obtenÇÃo de intermediÁrios quirais utilizando lipases em...

OBTENÇÃO DE INTERMEDIÁRIOS QUIRAIS UTILIZANDO LIPASES EM

REATORES ASSISTIDOS POR MEMBRANAS

Antônio Carlos de Oliveira Machado

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Engenharia Química, COPPE,

da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

parte dos requisitos necessários à obtenção do

título de Doutor em Engenharia Química.

Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire

Cristiano Piacsek Borges

Rio de Janeiro

Dezembro de 2011




TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO INSTITUTO ALBERTO LUIZ

COIMBRA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA DE ENGENHARIA (COPPE) DA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS

REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM

CIÊNCIAS EM ENGENHARIA QUÍMICA.

Examinada por:

________________________________________________

Prof. Denise Maria Guimarães Freire, D. Sc.

________________________________________________

Prof. Cristiano Piacsek Borges, D.Sc.

________________________________________________

Prof. Alessandro Bolis Costa Simas, D.Sc.

________________________________________________

Prof. Helen Conceição Ferraz, D.Sc.

________________________________________________

Prof. Reginaldo Ramos de Menezes, D.Sc.

________________________________________________

Prof. Maria da Graça do Nascimento, D.Sc.

RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL

DEZEMBRO DE 2011

iii

Machado, Antônio Carlos de Oliveira

Obtenção de intermediários quirais utilizando lipases

em reatores assistidos por membranas/ Antônio Carlos de

Oliveira Machado - Rio de Janeiro COPPE/UFRJ [2011].

XXIV, 165 p.: il.; 29,7 cm.

Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire,


Tese (doutorado) – UFRJ/ COPPE/ Programa de

Engenharia Química, 2011.

Referências Bibliográficas: p. 144-165.

1.Lipases. 2.Imobilização. 3. Contactores de membrana. I.

Freire, Denise Maria Guimarães, et al. II. Universidade

Federal do Rio de Janeiro, COPPE, Programa de Engenharia

Química. III. Título.

iv

Eu dedico este trabalho aos meus amados pais Estela

e Luis (eternamente entre nós), a minha irmã, Sandra,

meus afilhados, meus amigos e a minha avó que me

ajudou imensamente no início de tudo.

v

"As pessoas mais felizes não têm as melhores coisas. Elas sabem fazer o melhor das

oportunidades que aparecem em seus caminhos.”

vi

AGRADECIMENTOS

Ao programa de Engenharia Química da COPPE/UFRJ, pela oportunidade de ter feito

parte do corpo discente desta importante instituição.

A minha querida orientadora Denise Freire, a qual me fez acrediatr que existia uma luz

no fim do túnel. Além disso, agradeço pela indiscutível competência e dedicação na

transmissão de conhecimentos.

Ao meu também orientador Cristiano Borges pela orientação, paciência, competência e

atenção disponibilizada durante este trabalho.

Ao meu Pai Luis Carlos por tudo que fez por mim, principalmente por acreditar no meu

potencial e ter me incentivado, mesmo só no Rio de Janeiro, a seguir sempre em frente

superando todos os obstáculos. Pai dedico a você com muito amor essa Tese e te peço

desculpas por tudo...Sei que você estará comigo sempre.....Nunca te esquecerei....

À minha amada mãe por todo seu carinho e dedicação, desde pequeno, acreditando que

um dia eu chegaria lá. Obrigado por tudo e sempre saiba que se hoje sou alguém na

profissão que escolhi devo tudo a você que, sobretudo me deu a vida. Pode ter certeza

de que sempre estarei aqui sempre que você precisar.

À minha Vó que independente de qualquer coisa apoiou minha mãe na hora em que

mais precisou, e graças a ela tive força de vontade para estudar e crescer na vida.

À minha irmã, que mesmo sendo maluquinha sempre acreditou em mim...Lembra

quando a gente estudava junto, era uma loucura.

À Romi pela ajuda inicial com Bradford.

À Beth por toda sua paciência com as analises de DSC e TGA, além dos ensinamentos

iniciais no preparo de membranas.

vii

À Mariana pelas conversas de corredor e a ajuda no MEV.

À Cristina por todos os favores, que foram muitos. Obrigado por tudo.

Ao Wilson, amigo eterno, pela paciência e todas as ajudas ao longo desta Tese. Dizem

que Deus costuma colocar anjos na vida das pessoas e com certeza você é uma destas

pessoas. Apreendi muito com você.

Ao Alessandro e ao Ângelo pela produção dos substratos utilizados ao longo dos

experimentos.

Ao Roberto “Bob” pela ajuda na montagem do sistema de bancada.

Ao pessoal do LABIM por me aturar. Não vou citar todos porque sempre a gente

esquece de alguém, então prefiro que todos se sintam agradecidos.

As minhas eternas amigas Vanessa e Mariana, que apesar da distância sempre me

procuram.

A todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho

os meus sinceros agradecimentos.

Ao CNPQ pela bolsa de doutorado.

Agradeço em especial a Deus por ter me permitido chegar até aqui superando todas as

dificuldades. Sem sua ajuda nada disso teria sido possível, nem mesmo teria sentido.

Obrigado.

viii

Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários

para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)




Dezembro/2011

Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire


Programa: Engenharia Química

Este trabalho investigou o uso de diferentes lipases em meio orgânico, via

catálise enantiosseletiva para a produção do (R,S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol

((R,S)-IPG), que na forma S pode ser usado como intermediário quiral na produção de

bloqueadores β- adrenalérgicos e inibidores de β- galactosidase. Assim, a partir do éster

octanoato de (R,S)-IPG foram realizadas reações de hidrólise enatiosseletivas alterando-

se: temperatura, pH, concentração de água e diferentes solventes. O acompanhamento

do processo foi baseado nos valores de conversão e excessos enantioméricos (ee), e a

otimização das condições reacionais mostraram que a temperatura e o pH ótimos para o

processo (ee(P) > 99%) foram, respectivamente, 30°C e 7 em acetato de etila (50%)

com a lipase Amano AK. Ensaios de imobilização com lipase AK foram conduzidos

através de adsorção hidrofóbica e ligação covalente tanto em suporte microporoso como

em membranas (comerciais ou “home made”) e devido à elevada perda de atividade

enzimática (60%) após a imobilização, optou-se por utilizar a lipase confinada em

reatores de membrana. Ensaios preliminares de resolução cinética foram conduzidos em

um contactor de membranas planas compostas poli (éterimida) (PEI) recoberta com

filme de PVA) a 30°C com vazões da fase aquosa e da fase orgânica iguais a 5,14 L/h e

6,4 L/h, respectivamente.

ix

Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the

requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)

OBTAINING CHIRAL INTERMEDIATES USING LIPASES IN MEMBRANE

ASSISTED REACTORS


December/2011

Advisors: Denise Maria Guimarães Freire


Department: Chemical Engineering

This study investigated the use of different lipases in organic medium, via

enantioselective catalysis for the production of (R,S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-

methanol ((R,S)-IPG), which in the form S can be used as a chiral intermediate in the

production of β- adrenergic blockers and β-galactosidase inhibitors. Thus, from the

octanoate (R,S)-IPG ester, enantioselective hydrolysis were performed changing

temperature, pH, water and different solvents. The monitoring process was based on the

values of conversion and enantiomeric excess (ee), and the optimization of reaction

conditions showed that the temperature and pH for the process (e(P)> 99%) were

respectively 30°C and 7 in ethyl acetate (50%) with Amano lipase AK. Immobilization

tests were conducted with lipase AK by hydrophobic adsorption and covalent binding

both in microporous support and membranes (commercial or "home made") and saw the

high loss of enzyme activity (60%) after immobilization, the lipase was only confined.

The preliminary tests of kinetic resolution were carried out in a flat composite

membrane contactor (poly-ether-imide (PEI) film coated with PVA) at 30°C and the

flow of the aqueous phase and organic phase were 5,14L/h and 6,4 L / h, respectively.

x

Índice

Página

Capítulo 1: Introdução e Objetivos 1

1.1 Contextualização 1

1.2 Objetivos 4

Capítulo 2: Revisão bibliográfica 5

2.1 Enzimas 5

2.1.1 Lipases 6

2.1.1.1 Características gerais 6

2.1.1.2 Aplicações de lipases 11

2.1.1.3 Aspectos estruturais e mecanismo catalítico das lipases 13

2.1.1.3.1 Resolução de misturas racêmicas 17

2.1.1.3.1.1 Cinética de enantiosseletividade com substratos

enantioméricos 22

2.2 Imobilização de enzimas 24

2.2.1 Aspectos gerais 24

2.2.1.1 Imobilização de lipases por adsorção por interação hidrofóbica 31

2.2.1.1.1 Modelo de Langmuir 40

2.2.1.1.2 Modelo de Langmuir-multicamada 41

2.2.1.1.3 Modelo de Freundlich 41

2.2.1.1.4 Modelo de Langmuir-Freundlich 42

2.2.1.2 Imobilização de lipases via ligação covalente

43

2.3 Reatores multifásicos 46

2.3.1 Contactores de membrana 47

2.3.1.1 Transferência de massa em contactores de membrana 51

2.3.1.1.1 Equações para transferência de massa em contactores de

membranas 52

2.3.2 Aplicações dos contactores de membrana 54

2.3.2.1 Extração líquido-líquido 55

Capítulo 3: Material e Métodos 60

3.1 Material 60

3.2 Métodos 61

xi

3.2.1 Preparo das membranas de Poli(éter imida) (PEI) 61

3.2.2 Preparo de membranas planas por espalhamento simples 62

3.2.3 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 63

3.2.4 Determinação da área específica 64

3.2.4.1 Isoterma de BET 64

3.2.4.2 Picnometria 64

3.2.4.2.1 Volume total do sólido (matriz e poros) 64

3.2.4.2.2 Volume total da matriz 65

3.2.4.2.3 Determinação do raio médio (RMP) dos poros e área

específica 65

3.2.5 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR) 66

3.2.6 Termogravimetria (TG) 66

3.2.7 Imobilização via adsorção hidrofóbica 66

3.2.7.1 Preparo dos suportes 66

3.2.7.2 Imobilização 67

3.2.7.3 Dosagem de atividade hidrolítica por método espectrofotométrico 67

3.2.8. Imobilização via ligação covalente 68

3.2.8.1 Ativação dos suportes com glutaraldeído 68

3.2.8.2 Imobilização 68

3.2.8.2.1 Cálculo dos parâmetros de imobilização 68

3.2.9 Dosagem de proteínas 70

3.2.10 Análise por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 70

3.2.11 Resolução dos derivados do (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol 70

Capítulo 4: Resultados e Discussão 74

4.1 Reações enzimáticas enantiosseletivas 74

4.1.1 Resolução dos ésteres derivados do (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol 74

4.1.1.1 Seleção de enzimas 77

4.1.1.2 Efeito do solvente, temperatura, concentração enzimática e pH na

resolução enantiomérica do octanoato de (R,S)-IPG 80

4.1.1.2.1 Efeito do pH e concentração de água no meio reacional 80

xii

4.1.1.2.2 Efeito da concentração de enzima, solvente orgânico e temperatura 83

4.2 Caracterização dos Suportes 96

4.2.1 Microscopia de Varredura Eletrônica das Membranas de poli (éter-

imida) (PEI) 96

4.2.2 Microscopia de Varredura Eletrônica da membrana comercial de

Nylon 6,6 104

4.2.3 Microscopia de Varredura Eletrônica da membrana comercial de

Polipropileno (PP) 105

4.2.4 Microscopia de Varredura Eletrônica do suporte Accurel 106

4.2.5 Determinação da área específica (ASE) das membranas porosas e

accurel MP 100 utilizados na imobilização de enzimas 107

4.3 Estudo de diferentes suportes no ensaio de imobilização da lipase Amano

AK 109

4.3.1 Polipropileno 109

4.3.2 Membranas de Poli (éterimida) (PEI) 120

4.3.3 Membranas de Nylon 6,6 127

4.4 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR) 130

4.5 Termogravimetria (TG) 134

4.6 Reator enzimático assistido por membranas 135

Capítulo 5: Conclusões e Sugestões para trabalhos futuros 141

5.1 Conclusões 141

5.2 Sugestões para trabalhos futuros 143

Capítulo 6: Bibliografia 144

xiii

Índice de Figuras

Figura 1.1: Enantiômeros da talidomida. 2

Figura 1.2: Estrutura do (R,S)-IPG. 3

Figura 2.1: Mercado mundial de enzimas industriais no período de 2008-2015. 6

Figura 2.2: Reação de hidrólise catalisada por triacilgliceol lipases. 7

Figura 2.3: Reações catalisadas por lipases. 8

Figura 2.4: Representação esquemática do motivo estrutural conservado em

enzimas da família α/β hidrolise. Filamentos em conformação β (1-8) formando

uma estrutura em folha β-pregueada estão indicados pelas setas, estrutura em α-

hélices (A-F) indicadas pelas colunas. As posições relativas dos aminoácidos da

tríade catalítica estão indicadas pelos círculos.

14

Figura 2.5: Superposição dos esqueletos das lipases de Rhizomucor miehei (a) e de

pâncreas humano (b), mostrando a mudança conformacional da tampa na ativação

interfacial. As tampas estão destacadas em verde (fechado) e laranja (aberto).

15

Figura 2.6: Mecanismo cinético (Ping-Pong Bi Bi) de lipase catalisando reações

envolvendo múltiplos substratos e produtos usando a notação de Cleland’s (E:

enzima; Es: éster; Al: álcool; Ac: ácido, W: água, F: acil enzima, i = 1, 2, 3, ..., I; j

= 1, 2, 3, ..., J)

15

Figura 2.7: Mecanismo geral das reações catalisadas por lipases, considerando

também a reação de transesterificação (Tríade catalítica numerada como na lipase

Cal-B, Ser105–His224–Asp187; Primeiro substrato = EtOAc, segundo substrato =

ROH; IT = Intermediário tetraédrico)

16

Figura 2.8: a) Representação das duas porções hidrofóbicas da enzima; b)

Esquematização do encaixe álcool/enzima 20

Figura 2.9: Simetria de hidrólise enzimática e reação de transesterificação de

acordo com Kazlauskas. 20

Figura 2.10: Exemplo de Resolução Cinética Dinâmica de alcoóis. 21

Figura 2.11: Diferentes técnicas de imobilização. 27

Figura 2.12: Interação entre suporte e enzima. 33

Figura 2.13: Imobilização de lipases por adsorção física em suportes hidrofóbicos. 34

xiv

Figura 2.14: Exemplo da formação de base de Schiff utilizando suportes

aminopropilados para imobilização covalente, usando o glutaraldeído como agente

de ativação.

44

Figura 2.15: Seleção de reatores multifásicos. 46

Figura 2.16: (a) Contactor de membrana de fluxo paralelo comercializado pela

CELGARD LLC; (b) Esquema básico de funcionamento de um contactor e (c)

Geração da interface nos poros da membrana.

48

Figura 2.17: Perfil de concentração de um dado soluto para uma membrana

hidrofóbica. Onde: 1: Membrana hidrofóbica, 2: Fase orgânica, 3: Fase aquosa e 4:

Poros da membrana.

51

Figura 2.18: Esterificação do ácido mandélico via contactor de membranas. 56

Figura 2.19: Esquema de separação do ácido mandélico através de resolução

cinética dinâmica. 57

Figura 2.20: Resolução cinética do ibuprofeno éster racêmico via lipase

catalisando a reação de hidrólise, R’ designa um grupo alquil. 57

Figura 2.21: Estruturas químicas do (S)-1-heptil-ibuprofeno éster e (S)-2-etóxietil-

ibuprofeno éster. 58

Figura 2.22: Sistema utilizado para separação de misturas racêmicas com um

contactor de membranas. 58

Figura 3.1: Estruturas poliméricas contidas nas membras, (a) PEI, (b) Nylon 6,6 e

(c) PP. 61

Figura 3.2: Representação esquemática da preparação de membranas planas. 63

Figura 3.3: Reação de hidrólise do acetato de (R,S)-1,2-O- isopropilideno. 71

Figura 3.4: Reação de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno. 71

Figura 3.5: Sistema de transferência de massa da fase orgânica para fase aquosa. 73

Figura 3.6: Sistema de recirculação com contactor de membrana plana. 73

Figura 4.1: X (%) ( ), ee(S) ( ) e ee(P)( ) nas reações de hidrólise do octanoato de

(R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) catalisada por diferentes lipases (50 mg) a 35°C

em acetato de etila em (a) 2 horas e (b) 24h de reação.

78

xv

Figura 4.2: Gel de eletroforese da lipase de Pseudomonas fluorecens,

comercialmente denominada amano AK em diferentes concentrações. Da esquerda

para direita: Padrão de massa molar e soluções com a lipase de interesse.

79

Figura 4.3: Variação de X (%) ( ), ee(S) ( ) e ee(P)( ) em função do pH em

bateladas contendo (a) 16,6% ; (b) 50% e (c) 83,3 % v/v de água, nas reações de

hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM). Todas as reações

foram conduzidas em acetato de etila com 0,9 U de atividade enzimática colocada e

a 30°C.

81

Figura 4.4: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM)

em acetato de etila com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 30°C,

pH = 7 e relação solvente água: 1:1.

84


em tolueno com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 30°C, pH = 7 e

relação solvente água: 1:1.

84


em hexano com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 30°C, pH = 7 e

relação solvente água: 1:1.

85

Figura 4.7: Cromatograma obtido da reação (5 horas) entre a enzima Amano AK

(0,9 U) e o octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno em 3 horas de reação em

acetato de etila a 30°C.

86

Figura 4.8: Variação de ee(P) ( ) e X ( ) em (a) 3 e (b) 24 horas de reação do

octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) com a enzima amano AK (0,9 U)

em diferentes solventes com água (1:1).

87


em acetato de etila com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 10°C,

pH = 7 e relação solvente água: 1:1.

90


em tolueno com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 10°C, pH = 7 e

relação solvente água: 1:1

90


em hexano com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 10°C, pH = 7 e

relação solvente água: 1:1

91

xvi

Figura 4.12: Fotomicrografias da superfície das membranas planas obtidas a partir

da solução PEI/LiNO3/NMP (15/3/82 m/m/m). 97

Figura 4.13: Fotomicrografias das seções transversais das membranas planas

obtidas a partir da solução PEI/LiNO3/NMP (15/3/82 m/m/m). 97

Figura 4.14: Fotomicrografias da (a) superfície e da (b) seção transversal da

membrana plana obtida a partir da solução PEI/LiNO3/NMP (15/5/85 m/m/m). 98

Figura 4.15: Fotomicrografia da (a) superfície e (b) seção transversal da membrana

plana obtida a partir da solução PEI/LiNO3/NMP (15/3/82 m/m/m) em 10 min de

exposição a atmosfera.

99


plana obtida a partir da solução PEI/LiNO3/NMP (15/3/82% m/m) em 20 min de

exposição a atmosfera.

99

Figura 4.17: Fórmula estrutural do aditivo PVP. 100


plana obtida a partir da solução PEI/ PVP-K10/NMP (15/5/80 m/m/m). 101


plana obtida a partir da solução PEI/ PVP-K90/NMP (15/5/80 m/m/m). 101


plana obtida a partir da solução PEI/PVP-K90/NMP (15/3/82 m/m/m) em 10 min

de exposição a atmosfera.

102


plana obtida a partir da solução PEI/PVP-K90/NMP (15/3/82 m/m/m) em 20 min

de exposição a atmosfera.

103


plana obtida a partir da solução PEI/PVP-K90/NMP (15/1,5/1,5/82 m/m/m/m) em

10 min de exposição a atmosfera.

104


plana de nylon 6,6 comercial. 105


plana polipropileno (PP) comercial. 106

Figura 4.25: Fotomicrografias do suporte accurel. 107

Figura 4.26: Cinética de adsorção da lipase Amano AK sobre o accurel a 4°C. 110

(b)

xvii

Figura 4.27: Efeito da variação do pH nos parâmetros de imobilização (( ) E; ( )

Ra e ( ) η) da lipase Amano AK (2,6 U) a 4°C. 111

Figura 4.28: Isotermas de adsorção (A) para os dados experimentais de atividade

(0,679-14 U/mL) (B) para os dados experimentais de proteína (0,027-0,62 mg/mL),

ambas em accurel e a 4°C.

112


(10-100 U/mL) (B) para os dados experimentais de proteína (0,667-5,3 mg/mL),

ambas em accurel e a 4°C.

113

Figura 4.30: Parâmetros de imobilização do biocatalisador obtido pela

imobilização da lipase de Pseudomonas fluorecens (Amano AK), (a) concentração

enzimática até 0,62 mg de proteína e (b) concentração enzimática até 5,3 mg de

proteína, sobre o accurel MP 100.

114



ambas em membrana de polipropileno (PP) a 4°C.

117


imobilização da lipase de Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de PP a 4°C. 117

Figura 4.33: Esquema da rota de imobilização enzimática em membranas de PP

ativadas com NH2. 119



ambas em membrana de PEI contendo 3% de LiNO3 (PN) a 4°C.

121



ambas em membrana de PEI contendo 3% de PVP (PV) a 4°C.

122



ambas em membrana de PEI contendo 1,5% de LiNO3 + 1,5% de PVP (PH) a 4°C.

122


imobilização da lipase de Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de PEI

contendo 3% de LiNO3 (PN) a 4°C.

125

xviii



contendo 1,5% de LiNO3 e 1,5% de PVP (PH) a 4°C.

125



contendo 3% de PVP (PV) a 4°C.

125


imobilização da lipase de Candida antarctica fração B (CAL-B) sobre a membrana

de PEI contendo 3% de LiNO3 (PN) a 4°C.

127



ambas em membrana Nylon 6,6 (N) a 4°C.

128


imobilização da lipase de Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de nylon 6,6

(N) a 4°C.

129

Figura 4.43: Espectro de infravermelho na faixa de 0 a 5000cm-1

para diferentes

materiais utilizados como suporte para imobilização enzimática, a saber: (a)

PEI+3% de LiNO3, (b) PEI+1,5% de PVP+1,5% de LiNO3, (c) PEI+3% de PVP,

(d) Membrana de polipropileno e (e) membrana de nylon.

131

Figura 4.44: Análise termogravimétrica das membranas de PEI com diferentes

aditivos. 134

Figura 4.45: Variação da concentração do (S)-IPG e (R)-IPG na fase aquosa e na

fase orgânica (acetato de etila). Sendo a concentração inicial de (R,S)-IPG na fase

orgânica de 4,88 mM, volume das fases igual a 140 mL e temperatura do processo

igual a 23°C.

136

Figura 4.46: Variação da concentração do (S)-IPG e (R)-IPG na fase aquosa e na

fase orgânica (tolueno). Sendo a concentração inicial de (R,S)-IPG na fase orgânica

de 5,88 mM, volume das fases igual a 140 mL e temperatura do processo igual a

23°C.

136

Figura 4.47: Sistema de contactores de membranas utilizado na resolução racêmica

do éster octanoato de (R,S)-IPG. 137

xix

Figura 4.48: Variação da concentração do (S)-IPG e (R)-IPG nas fases aquosa e

orgânica em acetato de etila a 30°C. Sendo a atividade inicial da lipase Amano AK

igual a 30 U e a concentração do octanoato de (R,S)-IPG igual a 4mM. Os volumes

da fase orgânica e aquosa foram 200 e 50 mL, respectivamente, e sendo que 10 %

da fase orgânica foi água.

139

Figura 4.49: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-IPG em acetato de etila a

30°C. Sendo a concentração inicial do éster 4mM e a atividade enzimática inicial da

lipase Amano AK igual a 30 U. ( ) ee(P) e ( ) X e ( )ee(S).

140

xx

Índice de Tabelas

Tabela 2.1: Exemplos de processos industriais empregando lipases. 9

Tabela 2.2: Exemplos de aplicações industriais de lipases. 12

Tabela 2.3: Comparação entre os diferentes métodos de imobilização enzimática. 29

Tabela 2.4: Atividade relativa de lipases imobilizadas sobre suportes hidrofóbicos. 36

Tabela 2.5: Imobilização de lipases via adsorção física. 37

Tabela 2.6: Grupos funcionais presentes na enzima disponíveis para ligação

covalente com um dado suporte. 43

Tabela 4.1: Hidrólise dos ésteres derivados do IPG catalisado pela lipase

Novozyme 435. 75

Tabela 4.2: Hidrólise dos ésteres derivados do IPG catalisado pela lipase Amano

AK. 75

Tabela 4.3: Influência da concentração enzimática inicial na resolução do octanoato

de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) a 30°C em acetato de etila e água (1:1). 88

Tabela 4.4: Reações de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno

(5mM) em 5 horas de reação variando-se a atividade inicial da lipase (0,9U e 2,7U),

temperatura (10 e 30°C) e solvente (acetato de etila, tolueno e hexano).

93

Tabela 4.5: Reações de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno

(5mM) em 24 horas de reação variando-se a atividade inicial da lipase (0,9U e

2,7U), temperatura (10 e 30°C) e solvente (acetato de etila, tolueno e hexano).

93

Tabela 4.6: Resolução do (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol através de reações de

hidrólise e acilação enantiosseletiva utilizando diferentes catalisadores. 94

Tabela 4.7: Áreas específicas das membranas utilizadas na imobilização da lipase

Amano AK. 108

Tabela 4.8: Parâmetros da isoterma de Langmuir, em relação a atividade, obtidos

pela imobilização da lipase Amano AK sobre microporos e membranas de

polipropileno (PP).

118


pela imobilização da lipase Amano AK sobre diferentes membranas de PEI através

de ligação covalente e adsorção hidrofóbica.

121

xxi


pela imobilização da lipase Amano AK sobre membrana de nylon 6,6 através de

ligação covalente e adsorção hidrofóbica.

