêutico

UA – Unidade arbitrada

Vigileish – Laboratório de Vigilância em Leishmanioses

VPN – Valor Preditivo Negativo

VPP – Valor Preditivo Positivo

μg – micrograma

μL – microlitro

xiii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1

2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 4

2.1 ASPECTOS GERAIS E HISTÓRICOS DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA . 4

2.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS ........................................................................................ 5

2.3 ASPECTOS GERAIS DA RESPOSTA IMUNE ...................................................................... 9

2.4 DIAGNÓSTICO ....................................................................................................................18 2.4.1 Exames parasitológicos ....................................................................................................18 2.4.2 Métodos imunológicos ......................................................................................................19

3 OBJETIVO GERAL............................................................................................ 27

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................................27

4 METODOLOGIA ................................................................................................ 28

4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ...........................................................................................28 4.1.1 Aspectos éticos ................................................................................................................28 4.1.2 Grupos de estudo .............................................................................................................29 4.1.3 Critérios de elegibilidade ..................................................................................................30 4.1.4 Tamanho amostral e coleta ..............................................................................................30

4.2 REALIZAÇÃO DOS TESTES SOROLÓGICOS ....................................................................31 4.2.1 Antígenos .........................................................................................................................31 4.2.2 ELISA...............................................................................................................................32 4.2.3 Comparação de ELISA com IDRM, PCR e métodos parasitológicos .................................33 4.2.4 Associação de ELISA e IDRM para diagnóstico ................................................................34

4.3 ANÁLISE DOS RESULTADOS ..........................................................................................315 4.3.1 Variáveis de interesse ......................................................................................................35 4.3.2 Análise estatística ............................................................................................................35

5 RESULTADOS................................................................................................... 37

5.1 ELISA ..................................................................................................................................37 5.1.1 Confiabilidade ..................................................................................................................37 5.1.2 Acurácia ...........................................................................................................................38 5.1.3 Correlações ......................................................................................................................39

5.2 . COMPARAÇÃO DE ELISA COM IDRM, PCR E MÉTODOS PARASITOLÓGICOS ...........41

5.3. ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS ELISA E IDRM PARA O DIAGNÓSTICO................................43

xiv

5.4 . AVALIAÇÃO DO ELISA NO CONTROLE PÓS-TRATAMENTO DE PACIENTES COM LTA ..................................................................................................................................................44

5.4.1 Acompanhamento sorológico por ELISA no subgrupo I CT - pacientes com lesões cicatrizadas até dois anos pós-tratamento. ....................................................................................45 5.4.2 Acompanhamento sorológico por ELISA no subgrupo I RT - pacientes com reativações até dois anos pós-tratamento. .............................................................................................................47 5.4.3 Comparação da resposta de IgG nos subgrupos de pacientes com cicatrização (ICT) e pacientes com reativação de lesões pós-tratamento (IRT).............................................................52 5.4.4 Controle pós-tratamento de pacientes com LCM...............................................................55

6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 57

7 CONCLUSÕES .................................................................................................. 70

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 72

ANEXO I- APROVAÇÃO NO CEP/IPEC .................................................................. 85

ANEXO II- PROTOCOLO DE ATENDIMENTO CLÍNICO ......................................... 87

ANEXO III – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ................. 95

ANEXO IV - TERMO DE COMPROMISSO E RESPONSABILIDADE ................... 101

1

1 INTRODUÇÃO

No Brasil, a evidenciação direta do parasito, em esfregaço em lâmina de

escarificado do bordo da lesão corado pelo Giemsa, é o procedimento adotado para

diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA) pela rede de laboratórios

do Sistema Único de Saúde (SUS), Ministério da Saúde (MS), por ser de fácil

execução e baixo custo. Entretanto, tal técnica demanda tempo e treinamento do

operador ao microscópio, sendo considerada pouco sensível (MS, 2007).

A intradermorreação de Montenegro (IDRM), com sensibilidade e

especificidade consideradas próximas a 100%, é amplamente usada no diagnóstico

da LTA e em inquéritos epidemiológicos. Contudo, alguns fatores limitam a sua

utilização tais como a permanência de positividade do teste por longo tempo após a

infecção ou doença e a possibilidade de resultados falso negativos no primeiro mês

de infecção (Marzochi et al., 1980; Cuba Cuba et al., 1985; MS, 2007).

No Laboratório de Vigilância em Leishmanioses (Vigileish) do Instituto de

Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), o diagnóstico de LTA é estabelecido com

base no exame histopatológico, imunohistoquímica, exame direto, reação em cadeia

da polimerase (PCR), isolamento do parasito em meio de cultura, IDRM e testes

sorológicos. Por sua complexidade e custo, esta rotina de diagnóstico próxima do

ideal, não é possível de ser realizada em unidades primárias de atenção á saúde,

sendo limitada a instituições de pesquisa. Entretanto, limitações inerentes aos

métodos parasitológicos e à escassez de parasitos nas lesões de indivíduos

infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis (L. (V) braziliensis), espécie quase

que totalmente responsável pela doença no Estado do Rio de Janeiro, podem

contribuir para a ocorrência de resultados falsos negativos.

2

Na LTA a produção de anticorpos específicos é predominantemente

constituída por imunoglobulina G (IgG), independente da forma clínica (Guimarães et

al., 1989). Porém, as concentrações séricas detectadas em testes sorológicos

variam de baixas a moderadamente elevadas. Estas oscilações estão relacionadas

às formas clínicas e também a características individuais. Atualmente, o ensaio

imunoenzimático (ELISA) e a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) são as

técnicas mais empregadas. Entretanto, a possibilidade do encontro de resultados

falsos negativos e ou de reações inespecíficas, relatada por alguns autores, limita a

indicação dos testes sorológicos para o diagnóstico (Cuba Cuba et al., 1980; Ulrich

et al., 1988; MS, 2007).

A experiência acumulada por profissionais do Vigileish com testes sorológicos

na rotina de diagnóstico e o seguimento de pacientes com LTA sugerem que o

ELISA pode ser particularmente útil em quatro situações: a) estabelecimento do

diagnóstico em pacientes com forte suspeita clínica e epidemiológica de LTA e

testes sorológicos positivos, porém, com exames parasitológicos negativos; alguns

pacientes submetidos a teste terapêutico; b) para afastar o diagnóstico de LTA em

pacientes com investigação inconclusiva, cujos sinais clínicos sugeriam outras

enfermidades, particularmente, esporotricose atualmente endêmica no Rio de

Janeiro; c) controle de cura ou indicador de reativação, após o tratamento para LTA.

Na RIFI, utilizam-se parasitos íntegros como antígenos. No ELISA, podem ser

utilizados parasitos íntegros, extratos parasitários, antígenos purificados ou

proteínas recombinantes. Todavia, até o momento, não se dispõe de “kits”

comerciais para o diagnóstico da LTA humana por este método.

Neste estudo, avaliou-se o ELISA com extrato parasitário parcialmente solúvel

de L. (V.) braziliensis para detecção de IgG anti-Leishmania em amostras de soros,

3

realizado paralelamente aos métodos parasitológicos clássicos, PCR e IDRM,

durante o atendimento rotineiro de pacientes encaminhados para diagnóstico de

LTA. Além disso, verificou-se a sensibilidade, especificidade e valores preditivos

positivo e negativo do ELISA com antígeno de promastigotas de L. (V.) braziliensis e

investigaram-se as possíveis associações entre imunoglobulinas específicas da

classe G (IgG) e resposta terapêutica imediata e tardia, até dois anos após o

tratamento.

4

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 ASPECTOS GERAIS E HISTÓRICOS DA LEISHMANIOSE

TEGUMENTAR AMERICANA

As leishmanioses, em suas modalidades tegumentares e visceral, são

antropozoonoses causadas por parasitos da ordem Kinetoplastida, família

Trypanosomatidae do gênero Leishmania (Hommel, 1978; WHO, 2009). As

leishmanioses cutâneas ocorrem no Velho e no Novo Mundo com grande

prevalência na América do Sul, no Norte da África e na Ásia Central e Oriental.

Segundo estimativa da Organização Mundial de Saúde (OMS) (WHO, 2009) a

incidência anual das leishmanioses no mundo é de dois milhões, sendo um milhão e

meio de LTA. São consideradas, atualmente, “doenças negligenciadas” e em

expansão crescente. A leishmaniose tegumentar americana (LTA), denominação

que agrega as modalidades, cutânea e cutaneomucosa, objeto do nosso estudo, se

distribui desde o sul dos Estados Unidos até o Norte da Argentina. Dentre os países

da América do Sul, o Brasil é o que apresenta a maior prevalência de LTA com

média anual de 28.568 casos autóctones registrados no período de 1985 a 2005

(MS, 2007), distribuídos por todos os estados. Além da ampla distribuição

geográfica, a severidade das lesões em alguns casos, agravada pela possibilidade

de co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), fazem das

leishmanioses um permanente alvo da atenção dos órgãos de saúde pública no País

e no mundo (WHO, 2009).

Há evidências da presença da doença em cerâmicas peruanas e

equatorianas, datadas de 400 a 900 d.C., com representações de mutilações de

5

nariz e de boca com aspecto semelhante à leishmaniose cutaneomucosa. Além

disso, a doença pode ter sido documentada por “cronistas” do século XVI que

descreveram lesões cutâneas de face também sugestivas de LTA em populações da

Amazônia Ocidental (Altamirano-Enciso et al., 2003). Em 1895, Moreira identificou a

doença no Brasil e em 1911, Gaspar Vianna, denominou Leishmania braziliensis, o

agente etiológico da “úlcera de Bauru”, “ferida brava” (lesão cutânea) ou “nariz de

tapir” (lesão cutaneomucosa), espécie diferente das encontradas no Velho Mundo

(Vianna, 1911; Vianna, 1912). No ano seguinte, o próprio Gaspar Vianna comprovou

o valor do antimonial (tártaro emético) no tratamento da LTA (Vianna, 1914).

Desde o século XVIII suspeitava-se da transmissão da doença por

flebotomíneos, entretanto, o papel dos vetores só foi demonstrado em 1921 no

Velho Mundo por Sergent et al., 1921 e em 1922, no Brasil, por Aragão.

Contribuições significativas para a prática clínica, diagnóstico, tratamento e,

em certa medida, para o controle da doença ocorreram nas três primeiras décadas

do século XX, considerando-se ainda a introdução da IDRM como método auxiliar ao

diagnóstico e à epidemiologia introduzida por Montenegro em 1926.

Até o início da década de 70, apenas L. braziliensis era conhecida como

causadora da LTA no Brasil. Em 1970, Lainson & Shaw, identificaram L. mexicana

amazonensis como agente causal da leishmaniose cutânea difusa na região Centro-

Oeste do país.

2.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS

Inicialmente associada aos ambientes silvestres, nas últimas décadas a LTA

vem-se tornando cada vez mais frequente em áreas periurbanas e urbanas, sendo

associada, à mobilidade das populações, muitas vezes em ondas migratórias, a

6

modificações do meio ambiente, adaptação de vetores ao peridomicílio e a

condições sócio-econômicas precárias (Marzochi & Marzochi, 1994; 1997).

Nas Américas, a transmissão de Leishmania sp. ao ser humano, mamíferos

domésticos e silvestres, se dá pela picada de fêmeas de flebotomíneos do gênero

Lutzomyia infectados com formas evolutivas flageladas (promastigotas) presentes no

trato digestivo do vetor invertebrado. Estas penetram nas células do sistema

fagocítico mononuclear da pele e/ou de mucosas das vias aéreas superiores,

formando vacúolos parasitóforos, onde se transformam em formas amastigotas, com

flagelos interiorizados, multiplicam-se e evadem-se infectando novas células (REY,

2001).

As diferentes espécies de Leishmania com características dermatotrópicas,

identificadas no Brasil, pertencem aos subgêneros Viannia (Lainson and Shaw,

1972) e Leishmania (Saf’ ianova 1982), classificação proposta por Lainson & Shaw

(1987) para as Leishmania spp do Novo Mundo, são elas: Leishmania (Viannia)

braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni,

Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) naiff, e Leishmania (Leishmania)

amazonensis Leishmania (Viannia) lindenbergi (MS, 2007; Silveira et al., 2004).

No Brasil, as diferentes espécies de Leishmania podem produzir no ser

humano lesões cutâneas (LC) e mucosas (LM). As lesões cutâneas podem ser:

localizadas - únicas ou múltiplas (leishmaniose cutânea localizada - LCL);

disseminadas (leishmaniose cutânea disseminada - LD) ou difusas (leishmaniose

cutânea difusa - LCD). Nas mucosas pode ocorrer a forma primária, por inoculação

direta do parasito na mucosa próxima a superfície cutânea; a forma secundária

tardia, após cura da lesão cutânea primária; e a forma isolada, de origem não

determinada, em mucosas internas, sem comprometimento cutâneo aparente. Em

7

alguns pacientes pode haver o acometimento simultâneo da pele e da mucosa

(leishmaniose cutaneomucosa - LCM). Nestes casos, o envolvimento da mucosa

pode ocorrer por contiguidade com a lesão cutânea primária ou surgir de forma

concomitante a lesões cutâneas com localização distante (Marzochi & Marzochi,

1994). A LCL é a forma de manifestação mais frequentemente observada, podendo

evoluir para cura espontânea das lesões. As demais manifestações ocorrem em

percentual reduzido, estando sua ocorrência relacionada ao potencial patogênico de

algumas espécies e a fatores do hospedeiro. Alguns casos assumem caráter de

doença crônica e podem apresentar resistência ao tratamento. As formas

disseminadas, mucosas e cutâneomucosas são, em sua maioria, produzidas por L.

(V.) braziliensis e mais raramente por Leishmania (V.) guyanensis e L. (L.)

amazonensis, enquanto a forma difusa é quase sempre causada por L. (L.)

amazonensis (Barral et al., 1991; Marzochi & Marzochi, 1994).

Os insetos vetores da LTA pertencem à ordem Díptera, família Psychodidae,

subfamília Phlebotominae, gênero Lutzomyia, conhecidos por diferentes nomes em

diferentes regiões do país. As principais espécies potencialmente infectantes para o

ser humano são: Lutzomyia flaviscutellata, Lutzomyia whitmani, Lutzomyia

umbratilis, Lutzomyia intermedia, Lutzomyia wellcomei e Lutzomyia migonei

(Marzochi and Marzochi, 1997). Diversos animais silvestres e domésticos são

encontrados naturalmente infectados com as espécies de Leishmania. Porém, em

sua maioria, não são considerados possíveis reservatórios naturais. O conceito de

reservatório inclui, entre outros requisitos, a comprovação por métodos científicos da

manutenção do parasito no meio ambiente pelo reservatório, o que ainda não

aconteceu nestes casos (Grimaldi & Tesh, 1993; MS, 2007). Contrariamente, na

leishmaniose visceral, parasitos estão presentes em abundância na pele e vísceras

8

de cães infectados com Leishmania chagasi, sintomáticos ou não (Madeira et al.,

2009).

Em função das características dos parasitos, condições ambientais e

características biológicas de vetores e à capacidade de adaptação a ambientes

modificados pelo ser humano, são definidos três padrões epidemiológicos de

transmissão da LTA: silvestre, ocupacional e lazer, e rural e periurbano (MS, 2007).

L. (V.) braziliensis é encontrada na América do Sul e Central, estando

amplamente distribuída em todo o território nacional, infectando roedores silvestres

(Bolomys lasiurus, Nectomys squamips) e sinantrópicos (Rattus rattus), gatos (Felis

catus), cães (Canis familiaris) e equídeos (Equus caballus, Equus asinus).

Considerados prováveis reservatórios silvestres, os roedores estão envolvidos na

transmissão em áreas silvestres e em ambientes modificados, periurbanos e

urbanos, possivelmente com o envolvimento de animais sinantrópicos e domésticos

(Marzochi, 1992; Tolezano, 1994).

L. (L.) amazonensis é encontrada principalmente em áreas de terra firme da

bacia amazônica em alguns estados do Norte, do Nordeste e da região Sudeste do

Brasil (Furtado & Vieira, 1982; MS 2007). No Rio de Janeiro há referência a apenas

um caso autóctone devido a esta espécie (Azeredo-Coutinho et al., 2007). Os

vetores desta espécie são L. flaviscutellata, com ampla distribuição geográfica, e as

espécies Lutzomyia reducta e Lutzomyia olmeca nociva, encontradas nos estados

do Amazonas e Rondônia. Os prováveis animais reservatórios são roedores

silvestres dos gêneros Proechymis e Oryzomys.

Entre as demais espécies de Leishmania a que acomete o maior número de

indivíduos é L. (V.) guyanensis, cuja transmissão se dá em ambientes silvestres na

região Norte (Marzochi & Marzochi, 1994; MS 2007).

9

Atualmente são conhecidas diversas espécies de Leishmania causadoras da

doença humana no Brasil. Destas as mais amplamente distribuídas é L. (V.)

braziliensis que pode ser encontrada em todos os estados, inclusive no Rio de

Janeiro (MS, 2007).

2.3 ASPECTOS GERAIS DA RESPOSTA IMUNE

Apesar dos esforços empregados em pesquisas nas últimas décadas visando

à compreensão dos mecanismos de resposta imune nas leishmanioses, os avanços

obtidos ainda não permitem o pleno entendimento da funcionalidade das células e

moléculas envolvidas neste processo. Assim, resistência e susceptibilidade à

doença persistem com muitos pontos obscuros. As diferentes espécies de

Leishmania, fatores genéticos dos parasitos e do hospedeiro levam a diferentes

eventos imunológicos com manifestações clínicas diversas (Grimaldi, 1982:

Marzochi & Marzochi, 1994; Silveira et al., 2004).