129

Tabela 4.11: Comprimento de onda (λ) relativo às bandas características de

determinados grupos funcionais presentes nas moléculas da PEI, PP e nylon 6,6. 133

xxii

Lista de Siglas e Abreviaturas

Abs - Absorbância

Ads – Adsorção

AS – Área específica

Asp – Ácido aspártico

ATR - Refletância Total Atenuada

β - Coeficiente de transferência de massa individual

BASF - Badische Anilin und Soda-Fabrik

C – Carbono

C* - É a concentração da espécie em solução que está em equilíbrio com a fração

adsorvida no processo de imobilização

CA - Celulose

CAL-B – Lipase Candida antarctica – Fração B

CG – Cromatografia Gasosa

CMC – Concentração Micelar Crítica

CSTR - Continuous Stirred-Tank Reactor

DAG – Diacilglicerol

DNA - Ácido desoxirribonucleico

E - Razão enantiomérica

EC - Enzyme Commission

E. coli - Escherichia coli

ee – Excesso enantiomérico

Enz - Enzima

EUA - Estados Unidos da América

FDA - Food and Drug Administration

FTIR - Espectroscopia no infravermelho

Glu – Ácido glutâmico

His - Histidina

HMFS - Human Milk Fat Substitutes

HPLC - High-Performance Liquid Chromatography

Inc - Incorporation

IPG - Isopropilideno Glicerol

xxiii

J – Fluxo (L/h.m2)

K - Coeficiente de transferência de massa global, m/s

kcat - (Turnover number) = constante catalítica

KA - Constante de equilíbrio da reação de adsorção (Langmuir)

KAA - Constante que descreve a interação entre as moléculas de adsorvato (Langmuir

multicamada)

KD – Constante de dissociação aparente (Langmuir-Freundlich)

Km - Constante de Michaelis-Menten

K10 – Poli(vinipirrolidona) com massa molecular igual a 10 kDa

K90 – Poli(vinipirrolidona) com massa molecular igual a 360 kDa

LogP – Coeficiente de partição (1-octanol/água)

Ln – Logaritmo neperiano

MAG – Monoacilglicerol

MEV – Microscopia eletrônica de varredura

mi - Coeficiente de partição

min – minuto

mM –Mili molar

MMPG - (R,S)- trans-4 metóxi-3 –ácido fenilglicídico

n - Índice da isoterma de Freundlich

N - Nylon

NC-IUBMB – Nomenclature Committee of international Union of Biochemistry and

Molecular Biology.

NMP - N-metil-2-pirrolidona

PEI – Poli (éterimida)

PEO - Poli-óxido etileno

PFR - Plug Flow Reactor

pH - Potencial Hidrogeniônico

PH - Membrana de PEI com nitrato de lítio e PVP (1:1) como aditivo

PN - Membrana de PEI com 3% de nitrato de lítio como aditivo

pNPB – Butirato de p-nitrofenila

PP - Polipropileno

PVP – Poli (vinilpirrolidona)

PV – Membrana de PEI com 3% de PVP como aditivo

xxiv

PVA - Poli(álcool vinílico)

PTFE - politetrafluoretileno

Qmax - Capacidade maxima adsortiva

QTS - Membranas de quitosana

R2 – Coeficiente de ajuste de um determinado modelo de aos dados experimentais

Ra – Retenção de atividade, %

RMN - Ressonância Magnética Nuclear

RMP - raio médio do poro

Ser - Serina

ST – Seção transversal

TG – Termogravimetria

TGA –Analisador termogravimétrico

U - Unidade de atividade enzimática, µmol/min

V – Volume

X – Conversão, %

1

CAPÍTULO 1

Introdução e Objetivos

1.1 Contextualização

Atualmente, a preparação de compostos orgânicos de maneira enantiosseletiva a

partir de intermediários quirais é um dos principais objetivos dos químicos orgânicos

sintéticos (Lin et al., 2001; Blaser et al., 2004), e isto se deve principalmente à

reconhecida importância da quiralidade nos processos biológicos (desenvolvimento de

inúmeros produtos agroquímicos e farmacêuticos).

Os enantiômeros possuem propriedades físicas e químicas idênticas em um

ambiente aquiral. No entanto, em ambiente quiral, suas propriedades mudam

completamente, visto que a atividade biológica de substâncias quirais geralmente

depende de sua estereoquímica, uma vez que um organismo vivo é um ambiente

altamente quiral (Burton et al., 2006).

É conhecido que alguns fármacos são produzidos e comercializados na forma de

racematos, ou seja, mistura equimolar de isômeros (R,S), e que a atividade biológica

depende, em muitos casos, de sua configuração absoluta. Normalmente um dos

isômeros apresenta atividade biológica, enquanto o outro é menos ativo ou até mesmo

teratogênico.

A atividade biológica associada a cada um dos enantiômeros de uma substância

utilizada para fins medicinais passou a ser encarada com mais seriedade a partir de

1960, com os casos de má-formação de fetos associados ao consumo do fármaco

talidomida (Figura 1.1). A talidomida é uma droga que possui um forte poder sedativo e

anti-náusea e, portanto seu uso em mulheres grávidas no início de gestação passou a ser

considerado apropriado. Posteriormente foi descoberto que esta droga também possuía

um forte efeito teratogênico o que levava a sérios efeitos colaterias na formação do feto.

Estes efeitos foram atribuídos ao enantiômero (S) o qual ocasionava a teratogenia,

enquanto que o enantiômero (R) levava ao efeito desejado.

2

Figura 1.1: Enantiômeros da talidomida (www.wikipedia.org).

Em 1992, a FDA (Food and Drug Administration, órgão regulatóriodo EUA para

comercialização de alimentos e fármacos) adotou um programa no qual as drogas

racêmicas enfrentariam processos muito mais longos e complexos de aprovação para

venda nos EUA do que as drogas enantiopuras.

A obtenção de moléculas enantiomericamente puras não é somente uma necessidade

da indústria farmacêutica. Em muitos casos, em que substâncias bioativas são

empregadas na elaboração de agroquímicos, flavorizantes ou aditivos alimentares,

apenas um dos enantiômeros apresenta atividade desejada. Assim, novas metodologias

para separação de misturas racêmicas vêm sendo estudadas.

Neste contexto o uso de enzimas como biocatalisadores tem possibilitado a obtenção

de compostos enantiomericamente puros ou enriquecidos, visto que estas são capazes de

reconhecer moléculas quirais e atuam, preferencialmente, em um dos isômeros da

mistura racêmica. Um grupo de enzimas que vêm sendo bastante empregadas neste

campo são as lipases (EC 3.1.1.3) que além de serem versáteis em reações de hidrólise e

esterificação, biotransformações e resoluções ópticas, são também acessíveis, de baixo

custo e estáveis em solventes orgânicos, o que as torna extremamente atrativas em

processos biocatáliticos em geral. A aplicação e recuperação destas enzimas em meio

aquo-restrito vêm sendo desenvolvidas conjuntamente com técnicas de imobilização das

mesmas de modo a tornar possível a separação da enzima do meio reacional, seu reuso e

maior estabilidade. A escolha do método de fixação quando se imobiliza uma dada

enzima é extremamente importante, pois deve prevenir a perda de atividade enzimática,

sem alterar a natureza química ou os grupos reativos no local de ligação da enzima (sítio

ativo).

Assim, atualmente tem sido cada vez mais difundida, especialmente entre os

químicos orgânicos, a utilização de processos com membrana na separação de misturas

(S)- Talidomida

teratogênico

(R)- Talidomida

sedativo

3

racêmicas (contactores de membrana), já que os mesmos sistemas permitem a reação e a

separação dos os produtos simultaneamente.

Neste trabalho, o bloco quiral estudado foi o (R,S)-IPG (Figura 1.2), também

conhecido como (R,S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol ou (R,S)-IPG (1,2-O-

isopropilideno glicerol) foi originalmente sintetizado por Fischer em 1895 através da

reação do glicerol com acetona na presença de cloreto de zinco (Fai Liu, 1999).

Figura 1.2: Estrutura do (R,S)-IPG (www.wikipedia.org).

No caso específico do (R,S)-IPG, nenhum dos enantiômeros causa algum tipo de

efeito deletério e, apesar da forma S ser mais facilmente obtida em resoluções

enantioméricas, a forma R pode ser usada como bloco quiral na síntese do ácido γ-

amino β-hidroxibutírico, medicamento usado no tratamento da hipertensão. Já o S-IPG é

bloco quiral utilizado para a síntese de diglicerídios e muitos outros compostos

biologicamente ativos, tais como, fosfolipídeos, fatores de agregação plaquetária, β-

adrenoceptores, dentre outros (Fai Liu, 1999). Além disso, por ser derivado do glicerol,

este substrato é bastante atrativo, visto que pode ser obtido da glicerina bruta, rejeito da

produção de biodiesel.

Desta forma, pensando na integração de processos (produção e separação de

bioprodutos) e áreas do conhecimento (química, bioquímica e engenharia química)

buscou-se neste trabalho efetuar reações enzimáticas (usando lipases como

biocatalisadores) para resolução enantiomérica do (R,S)-IPG seguida pela separação

simultânea dos produtos em contactores de membranas.

4

1.2 Objetivos

O objetivo global deste trabalho é propor um sistema utilizando membranas

catalíticas, ou seja, contendo lipases imobilizadas, visando a resolução de uma mistura

racêmica ((R,S)-IPG)) com separação simultânea dos produtos reacionais.

Como objetivos específicos podem ser destacados:

Escolha do melhor éster derivado do (R,S)-IPG a ser empregado no sistema

de resolução e separação simultânea.

Estudos com diferentes lipases, solventes e temperaturas a fim de verificar

a melhor condição reacional de resolução enantiomérica.

Desenvolver membranas poliméricas para imobilização de diferentes

enzimas.

Imobilização da lipase de interesse em diversas membranas poliméricas,

comerciais e desenvolvidas no Laboratório de Biotecnologia Microbiana

(LaBim).

Verificar a influência de diferentes métodos de imobilização sobre a

atividade enzimática.

Efetuar resoluções enantioméricas em contactor de membranas planas de

forma contínua com recuperação simultânea de produto.

5

CAPÍTULO 2

Revisão Bibliográfica

2.1.Enzimas

As limitações existentes na obtenção de produtos ou intermediários de interesse

comercial podem ser associadas aos tipos de catalisadores químicos empregados, os

quais são pouco versáteis além de exigirem altas temperaturas a fim de garantir razoável

velocidade de reação. Além disso, devido a sua baixa especificidade, fornecem produtos

de composição química ou mista até mesmo contaminados, gerando, desta forma, a

necessidade de uma etapa posterior para purificação, o que gera um aumento nos custos

do processo. Diferentemente de um catalisador químico, enzimas são biocatalisadores

de natureza protéica ou glicoprotéica que, além de apresentarem seletividade (quimio,

regio e enantio), também atuam em condições brandas de temperatura (30 a 70 ºC), pH

e pressão, atingindo taxas de reação bastantes elevadas (podem elevar a taxa de uma

reação de 108 a 10

12 vezes). Este comportamento das enzimas permite uma redução dos

custos com o “downstrean” do processo, já que sua elevada especificidade resulta em

um maior rendimento do processo, obtenção de produtos biodegradáveis e redução na

quantidade de resíduos (De Castro et al., 2004).

De acordo com NC-IUBMB (Nomenclature Committee of the International Union

of Biochemistry and Molecular Biology) as enzimas são classificadas e codificadas em

relação à reação catalisada. A nomenclatura utiliza a abreviação E.C (Enzyme

Commission) seguida de até 4 dígitos referentes à classe e subclasses a que pertence a

enzima (Lima, 2004; Zimmermann, 2005). O interesse industrial por tecnologias

enzimáticas vem aumentando gradativamente, principalmente, nas áreas de engenharia

de proteínas e enzimologia em meios não convencionais, as quais ampliaram

consideravelmente o potencial de aplicação das enzimas como catalisadores em

processos industriais. Entre os processos de maior interesse estão as reações de

hidrólise, síntese e interesterificação de lipídeos por meio das lipases. As razões do

enorme potencial biotecnológico dessa enzima são: i) apresentam alta estabilidade em

6

solventes orgânicos; ii) não requerem a presença de co-fatores; iii) possuem uma larga

especificidade pelo substrato e, iv) exibem uma alta enantiosseletividade.

O reconhecimento dessas vantagens tem proporcionado um aumento considerável

na produção e comercialização de enzimas em geral, resultando no desenvolvimento de

tecnologias alternativas consistentes para utilização no setor industrial. De acordo com a

reportagem da Business Communications Company Inc. o mercado global de enzimas

para interesse industrial foi estimado em U$ 4,4 bilhões de dólares em 2015. Esta

estimativa está baseada no fato de que novas aplicações utilizando enzimas estão

surgindo, exigindo desta forma que a indústria responda com um fluxo contínuo de

produtos inovadores. A Figura 2.1 ilustra os principais consumidores de enzimas e o

valor gasto anualmente por estes setores.

Figura 2.1: Mercado mundial de enzimas industriais no período de 2008-2015.

(http://www.bccresearch.com/report/BIO030F.htmL, 2011).

2.1.1. Lipases

2.1.1.1.Características gerais

Lipases (triacilglicerol éster hidrolases - E.C.3.1.1.3) compreendem um grupo de

enzimas hidrolíticas que atuam na interface orgânico-aquosa catalisando a hidrólise de

ligações éster carboxílicas de triacilgliceróis a fim de liberar ácidos orgânicos e glicerol

(Figura 2.2), podendo a reação inversa (síntese) ocorrer em ambientes com baixa

http://www.bccresearch.com/report/BIO030F.html

7

concentração de água. Além dos lipídeos, seus substratos naturais, lipases constituem

um grupo de enzimas bastante diversificado em relação à utilização de outros substratos

não específicos, tais como, amidas, tioésteres, dentre outros (Paques e Macedo, 2006;

Berglund, 2001).

As lipases são comumente encontradas na natureza e podem ser obtidas de fontes

animal (pancreática, hepática e gástrica), vegetal (extraída da soja, do centeio e do

algodão) e microbiana (bactérias e fungos) (Paques e Macedo, 2006; De Castro et al.,

2004; Sharma et al., 2001; Costa e Amorim, 1999). Inicialmente eram obtidas a partir

do pâncreas de animais e utilizadas como auxiliar digestivo para consumo humano

(Kazlauskas e Bornscheuer, 1998). O elevado custo de produção, quando comparadas a

outras hidrolases (proteases e carboxilases), bem como o baixo rendimento do processo

fermentativo limitou por anos a utilização de lipases microbianas. Entretanto, avanços

registrados em relação à tecnologia do DNA recombinante associados à facilidade de

produção e abundância de microorganismos mudaram este cenário nas últimas décadas

(Hasan et al., 2006). Atualmente as lipases microbianas são produzidas por diversas

indústrias, como Novozymes, Amano, Gist Brocades, dentre outras.

Tanto por razões técnicas quanto econômicas, as enzimas microbianas têm tido

sua importância cada vez mais aumentada. No caso das enzimas vegetais, há

necessidade de grande quantidade de plantas para se obter uma quantidade razoável de

uma determinada enzima de interesse. Muitas vezes, isto se torna inviável em virtude

dos elevados valores da terra e custos operacionais. Já as enzimas animais são

subprodutos das indústrias de carne, cujo suprimento é limitado, principalmente, para

atendimento a uma demanda súbita, em grande escala (Jaeger et al., 1994).

As enzimas microbianas, entretanto, não estão sujeitas às limitações de produção

ou de suprimento.

Figura 2.2: Reação de hidrólise catalisada por triacilgliceol lipases (Lima, 2004).

8

Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molar variando entre 20 a 75

KDa, atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e em temperaturas variando desde a 25 até

70°C.

A possibilidade de aceitarem diferentes substratos com elevada eficiência e

estabilidade, além dos lipídeos, seus substratos naturais, bem como suas propriedades

químio, régio ou enantiosseletivas faz com que as lipases catalisem uma série de

diferentes reações (Freire e Castilho, 2008), como ilustra a Figura 2.3. Além de catalisar

reações de hidrólise e esterificação, lipases podem atuar em reações de interesterificação

(acidólise, alcoólise e transesterificação), dependendo dos reagentes de partida a serem

empregados (Hasan et al., 2006). Além disso, reações de aminólise (síntese de amidas)

e lactonização vêm sendo também estudadas, entretanto, independente do tipo de reação

catalisada, a atividade de água do meio reacional é um dos fatores determinantes para

cada classe de reação (Berglund, 2001; Paques e Macedo, 2006).

Figura 2.3: Reações catalisadas por lipases (Paques e Macedo, 2006).

Importantes indústrias do setor químico como a BASF, com sede em

Ludwigshafen na Alemanha, empregam lipases, especificamente de Candida antarctica,

9

em processos de resolução de aminas e álcoois racêmicos para a síntese de

intermediários de fármacos e agrotóxicos (Bornscheuer, 2002). Outros produtos, tais

como substitutos da gordura do leite materno (HMFS), análogos da manteiga de cacau

(CBE), compostos aromatizantes, di- (DAG) e monoacilgliceróis (MAG), ácidos graxos

poliinsaturados concentrados e precursores de fármacos também são produzidos em

escala industrial utilizando lipases como biocatalisador (Bickerstaff, 2009 citado em

Mendes, 2009). A Tabela 2.1 apresenta outros exemplos de aplicações industriais de

lipases.

Tabela 2.1: Exemplos de processos industriais empregando lipases (Vasic-Racki, 2000 citado em

Freire e Castillho, 2008).

Processo Início da operação Firma

Interesterificação de

gorduras

Hidrólise de ésteres

Transesterificação

Acilação

1979, 1983

1988

1990

1996

Fuji Oil, Unilever

Sumitomo

Unilever

BASF

A aplicação de lipases em meio não aquoso ou aquo-restritos, com baixa atividade

de água pode ser realizada atualmente devido (i) elucidação das estruturas

tridimensionais das enzimas pela engenharia de proteínas, (ii) estudo do mecanismo de

reação de lipases (ativação interfacial), (iii) utilização da engenharia genética na

produção de enzimas recombinantes e (iv) adoção de métodos de imobilização da

enzima (De Castro et al., 2004).

Esterases (E.C.3.1.1.1), assim como as lipases, representam também um diverso

grupo de hidrolases que catalisam a quebra e formação de ligações éster (Bornscheuer,

2002). Entretanto, diferentemente das lipases, que hidrolisam acilgliceróis de cadeia

longa (mais de 10 átomos de carbono), as esterases segundo Verger (1997) hidrolisam

acilgliceróis com menos de 10 átomos de carbono. Porém, o interesse nestas enzimas

reside no fato de que as mesmas não requerem cofatores, são relativamente estáveis e

também são ativas em solventes orgânicos (Bornscheuer, 2002). Deve-se enfatizar

também, que a maioria das lipases podem hidrolisar os substratos de esterases, enquanto

que o inverso não é verdadeiro (Jaeger et al., 2002).

10

Em 1958, Sarda e Desnuelle definiram lipases em relação a suas características

cinéticas, embasados no fenômeno de ativação interfacial que foi observado pela

primeira vez em 1936 por Holwerda e colaboradores e em 1945 por Schonheyder e

Volqvartz. Segundo eles a propriedade de ativação está relacionada com a presença de

uma interface água/lipídeo que é gerada na presença de substratos insolúveis em água e

emulsionados (Verger, 1997). Desta forma o fenômeno de ativação interfacial se

caracteriza pelo aumento da atividade lipolítica quando a solubilidade do substrato é

excedida, ou seja, sua concentração está próxima ou ultrapassa seu limite de

solubilidade, gerando uma fase independente, e tanto a qualidade quanto a quantidade

da interface tem papel importante na atividade catalítica essas enzimas. Por este motivo,

lipases não hidrolisam substratos que estejam abaixo de uma concentração mínima, a

concentração micelar crítica (CMC) (Verger, 1997; Costa e Amorim, 1999).

Quando as primeiras estruturas tridimensionais de algumas lipases fúngicas de

Rhizomucor miehei e Geotrichum candidu, bem como a lipase pancreática humana,

foram elucidadas no início da década de 90, o fenômeno de ativação interfacial passou a

ser explicado em função da presença de uma cobertura ou tampa hidrofóbica que

protege o sítio ativo da enzima expondo-o ao interagir com a interface orgânico-aquosa

em virtude das mudanças conformacionais. Hoje, sabe-se que a presença da tampa não

está necessariamente correlacionada com a ativação interfacial, visto que diversas

lipases de origem microbiana (Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae e

Candida antarctica B) apresentam “tampa” em suas estruturas, mas não sofrem

ativação interfacial (Verger, 1997; Paiva et al., 2000; De Castro et al., 2004; Cunha,

2007; Freire e Castilho, 2008).

Por outro lado, algumas enzimas provenientes das bactérias Pseudomonas

aeruginosa e Burkholderia glumae, além da cutinase proveniente de Fusarium solani

ssp. pisi não precisam da interface para exercer sua atividade hidrolítica (Paiva et al.,

2000). Além disso, a ocorrência ou não da ativação interfacial pode ser influenciada

pelas condições experimentais e pelos substratos utilizados (Ferrato et al., 1997).

A fim de acabar com as diversas contradições existentes na literatura, atualmente a

maioria dos autores define lipase como uma carboxilesterases capaz de hidrolisar

triacilgliceróis de cadeia longa, (Verger, 1997; Reetz, 2002; De Castro et al., 2004;

Lima, 2004).

11

A principal forma de produção de lipases tem sido através de processos

fermentativos, pois estes processos apresentam maior facilidade de controle, maior

capacidade produtiva e custo de obtenção reduzido. Os principais microorganismos

utilizados para produção de lipases são fungos dos gêneros Rhizopus, Aspergillus e

Mucor, bactérias do gênero Pseudomonas e leveduras do gênero Candida (Balcão et al.,

1996; Pandey et al., 1999; Freire e Castilho, 2008).

2.1.1.2. Aplicações de lipases

O crescente interesse no uso de lipases encontra-se principalmente em aplicações

industriais de larga escala, em virtude de suas características peculiares:

biocatalisadores acessíveis, ou seja, de fácil produção, baixo custo de geração, não

requerimento de cofatores, operação em condições brandas de temperatura e pH,

minimização de problemas de isomerização, racemização e rearranjo, estabilidade em

solventes orgânicos, quimiosseletividade (habilidade da enzima gerar seletivamente um

certo produto atuando no seu grupo funcional), regiosseletividade (habilidade da enzima

atuar seletivamente em uma determinada posição dentro da molécula) e

enantioespecificidade (habilidade da enzima diferenciar enantiômeros em um racemato)

(Castilho et al. ,2001).

Os setores industriais que mais se utilizam de lipases para geração de bens de

consumo são: o de formulação de detergentes, degradação de óleos e gorduras, síntese

farmacêutica, produção de cosméticos, manufatura de fermento e queijo (indústria

alimentícia), manufatura de papéis, couro, tratamento de efluentes, produção de

biodiesel, kits diagnósticos, biossensores para utilização em análises clínicas, de

alimentos, químicas, de contaminação ou poluição de ambientes, dentre outras (Reetz,

2002; Vulfson, 1994 citado em Tincom, 2003; Hasan et al., 2006; Cunha, 2007; Freire e

Castilho, 2008; Pandey et al., 1999). Além disso, as lipases têm sido utilizadas em

terapias enzimáticas (Kurita-Water, 1994 citado em Tincom, 2003). Na Tabela 2.2 é

possível verificar diferentes exemplos de aplicações industriais de lipase em função do

tipo de reação catalisada.

12

Tabela 2.2: Exemplos de aplicações industriais de lipases (Paques e Macedo, 2006; Hasan et al.,

2006; Freire e Castilho, 2008).

Área

Industrial Aplicação Produto

Alimentação

Hidrólise de gordura do leite

Síntese de ésteres

Transesterificação de óleos

Melhorar textura

Hidrólise de óleos e gorduras

Remoção de manchas/gordura

Síntese de ésteres

Agentes flavorizantes para produtos matinais

Aromas para alimentos e bebidas

Manteiga de cacau

Fabricação de pães

Ácidos graxos, di e monotriglicerideos

Detergentes

Ésteres, emulsificantes

Química

Transesterificação de óleos vegetais

Pré-tratamento enzimático de

efluentes oriundos de abatedouros e

indústria de laticínios.

Biodiesel

Resíduos contendo menos gorduras

Médica Dosagem de triglicerídeos do sangue

Resolução enantiosseletiva

Kits diagnósticos

(R,S)-ibuprofeno, (R,S)-naproxeno

Cosméticos Síntese de ésteres Fragrância para perfumes

O advento de novas tecnologias, como a recombinação genética, engenharia de

proteínas e a evolução dirigida vêm propiciando a obtenção de enzimas com

características (atividade, quimio, régio e enantiosseletividade) novas e mais especificas

para determinados processos industriais, promovendo desta forma, uma expansão do

mercado para as enzimas, em especial para as lipases. Mais de 30% deste mercado até

2001 era destinado ao setor de fabricação de detergentes (Sharma et al., 2001).Uma

aplicação que tem merecido destaque é a utilização de lipases na obtenção de fármacos

ou insumos farmacêuticos em suas formas enantioméricas ativas com elevada pureza

ótica, já que estas enzimas são capazes de reconhecer moléculas quirais e atuam,

preferencialmente, em um dos isômeros de uma mistura racêmica.

No período de 2000-2010 foram publicados cerca de 2900 trabalhos, sendo que

somente nos últimos dois anos, foram 920 trabalhos relatando o uso de lipases em

processos químicos e industriais (http://apps.isiknowledge.com, 2010). Estes dados

http://apps.isiknowledge.com/

13

demonstram o grande interesse e a versatilidade do uso desses catalisadores em

inúmeras áreas como mencionado anteriormente.

Entre as maiores empresas produtoras destas enzimas estão a Amano

Pharmaceuticals (Japão), Novozymes (Dinamarca), Genencor International (EUA),

Unilever (Holanda), Biocatalysts (Inglaterra) e Meito Sankyo (Japão) (Hasan et al.,

2006).

2.1.1.3. Aspectos estruturais e mecanismo catalítico das

lipases

Desde 1990, com a resolução das primeiras estruturas tridimensionais (lipase

fúngica de Rhizomucor miehei e da lipase pancreática humana) através da técnica de

cristalografia de Raios-X, o entendimento sobre os mecanismos de atuação das lipases

começou a ser desvendado. Daí por diante, mais de onze estruturas de lipases já foram

determinadas, das quais, com exceção da lipase pancreática, todas são de origem

microbiana (Jaeger e Reetz, 1998; Kazlauskas et al., 1998).

Todas as lipases cujas estruturas tridimensionais têm sido elucidadas são do tipo

α/β hidrolase (Pissilão, 2006; Lima, 2004; Bornscheuer, 2002; Jaeger e Reetz, 1998;

Kazlauskas et al., 1998) (Figura 2.4). Este tipo de estrutura apresenta um núcleo central

composto por fitas β paralelas rodeado por porções em α-hélice. As fitas β têm

orientação para a esquerda, e a primeira e a última fita possuem um ângulo de

aproximadamente 90°C entre si.

O sítio catalítico das lipases é composto por uma tríade catalítica (Serina (Ser),

ácido aspártico ou glutâmico (Asp/Glu) e histidina (His)) semelhante à observada

primeiramente em serina-proteases. O sítio ativo está localizado no lado C-terminal das

fitas. O nucleófilo catalítico (serina) está localizado específicamente no C-terminal da

fita β5 em um pentapeptídeo altamente conservado (G-X1-S-X2-G, onde G= glicina; S=

Serina; X1= histidina e X2= ácido glutâmico ou aspártico), que constitui o ângulo

nucleofílico (Jaeger et al.,1999; Lima, 2004; Bornscheuer, 2002; Uppenberg et al.,

1994).

14

Figura 2.4: Representação esquemática do motivo estrutural conservado em enzimas da família α/β

hidrolase. Filamentos em conformação β (1-8) formando uma estrutura em folha β-pregueada estão

indicados pelas setas, estrutura em α-helices (A-F) indicadas pelas colunas. As posições relativas

dos aminoácidos da tríade catalítica estão indicadas pelos círculos (Bornscheuer, 2002).

Quando a enzima é submetida a meios aquosos, a exposição do sítio é

termodinamicamente desfavorável, permanecendo então na conformação “fechada” ou

inativa (Figura 2.5). No entanto, na presença de substratos hidrofóbicos (interfaces)

observa-se uma mudança na estrutura da enzima para a conformação ativa ou “aberta”,

tornando o sítio ativo da enzima totalmente acessível ao substrato, explicando assim o

fenômeno de ativação interfacial (Costa e Amorim, 1999). Essa abertura consiste na

reestruturação conformacional da lipase que cria uma região eletrofílica (“cavidade do

oxiânion”) em torno do resíduo serina: a tampa helicoidal vira-se para trás encobrindo

seu lado hidrofílico em uma cavidade polar, antes preenchida por moléculas de água, e

expondo totalmente o lado hidrofóbico da tampa. Essa exposição faz com que a

superfície apolar em torno do sítio catalítico seja expandida. A cavidade do oxiânion é

responsável pela estabilização de cargas negativas geradas durante o ataque nucleofílico

na ligação carbonila do substrato, portanto estabiliza o estado de transição durante a

catálise. (Balcão et al, 1996; Paiva et al., 2000).

15

Figura 2.5: Superposição dos esqueletos das lipases de Rhizomucor miehei (a) e de pâncreas

humano (b), mostrando a mudança conformacional da tampa na ativação interfacial. As tampas

estão destacadas em verde (fechado) e laranja (aberto). Modificado de Petersen et al.( 2001), citado

em Almeida (2005).

Independente do tipo de reação catalisada (hidrólise, esterificação ou

interesterificação) o mecanismo mais descrito e aceito para descrever a ação catalítica

das lipases é o Ping-Pong Bi Bi (Figura 2.6). Este mecanismo consiste em duas etapas

majoritárias (Paiva et al., 2000; Jaeger et al., 1999):

1. Ataque nucleofílico sobre a ligação éster do substrato pelo átomo de oxigênio do

grupamento hidroxila do resíduo serina do sítio catalítico, após a abertura da

tampa, resultando na formação de um complexo denominado enzima acilada e

liberação de uma porção álcool do substrato original.

2. Hidrólise do complexo enzimático acilado, resultando na regeneração da enzima.

Figura 2.6: Mecanismo cinético (Ping-Pong Bi Bi) de lipase catalisando reações envolvendo

múltiplos substratos e produtos usando a notação de Cleland’s (E: enzima; Es: éster; Al: álcool;

Ac: ácido, W: água, F: acil enzima, i = 1, 2, 3, ..., I; j = 1, 2, 3, ..., J) (Paiva et al., 2000).

16

A Figura 2.7 representa o mecanismo de ação catalítica e os estados transientes

formados durante a hidrólise de um éster (etanoato de metila) catalisada por lipases e

esterases (Simas et al., 2011).

Figura 2.7: Mecanismo geral das reações catalisadas por lipases, considerando também a reação de

transesterificação (Tríade catalítica numerada como na lipase Cal-B, Ser105–His224–Asp187;

Primeiro substrato = EtOAc, segundo substrato = ROH, IT = Intermediário tetraédrico) (Simas et al.,

2011).

De acordo com a Figura 2.7 o processo de hidrólise de um éster catalisada por

uma lipase ocorre em 4 etapas, descritas a seguir:

Primeira etapa: Inicialmente a histidina da tampa hidrofóbica aumenta a

nucleofilicidade do grupo hidroxila da serina presente no sítio catalítico. Ocorre, então,

o ataque nucleofílico ao átomo de carbono suscetível da ligação éster do substrato,

abrindo a ligação C =O e dando origem ao intermediário tetraédrico. O anel imidazólico

da histidina fica protonado e carregado positivamente, sendo estabilizado pela carga

negativa do resíduo ácido.

Segunda etapa: O intermediário tetraédrico formado é estabilizado por ligações

de hidrogênio com os grupamentos amidas dos resíduos pertencentes à chamada

“cavidade do oxiânion”. O intermediário tetrédrico é desfeito, pelo retorno da ligação

C=O e consequente clivagem da ligação éster e liberação da porção álcool, cujo

17

oxigênio recebe um próton proveniente da histidina, que age como ácido gerando-se

assim o intermediário denominado enzima acilada.

Terceira etapa: Formação do intermediário covalente enzima acilada, onde o

componente ácido do substrato encontra-se esterificado com o resíduo serina da enzima.

A molécula de água que se aproxima e é ativada pelo resíduo histidina vizinho, e o íon

hidroxila resultante promove o ataque nucleofílico ao átomo de carbono da carbonila do

intermediário covalente. Uma molécula de água, que tem seu caráter nucleofílico

acentuado pela ação básica da histidina protonada, ataca o carbono suscetível do

intermediário acil enzima, abrindo a ligação C=O, gerando um segundo intermediário

tetraédrico.

Quarta etapa: Retorno da ligação C=O desfaz-se o segundo intermediário

tetraédrico com a liberação do ácido carboxílico e da enzima livre.

Quando a água está presente em excesso, e, portanto, permanece constante no

meio reacional, a expressão genérica que descreve a taxa de hidrólise para o mecanismo

Ping-Pong Bi Bi é muito semelhante à expressão da taxa de Michaelis-Menten

(Equação 2.1) (Paiva et al., 2000).

Eq. 2.1

onde: max,aparente definida como max,f[W]/(Km,W + [W]) denota a taxa máxima aparente da reação no

sentido direto (hidrólise) e Km,aparente definido como Km,Es[W]/(Km,W + [W]) denota uma constante de

Michaelis-Menten aparente. [Es] é a concentração do éster e [W] é a concentração de água.

2.1.1.3.1. Resolução de misturas racêmicas

Isômeros são compostos que possuem os mesmos constituintes atômicos (fórmula

molecular), porém suas disposições na molécula são diferentes, conferindo

conseqüentemente características químicas diversas. Já estereoisômeros são aqueles

isômeros cujos átomos ou grupos de átomos possuem uma distribuição espacial

diferente na molécula. Eles podem ser divididos em geométricos ou ópticos. Os

isômeros geométricos são estereoisômeros que não apresentam atividade óptica e sua

terminologia está centrada em cis (do mesmo lado) e trans (lados opostos) para

EsK

Esvr

aparentem

aparente

,

max,

18

descrever sua disposição espacial. Já os isômeros ópticos são aqueles que apresentam

atividade óptica, possuindo centros quirais ou centros assimétricos (Nasipuri, 1991).

A quiralidade representa uma propriedade intrínseca dos chamados “blocos

estruturais da vida”, tais como aminoácidos e açúcares e, conseqüentemente, dos

peptídeos, proteínas e polissacarídeos (Júnior et al., 2006). O conceito básico de

resolução quiral teve início em 1809, com o cristalógrafo Hauy (White e Subramanian,

1994 citado em Lourenço et al., 2010), entretanto foi Pasteur, em 1848, que

efetivamente descobriu a diferença de atividade entre dois enantiômeros, ao publicar

que a enzima de Penicillium glaucum consumia mais rapidamente o enantiômero (R)-

tartarato de amônio do que o (S)-tartarato de amônio. O fenômeno foi observado

verificando-se que as imagens não sobreponiveis desviavam a luz plano polarizada em

direções opostas (Berthod et al., 2006 citado em Lourenço et al., 2010).

É importante enfatizar que o fenômeno da quiralidade esta associado à

impossibilidade de realização de determinadas operações de simetria, gerando desta

forma a lógica de que todas as substâncias assimétricas são quirais, entretanto a

recíproca não é verdadeira (Nasipuri, 1991).

Quando, em uma amostra, os enantiômeros estão em quantidades iguais,

chamamos de mistura racêmica ou racemato, no entanto quando estes compostos estão

em quantidades desiguais, dizemos que a amostra é enantiomericamente enriquecida.

Durante décadas a questão da quiralidade, e consequentemente da pureza ótica de

compostos biologicamente ativos comercializados como fármacos foi negligenciada

pela comunidade científica. Como um exemplo clássico e trágico da importância da

quiralidade na indústria farmacêutica podemos citar o caso da talidomida. Na década de

60 a talidomida foi comercializada na sua forma racêmica como um sedativo, para

aliviar náuseas matinais em gestantes. Entretanto, posteriormente o fármaco foi retirado

do mercado por causar sérios efeitos colaterais levando a deformações congênitas em

fetos, quando administrado em gestantes (Burton et al., 2006; Júnior et al., 2006;

Cunha, 2007). O enantiômero R da talidomida possui as propriedades sedativas

anunciadas, enquanto que o seu antípoda ótico é teratogênico. Entretanto, hoje se sabe

que o enantiômero R in vivo causa teratogenias também, visto que ocorre racemização,

formando o enantiômero S (Burton et al., 2006).

O caso da talidomida foi um marco para a indústria farmacêutica, acarretando

mudanças profundas na legislação e no controle de fármacos e medicamentos. Em 1992,

19

a FDA (Food and Drug Administration) adotou um programa no qual as drogas

racêmicas enfrentariam processos muito mais longos e complexos de aprovação para

venda nos EUA do que as drogas quirais. A partir desse ano a grande maioria das

indústrias farmacêuticas tem procurado metodologias eficientes para produção de

compostos opticamente puros. O uso de mistura racêmica para novos medicamentos só

é permitido se todos os ensaios clínicos forem realizados com cada enantiômero

isoladamente e comparados com aqueles presentes na mistura racêmica. Devido a sua

enantioseletividade, lipases têm sido empregadas em vários processos deste tipo por

meio de hidrólise em meio aquoso ou de síntese em meio orgânico (Margolin, 1996;

Tsai e Huang 1999).

Alguns modelos podem ser utilizados para descrever o mecanismo de

enantiosseletividade em uma reação enzimática, sendo possível prever a

enantiopreferência pelo substrato, entretanto, o mais simples dos modelos não consegue

predizer o grau de enantiosseletividade (Ghanem et al., 2004; Cunha, 2007). Em 1964

Prelog (Faber, 1997) observou que a estereosseletividade da biorredução de cetonas

dependia do tamanho dos grupamentos ligados a carbonila. Denominado como um

modelo simples, a regra de Prelog’s, prediz que a enantiosseletividade de redução de

cetonas por álcool desidrogenases de leveduras baseia-se no tamanho dos dois

substituintes no grupamento carbonila.

Em 1991, Kazlauskas e colaboradores desenvolveram uma regra empírica para a

resolução de álcoois secundários quirais. Esta regra prevê qual enantiômero constituinte

de um racemato reagirá mais rapidamente com uma lipase ou uma esterase. Esta

proposta está baseada fundamentalmente no efeito estéreo de cada grupo substituinte do

álcool em questão e em estruturas de raios-X de enzimas.

Através da análise de estruturas das enzimas, foi admitida a presença de duas

porções hidrofóbicas, uma de tamanho grande e outra média e estas seriam as porções

responsáveis pela “acomodação” dos grupamentos substituintes de um álcool

secundário durante uma reação enzimática. Naturalmente, um grupo de tamanho médio

se acomodará na porção hidrofóbica média e um grupo de tamanho grande se

acomodará na porção hidrofóbica grande (Figura 2.8) (Kazlauzkas, 1991; Ghanem et

al., 2004 ).

20

Figura 2.8: a) Representação das duas porções hidrofóbicas da enzima.

b) Esquematização do encaixe álcool/enzima (Kazlauskas et al., 1991).

É importante enfatizar que este postulado não possui vínculo com a configuração

R ou S, mas sim estritamente com o tamanho dos grupos. Adicionalmente, apesar de

lipases catalisarem reações de hidrólise enantiosseletiva de alcoóis primários, lactonas e

ácidos carboxílicos, esta regra só vale para álcoois secundários e algumas aminas

primárias. Na Figura 2.9 está representada a simetria em processos reacionais

enzimáticos distintos seguindo a regra de Kazlauskas.

P G

O

O

P G

O

O

P G

HO

PSL

H2O

PG

O

O

PG

HO

PG

HOPSL

acetato de vinila

Hidrólise Transesterificação

R S

S R

racemato racemato

+ +

Figura 2.9: Simetria de hidrólise enzimática e reação de transesterificação de acordo com

Kazlauskas. Onde PSL: Lipase proveniente de Pseudomonas cepacia. Reproduzido de Gotor et al.

(2006).

21

Um substrato racêmico quando é submetido a uma reação enzimática sofre

discriminação entre os enantiômeros. Devido à quiralidade da enzima, o enantiômero

que melhor se ajusta no seu sitio ativo é convertido em uma velocidade mais alta. Para

assegurar uma alta seletividade para um dos enantiômeros a diferença na velocidade de

reação dos enantiômeros individuais deve ser a maior possível. Em alguns casos ideais a

velocidade é tão extrema, que o “bom” enantiômero é transformado rapidamente e o

outro não é convertido. Então a reação enzimática cessaria automaticamente em 50% de

conversão, quando já não existe mais o enantiômero reativo. Como conseqüência, cada

enantiômero pode ser obtido somente com 50% de rendimento em uma resolução

enzimática (Lozano et al., 2006). De modo a aumentar o rendimento teórico máximo

obtido a partir desta técnica de resolução foi desenvolvida a metodologia de Resolução

Cinética Dinâmica. Está técnica assemelha-se a resolução cinética convencional, como

mencionada anteriormente, entretanto, durante o processo, ocorre a racemização in situ

do reagente como demonstra a Figura 2.10.

Figura 2.10: Exemplo de Resolução Cinética Dinâmica de álcoois (Martin-Matute et al., 2005).

Analisando a Figura 2.10 observa-se que, através da racemização in situ do álcool

((S)-1-feniletanol), que não reage na presença do catalisador quiral. Já se utilizando um

catalisador de rutênio é possível obter um rendimento teórico máximo de 100%. Pode-

se destacar que um fator fundamental para a eficiência desse método, para esse

exemplo, é que a velocidade de racemização do álcool deve ser superior à velocidade de

reação de transesterificação. A escolha da técnica de resolução de racematos a ser

utilizada para separar uma determinada mistura racêmica dependerá de fatores tais

22

como propriedades físicas e químicas das moléculas e, até mesmo, o custo e a

viabilidade do processo.

2.1.1.3.1.1. Cinética de enantioespecificidade

As propriedades enantioespecíficas das enzimas isoladas podem, muitas vezes

com vantagem, ser utilizadas em processos de resolução de racematos. O enantiômero

para qual a enzima é mais específica é transformado mais rapidamente, enriquecendo

desta forma o meio reacional com o substrato para o qual a enzima é menos específica

(Pinto et al., 1999). Normalmente, quando uma mistura de dois enantiômeros (um

racemato, por exemplo) é submetida a um ensaio cinético, a enzima atua

simultaneamente sobre os dois enantiômeros, que constituem “substratos alternativos”.

A relação entre as duas eficiências catalíticas é conhecida como razão enantiomérica

(E), um parâmetro cinético intrínseco de cada enzima que descreve a especificidade da

enzima para os substratos alternativos, ou seja, quantas vezes um enantiômero é melhor

substrato que o outro para a enzima utilizada (Pinto et al., 1999, Straathof e Jongejam,

1997; Costa e Amorim, 1999; Ghanem et al., 2004).

Eq.2.2

Onde: kcat/Km representa a constante de especificidade e relaciona a eficiência catalítica da enzima

com sua afinidade pelo substrato, ou seja, trata-se da velocidade aparente de segunda ordem para

reação entre uma enzima e um substrato; kcat (turnover number) é a constante catalítica, representa

o número de moléculas de substrato convertidos em produto por segundo por molécula de enzima

sob condições de saturação; Km é a constante de Michaelis e; E é a razão enantiomérica.

Um valor elevado de E para um dado par enzima-substrato é essencial para o

sucesso de uma resolução cinética, já que isto assegura não apenas um excesso

enantiomérico (ee) elevado, mas também um rendimento proporcionalmente alto. Para

propósitos práticos, um valor de E abaixo de 10 para qualquer processo biocatalítico

torna-o inviável de ser realizado como um processo enantiosseletivo. Por outro lado,

este pode ser considerado bom se estiver situado entre aproximadamente 10 e 30 e,

acima disto, excelente. Valores de E > 200 normalmente podem estar relacionados a

')/(

)/(

smcat

smcat

Kk

KkE

23

incertezas intrínsecas derivadas dos métodos analíticos de determinação do excesso

enantiomérico (por exemplo, RMN, HPLC ou CG), já que para valores de E acima deste

patamar, uma pequena variação no excesso enantiomérico do produto ou substrato

provoca um significativo aumento no valor numérico de E (Costa e Amorim, 1999;

Faber, 1997).

Chen e col. (1982) analisaram o modelo Michaeliano sem reação reversa e foram

os primeiros a encontrar relações úteis entre razão enantiomérica, excesso

enantiomérico (ee) e conversão (X), no estudo de resoluções de racematos.

Suponha que A e B sejam o par enantiomérico, o rápido e o lento,

respectivamente, que competem pelo sítio ativo da enzima. Com base no modelo

mecanístico, considerando A0 = B0 (mistura racêmica, ou seja, 50% de cada

enatiômero), além de reações irreversíveis sem inibição por produto, as equações de

velocidade podem ser escritas como:

A + E EA E+PA

B + E EB E+P

Levando-se em consideração o modelo acima é possível deduzir a equação 2.3, a

qual representa a razão enantiomérica em um processo de resolução enantiosseletiva de

um dado racemato, onde os produtos gerados não interferem na velocidade da reação.

Neste caso, a razão enantiomérica é função apenas de dois parâmetros, logo, ao se

definir dois deles, o terceiro fica determinado (Chen et al., 1982; Straathof e Jongejam,

1997).

))](1).(1ln[(

))](1).(1ln[(

Seec

SeecE

Eq. 2.3

Equação similar (2.4) baseada no excesso enantiomérico em relação aos produtos

também pode ser escrita, de forma que:

))](1.(1ln[

))](1.(1ln[

Peec

PeecE

Eq. 2.4

k2

k-1

k1

k2

k-1

k1

24

Os excessos enantioméricos, mencionados nas equações acima, equivalem a

diferença das frações molares dos enantiômeros da mistura tanto em relação aos

substratos quanto aos produtos, logo, podem ser determinados diretamente na mistura

através de um polarímetro, onde se determina o desvio ótico do par enantiomérico.

Além disso, o uso de CG também é bastante simples, já que a área de cada pico pode ser

relacionada com uma determinada concentração na amostra analisada, permitindo a

determinação dos excessos enantioméricos (Equações 2.5 e 2.6).

)(

)()(

BA

ABSee

Eq. 2.5

Eq. 2.6

Já o valor da conversão pode ser determinado pela equação 2.7:

Eq. 2.7

Outras equações, bem mais complexas podem ser utilizadas a fim de se determinar

E. A equação 2.8 representa outra forma de se obter este parâmetro levando-se em

consideração tanto o excesso do substrato quanto do produto (Straathof e Jongejam,

1997).

)))(/)(1/()(1ln((

)))(/)(1/()(1ln((

PeeSeeSee

PeeSeeSeeE

Eq. 2.8

2.2. Imobilização de enzimas

2.2.1. Aspectos gerais

A crescente utilização de enzimas em processos industriais ocasionou nos últimos

anos um aumento no consumo destas proteínas. Entretanto, nem sempre foi assim, pois

a estabilidade das enzimas era muito baixa, apresentavam um elevado custo e, além

)(

)(1

)()(

0000

00

BA

BA

BA

BBAAc

)(

)()(

BA

BA

PP

PPPee

25

disso, quando incorporadas a um determinado processo industrial geravam um

encarecimento da etapa de separação e concentração (downstrean), visto que eram

utilizadas na forma liofilizada, normalmente. Desta forma, no início dos anos 50 foram

produzidas preparações enzimáticas imobilizadas por inclusão em matrizes poliméricas

e por ligação em suportes (Tischer e Kasche, 1999).

A utilização de enzimas imobilizadas facilitou o desenvolvimento de processos em

escala comercial, visto que são inúmeras as vantagens destas em relação ao uso de

preparações contendo enzimas livres. Dentre as principais vantagens apontadas por

diversos autores (Freire, 1988; Illanes, 1994; Freire et al., 1990; Benjanmin e Pandey,

1998; Villeneuve et al., 2000; Guisan et al., 2001; Mateo et al., 2007) estão:

Facilidade de separação dos produtos. Quando elevado grau de pureza é exigido em

um determinado processo, recomenda-se o uso de enzimas imobilizadas, pois como

mencionado anteriormente, os processos unitários de separação são bastante simples.

Facilidade de recuperação do biocatalisador. A utilização de biocatalisadores

imobilizados facilita as etapas de purificação (downstrean) em um processo, já que as

técnicas empregadas na separação do biocatalisador passam a ser operações unitárias

simples como filtração ou centrifugação dispensando, portanto a realização de

procedimentos de inativação enzimática como desnaturação térmica ou por pH, que

podem levar a alterações indesejáveis do produto final. Já em alguns casos, onde os

biocatalisadores apresentam custo elevado, a imobilização pode tornar o processo

economicamente viável, visto que, o mesmo podem ser reutilizados diversas vezes.

Processo pode ser operado continuamente. Além de reduzir o volume reacional, já que

a enzima pode ser utilizada em maior concentração, e facilitar o controle do processo, a

utilização de biocatalisadores imobilizados também possibilita a implementação de

processos operando de forma contínua através de reatores tubulares (PFR) ou tanques de

agitação (CSTR).

Previne a formação de agregados em meio orgânico. As enzimas livres, quando

suspensas em um solvente orgânico, tendem a se agregar e aderir às paredes do reator,

principalmente, se a água for adicionada a esse sistema. A imobilização de enzimas

sobre suportes sólidos pode contornar esse problema.

26

Manutenção de micro-ambiente com elevada atividade de água. A imobilização

permite a manutenção de uma camada de solvatação no micro-ambiente em torno da

enzima capaz de manter uma dinâmica molecular mínima, essencial à atividade

enzimática em ambientes orgânicos.

Estabilização da enzima. A imobilização da enzima sobre diferentes suportes pode

aumentar a rigidez da estrutura molecular minimizando a ocorrência de desnaturação

por temperatura, pH ou solvente. Além disso, a reação pode ser interrompida a qualquer

momento, ou seja, quando se atinge um determinado grau de conversão.

Propriedades enzimáticas podem ser alteradas favoravelmente. A interação entre a

enzima e o suporte pode ocasionar mudanças conformacionais na enzima provocando

alterações desejadas nas propriedades catalíticas, como por exemplo, o aumento da

atividade e estereoespecificidade da enzima.

Custos com manejo de materiais são minimizados. O aumento da estabilidade da

enzima imobilizada facilita a sua estocagem e diminui as exigências para sua

manipulação.

Com o advento da técnica de imobilização, vários processos, antes inviáveis,

foram reavaliados. Segundo Kourkoutas e col. (2004), as técnicas de imobilização

podem ser divididas diferentes categorias baseadas no mecanismo empregado (Figura

2.11): (a) fixação ou adsorção em superfícies sólidas, (b) oclusão em matrizes porosas,

(c) floculação natural ou ligação cruzada através de agentes artificiais, e (d) contenção

através de barreiras, como, por exemplo, membranas.

27

Figura 2.11: Diferentes técnicas de imobilização (Kourkoutas et al., 2004).

Fixação ou adsorção em superfícies sólidas

Consiste na fixação do biocatalisador a um suporte insolúvel em água através de

adsorção física (interações hidrofóbicas), forças eletrostáticas ou por ligações

covalentes. A seleção do suporte depende da natureza própria da enzima, assim como

de:

Tamanho da partícula

Área superficial

Razão molar entre grupos hidrofílicos e hidrofóbicos

Composição química

Os materiais utilizados como suporte podem ser orgânicos ou inorgânicos sendo

os mais comuns a sílica, alumina, carvão ativado, diversos polissacarídeos, além dos

polímeros naturais, como o agar, e sintéticos, como o poli-óxido etileno (PEO).

Oclusão em matrizes porosas

Esta técnica baseia-se fundamentalmente na retenção de enzimas no interior de

uma matriz polimérica de modo a impedir a sua liberação para o meio, permitindo

apenas a difusão de substratos e produtos. Neste processo não há nenhum tipo de ração

envolvida, pois a enzima ou célula é somente retida fisicamente, não sofrendo qualquer

28

tipo de modificação estrutural, pois está protegida por polímeros de elevada massa

molar.

Floculação natural ou ligação cruzada através de agentes artificiais

A floculação natural ou agregação é definida por muitos autores como um

aglomerado de células ou proteínas (enzimas) que se juntam para a formação de

unidades maiores. Nesta técnica não há adição de qualquer agente externo, e os

agregados são gerados através de adesão natural. Está técnica é muito utilizada em

reatores do tipo leito fluidizado, leito empacotado e CSTR.

Na floculação artificial, ou reticulação cruzada (cross-linking), as enzimas formam

agregados através de reações com agentes bifuncionais, sendo o gluteraldeído o mais

comum. Os dois grupos aldeídicos do gluteraldeído formam base de shiff com os

resíduos de aminoácidos livres da enzima, formando uma rede de ligação cruzada .