A LC é quase sempre benigna, com lesões que podem ser auto-resolutivas e,

geralmente, responde bem à terapia. Cerca de 3% dos casos de infecção por L. (V.)

braziliensis podem apresentar lesões primárias ou secundárias em mucosas que, se

não tratadas, podem evoluir de forma desfigurante e/ou mutilante (Grimaldi, 1982). A

gravidade da doença está mais relacionada à resposta imunológica exacerbada que

à ação direta de Leishmania sobre os tecidos. Aliás, costuma haver escassez de

parasitos nas lesões, mas se observa positividade à IDRM. Contrariamente, a LCD

que acomete uma pequena proporção de infectados por L. (L.) amazonensis, cursa

com intenso parasitismo e reduzida atividade da resposta imunológica protetora

(Marzochi & Marzochi, 1994). Isto pode ser demonstrado pela ausência de

10

reatividade à IDRM e à resposta linfoproliferativa “in vitro” das células destes

pacientes a antígenos de Leishmania. (Silveira et al., 2004)

Modelos experimentais de leishmaniose tegumentar (LT) podem ser

empregados para algumas espécies de Leishmania. Por exemplo, L. major (no

Velho Mundo) e L. (L.) amazonensis podem ser estudadas em animais

geneticamente susceptíveis e em animais pouco susceptíveis. Todavia, a infecção

por L. (V.) braziliensis não é reproduzida em camundongos, em sua maioria

resistente à infecção. Os animais que melhor desenvolvem o modelo da doença

humana causada por L. (V.) braziliensis são o macaco rhesus (Grimaldi, 2008) e o

cão (Pirmez et al., 1988), este último frequentemente encontrado naturalmente

infectado na região sudeste. Portanto, grande parte do conhecimento experimental

relativo à imunologia da LTA causada por L. (V.) braziliensis foi obtido em estudos

com células de pacientes humanos, a partir de experimentos ex vivo (Conceição-

Silva et al., 1988; Campanelli et al., 2006; Morgado et al., 2008).

A complexidade de eventos, de células e moléculas envolvidas na relação

parasito/hospedeiro, tem início no momento da inoculação das formas promastigotas

pelos flebotomíneos, quando a participação da saliva do vetor pode ser determinante

para o progresso da infecção (Titus & Ribeiro, 1988).

Saliva de flebotomíneos possui um conjunto de moléculas que inibe os

mecanismos hemostáticos do hospedeiro modificando a resposta inflamatória e a

resposta imune a Leishmania sp. (Titus & Ribeiro, 1988; Kamhawi, 2000). Diversos

estudos foram desenvolvidos visando esclarecer o papel da saliva no

desenvolvimento inicial da lesão (Costa et al., 2004; Menezes et al., 2008). Por outro

lado, observaram-se em estudos experimentais que componentes da saliva induzem

a produção de anticorpos e de resposta celular de hipersensibilidade do tipo tardia e

11

que este fenômeno (resposta imune à saliva) está associado à proteção contra a

infecção por Leishmania sp. (Belkaid et al., 2000a). Tais estudos foram conduzidos,

em sua maioria, com extrato bruto de glândula salivar de flebotomíneos. Em soro de

indivíduos de área endêmica, portanto expostos a sucessivas picadas de

flebotomíneos, infectados ou não, detectaram-se anticorpos anti-componentes de

saliva. Os mecanismos envolvidos e a generalização desses achados para as

diversas espécies de flebotomíneos e de hospedeiros continuam sendo objeto de

pesquisas (Kamhawi et al., 2000).

O primeiro contato do parasito com o hospedeiro envolve componentes

celulares da resposta inata: células fagocíticas, macrófagos, basófilos, eosinófilos,

mastócitos, células natural killer (NK), e células dendríticas (células Langerhans).

Além disso, moléculas tais como proteínas do sistema complemento, proteínas de

fase aguda e interferons fazem parte do cenário inicial. As células T CD4+ e T CD8+

são os componentes efetores da imunidade adquirida, necessárias para o

desenvolvimento de uma resposta protetora, participando do processo após ativação

e apresentação dos antígenos pelas células apresentadoras, células dendríticas,

macrófagos e possivelmente células B (Von Stebut, 2007).

Leishmania spp. possuem diversos mecanismos de evasão das defesas do

hospedeiro. Promastigotas são sensíveis à ação do complemento, mas não as

amastigotas, as quais escapam da atividade fagocítica de neutrófilos, infectando

macrófagos. Utilizam-se, para isso, de vias clássicas de interiorização de

microorganismos dos macrófagos, penetrando nestas células, diferenciando-se em

formas amastigotas, resistentes às enzimas digestivas da célula hospedeira e

capazes de se multiplicar. O curso da infecção depende dos diversos mecanismos

de modulação da resposta inata e da resposta imune (Von Stebut, 2007).

12

O preciso papel das células da resposta inata na infecção por Leishmania spp

é pouco conhecido em modelos experimentais e em humanos. Macrófagos e células

dendríticas são as mais estudadas neste contexto. Alguns estudos sugerem uma

contribuição crítica da participação de leucócitos e interação com macrófagos na

resposta imune (Ribeiro-Gomes et al., 2004), não havendo um consenso sobre a

resultante desta participação, se no sentido da progressão ou da resistência à

doença. A depleção de neutrófilos em camundongos susceptíveis Balb/c, mas não

em resistentes C3H /HeJ resulta no agravamento da doença, aumento da produção

de IL-4 e da carga parasitária (Chen et al., 2005). A análise de infiltrado celular de

lesões cutâneas de pacientes com LTA revelou processo inflamatório, mesmo nos

estágios finais da infecção. Os autores consideraram a hipótese de participação de

neutrófilos também neste estágio (Morgado et al., 2008).

Em modelo murino de infecção por Leishmania major, com dose e via de

inoculação simulando infecção natural, Belkaide et al. (2000b) dentificaram duas

fases distintas de resposta imune do hospedeiro. A primeira fase - silenciosa - tem a

duração aproximada de quatro a cinco semanas. Nesta fase, ocorre fagocitose por

macrófagos residentes, facilitada pela opsonização por componentes do

complemento (C3bi, C3b e anticorpos naturais-IgG) e produção de citocinas

inflamatórias. Há multiplicação de parasitos, sem sinais clínicos visíveis. A segunda

fase inicia-se aproximadamente seis semanas após a infecção. É caracterizada pelo

recrutamento de células inflamatórias, neutrófilos, eosinófilos e macrófagos para o

sítio da infecção. Há presença de células dendríticas, migração de células T CD4+ e

CD8+, citocinas, morte do parasito e aparecimento de sinais clínicos, com

surgimento da lesão e posterior regressão. Mediadores derivados de mastócitos

(Maurer et al., 2006), mecanismos mediados por IgG (Woelbing et al., 2006) e por

13

citocinas e quimiocinas (Sato et al., 2000) contribuem para o recrutamento de

células dendríticas. Células dendríticas, células de Langerhans, e macrófagos são

apresentadores de antígenos a linfócitos T e representam a ligação entre a resposta

inata e a resposta adaptativa. Células dendríticas ativadas processam antígenos e

migram para nódulos linfáticos, apresentando antígenos e produzindo citocinas

fundamentais para ativação de células T. Estas células são as principais fontes de

interleucina 12 (IL-12) principal citocina que induz resposta tipo Th1 e células T

citotóxicas (CD8+) tipo um (Tc1). A ação coordenada deste sistema leva à

eliminação de grande número de parasitos e à involução da lesão. Ao final, há

produção de interleucina 10 (IL-10) e persistência de poucos parasitos identificados

em células dendríticas com resolução da lesão (Jones et al., 1998; Castés & Tapia,

1998).

Resultados de diversos estudos apontam para a hipótese que a persistência

de parasitos na lesão leve à manutenção de células T efetoras de memória local. A

manutenção de parasitos inclui a ação de células T regulatórias (Treg), outra

subpopulação de células T (Belkaid et al., 2006).

São descritos mais de um tipo de células Treg. As denominadas células Treg

naturais são responsáveis pelo controle de processos infecciosos, limitando a

magnitude de resposta de células T efetoras, resultando em controle adequado da

infecção. Esta redução também pode ter lugar durante a fase ativa da doença

impedindo danos excessivos aos tecidos. Contrariamente, o excessivo controle das

células efetoras pelas células Treg pode levar ao desenvolvimento e multiplicação

do parasito (Mendez et al., 2004; Belkaid et al., 2006). Um exemplo é a infecção por

L. (L.) amazonensis em camundongos, caracterizada pelo acúmulo de células Treg

14

locais modulando negativamente a atividade de células Th1 levando a expansão de

parasitos no hospedeiro (Ji et al., 2005; Veras et al., 2006).

Pesquisas recentes em humanos corroboram a hipótese de que a resolução

da lesão não está associada à eliminação de todos os parasitos (Schubach et al.,

2001; Bittar et al., 2007). A presença de células Treg em lesões de pacientes

humanos infectados por L. (V.) braziliensis foi demonstrada por Campanelli et al.,

(2006).

Em humanos, o conceito de dicotomia da resposta imune das leishmanioses,

desenvolvido a partir do modelo citado anteriormente, vem sendo investigado ao

longo dos anos. Embora não evidencie uma verdadeira dicotomia de resposta, a

importância do balanço de citocinas tipo um ou tipo dois é aceita (Barral Netto et al.,

1998; Coutinho et al., 1998; Pirmez et al., 1993; Rocha et al., 1999), ou seja, o

sucesso no controle da infecção por protozoários intracelulares é obtido com

resposta predominantemente tipo Th1, mas também com participação das do tipo

Th2. Está bem estabelecido que IL-12 é importante para resposta protetora

induzindo citocinas tipo Th1 e que IL-10 está associada à desativação de

macrófagos. Na fase ativa da forma cutânea e cutaneomucosa observa-se um

padrão misto de citocinas produzidas por células T com predomínio do tipo Th1

como interferon γ (IFNγ) e baixa detecção de IL-10. Em pacientes com LCD

detectam-se altos níveis de IL-4, IL-10, (citocinas tipo Th2) e baixos níveis de IFNγ

(citocina tipo Th1); células T CD4+ e CD8+ participam ativamente da resposta imune

protetora em humanos (Barral Netto et al., 1998).

A participação de células B e de anticorpos na resposta imune a Leishmania é

pouco conhecida. As investigações são em número relativamente pequeno se

comparadas às realizadas com células T. A resposta a algumas questões básicas,

15

para o entendimento da funcionalidade destas células e de anticorpos específicos,

ainda não é consenso entre os pesquisadores da área. A primeira questão

importante diz respeito às fases iniciais da infecção, quando a opsonização do

patógeno, Leishmania, por anticorpos pode ser importante para eficiência da

resposta inata e protetora. As evidências para a importância destes mecanismos

vêm de modelos experimentais de infecção com Leishmania major em

camundongos pouco susceptíveis à leishmaniose, nos quais a depleção de células B

reduz o número de células dendríticas infectadas tornando-os susceptíveis

(Anderson et al., 2002; Woelbing et al., 2006). Considerando verdadeira esta

hipótese, duas outras questões necessitam ser esclarecidas nas fases iniciais da

infecção: a) a opsonização se faz apenas com anticorpos naturais IgG e IgM ou

também com anticorpos específicos? b) Se houver participação de anticorpos

específicos nesta fase, como se dá a ativação de células B sem a colaboração de

células T ainda não ativadas? (Von Stebut, 2007). Outras investigações sugerem

que a participação de linfócitos B contribui para o agravamento da doença. A

expansão de células B em camundongos BALB.Xid, pouco susceptíveis a

Leishmania major e geneticamente deficientes de células B, aumenta a

susceptibilidade destes animais (Kima et al., 2000). Mais evidências vêm de alguns

estudos experimentais com L. (L.) amazonensis (Colmenares et al., 2002; Wanasen

et al., 2008). Por outro lado, há demonstrações experimentais da contribuição de

células B para aquisição de resistência (Anderson et al., 2002; Miles et al., 2005).

Além disso, alguns autores sugerem que a apresentação de antígenos por células B

e funções mediadas por anticorpos não desempenham papel relevante na infecção

por Leishmania major em camundongos (Brown & Reiner, 1999). As divergências

entre estes resultados podem estar relacionados a diferenças entre os animais

16

estudados, dose de inóculo, via de inoculação e polimorfismo entre isolados de

Leishmania, entre outras possibilidades (Teixeira et al., 2005; Matos et al., 2007).

Estes dados em conjunto reforçam a necessidade de um maior número de

investigações das funções de células B e anticorpos na resposta inata e na

adquirida.

No curso da doença humana, há uma associação positiva observada entre

gravidade da doença e detecção de anticorpos séricos. A produção de anticorpos

específicos, independente da forma clínica, é predominantemente constituída por

IgG. Não se observa correlação entre intensidade das respostas humoral e celular

(Mendonça et al., 1986) , tanto “in vitro” (proliferação celular após estimulação com

antígenos) quanto “in vivo” (IDRM). Ao contrário do que ocorre na leishmaniose

visceral (LV), observa-se baixa ou moderada produção de anticorpos detectados por

RIFI ou ELISA nos indivíduos com LC (Anthony et al., 1980; Guimarães et al., 1983).

Níveis mais elevados de anticorpos são encontrados em pacientes com LM e LCM,

apesar de existirem variações individuais. Na LCD, há geralmente detecção de altos

níveis de anticorpos. Silveira et al., (2004) relataram títulos médios de IgG de 1:

20.480 na RIFI em pacientes com LCD. A redução de anticorpos séricos após a cura

das lesões após terapia é referida por vários autores. A maioria se reporta à redução

de títulos de anticorpos reagentes em RIFI; porém alguns observaram o

desaparecimento destes títulos em poucos meses (Chiari et al., 1973a; Souza et al.,

1982).

Quanto às demais classes de imunoglobulinas produzidas, a análise de

amostras de soros de pacientes com LCM no início da infecção, demonstra baixa

concentração de imunoglobulina A (IgA) anti-Leishmania (Labrada et al. 1989) e

17

níveis moderados de imunoglobulina M (IgM) nos dois primeiros meses de infecção

(Guimarães et al., 1989; 1990; O'Neil et al.,1993).

A secreção de classes e subclasses de imunoglobulinas por células B é em

parte dependente de citocinas produzidas por células T em resposta a estímulos

antigênicos. Diferentes antígenos estimulam diferentemente a produção de

determinadas classes e subclasses de imunoglobulinas (Walker et al., 1983; Schur,

1987). Antígenos T dependentes parecem induzir predominantemente a produção

de IgG1 e IgG3, enquanto IgG2 é induzida por antígenos polissacarídicos como o

LPS, encontrado na parede celular de certas bactérias. A persistência de estímulos

antigênicos pode induzir resposta predominantemente de IgG4. Em indivíduos

saudáveis, as subclasses de IgG, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 representam

respectivamente, cerca de 65%, 24%, 7% e 4%. Todavia, nas diferentes infecções,

esta proporcionalidade se encontra modificada. Nas diversas formas clínicas da

leishmaniose, observa-se predominância de IgG1 específica, podendo haver

alterações nas demais subclasses. IgG4 encontra-se elevada na LCD e em alguns

casos de LV (Ulrich et al., 1995; Caldas et al., 2005). Na LCL e na LCM há

prevalência de IgG1 seguida de IgG3 de IgG2, sendo IgG4 pouco prevalente

(Rodriguez et al., 1996).

Investigações de subclasses de IgG com abordagens diagnósticas são

desenvolvidas em soros de pacientes com LV do Velho Mundo com resultados de

soroprevalência, sensibilidade e especificidade que parecem variar com a área

geográfica (Elassad et al., 1994).

Apesar do grande número de investigações realizadas e da quantidade de

informações atualmente disponíveis na literatura científca, existem grandes lacunas

18

a serem preenchidas, especialmente as que dizem respeito ao papel de células B e

anticorpos produzidos durante a infecção por Leishmania.

2.4 DIAGNÓSTICO

2.4.1 Exames parasitológicos

O diagnóstico da doença humana considera critérios clínicos, epidemiológicos

e laboratoriais. Doenças dermatológicas com as quais a LTA pode ser confundida

são, entre outras, sífilis, piodermites, esporotricose, cromomicose, tuberculose

cutânea, e hanseníase (MS, 2006).

Os métodos parasitológicos são os mais indicados para o diagnóstico,

constituindo-se no diagnóstico de certeza (Hepburn, 2000; MS, 2007). O exame

direto é o mais empregado e consiste na visualização ao microscópio de formas

amastigotas a partir de material de escarificação, aspirado de borda da lesão, ou

impressão de fragmento de lesão, por aposição em lâmina corada pelo Giemsa. O

exame é de baixo custo e fácil execução. Porém, apresenta baixa sensibilidade,

principalmente, em lesões com longo tempo de evolução e em casos de infecção por

L. (V.) braziliensis, caracterizados pela presença de baixo número de parasitos

(Furtado, 1980; Mendonça et al., 1986; Hepburn, 2003).

O exame histopatológico, realizado a partir de fragmento de lesão excisado

por biópsia, permite a visualização de parasitos em macrófagos e as características

do processo e das células inflamatórias (Faber et al., 2003). As preparações podem

ser analisadas por coloração com hematoxilina-eosina ou por colorações para

análise imunohistoquímica. Nas duas situações a sensibilidade é baixa, com

resultados descritos na literatura variando entre 14% e 80,3%. Como na maioria das

19

técnicas para comprovação de Leishmania, esta também produz melhores

resultados quanto mais recente for a infecção (Mendonça et al., 1986; Weigle et al.,

1987; Singh, 2006; Quintella et al., 2009;).

O isolamento do parasito de fragmento de lesão, semeado em meios de

cultura apropriados, permite a visualização de formas promastigotas. A positividade

é variável, podendo ocorrer contaminações que inviabilizam o crescimento de

Leishmania sp. encontrando-se, na literatura, valores de sensibilidade em torno de

50% (Furtado, 1980). O isolamento por inoculação em animais, muito empregado no

passado, não é atualmente indicado para a rotina diagnóstica (MS, 2007).

As técnicas de biologia molecular fundamentam-se na amplificação de

moléculas de DNA do cinetoplasto dos parasitos presentes na amostra analisada.

Atualmente, existe uma variedade de técnicas derivadas do mesmo princípio. Estes

métodos, até o momento, são usados com finalidade de investigação e/ou de

diagnóstico da LTA em centros de referência e instituições de pesquisa. Possuem

boa acurácia, porém, são de custo elevado (Faber et al., 2003; Fagundes et al.,

2007a; MS, 2007).