Contenção através de barreiras

A contenção de enzimas através de barreiras pode ser alcançada utilizando-se

filtros de membranas microporosas, por confinamento em microcápsulas ou através de

sistemas bifásicos, onde se gera uma interface para atuação enzimática. A tecnologia de

reatores com membranas vem sendo amplamente utilizado em processos contínuos para

separação de misturas racêmicas.

Inicialmente reatores de membrana foram utilizados em reações de hidrólise de

óleos, visto que a glicerina gerada é obtida na fase hidrofílica e os ácidos graxos na fase

hidrofóbica. Hoq e col. (1985) estudaram a hidrólise enzimática do óleo de oliva em um

reator de membranas hidrofóbicas contendo lipases imobilizadas via adsorção

hidrofóbica. A enzima foi adsorvida na superfície da membrana em contato com a fase

aquosa enquanto que o óleo foi continuamente recirculado pelo outro lado. Neste caso,

além de servir como um suporte de imobilização a utilização do sistema proposto evitou

a formação de emulsão.

Merçon e col. (2000) hidrolizaram óleo de babaçu em um reator de membranas

planas contendo a lipase imobilizada por adsorção física.

29

Hilal e col. (2006) utilizaram reator de membrana contendo lipases imobilizadas,

tanto por adsorção física quanto através de ligação covalente, na esterificação do ácido

oléico com n-butanol.

Wang e col. (2007) utilizaram um reator de membranas compostas de acetato de

celulose e politetrafluoretileno, contendo enzimas imobilizadas na separação do

ibuprofeno através de uma reação de hidrólise.

Balcão e Malcata (1998) relataram mudanças ocorridas na composição em ácidos

graxos da manteiga submetida à acidólise com ácido oléico através da utilização da

lipase comercial Mucor javanicus, imobilizada por adsorção física em membrana fibra

oca hidrofóbica, a 40 ºC e sob condições reacionais com atividade de água controlada.

O principal objetivo dessa pesquisa foi aumentar o nível de ácidos graxos insaturados da

manteiga e reduzir, concomitantemente, o nível de ácidos graxos saturados de cadeia

média e longa (láurico e mirístico). Com a hidrólise, observou-se na manteiga

modificada um aumento de 30% m/m de ácido oléico e redução de 8 e 2% para os

ácidos graxos láurico e mirístico, tendo em vista a composição original da manteiga.

Na Tabela 2.3 modificada de Kennedy e Cabral (1987) é possível verificar as

comparações entre os diferentes métodos de imobilização enzimática.

Tabela 2.3: Comparação entre os diferentes métodos de imobilização enzimática

(Kennedy e Cabral, 1987).

Características Adsorção Ligação

covalente

Ligação

iônica

Ligação

cruzada Oclusão Membranas

Preparação Simples Difícil Simples Intermediária Difícil Simples

Custo Baixo Elevado Baixo Intermediário Moderado Elevado

Força de ligação Variável Forte Intermediária Forte Fraca Forte

Aplicabilidade Vasta Seletiva Vasta Pouca Vasta Vasta

Estabilidade da

enzima imobilizada Baixa Alta Intermediária Alta Alta Alta

Barreiras difusionais Não Não Não Sim Sim Sim

O processo de imobilização normalmente ocasiona modificações nas propriedades

físico-químicas da enzima com consequente alteração na estabilidade e nas propriedades

30

cinéticas. Os principais aspectos a respeito desses efeitos são discutidos abaixo

(Freire,1988):

Efeitos conformacionais. São efeitos associados às modificações conformacionais da

proteína em virtude das interações entre a enzima e o suporte, tal como, o enrijecimento

da estrutura protéica durante o processo de imobilização covalente.

Efeitos esteroquímicos. Hidrofobicidade, constante dielétrica e a presença de cargas

fixas no suporte são características que podem interferir diretamente no desempenho do

biocatalisador, gerando efeitos de exclusão, ou seja, certas regiões da enzima tornam-se

pouco acessíveis para o substrato. A utilização de espaçadores entre o suporte original e

a enzima é uma excelente alternativa para minimizar o problema, já que, mantém os

sítios ativos da enzima mais distantes dos efeitos de exclusão do suporte.

Efeitos de partição. São efeitos ocasionados pela diferença de distribuição das espécies

entre o micro-ambiente e seio da fase. Esses efeitos resultam de interações hidrofóbicas,

hidrofílicas e eletrostáticas entre o suporte e o substrato.

Limitações difusionais. Da mesma forma que na catálise heterogênea, a ação catalítica

de enzimas imobilizadas pode ser dividida em no mínimo cinco etapas, a saber:

Difusão externa de substratos: Difusão do substrato do seio da fase líquida até a

superfície do suporte;

Difusão interna de substratos: Transporte do substrato da superfície do suporte para o

domínio da enzima;

Catálise: Reação química propriamente dita;

Difusão interna de produtos: Transporte do produto do domínio da enzima para a

superfície do suporte;

Difusão externa de produtos: Difusão do produto da superfície do suporte para o seio

do meio reacional.

As alterações nas propriedades das enzimas são decorrentes da interação entre os

vários efeitos citados anteriormente (conformacionais, estereoquímicos, de partição e

limitações difusionais). Dependendo do efeito que controla a reação, os parâmetros

31

cinéticos podem ser diferenciados. Esses parâmetros podem ser classificados em três

categorias principais (Freire,1988).

Parâmetros cinéticos intrínsecos. São os parâmetros que refletem o comportamento

cinético verdadeiro da enzima imobilizada. Esses parâmetros só podem ser

determinados no macroambiente caso a concentração de substrato e produto seja a

mesma do micro-ambiente. Devido à existência de efeitos conformacionais e

esteroquímicos, os parâmetros cinéticos intrínsecos da enzima imobilizada podem ser

distintos, e geralmente o são, dos parâmetros para a enzima solúvel.

Parâmetros cinéticos inerentes. Esses parâmetros refletem o comportamento cinético

da enzima na ausência de limitações difusionais e só podem ser determinados quando o

transporte de substratos e produtos ocorrer de forma infinitamente rápida. Essa condição

pode ser alcançada na prática pelo uso de membranas finas, enzimas com baixa

atividade e agitação suficiente do meio reacional. Os parâmetros cinéticos inerentes e

intrínsicos diferem entre si quando o efeito de partição é importante, ou seja, quando a

matriz sólida interage com as espécies solúveis.

Parâmetros cinéticos efetivos. São os parâmetros globais que refletem o

comportamento da enzima imobilizada na presença de efeitos difusionais, de partição,

conformacionais e estereoquímicos. Esses parâmetros são determinados a partir da

velocidade global da reação nas condições experimentais normalmente empregadas.

2.2.1.1. Imobilização de lipases via adsorção por interação

hidrofóbica

Neste método de imobilização, considerado bastante simples e amplamente

utilizado, grupos superficiais do suporte interagem com grupos de superfície da enzima,

através da combinação de interações hidrofóbicas, forças de Van der Waals, atrações

eletróstaticas, pontes de hidrogênio, dentre outras (Fernandez-Lafuente et al., 1998;

Dalla Vecchia et al., 2004). As interações predominantes dependem da natureza

química e propriedades superficiais do suporte e da enzima de trabalho. Embora as

enzimas imobilizadas por esta técnica estejam suscetíveis a uma dessorção, a

32

imobilização por adsorção é uma das técnicas mais empregadas na obtenção de

biocatalisadores insolúveis, haja vista sua maior praticidade e menor custo (Kennedy,

1987). E a maior aplicação de biocatalisadores imobilizados por adsorção encontra-se

em meios orgânicos, onde as enzimas não são solúveis, desfavorecendo a dessorção

(Fernandez-Lafuente et al., 1998).

O processo de imobilização por adsorção consiste no contato de uma solução, de

concentração enzimática conhecida (μg de proteína/mL ou U/mL), com uma dada massa

do suporte em estudo, à temperatura constante. Oliveira e col. (2006) mostraram que o

aumento da concentração inicial de proteína nem sempre melhora a retenção de

atividade do sistema, já que para valores acima de 8,1 mg de proteína/ g de suporte os

autores não observaram nenhum aumento significativo em relação a atividade

hidrolítica, provavelmente pelo fato do suporte ter atingido sua capacidade máxima

adsortiva. Além disso, outra forma de adsorção é a precipitação da lipase sobre a

superfície do suporte através do uso de solventes, como por exemplo, acetona e butanol

(Cunha, 2007).

Na seleção de um suporte para uma determinada aplicação, devem ser analisadas

suas propriedades físicas e químicas, bem como as relativas à possibilidade de

regeneração do material. Assim, o processo de imobilização bem como o uso repetido e

contínuo do biocatalisador, algumas vezes, requer o uso de operações tais como:

filtração, centrifugação e agitação, portanto, o suporte deve ter também boa resistência

mecânica. Outra característica importante é a estabilidade térmica do suporte, pois

dependendo do coeficiente de expansão, pode ocorrer distorção ou destruição do sítio

ativo da enzima sob expansão ou contração, quando submetido à variação de

temperatura (Kennedy et al., 1987). Outras propriedades relevantes são: caráter

hidrofóbico/hidrofílico, área superficial, insolubilidade no meio reacional, boa

permeabilidade, elevada rigidez, forma e tamanhos adequados, resistência ao ataque de

microorganismos, capacidade de reutilização e custo (Dalla-Vecchia et al., 2004).

Assim, levando-se em consideração as propriedades desejadas de um suporte, diversos

materiais podem ser utilizados tais como polietileno, polipropileno, poliestireno, resinas

sintéticas, celulose e sefadex® dentre outros.

33

Considerando as forças envolvidas no processo de adsorção, pode-se inferir que o

sucesso e a eficiência de adsorção de uma enzima sobre um suporte dependem de vários

parâmetros tais como pH, força iônica do meio, natureza do solvente empregado,

relação entre a concentração de enzima e suporte, além das propriedades intrínsecas da

enzima e do suporte empregado (Figura 2.12).

Figura 2.12: Interação entre suporte e enzima (Kennedy, 1987).

O uso de suportes porosos é mais vantajoso em um processo de imobilização, pela

grande área interna disponível para a adsorção enzimática, além disso, a enzima fica

protegida da turbulência externa, entretanto isto pode gerar limitações difusionais, bem

como uma sub-estimativa de atividade, pois a enzima pode estar tão inclusa que não fica

desta forma disponível para atuar.

Vários modelos foram propostos para analisar a adsorção de catalisadores sobre

diferentes suportes, e assim como na cinética heterogênea na cinética enzimática, a

quantidade de enzima adsorvida por quantidade do suporte aumenta com a concentração

do biocalisador. Assim, mantendo-se a temperatura do processo de adsorção constante é

possível gerar as isotermas de adsorção, que normalmente, seguem os modelos de

Langmuir, Freundlich ou a combinação destes (Soares et al., 1999).

No processo de imobilização por adsorção, tanto a quantidade de enzima

adsorvida quanto a orientação em que estas são imobilizadas afetam sua atividade e

34

estabilidade (Nakanishi et al., 2001). Logo, além de avaliar a quantidade adsorvida, é

necessário determinar os valores de atividade recuperada e rendimento obtidos para um

dado processo de imobilização (Gitlesen et al.,1997).

Normalmente por apresentarem caráter mais hidrofóbico, lipases são imobilizadas

em suportes hidrofóbicos quando se opta pelo processo de adsorção física. A presença

de interfaces hidrofóbicas ocasiona mudanças estruturais da lipase, por exemplo, o

fenômeno de ativação interfacial. Sendo assim, a adsorção de lipases sobre suportes

porosos em meios com baixa força iônica ocorre através de grandes bolsos hidrofóbicos,

formados pela face interna da tampa que recobre o sítio ativo e a área hidrofóbica

próxima ao sítio enzima, deslocando o equilíbrio conformacional em direção à forma

aberta (Figura 2.13) (Paiva et al, 2000; Mateo et al, 2007, Almeida et al., 2008). Outra

razão pela qual o emprego de suportes hidrofóbicos é preferível aos hidrofílicos para

imobilização decorre da tendência dos suportes hidrofílicos em competir pela água

disponível no meio reacional (Villeneuve et al., 2000).

Desta forma é possível obter preparações enzimáticas imobilizadas e hiperativadas

que possam atuar sobre pequenos substratos hidrofóbicos solúveis no meio reacional.

Entretanto, o aumento de cadeia e hidrofilicidade de um substrato pode acarretar

impedimento estereoquímico devido à proximidade da superfície do suporte hidrofóbico

em relação ao sítio ativo da lipase, reduzindo a atividade enzimática (Mateo et al., 2007,

Almeida et al, 2008).

Figura 2.13: Imobilização de lipases por adsorção física em suportes hidrofóbicos (Mateo et al.,

2007).

Apesar de dificultar o entendimento e o controle do mecanismo de imobilização, o

fenômeno de ativação interfacial pode ser explorado no desenvolvimento de métodos de

purificação e no aperfeiçoamento dos métodos de imobilização. Pode-se esperar que

35

lipases com pequenas diferenças estruturais reconhecessem de forma distinta uma

mesma superfície hidrofóbica, modificando a taxa e a força de adsorção. Gera-se, desta

forma, a separação ou o enriquecimento de diferentes isoformas por adsorção seletiva

variando as condições experimentais como tempo de equilíbrio, pH, força iônica e

temperatura de equilíbrio da solução. Fibras de agarose recobertas por grupos

hidrofóbicos (butil, fenil ou octil) representam uma interface hidrofóbica na qual lipases

estão aptas a sofrer adsorção interfacial seletiva similar à experimentada por lipases na

presença de gotas de substratos líquidos insolúveis (Sabuquillo et al., 1998; Fernandez-

Lorente et al., 2001, Cunha et. al; 2008).

A técnica de imobilização por adsorção hidrofóbica tem sido extensivamente

utilizada na modificação favorável das propriedades catalíticas e físico-químicas das

lipases. Comercialmente destacam-se: a lipase de Candida antarctica tipo B (CALB)

imobilizada em resina poliacrílica e denominada no mercado pelo nome Novozym 435,

o biocatalisador mais empregado em reações de biotransformação de lipases em meios

aquo-restritos; lipase de Mucor miehei imobilizada em resina de troca aniônica

macroporosa (Lipozyme-IM) quando comercializada pela Novozymes e Chirazyme ao

ser comercializada pela Roche (Christensen et al., 2003). Entretanto, estes

biocatalisadores são de alto custo, associado ao preço das matrizes hidrofóbicas.

A Tabela 2.4 apresenta a hiperativação de lipases de diferentes fontes após o

processo de imobilização em alguns suportes utilizando o palmitato de p-nitro fenila (p-

NPP) como substrato reacional (Bastida et al., 1998; Fernandez-Lafuente et al., 1998;

Cunha et al., 2009).

36

Tabela 2.4: Atividade relativa de lipases imobilizadas sobre suportes hidrofóbicos.

Lipase Suporte Atividade relativa (%)

C. antarctica

C. rugosa

H. lanuginosa

R. miehei

M. javanicus

P. fluorescens

R. niveus

Pancreática de porco

M. miehei

T. thermophilus

P. simplicissimum

P. simplicissimum

P. simplicissimum

Octil-agarose

Octil-agarose

Octil-agarose

Octil-agarose

Octil-agarose

Octil-agarose

Octil-agarose

Octil-agarose

Octadecil-sepabeads

Octadecil-sepabeads

Butil-agarose

Fenil-agarose

Octil-agarose

200

110

2000

700

300

150

600

300

500

400

131

240

1133

A esterase termoestável recombinante oriunda da arquea hipertermófila de

Pyrococcus furiosus também apresentou, após imoblização via adsorção hidrofóbica em

Accurel® EP 100 (polipropileno microporoso), uma melhora significativa em relação a

retenção de atividade (106%). Segundo os autores esta esterase apresenta um número

razoável de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos nas proximidades do sítio ativo que

podem interagir com o suporte, permitindo assim a formação de um ambiente que

envolve a superfície deste suporte, o sítio ativo e o substrato resultando, desta forma, em

uma melhora da eficiência catalítica da esterase (Almeida et al., 2006; Almeida et al.,

2008).

O efeito de solventes polares pode ser prejudicial, mesmo sobre lipases

imobilizadas, podendo haver perda de atividade por desnaturação. Desta forma, para

evitar o contato direto entre a enzima e os solventes, um novo protocolo de imobilização

lipásica foi desenvolvido por Guisán e col. (2001) para aplicações de biocatálise em

meio orgânico. A técnica proposta constituiu da adsorção seletiva da lipase de Candida

rugosa sobre o suporte hidrofóbico octadecil-sepabeads. Após a imobilização

propriamente dita, foi feito o recobrimento da enzima por poli (etileno imina) capaz de

protegê-la dos efeitos deletérios de solventes orgânicos.

37

A Tabela 2.5 apresenta alguns trabalhos desenvolvidos envolvendo imobilização

de enzimas nos últimos anos.

Tabela 2.5: Imobilização de lipases via adsorção física.

Suporte Características do suporte Reação Referência

Polimetil metacriato

Esterificação Basri et al., 1996

Accurel® EP 100

Esterificação Gitlesen et al., 1997

Eupergit C250L

Celite

Octil-silica

Esterificação e hidrólise Ivanov e Schneider,

1997

Octil-sepharose

Agarose octil ligada ao

suporte

Hidrólise enantiosseletiva Sanchez et al., 1999

Óxido de “hidrous

niobium” amorfo

Óxido de “hidrous

niobium” cristalino

Fosfato de zircônio

amorfo

Esterificação Castro et al.., 2000

Accurel® EP 100

Esterificação Persson et al., 2000

Celite 535 Terra diatomácea Hidrólise

Akova e Ustun, 2000

38

Octadecil-sepabeads

Polimetacrilato

funcionalizado com grupo

octadecil

Hidrólise enantiosseletiva

Fernández-Lorente et al.

(2001)

Octadecil Sílica

Imobilização in situ.

Emprego no estudo de

reações enantiosseletivas

Calleri et al., 2003

citado em Cardoso,

2009

MCM-36

Aluminosilicato

Transesterificação Dimitriu et al., 2003

Sílica funcionalizada

Sílica macroporosa

funcionalizada com grupo

octil

Esterificação Blanco et al., 2004

Celulose octato

Celulose palmitato

Terra diatomácea

Vidro octil

Vidro octadecil

Vidro silanizado

Esterificação

Miroslawa et al., 2004

PVA-C12

Polifenilacetileno

Octadecil-sepabeads

Accurel® EP 100

PVA funcionalizada com

ácido láurico

Transesterificação

enantiosseletiva

Panzavolta et al., 2004

Poli-acrilonitrila-co-ácido maleíco Hidrólise Ye et al., 2006

39

DEAE-agarose Agarose funcionalizada com

grupos amino Hidrólise enantiosseletiva Palomo et al., 2005

Membrana de

poliacrilonitrila Hidrólise enantiosseltiva Long et al., 2005

Accurel® MP 1000

Polímero de polipropileno

Esterificação Oliveira et al., 2006

PEI-agarose Agarose recoberta com

polietilenoimina Hidrólise enantiosseletiva Wilson et al., 2006

PEI-agarose Agarose recoberta com

polietilenoimina

Hidrólise enantiosseletiva

Torres, 2006

Celulose

Polisulfona Esterificação Hilal et al., 2006

Accurel® EP 100 Polímero de polipropileno Esterificação Oliveira et al., 2006

Membrana de acetato de

celulose com poli-

tetrafluor etileno

Hidrólise enantiosseletiva Wang et al., 2007

Accurel® EP 100 Hidrólise

Almeida et al., 2008

Octadecil-sepabeads

Octil-agarose

Hidrólise

Cunha et al., 2008

Octil-agarose

Hexil-toyopearl

Octadecil-sepabeads

Poli-hidroxibutirato

(PHB)

Etanólise do óleo de babaçu Mendes, 2009

40

Membrana de

poliacrilonitrila Transesterificação Sakai et al., 2010

Fibra de coco Hidrólise Brigida, 2010

Suporte com ácido

fenilboroníco e grupos

aldeídos

Hidrólise Gutarra et al., 2011

A imobilização seletiva de enzimas é muito importante no desenvolvimento de

biossensores, kits imunológicos e colunas cromatográficas. Questões como velocidade

de adsorção, as forças motrizes responsáveis pela imobilização e as mudanças

conformacionais são fatores de extrema importância para a determinação da quantidade

de proteína que se adsorve em um determinado suporte, principalmente para que não

haja perda de enzima (Pancera, 2006).

A adsorção pode ser avaliada quantitativamente através de isotermas, as quais

mostram a relação existente entre a concentração das lipases em solução após o

equilíbrio e a concentração das mesmas adsorvida nos suportes numa mesma

temperatura. O equilíbrio da adsorção de lipases em suportes com diferentes graus de

hidrofobicidade pode ser descrito por modelos de equilíbrio clássicos, que

correlacionam matematicamente as quantidades adsorvidas em equilíbrio com o meio

circundante, tais como: Langmuir, Langmuir multicamada, Freundlich ou ainda

Redlich-Kwong (Al-Duri e Yong, 2000). Entretanto, devido à natureza complexa das

biomoléculas, o desenvolvimento de um mecanismo geral para descrever a adsorção das

mesmas sobre suportes sólidos não é uma tarefa trivial e nenhum dos modelos acima

citados foi capaz de explicar todos os resultados encontrados na literatura (Pancera,

2006). Cabe dizer que o modelo que melhor descreve o equilíbrio de adsorção

dependerá da interação enzima-suporte (Sharma & Agarwal, 2001b).

2.2.1.1.1. Modelo de Langmuir

A isoterma de Langmuir é capaz de descrever o comportamento de adsorção de

várias substâncias e diversos pesquisadores já demonstraram isso. Este tipo de isoterma

41

foi inicialmente desenvolvida para descrever a adsorção de gases e é descrita pela

equação 2.9 (Al-Dury e Yong, 2000).

O modelo baseia-se nas seguintes premissas: (i) a adsorção não excede uma

monocamada, (ii) todos os sítios de adsorção são equivalentes e a superfície do

substrato é uniforme (perfeitamente plana em escala microscópica), (iii) uma molécula

de adsorbato pode interagir somente com um sítio de adsorção e (iv) as moléculas

adsorvidas não interagem entre si.

*

*

max*

.1

..

CK

CKQQ

A

A

Eq. 2.9

C* é a concentração da espécie em solução que está em equilíbrio com a fração adsorvida Q*(mg de

proteína/g de suporte), KA é a constante de equilíbrio da reação de adsorção e Qmax é a máxima

capacidade de adsorção.

2.2.1.1.2. Modelo de Langmuir multicamada

Muitas vezes diversas proteínas apresentam processos de adsorção que não são

completamente descritos pelo modelo de Langmuir monocamada, pois há interação

entre as moléculas, ocasionando a geração de multicamadas. A equação 2.10 descreve

esse modelo.

**

max*

.).(.2)/1(

.

CKKKKKC

KQQ

AAAAAAAA

A

Eq. 2.10

Onde os parâmetros são os mesmos da isoterma de Langmuir, porém essa isoterma

apresenta um parâmetro a mais, o KAA que descreve a interação entre as moléculas de

adsorvato, de forma que, quando todos os sítios de adsorção são saturados, outras

camadas são formadas (Castilho, 2001).

2.2.1.1.3. Modelo de Freundlich

A isoterma de Freundlich corresponde a adsorção em sítios não uniformes. Neste

caso, calor de adsorção freqüentemente diminui com o aumento da cobertura na

42

superfície. A falta de uniformidade pode existir previamente nos diferentes sítios de

adsorção ou ser causada pelas forças repulsivas entre os átomos ou moléculas

adsorvidas. A equação 2.11 descreve matematicamente esta isoterma.

nCKQ ).( ** Eq. 2.11

K é a constante da isoterma de Freundlich e n é um índice desta isoterma (determinado

experimentalmente).

Embora normalmente aplicado num sentido estritamente empírico, isto pode ser de

interesse teórico em termos de adsorção em superfície energeticamente heterogênea.

Como o montante de adsorção aumenta indefinidamente, a isoterma de Freundlich

apresenta como incoveniente o fato de não prever a capacidade máxima de adsorção

(Sharma & Agarwal, 2001a).

2.2.1.1.4. Modelo de Langmuir-Freundlich

Outra aproximação para explicar a natureza heterogênea das interações entre a

proteína e o adsorvente envolve a equação (2.12).

n

D

n

CK

CQQ

)(

).(*

*

max*

Eq.2.12

KD é a constante de dissociação aparente que inclui contribuições de ligações entre ligante e forma

monomérica, n é o coeficiente numérico de Langmuir - Freundlich.

A inclusão do terceiro parâmetro “n”, a ser ajustado, permite que esta equação

possa representar melhor a natureza heterogênea da adsorção e as interações

cooperativas, uma vez que o coeficiente “n” é classicamente um indicativo do tipo de

cooperatividade presente no mecanismo de adsorção. Quando n=1, não há

cooperatividade entre as proteínas, ou os sítios são independentes. Para n>1, uma

cooperatividade positiva é sugerida e quando 0 < n < 1, uma cooperatividade negativa é

atribuída ao processo (Sharma & Agarval, 2001a). O valor de n pode, assim, ser

empregado como um coeficiente empírico, representando o tipo e a extensão da

presente cooperatividade na interação.

43

2.2.1.2. Imobilização de lipase via Ligação Covalente

A utilização de proteínas imobilizadas covalentemente teve início no final da

década de 50, sendo que a técnica foi originalmente desenvolvida para auxiliar na

elucidação da estrutura de proteínas. Desde o final da década de 70, diversos trabalhos

vêm utilizando esta técnica de imobilização a fim de alterar e melhorar as propriedades

da lipase nativa (Matsushima et al., 1996). A ligação covalente em uma matriz baseia-se

na retenção da enzima à superfície do suporte através de ligações covalentes entre

grupos funcionais presentes na enzima (Tabela 2.6) e na superfície do suporte (Cunha et

al., 2009; Brigída, 2010).

Tabela 2.6: Grupos funcionais presentes na enzima disponíveis para ligação covalente com um dado

suporte (Brígida, 2010)

-NH2 T-amino de L-lisina e grupamento amino N-terminal

-SH Tiol de L-Cisteína

-COOH Carboxila de L-aspartato e L-glutamato e grupamento carboxílico

C- terminal

Grupamento fenólico de L-Tirosina

-S-S- Pontes dissulfídicas de L-cisteína

CH3-S- Tioéter de L-metionina

-CH2-OH Hidroxíla de L-serina e L-treonina

Imidazol de L-histidina

-NH-C(N2H3) Guanidino de L-arginina

A imobilização por esta técnica é dividida em duas etapas: i. funcionalização do

suporte, a fim de torná-lo apto a ligar-se covalentemente à enzima e ii) contato enzima-

suporte para que a reação ocorra. As características do suporte definem os

44

procedimentos a serem adotados na primeira etapa do processo de imobilização. A

presença de grupos hidroxilas, aldeídos e/ou grupos carboxilas, por exemplo, vai definir

o tipo de ativação possível de ser realizada e/ou grupamento ligante a ser adicionado.