2.4.2 Métodos imunológicos

2.4.2.1 Intradermorreação de Montenegro

A IDRM avalia a resposta celular de hipersensibilidade tardia a antígeno de

Leishmania inoculado por via intradérmica, sendo amplamente utilizada para

diagnóstico e em inquéritos epidemiológicos (Cuba-Cuba et al., 1985; Marzochi et

al., 1980). A reação foi observada por Wagener (1923) com extratos de Leishmania

20

tropica e de Leishmania donovani em cobaios previamente imunizados. Em seguida,

Montenegro (1926) obteve reações positivas com extratos de promastigotas da

então denominada L. braziliensis. Ao longo dos anos, as preparações foram

modificadas e avaliadas nas diversas regiões geográficas. No Brasil, atualmente, a

rede pública distribui testes intradérmicos compostos por extrato semiparticulado de

Leishmania (L.)amazonensis (IFLA/Br/1967/PH8), isolada de flebotomíneo

(Fagundes, 2007b, c). Considera-se o teste positivo quando há formação de

enduração superior a cinco milímetros, no local da aplicação, após 48 horas. A

sensibilidade da reação próxima a 100% (Furtado, 1980; Mendonca et al., 1986) foi

observada por diversos autores. Tem como desvantagens a possibilidade de

resultados negativos até seis semanas de evolução da lesão e a impossibilidade de

discriminar entre infecção ativa e doença pregressa. Além disso, resultados falsos

positivos podem ocorrer devido a reações alérgicas ao preservante usado nas

preparações antigênicas ou a reações cruzadas (de Lima Barros et al., 2005).

Fagundes, (2007c) estudou indivíduos saudáveis de área não endêmica, para

verificar a ocorrência de reações alérgicas a preservantes utilizados na preparação

do antígeno. Os autores encontraram 9,2% de reatividade à salina mertiolatada,

porém, não observaram reatividade à salina fenolada. Curiosamente, cerca de 30%

dos indivíduos estudados foram reatores ao antígeno de Leishmania.

2.4.2.2 Testes sorológicos

Testes sorológicos são empregados para detecção de anticorpos específicos

nas infecções por Leishmania, sendo indicados para diagnóstico nos casos de LVA

(Badaró et al., 1983; Badaró et al., 1986; Kar, 1995). Todavia, a sua aplicação para o

diagnóstico de LTA tem valor limitado, devido aos baixos níveis séricos de

21

imunoglobulinas específicas observados na maioria dos indivíduos infectados.

Adicionalmente, observam-se com frequência reações cruzadas em amostras de

indivíduos com esporotricose, malária, doença de Chagas, esquistossomose,

hanseníase, tuberculose e sífilis (Bray and Lainson, 1967; Roffi et al., 1980).

Diferentes testes sorológicos podem ser empregados para detecção de

anticorpos específicos anti-Leishmania, alguns dos quais caíram em desuso:

reações de precipitação, imunodifusão, contraimunoeletroforese, reação de fixação

de complemento e reações de aglutinação direta e indireta. Atualmente, a reação de

imunofluorescência indireta, os ensaios enzimáticos (ELISA e dot-ELISA) e o

“immunoblotting” vêm sendo empregados tanto para pesquisa quanto para

diagnóstico (Hommel, 1976; Abdalla, 1977; Masuda et al., 1989; Ryan et al., 2002).

A sensibilidade e a especificidade dos testes variam em função do método utilizado,

da espécie de parasito envolvida e da preparação antigênica empregada, não

havendo antígenos purificados com antigenicidade adequada para bons testes

diagnósticos em larga escala.

Diversas técnicas de precipitação foram utilizadas para diagnóstico até a

década de 70. Difusão em meio líquido (teste do anel) e diversas modalidades de

imunodifusão em gel, como Ouchterlony e contraimunoeletroforese, foram

padronizadas, analisadas e empregadas em estudos visando aplicabilidade no

diagnóstico das leishmanioses. Estas técnicas são pouco usadas na atualidade por

apresentarem resultados relativos à acurácia muito aquém dos necessários a bons

testes diagnósticos. Além disso, quase sempre demandam muito tempo para sua

execução e consomem quantidade relativamente grande de reagentes (Chang &

Negherborn, 1947; Abdalla, 1977; Brener, 1957; Monjour et al., 1978).

22

A reação de aglutinação direta foi um dos primeiros testes sorológicos

empregados para diagnóstico da leishmaniose. Em 1910, Jemma e Di Cristina,

citados por Chaves em 1981, pesquisaram anticorpos aglutinantes em soro de

crianças com LV visando diagnosticar a doença. Apesar dos insucessos dos

primeiros estudos, ao longo das demais décadas, inúmeros trabalhos foram

realizados com objetivo de estabelecer o diagnóstico sorológico com aglutinação

direta (Noguchi, 1926; Auricchio, 1927; Cunha,1938), culminando com a metodologia

estabelecida por Allan e Kagan (1975), que empregaram formas promastigotas de

Leishmania tratadas com tripsina e fixadas por formol. Nestes experimentos, os

autores observaram reações com títulos mais elevados com o uso de parasitos

homólogos. O tratamento enzimático de Trypanosoma cruzi, com a tripsina,

desenvolvido anteriormente para diagnóstico da doença de Chagas por (Vattuone et

al., 1973), resultou segundo os autores, em diminuição da reatividade inespecífica e

da autoaglutinação até então observadas neste tipo de reação. Em 1986, Harith et

al., introduziram no teste para diagnóstico de leishmanioses, o azul brilhante de

Comassie, que permitiu visualização de reação em elevadas diluições aumentando a

acurácia. O teste de aglutinação direta (DAT), assim modificado, tem-se mostrado

apropriado para o diagnóstico de LVA, mas não para LTA, pois se consideram

positivos títulos muito elevados objetivando eliminar possíveis resultados de reações

cruzadas.

Reações de aglutinação indireta com antígenos solúveis adsorvidos em

células, (hemácias de carneiro ou humanas) ou em partículas inertes (partículas de

látex) também foram avaliadas pelo seu potencial diagnóstico para LT. Nestes

diversos estudos ficou evidenciado o limitado valor diagnóstico para a LTA (Bray &

23

Lainson, 1967; Antunes et al., 1972; Mayrink et al., 1972; Al-Qadhi & Haroun, 1976;

Menzel & Bienzle, 1978).

A reação de Fixação de Complemento (RFC), utilizada desde os primórdios

das avaliações de testes com finalidade diagnóstica, foi muito usada em inquéritos

sorológicos caninos no século passado. A RFC pode ser realizada com parasitos

íntegros, antígenos particulados ou antígenos solúveis. Nesta técnica, empregou-se

também antígeno de bacilos alcool-ácido resistentes (BAAR) para o diagnóstico da

LV (Cunha, 1938). Semelhante às técnicas citadas anteriormente, esta também é

pouco adequada para diagnóstico da LTA (Aston and Thorley, 1970).

A RIFI foi usada inicialmente para diagnóstico das leishmanioses em 1963 por

Oddo & Cascio. Fundamenta-se na identificação de anticorpos específicos,

presentes na amostra, com o uso de parasitos íntegros formolizados e anti-

imunoglobulina marcada com fluorocromo. Desde então, formas promastigotas ou

amastigotas de diferentes espécies de Leishmania foram testadas como antígenos

(Furtado, 1980; Guimarães et al., 1989; 1990; Guimarães & Celeste, 1991). Pela

relativa facilidade de obtenção e maior sensibilidade (Bray & Lainson, 1965; Convit &

Pinardi, 1969; Shaw & Lainson, 1977), as primeiras têm sido preferencialmente

empregadas como antígeno. Soro e eluato de sangue, coletado em papel de filtro,

podem ser analisados por esta técnica. O método tem como vantagem, em relação

aos anteriores, o uso de uma quantidade muito pequena de reagente e maior

sensibilidade. Tem como desvantagem o longo tempo empregado nas análises

individuais de diferentes diluições para cada amostra, sendo de difícil automação.

No Brasil, o teste para o diagnóstico de LV, disponível na rede pública de

laboratórios, pode ser empregado para o diagnóstico da LTA, pelo fato das reações

serem gênero específicas. Promastigotas homólogas crescidas em laboratórios de

24

pesquisas são também utilizadas como antígeno, na tentativa de aumentar a

sensibilidade das reações. Os percentuais de sensibilidade e especificidade da RIFI

encontrados na literatura variam entre 60% e 100% (Cuba Cuba et al., 1980;

Marzochi et al., 1980). Geralmente, melhor acurácia é relatada para o diagnóstico de

casos com comprometimento de mucosas, LM ou LCM e nas formas crônicas com

maior tempo de evolução (Cuba Cuba et al., 1980; Barroso-Freitas et al., 2009).

A partir da década de 70, com a introdução dos ensaios enzimáticos, que

possuem elevado grau de acurácia, tornou-se comum o uso do ELISA, técnica

realizada com antígenos adsorvidos em suportes sólidos, principalmente em

microplacas de material inerte (Hommel, 1978; Voller et al., 1976; 1978).

Os ensaios enzimáticos foram inicialmente descritos como ensaios

homogêneos para moléculas de baixo peso molecular (Rubenstein et al., 1972;

Voller & Bidwell, 1975; Voller et al, 1978) e em seguida modificados para ensaios

heterogêneos, mais adequados para detecção de anticorpos em amostras de soros,

com aplicação em doenças infecciosas. O fundamento do teste é semelhante ao da

RIFI, diferenciando-se pelo tipo de marcador usado na anti-imunoglobulina, que

neste caso é uma enzima. Com adição do substrato da enzima e de um cromógeno

a reação pode ser visualizada a olho nu e a intensidade da reação medida por leitura

de absorbância ou transmitância, em fotômetros ou espectrofotômetros.

O primeiro ensaio enzimático usado em grande escala teve por finalidade

identificar anticorpos antivirais em uma investigação pós-vacinal (Voller & Bidwell,

1975). Atualmente estes testes são amplamente usados em diversas áreas de

pesquisa e de diagnóstico (Voller et al., 1976; Voller, 1978; Badaró et al., 1993;

Vidigal Cde et al., 2008; Barroso-Freitas et al., 2009). Isto se deve ao elevado limiar

de detecção destas técnicas, resultando em maior sensibilidade, ao uso de

25

pequenas quantidades de reagentes, ao tempo de execução relativamente pequeno

e, especialmente, à possibilidade de automação, permitindo a realização de grande

número de tesetes em curto espaço de tempo.

O desempenho dos testes está estreitamente relacionado aos antígenos

empregados, que podem ser particulados ou solúveis, purificados ou não e

recombinantes (Badaró et al., 1986; 1993). Antígenos purificados e bem

caracterizados apresentam maior probabilidade de elevar a especificidade, mas

muitas vezes reduzem a sensibilidade do teste. As características dos anticorpos

também podem ser relevantes para a melhoria dos parâmetros desejados nos

ensaios. Por exemplo, sabe-se que o grau de avidez e de afinidade dos anticorpos

pelos antígenos interfere significativamente na sensibilidade e na especificidade das

reações.

No sorodiagnóstico da LTA emprega-se, na maioria das vezes, o parasito

íntegro ou extratos parasitários totais, investigando-se imunoglobulina total ou IgG

específicas. Além disso, a acurácia dos testes pode variar também em função dos

protocolos utilizados, do parasito infectante e da espécie usada como antígeno nos

ensaios (Ulrich et al., 1988). Em trabalhos desenvolvidos por nosso grupo, em

casuística do IPEC, encontramos valores de sensibilidade entre 95,7% e 97,4% e de

especificidade entre 93,7%, e 97,4% (Barroso-Freitas et al., 2009; Ulrich et al.,

1988).

Outra técnica de importância para o sorodiagnóstico da LTA é o

“immunoblotting”, que pode ser usado tanto para a detecção de anticorpos

específicos, quanto para identificação e caracterização de antígenos de Leishmania

reconhecidos por soros de indivíduos infectados. Desta forma, é possível identificar

um padrão de reconhecimento de moléculas ou de grupos de moléculas por

26

amostras de soros, quando se utiliza extratos antigênicos ou frações parcialmente

purificadas. Para diversas doenças infecciosas, os “kits” diagnósticos por

“immunoblotting” são produzidos com proteínas purificadas ou antígenos

recombinantes e previamente transferidos para papel de nitrocelulose (Roffi et al.,

1980; Soto et al., 1996 ; Goncalves et al., 2002). No caso da LTA, o teste com

antígenos totais, produtos liberados em meios de cultura (Mouta-Confort, 1991),

proteínas e glicoproteínas purificadas ou recombinantes (gp 63; GBP; HSP 60; T26-

U2 e T26-U4) têm sido objeto de pesquisas (Bouvier et al., 1985; Montoya et al.,

1990; 1993; Jensen et al., 1996; Rey-Ladino et al., 1997). O seu emprego está

restrito à instituições de pesquisa podendo ser empregada como técnica

confirmatória, não se aplicando à triagem, devido à dificuldades operacionais.

Até o momento não se dispõe de antígenos purificados ou recombinantes

com eficácia comprovada para o diagnóstico de LTA, nem de “kit” comercial com

antígeno de qualquer natureza para ensaios com amostras de origem humana.

27

3 OBJETIVO GERAL

Avaliar o ELISA usando extrato parasitário parcialmente solúvel de formas

promastigotas de L. (V.) braziliensis para detecção de IgG anti-Leishmania em

amostras de soros obtidas de pacientes encaminhados para diagnóstico de LTA.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a sensibilidade, especificidade e valores preditivos, positivo e

negativo, do ELISA para o diagnóstico de LTA considerando-se padrão ouro

a positividade em um dos exames parasitológicos ou exame molecular,

PCR.

Comparar os resultados do ELISA com cada um dos seguintes exames:

IDRM, PCR, exame direto, histopatologia e isolamento em cultura.

Investigar possíveis associações entre resposta humoral por IgG e resposta

terapêutica imediata e tardia, até dois anos após o tratamento.

28

4 METODOLOGIA

4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO

Estudo transversal de avaliação do ELISA como técnica para diagnóstico e

longitudinal para acompanhamento pós-terapêutico de pacientes com LTA durante

um período de dois anos. Comparou-se este ensaio com exames parasitológicos

(exame direto, histopatologia e isolamento em cultura) e PCR, que em conjunto

constituem padrão de referência neste diagnóstico, além da IDRM.

4.1.1 Aspectos éticos

O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do IPEC (CEP/IPEC)

e aprovado com o número 0032.0.009.000-07 (Anexo I). A rotina clínica de

atendimento dos pacientes foi previamente submetida ao CEP/IPEC, constituindo o

projeto: “Estudo para a sistematização do atendimento de pacientes com

Leishmaniose Tegumentar Americana no Centro de Referência em LTA - Instituto de

Pesquisa Clínica Evandro Chagas – FIOCRUZ”, aprovado no CEP/IPEC com o

número 0016.0.009-02 (Anexo II). Os indivíduos foram esclarecidos quanto aos

objetivos gerais do estudo e à utilização de suas amostras de soros solicitando-se

consentimento para o emprego das mesmas, através da assinatura de um termo de

consentimento esclarecido (Anexo III) e o compromisso de confidencialidade foi

assumido e assinado pela autora (Anexo IV).

29

4.1.2 Grupos de estudo

O estudo transversal, de avaliação diagnóstica, incluiu amostras de pacientes

de áreas endêmicas de LTA atendidos no IPEC - FIOCRUZ, Rio de Janeiro - Brasil,

entre março de 2005 e março de 2006. De acordo com a apresentação clínica, o

diagnóstico parasitológico e a evolução clínica dos pacientes, as amostras foram

agrupadas da seguinte forma:

grupo I (LTA) - amostras de 150 pacientes com diagnóstico confirmado de

LTA por pelo menos um exame parasitológico ou PCR. Neste grupo 132 pacientes

apresentavam lesões ulceradas em pele (LC) e 18 tinham comprometimento mucoso

ou cutaneomucoso. Para efeito do estudo estas apresentações clínicas (mucosas e

cutaneomucosas) foram analisadas em conjunto como LCM;

grupo II (controles) - amostras de 103 pacientes suspeitos de LTA,

submetidos ao mesmo protocolo de investigação clínica com resultados negativos

para LTA e confirmação de outro diagnóstico clínico.

Para o estudo longitudinal de avaliação da resposta terapêutica tardia até dois

anos, os pacientes do grupo I (LTA) foram reagrupados em:

subgrupo Cura Terapêutica (ICT) - amostras de 75 pacientes que mantiveram

as lesões cicatrizadas durante o período de acompanhamento pós-tratamento;

subgrupo Recidiva Pós-Terapêutica (IRT) - amostras de 30 pacientes que

apresentaram recidiva das lesões durante o período de acompanhamento pós-

tratamento. Estes pacientes podem ter realizado mais de um tratamento e nesse

caso as amostras foram coletadas antes, durante e após cada um deles: o

tratamento inicial (IRT1), o segundo tratamento (IRT2) ou o terceiro tratamento

(IRT3).

30

Definiu-se reativação como o reaparecimento de sinais de atividade da lesão

(ulceração, eritema, infiltração, descamação e/ou crostas) após o tratamento.

O tratamento dos pacientes com a forma cutânea foi realizado

preferencialmente com trinta aplicações intramusculares de antimoniato de

meglumina na dose de cinco miligramas de antimônio pentavalente por quilograma

de peso por dia. Os pacientes com a forma mucosa foram tratados da mesma forma

até a epitelização total e desinfiltração das lesões (geralmente entre 30 e 60

aplicações). Alternativamente, na forma cutânea, o antimoniato de meglumina pode

ter sido utilizado por via intralesional. Como droga de segunda linha foi utilizada

anfotericina B.

4.1.3 Critérios de elegibilidade

Foram incluídos no estudo pacientes com suspeita de LTA submetidos ao

protocolo do Vigileish para atendimento e investigação diagnóstica no período de

março de 2005 a março de 2006 (Bossuyt et al., 2003).

Foram excluídos do estudo de acompanhamento pacientes do grupo I com

número de coletas inferior a quatro.

4.1.4 Tamanho amostral e coleta

Para determinação da acurácia estimou-se um número mínimo de 158

amostras (79 LTA e 79 controles) com erro α de 0,5% e poder de 80%, para detectar

uma diferença de ao menos 6%, tomando como base a sensibilidade de 90% obtida

31

em trabalho anterior (valor compreendido no intervalo de confiança de 95%)

(Barroso-Freitas et al., 2009).