A ativação do suporte com glutaraldeído gera grupos aldeídos que irão reagir com

os grupos aminos da enzima por meio de ligações covalentes instáveis (base de Schiff)

como mostra a Figura 2.14.

Figura 2.14: Exemplo da formação de base de Schiff utilizando suportes aminopropilados para

imobilização covalente, usando o glutaraldeído como agente de ativação (Cardoso, 2009).

Embora seja um método mais complexo e de maior custo operacional, algumas

vantagens podem ser citadas, dentre elas: grande força de ligação com conseqüente

estabilização do complexo enzima-suporte (evita o fenômeno de dessorção); pode-se

obter elevada atividade enzimática após a imobilização e, além disso, a modificação

conformacional sofrida pela enzima pode ser favorável (alteração das faixas de

temperatura e pH ótimos), embora a alteração de sua estrutura normalmente possa gerar

uma redução de atividade catalítica. Porém, é essencial que as condições usadas para a

formação das ligações covalentes sejam brandas para evitar perda da atividade catalítica

e o sítio ativo também deve permanecer livre de ligações covalentes e assim é às vezes

protegido por um substrato ou composto análogo durante o processo de imobilização.

Após a imobilização e bloqueio dos grupos ativos remanescentes no suporte, as

moléculas de enzima tornam-se ligadas ao suporte de forma bem definida e estável sem

que ocorra desligamento nem interação adicional enzima-suporte. Além disso, a

imobilização por esta técnica também pode ser utilizada como ferramenta na engenharia

de proteínas, como, por exemplo, estabilização de enzimas monoméricas por

imobilização covalente multipontual e estabilização de enzimas oligoméricas por

imobilização das sub-unidades (Guisán et al., 2001; Cardoso, 2009).

As enzimas necessitam de uma pequena quantidade de água para reter sua

estrutura tridimensional ativa, mesmo quando estão ligadas covalentemente a um

suporte, pois a água contribui para sua integridade estrutural, polaridade do sítio ativo e

estabilidade da enzima, além de limitar a solubilidade dos substratos hidrofóbicos em

45

torno da enzima (Dalla-Vecchia et al., 2004). Assim, quando a utilização da enzima

covalentemente imobilizada é feita em sistemas com baixa atividade de água, o solvente

penetra dentro da estrutura porosa do suporte e as moléculas de lipase sofrem ativação

interfacial sobre a interface do solvente. Neste caso, a imobilização covalente se torna

uma técnica adequada para uma correta elucidação da interação entre a lipase e a

interface do solvente, sem que ocorram interações adicionais entre proteína-proteína e

proteína-suporte (Fernadez- Lafuente et al., 1998).

Bruno e col. (2004) imobilizaram via ligação covalente a enzima de Mucor miehei

em membranas de Nylon através da ativação com glutaraldeído. Segundo os autores

bons resultados fora obtidos na reação de hidrólise do p-nitrofenolpalmitato (pNPP),

entretanto os mesmos não dosaram a atividade real do suporte, gerando desta forma, um

grande erro de análise.

Torres e col. (2006) imobilizaram a enzima proveniente de Candida antarctica em

suporte de brometo cianogênico (CNBr) a fim de efetuar a hidrólise enantiosseletiva do

éster derivado do (R,S) ácido mandélico.

Gutarra e col. (2011) imobilizaram a lipase de Candida antarctica Fração B (gen

sintético) expressa em Pichia pastoris em um novo suporte heterofuncional composto

de ácido fenilboroníco e grupos aldeídos. Segundo os autores o biocatalisador gerado

foi muito estável na presença de elevadas quantidades de solvente e alta temperatura

(50°C). Além disso, os autores verificaram melhora de pelo menos 5 vezes em relação a

atividade enzimática específica quando compararam este método de imobilização com o

tradicional método de ligação covalente. Um ee(P)= 89 % pelo enantiômero R foi

obtido quando efetuou-se a hidrólise enantiosseletiva do (R,S) mandelato de metila com

este novo biocatalisador.

Tan e col. (2002) obtiveram monoglicerídeos (MAG) por hidrólise do óleo de

palma utilizando lipases imobilizadas em membranas de quitosana (QTS), poli-álcool

vinílico (PVA) e QTS/PVA, utilizando glutaraldeído ou epicloridrina como agente “de

ligação cruzada”. A lipase de Rhizopus oryzae imobilizada na membrana QTS/PVA foi

mais ativa na reação de hidrólise, quando comparada com as de QTS e PVA. Os

rendimentos de MAG foram de 35-52%.

46

2.3. Reatores Multifásicos

A seleção do reator mais apropriado para um dado bioprocesso depende das

características da bioconversão (propriedades dos substratos/produtos), limitações

reacionais (pH, temperatura, controle de atividade de água), cinéticas (inibição por

substrato e/ou produtos) e do próprio biocatalisador (interações com o meio reacional),

pois o conjunto destas informações determina o modo de operação e as características

do fluxo (Figura 2.15) (Aires-Barros, 2007).

Figura 2.15: Seleção de reatores multifásicos (Aires-Barros, 2007).

De uma maneira geral, os requisitos essenciais para a seleção do reator mais

apropriado para uma dada bioconversão são uma área interfacial elevada, de modo a

permitir uma transferência adequada de substratos/produtos através da interface e

produtividade volumétrica no reator (Aíres-Barros, 2007).

Dentre os reatores usados em sistemas multifásicos destacam-se os agitados

mecanicamente (contínuos ou descontínuos), os de membrana (também chamados de

contactores), leito fixo e os reatores agitados por uma fase líquida.

Quando se opta por sistemas onde o catalisador é biológico, como por exemplo,

enzimas, a escolha do reator deve levar em consideração as seguintes proposições:

modo de operação: descontínuo (mais barato e de multiuso) e contínuo (mais

caro e desenhado para um processo específico);

Características da Bioconversão

Propriedades do

Biocatalizador

Limitações

reacionais

Limitações

cinéticas

Modos de

operação

Características do

fluxo

Seleção do reator

47

custo do biocatalisador frente ao custo total do processo;

estabilidade da enzima ao longo do processo;

requisitos operacionais, a saber, possibilitar pleno controle do pH e da

temperatura, permitir operar em concentrações não inibitórias de substrato, ser

adequado frente às características da matéria-prima (por exemplo, o reator

contínuo de leito fixo pode ser inadequado se a matéria-prima a ser

processada contiver sólidos insolúveis);

permitir a substituição do catalisador desativado sem interrupção do processo

(por exemplo, o reator continuamente agitado é muito versátil nesta situação).

2.3.1. Contactores de membrana

Em qualquer processo biotecnológico é importante conhecer tanto o biocatalisador

e seu mecanismo de atuação, como a separação dos bioprodutos gerados. Normalmente

o mecanismo de atuação está associado à atividade do biocatalisador e, portanto, a

quantidade de produto gerada, enquanto que as etapas de separação com a pureza do

produto.

A maior parte das reações enzimáticas, em geral, são conduzidas em reatores

simples operando em batelada, com controle de temperatura e eventualmente de pH. No

final da reação, antes da recuperação do produto desejado, em geral, a enzima é

inativada, ocasionando um aumento no custo total do processo (Rios et al., 2004). Esta

forma de operação dos biorreatores apresenta uma série de desvantagens como: baixa

produtividade, altos custos de funcionamento, inativação enzimática, grande

variabilidade de produtos, formação de emulsões, espuma, dentre outras (Rios et al.,

2004; Gabelman et al., 2006).

Uma alternativa tecnológica para contornar estes problemas é a separação

contínua dos produtos durante a reação. Entretanto, dependendo do sistema reacional, o

modo de conduzir a separação pode ser a etapa limitante. Neste sentido, a utilização dos

processos de separação com membranas tem sido apontada como uma forma eficiente

de remover os produtos com mínima alteração das condições reacionais.

Em sistemas reacionais bifásicos solvente-água, por exemplo, a membrana pode

atuar como uma barreira seletiva, confinando a enzima e permitindo a permeação de

apenas um componente, normalmente o produto, o que aumenta a eficiência da reação e,

48

ao mesmo tempo, possibilita a separação e purificação do produto (Trusek-Holownia e

Noworyta, 2002; Hilal et al., 2006). Neste tipo de sistema as membranas são utilizadas

em módulos denominados como contactores. A força motriz para permeação é gerada

pelo grandiente do potencial químico através da membrana, que pode ser obtido por

uma diferença de concentração, pressão, campo elétrico, dentre outras.

O contato não dispersivo de duas fases através de um contactor é uma alternativa

tecnológica que também oferece substancialmente mais área interfacial por volume,

quando comparada com outras operação de separação mais convencionais. Eficiências

elevadas podem ser alcançadas usando a configuração adequada para a membrana,

como por exemplo, fibras ocas ou membranas planas. As fases circulam em lados

opostos da membrana e o contanto interfacial entre estas fases é obtido na entrada de

cada poro (Gabelman et al., 2006). A Figura 2.16 representa um contactor com

membranas na forma de fibras ocas, comercializado pela CELGARD LLC, mais

conhecido como Liqui-CelTM

.

Figura 2.16: (a) Contactor de membrana de fluxo paralelo comercializado pela CELGARD LLC (b) Esquema

básico de funcionamento de um contactor e (c) Geração da interface nos poros da membrana (Gabelman et al.,

1999).

Além deste tipo de módulo não estar sujeito à formação de emulsão e espuma,

visto que não há dispersão líquido-líquido, não é necessário que os líquidos

(a)

(b)

(c)

49

apresentem densidades diferentes, condição necessária quando se trabalha com

coluna ou torre, ampliando, assim, a faixa de operação do sistema. Os contactores

vêm sendo utilizados para extração e recuperação de poluentes orgânicos, proteínas,

produtos farmacêuticos e produtos de fermentação voláteis e não voláteis (Bothun et

al., 2003). Além disso, os contactores possibilitam operação em condições assépticas

e também ser utilizados em processos fermentativos (Gabelman et al., 1999).

Industrialmente a separação dos produtos, bem como a recuperação e reuso de

catalisadores da mistura reacional, constitui uma etapa de grande importância

econômica do processo (Prazeres e Cabral, 1994 citado em Moura et al., 2007).

Assim, processos enzimáticos conduzidos através do contato não dispersivo em

contactores com membranas aumentam a atratividade econômica do processo, pois

possibilitam a utilização da enzima livre ou imobilizada nos poros da membrana (a

escolha depende da

atividade desejada no volume reacional), retenção e reuso do catalisador, redução da

inibição por substrato e/ou produto, purificação simultânea com a síntese do produto,

controle das propriedades de produto através da enzima (especificidade) e/ou

membrana (seletividade) e possibilidade de integração com outros processos dentro

de uma planta industrial (Rios et al., 2004; Prazeres e Cabral, 1994 citado em Moura

et al., 2007; Wang et al., 2007).

Além das vantagens mencionadas anteriormente, a utilização de contactores

torna-se ainda mais vantajosa, visto que o sistema opera de forma contínua e o

escalonamento é simples e fácil através da adição de outros módulos. É também de

extrema importância mencionar que por não apresentarem partes móveis, a limpeza e

manutenção destes módulos ficam facilitadas, além de que, quando se trabalha com

solventes muito voláteis, o uso destes módulos minimiza a perda dos mesmos

(Gabelman et al., 1999).

As membranas de ultrafiltração apresentam distribuição de tamanho de poros

entre 1 a 100 nm, correspondendo a retenções de compostos com massa molar entre

500 a 100.000 Da, respectivamente, e são mais adequadas para retenção da maioria

das enzimas, nativas ou modificadas. O limite de exclusão de massa molar de uma

membrana é dado pela massa molar da menor molécula retida em pelo menos 90%

pela membrana (Prazeres e Cabral, 1994 citado em Moura et al., 2007).

50

A seleção da membrana a ser utilizada em reatores enzimáticos deve levar em

consideração o tamanho da enzima (geralmente apresentam massa molar entre 10 e

80kDa,), substratos e produtos, bem como a natureza química das substâncias e do

material da membrana, já que seletividade em relação às várias substâncias no meio

reacional, em um contactor, depende do tamanho relativo entre as moléculas e os

poros da membrana (Rios et al., 2004; Prazeres e Cabral, 1994 citado em Moura et

al., 2007). Um importante parâmetro a ser utilizado nesta seleção é o coeficiente de

rejeição de solutos, que idealmente deve ser zero para o produto e 100% para a

enzima, permitindo completa retenção do catalisador no sistema reacional (Prazeres e

Cabral, 1994 citado em Moura et al., 2007).

Na última década, imobilização de enzimas, em especial, lipases, na superfície

ou dentro dos poros de membranas semi-permeáveis tem despertado o interesse de

diversos grupos de pesquisas.

Enzimas imobilizadas em reatores de membranas operam simultaneamente

como um suporte catalítico e barreira seletiva. Além disso, estabilidades mais

elevadas e maior resistência a solventes orgânicos são obtidas ao se optar em

trabalhar com a enzima imobilizada (Molinari et al., 1994; Giorno et al., 1997; Rios

et al., 2004). As características inerentes aos contactores com membranas os tornam

como excelentes ferramentas para a separação via enzimática de misturas racêmicas,

já que a enzima apresenta melhor desempenho no meio reacional (solvente/tampão,

por exemplo) livre da geração de uma emulsão.

Apesar das inúmeras vantagens mencionadas anteriormente, os contactores de

membranas introduzem outra resistência à transferência de massa, a resistência da

própria membrana. Além disso, membranas estão sujeitas a incrustações e podem ter

vida útil limitada, o que aumenta os custos operacionais. Estes módulos também

estão sujeitos a diminuição de eficiência, devido a heterogeneidade da reação no seio

e na superfície da membrana, variação da concentração dos componentes do sistema

reacional na superfície da membrana e decaimento da atividade enzimática ao longo

do tempo (Gabelman et al., 1999; Rios et al., 2004; Kneifel et al., 2006).

Um outro problema, também relacionado a estes módulos, muito comum na

escala de laboratório, é o adesivo utilizado na colagem das fibras ocas ser atacado

por solventes químicos e interferir diretamente no processo (Gabelman et al., 1999).

51

2.3.1.1. Transferência de massa em contactores de

membranas

O decaimento do fluxo é o maior problema em muitos processos com membranas,

como osmose inversa e ultrafiltração. Nestes processos, o fluxo decai quando a

resistência ao transporte aumenta e isto, normalmente, é causado pelo acúmulo de

material retido próximo da superfície ou dentro da própria membrana (Mavroudi et al.,

2003). Assim, tem-se utilizado o modelo de resistência em série para analisar o

decaimento do fluxo devido à formação de incrustações na membrana, que pode gerar

tanto um bloqueio reversível como irreversível (Mavroudi et al., 2006). A Figura 2.17

representa um o perfil de concentração do soluto em uma extração líquido-líquido em

um contactor de membrana hidrofóbica.

Figura 2.17: Perfil de concentração de um dado soluto para uma

membrana hidrofóbica. Onde: 1: Membrana hidrofóbica, 2: Fase

orgânica, 3: Fase aquosa e 4: Poros da membrana. (adaptado de

Galbeman et al., 1999).

52

2.3.1.1.1. Equações para transferência de massa em contactores de

membranas

De acordo com o modelo de resistência em série, um determinado soluto encontra,

pelo menos, três resistências a sua passagem de uma fase para outra: a camada limite da

fase aquosa, a membrana e a camada limite da fase orgânica (Gabelman et al., 1999). O

modelo de resistência em série é baseado nas seguintes suposições: (i) Os dois fluidos

são imiscíveis, (ii) existe equilíbrio na interface líquido/líquido, (iii) transferência de

massa pode ser descrita pela teoria do filme, (iv) o coeficiente de partição é constante ao

longo de toda a faixa de condições investigadas, (v) o sistema encontra-se em estado

estacionário, (vi) a curvatura da interface líquido/líquido não afeta significativamente a

taxa de transferência de massa, o equilíbrio de distribuição de soluto ou a área

interfacial e (vii) transporte de soluto não ocorre através das partes não porosas da

membrana. (Bothun et al., 2003; Gabelman et al., 1999). Os coeficientes de

transferência de massa global e individual podem ser determinados experimentalmente.

Assim, por exemplo, para membranas hidrofóbicas, com a fase orgânica escoando

do lado externo das fibras e sem reação química, podemos escrever duas equações

distintas relacionando os coeficientes de transferência de massa global e os relativos a

cada fase, baseadas na utilização da força motriz a partir da concentração da fase

orgânica, Eq. (1.13) ou da concentração da concentração da fase aquosa, Eq. (1.14).

Eq.1.13

Eq.1.14

Onde: K é o coeficiente de transferência de massa global baseado na concentração da fase orgânica

(o) e na concentração da fase aquosa (w), m/s; β é o coeficiente de transferência de massa individual

associado com a fase aquosa (w), com a fase orgânica (o) e com a membrana (m), m/s. O termo d

refere-se ao diâmetro interno (i), externo (e) e a média logarítmica (lm) da fibra, m.

O coeficiente de partição, mi é definido na interface de acordo com a seguinte

relação de equilíbrio:

mlmi

i

Oei

i

wW dm

d

dm

d

K

11

mlm

i

oe

i

w

i

d

d

d

dm

K

0

1

53

Eq.1.15

Cio e Ciw são as concentrações em gmol/m3 de soluto na fase orgânica e aquosa, respectivamente.

As equações (1.13) e (1.14) são utilizadas quando a transferência de massa é

limitada pela fase orgânica (mi << 1) e pela fase aquosa (mi >>1), respectivamente

(Bothun et al., 2003). Quando a membrana é hidrofílica e a fase aquosa percola o

interior das fibras, sem reação química, equações similares às equações (1.13) e (1.14)

podem ser escritas.

É importante mencionar que apesar de os modelos apresentados até o momento

serem para um contactor de membranas do tipo líquido-líquido, o processo para um

contactor gás-líquido é análogo se o coeficiente de partição for substituído pela

constante da lei de Henry (Gabelman et al., 1999).

Em um contactor com membranas há variação da concentração das espécies ao

longo do sentido do escoamento. Neste caso, o fluxo das espécies i (J i em g/m2.s)

através da membrana pode ser definido segundo a equação (1.16) e pode ser relacionado

com o coeficiente global de transferência de massa pela equação (1.17).

Eq. 1.16

Eq. 1.17

Onde: Qaq é a vazão volumétrica de alimentação da fase aquosa, m3/s; ρF é a densidade da

alimentação, g/m3; C representa a concentração do soluto i (fração massa) na alimentação (f) e

permeado (r), e A é a área interfacial de contato, m2. ΔClm é a média logarítmica das

concentrações, que pode ser determinada através da equação (1.18):

Eq. 1.18

Os subscritos 1 e 2 referem-se as extremidades do módulo, e:

Eq. 1.19

iwii CmC *0

A

CCQJ

iriofFaq

i

)( ,,

)ln(

)(

2

1

21

i

i

ii

lm

C

C

CCC

lmi CKJ .

0iiwii CCmC

54

Trusek-Holownia e Noworyta (2004) utilizaramum contactor com membranas

planas e as equações para a determinação do coeficiente de transferência de massa, para

sistemas com membranas hidrofóbicas e hidrofílicas, respectivamente, foram re-escritas

como:

Eq. 1.20

Eq. 1.21

km é o coeficiente de transferência de massa na membrana, m/s, definido pela relação 1.22.

Eq. 1.22

Onde DF é o coeficiente de difusão do soluto na fase orgânica ou aquosa, m2/s; κ é a

tortuosidade e dm é a espessura da membrana, m.

Os coeficientes de transferência de massa nas fases orgânica e aquosa podem ser

determinados experimentalmente ou estimado através das equação de Sherwood,

conforme apresentado nas equações (1.23) e (1.24):

Gr > 11 Eq. 1.23

Gr < 11 Eq.1.24

ShF: número de Sherwood; Gr: número de Grashov (=Razão entre empuxo e forças viscosas ); b: largura

do canal no módulo; sub-índice F representa qualquer uma das duas fases.

2.3.2. Aplicações dos contactores de membrana

Algumas aplicações especiais dos contactores de membrana como destilação por

membrana ou evaporação osmótica são descritas e estão sendo bastante estudadas na

literatura, tais como concentração de suco, sistemas de desumidificação de ar e

55

oxigenação de meio de cultivo (Kronenberger et al., 2008; Albrecht et al., 2005). De

acordo com Gabelman e Hwang (1999) contactores de membrana podem ser utilizados

para: extração líquido/líquido simples, absorção de gás e degaseificação (stripping),

extração de gás denso, separações quirais, fermentações e transformações enzimáticas,

extração de proteínas, tratamento de água, extração de metais e semicondutores,

separações quirais.

2.3.2.1. Extração líquido/líquido

O sistema de contato líquido/líquido via uma membrana porosa é utilizado com

sucesso para uma ampla faixa de valores para os coeficientes de partição usando

diferentes geometrias e materiais de membrana, além de configurações de fluxo

distintas. Neste processo, diversos fatores determinam qual o líquido que passará pelo

lado externo ou interno das fibras. Por exemplo, o lado externo das fibras esta sujeito à

formação caminhos preferenciais, o que reduz a eficiência de extração do soluto contido

na alimentação. Além disso, é muito difícil obter um elevado grau de extração quando o

soluto é alimentado pelo lado externo das fibras.

Na maior parte das aplicações da extração líquido-líquido, a resistência à

transferência de massa é menor quando os poros da membrana são preenchidos com o

fluido em que o soluto é mais solúvel. Isto sugere o uso de membranas hidrofílicas ou

hidrofóbicas para solutos com baixo ou alto coeficiente de partição, respectivamente.

Em geral, um soluto com baixa massa molar apresenta maior solubilidade em solventes

polares, portanto, um solvente polar deverá ser utilizado para molhar os poros de uma

membrana hidrofílica. A situação oposta é obtida para altos valores da massa molar,

quando se deve usar uma membrana hidrofóbica. Entretanto, o pré-tratamento da

membrana pode ser utilizado, possibilitando que um solvente polar consiga molhar uma

membrana hidrofóbica, reduzindo a resistência à transferência de massa; similarmente,

os poros de uma membrana hidrofílica podem ser preenchidos por um solvente não

polar (Gabelman et al., 1999).

A separação de uma mistura racêmica através de um contactor de membrana e de

extração líquido-líquido pode ser realizada por dois processos distintos: a separação

indireta, na qual a membrana faz parte do processo enantiosseletivo, mas não apresenta

56

seletividade entre os enantiômeros, ou por separação direta utilizando membranas

quirais enantiosseletivas.

No processo de separação indireta a solução contém a mistura racêmica e os

agentes quirais, que podem ser enzimas livres. Choi e col. (2007) efetuaram a separação

do (R,S) ácido mandélico (Figura 2.18), intermediário quiral usado na produção da

semi-sintética cefalosporina e penicilina, através de um contactor de membranas

atuando de forma indireta via reação de esterificação.

Figura 2.18: Esterificação do ácido mandélico via contactor de membranas (Choi et al., 2007).

A fim de ultrapassar 50% de rendimento, o máximo permitido através de uma

resolução cinética, os autores propuseram uma resolução cinética dinâmica, clonando e

super-expressando a enzima mandelato racemase proveniente de Pseudomonas putida

em E. coli Top 10, que atuou na conversão do S-ácido mandélico em R-ácido

mandélico, alcançando desta forma melhores resultados de conversão. Assim, pelo lado

externo das fibras foi recirculado o solvente orgânico com a lipase (ambos definidos por

testes investigativos iniciais), que atuou na reação de esterificação transformando o (R,

S)-ácido mandélico em R-mandelato de etila. Por questões de afinidade, a enzima

contida na fase orgânica atuou somente sobre o enantiômero R, desta forma o outro

enantiômero migrava para o interior das fibras, onde recirculava-se solução tampão com

a mandelato racemase. Assim, após a reação de racemização na interface entre as

soluções, o R-ácido mandélico migrava novamente para o exterior das fibras e desta

forma era convertido no seu respectivo éster (R- mandelato de etila). A Figura 2.19

representa o esquema reacional no contactor.

57

Figura 2.19: Esquema de separação do ácido mandélico através de resolução cinética dinâmica

(Choi et al., 2007).

As análises para a determinação dos parâmetros de interesse foram efetuadas

através de cromatografia gasosa e o melhor sistema proposto atingiu 65% de conversão

e 98% de excesso enatiomérico com a lipase de Candida antarctica (fração B) em

dicloreto de etileno após 48 horas.

O ibuprofeno (ácido 2-[4-(2-metilpropil)fenil] propanóico) (Figura 2.20), fármaco

quiral muito usado no tratamento de artrite reumatóide e também como anti-

inflamatório, foi separado em contactor de membranas por Long e col. (2005).

Figura 2.20: Resolução cinética do ibuprofeno éster racêmico via lipase catalisando a reação de

hidrólise, R’ designa um grupo alquil (Long et al., 2005).

Os objetivos dos autores foram: comparar a hidrólise enzimática de dois diferentes

ésteres do ibuprofeno, 1-heptil-ibuprofeno éster e 2-etóxietil-ibuprofeno éster (Figura

2.21) e identificar as condições ótimas de operação para a estereoespecificidade da

enzima para obter os enantiômeros puros. Como o enantiômero (S) do ácido ibuprofeno

tem uma taxa de formação mais rápida do que o enantiômero (R), a forma (S) é

transportada através dos poros da membrana até a fase aquosa onde sua solubilidade

também é maior do que a do enantiômero (R).

58

Figura 2.21: Estruturas químicas do (S)-1-heptil-ibuprofeno éster e (S)-2-etóxietil-ibuprofeno éster

(Long et al., 2005).