Amostras para comparação da sensibilidade do ELISA com a de métodos

parasitológicos, PCR e IDRM foram estimadas para comparação de proporções,

considerando-se valores médios de sensibilidade das técnicas obtidos na literatura

admitindo intervalo de confiança de 95% e um poder de 80% (Pagano & Kimberlee,

2004). Estimou-se 99% para PCR e IDRM (Faber et al., 2003; Furtado, 1980), 50%

para isolamento em cultura, para exame histopatológico e para o exame direto

(Furtado, 1980; Romero et al., 2001). Os tamanhos mínimos amostrais para

comparações do ELISA com outras técnicas diagnósticas foram calculados em: 194

amostras para comparação com PCR e IDRM, 34 amostras para comparação com o

isolamento em cultura, com o exame histopatológico e com o exame direto.

As amostras foram obtidas por coletas de sangue periférico, de acordo com o

protocolo de atendimento de pacientes com LTA e coletadas na primeira consulta e

após o tratamento: imediatamente após o final do tratamento; um mês, três meses,

seis meses, um e dois anos após o tratamento; separadas em alíquotas e

conservadas em freezer a –20ºC no Vigileish.

As informações de avaliação clínica, dermatológica e otorrinolaringológica das

variáveis de interesse para o estudo foram obtidas dos prontuários.

4.2 REALIZAÇÃO DOS TESTES SOROLÓGICOS

4.2.1 Antígenos

O antígeno para uso em todos os ensaios foi produzido a partir de formas

promastigotas de L.(V.) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), expandidas em meio

32

BHI (Brain Heart Infusion-Difco), suplementado com 10% de soro bovino fetal (SFB),

200 U/mL de penicilina, 200 μg/mL de estreptomicina e 1% de urina humana

(Madeira et al., 2009). Os parasitos foram coletados em fase estacionária de

crescimento e lavados três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS) ph 7,2 a

3000g a 4ºC (Centrífuga Refrigerada Coulter Allegra 21R-Beckman). Após a última

lavagem, a massa parasitária foi ressuspensa em tampão de lise, contendo

inibidores de protease (1 mM iodoacetamina, 1mM fenilmetilsulfonilfluorídrico e 1mM

fenantrolina) e submetida a ultra-som (Transonic 310, Elma, Durhan, NC, USA)

para o rompimento total dos parasitos. A suspensão foi novamente centrifugada a

10.000g 10 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi coletado e o seu teor de proteína

dosado pelo método de Folin Lowry (micro-Lowry total protein determination kit,

Peterson’s modification; Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA). O antígeno foi

separado em alíquotas e conservado a -20 ºC até o momento do uso.

4.2.2 ELISA

4.2.2.1 Realização do teste

Cada amostra foi analisada em dois momentos distintos, de forma

mascarada, pelo mesmo técnico. O teste foi realizado como descrito em Barroso-

Freitas et al., 2009, resumido a seguir. Para controle da reação, em todos os ELISA,

foram empregadas três amostras de soros reatores de pacientes comprovadamente

com LTA e três não reatoras de indivíduos saudáveis.

Placas de poliestireno (nº de catálogo 439454, Nunc Maxisorp, Nalgene

Nunc International, Rochester, MN) foram sensibilizadas com 100 µL de solução

antigênica em concentração de 7.5 μg/mL, diluída em tampão carbonato-bicarbonato

33

a 0, 06M e pH 9, 6 e incubadas durante a noite a 4ºC. Seguiram-se quatro lavagens

com PBS pH 7,2 com 0,05% de Tween 20 (PBS-T), em lavadora automática (Tecan

– Columbus Washer). Das amostras de soro diluídas a 1: 40 em solução 1% leite

desnatado (Molico) em PBS 0,01M pH 7,2 Tween 20 a 0,05% (PBS-T-L), foram

adicionados 100 µL em cada poço, incubando-se por 45 minutos a 37ºC em câmara

úmida. Após quatro novas lavagens, foram adicionados 100µL de anti-IgG

conjugada à peroxidase diluída em PBS-T-L em cada poço. A diluição do conjugado

usada no teste foi estabelecida através de titulação prévia. As etapas de lavagem

dos poços das placas foram realizadas com PBS Tween 20 a 0,5% e as incubações

com os reagentes foram de 45 minutos a 37ºC. A reação foi revelada utilizando-se

3.3’.5.5’-tetrametilbenzidina (TMB) e a densidade optica (DO) determinada em

absorbância em espectrofotômetro de placa de ELISA (Tecan - Genius).

4.2.3 Comparação de ELISA com IDRM, PCR e métodos parasitológicos

As amostras de sangue foram obtidas antes do tratamento e os dados clínicos

e resultados de exames a partir de prontuários. Comparou-se o ELISA com a IDRM

e com cada um dos métodos parasitológicos (exame direto, histopatológico e

cultura) e PCR. Na rotina do Vigileish a PCR e IDRM são sumarizados a seguir:

Investigou-se DNA do parasito em lesão pela PCR usando-se o “primer” para

região conservada de kDNA do gênero Leishmania (5´-(G/C)(G/C)(C/G)CC(A/C)-

CTAT(A/T)TTACACCAACCCC e 5´-GGGGAGGGG-CGTTCTGCGAA) produto de

120 pares de bases, protocolo “Hot Start”, enzima Amplitaq Gold (Pirmez et al.,

1999; Schubach et al., 2001; Fagundes et al., 2007b).

34

Na IDRM empregou-se o antígeno produzido pelo Centro de Produção e

Pesquisas de Imunobiológicos do Paraná, 40 µg /mL Leishmania amazonensis cepa

IFLA/BR/1967/ PH8 contendo 40 µg /mL de nitrogênio proteico preservado em 0,4%

de fenol (Fagundes et al., 2007a).

O exame direto foi realizado a partir de material obtido por esfregaço em

lâmina de escarificado da borda da lesão ou de aposição em lâmina de fragmento de

biópsia, ambos corados pelo Giemsa.

Os exames histopatológicos foram analisados após coloração de lâminas com

seções de blocos de tecidos embebidos em parafinas e corados pela hematoxilina e

eosina.

O isolamento de Leishmania foi obtido a partir de fragmentos de biópsia das

lesões como descrito em Madeira et al. (2009). Após imersão do fragmento em

salina contendo antibióticos e antifúngicos por 24horas a 4 ºC, o espécime foi

transferido para meio de cultura bifásico Novy-MacNeal-Nicolle suplementado com

meio de cultura de Schneider e SFB a 10%. Os cultivos foram semanalmente

observados para evidenciar crescimento num período máximo de 30 dias.

4.2.4 Associação de ELISA e IDRM para diagnóstico

Realizou-se também análise do uso combinado do ELISA e da IDRM em 242

pacientes (142 do grupo I e 100 do grupo II) com a finalidade de investigar se a

associação dos métodos produz resultados com valor diagnóstico mais preciso que

usados isoladamente. Avaliou-se a associação dos métodos em paralelo, quando se

procede à análise nos dois testes considerando-se como resultado a positividade em

um deles, e em série quando um dos métodos é usado como triagem e o outro como

confirmatório de resultados positivos.

35

4.3. ANÁLISE DOS RESULTADOS

4.3.1 Variáveis de interesse

As variáveis consideradas foram sexo, pesquisa de Leishmania pelo exame

direto, pesquisa de Leishmania pelo exame histopatológico, isolamento em cultura e

PCR; intradermorreação de Montenegro, forma clínica da doença, tempo de

evolução da LTA em dias, exames diretos com colorações especiais e inoculação

em meios de cultura para fungos e micobactérias, resposta ao tratamento, número

de lesões, tamanho das lesões em milímetro, resultado de testes expres em unidade

arbitrada (UA)

4.3.2 Análise estatística

As análises foram realizadas considerando-se o intervalo de confiança de

95% (IC=95%) empregando-se os programas estatísticos Statistical Package for the

Social Science versão 11.0 (Inc., Chicago,IL, USA) e MedCalc 8.2 (Mariakerke,

Belgium).

A confiabilidade foi avaliada pelo coeficiente de correlação intraclasse (ICC)

onde valores próximos a um indicam uma boa reprodutibilidade.

A linha de corte (“cut-off”) do ELISA foi estabelecida no ponto de maior

sensibilidade e especificidade da curva “Receiver Operating Characteristic” (ROC),

considerando-se os grupos I (no momento do diagnóstico) e II. A área sob a curva

(AUC), cujo valor máximo é um, indica um bom desempenho do teste.

Os resultados são representados por Unidade Arbitrada (UA) calculada como

o resultado da divisão entre a leitura de DO de cada uma das amostras e “cut-off”

36

(UA = DO amostra/’cut-off’), cujo valor superior a um corresponde a resultado

positivo. Consequentemente a UA igual a um corresponde ao “cut-off”.

Alternativamente analisou-se o valor de UA superior a dois (UA>2) como um

possível “cut-off” em função da obtenção de valores elevados encontrados em

amostras no estudo de acompanhamento após o tratamento.

Os parâmetros de acurácia, sensibilidade, especificidade, valores preditivos e

razões de verossimilhança foram calculados com o auxílio do MedCalc 8.2.

As comparações entre as variáveis contínuas segundo as leituras de DO e

unidades arbitradas entre os grupos foram realizadas pelo teste não paramétrico de

Mann-Whitney para amostras independentes e Wilcoxon para grupos relacionados

(comparações de unidades arbitradas intra-grupos no acompanhamento das

amostras). As análises foram conduzidas comparando-se a reatividade das

amostras dos pacientes do grupo I no momento do diagnóstico e nos demais tempos

estabelecidos. Investigaram-se possíveis diferenças intragrupos e intergrupos nas

amostras daqueles pacientes que mantiveram as lesões cicatrizadas (subgrupo ICT)

com aquelas de pacientes cujas lesões reativaram durante o período do estudo

(subgrupo IRT).

Comparações de proporções de sensibilidade entre o ELISA e os outros

métodos diagnósticos foram realizadas pelo teste Qui-quadrado com o auxílio do

MedCalc 8.2.

Para as correlações entre as leituras de DO número de lesões e idade usou-

se o coeficiente de correlação de Spearman.

37

5 RESULTADOS

Foram analisadas 780 amostras de soros de 253 pacientes, 110 (43,4%)

mulheres e 143 (56,6%) homens com idade entre 4 e 91 anos (38,8 + 19,7anos).

Entre os casos 92 (61,3%) eram homens e 58 (38,7%) mulheres.

As informações obtidas de prontuários dos pacientes, relativas ao diagnóstico

parasitológico e frequência dos diagnósticos observados no grupo controle (II)

encontram-se na tabela 1.

Tabela 1 Grupos do estudo para determinação da acurácia do ELISA.

Grupos N Subtotal

Grupo I LTA confirmada parasitologicamente 150

LC 132

LCM 18

Grupo II Controle (outro diagnóstico confirmado) 103

Esporotricose 44

Infecções bacterianas 19

Ulceras de estase 19

Carcinomas 5

Outros 16

Total 103 253

LTA, leishmaniose tegumentar americana; LC, leishmaniose cutânea; LCM, leishmaniose cutaneomucosa

5.1 ELISA

5.1.1 Confiabilidade

A repetibilidade do ELISA, aferida em duas análises independentes, foi

avaliada pelo coeficiente de correlação intraclasse (ICC) obtendo-se o valor 0,953,

IC 95%= (0,939 - 0,963) considerado excelente (Gráfico 1).

38

Gráfico 1. Confiabilidade do ELISA, leitura de densidade óptica (DO) em duas análises, estimado pelo coeficiente de correlação intraclasse 0,953 Intervalo de confiança de 95% (0,939 - 0,963).

5.1.2 Acurácia

A definição dos soros reatores foi estabelecida pela linha de corte (cut-off) de

0,497, obtida na curva ROC com a leitura de DO das amostras. A área sob a curva

foi 0,967 (Intervalo de confiança de 95% = 0,943 a 0,992; gráfico 2).

Gráfico 2. Área sob a curva ROC obtida com o ELISA, 0,967 (Intervalo de confiança de 95% = 0,943 a 0,992).

DO2

2,52,01,51,0,5 0,0

DO

1

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

Controles

LTA

1 - Especificidade

1,00,80,5 0,30

1,0

0,8

0,5

0,3

Se

nsi

bili

da

de

39

Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN),

razão de verossimilhança positiva (RVP) e razão de verossimilhança negativa (RVP)

com base na análise dos resultados dos grupos LTA e controles estão apresentados

na tabela 2.

Tabela 2. Resultados de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN), razão de verossimilhança positiva (RVP) e negativa (RVN), intervalo de confiança (IC).

Parâmetros de acurácia % IC (95%)

Sensibilidade 94,7 89,8- 97,7

Especificidade 95,1 88,9- 98,4

VPP 96,6 91,1 - 98,6

VPN 92,4 89,7 - 98,7

RVP 19,31

RVN 0,06

5.1.3 Correlações

Média, desvio padrão e mediana da UA de DO obtidos com o grupo I foram

respectivamente 1,057 (+0,343), e 2,1 e com o grupo II respectivamente, 0,312 (+0,

169) e 0,6. As medianas das UA dos grupos I e II diferiram entre si com significância

estatística (p-valor<0.0001).

A média de leitura de DO e mediana das UA foram mais elevadas nas

amostras de pacientes com LCM que com LC. A diferença entre as medianas das

UA destes grupos apresentou significância estatística (Mann-Whitney; p-valor <0,05)

(Gráfico 3).

40

Gráfico 3. Distribuição dos valores de unidades arbitradas (UA) obtidas no ELISA com amostras dos grupos I (LC-leishmaniose cutânea e LCM - leishmaniose cutâneo-mucosa) e II (controles).

Os demais resultados relativos às médias de leituras de DO, desvios padrão e

medianas da UA no ELISA dos grupos e subgrupos estão apresentados na tabela 3.

Diferente das amostras de pacientes com LC, todas as amostras de pacientes com

LCM foram reatoras ao ELISA.

No grupo I, foram observadas correlações positivas fracas, obtidas pelo

coeficiente de correlação de postos de Spearman, entre a intensidade de reação

representada pela UA e as formas clínicas, (r = 0,196 p-valor<0,05), o número de

lesões (r = 0,268, p-valor=0,001), diâmetro das lesões (r = 0,207 p-valor<0,05).

Não se observou correlação entre UA e diâmetro da IDRM e tempo de

evolução em meses. No grupo II, as reações inespecíficas ocorreram em cinco

pacientes com os seguintes diagnósticos: esporotricose (2), piodermite (1),

carcinoma (1) e úlcera vascular (1).

Grupos

III LCM I LC

UA

5

4

3

2

1

0

-1

41

Tabela 3. Médias de densidade óptica (DO), desvio padrão (dp) e medianas das unidades arbitradas (UA) obtidas no ELISA com as amostras analisadas. (LTA) leishmaniose tegumentar americana, (LC) leishmaniose cutânea, (LCM) leishmaniose cutaneomucosa.

Grupos Subtotal

Média

de DO dp

Mediana

das UA

Grupo I LTA N 150 1,057+0,343 2,1

LC 132 1,03 +0,34 2,03

LCM 18 1,253+0,304 2,4

Grupo II Controle 103 0,312+0,169 0,6

Esporotricose 44 0,306+0,106 0,6

Infecções bacterianas 19 0,314+0,18 0,6

Ulcera de estase 19 0,318+0,298 0,4

Carcinomas 5 0,394+0,174 0,7

Outros 16 0,297+0,07 0,6

Total 253 0,754+0,464 1,5

5.2 . COMPARAÇÃO DE ELISA COM IDRM, PCR E MÉTODOS

PARASITOLÓGICOS

A sensibilidade do ELISA foi comparada com a de cada uma das demais

técnicas diagnósticas (dados obtidos dos prontuários) pelo teste Qui-quadrado

(gráfico 4).

Não foram observadas diferenças com significância estatística entre a

sensibilidade do ELISA e da PCR ou da IDRM, o mesmo não ocorrendo na

comparação com outros métodos (tabela 4). Os pacientes não reatores à IDRM

tinham até 3 meses de evolução das lesões. Nestes mesmos pacientes o ELISA foi

42

reator. Entre os controles observou-se reatividade da IDRM em 37 (37%) indivíduos.

Quinze deles receberam o diagnóstico de esporotricose.

Gráfico 4. Comparação entre as sensibilidades do ELISA, IDRM, PCR e métodos parasitológicos.

94,7 92,3 91,7

76,0

63,9

49,3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ELISA IDRM PCR Cultura Histopat Imprint

Se

nsib

ilid

ad

e %

Tabela 4. Comparação entre a sensibilidade do ELISA e IDRM, PCR e métodos parasitológicos.

Método Nº amostras N° reatores Sensibilidade % p-valor

ELISA* 150 142 94,7

IDRM 142 131 92,3 0,575

PCR 144 132 91,7 0,454

Cultura 146 111 76 <0,0001

Histopatológico 144 92 63,9 <0,0001

Exame direto 142 70 49,3 <0,0001

*grupo de comparação em teste Qui-quadrado

Os valores de concordância corrigida Kappa de 0,492 e 0,542 foram obtidos na

comparação dos resultados do ELISA com PCR e da IDRM respectivamente

(Tabelas 5 e 6). Observou-se maior concordância de resultados positivos do ELISA

com a PCR 79,1%, com a IDRM a concordância foi de 52,9%.

43

Tabela 5. Concordância de resultados do ELISA com IDRM.

IDRM Total

Reator Não reator

ELISA Reator 128a 12 140

Não reator 40 62b 102

Total 168 74 242 a concordância de resultados positivos 52,9% b concordância de resultados negativos 25,6%

Tabela 6. Concordância de resultados do ELISA com PCR.

a - concordância de resultados positivos 79,1% b- concordância de resultados negativos 8,2%

5.3. ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS ELISA E IDRM PARA O

DIAGNÓSTICO

A associação de métodos é uma estratégia comum, visando à melhoria da

sensibilidade e da especificidade para o diagnóstico. O uso do ELISA e IDRM em

paralelo, quando o resultado positivo em uma das técnicas é considerado para o

diagnóstico, resultou em sensibilidade de 99,2%, porém a especificidade foi da

ordem de 61%. Com o uso em série, quando são considerados apenas os

resultados positivos em ambas, encontrou-se 88,0 % de sensibilidade e 98,0% de

especificidade. Os valores preditivos positivos e negativos também foram elevados

(Tabela 7).