O módulo utilizado no trabalho citado foi composto de membranas de

poliacrilonitrila contendo lipase de Candida rugosa imobilizada através de adsorção

hidrofóbica. O substrato orgânico foi mantido escoando pelo lado externo das fibras, e

não foi observada passagem para o interior das mesmas em função da sua polaridade e

hidrofobicidade, que é molhada pela fase aquosa (a qual escoa no interior das fibras),

facilitando assim a permeação do produto, (S)-ibuprofeno ácido, que este é muito

solúvel em água e difunde através da membrana até o interior da fibra (Figura 2.22).

Figura 2.22: Sistema utilizado para separação de misturas racêmicas com um contactor de

membranas (Long et al., 2005).

Os autores concluíram que elevadas enantiosseletividades da enzima foram

observadas em tampão fosfato com pH = 8 e temperatura de 40°C, além de uma baixa

vazão para a fase orgânica. Além disso, o sistema de contactor de membrana contendo

59

lipase do tipo C. rugosa imobilizada foi mais eficiente para a obtenção do ácido (S)-

etóxietil-ibuprofeno, visto que a atividade desta enzima diminuiu com o aumento da

cadeia alifática do álcool.

Ding e col. (1992) demonstraram a extração seletiva de D-leucina partir de uma

mistura racêmica em água usando uma solução de 1-octanol com N-N-dodecil-l-

hidroxiprolina. Neste caso, os autores utilizaram o sistema como apenas um extrator que

foi capaz de conseguir uma separação quase completa dos dois enantiômeros.

Lopez e Madson (1997) utilizaram um contactor de membranas com fibras de

poliacrilonitrila a fim de separar o (R,S)-trans-4metóxi-3–ácido fenilglicídico (MMPG),

droga utilizada no tratamento da hipertensão e angina. Assim, primeiramente a enzima

de trabalho foi imobilizada nos poros das fibras e a interface foi resultante da

imiscibilidade das fases orgânica (substrato em tolueno escoando no lado externo das

fibras) e aquosa (solução aquosa de bissulfito de sódio). Os autores concluíram que

elevadas enantiosseletividades da enzima foram observadas em tampão fosfato com pH

8 e temperatura de 40°C, além de uma baixa vazão para a fase orgânica. Além disso, o

sistema de contactor de membrana contendo lipase do tipo Candida. rugosa imobilizada

foi mais eficiente para a obtenção do ácido (S)-etóxietil-ibuprofeno, visto que a

atividade desta enzima diminui com o aumento da cadeia alifática do álcool.

Trusek-Holownia e Noworyta (2004) avaliaram em seu trabalho a influência da

camada formada pela enzima imobilizada na membrana, e como ela influenciou a

transferência de massa, através do coeficiente global e dos individuais de transferência

de massa. Neste trabalho um contactor de membranas planas foi escolhido apenas para

facilitar o estudo, já que como discutido acima as equações ficam simplificadas.

Wang e col. (2007) utilizaram um contactor de membranas na forma de fibras ocas

a fim de separar o (R,S) ibuprofeno através de uma reação de hidrólise. Neste caso, os

autores utilizaram uma membrana especial composta de acetato de celulose hidrofílico

(CA) e politetrafluoretileno hidrofóbico (PTFE) contendo lipase de Candida rugosa

imobilizada na camada hidrofóbica da membrana. Segundo os autores os aspectos

relevantes foram: a atividade lipásica que apresentou aproximadamente 100% de

retenção de atividade; enantiosseletividade que foi avaliada através do E, que neste caso

variou entre 9,4 e 10,9; e a estabilidade que foi avaliada através do tempo de meia vida,

obtendo-se 373% maior para a lipase imobilizada em relação à lipase liofilizada.

60

CAPÍTULO 3

Material e métodos

3.1. Material

As lipases Pseudomonas cepacia (Amano PS), Pseudomonas fluorecens (Amano

AK), Aspergillus niger (Amano A), Candida rugosa (Amano AY) e Rhizopus oryzae

(Amano F) foram adquiridas da Sigma Chemical Co (St. Louis, USA), Novozyme 435,

CAL-B e Lipozyme 100TL foram cedidas pela Novozymes (Bagsvaerd, Dinamarca).

Os substratos butirato de p-nitrofenila (pNPB), (R,S)-1,2-O-isopropilideno

glicerol, bem como os substratos R e S purificados foram adquiridos da Sigma Chemical

Co (St. Louis, USA). Os substratos derivados do álcool (R,S)-1,2-O-isopropilideno

glicerol, ou seja, acetato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno e octanoato de (R,S)-1,2-O-

isopropilideno foram preparados no Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais (NPPN)

no Laboratório do Professor Alessandro Bolis Costa Simas. Os solventes: NMP (N-

metil-2-pirrolidona), hexano, acetato de etila, tolueno, acetonitrila, decano, iso-octano,

heptano, etanol, ácido clorídrico e glutaraldeído foram comprados da Vetec Química

Fina Ltda. Os reagentes sólidos, a saber, nitrato de lítio, fosfato de sódio monobásico,

fosfato de sódio dibásico também foram comprados na Vetec Química Fina ltda. PVP

(Polivinilpirrolidona) K10 e K90 foram adquiridos da Fluka Chemica Co e a poli(éter

imida) (PEI) foi fornecida pela General Eletric. As membranas de nylon 6,6 e de

polipropileno (PP) foram adquiridas da Pall Corporation. A Figura 3.1 representa as

estruturas dos polímeros que foram utilizados no decorrer da tese. Polipropileno

microporoso (Accurel MP 1000) foi comprado da Uderlining Performance.

61

Figura 3.1: Estruturas dos polímeros usados para preparar as membranas, (a) PEI, (b) Nylon 6,6 e

(c) PP.

3.2. Métodos

3.2.1. Preparo das soluções poliméricas de

poli(éter-imida) (PEI)

As soluções (15% m/m) foram preparadas pesando-se por adição o polímero (seco

a 60°C por no mínimo 24 horas) e com o auxílio de uma proveta o NMP em um

erlenmeyer de vidro com tampa esmerilhada. Após a pesagem do PEI e do NMP, o

erlenmeyer foi fechado e vedado com Parafilm®, sendo a mistura resultante submetida

à agitação magnética e com aquecimento constante (70ºC) até a total solubilização, a

qual ocorreu em aproximadamente 24 horas. A solução obtida foi colocada em repouso

por um dia, para garantir a total eliminação das bolhas de ar formadas durante a

agitação. Após a solubilização adicionou-se o aditivo (nitrato de lítio ou PVP, ambos

deixados em estufa a 60°C) para auxiliar na formação da estrutura da membrana. As

soluções poliméricas, após dissolução completa do aditivo foram deixadas em repouso a

fim de eliminar as bolhas ainda presentes em virtude da agitação vigorosa da solução

polimérica viscosa.

(a)

(b)

(c)

62

3.2.2. Preparo de membranas planas por

espalhamento simples

Após a dissolução do aditivo, a solução foi espalhada sob uma placa de vidro (17

x 11cm) previamente lavada, seca e isenta de material aderido, com o auxilio de uma

faca de espalhamento (0,15mm de espessura em aço inoxidável). Após a etapa de

espalhamento, o filme polimérico foi exposto ao ambiente (umidade relativa entre 62 e

78 % a 25 ºC) por 4 minutos e em seguida, imerso no banho de precipitação de água até

desprendimento total da membrana da placa.

Lavagens consecutivas em estufa a 50°C por 24 horas foram efetuadas para

remoção do solvente e aditivos residuais na matriz polimérica. Então, as membranas

formam submetidas à troca de solvente, a fim de evitar colapso nos poros, em função da

elevada tensão superficial da água. Assim, as membranas foram transferidas

inicialmente para um banho contendo etanol, onde permaneceram por cerca de 2 horas,

e em seguida para um contendo hexano (menor tensão superficial), onde permaneceram

imersas por mais um período de, no mínimo, duas horas. Somente após a troca de

solvente pode-se secar e armazenar as membranas geradas. A Figura 3.2 representa o

processo descrito acima.

Na maior parte das preparações foram utilizados 5% de aditivo, nitrato de lítio

e/ou PVP K90, entretanto testou-se também o PVP K10.

63

Figura 3.2: Representação esquemática da preparação de membranas planas.

3.2.3. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Todas as membranas planas de camada simples, além do suporte microporoso de

polipropileno, foram caracterizadas quanto à morfologia por microscopia eletrônica de

varredura (MEV), tendo-se utilizado os microscópios da marca Jeol, modelos JSM 5300

ou 5310. Antes de caracterizadas por MEV, as amostras das membranas secas pela

técnica de troca de não-solvente foram quebradas em nitrogênio líquido. O

congelamento rápido da membrana facilita a fratura e evita uma deformação dos poros

da seção transversal. As amostras fraturadas foram colocadas em suportes metálicos e

cobertas com uma espessura de aproximadamente 300Å de ouro, num metalizador da

Jeol, modelo JFC 1500. Na análise das membranas planas foram observadas as

seguintes regiões: a seção transversal (ST) e a área específica (AS).

64

3.2.4. Determinação da área específica

3.2.4.1. Isoterma de BET

Suporte microporoso de polipropileno foi submetido ao teste de determinação de

área específica através do método de BET, utilizando o nitrogênio como molécula

sonda. A determinação das propriedades texturais dos suportes foi feita através da

técnica de isotermas de adsorção/dessorção de N2 a –196°C, em equipamento

Micromeritics ASAP (Accelerated Surface Area and Porosimetry) modelo 2000. A

amostra foi pré-tratada a vácuo a uma temperatura de 100°C, por 2 horas.

3.2.4.2. Picnometria

Por serem menos porosas que um suporte microporoso, microporos de

polipropileno, por exemplo, as áreas específicas das membranas não puderam ser

determinadas pelo método de BET, já que valores abaixo do limite de detecção do

aperelho foram obtidos. Assim, as áreas específicas destes materiais foram calculadas

através de um método indireto, picnometria. Este método pode ser dividido em duas

etapas:

3.2.4.2.1. Volume total do sólido (matriz e poros)

Pesou-se o picnômetro vazio (mpic.), cujo volume era de 50 mL (Vpic.), e em

seguida o mesmo com uma determinada massa de membrana (m1, onde m1 é a massa do

picnômetro vazio com a membrana pesada), assim por diferença determinou-se a massa

de suporte testada (mm = m1- mpic.). Em seguida completou-se o sistema com o líquido

de Culter e o mesmo foi pesado. Entretanto é necessário um tempo de preenchimento,

ou seja, tempo para o líquido penetrar completamente no material mais poroso, logo,

após este tempo foi necessário completar novamente o picnômetro com o líquido de

Culter obtendo-se, desta forma, a massa total do sistema após 3 horas (mT). Para a

determinação da densidade total de sólidos foi necessário também o conhecimento da

massa de líquido que ocupam os 50mL do picnômetro, assim com a densidade de

65

1,93g/cm3(ρL) a 26 °C, obteve-se uma massa de 96,62g (mL) de líquido de Culter no

picnômetro vazio. A equação 3.1 foi utilizada para calcular a densidade do sólido total

(ρS; [g de membrana/ cm3]).

Eq. 3.1

A equação 3.2 representa o cálculo do volume específico total (cm3/g de

membrana), valor que deve ser utilizado na determinação da área superficial.

S

SV

1 Eq.3.2

3.2.4.2.2. Volume total da matriz

A matriz representa somente a parte densa da membrana (VM) e, neste caso,

foram utilizadas as mesmas equações acima definidas, entretanto, o líquido utilizado

nos testes foi o mercúrio (Hg), já que, por apresentar uma elevada tensão superficial não

penetrou nos poros do material. Definiu-se inicialmente que 50mL do picnômetro era

ocupado por cerca de 677mL de Hg com densidade de 13,6 g/cm3.

A diferença entre o volume específico total (VS) e o volume da matriz (VM)

forneceu o valor do volume poroso do suporte (VP) e, este valor foi utilizado

posteriormente na determinação da área específica dos suportes.

3.2.4.2.3. Determinação do raio médio (RMP) dos poros e área

específica

Através da fotomicrografia de cada material foi possível determinar através de

uma ferramenta do MEV o diâmetro de cada poro do material. Esta determinação foi

aleatória e diferentes poros foram escolhidos, dos quais se obteve uma média aritmética.

A equação 3.3 representa o cálculo da área específica estimada através do método de

picnometria.

L

TL

mS

mmm

m .

)( 1

66

MP

PS

R

VA

.2

Eq.3.3

3.2.5. Espectroscopia no Infravermelho (FTIR)

As análises de infravermelho foram conduzidas em um espectrômetro FTIR da

Perkin-Elmer, modelo Spectrum 100, utilizando refletância total atenuada (ATR). Os

espectros foram analisados na região de 5.000 a 500 cm-1

, com resolução de 4 cm-1

,

utilizando em média 16 varreduras para cada amostra. As análises de FTIR permitiram

avaliar a diferença estrutural entre as amostras, antes e após a imobilização enzimática.

3.2.6. Termogravimetria (TG)

As curvas de TG das amostras foram obtidas em um analisador termogravimétrico

da Perkin-Elmer, modelo TGA. A amostra (aproximadamente 5 mg) foi colocada em

uma cápsula de platina e submetida a aquecimento na razão de 10ºC/min, sob atmosfera

de nitrogênio, no intervalo de temperatura de 50 a 900ºC. O acompanhamento da perda

de massa com a temperatura possibilitou avaliar as mudanças ocorridas na degradação

térmica de cada amostra.

3.2.7. Imobilização via adsorção hidrofóbica

3.2.7.1. Preparo dos suportes

As membranas de PEI com diferentes concentrações de nitrato de lítio e PVP, bem

como as membranas de nylon e polipropileno foram cortadas na forma de quadrados

com aproximadamente 2 x 2mm de comprimento a fim de gerar maior área específica

para a imobilização. No caso do accurel não houve tal necessidade, pois o suporte já se

apresentava na forma adequada para os experimentos.

67

Todos os suportes foram submetidos a uma etapa de pré-tratamento, a fim de

diminuir a tensão superficial dos poros e permitir a entrada da solução aquosa por toda a

extensão do suporte. Assim, primeiramente 50mg dos diversos suportes foram imersos

em 1 mL etanol por aproximadamente 30 minutos e depois, com posterior remoção do

solvente, mais 30 minutos em 1 mL de água. Além disso, a fim de evitar a presença de

etanol residual durante o processo de imobilização, os suportes foram lavados 3 vezes

consecutivas com água destilada.

3.2.7.2. Imobilização

Após o processo de hidratação e remoção completa do etanol, ao suporte foram

adicionados 500µl de solução enzimática em diferentes concentrações. A mistura

permaneceu em contato por 24 horas a 4°C em sistema sob constante agitação

(200rpm). O processo de imobilização foi acompanhado pela determinação da atividade

hidrolítica com p-NFB do suporte e do sobrenadante.

3.2.7.3. Dosagem de atividade hidrolítica por método

espectrofotométrico

Esta atividade baseia-se na formação de um produto cromóforo, p-nitro fenol, a

partir da hidrólise de uma solução de butirato de p- nitrofenila (p-NFB) catalisada pelas

lipases. As reações foram conduzidas a 30°C e iniciadas pela adição de 25µL de uma

solução 25mM de p-NFB ao sistema reacional composto de 50mg de suporte seco (após

o processo de imobilização) ou 25µL das soluções enzimáticas inicial (antes do

processo de imobilização) e final (depois do processo de imobilização) juntamente com

2,3mL de tampão fosfato de sódio 20mM. O progresso das reações foi acompanhado em

espectrofotômetro com leituras de absorbância a 412nm. Uma unidade internacional

(UI) foi definida como a quantidade de enzima necessária para catalisar a hidrólise de

um micromol de p-NPB por minuto nas condições do ensaio.

O cálculo da atividade foi realizado utilizando-se a equação 3.4:

68

Eq. 3.4

Onde:

A = atividade lipásica (UI/mL) ou (UI/g)

V final = volume final de meio reacional (mL)

Vam = volume de amostra (mL) ou massa de enzima imobilizada (mg)

f = 0,1293 mM/Abs (fator obtido na curva de calibração de p-nitro fenol)

3.2.8. Imobilização via ligação covalente

3.2.8.1. Ativação dos suportes com glutaraldeído

Inicialmente 50mg dos suportes, com exceção do polipropileno, foram pesados e

deixados em contato com metanol a 50°C por cerca de 20 min e em seguida foram

tratados com ácido clorídrico 9M a 40 °C por 40 min conforme metodologia descrita

por Bruno e col. (2004). Na etapa posterior, os suportes foram lavados e postos em

contato com uma solução 2,5% de glutaraldeído por 1h a temperatura ambiente e após o

processo os suportes foram exaustivamente lavados.

3.2.8.2. Imobilização

Finalizada a etapa de ativação dos suportes, aos mesmos foram adicionadas

soluções enzimáticas em diferentes concentrações assim como na imobilização por

adsorção hidrofóbica, inclusive utilizando-se as mesmas condições de agitação e

temperatura. Após o processo de imobilização efetuaram-se as mesmas dosagens do

processo via adsorção hidrofóbica.

3.2.8.2.1. Cálculo dos parâmetros de imobilização

O processo de imobilização foi acompanhado pela determinação da atividade

hidrolítica com p-NPB das soluções enzimáticas antes e após o processo de

am

final

Vf

VAbsA

.

.min/

69

imobilização em tempos determinados. Os parâmetros de imobilização foram calculados

de acordo com as equações a seguir:

A eficiência de imobilização (Eimo) foi calculada pela equação (3.5):

Eq. 3.5

Em relação à eficiência de imobilização, pode-se afirmar que este parâmetro é um

indicativo da quantidade de proteína adsorvida no suporte, e durante a seleção de uma

metodologia de imobilização não deve ser o parâmetro mais importante a ser

considerado, visto que se pode ter um suporte onde a eficiência de imobilização seja

alta, entretanto, a atividade da enzima imobilizada tenha sido perdida, em virtude de

diversos fatores, tais como: perda da conformação original da proteína, oclusão do sítio

ativo, impedimento estérico, limitações difusionais, sendo este último, mais importante,

para o caso do suporte ser uma membrana polimérica.

O rendimento de imobilização em atividade () calculado pela equação (3.6)

Eq. 3.6

A retenção de atividade (Ra) foi calculada pela equação (3.7):

Eq. 3.7

Onde:

Uimo = unidades de enzima real imobilizada

Uc = unidades totais de enzima que são colocadas na etapa de imobilização.

Us = unidades de enzima que não reagiram com o suporte e que saíram nas primeiras

lavagens.

UTeo = (Uc – Us) unidades de enzima teoricamente imobilizada.

Em relação ao rendimento de imobilização e à retenção de atividade, observa-se

que ambos os parâmetros dependem da atividade real do suporte, logo, ambos podem

ser maior que 100%, em virtude de fenômenos associados a hiperativação da enzima.

Teo

imoa

U

UR

100.(%)

c

imo

U

U 100.(%)

c

Teoimo

U

UE

100.(%)

70

O rendimento de imobilização fornece uma idéia da quantidade de atividade

“aproveitada” pelo suporte quando comparada à solução de entrada.

Já a retenção de atividade é um parâmetro que traduz a retenção, perda ou

desativação da atividade da enzima imobilizada, visto que, a sua definição é a razão da

atividade real imobilizada sobre a atividade teórica.

3.2.9. Dosagem de proteínas

A dosagem do teor de proteínas foi realizada segundo metodologia estabelecida

por Bradford (1976), utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão.

3.2.1O. Análise por eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE)

As enzimas foram analisadas por SDS-PAGE utilizando o método segundo

LaemmLi (1970) em uma unidade de eletroforese SE 250-Mighty Small II (Hoefer Co.)

usando gel de 12% poliacrilamida na zona de separação de 9 cm × 6 cm e na zona de

concentração 5% poliacrilamida. Os géis foram revelados pelo método de Coomassie

blue.

3.2.11. Resolução dos derivados do (R,S)-1,2-O-

isopropilideno glicerol

Na forma racêmica o (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol não apresenta muitas

aplicações, assim é necessário separá-lo em seus enantiômeros puros (Hof e Kellog,

1996; Fai Liu, 1999). Primeiramente foi necessário verificar qual dos enantiômeros era

o mais útil à síntese de substâncias bioativas, neste caso o S-1,2-O-isopropilideno. No

caso específico deste substrato, o antípoda ótico não causa efeitos deletérios, entretanto

é o S-1,2-O-isopropilideno glicerol que pode ser utilizado como sinton quiral para a

síntese de diglicerios, glicertil fosfatos e muitos outros compostos biologicamente

71

ativos, tais como fosfolipideos, fatores de agregação plaqueática, β- adrenoceptores,

dentre outros (Fai Liu, 1999).

Inicialmente foram testados diferentes substratos derivados deste álcool, a saber,

acetato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno e octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno , além

do éster proveniente da reação do álcool com o tolueno.

Na etapa inicial dos estudos com este substrato todos os experimentos de hidrólise

enzimática foram conduzidos em batelada em frascos fechados, termostatizados a 35°C

e agitados a 250 rpm. Em alguns meios reacionais, optou-se em se fazer a extração do

álcool diretamente para uma fase aquosa, sistema bifásico. Assim, utilizou-se 3mL de

tampão fosfato (50mM e pH = 7,0) juntamente com 3 mL do solvente testado. Além

desta metodologia, investigou-se também o sistema monofásico. Neste caso, os

solventes escolhidos foram submetidos a um processo de hidratação com água destilada.

A quantidade de substrato usada em todos os experimentos foi a mesma, ou seja, 10µL e

as reações foram inicializadas pela adição de 0,05g de enzima. As Figuras 3.3 e 3.4

representam o esquema reacional esperado para hidrólise dos diferentes substratos

testados.

Figura 3.3: Reação de hidrólise do acetato de (R,S) -1,2-O-isopropilideno.

Figura 3.4: Reação de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O- isopropilideno.

O excesso enantiomérico do (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol foi determinado

através de Cromatografia gasosa (CG) em um cromatógrafo gasoso CHROMPACK CP

9000 equipado com coluna quiral, nas seguintes condições cromatográficas: coluna

Hydrodex®-β-6TBDM, temperatura do injetor: 250°C, temperatura do detector: 280°C,

temperatura inicial: 100°C por 1 minuto, taxa de aquecimento 1: 2°C/min até 106°C,

taxa de aquecimento 2: 40°C/min até 160°C, taxa de aquecimento 3: 1°C/min até

165°C. Durante 15 min o sistema foi mantido a 165 °C.

72

O excesso enantiomérico do produto (ee(P)) foi determinado através da equação

3.8:

Eq. 3.8

Onde, P1 e P2 são as áreas dos cromatogramas dos isômeros R e S no produto formado.

Já o excesso enantiomérico do substrato (ee(S)) foi determinado pela equação 3.9:

Eq.3.9

S1 e S2 são as áreas dos cromatogramas dos isômeros R e S no substrato residual.

A razão enantiomérica foi determinada pela equação 3.10 de acordo com Chen e

col. (1982):

Eq. 3.10

Onde: c é a extensão da conversão.

Definidas as condições reacionais, propôs-se incialmente um reator contendo dois

compartimentos, um para cada fase, onde o contato entre ambos era efetuado via uma

interface criada por uma membrana de 5 cm de diâmetro. Os estudos iniciais foram

desenvolvidos neste sistema a fim de se determinar as melhores condições reacionais do

sistema contendo maior área de membrana, além de recirculação das fases, favorecendo

a transferência de massa. Assim, em cada compartimento era adicionado cerca de 140

mL de cada fase, solvente e tampão, e tanto o (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol puro

quanto o éster que estavam sendo estudados foram usados em concentrações em torno

de 4,8 mM. Ambos eram adicionados a fase orgânica. Por meio de cromatografia gasosa

acompanhava-se a migração do álcool para fase aquosa. A Figura 3.5 representa o

esquema de funcionamento deste sistema com maior volume.

)(

)()(

21

21

SS

SSSee

)(1)1(ln

)(1)1(ln

Seec

SeecE

)(

)()(

21

21

PP

PPPee

73

Figura 3.5: Sistema de transferência de massa da fase orgânica para fase aquosa.

Após a determinação dos parâmetros necessários para o dimensionamento do

sistema de membranas planas de nylon com recirculação das fases orgânica e aquosa. A

Figura 3.6 representa o sistema de membranas planas desenvolvido para contactar de

forma não dispersiva as fases orgânica e

aquosa.

Figura 3.6: Sistema de recirculação com contactor de membrana plana.

74

CAPÍTULO 4

Resultados e Discussão

4.1. Reações enzimáticas enantiosseletivas

4.1.1. Resolução dos ésteres derivados do (R,S)-1,2-

O-isopropilideno glicerol

A partir do (R,S)-1,2-O-isopropilideno-glicerol (IPG) foram sintetizados dois

diferentes ésteres com hidrofobicidades distintas, a saber: acetato de (R,S)-1,2-O-

isopropilideno e octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno que foram submetidos à

reação de hidrólise catalisada pelas lipases provenientes de Pseudomonas fluorecens

(Amano AK) e Candida antarctica fração B (Novozyme 435), esta última imobilizada

em resina acrílica. Além disso, foram utilizados como solventes hexano (Log P =3,5) e

acetato de etila (Log P = 0,7) e o tempo de reação foi fixado em 2 horas, visto que foi

possível obter maior estereosseletividade, ou seja, elevados valores de excessos

enantioméricos.

Nesta etapa os ésteres foram utilizados na concentração de 4.1 mM com 9 U de

atividade enzimática colocada em um volume reacional de 6mL (1:1 água e solvente

orgânico). As Tabelas 4.1 e 4.2 apresentam as conversões e os excessos gerados

(equações na página 73) para os substratos testados. É importante ressaltar que há

preferência pela formação do (S)-IPG em todos os ensaios.

75

Tabela 4.1: Hidrólise dos ésteres derivados do IPG catalisado pela lipase Novozyme 435.

Substrato Solvente X (%) ee (P) (%) ee (S) (%)

Acetato de (R,S)-isopropilideno Hexano 50 0,4 0,4

Octanoato de (R,S)-isopropilideno Hexano 30,4 5,1 2,6

Acetato de (R,S)-isopropilideno Acetato de etila 8,8 4,3 30

Octanoato de (R,S)-isopropilideno Acetato de etila 6,6 5,8 0,41

Tabela 4.2: Hidrólise dos ésteres derivados do IPG catalisado pela lipase Amano AK.