Tabela 7. Resultados de associações do ELISA e da IDRM em paralelo e em série com os respectivos desvios padrão para o diagnóstico de LTA.

PCR

Positivo Negativo Total

ELISA Reator 125a 12 137

Não reator 8 13 21

Total 133 25b 158

44

Testes em paralelo IC 95% Testes em série IC 95%

Sensibilidade % 99,2 (95,6 - 100) 88 (81,2 - 92,7

Especificidade % 61 (50,7 - 70,4) 98 (92,3 - 99,7)

VPP % 78,3 (71,5 - 84,0) 98,4 (93,3 - 99,7)

VPN % 98,4 (90,2 - 99,9) 85,2 (77,1 - 90,9)

5.4 . AVALIAÇÃO DO ELISA NO CONTROLE PÓS-TRATAMENTO DE

PACIENTES COM LTA

O monitoramento de IgG por ELISA até dois anos após o tratamento foi

realizado em 720 amostras de 106 pacientes do grupo I que preencheram os

critérios de inclusão.

O subgrupo ICT foi constituído por amostras de 75 (70,7%) pacientes que se

mantiveram curados durante o período de seguimento. O subgrupo IRT foi

constituído por 31 pacientes (29,2%) nos quais ocorreu reativação das lesões. Em

nove deles (8,5%) houve mais de uma reativação. Estes subgrupos (ICT e IRT),

foram constituídos para avaliação de resposta terapêutica incluindo-se nas análises

amostras de pacientes independente da forma clínica, exceto quando especificado

análises em separado. As 103 amostras do grupo controle – grupo II foram

coletadas apenas no momento do diagnóstico. A distribuição dos pacientes, o

número de amostras analisadas e a mediana das unidades arbitradas obtidas no

ELISA encontram-se na tabela 8. Como citado, o “cut-off” corresponde à UA igual a

um (UA =1) porém em função dos elevados valores de UA observados no grupo IRT

os resultados foram também analisados com base em UA maior que dois (UA>2).

45

Tabela 8. Número de pacientes, de amostras analisadas e mediana das unidades arbitradas (UA) do ELISA. Grupos: ICT – amostras de pacientes com cura após tratamento; grupo IRT – amostras de pacientes com reativação da lesão após tratamento. Med- mediana; IIQ- intervalo interquartil.

Grupos e Subgrupos N pacientes N amostras Med (IIQ)

LTA

Subgrupo I CT* - cicatrização 75 441 1, 840 (1,289)

Grupo IRT*- reativação 31 279 2,739 (1,910)

Subtotal 106 720 2,115 (1,627)

Controles 103 103 0,609 (0,299)

Total 209 823 1,864 (1,797)

* Mann-Whitney; p-valor<0,0001.

5.4.1 Acompanhamento sorológico por ELISA no subgrupo I CT - pacientes

com lesões cicatrizadas até dois anos pós-tratamento.

Os níveis de IgG, representados pela UA, obtidos com as 441 amostras

analisadas neste subgrupo, foram mais elevados no momento do diagnóstico e logo

após o tratamento, havendo redução gradual ao longo de dois anos de

acompanhamento (Gráfico 5). A reatividade individual das amostras no ELISA de

pacientes sem reativação não foi homogênea. Contudo, no período imediatamente

após o tratamento, as medianas das UA observadas foram significativamente mais

elevadas que no momento de diagnóstico (Wilcoxon, p-valor <0, 0001 e 0, 022) e um

mês após o tratamento. Inversamente, a partir de seis meses após o tratamento,

encontraram-se medianas com valores inferiores às do momento diagnóstico

(Wilcoxon; p-valor<0,016), (Tabela 9).

46

Gráfico 5. Distribuição dos valores de unidades arbitradas (UA) de IgG do ELISA no grupo com cura até dois anos após tratamento (subgrupo grupo ICT) avaliados: no diagnóstico (D), imediatamente após tratamento (pt) 1mês (1m), 3 meses (3m), 6 meses (6m), 1 ano (1a) e 2 anos (2a) após o tratamento e nos (C) controles.

A frequência de soros positivos, inicialmente de 97,3%, também foi

gradualmente reduzindo até alcançar 47,2% ao final de dois anos de

acompanhamento (Tabela 9).

Tabela 9. Comparação das medianas (med) das unidades arbitradas obtidas com as amostras do subgrupo I CT (cura após tratamento) no período avaliado.

Período % reatores Nº de reatores /N Med das UA p valor

Diagnóstico* 97,3 (73/75) 2,147

Final tratamento 100 (50/50) 2,62 <0,0001

1 mês 96,9 (62/64) 2,261 0,022

3 meses 83,3 (57/66) 1,978 0,348

6 meses 88,6 (62/70) 1,58 0,016

1 ano 82 (50/61) 1,388 <0,0001

2 anos 47,2 (26/55) 0,884 <0,0001

Total 86,2 (381/441) 1,84

*Grupo de comparação em teste Wilcoxon

Período acompanhamento

C2a 1a6m3m1mptD

UA

10 9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

-1 -2

47

Dois pacientes apresentavam amostras não reativas ao ELISA no momento

do diagnóstico: um deles se manteve sem reatividade durante o período

acompanhado, neste caso até um ano de acompanhamento, porém, o outro se

tornou reator fraco com leituras de DO próximas ao “cut-off” perdendo a reatividade

aos dois anos após o tratamento.

Níveis mais elevados de IgG, em amostras com UA superior a dois (duas

vezes o “cut-off”), foram encontrados apenas em 15,3% (4/26) das amostras

reatoras representando 6,8% (4/59) do total deste subgrupo ao final de dois anos de

acompanhamento.

5.4.2 Acompanhamento sorológico por ELISA no subgrupo I RT - pacientes

com reativações até dois anos pós-tratamento.

No subgrupo IRT foram estudadas 279 amostras de 31 pacientes com

reativação das lesões após o tratamento, dos quais oito reativaram mais de uma

vez. Os valores das medianas das unidades arbitradas no ELISA das amostras do

subgrupo IRT analisadas em conjunto e a significância estatística estão

apresentadas na tabela 10.

Tabela 10. Medianas (med) das unidades arbitradas (UA) no ELISA das amostras de pacientes com reativação coletadas antes e após tratamento.

IRT N Med p-valor

Diagnóstico 31 2,327

Pós-tratamento 40 3,238 <0,001

1mes 39 2,915 0,006

3 meses 31 2,464 0,013

6 meses 23 2,643 0,527

1ano 22 1,568 0,072 2anos 13 1,252 0,001

Anterior à reativação 38 2,805 0,019

Reativação 31 4,017 <0,0001 * Grupo de comparação no teste Wilcoxon

48

As análises foram realizadas em amostras coletadas antes, durante e após: o

tratamento inicial (IRT1), o segundo tratamento (IRT2) ou o terceiro tratamento

(IRT3); (gráfico 6 e tabela 11).

A reatividade individual das amostras no ELISA de pacientes com reativações

não foi homogênea quanto à intensidade de reativação nem quanto à elevação no

momento da reativação (gráfico 6). Contudo, considerando-se em conjunto o

subgrupo IRT, (IRT1, IRT2 e IRT3), encontrou-se valor da mediana da UA na

reativação (4,017) superior ao do momento do diagnóstico (2,327; Wilcoxon p-

valor<0,0001) e ao do momento imediatamente pós-tratamento (3,238; p-

valor=0,023) , tabela 10.

49

Gráfico 6. Resultados da reatividade, em unidades arbitradas (UA), do ELISA em amostras de pacientes com reativações coletadas antes, durante e após: (A) tratamento inicial (IRT1), (B) segundo tratamento (IRT2) terceiro tratamento (IRT3).

D= diagnóstico; R1= primeira reativação; R2= segunda reativação; Pt= final de tratamento; 1m=

1mês; 3m= três meses; 6m= seis meses; 1a= um ano e 2a= dois anos após o tratamento, C=

controles.

Período de acompanhamento

C1a6m3m1mPtD

UA

7

6

5

4

3

2

1

0

-1

808826

814

815

676

Período de acompanhamento

C2a1a6m3m1mPtR1 U

A

7

6

5

4

3

2

1

0

-1

808826

814

815

398

416

Período de acompanhamento

C2a1a 6m3m1mPtR2

UA

A

8

7

6

5

4

3

2

1

0

-1

-2

808826

814

815

339

608

A B

C

50

A soroprevalência de IgG, nos três subgrupos (momentos de

acompanhamento), foi elevada em todos os pontos da análise, havendo poucas

conversões para o estado de não reator durante o período de observação (Tabela

11). Encontrou-se correlação positiva entre os valores de UA das amostras no

diagnóstico e no momento da reativação após tratamento (r= 0,637 p-valor <0,01).

Tabela 11. Soroprevalência de IgG detectada por ELISA e mediana das unidades arbitradas (UA) em amostras de pacientes com reativação coletadas antes e após: o tratamento inicial (I RT1), o segundo tratamento (I RT2) ou o terceiro tratamento (I RT3).

Período

acompanhamento __ _I RT1______ _ _ _IRT2_____ __ _ IRT3______

% reatores

(N)

Med da

UA

% reatores

(N)

Med da

UA

% reatores

(N)

Med da

UA

Diagnóstico/R* 96,8 (31) 2,327 100 (27) 4,099 100 (10) 3,113

Pós-tratamento 95,2 (21) 3,321 100 (16) 3,17 100 (6) 3,138

1mes 100 (19) 2,9 94,4 (18) 2,76 85,7 (8) 3,142

3 meses 92,9 (14) 2,387 100 (18) 2,279 100 (6) 3,82

6 meses 88,9 (9) 2,652 100 (15) 2,678 100 (3) 2,207

1ano 100(3) 3,08 80 (15) 1,686 66,7(3) 1,193

2anos - - 71,4 (7) 1,252 50 (2) 0,866

* Diagnóstico em IRT1 e reativação em IRT2 e IRT3

As medianas das unidades arbitradas do momento imediatamente anterior à

reativação (med=2,850) e da reativação (med=4,016) também diferiram com

significância estatística (Wilcoxon p-valor<0,0001). As médias das unidades

arbitradas, cujos valores foram próximas às das medianas encontram-se no gráfico

7.

51

Analisando-se apenas as amostras antes da primeira reativação (IRT1)

observou-se que a UA do momento do diagnóstico (2,327) foi inferior: à do pós-

tratamento (med=3,321, Wilcoxon p-valor=0,002), a do momento anterior à

reativação (med=2,804; p-valor=0,019) e a da reativação (med=4,01; p-valor,0,0001)

A frequência de amostras com UA superior a dois (24/27), também foi maior

na reativação que nos demais momentos, todavia esta diferença não apresentou

significância estatística.

Gráfico 7. Médias e desvios padrão das unidades arbitradas (UA) de soros de pacientes do subgrupo IRT (IRT1, IRT2 e IRT3) avaliados por ELISA.

(D), no diagnóstico; (Pt), pós-tratamento (ARe), antes da reativação e (Re), na reativação.

Como regra, as aparentes perdas durante o período de seguimento foram

consequência das reativações, que alteraram a classificação dos pacientes em

momentos diferentes. As reativações ocorreram em sua maioria no primeiro ano

após o tratamento, com 16 eventos até o terceiro mês, doze até seis meses e três

com um ano ou mais. Ao final do período de estudo, treze pacientes haviam

completado dois anos de acompanhamento da seguinte forma: sete completaram o

acompanhamento após o segundo tratamento, dois após um terceiro tratamento e

quatro após um quarto tratamento (dados não mostrados). Outros catorze pacientes

0

2

4

6

8

D Pt ARe Re

Período de acompanhamento

UA

52

se encontravam em acompanhamento não tendo completado dois anos pós-

tratamento até o final da coleta dos dados deste trabalho. Dois outros estão com

tratamento em curso e apenas dois abandonaram o acompanhamento, um após seis

meses e outro após um ano.

5.4.3 Comparação da resposta de IgG nos subgrupos de pacientes com

cicatrização (ICT) e pacientes com reativação de lesões pós-tratamento (IRT).

A reatividade de todas as amostras de pacientes com reativação das lesões

(IRT) foi mais elevada que a dos que se mantiveram com as lesões cicatrizadas

(ICT) no período pós-tratamento como demonstrado pelas medianas das UA,

respectivamente 1,840 e 2,739 (Mann-Whitney; p-valor<0,0001) (Tabela 8). No

subgrupo ICT os valores de DO e a frequência de resultados positivos tenderam à

redução ao longo do seguimento, enquanto que os do subgrupo IRT se mantiveram

elevados ou tenderam a aumentar.

Avaliando-se o critério de linha de corte de UA>2, encontrou-se frequencia de

resultados positivos (UA>2) até o terceiro mês após o tratamento no subgrupo ICT,

enquanto que no subgrupo IRT1 (pacientes antes da reativação) este valor foi

observado até um ano após o tratamento. Todavia, as medianas destes subgrupos

(ICT e IRT1), quando comparadas em cada ponto do acompanhamento

apresentaram diferenças com significância estatística no sexto mês (Mann-Whitney;

p-valor=0,046) e em um ano após o tratamento (p-valor=0,022). Como pode ser visto

no gráfico 8, os valores médios de intensidade das reações no subgrupo ICT foram

sempre inferiores aos obtidos com o subgrupo (IRT1, IRT2 e IRT3), apesar da

ausência de significância estatística até o terceiro mês.

53

Gráfico 8. Medianas das unidades arbitradas (UA) do ELISA de amostras de soros de pacientes que se mantiveram com lesões cicatrizadas após tratamento (subgrupo ICT) e do subgrupo com reativação das lesões (IRT), após o primeiro (IRT1), segundo (IRT2) ou terceiro tratamentos (IRT3).

D/R= diagnóstico ou reativação; Pt= final de tratamento; 1m= 1mês; 3m= três meses; 6m= seis

meses; 1a= um ano e 2a= dois anos após o tratamento, C= controles.

No subgrupo IRT1 a frequência de UA superior a dois no momento da

reativação foi de 88,9%, (24/27) como demonstrado na tabela 13 e gráfico 9. Por

outro lado, no subgrupo ICT apesar da tendência de declínio da reatividade

observada ao final de dois anos após o tratamento há ainda 48,2% de amostras

reatoras, porém com UA superior a dois em 15,4% (22/26) delas (tabela 12).

Tabela 12. Percentuais de amostras com unidades arbitradas maiores que 2 (%UA>2) nos subgrupos (ICT) pacientes com lesão cicatrizada e (IRT1) pacientes antes da reativação. (N), número de amostras analisadas.

% UA>2

Subgrupos D Pt 1m 3m 6m 1a 2a ARe Re

ICT % UA >2 64 72 57,8 47 35,7 23 7,3 - -

N 75 50 64 66 70 61 55 - -

IRT1 % UA >2 67,7 81 78,9 64,3 77,8 100 - 74,1 88,9

N 31 21 19 14 9 3 - 31 27

p-valor* 0,889 0,619 0,161 0,378 0,039 0,023 - - -

* significância em teste Qui-quadrado (IC=95%) D= diagnóstico Pt= final de tratamento; 1m= 1mês; 3m= três meses; 6m= seis meses; 1a= um ano, 2a= dois anos após o tratamento, ARe= momento anterior à reativação e Re= reativação.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

D/R pt 1m 3m 6m 1a 2a

Período de acompanhamento

ICT

IRT1

IRT2

IRT3

UA

54

A diferença entre as proporções de amostras com UA maior que dois entre os subgrupos ICT e IRT, quando comparadas em cada momento do acompanhamento também diferem a partir do sexto mês.

Gráfico 9. Percentual de soros com unidade arbitrada maior que dois (% de UA > 2) nos subgrupos (ICT) com cura das lesões e (IRT1) antes da reativação.

D= diagnóstico Pt= final de tratamento; 1m= 1mês; 3m= três meses; 6m= seis meses; 1a= um ano, 2a= dois anos após o tratamento, ARe= momento anterior à reativação e Re=

reativação.

Da mesma forma, foi possível estabelecer uma associação entre recidiva e

UA>2, estimada pela UA de chances (odds ratio; OR) a partir de três meses após o

tratamento e pelo risco relativo (RR) a partir de um ano. A estes tempos, a chance

dos pacientes que apresentaram UA>2 no ELISA recidivarem é nove vezes maior do

que naqueles que apresentaram UA<2. (Tabela 13). O risco relativo (RR) assume

significância a partir de 1 ano de acompanhamento, ou seja, com um ano de cura

clínica, o risco de recidivas em pacientes com UA maior que dois é 3,9 vezes maior

que naquelas com UA<2 (IC=95 %) (2,4 - 6,2) e aos 2 anos RR é de 12,2 vezes (IC

95% = 4,7 - 31,7).

01020

3040506070

8090

100%

UA

>2

D Pt 1m 3m 6m 1a 2a AR Re

Período de acompanhamento

ICT %UA >2 IRT %UA >2

55

Tabela 13. Razão de chance (odds ratio; OR) de recidiva em pacientes com UA do ELISA maior que 2 (UA>2) comparado aos que não recidivaram (subgrupo ICT) no período acompanhado.

Períodos avaliados OR IC=95%

Diagnóstico 7,8 2,1 - 28-1 Pós-tratamento 3,1 08 - 11,9

1 mês 5,8 1,5 - 21-4

3 meses 9 2,5 - 32,9 6 meses 14 3,9 - 52,6

1 ano 26,8 7,1-102,6 2 anos 102 21,1 - 492,1

5.4.4 Controle pós-tratamento de pacientes com LCM.

Entre os pacientes com a forma cutâneomucosa, onze preencheram os

critérios estabelecidos para o estudo de acompanhamento (Gráfico 10). Todas as

amostras foram reatoras ao ELISA no diagnóstico. Não houve diferença entre as

medianas da UA dos subgrupos ICT e ITR no diagnóstico, cujos valores foram

2,0393 e 2,430 respectivamente. Em sete, as lesões se mantiveram cicatrizadas

(ICT) durante o período de acompanhamento pós-tratamento que variou entre seis

meses, um ano e dois anos. Nas amostras de quatro destes pacientes

acompanhados até dois anos, se observou conversão para negativação do ELISA

em dois. Nos outros dois a positividade no ELISA se manteve com valores de UA de

1,2 e 1,5 respectivamente. Em um paciente acompanhado até o sexto mês e dois

outros acompanhados até um ano após o tratamento, se observou a manutenção da

reatividade do ELISA com UA, respectivamente, de 1,7; 1,4 e 3,4.

56

Gráfico 10. Reatividade no ELISA, em unidade arbitrada (UA), de soros de sete pacientes com leishmaniose cutâneomucosa distribuídos nos subgrupos ICT (cicatrização das lesões) e de quatro do grupo IRT (com reativação de lesões).

Em quatro outros casos houve reativação de lesões (IRT). Em três deles a

reativação ocorreu um ano após o tratamento e em um deles após dois anos. Todos

apresentaram o perfil geral semelhante ao descrito para o subgrupo IRT, ou seja,

mediana da UA (4,491) no momento da reativação mais elevada que a observada

imediatamente anterior à reativação e ao momento logo após o pós-tratamento

(3,064). Entretanto as diferenças entre as medianas nos momentos de

acompanhamento não são significativas.

ICT

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

D Pt 1m 3m 6m 1a 2a

Período de acompanhamento

UA

1

2

3

4

5

6

7

P

IRT

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

D Pt 1m 3m 6m 1a 2aPeríodo de acompanhamento

UA

1

2

3

4

(D), no diagnóstico; (Pt), logo após o tratamento (1m) um mês, (3m) três meses, (6m) seis meses, um ano (1a) e dois anos (2a) pós- tratamento.

57

6 DISCUSSÃO

No presente estudo, avaliou-se o ELISA para diagnóstico e investigação de

resposta terapêutica imediata e pós-tratamento em amostras de soro de pacientes

com suspeita de LTA atendidos no Vigileish – IPEC - FIOCRUZ, Rio de Janeiro –

Brasil.

O emprego do ELISA para determinação de anticorpos séricos específicos na

LTA baseia-se na sua elevada sensibilidade relacionada ao limiar de detecção deste

método (Voller, 1978; Porstmann & Kiessig, 1992; Singh, 2006). Contudo, a precisão

pode variar em função da forma evolutiva, da espécie de Leishmania e das

preparações utilizadas como antígeno nestes ensaios. Neste estudo, os resultados

do ELISA revelaram excelente reprodutibilidade e valores elevados de acurácia (de

sensibilidade, especificidade, valores preditivos e UA de verossimilhança),

confirmando estudos anteriores de nosso grupo para determinar a espécie de

Leishmania (Barroso-Freitas et al., 2009) e o sistema revelador (Nascimento et al.,

2009) a serem utilizados no teste. Alguns autores também relatam melhor

sensibilidade do ELISA ou RIFI com antígenos de espécie homóloga à responsável

pela infecção (Furtado, 1980; Yoneyama et al., 2007). Outros encontraram

sensibilidade no ELISA, entre 62% e 85%, com baixos valores preditivos (Guimarães

& Celeste, 1991; Brito et al., 2000; Ferreira et al., 2006). Estas divergências podem

ser devidas ao emprego de diferentes isolados de L. (V.) braziliensis na preparação

dos antígenos, a diferenças nos protocolos utilizados nos ensaios e ainda à

diversidade genética do parasito infectante encontrada nas diversas áreas

endêmicas. (Saravia et al., 1989) observaram maior intensidade de resposta

humoral significativa em pacientes com infecção por L. (V.) braziliensis que por

58

Leishmania (V.) panamensis em casos de LC. Romero et al., 2005 encontraram

maior reatividade de soros a antígenos de L. (L.) amazonensis em amostras de

pacientes infectados com L. (V.) braziliensis que nos infectados por L.(V.)

guyanensis.

Embora não seja do nosso conhecimento a existência de estudos

relacionando diversidade genética de isolados de uma mesma espécie com resposta

humoral, o encontro de diferentes genótipos e fenótipos para isoenzimas e para

moléculas de superfície reconhecidas por anticorpos monoclonais é relatado por

diversos autores (Romero et al., 2002; Nolder et al., 2007). Baptista et al., 2009

demonstraram a existência de nove genótipos diferentes de L. (V.) braziliensis

isolados de pacientes do Rio de Janeiro. Híbridos de L. (V.) braziliensis e L. (V)

peruviana, e Leishmania (V) naiff e Leishmania (V) lainsoni foram demonstrados por

Tojal da Silva et al., 2006 e Nolder et al., 2007. Tal variabilidade genética em

espécies causadoras de LTA poderia se refletir na imunogenicidade dos parasitos

produzindo diferenças na resposta humoral do hospedeiro. Por outro lado, poderia

ser de importância a modalidade da infecção, recidivante ou de mucosa e, nesse

caso, se primária ou secundária metastática, associada ou não a diferentes

genótipos.

Inúmeros epítopos e moléculas em preparações antigênicas não purificadas

(Williams et al., 1986) empregadas em testes sorológicos, como a utilizada neste

estudo, podem contribuir para a existência de possíveis reações cruzadas, podendo

também interferir negativamente na reprodutibilidade destes ensaios. Entretanto,

apesar da existência de pesquisas visando o encontro de moléculas com boa

antigenicidade e imunogenicidade para fins diagnósticos e também de vacinação, os

resultados não têm se mostrado superiores aos obtidos com extratos parasitários e

59

frações antigênicas não purificadas (Vidigal Cde et al., 2008). Algumas dessas

moléculas são amplamente conhecidas e estudadas tais como a principal proteína

glicoproteína de superfície de membrana gp63 (Bouvier et al., 1985), proteínas da

família de choque térmico, (“heat shock”) Hsp70, Hsp83 (Celeste et al., 2004),

proteína de membrana de cinetoplasto, KMP-11, entre outras. A despeito destas

considerações, os resultados do ELISA para a avaliação de IgG específica em

pacientes com LTA com antígeno não purificado de L. (V.) braziliensis, aqui

apresentados demonstraram bons parâmetros de acurácia.

A especificidade foi estimada com a análise de amostras do grupo controle,

representativo da população do estudo, constituído por indivíduos com suspeita

inicial de LTA, posteriormente afastada pela confirmação de outro diagnóstico. Desta

forma, não foram incluídas amostras de pacientes com LV, doença de Chagas e

outras doenças que não se constituem em diagnóstico diferencial de LTA e pela

baixa probabilidade da ocorrência dessas co-morbidades na população do estudo.

Nestes casos, a frequência de reações cruzadas com antígenos de Leishmania não

definidos poderia ser elevada (Furtado, 1980; Williams et al., 1986; Vexenat et al.,

1996). Inversamente, a esporotricose é endêmica no estado e representa a principal

causa de investigação para o diagnóstico diferencial com LTA no RJ (de Lima Barros

et al., 2003) . Há sobreposição de áreas endêmicas, além de semelhanças em suas

características clínicas e epidemiológicas. Em estudos anteriores foi encontrado um

percentual expressivo de reações cruzadas no ELISA (22%) com antígeno de

Leishmania major-”like” e na IDRM (39%), (de Lima Barros et al., 2005). Neste

estudo, com antígeno de L. (V.) braziliensis, apenas um entre 44 soros de pacientes

com esporotricose apresentou reatividade ao ELISA, as quatro demais reações

positivas, ocorreram em amostras de pacientes com infecções bacterianas e

60

carcinoma, totalizando 4,8% de reações inespecíficas. Uma das possíveis

explicações para este reduzido número de falsos positivos encontrados poderia ser

a maior afinidade dos anticorpos dos pacientes com LTA para antígenos homólogos,

resultando em reações específicas mais intensas, favorecendo melhor ponto de

corte (“cut-off”) no ELISA e, consequentemente melhoria nos parâmetros de

acurácia. Por outro lado, pode-se também considerar a possibilidade de parte destas

reações serem específicas por se tratar de indivíduos de área endêmica.

A elevada concentração sérica de IgG específica está associada à gravidade

nas leishmanioses, bem exemplificado na LCD e na LV nas quais se pode observar

níveis muito altos de anticorpos (Marzochi & Marzochi, 1994; Silveira et al., 2004).

Na forma mucosa, a maioria dos autores se refere a níveis séricos moderadamente

elevados (Saravia et al., 1989; Silveira et al., 2004). Corroborando estes relatos,

encontrou-se aqui reatividade em todas as amostras de pacientes com LCM

analisadas e diferenças com significância entre as medianas das UA do ELISA das

amostras de pacientes com LC (UA=2,0) e com LCM (UA=2,4). Também se

observou correlação positiva fraca entre os valores de UA e as formas clínicas,

admitindo-se valor numérico de um e dois para LC e LCM respectivamente. Quanto

à relação tempo de evolução das lesões e intensidade de reação, não foram

observadas correlações significativas, diferentemente dos resultados obtidos por

Labrada et al.,1989, .cujos resultados foram superiores em pacientes com mais de

um mês de evolução das lesões. Porém, houve correlação fraca e positiva entre

intensidade de reação e número de lesões (r = 0,268,p<0,01) e diâmetro das lesões

(r = 0,207 p<0,05). Estes achados foram observados por outros autores (Chiari et al.,

1973b; Saravia et al., 1989) que atribuem este fato à presença de maior número de

parasitos em lesões múltiplas, tendo como conseqüência maior estímulo antigênico.

61

A sensibilidade do ELISA foi superior à encontrada em todos os demais

exames realizados, não se observando diferença significativa entre esta e a da

IDRM e da PCR. Por outro lado, a sensibilidade dos testes parasitológicos foi baixa,

especialmente a do exame direto cujo valor foi inferior a 50%. A sensibilidade do

exame direto em esfregaços corados Giemsa, Wright, Leishman ou Fulgem é

conflitante na literatura encontrando-se percentuais entre 13,3% e 100% de

positividade (Furtado, 1980; Mendonca et al., 1986; Romero et al., 2001; Amato et

al., 2003). Entretanto, parece haver um consenso quanto aos exames

parasitológicos, no qual a positividade obtida é inversamente proporcional ao tempo

de infecção (Furtado, 1980; Guimarães et al., 1989; Hepburn, 2003). O exame direto

é utilizado nos laboratórios da rede pública para o diagnóstico de LTA, não sendo do

nosso conhecimento o percentual de positividade obtido nessas análises. É possível

que poucos sejam os casos de LTA efetivamente confirmados nestes laboratórios

por este método. Pode-se argumentar que melhores resultados de acurácia podem

ser obtidos em pacientes com infecções por outras espécies de Leishmania,

especialmente L. (L.) amazonensis, que apresenta maior probabilidade do encontro

de formas amastigotas no exame direto. Porém, a espécie dermatotrópica mais

difundida nas diversas regiões do Brasil é L. (V.) braziliensis, inclusive no estado do

Rio de Janeiro, e se caracteriza por fraco crescimento em meios de cultura e

escassez de parasitos nas lesões. Em estudo comparativo entre aspectos clínicos e

laboratoriais de infecção por L. (V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis de duas

diferentes regiões do Brasil, Romero et al. (2001) detectaram percentuais de

positividade em preparações de exame direto de 24% na primeira situação e 92,6%

para a segunda. Estes dados, entre outros da literatura, parecem confirmar a visão

que o diagnóstico da LTA nas diversas regiões do Brasil causados por diferentes

62

espécies de Leishmania não deveria ser tratado como um procedimento padrão

único (Furtado, 1980; Amato et al., 2003).

O bom desempenho do ELISA quando comparado ao da histopatologia, não

surpreende, em função das dificuldades já descritas anteriormente com relação ao

encontro de parasitos em espécimes de lesões causadas por L. (V.) braziliensis. Os

índices de sensibilidade do exame histopatológico encontrados na literatura têm uma

amplitude de variação muito grande (Furtado, 1980; Amato et al., 2003) aqui se

encontrou 63,9%. Por outro lado, no exame histopatológico há visualização local de

células e de formações características e sugestivas do processo inflamatório

induzido pelo parasito, com ou sem visualização de amastigotas. Contudo, tais

alterações, algumas vezes também não são identificadas (Furtado, 1980; Amato et

al., 2003).

A diferença observada entre as sensibilidades do ELISA (94,7%) e do

isolamento em meio de cultura axênica (76%) também foi significativa. Este método

está geralmente disponível em instituições de pesquisa e em centros de referência

devido ao custo elevado e à infra-estrutura necessária à sua realização. Além disto,

tem como desvantagem a possibilidade de contaminação por outros

microorganismos levando a resultados falsos negativos e o tempo necessário para o

crescimento de Leishmania é variável, que pode se alongar até um mês.

Frente à PCR os resultados de ELISA confirmam a boa performance já

discutida nos parágrafos anteriores. Introduzida na última década como ensaio

diagnóstico, além dos bons índices de acurácia a PCR possibilita a identificação da

espécie de Leishmania pelo emprego de oligonucleotídeos espécie-específicos. Na

rotina diagnóstica do Vigileish esta técnica foi recentemente introduzida para

avaliação de pacientes de LTA do Rio de Janeiro apresentando sensibilidade de

63

94% (Fagundes, 2007a). A relativa complexidade operacional e custos elevados

limitam seu emprego, não sendo possível o uso na maioria dos laboratórios de rotina

diagnóstica.

A boa correlação de resposta humoral, avaliada por ELISA, com infecção e

diagnóstico clínico também foi observada durante este estudo em sete pacientes

que apresentavam fortes evidências clínico/epidemiológicas de LTA. Os resultados

de exames parasitológicos foram negativos (histopatologia, exame direto e cultura),

mas com reatividade no ELISA em amostras de seis dos sete pacientes. Estes foram

submetidos à terapia específica evoluindo com resolução das lesões. A PCR,

realizada posteriormente com espécime clínico da época do diagnóstico, identificou

positividade em todas as amostras. A discordância do ELISA se deu em um dos

casos apenas.

O bom desempenho do ELISA frente aos testes parasitológicos e à PCR,

demonstram que quando alguns destes testes falharam em diagnosticar

corretamente, o ELISA pode produzir um resultado verdadeiro. Ainda que testes

sorológicos não se constituam em ferramenta conclusiva para o diagnóstico de

leishmanioses o seu valor junto às evidências clínico/epidemiológicas, a nosso ver,

não deve ser subestimado.

Não se encontrou correlação entre a intensidade de reação do ELISA e da

IDRM. Esta ausência de correlação é conhecida e relatada por diversos autores

(Mendonca et al., 1986; Silveira et al., 2004). Porém, a concordância de resultados

positivos entre os casos de LTA foi elevada encontrando-se sensibilidades,

respectivamente, de 94,7% e 92,3%. Na prática clínica, a IDRM é muito empregada

como auxiliar ao diagnóstico da LTA, especialmente em condições de difícil acesso

a exames parasitológicos ou na ausência de resultados positivos destes. A

64

credibilidade da IDRM como teste diagnóstico se deve à boa correlação com a

presença de lesões e por representar uma resposta imune do hospedeiro produzida

por linfócitos T cujas funções estão fortemente associadas à resposta protetora. A

despeito da sua elevada sensibilidade existem limitações relativas à baixa

reatividade no início da infecção, à permanência de resultados positivos muitos anos

após a cura clínica ou por toda a vida, à possibilidade de reações cruzadas e a

reações falso positivas ao preservante usado na preparação do antígeno (Marzochi

et al., 1998; de Lima Barros et al., 2005; Fagundes et al., 2007a). Nossos resultados

são consistentes com estas observações; não houve reatividade na IDRM em 10

pacientes do grupo I com tempo de evolução das lesões variando entre um e três

meses, nestes o ELISA foi reator. Por outro lado, entre os reatores à IDRM do grupo

II (37/100), apenas três foram reatores ao ELISA. Todavia, não se pode descartar a

possibilidade destas reações serem específicas, já que os indivíduos residiam em

áreas endêmicas. A concordância kappa observada entre os testes foi baixa 0,542

devido à elevada reatividade observada na IDRM neste segundo grupo (não

doentes). Desta forma, a performance do ELISA, nas condições deste estudo, foi

superior à da IDRM, considerando-se a especificidade de ambas. Por estas

unidades arbitradas, a análise da associação do ELISA com a IDRM, combinadas

em paralelo, quando se considera os resultados positivos dos dois testes, produziu

sensibilidade próxima a 100% mas com especificidade baixa (61%). A associação

em série produz sensibilidade e especificidade elevadas, respectivamente 88% e

98%, com valor preditivo positivo de 98,4% (IC=95; 93,3 - 99,7) o emprego destes

testes em associação também pode ser uma alternativa para o diagnóstico na

ausência de resultados parasitológicos positivos.

65

O controle da cura clínica de pacientes com LTA é importante para detecção

precoce de recidivas cuja ocorrência não é rara Chiari et al. (1973a). Em casos de

LTA causada por L. (V.) braziliensis, além das recidivas no mesmo sítio anatômico,

há possibilidade de surgimento de lesões em mucosas após a cura clínica de

pacientes com diagnóstico inicial de LC. O diagnóstico e tratamento precoce de

lesões em mucosas se justificam pela possibilidade de evolução com elevado poder

destrutivo, geralmente com comprometimento cartilaginoso, das vias aéreas

superiores.

O declínio da resposta humoral após a terapia específica, avaliado pela

redução da intensidade das reações de IgG no ELISA, em pacientes que não

apresentaram reativação de lesões (grupo ICT), é consistente com relatos existentes

na literatura tanto para LC quanto para LCM (Souza et al., 1982; Labrada et al.,

1989; Convit et al., 1993). A intensidade das reações aferida ao final do tratamento

foi superior à do momento do diagnóstico, iniciando uma curva decrescente um mês

após o tratamento. É possível que este aumento de reatividade imediatamente após

a terapia seja consequência de uma maior liberação de antígenos devido à

destruição de células infectadas e de amastigotas gerando maior ativação da

resposta humoral. Aumento de títulos de anticorpos em RIFI precedendo a

cicatrização da lesão em pacientes de LTA também foi observado em percentuais

variados por alguns investigadores (Chiari et al., 1973a; Souza et al., 1982; Convit et

al., 1993). Coincidindo com estes achados, em investigação de resposta

linfoproliferativa de pacientes com LC, Mendonça et al., 1986 observaram resposta

significativamente mais elevada a antígenos de Leishmania durante a terapia que

antes da terapia. Os autores também relacionam este fato à destruição de parasitos

e consequente aumento da resposta imune celular. Apesar da ausência de

66

correlação entre resposta celular e resposta humoral e do pouco conhecimento

desta na imunopatologia da doença, o fato é que estímulo antigênico também induz

produção de anticorpos.