Substrato Solvente X (%) ee (P) (%) ee (S) (%)

Acetato de (R,S)-isopropilideno Hexano 11 23 4,2

Octanoato de (R,S)-isopropilideno Hexano 50 28 28

Acetato de (R,S)-isopropilideno Acetato de etila 16 2,3 0,4

Octanoato de (R,S)-isopropilideno Acetato de etila 5,6 99 5,9

Sabe-se que muitas lipases apresentam elevada enantiosseletividade para álcoois

secundários ou seus respectivos ésteres, entretanto baixos valores para este parâmetro

são obtidos quando se utiliza substratos primários, como o (R,S)-IPG, por exemplo.

Poucas lipases demonstram alguma enantiopreferência para álcoois primários e

normalmente a enantiosseletividade é de baixa a moderada (Mezzetti et al., 2003).

A escolha inicial pela utilização da Novozyme 435 de Candida antarctica se

refere ao fato desta enzima comercial ser muito conhecida e utilizada na literatura para

resolução de diversos racematos. Entretanto, segundo as Tabelas 4.1 e 4.2 é possível

verificar que apesar de apresentar conversões razoáveis no solvente mais hidrofóbico

(hexano), a enzima foi incapaz de diferenciar enantiosseletivamente os ésteres derivados

do IPG.

Já a Amano AK, lipase de Pseudomonas fluorecens demonstrou ser mais

enantiosseletiva quando submetida às mesmas condições reacionais. Na reação com o

octanoato de (R,S)-IPG em acetato de etila, apesar da baixa conversão (5,6 %) foi

alcançado elevado valor de ee(P),em torno de 99%, indicando que de fato é possível

obter o produto ((S)-IPG) de forma pura..

Alguns autores já avaliaram (Mezzetti et al., 2003; Koskinen et al., 1996) a

influência do tamanho da cadeia carbônica do éster na enantiosseletividade da enzima,

76

segundo estes, o tamanho da cadeia do éster influência o tipo de estrutura (enzima-

éster), gerada no estado de transição, responsável pela enantiosseletividade da enzima.

Miyazawa e col. (2001) aperfeiçoaram o processo de esterificação enantiosseletiva

do 2-fenóxi-1-propanol com a lipase proveniente de Achromobacter sp., denominada

comercialmente por AL. Segundo os autores houve um aumento de cerca de 15% no

valor de E quando se utilizou o propionato ao invés do trifluoracetato de vinila como

substrato. Além disso, os valores de ee(S) gerados foram 2% para o éster trifluoracetato

de vinila e 78% para o propionato de vinila. É importante mencionar que, além do

aumento da cadeia em relação ao carbono, há a introdução de flúor na molécula de um

dos ésteres testados, o que pode também gerar essa elevada diferença nos valores

mencionados acima. Ainda segundo os autores, os ésteres de maior cadeia serviram

como melhores doadores acila, provavelmente em função da maior afinidade das lipases

por ésteres de maior cadeia carbônica.

Liu e col. (2001) mostraram que a enzima de Bacillus thermocatenulanatus

apresentou maior enantiosseletividade por substratos menores, ou seja, o valor de E foi

69% mais elevado quando utilizou-se o butirato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno

comparativamente ao octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno na reação de hidrólise

enzimática. Por outro lado, os autores mostraram que tanto com acetato quanto com

butanoato de vinila, valores maiores que 100 foram encontrados para a razão

enantiomérica da mesma enzima catalisando reações de esterificação com o (R,S)-1-

feniletanol.

Molinari e col. (2004) realizaram em seu trabalho uma série de reações de

hidrólise, catalisadas por células de Strptomyces sp liofilizadas, com diversos ésteres

derivados do IPG. Os autores verificaram que o crescimento da cadeia do éster

favoreceu um aumento no valor do ee(P), entretanto esse aumento não foi linear, já que

passou de 28% (acetato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno) para 50% (butirato de (R,S)-1,2-

O-isopropilideno) diminuindo para 25% (heptanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno)

mantendo uma conversão de 33% em aproximadamente 6 horas. Segundo os autores os

piores resultados (ee(P) < 5% e X =35%) foram obtidos quando o benzoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno foi utilizado como substrato.

Neste trabalho, o benzoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno também foi testado e

assim como no trabalho de Molinari e col. (2004), e baixas conversões (30%) e ee(P) (

< 3%) foram obtidos. O fato de se ter um grupamento benzoila pode causar algum tipo

77

de dificuldade ao reconhecimento do substrato pela enzima, com reflexos sobre a

enantiosseletividade.

Além do tamanho da cadeia carbônica do substrato, a atividade enzimática é

dependente da quantidade de água associada à enzima, e, em menor grau, da quantidade

de água contida em todo sistema. Assim, solventes hidrofílicos (baixos valores de

Log(P)) podem desativar enzimas pela remoção de moléculas de água aderidas a sua

estrutura que seriam essenciais para manutenção da atividade catalítica (Koskinen e

Klibanov, 1996). Entretanto, diferentes lipases apresentam comportamentos distintos

em relação ao tipo de solvente utilizado na reação. No caso da lipase Amano AK

(Tabela 4.2) apesar da taxa de hidrólise ser maior com hexano, foi em acetato de etila

que houve diferenciação do substrato, (S)-IPG.

4.1.1.1. Seleção de enzimas

Definido o substrato, uma etapa de seleção de biocatalisadores foi realizada com

acetato etila como solvente. Inicialmente foram utilizadas 50mg de enzima no meio

reacional não levando em consideração a atividade específica de cada uma, já que a

intenção nesta etapa era somente identificar qual das enzimas seria capaz de hidrolisar

enantiosseletivamente o éster testado. Assim, definida a enzima, testes de caracterização

foram efetuados a fim de padronizar os ensaios em relação à atividade enzimática

colocada. A Figura 4.1 representa os ensaios de hidrólise efetuados a 35°C com retirada

de amostras em 2 horas (a) e 24 horas (b).

(a)

78

Figura 4.1: X (%) ( ), ee(S) ( ) e ee(P)( ) nas reações de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-

isopropilideno (5mM) catalisada por diferentes lipases (50 mg) a 35°C em acetato de etila em (a) 2

horas e (b) 24h de reação.

As Figuras 4.1 (a) e (b) mostram que é possível obter-se tanto o éster (elevadas

conversões) quanto o álcool (baixas conversões) com elevado grau de enantiopureza.

Em 24 horas de reação elevadas conversões foram obtidas para as enzimas Amano AY

(93,4 %) e Amano PS (86,9 %) e em 48 horas de reação conversões de 100% foram

obtidas com ambas as enzimas.

No caso da lipase Amano F de Rhizopus oryzae, a baixa conversão (em torno de

4%) e o elevado excesso enantiomérico (> 99%) em 2h de reação (Figura 4.1(a))

levaram a um valor da razão enantiomérica (E) sem significado físico uma vez que valor

de conversão (X) obtido foi inferior a 1 %. Entretanto em 24 (Figura 4.1 (b)) e em 48h

de reação, a conversão atingiu 16% e 30%, respectivamente, mas com completa perda

de enantiosseletividade. Este fenômeno pode ser explicado com base na perda de

atividade desta enzima em acetato de etila, já que o mesmo pode estar removendo água

necessária para manutenção de atividade. Além disso, está foi a única lipase testada que

resultou na obtenção do (R)-IPG.

De uma maneira geral, verificou-se que em 24 horas há uma diminuição drástica

do excesso enantiomérico em relação ao produto (ee(P)). Além disso, acima de um

determinado valor de conversão, cerca de 15% a lipase passa a não diferenciar mais o

substrato, gerando desta forma o álcool também na forma racêmica.

(b)

79

Em tempos superiores, conduzindo-se o processo acima de 24 horas houve um

aumento do ee(S), o que mostra que um dos substratos apresenta velocidade específica

de consumo maior que o outro, já que é completamente consumido durante a reação.

Desta forma, o substrato residual, obtido ao final da reação e caracterizado por apenas

um pico mostra que há a possibilidade de obter na forma enantiopura, também, o

substrato (octanoato de (R)-1,2-O-isopropilideno).

Além disso, as enzimas comerciais utilizadas neste trabalho são preparados

enzimáticos que podem conter outras proteínas, além da de interesse, e podem, portanto,

interferir na reação tanto de forma favorável quanto desfavorável. Por apresentar um

comportamento mais eficaz na resolução do enantiômero testado (octanoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno) a lipase proveniente de Pseudomonas fluorecens (massa molar

igual a 32KDa foi analisada por meio de um gel de eletroforese (Figura 4.2), a fim de

identificar presença de impurezas no preparado enzimático.

Figura 4.2: Gel de eletroforese da lipase de Pseudomonas

fluorecens, comercialmente denominada amano AK em

diferentes concentrações. Da esquerda para direita:

Padrão de massa molar e soluções com a lipase de

interesse.

No gel de eletroforese (Figura 4.2) é possível verificar que existem diversas

bandas e uma delas é a lipase de interesse enquanto que as demais possivelmente são

impurezas do preparado enzimático, neste caso, outras proteínas. Considerando-se todos

os efeitos presentes, e comparativos entre si, optou-se então pela escolha da enzima

Amano AK, proveniente de Pseudomonas fluorecens para a continuidade deste

trabalho, já que para baixas (Figura 4.1(a)) e elevadas conversões (Figura 4.1(b)) foram

obtidos os enatiômeros (S)-IPG (ee(P) > 99%) e o octanoato de (R)-IPG (ee(S) >99%)

com elevada pureza ótica, respectivamente.

80

4.1.1.2. Efeito do solvente, temperatura, concentração enzimática e

pH na resolução enantiomérica do octanoato de (R,S)-1,2-O-

isopropilideno

4.1.1.2.1. Efeito do pH e concentração de água no meio reacional

O pH bem como a atividade de água são parâmetros muito importantes na

definição do meio reacional mais adequado para uma dada reação enzimática, visto que

o estado de ionização da enzima é essencial na biocatálise. Segundo Lima e Angnes

(1999) a presença de água é importante porque aumenta a mobilidade e flexibilidade

dos sítios ativos e, concomitantemente, a polarização da estrutura proteíca, ou seja,

manutenção da estrutura tridimensional.

Avaliou-se inicialmente o efeito do pH (faixa entre 6 e 8) e do teor de água (16,6,

50 e 83,3% v/v) em bateladas com volume útil de 6 mL com relação solvente

orgânico:água variável. Todos os ensaios foram conduzidos com cerca de 5mg de

enzima (massa equivalente a 0,9 U, 10 vezes menor que nos ensaios iniciais de seleção

da enzima), concentração de substrato de 5mM e temperatura de 30°C. A Figura 4.3

(a),(b) e (c) apresenta os resultados de X, ee(P) e ee(S) obtidos em 24h de reação, para

diferentes teores de água .

(a)

81

Figura 4.3: Variação de X (%) ( ), ee(S) ( ) e ee(P)( ) em função do pH em bateladas contendo (a)

16,6% ; (b) 50% e (c) 83,3 % v/v de água, nas reações de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-

isopropilideno (5mM). Todas as reações foram conduzidas em acetato de etila com 0,9 U de

atividade enzimática colocada e a 30°C.

O aumento da conversão e do ee(S), independente do pH reacional, está associado

com o aumento da atividade de água no meio reacional. Este fato, principalmente em

relação a conversão já era esperado por se tratar de uma reação de hidrólise. Entretanto

deve-se ressaltar que quantidade de água necessária para um determinado ensaio

biocatálitico depende das características de cada enzima, substrato, solvente e a

correlação entre eles.

Por outro lado, os valores de ee(P) diminuíram com o aumento da atividade de

água no meio reacional, principalmente na condição da Figura 4 (c). Já a Figura 4 (a) e

(b) mostram pouca variação no valor de ee(P) indicando que deve haver um limite onde

o aumento de água na batelada começa a influenciar negativamente na diferenciação

enantiosseletiva em relação ao produto. A diminuição acentuada no valor de ee(P) na

batelada com 83,3% v/v de água provavelmente está associada ao aumento da

(b)

(c)

(c)

82

conversão (velocidade específica de reação elevada). Além desta hipótese, Aires-Barros

(2011) descreveu em seu trabalho que a água pode participar de vários mecanismos que

podem levar a desnaturação proteíca com conseqüente perda de atividade enzimática no

meio reacional, dificultando a diferenciação enantiosseletiva.

É conveniente lembrar também que uma quantidade mínima de água é necessária

para manutenção da atividade enzimática, já que, além da mesma contribuir para a

integridade estrutural, polaridade do sítio ativo e estabilidade da proteína, pode também

limitar a solubilidade de substratos hidrofóbicos em torno da enzima (Lima e Angnes,

1999; Liu et al., 2001). Provavelmente em concentrações de água inferiores a 6,6%

menores valores de conversões seriam obtidos, em função da diminuição da taxa de

hidrólise o que ocasionaria, provavelmente, uma maior diferenciação pela lipase, ou

seja, aumento de ee(P). Entretanto, é importante analisar cada caso individualmente,

pois com uma maior quantidade de água (Figura 4.3) é possível obter elevados valores

de ee(P) associados com altas conversões, e desta forma, o tempo de processo é menor e

a produtividade também.

Todas as reações enzimáticas em meio aquoso são fortemente dependentes do pH

visto que o estado de ionização da enzima é essencial para a catálise. Assim, discutido o

papel da água neste processo biocatálitico, verificou-se que o aumento do pH provocou

um aumento na conversão e no ee(S) para concentrações de água abaixo de 50% v/v,

enquanto que o ee(P) manteve-se praticamente constante. Acima deste valor há uma

queda drástica deste parâmetro, enquanto que X e o ee(S) aumentam consideravelmente

(Figura 4.3). Segundo Vallikiti e col. (2003) melhores desempenhos enzimáticos são

alcançados em pH’s acima de 8 porque ocorre aglomeração dos resíduos não-polares

em torno do sítio ativo da enzima. A Figura 4.3 (a) e (b) indicam o mesmo

comportamento observado pelos autores citados anteriormente, entretanto o valor de ee

(P) não sofreu alterações significativas. Para os experimentos realizados com

concentração água igual a 83,3 % v/v observou-se uma pequena diminuição de X e

ee(S) e um pequeno aumento no valor de ee(P).

Além das informações observadas nos experimentos é de conhecimento que o pH

ótimo de atuação da enzima Amano AK de Pseudomonas fluorescens situa-se na faixa

alcalina em torno de oito (http://www.amano-enzyme.co.jp). A Figura 4.3 mostra que o

aumento do pH, de uma forma geral propiciou um pequeno aumento ( < 20%) no valor

de ee(P), confirmando,desta forma, um melhor desempenho, em pH’s mais alcalinos.

83

Entretanto, visando associar razoáveis conversões (> 30%) com elevados valores de

ee(P) (> 60%) optou-se em se trabalhar com bateladas na proporção 1:1 (água:solvente

orgânico), e devido a pequena variação experimental (Figura 4.3 (b)) entre os pH’s sete

e oito, certamente dentro do erro, definiu-se pH = 7 como referência para todas as

reações enzimáticas posteriores.

Segundo Beatriz e col. (2011) as resoluções cinéticas reportadas para os derivados

do glicerol, como é o caso do (R,S)-IPG, envolvendo o uso de enzima, são altamente

estereosseletivas em condições brandas e pH próximos da neutralidade (confirmando o

que foi obtido neste trabalho), produzindo excessos enantioméricos acima de 90%.

Molinari e col. (2005) efetuaram a hidrólise de vários ésteres derivados do (R,S)-

IPG utilizando como biocatalisadores duas cepas distintas de bactérias, Streptomyces sp.

90852 e 90930. Segundo os autores, além de apresentarem enantiosseletividades

diferentes, uma pelo álcool (S) (Streptomyces sp. 90852) e outra pelo (R) (Streptomyces

sp. 90930), o comportamento frente a diferentes pH’s também foi diferenciado.

Enquanto a cepa de Streptomyces sp. 90930 apresentou declínio na razão enantiomérica

em pHs acima de sete a outra cepa (Streptomyces sp. 90852) mostrou aumento, sendo

que o maior valor de E foi gerado no máximo pH testado, neste caso, oito.

4.1.1.2.2. Efeito da concentração de enzima, solvente orgânico e

temperatura

O solvente pode alterar a especificidade, quimiosseletividade, regiosseletividade,

seletividade proquiral e enantiosseletividade das lipases e outras hidrolases. Vários

modelos foram propostos para explicar a mudança da seletividade destas enzimas em

função do solvente, os quais foram baseados na alteração da flexibilidade

conformacional do sítio ativo, na partição de grupos funcionais do substrato ou de

moléculas de solvente para fora ou para dentro das cavidades do sítio ativo, e na

estrutura do solvente (Cygler et al., 1997).

Assim, definido o substrato, biocatalisador, relação água:solvente orgânico e pH

do meio reacional, diferentes atividades enzimáticas (0,9 U (5 mg) e 2,7 U (15 mg)),

bem como solventes (acetato de etila (LogP = 0,7) (Figura 4.4 (a) e (b)), tolueno

(LogP=2,5) (Figura 4.5 (a) e (b)) e hexano (LogP=3,5) (Figura 4.6 (a) e (b))) foram

84

testados na resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno inicialmente a

30°C (Figura 4.4 a 4.6).

Figura 4.4: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em acetato de

etila com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 30°C, pH = 7 e relação solvente água:

1:1.

Figura 4.5: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em tolueno com

0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 30°C, pH = 7 e relação solvente água: 1:1.

(a) (b)

(a) (b)

85

Figura 4.6: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em hexano com


Em uma resolução enzimática o solvente atua no coeficiente de partição da água,

substratos e produtos para o microambiente da enzima. Quanto à água, este efeito é

devido à propensão que determinados solventes têm para remover água da enzima

(“water stripping”) (Zaks e Klibanov, 1988; citado em Koskinen e Klibanov, 1996),

levando a uma insuficiente hidratação da mesma e, consequentemente, a um decréscimo

da atividade enzimática (Halling, 1994). Normalmente, a extensão deste fenômeno é

maior nos solventes hidrofílicos o que acaba gerando uma preferência pelos solventes

hidrofóbicos. Já em relação ao substrato o poder de solvatação do solvente dificulta a

partição deste até o centro ativo da enzima e, em relação ao produto, a difusão deste

para o solvente. Mais especificamente, o solvente afeta a estabilização do substrato,

normalmente traduzida pela diferença de energia de Gibbs (ΔG) referente ao complexo

enzima-substrato e o substrato livre (Halling, 1994).

De acordo com as cinéticas geradas (Figuras 4.4 - 4.6) é possível obter na forma

enantiopura o (S)-IPG (ee(P) > 99% e E > 200) até 10 horas de reação, em acetato de

etila e em até 5 horas em resoluções cinéticas efetuadas em tolueno. Entretanto,

confirmando o que já foi verificado anteriormente essa diferenciação só ocorre em

conversões baixas, neste caso, menores que 10%, indicando que a lipase apresenta de

fato, nas primeiras horas de reação, capacidade de diferenciação. Assim o octanoato de

(S)-1,2-O-isopropilideno é consumido mais rapidamente (maior constante de afinidade)

gerando por conseqüência o (S)-IPG. Por outro lado o octanoato de (R)-1,2-O-

isopropilideno é consumido mais lentamente, logo em conversões acima de 80% ele

pode ser removido na forma pura (ee(S) > 99%). Naturalmente, a condução do processo

(a) (b)

86

até 100% de conversão impede a diferenciação enantiosseletiva enzimática, já que

ambos os substratos são convertidos em álcool. A Figura 4.7 apresenta o cromatograma

gerado para a resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno em acetato

de etila com a enzima Amano AK (T= 30°C ).

Figura 4.7: Cromatograma obtido da reação (5 horas) entre a enzima Amano AK (0,9 U) e o

octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno em 3 horas de reação em acetato de etila a 30°C.

Neste caso (Figura 4.7) observa-se que há apenas consumo de um dos substratos, o

que apresenta maior velocidade específica de consumo, enquanto que o outro é mantido

no meio reacional. A conversão em 3 horas foi menor que 10%, entretanto como já

discutido anteriormente, o ee(P) obtido foi maior que 99%.

A hidrofobicidade do solvente, expressada por logP (logaritmo do coeficiente de

partição de uma substância em um sistema padrão de duas fases: 1-octanol/água), apesar

de inúmeras exceções, é o que apresenta melhor correlação com a atividade de enzimas

e, geralmente, as enzimas são mais estáveis em solventes com caráter hidrofóbico (Yang

e Russel, 1996). Os parâmetros de solubilidade de Hildebrand e a constante dielétrica de

diferentes solventes orgânicos, normalmente não fornecem uma boa correlação.

Segundo Laane e col. (1987) a atividade enzimática é baixa em solventes relativamente

hidrofílicos que apresentam log P < 2, é moderada em solventes com 2< log P< 4 e alta

em solventes apolares onde log P > 4. Solventes hidrofílicos podem desativar

biocatalisadores devido à remoção de moléculas de água essenciais para manutenção da

Ácido octanóico

87

atividade dos mesmos (Monti et al., 2008). A Figura 4.8 apresenta o comportamento da

enzima Amano AK (0,9U), em relação ao ee (P) e X nos diferentes solventes testados

(a) em 3 horas e em 24 horas de reação.

Figura 4.8: Variação de ee(P) ( ) e X ( ) em (a) 3 e (b) 24 horas de reação do octanoato de (R,S)-1,2-

O-isopropilideno (5mM) com a enzima Amano AK (0,9 U) em diferentes solventes com água (1:1).

A forma como os solventes afetam a atividade enzimática e a enantiosseletividade

ainda não é bem compreendida e as hipóteses apresentadas para explicar esse fenômeno

apresentam discrepâncias entre si (Costa e Amorim, 1999). Pode-se observar nos

trabalhos que exploram esse tema a preocupação em salientar que os resultados

alcançados são restritos aos sistemas estudados, evitando-se generalizações.

Assim, de acordo com os resultados gerados (Figura 4.8) é possível verificar que a

enzima testada apresenta comportamento diferenciado, já que a mesma apresentou bom

desempenho (ee(P) > 99%; E > 200) em acetato de etila (solvente mais hidrofílico) e em

tolueno, cuja hidrofobicidade é 3,6 vezes maior. Os testes em solventes mais

hidrofóbicos LogP > 3,5 apresentaram taxa de conversão tão rápida quanto em hexano,

descartando a possibilidade de utilizar solventes muito hidrofóbicos no meio reacional.

Miyazawa e col. (1999) estudando a resolução do 2,2 difenil-1,3-dioxano-4

metanol por meio da reação de transesterificação via lipase de Rhizopus sp. com

butanoato de vinila verificaram também que solventes com coeficientes de partição

intermediários, ou seja, solventes mais hidrofílicos forneceram maiores valores de ee

(P) e consequentemente de E.

(b) (a)

88

O desempenho catalítico da lipase de Mucor javanicus na síntese do laurato de n-

pentila foi avaliado em relação a diferentes solventes orgânicos. A enzima não

apresentou atividade catalítica nas reações realizadas com solvente relativamente

hidrofílico (logP < 2), apresentou eficiência catalítica moderada em solvente com log P

entre 2 e 4; e alta eficiência em solventes fortemente apolares (logP > 4). Os

rendimentos em laurato de n-pentila foram: 82% em hexano (logP = 3,5); 70% em

ciclohexano (logP = 3,2); 68% em tolueno (logP = 2,5) e em diclorometano (logP =

0,93). Nos solventes acetona (logP = –0,23) e acetonitrila (logP = –0,33) não foram

observadas a formação do éster (Silva e Jesus, 2003).

Frings e col. (1999) mostraram que houve uma diferenciação enzimática mais

eficiente na medida que se aumentou a hidrofobicidade do solvente na reação de

esterificação do 1-feniletanol com a lipase de Mucor miehei. Entretanto, segundo os

autores o ponto ótimo da resolução foi obtido em hexano, já que em solventes mais

hidrofóbicos que este houve uma diminuição na eficiência de resolução, da mesma

forma que em solventes mais hidrofílicos, como é o caso do MTBE (éter metil-terc

butílico), também testado.

Além do solvente é possível também analisar a influência da concentração do

biocatalisador utilizado nos ensaios cinéticos (Figura 4.4 a 4.6). A Tabela 4.3 representa

somente a conversão e o ee(P) em função de alguns tempos utilizando-se 5 mg (0,9 U) e

15 mg (2,7 U) de enzima em acetato de etila.

Tabela 4.3: Influência da concentração enzimática inicial na resolução do octanoato de (R,S)-1,2-O-

isopropilideno (5mM) a 30°C em acetato de etila e água (1:1).

Apesar de ter aumentado consideravelmente a conversão em função do tempo o

aumento da atividade enzimática inicial diminuiu a diferenciação pelo substrato como

Tempo

(h)

Atividade enzimática inicial (U)

0,9 2,7

X ee (P) X ee (P)

(%) (%)

1 0,8 99 4,9 99

3 1,8 99 19,1 71

5 7,4 99 25,9 66,8

24 40,7 54,6 62,1 49,4

48 57,1 53 76,7 30

89

indicam os valores de ee(P) (Tabela 4.3). Por exemplo, em 5 horas de processo,

utilizando-se 0,9 U de atividade enzimática inicial é possível obter o S-IPG puro com

conversão de 7,4 %, enquanto que, ao se utilizar 2,7U ,na mesma condição, verifica-se

que a conversão aumentou 3,5 vezes, entretanto não há mais diferenciação da enzima

por apenas um dos enantiômeros, pois ee(P) passa a ser 66,8%. O mesmo

comportamento também foi observado para as reações em tolueno a 30°C.

Além de melhorar o processo de resolução, a utilização de menores concentrações

de biocatalisador diminuem o custo do processo, já que normalmente estes são caros e

quando utilizados na forma livre (não imobilizados) não podem ser reaproveitados.

Ensaios para analisar a perda da atividade enzimática durante as resoluções

cinéticas também foram efetuados de forma a explicar alguns resultados obtidos. Na

temperatura de 30°C ficou constatado que até 5 horas a atividade enzimática é mantida

integralmente, independente do solvente e da concentração de enzima no meio

reacional. Em 24 horas percebe-se, principalmente em acetato de etila uma diminuição

na atividade, cerca de 40%, provavelmente pelo fato de solventes mais hidrofílicos

removerem água essencial da camada protéica que está relacionada a manutenção da

atividade enzimática. O mesmo comportamento foi observado em tolueno, entretanto a

queda na atividade da enzima ficou em torno de 20%. No caso do solvente mais

hidrofóbico, o hexano, quase não foi observado desativação enzimática.