No presente estudo, a intensidade das reações só se tornou

significativamente inferior à do momento do diagnóstico a partir do sexto mês após a

terapia, mas o percentual de indivíduos reatores nesta época ainda foi da ordem de

88%. Somente após dois anos a frequencia de reatores, ainda que de baixa

intensidade, ficou inferior a 50%. Entretanto, UA maior que dois foram encontradas

apenas, em 7,3% das amostras analisadas neste período. Neste aspecto, estes

resultados diferem de alguns encontrados na literatura os quais relatam negativação

de testes sorológicos na maioria dos pacientes, a partir de três a quatro meses após

a terapia bem sucedida. Estas divergências possivelmente se devem ao teste

empregado nestas pesquisas, a RIFI. De fato, em nossa experiência em diagnóstico

de pacientes no Rio de Janeiro, observamos que na maioria das vezes detecta-se

primeiro a redução e/ou negativação dos títulos de imunofluorescência indireta e

posteriormente redução ou negativação do ELISA (dados não mostrados). Além do

limiar de detecção inerente às metodologias os antígenos usados são de natureza

diferente. Na RIFI, são empregados parasitos íntegros, consequentemente há

exposição de antígenos de superfície para reconhecimento pelos anticorpos das

amostras testes. No ELISA, em geral e também no nosso caso, se utilizam extratos

solúveis oriundo de rompimento dos parasitos por ultrassom contendo antígenos

citoplasmáticos (Williams et al., 1986).

As amostras do subgrupo com reativação de lesões (subgrupo IRT)

apresentaram elevados valores de DO cuja mediana da UA (2,739) diferiram

significativamente daquelas do subgrupo ICT (1,840). Aumento da intensidade de

67

reação após o tratamento também foi detectado neste subgrupo diferindo do anterior

pelo fato que, após uma redução dos valores de UA, a intensidade das reações volta

a aumentar por ocasião da reativação, iniciando um novo declínio após o re-

tratamento. Portanto, este grupo de pacientes apresentou um perfil de reatividade

característico no ELISA: positividade no diagnóstico, elevação da reatividade logo

após a terapia específica seguida por leve redução, e nova elevação acima dos

níveis alcançados no momento da recidiva.

A análise do subgrupo IRT1, (antes da primeira reativação) também

demonstra que o percentual de soros com reatividade superior a duas vezes o “cut-

off” (UA>2) tende a permanecer elevado até um ano quando quase todos os

pacientes já reativaram. Apesar do pequeno número de amostras analisadas aos 6

meses após o primeiro tratamento, a proporção de soros com UA>2 é

significativamente maior neste subgrupo (77,8) que no ICT (35,7). Portanto, apesar

das diferenças individuais o comportamento dos subgrupos ICT e IRT difere na

intensidade da reação e na tendência observada ao longo do acompanhamento a

partir de seis meses. Por outro lado, a chance de recidivas significativamente mais

elevada em pacientes com UA>2 que aqueles com UA<2 aumenta à medida que

ocorrem em períodos mais distante do final do tratamento. Estes resultados são

compatíveis com as observações, já discutidas anteriormente, de redução de

parasitos após a cura clínica e eventual retorno de multiplicação por ocasião de

recidivas.

Devido a diversidade de resposta humoral nos pacientes com LTA , que inclui

pobre resposta de anticorpos específicos em muitos pacientes, o “cut-off” , como

calculado neste estudo, atende às necessidades do diagnóstico. No entanto, para

monitoramento pós-tratamento, este critério poderia ser substituído adotando-se

68

UA>2 a partir do terceiro ou sexto mês como cut-off para ser usado no controle pós-

tratamento dos pacientes de LTA do Rio de Janeiro.

Nos pacientes com LCM o perfil observado durante o acompanhamento foi

semelhante ao do conjunto de resultados discutidos anteriormente. Apesar do

pequeno número de amostras de pacientes com LCM, se observou frequência de

reativação semelhante ao descrito (4/10) para o conjunto dos casos. As intensidades

de reações no momento diagnóstico foram semelhantes para os que curaram e os

que recidivaram. Com um ano de acompanhamento, os pacientes com LCM do

subgrupo ICT apresentaram mediana de UA de 2,633 enquanto que a mediana do

subgrupo IRT foi 4,491 na reativação (entre seis meses e um ano), apesar da

ausência de significância estatística.

Estes resultados estão de acordo com os obtidos por vários investigadores,

alguns desde a década de 60, que identificaram um percentual de pacientes nos

quais detectaram anticorpos circulantes após a terapia e cicatrização das lesões

(Bittencourt et al., 1968; Souza et al., 1982; Mendonca et al., 1986). O risco de

recidiva nestas circunstâncias foi apontado por todos os autores como elevado

devido à possível persistência do parasito mesmo após a cura clínica. Reforçando

estas hipóteses, em pesquisas mais recentes, (Schubach et al., 1998 & 2001)

encontraram amastigotas viáveis em cicatrizes de pacientes 11 anos após terapia e

cura, além de DNA e antígenos parasitários. Porém, não se encontrou reatividade na

RIFI nestes pacientes. Amato et al., (2003) também identificaram, por

imunohistoquímica antígenos de Leishmania em 40% de pacientes seis meses após

tratamento em estudo para caracterização de resposta inflamatória local de

pacientes com LCM antes e após tratamento. Apesar de observarem variações no

69

número de células relacionadas à patogenia das lesões, a frequência de células B

permaneceu inalterada após seis meses de tratamento e aparente cura das lesões.

Em conjunto, os resultados demonstram uma tendência à redução dos níveis

de IgG séricas específicas em pacientes com cura clínica mantida. Contrariamente,

a manutenção ou elevação de anticorpos específicos podem estar associadas a

reativação.

Sugere-se que, no Rio de Janeiro, o ELISA seja utilizado tanto para o

diagnóstico de LTA, quanto para o controle pós-tratamento de suas modalidades

cutânea e mucosa.

70

7 CONCLUSÕES

Os resultados de avaliação do ELISA e do acompanhamento sorológico para

detecção de IgG nas condições do estudo permitem concluir:

Os parâmetros de acurácia, e a confiabilidade do ELISA para detecção de

IgG específica demonstram um bom desempenho do teste para o

diagnóstico da LTA.

A baixa reatividade cruzada com soros de indivíduos com esporotricose ou

com outras doenças dermatológicas confirmam a possibilidade do uso do

ELISA para o diagnóstico diferencial da LTA no Rio de Janeiro.

A sensibilidade do ELISA não diferiu da encontrada para a IDRM e a PCR e

foi superior à de cada uma das técnicas parasitológicas, exame direto,

histopatologia e isolamento em meio de cultura.

A associação do ELISA com IDRM em série resultou em ganhos na

especificidade do diagnóstico imunológico com pouca perda na

sensibilidade.

A frequência de resultados positivos e os níveis de IgG encontrados em

amostras de pacientes com LTA que não apresentaram reativação de

lesões, tendeu a decrescer ao longo do tempo de acompanhamento.

Os níveis séricos de IgG anti-Leishmania foram significativamente mais

elevados no momento de reativação (subgrupo IRT).

Com base nos itens anteriores, pode-se concluir que o ELISA se constitui

em ferramenta apropriada para monitorar a cura clínica ou recidiva pós-

71

tratamento de pacientes com LTA ressaltando-se as chances mais elevadas

de recidivas em pacientes cujos resultados apresentem UA maior que dois

quando se utiliza este protocolo.

72

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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85

ANEXO I - APROVAÇÃO NO CEP/IPEC

86

87

ANEXO II - PROTOCOLO DE ATENDIMENTO CLÍNICO

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas - Fiocruz Centro de Referência Nacional em LTA - Fiocruz/Funasa

Rotina para o Atendimento de Pacientes

Critério clínico para encaminhamento de pacientes para o Centro de Referência

Paciente proveniente de área endêmica ou suspeita; apresentando lesão cutânea

ulcerosa ou tuberosa, única ou múltipla, com evolução superior a 30 dias; com ou sem

adenopatia associada e reação de Montenegro positiva (superior a 5 mm de

enduração).

Outros pacientes provenientes de área endêmica, porém, de difícil diagnóstico:

apresentando lesões sugestivas e reação de Montenegro negativa; adenomegalia

localizada sem lesão cutânea; má resposta ou recidiva após um primeiro tratamento

para LTA.

Rotina para Diagnóstico Clínico-Laboratorial (pré-tratamento)

Avaliação clínica e dermatológica: Exame clínico geral e exame dermatológico com

descrição e documentação fotográfica das lesões.

Avaliação otorrinolaringológica: Realizada com fibra ótica, para descrição e

documentação fotográfica das lesões.

Sangue:

Sorologias para LTA, VDRL, Paracoccidioidomicose, histoplasmose, eletroforese de

hemoglobina (úlceras de perna)

Hemograma

Bioquímica: glicose, uréia, creatinina, TGO, TGP, fosfatase alcalina, gama GT,

amilase, lipase

Coagulograma (pacientes com indicação de biópsia mucosa)

Eletrocardiograma (ECG)

88

Reações intradérmicas: PPD e Montenegro (nos casos negativos inicialmente)

Aspirado do bordo da lesão cutânea e / ou de gânglio periférico:

Direto no tubo à vácuo (cultura para Leishmania)

Após injeção de 0,1 ml de salina estéril (com antibiótico) 0,9% no tubo à vácuo

(cultura para Leishmania)

Biópsia cutânea e/ou mucosa e / ou de gânglio periférico:

Formol (histopatologia)

Solução salina estéril (cultura para fungos e micobactéria)

Solução salina estéril com antibiótico (cultura para Leishmania)

Imprint em lâmina de vidro

Congelação a –70 oC (imunopatologia)

Radiografia do tórax e dos seios da face (rotina apenas nos casos mucosos)

Outros exames: direcionados pela história e/ou exame clínico

Tratamento Padrão

Medidas Gerais:

Tratamentos para outras doenças concomitantes como hipertensão arterial, diabetes

etc. deverão, preferencialmente, ser iniciados antes ou durante a investigação

diagnóstica, a fim de iniciarmos o tratamento específico com o paciente o mais

compensado possível.

A infecção secundária deverá ser tratada com cuidados locais (água, sabão de coco e

anti-sépticos) e, se necessário, antibióticos orais, pelo menos, na semana que

anteceder à biópsia de pele, a fim de diminuir a contaminação bacteriana das culturas

para Leishmania.

No caso da presença de crostas e obstrução nasal, as cavidades nasais deverão ser

instiladas com solução fisiológica de cloreto de sódio 0,9% por várias vezes ao dia

durante todo o período do acompanhamento, a fim de possibilitar uma boa

visualização das mucosas das cavidades nasais, assim como o alívio sintomático do

paciente.

89

Nos casos de lesões abaixo dos joelhos, o repouso com os membros inferiores

elevados durante o maior tempo possível, é um excelente método terapêutico auxiliar.

Medidas específicas:

Em princípio, todos os pacientes deverão ser tratados, ambulatorialmente, com

antimoniato de N-metil-glucamina (Glucantime) na dosagem de 5 mg Sb5+/kg/dia1 IM.

A administração EV, quando indicada para diminuir o desconforto local, deverá ser

realizada, de preferência, em ambiente hospitalar. Pacientes idosos ou apresentando

outras complicações clínicas, poderão ser tratados em regime de internação ou de

hospital-dia.

O antimoniato de N-metil-glucamina (antimoniato de meglumina) é apresentado em

ampolas de 5ml contendo 1,5g de N-metil-glucamina, equivalente a 405mg de Sb5+.

Portanto, 5ml correspondem a 405mg de Sb5+ e cada ml a 81mg de Sb5+.

Os pacientes com a forma cutânea serão tratados inicialmente durante 30 dias. Caso

seja indicado, o tratamento poderá ser prorrogado, na mesma dosagem, por mais 10

a 30 dias consecutivos (ver acompanhamento clínico).

Os pacientes com a forma mucosa serão tratados por um mínimo de 30 dias, porém

o tratamento será continuado, preferencialmente sem interrupção, até a epitelização

e/ou desinfiltração das mucosas.

Pacientes com lesões na laringe ou com extensas lesões nas vias aéreas e

digestivas superiores deverão ser internados a fim de prevenir a instalação de um

quadro de insuficiência respiratória por edema local, mais provável de ocorrer na

primeiras 72 horas após início do tratamento. A profilaxia com corticosteróides deverá

ser iniciada antes da primeira dose do tratamento específico. Utiliza-se hidrocortisona

100mg EV 6/6h durante um mínimo de 24 horas e descontinuada durante os próximos

dois dias,

Pacientes que necessitem interromper temporariamente o tratamento por toxicidade,

ao recomeçar, deverão dar seqüência ao tratamento a partir da última dose

administrada, como se não tivesse havido qualquer interrupção.

1 Exemplo de cálculo de dose para um paciente de 60 kg: 5 mg Sb5+/kg/dia = 300 mg Sb5+/dia = 3,7 ml/dia, arredondando, = 3,5 ml/dia EV ou IM. 20 mg Sb5+/kg/dia = 1200 mg Sb5+/dia = 14,8 ml/dia, arredondando, = 15 ml/dia EV ou IM.

90

Os casos de lesões recidivantes e as possíveis evoluções para forma mucosa (ver

acompanhamento clínico), deverão ser retratadas, inicialmente, com a mesma

dosagem e pelo mesmo período que os pacientes virgens de tratamento, porém se

possível, em regime de internação ou hospital-dia.

Em caso de insucesso no segundo tratamento, avaliar a possibilidade de utilização

da dose de 20mg Sb5+/kg/dia ou de outra droga como a anfotericina B ou a

pentamidina.

A anfotericina B deverá ser diluída em solução de glicose 5% a uma concentração de

0,1mg/ml (não utilizar soluções contendo eletrólitos). A administração deve ser diária

ou em dias alternados, por um período de 1 a 4 horas de infusão endovenosa. A dose

inicial é de 0,3-0,5mg/Kg/dia aumentando-se progressivamente até 1mg/Kg/dia, até

alcançar a dose máxima diária de 50mg. As doses totais recomendadas são de 1 a

1,5g para LC e, de 2,5 a 3g para LM.1-6

A Pentamidina pode ser encontrada sob a formulação de mesilato e de isotionato, em

frascos/ampolas contendo 300mg. A formulação de isotionato costuma ser melhor

tolerada.7-10 A droga deve ser administrada após a alimentação devido a sua ação

hipoglicemiante. A dose habitual é de 2-4mg/Kg, IM, em dias alternados durante 5 a

25 semanas, ou por período mais prolongado se necessário.11-13 O Ministério da

Saúde recomenda que a dose total não ultrapasse 2g.1 e alguns autores têm utilizado

esquemas curtos com sucesso 14

Pacientes com uma ou duas lesões cutâneas, que por qualquer motivo apresentem

impossibilidade de receber medicação parenteral regular ou que apresentem sinais de

toxicidade importante à medicação sistêmica, poderão ser submetidos a tratamento

intralesional com N-metil-glucamina.

Rotina de acompanhamento

Exames laboratoriais para monitorização da toxicidade:

Hemograma, glicose, uréia, creatinina, TGO, TGP, fosfatase alcalina, gama GT,

amilase, lipase e ECG deverão ser realizados durante o tratamento a cada 7, 10 ou

15 dias; imediatamente após o tratamento; e depois, apenas os exames alterados, até

a sua normalização. Em casos de alterações persistentes ou rapidamente

progressivas, recomenda-se a suspensão temporária do tratamento até a

normalização dos exames.

91

Para Anfotericina B acrescentar dosagens de Na e K e utilizar intervalos de uma

semana ou menos.

Ao utilizar-se a Pentamidina, a glicemia deve ser acompanhada mensalmente

durante 6 meses sempre que a dose total ultapassar 1g.

Sorologias para LTA: Deverão ser realizadas em todas as consultas de retorno.

Quando as consultas forem realizadas em outros locais, o sangue deverá ser

centrifugado e o soro poderá ser transportado imediatamente em isopor com gelo ou

estocado congelado (preferencialmente a –20oC) e posteriormente transportado em

isopor com gelo para o laboratório.

Sorologia anti-HIV: Deverá ser solicitada nos casos de evolução aberrante (lesões

fora do padrão clínico usual, apresentando exuberância parasitária, teste de

Montenegro não reator etc.) e má resposta terapêutica.

Acompanhamento clínico

Casos cutâneos

Avaliação clínica e dermatológica:

Devem ser repetidas a cada 15, 10 ou 7 dias durante o tratamento, de acordo com as

condições clínicas do paciente, e no 30o dia.

Ao término do tratamento espera-se que as lesões estejam com pouquíssima

infiltração (não endurecidas à palpação) e epitelizadas (recoberta por uma "pele fina"),

embora mantenham algum eritema (cicatriz rósea).

Nos casos em que não ocorra epitelização das lesões (geralmente úlceras localizadas

abaixo dos joelhos), manter sem tratamento (apenas cuidados locais) e reavaliar

quinzenalmente. Caso não ocorra uma tendência progressiva para a epitelização,

reavaliar o diagnóstico (principalmente nos casos sem comprovação parasitológica)

e/ou a necessidade de repetir o tratamento.

A partir da constatação da epitelização das lesões, os pacientes deverão ser

reavaliados após 1, 3, 6, 12 meses e então anualmente, pelo mínimo de 5 anos.

Avaliação otorrinolaringológica

Nos pacientes sem lesão mucosa anterior ao tratamento, devem ser realizadas, no

mínimo, com 6 e 12 meses e então anualmente, por um mínimo de 5 anos.

92

Casos mucosos

Avaliação clínica:

Devem ser repetidas a cada 15, 10 ou 7 dias durante o tratamento, de acordo com as

condições clínicas do paciente, e no 30o dia. Caso haja indicação de prorrogação do

tratamento as reavaliações devem seguir com a periodicidade necessária.

Avaliação otorrinolaringológica:

Após o 30o dia de tratamento deverão ser a cada 15, 10 ou 7 dias de prorrogação do

tratamento, de acordo com as condições clínicas do paciente.

A partir da constatação da epitelização das lesões, os pacientes deverão ser

reavaliados após 1, 3, 6, 12 meses e então anualmente, por um mínimo de 5 anos.

Recidivas de lesões e/ou evolução de um caso de forma cutânea para a forma

mucosa

Pacientes com lesões recidivantes, deverão reiniciar a investigação diagnóstica

(principalmente aqueles sem comprovação parasitológica) e/ou repetir o tratamento,

de preferência em regime de internação ou hospital-dia.

Pacientes que evoluírem da forma cutânea para a forma mucosa, necessariamente

deverão seguir a rotina de investigação inicial para pacientes mucosos.

Em ambos os casos, atentar para a possibilidade para a co-infecção pelo HIV ou

outras doenças associadas de natureza infecciosa ou degenerativa.

93

Calendário para pacientes tratados em outras unidades de saúde

Pacientes de Forma Cutânea

MOMENTO FREQÜÊNCIA LOCAL

Confirmação do diagnóstico: Centro de Referência

Durante o tratamento: a cada 15, 10 ou 7 dias Unidade de origem Imediatamente após o tratamento:

no 30o dia Unidade de origem

Caso persista lesão não epitelizada:

quinzenalmente até a constatação da epitelização (dentro de mais 2 meses)

Unidade de origem

caso persista a lesão aberta ou

caso ocorra piora nesse período Centro de Referência

Primeiro ano após o tratamento:

2 e 4 meses Unidade de origem

1, 6 e 12 meses Centro de Referência

Anos subseqüentes: anualmente durante no mínimo 5

anos Centro de Referência

Pacientes de Forma Mucosa

MOMENTO FREQÜÊNCIA LOCAL Confirmação do diagnóstico: Centro de

Referência Durante o tratamento: a cada 15, 10 ou 7 dias Unidade de origem Imediatamente após o tratamento:

no 30o dia Centro de Referência

Caso necessite prorrogar o tratamento:

a cada 7 ou 10 dias para acompanhamento clínico geral

Unidade de origem

a cada 10 ou 15 dias até a

constatação da cura clínica Centro de Referência

Primeiro ano após o tratamento:

1, 3, 6 e 12 meses Centro de Referência

Anos subseqüentes: anualmente durante no mínimo 5

anos Centro de Referência

94

Anexo II (do projeto rotina) Ficha Projeto Rotina Projeto: Estudo para a sistematização do atendimento de pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana no Centro de Referência em LTA - Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas - Fiocruz Início: CTC: 09/08/02 CEP/IPEC: protocolo 0016.0.009-02 aprovado em 04/11/02 Término previsto: indeterminado Coordenador: Armando de Oliveira Schubach. Fonte de Financiamento: Recursos orçamentários da Fiocruz e Convênio Fiocruz/SVS-MS (Centro de Referência Nacional LTA) Valor: R$: 273.680,00 Linha de pesquisa: Diagnostico e terapêutica das leishmanioses Area temática: Doença relacionada: Leishmaniose Tegumentar Americana Aplicações potenciais: Este é o projeto base para todos os demais projetos do CRNLTA envolvendo diagnóstico e tratamento de pacientes, uma vez que sistematiza o atendimento de rotina Laboratório envolvido/Unidade: Centro de Referência Nacional em LTA

Equipe:

Armando de Oliveira Schubach, Médico infectologista e dermatologista, Doutor – Coordenador;

Mauro Célio de Almeida Marzochi, Médico, Biólogo, Livre Docente, Parasitologista

Keyla B. Feldman Marzochi, Médico infectologista, Doutor – ex-Diretora IPEC;

Aline Fagundes da Silva, Bióloga, Mestre, Doutoranda - IPEC;

Ana Cristina Martins, Médico Otorrinolaringologista, Doutoranda – IPEC;

Cibele Baptista, Médico Veterinário, Mestre – IPEC;

Cláudia Maria Valete Rosalino, Médico Otorrinolaringologista, Doutora – IPEC;

Eliame Mouta Confort, Farmacêutica, Doutoranda -IPEC-FIOCRUZ;

Ginelza Peres Lima dos Santos, Bióloga, Doutora – ENSP;

João Soares Moreira, Médico Otorrinolaringologista, Doutorando – IPEC;

Maria de Fátima Madeira, Bióloga, Parasitologista, Doutora – ENSP;

Mariza Matos Salgueiro, Médica Estagiária;

Tânia Maria Pacheco Schubach, Médico Veterinário, Doutor – IPEC;

Tullia Cuzzi, Médico Patologista, Doutor – IPEC;

95

ANEXO III – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

INSTITUIÇÃO: INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS – FIOCRUZ COORDENADOR DA PESQUISA: ARMANDO DE OLIVEIRA SCHUBACH ENDEREÇO: Av. Brasil 4365 - Manguinhos - Rio de Janeiro - RJ - CEP 21045-900 TELEFONES (0xx21) 3865-9541 / 3865-9525 / 3865-9536 / FAX (0xx21) 3865-9541

NOME DO PROJETO DE PESQUISA: ESTUDO PARA A SISTEMATIZAÇÃO DO

ATENDIMENTO DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR

AMERICANA NO CENTRO DE REFERÊNCIA EM LTA - INSTITUTO DE PESQUISA

CLÍNICA EVANDRO CHAGAS - FIOCRUZ

NOME DO VOLUNTÁRIO: ____________________________________________

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença que atinge seres

humanos e animais, incluindo o cão, causada por parasitos chamados Leishmanias. A

doença é transmitida pelo "mosquito palha", que vive em regiões de mata, plantações

de banana, manga etc. localizadas próximas às moradias humanas, onde costuma

entrar para se alimentar de sangue de pessoas e animais domésticos. A LTA se

apresenta como feridas na pele de difícil cicatrização. Algumas vezes, a LTA pode se

tornar mais grave, envolvendo as mucosas de revestimento interno do nariz e da

garganta, mesmo vários anos após a cicatrização da ferida na pele. Atualmente, não

temos como saber qual paciente adoecerá de novo e qual permanecerá curado

definitivamente.

Outras doenças como infecções por bactérias, tuberculose, sífilis, esporotricose,

outras micoses, tumores etc. podem se manifestar de forma parecida com a

leishmaniose e precisam ser diferenciadas para que se possa iniciar o tratamento

correto. Entretanto, com os exames existentes atualmente, nem sempre se consegue

ter certeza absoluta sobre qual a doença em questão.

96

No momento, várias perguntas precisam ser respondidas como: de que outras

maneiras a LTA pode se manifestar? como se comportam os exames de laboratório

antes, durante e após o tratamento? quais pacientes, mesmo após o tratamento, irão

reabrir suas cicatrizes ou irão desenvolver doença dentro do nariz ou na garganta?

que outras doenças parecidas estão sendo confundidas com a LTA e quais exames

devem ser utilizados para esclarecimento? qual o papel dos seres humanos como

reservatórios da doença? quais as melhores formas de tratamento? que medidas

devem ser tomadas para controlar o problema?

Pelo presente documento, você está sendo convidado(a) a participar de uma

investigação clínica a ser realizada no IPEC-Fiocruz, com os seguintes objetivos:

Descrever aspectos da LTA: manifestações clínicas e exames de laboratório,

tentando estabelecer padrões de apresentação da doença e seu modo de evolução,

comparando com outras doenças.

Avaliar o uso dos antimoniais e outras drogas utilizadas no tratamento da LTA

levando em consideração o tempo de tratamento, toxicidade, facilidade de

administração, custo e ausência de envolvimento das mucosas do nariz e da

garganta.

Isolar, identificar e comparar as leishmanias causadoras da LTA provenientes de

diversas localidades.

Este documento procura esclarecê-lo sobre o problema de saúde em estudo e sobre

a pesquisa que será realizada, prestando informações, detalhando os procedimentos

e exames, benefícios, inconvenientes e riscos potenciais.

A sua participação neste estudo é voluntária. Você poderá recusar-se a participar de

uma ou todas as etapas da pesquisa ou, mesmo, se retirar dela a qualquer momento,

sem que este fato lhe venha causar qualquer constrangimento ou penalidade por

parte da Instituição. O seu atendimento médico não será prejudicado caso você

decida não participar ou caso decida sair do estudo já iniciado. Os seus médicos

poderão também interromper a sua participação a qualquer momento, se julgarem

conveniente para a sua saúde.

A sua participação com relação ao Projeto consiste em autorizar a realização de uma

série de exames para o diagnóstico da sua doença, e que parte deste material, assim

como os resultados destes exames de rotina, sejam utilizados neste estudo. Também

será necessária a sua autorização: 1) para a utilização de documentação fotográfica

97

ou filmagem de suas lesões para estudo 2) para que parte do material coletado

periodicamente para a realização de exames para acompanhamento da evolução da

sua doença, assim como os resultados destes exames de rotina e do seu tratamento

sejam utilizados neste estudo 3) para que parte das amostras coletadas seja estocada

a fim de servir para outros estudos que tenham como finalidade a melhor

compreensão da doença, o desenvolvimento e avaliação de novos métodos

diagnósticos; avaliação da resposta ao tratamento etc., desde que tal estudo seja

previamente analisado e autorizado por um Comitê de Ética em Pesquisa.

Os exames e procedimentos aplicados lhe serão gratuitos. Você receberá todos os

cuidados médicos adequados para a sua doença.

Participando deste estudo você terá algumas responsabilidades: seguir rigorosamente

as instruções do seu médico; comparecer à unidade de saúde nas datas marcadas;

relatar a seu médico todas as reações que você apresentar durante o tratamento,

tanto positivas quanto negativas.

Caso você necessite de atendimento médico, durante o período em que estiver

participando do estudo, procure o Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas -

Fiocruz, mesmo fora do seu agendamento. Em caso de necessidade ligue para o Dr.

Armando de Oliveira Schubach, Dra. Fátima Conceição-Silva ou Dra. Mariza

Salgueiro nos telefones acima. Caso você apresente qualquer quadro clínico que

necessite de internação, a equipe médica providenciará seu leito no Instituto de

Pesquisa Clínica Evandro Chagas - Fiocruz. Seus animais com suspeita de LTA

poderão ser atendidos gratuitamente pela médica veterinária Dra. Tânia Maria

Pacheco Schubach no Serviço de Zoonoses do IPEC.

Sua identidade será mantida como informação confidencial. Os resultados do estudo

poderão ser publicados sem revelar a sua identidade e suas imagens poderão ser

divulgadas desde que você não possa ser reconhecido. Entretanto, se necessário, os

seus registros médicos estarão disponíveis para consulta para a equipe envolvida no

estudo, para o Comitê de Ética em Pesquisa, para as Autoridades Sanitárias e para

você.

Você pode e deve fazer todas as perguntas que julgar necessárias antes de

concordar em participar do estudo, assim como a qualquer momento durante o

tratamento. O seu médico deverá oferecer todas as informações necessárias

relacionadas à sua saúde, aos seus direitos, e a eventuais riscos e benefícios

relacionados à sua participação neste estudo.

98

Procedimentos, exames e testes que serão utilizados:

Antes do tratamento haverá coleta de informações sobre a doença; exame médico

geral e exame da pele com descrição e documentação fotográfica ou filmagem das

lesões; exame interno do nariz e da garganta com um aparelho chamado fibra ótica,

que permite ver lesões pequenas ou em locais de difícil acesso, para descrição e

documentação fotográfica ou filmagem das lesões (se necessário será aplicado

"spray" anestésico local). Retirada, com anestesia local, de um pequeno fragmento da

lesão de pele, de mucosa ou de "íngua" para realização de exames tanto para

diagnóstico (aspecto microscópico do tecido doente e culturas para tentativa de

isolamento de possíveis agentes de doença como fungos, bactérias e leishmanias)

quanto para pesquisa (identificação de células e outros componentes da resposta

inflamatória, assim como novos métodos de identificação dos possíveis agentes da

doença). Outros materiais também poderão ser coletados na tentativa de isolamento

do agente causador da doença: aspiração com seringa e agulha do bordo da lesão e

de secreções em lesões de pele fechadas.

Outros exames também serão realizados para diagnosticar outras doenças possíveis

de serem confundidas com a LTA, para classificar a gravidade da doença e avaliar os

efeitos dos medicamentos a serem utilizados durante o seu tratamento: um a quatro

testes cutâneos (injeção da décima parte de um mililitro de um reativo para

determinada doença na pele da região anterior do antebraço, a qual deverá ser

revista entre 2 a 3 dias após a injeção); exames de sangue (quantidade equivalente a

aproximadamente três colheres de sopa), exame de saliva (coletada com um tipo de

cotonete), radiografia dos pulmões e da face (se necessário complementada por

tomografia computadorizada); e eletrocardiograma.

O tratamento da LTA em pacientes humanos costuma ser com o medicamento

glucantime por via intramuscular (IM), intravenosa (IV) uma injeção ao dia,

geralmente, durante um período de 30 dias contínuos ou com intervalos de descanso.

Excepcionalmente, para idosos, pacientes com doenças graves ou que não tolerem o

tratamento normal, poderá ser utilizada a via intralesional (IL). O tempo do tratamento

poderá ser diminuído ou aumentado conforme a necessidade. Outras opções de

tratamento são a anfotericina B (IV) e a pentamidina (IM), ambas injetáveis e

necessitando medidas de acompanhamento parecidas com as do glucantime.

Após o início do tratamento, você deverá comparecer a aproximadamente três

consultas dentro de 10, 20 e 30 dias. Caso as lesões não cicatrizem totalmente, o

99

tratamento poderá ser continuado pelo período de tempo necessário. Ao se atingir a

cura clínica, você deverá retornar para consulta de reavaliação em 1, 3, 6, 9 e 12

meses após o término do tratamento. E, a partir de então, pelo menos uma vez por

ano durante um prazo indefinido (no mínimo 5 anos).

A cada retorno deverão ser realizados avaliação médica e exames de sangue (na

quantidade aproximada de uma ou duas colheres de sopa) para avaliar os efeitos dos

medicamentos utilizados no seu tratamento e/ou para avaliar a evolução da doença.

Outros exames, como o eletrocardiograma durante o tratamento, poderão ser

realizados quando indicados.

Inconvenientes e riscos principais conhecidos até os dias atuais:

A coleta de sangue poderá causar alguma dor no momento da punção venosa e,

eventualmente, poderá haver a formação de uma área arroxeada no local, que voltará

ao normal dentro de alguns dias.

Ocasionalmente, os testes na pele poderão, apresentar uma reação forte com

inflamação do local, formação de bolhas e, mais raramente, formação de ferida. Todo

o processo costuma regredir dentro de alguns dias a poucas semanas.

Tanto os testes na pele quanto o anestésico injetado no momento da biópsia (retirada

de um pequeno fragmento de pele para exame) poderão causar alergia, geralmente

limitada ao aparecimento de áreas vermelhas, empoladas e com coceira na pele e

que respondem bem a medicamentos anti-alérgicos. Mais raramente poderá haver

uma reação mais severa com dificuldade de respirar e necessidade de cuidados mais

intensos, existentes no IPEC.

No local da biópsia poderá ocorrer inflamação e dor, acompanhados ou não de

infecção por bactérias. Caso isso ocorra, poderá ser necessário o uso de

medicamentos para dor e antibióticos.

O medicamentos glucantime e pentamidina costumam causar efeitos indesejáveis,

não devem ser utilizados na gravidez e seu uso em mulheres em idade reprodutiva

deve ser acompanhado de uso de método anticoncepcional eficaz como preservativo

de látex masculino ou feminino ("camisinha"), diafragma feminino ou anticoncepcional

oral ("pílula"). Quando o tratamento não puder ser adiado, a anfotericina B poderá ser

utilizada na gravidez. Os exames com raios-x também não devem ser realizados em

grávidas.

Formas de ressarcimento:

100

Sempre que necessário, nos dias de seu atendimento, poderá ser fornecida

alimentação conforme rotina do Serviço de Nutrição e Serviço social do IPEC para

pacientes externos.

Benefícios esperados:

Espera-se que, ao final do tratamento, você esteja curado da LTA, embora as

consultas de retorno por vários anos após o tratamento sejam necessárias para a

confirmação da cura. Os resultados deste estudo poderão ou não beneficiá-lo

diretamente, mas no futuro, poderão beneficiar outras pessoas, pois espera-se

também que este estudo contribua para que o diagnóstico e acompanhamento do

tratamento de pacientes com LTA possa ser feito de forma mais eficaz e segura.

Caso a sua investigação demonstre outro diagnóstico diferente de LTA, você será

devidamente orientado a buscar o tratamento mais adequado para o seu caso.

Declaro que li e entendi todas as informações referentes a este estudo e que todas as

minhas perguntas foram adequadamente respondidas pela equipe médica, a qual

estará à disposição para responder minhas perguntas sempre que eu tiver dúvidas.

Recebi uma cópia deste termo de consentimento e pelo presente consinto,

voluntariamente, em participar deste estudo de pesquisa.

_________________________________________________ ___________

Nome paciente: Data

_________________________________________________ ___________

Nome médico: Data

_________________________________________________ ___________

Nome testemunha2: Data

_________________________________________________ ___________

2 Apenas no caso de pacientes impossibilitados de manifestar o seu consentimento por escrito. No caso de menores de 18 anos, deverá ser assinado pelo pai, mãe ou responsável legal.

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ANEXO IV - TERMO DE COMPROMISSO E RESPONSABILIDADE

Eu, Eliame Mouta Confort, responsável pelo projeto de pesquisa intitulado

“Avaliação dos ensaio imunoenzimático, ELISA (IgG e subclasses específicas) e da

identificação e caracterização de antígenos de Leishmania (Viannia) braziliensis,

reconhecidos por subclasses IgG, no diagnóstico e acompanhamento de pacientes

com Leishmaniose Tegumentar Americana”, comprometo manter a confidencialidade

assim como a privacidade dos participantes do projeto cv.

A identidade dos participantes, assim como os resultados obtidos com este

projeto, serão mantidos em um banco de dados sob a minha responsabilidade.

Os resultados obtidos com esta pesquisa serão divulgados em comunicações

científicas mantendo o anonimato dos participantes e o material utilizado não será

empregado em outras pesquisas, a não ser quando abertos novos protocolos.

Rio de Janeiro,

__________________________________