Uma alternativa para atenuar ou até mesmo eliminar a perda de atividade

enzimática seria o uso do processo de imobilização, pois desta forma a enzima não

ficaria tão exposta ao efeito do solvente.

Além da quantidade de enzima e solvente uma avaliação da temperatura da reação

foi efetuada, já que a 50°C não foram obtidos resultados satisfatórios. Segundo Reetz

(2002) normalmente se espera que a diminuição de temperatura aumente a

enantiosseletividade da enzima tempos reacionais mais longos. Por este motivo, com o

objetivo de estudar o efeito desta variável na reação foram conduzidas cinéticas a 30oC

(Figuras 4.4 a 4.6) e a 10°C (Figuras 4.9 a 4.11). É importante deixar claro que cinéticas

a temperatura ambiente não geraram resultados melhores do que os testados a 30°C, por

esse motivo ensaios nesta temperatura não foram discutidos. Além disso, sempre foram

feitos brancos reacionais para garantir a integridade do processo, ou seja, apenas o

aumento da temperatura ser responsável pela hidrólise.

90

As Figuras 4.9-4.11 representam a resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-

isopropilideno nas mesmas condições mencionas para as reações a 30°C, entretanto

neste caso a temperatura dos ensaios foi de 10°C.

Figura 4.9: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em acetato de

etila com 0,9 (a) e 2,7 U (b) de atividade enzimática inicial a 10°C, pH = 7 e relação solvente água:

1:1.

Figura 4.10: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em tolueno com


(b) (a)

(a) (b)

91

Figura 4.11: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em hexano com


Assim como a 30°C, as reações em acetato de etila e tolueno a 10°C apresentaram

melhores resultados, principalmente quando as reações foram efetuadas com 0,9 U de

atividade enzimática inicial (ee(P) > 99%, E > 200). Nesta temperatura, com uma maior

atividade enzimática inicial, ou seja, 2,7 U foi possível obter a forma S enantiopura (ee

(P) > 99%), fato não observado a 30°C. A diminuição de temperatura provavelmente

provocou a diminuição da velocidade especifica da reação, favorecendo o consumo de

apenas um dos substratos.

As reações em hexano também tiveram sua taxa reacional diminuída a 10°C.

Utilizando-se atividade enzimática inicial de 0,9U em tempos de reação inferiores a 1

hora foi possível obter o composto S-IPG com pureza , fato também não observado na

resolução a 30°C (Figura 4.6 (a)).

Visto a significativa melhora em termos de resolução do enantiômero, medidas da

atividade enzimática a menores temperaturas (10°C) foram também efetuadas, a fim de

discutir os resultados gerados. Nesta temperatura a atividade enzimática foi mantida a

100% em até 7 horas independente da concentração enzimática inicial.

A mudança de temperatura de 30°C para 10°C não alterou significativamente a

cinética conduzida em acetato de etila na menor concentração enzimática (5mg , 0,9 U)

optou-se pela escolha deste solvente na temperatura de 30°C para a continuidade dos

experimentos. Além de 13% de conversão e elevado excesso de produto (ee(P)> 99%),

uma recuperação de 1,4mg de produto, equivalente a 22% de rendimento químico real

(a) (b)

92

foi gerada. Além disso, processos efetuados em baixa temperatura demandam gastos

energéticos extras para manutenção de baixas temperaturas reacionais.

Em décadas passadas, muitos métodos foram desenvolvidos para a síntese do S-

1,2-O-Isopropilideno glicerol visando um aumento de E, normalmente entre 5-15.

Dentre eles, podem-se citar os métodos a partir do ácido ascórbico ou D- manitol e L-

serina (Beatriz, 2011). Entretanto, o uso de enzimas para gerar o (S)-1,2-O-

isopropilideno glicerol tem se tornado uma alternativa bastante atrativa, visto que

enzimas são capazes de catalisar enantiosseletivamente reações de hidrólise ou

esterificação em um ambiente favorável ao processo com um custo-beneficio adequado

(Hof e Kellog, 1996; Fai Liu, 1999).

Sakai e col. (1998) estudaram o efeito da temperatura na resolução cinética de

(R,S)-IPG catalisada por lipase AK de Pseudomonas fluorences e conseguiram

aumentar o valor de E de 9 (a 30°C) para 55 (a -40°C) em éter isopropílico, com e.e.

igual a 93%. Neste trabalho os autores obtiveram os melhores resultados, em maiores

tempos de reação, com a utilização de butirato de vinila e elevadas quantidades de

enzima (cerca de 150 mg). Miyazawa e col. (2001) estudaram a transesterificação

irreversível catalisada por lipase, para resolver dois cetais do glicerol, assim como

(R,S)-IPG. Inicialmente, os autores testaram a resolução enzimática do (R,S)-IPG via

acilação com acetato de vinila em éter isopropílico. Foram usadas 12 lipases de fontes

microbianas e pancreática, no entanto, somente os resultados com 3 lipases foram

apresentados no artigo para a resolução do (R,S)-IPG. A enantiosseletividade, incluindo

a preferência estereoquímica (R ou S), variou consideravelmente com a enzima usada.

Nenhuma das lipases testadas mostrou elevada enantiosseletividade, exceto a lipase de

Rhizopus javanicus, a qual apresentou grau moderado de enantiosseletividade (E = 11,

48% de e.e. para o enantiômero S), em longos tempos de reação (280 h).

Os dados apresentados nas Tabelas 4.4 e 4.5 sumarizam os principais resultados

obtidos a partir das cinéticas geradas nas diferentes temperaturas, atividades enzimáticas

e solventes estudados

93

Tabela 4.4: Reações de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em 5 horas de

reação variando-se a atividade inicial da lipase (0,9U e 2,7U), temperatura (10 e 30°C) e solvente

(acetato de etila, tolueno e hexano).

Solvente

Atividade enzimática (U)

Temperatura

(°C)

0,9 2,7

X ee (P) ee (S) E

X ee (P) ee (S) E

(%) (%)

Acetato de

etila 7 99 8 > 200 26 67 23 6,3

30 Tolueno 4 99 4 > 200 9 78 8 8,8

Hexano 88 13 99 4,6 82 16 72 2,6

Acetato de

etila 9 99 10 > 200 16 99 18 15

10 Tolueno 8 99 9 >200 21 99 27 > 200

Hexano 72 39 99 3,1 96 4 99 3,1

Tabela 4.5: Reações de hidrólise do octanoato de (R,S)-1,2-O-isopropilideno (5mM) em 24 horas de

reação variando-se a atividade inicial da lipase (0,9U e 2,7U), temperatura (10 e 30°C) e solvente

(acetato de etila, tolueno e hexano).

Solvente

Atividade enzimática (U)

Temperatura

(°C)

0,9 2,7

X ee (P) ee (S) E

X ee (P) ee (S) E

(%) (%)

Acetato de

etila 41 55 38 4,9 62 49 81 6,9

30 Tolueno 47 54 49 5,3 68 36 76 4,5

Hexano 97 2 57 1,4 89 13 99 4,6

Acetato de

etila 37 71 41 8,8 45 67 54 8,6

10 Tolueno 47 63 56 7,6 62 42 69 5,8

Hexano 100 - - - 100 - - -

94

Além do excesso enantiomérico para caracterizar a eficiência na resolução de um

racemato, a razão enantiomérica (E) é um parâmetro muito importante, principalmente

quando se quer aperfeiçoar um dado processo, pois a partir dele é possível verificar

quantas vezes um enantiômero é melhor substrato que o outro para a enzima ensaiada.

Uma análise da razão enantiomérica mostra que E ≤ 10 não conduzem a resoluções

eficientes, enquanto que E ≥ 100 se aproximadas às condições ideais de reação conduz a

obtenção tanto de produto quanto de substrato residual enantioméricamente

enriquecidos. Entretanto elevados valores de razão enantiomérica (E > 200) podem estar

sendo influenciados, além do preparado enzimático, pela desativação pelo solvente

(verificado através de acompanhamento cinético) e, também pelas incertezas intrínsicas

relativas aos métodos analíticos de determinação dos excessos, neste caso GC

(cromatografia gasosa) (Costa e Amorim, 1999).

A Tabela 4.5 apresenta alguns resultados obtidos pela literatura na resolução

enantiomérica do (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol.

Tabela 4.6: Resolução do (R,S)-1,2-O-isopropilideno glicerol através de reações de hidrólise e

acilação enantiosseletiva utilizando diferentes catalisadores.

Biocatalisador Reação E Referência

Lipase Amano AK

Acilação do (R,S)-1,2-O-

isopropilideno glicerol com

butirato de vinila

44 Sakai et al., 1998 *

Lipase de fígado de cavalo Hidrólise do butanoato de (R,S)-

1,2-O- isopropilideno glicerol 15

Fai Liu, 1999

Bacillus subtilis niger Hidrólise do caprilato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno glicerol 11

Proteinase de Aspergillus oryzae Hidrólise do butanoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno glicerol 9

Penicilinacinase

Hidrólise do p-fenilacetato de

(R,S)-1,2-O-isopropilideno

glicerol

7.2

Lipase de Pseudomonas cepacia Hidrólise do benzoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno glicerol 7.0

95

Lipase Amano P Hidrólise do butanoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno glicerol 5.1

Lipase de Pseudomonas cepacia



butirato de vinila

4.0

Lipase de pâncreas de porco

Hidrólise do butanoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno glicerol

3.0

Lipase Amano AK



acetato de isopropenila

5.4

Pseudomonas cepacia Hidrólise do butanoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno glicerol 5.2 Mezzetti et al., 2003

Bacillus coagulans

Hidrólise do benzoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno glicerol 80-100

Romano et al., 2005 Hidrólise do propionato de

(R,S)-1,2-O-isopropilideno

glicerol

32-34

Lipase Amano AK Hidrólise do octanoato de (R,S)-

1,2-O-isopropilideno >200 Este trabalho

* Reação a -44°C

De uma forma geral, o valor de E obtido neste trabalho, > 200 nas primeiras horas

de reação pode ser reflexo das incertezas associadas às dosagens experimentais,

entretanto, em 24 horas o valor de E a 30°C com 2,7U de atividade colocada passa a ser

8,8, indicando que o processo é viável e pode ser otimizado. Os elevados valores para

este parâmetro obtido por Sakai e col. (1998) são reflexos da alta concentração

enzimática (150 mg de lipase) e da baixa temperatura reacional. Os autores não fizeram

um estudo comparativo em temperaturas maiores mantendo a concentração da enzima.

Romano e col. (2005) utilizaram células integras de Bacillus coagulans como

biocatalisador da reação. Os outros trabalhos citados na Tabela 4.5 utilizaram solventes

mais complexos nos meios reacionais, o que encarece o processo além de limitar a sua

utilização, visto que alguns são muito tóxicos.

96

Outro aspecto relevante deste trabalho é que o valor obtido para o E está

compatível com os relatados para as reações de hidrólise, visto a dificuldade em se

trabalhar com álcoois primários. Entretanto, para fins práticos o valor de E não foi o

parâmetro mais relevante na definição do processo, mais sim o valor de ee(P), pois desta

forma foi possível obter um dos enantiômeros em sua forma pura.

4.2. Caracterização dos Suportes

4.2.1. Microscopia de Varredura Eletrônica das

Membranas de poli (éter-imida) (PEI)

Para a adsorção enzimática, inicialmente, optou-se por utilizar suportes

microporosos de PEI, na forma de membranas poliméricas. As membranas de PEI

foram preparadas através da técnica de imersão-precipitação, utilizando diferentes

aditivos para obter morfologias e propriedades superficiais distintas. A morfologia das

membranas foi avaliada pela da técnica de MEV, enquanto a porosidade e a área

disponível para adsorção foram avaliadas por picnometria conforme discutido no

capítulo 3.

Os aditivos foram utilizados foram nitrato de lítio e polivinilpirrolidona (PVP)

K10 e K90. Além de alterar a morfologia da membrana, os aditivos permitem modificar

as características superficiais. O primeiro é totalmente removido da matriz polimérica

após a formação da membrana, enquanto o PVP permanece parcialmente retido

(Borges, 1993). A composição da solução e o tempo de exposição da solução a

atmosfera (umidade relativa em torno de 60%) foram investigados para o preparo da

membrana a fim de obter um suporte adequado para imobilização enzimática.

Inicialmente foram testadas duas concentrações de nitrato de lítio, mantendo o tempo de

exposição em 5 min. As Figuras 4.12, 4.13 e 4.14 apresentam as fotomicrografias das

superfícies e das seções transversais das membranas obtidas a partir das soluções

contendo PEI/LiNO3/NMP (N-metil-2-pirrolidona).

97

Figura 4.12: Fotomicrografias da superfície das membranas planas obtidas a partir da solução

PEI/LiNO3/NMP (15/3/82 m/m/m).

Figura 4.13: Fotomicrografias das seções transversais das membranas planas obtidas a partir da

solução PEI/LiNO3/NMP (15/3/82 m/m/m).

Apesar de apresentar elevada porosidade na seção transversal, variável importante

no processo de imobilização, as membranas contendo 3% de nitrato de lítio foram

caracterizadas por pouca interconectividade dos poros, provenientes possivelmente da

separação de fases por nucleação e crescimento da fase diluída em polímero. Assim,

com esta morfologia o processo contínuo ficaria limitado a baixos valores de fluxo,

prejudicando a transferência de massa através da membrana.

98

Além disso, observando-se as fotomicrografias das superfícies da membrana

(Figura 4.12) foi possível observar que há uma distribuição de poros irregulares, ou

seja, determinadas regiões do suporte são bem mais porosas do que outras.

Visando um aumento da interconectividade dos poros propôs-se uma nova

concentração de nitrato de lítio na solução polimérica, a saber, 5 % m/m. Na Figura 4.14

(a) e (b) estão representadas a superfície e a seção transversal da membrana obtida a

partir da solução de PEI/LiNO3/NMP (15/5/85 m/m/m), respectivamente. O tempo de

exposição a atmosfera foi mantido constante em 5 min.

Figura 4.14: Fotomicrografias da (a) superfície e da (b) seção transversal da membrana plana

obtida a partir da solução PEI/LiNO3/NMP (15/5/85 m/m/m).

O aumento na concentração de nitrato de lítio não gerou mudanças morfológicas

significativas, que pode ser explicado em relação à estabilidade da solução polimérica

quando a mesma entra em contato com a atmosfera. O sistema com maior quantidade de

aditivo encontra-se mais próximo a condição de separação de fases devido à elevada

afinidade que este aditivo possui com o não-solvente (água). Em princípio, esta

condição favorece o processo de nucleação, levando a formação de superfícies com

porosidade maior. Como, para este sistema, a faixa de miscibilidade é reduzida, a

variação na concentração do aditivo não foi suficiente para ocasionar uma alteração

significativa na taxa de nucleação.

Aumentos superiores a 5% em nitrato de lítio poderiam comprometer a

estabilidade da solução, inviabilizando o preparo da membrana. Definida a concentração

de lítio em 3% m/m, estudou-se então o tempo de exposição. Oliveira (1994) também

(a) (b)

99

avaliou o efeito do tempo de exposição da solução polimérica a atmosfera, antes da

imersão no banho de precipitação, já que este tempo está diretamente relacionado com a

absorção de vapor de não-solvente da atmosfera ao redor ou a evaporação de

componentes voláteis da solução. No sistema investigado, tanto o solvente (NMP) como

os aditivos (PVP e nitrato de lítio) não apresentam volatilidade significativa. As

fotomicrografias apresentadas nas Figuras 4.15 e 4.16 mostram a superfície e a seção

transversal das membranas planas sintetizadas a partir de soluções de PEI/LiNO3/NMP

com composição igual a 15/3/82 (m/m/m), entretanto com tempos de exposição de 10 e

20 min, respectivamente.

Figura 4.15: Fotomicrografia da (a) superfície e (b) seção transversal da membrana plana obtida a

partir da solução PEI/LiNO3/NMP (15/3/82 m/m/m) em 10 min de exposição a atmosfera.


partir da solução PEI/LiNO3/NMP (15/3/82% m/m) em 20 min de exposição a atmosfera.

(a) (b)

(a) (b)

100

Elevados tempos de exposição mantiveram a morfologia “esponjosa” e

constituída por células fechadas (Figuras 4.15 (b) e 4.16 (b)), como observado também

por Oliveira (1994). O aumento no tempo de exposição intensifica a absorção de não-

solvente pela solução polimérica, uma vez que tanto o solvente quanto o aditivo são

substâncias altamente higroscópicas. Logo, maior é a quantidade de água que se difunde

ao longo da espessura da solução, gerando instabilidades que levam à formação dos

núcleos. Desta forma, os núcleos formados na interface superior não encontram ao seu

redor condições de estabilidade e a sua expansão fica desfavorecida, originando a

morfologia “esponjosa”.

Para aumentar a interconectividade dos poros, propriedade que facilita a

transferência de massa através da membrana, optou-se em se trocar de aditivo. Assim,

após a análise de alguns materiais escolheu-se o PVP com duas massa molares distintas,

K10 (10 kDa) e o K90 (360 kDa).

O PVP é um polímero hidrossolúvel e miscível com muitos polímeros e solventes

orgânicos. Além disso, está disponível em diferentes massas molares, logo, tem sido

amplamente utilizado como aditivo polimérico na preparação de membranas. A sua

presença na solução reduz a região de miscibilidade para a precipitação do polímero,

além de aumentar a resistência à difusão do solvente e do não-solvente. Entretanto,

embora seja solúvel em água, uma parte dele permanece na matriz polimérica,

conferindo uma maior hidrofilicidade à membrana. A estrutura de sua unidade

monomérica lhe confere um caráter anfifílico (Figura 4.17), que se deve à presença do

grupo amida, altamente polar, com propriedades hidrofílicas, e, por outro lado os grupos

metileno e metino, que possuem propriedades hidrofóbicas (Oliveira, 1994, Silveira,

2003 citado em Basseti, 2002).

Figura 4.17: Fórmula estrutural do aditivo PVP.

As Figuras 4.18 e 4.19 apresentam as fotomicrografias da (a) superfície e da (b)

seção transversal das membranas originadas a partir das soluções poliméricas: PEI/PVP

K10/NMP (15/5/80 m/m/m) e PEI/PVP K90/NMP (15/5/80 m/m/m), respectivamente.

(a) (b)

101


partir da solução PEI/ PVP-K10/NMP (15/5/80 m/m/m).


partir da solução PEI/ PVP-K90/NMP (15/5/80 m/m/m).

A troca de aditivo alterou significativamente tanto a porosidade superficial quanto

a interconectividade entre os poros, entretanto a Figura 4.18 (a) mostra que a membrana

com PVP de menor massa molar, 10 kDa (PVP K10), levou à formação de um suporte

mais espesso e com menor porosidade superficial, quando comparado com a membrana

obtida com o PVP com maior massa molar, PVP K90, 360 kDa. Além disso, diâmetros

de poros relativamente maiores foram obtidos quando se utilizou o aditivo de maior

massa molar. Boom (1992) ao estudar o efeito de diferentes aditivos durante a

precipitação de soluções polimérica concluiu que a principal influência da massa molar

(a) (b)

(a) (b)

(a) (b)

(a) (b)

102

do aditivo reside na viscosidade que este proporciona a solução polimérica, o que afeta

diretamente a transferência de massa entre a solução polimérica e o banho precipitante.

Com o PVP K10 a viscosidade da solução é menor do que com PVP K90, desta

forma, acelerando a transferência de massa e aumentando a concentração de polímero

na interface filme/banho no instante da precipitação. Essa região passa, então, a atuar

como uma resistência adicional ao transporte de massa de solvente e de não-solvente

nas subcamadas da solução e, por isso, a separação de fases nessas regiões é mais lenta

(ou com atraso). Assim, a solução polimérica nas subcamadas permanece estável por

um tempo maior e, por essa razão, os núcleos formados na camada abaixo da interface

conseguem expandir-se (ou crescer). A expansão desses núcleos origina macrovazios

observados na seção transversal da Figura 4.18 (b).

Outros autores também verificaram em suas pesquisas que quanto maior a massa

molar do aditivo, menor sua mobilidade e maior a possibilidade de a separação líquido-

liquido ser iniciada pelo processo de separação espinodal, aumentado a

interconectividade da fase diluída no momento da precipitação (Di Luccio, 1997,

Pereira, 1999, Carvalho et al., 2002).

A fim de se verificar a influência do tempo de exposição e da concentração do

aditivo, assim como no caso com LiNO3 foram preparadas membranas com

concentração de 3% m/m de PVP K90. As Figuras 4.20 e 4.21 apresentam as

fotomicrografias da superfície e seção transversal de membranas preparadas com 10 e

20 minutos de tempo de exposição, mantendo a concentração de PVP K90 em 3% m/m.


partir da solução PEI/PVP-K90/NMP (15/3/82 m/m/m) em 10 min de exposição a atmosfera.

(a) (b)

103


partir da solução PEI/PVP-K90/NMP (15/3/82 m/m/m) em 20 min de exposição a atmosfera.

Normalmente quando se trabalha com um solvente não volátil com o é o caso do

NMP, durante o tempo de exposição, o fluxo de entrada de não-solvente na fase

polimérica prevalece sobre o fluxo de saída de solvente desta fase para a atmosférico, de

forma que é possível ocorrer a precipitação na interface filme/atmosfera.

Dependendo do tempo de exposição, esta frente de precipitação pode avançar

significativamente antes da imersão do filme no banho de precipitação, entretanto, como

verificado nas Figuras 4.20 e 4.21, o aumento do tempo de exposição não alterou a

porosidade superficial. Outra observação é a ausência de macrovazios na seção

transversal e a estrutura torna-se “esponjosa”, o que novamente pode ser relacionado a

difusão do não solvente (água) ao longo da espessura da membrana, favorecendo o

processo de nucleação.

A combinação de aditivos, mantendo a concentração total em 3% m/m e utilizando

a relação entre LiNO3 e PVP K90 na proporção de 1:1 em massa foi efetuada visando-se

obter um material com características hidrofóbicas intermediárias. A Figura 4.22

apresenta a morfologia obtida nesta condição e mantendo 10 min de exposição a

atmosfera.

(b)

(a) (b)

104


partir da solução PEI/PVP-K90/NMP (15/1,5/1,5/82 m/m/m/m) em 10 min de exposição a

atmosfera.

Uma comparação qualitativa entre as Figuras 4.15 (3% de LiNO3), 4.20 (3% de

PVP K90) e 4.22 (1,5% de LiNO3 e 1,5% de PVP K90) mostrou que há um aumento na

porosidade superficial com a quantidade de PVP presente na solução. O efeito do tempo

de exposição não foi significativo para alterar a morfologia da membrana, como

discutido anteriormente, e a mesma estrutura esponjosa foi gerada.

4.2.2. Microscopia de Varredura Eletrônica da

membrana comercial de Nylon 6,6

Além das membranas de PEI, confeccionadas no laboratório, outras membranas

foram testadas como suporte para imobilização, dentre elas, a de nylon 6,6 (poliamida)

foi uma alternativa, visto que apresenta boa resistência frente aos solventes. Por serem

mais hidrofílicas, estas membranas não necessitam de agentes de molhamento (Araujo

et al., 2006).

Membranas de nylon também apresentam importância significativa como um

material de desempenho elevado e, ainda, excelentes propriedades mecânicas e térmicas

(Espeso et al., 2006). A Figura 4.23 apresenta as fotomicrografias da membrana

comercial de nylon 6,6.

(a) (b)

105

Figura 4.23: Fotomicrografia da (a) superfície e (b) seção transversal da membrana plana de nylon

6,6 comercial.

Verifica-se a partir da Figura 4.23 uma grande irregularidade tanto na distribuição

de poros quanto no tamanho dos mesmos. Os poros na seção transversal apresentam

interconectividade, garantindo baixa resistência a transferência de massa através da

membrana. Trata-se de uma membrana suportada em um tecido sem tramas (“non

woven”), ou seja, material que serve para deposição da membrana e que lhe confere

maior estabilidade mecânica e rigidez.

4.2.3. Microscopia de Varredura Eletrônica da

membrana comercial de Polipropileno (PP)

O polipropileno (PP) é um termoplástico semi-cristalino e conhecido por seu baixo

custo, sua elevada resistência química e a solventes, por ser fácil de moldar, por possuir

alta resistência à fratura por flexão ou fadiga, ter boa resistência ao impacto e

estabilidade térmica. O PP é hidrofóbico e não possui grupos funcionais reativos em sua

estrutura molecular assim, alguns problemas podem surgir em certas aplicações (Zen et

al., 2011).

Normalmente membranas geradas a partir deste polímero utilizam a técnica de

precipitação térmica, onde a solução polimérica preparada em alta temperatura é a

precipitação da fase concentrada em polímero ocorre por resfriamento. Durante a

(a) (b)

106

redução de temperatura a precipitação é precedida pelo processo de separação de fases

líquido-líquido, por nucleação e crescimento da fase diluída em polímero, o que irá

gerar os poros da membrana. A Figura 4.24 apresenta a superfície e seção transversal de

uma membrana de PP gerada por esta técnica.

Assim como ocorreu com a membrana de nylon 6,6, pode-se perceber que há

também uma distribuição de poros irregular ao longo da superfície da membrana de

polipropileno (Figura 4.24 (a)). Observando-se a seção transversal da membrana (Figura

4.24 (b)) concluiu-se que se trata de uma membrana isotrópica, já que a porosidade é

regular ao longo da seção. A elevada interconectividade dos poros também é uma

característica que foi observada na seção transversal.

Figura 4.24: Fotomicrografia da (a) superfície e (b) seção transversal da membrana plana

polipropileno (PP) comercial.

4.2.4. Microscopia de Varredura Eletrônica do

suporte Accurel

As mesmas propriedades apresentadas pela membrana de polipropileno podem ser

aplicadas ao accurel, já que ambos os materiais são confeccionados a partir do

polipropileno, entretanto, o suporte microporoso apresenta uma área específica mais

elevada. A Figura 4.25 apresenta a fotomicrografia do suporte microporoso derivado do

polipropileno.

(a) (b)

107

Figura 4.25: Fotomicrografias do suporte accurel.

A Figura 4.25 mostra que além de apresentar alta porosidade, o tamanho dos poros

no suporte são regulares, e estes aspectos favorecem a imobilização da enzima.

4.2.5. Determinação da área específica (ASE) das

membranas porosas e accurel MP 100 utilizados na

imobilização enzimática

A determinação da área específica (ASE, área por unidade de massa) é feita a

partir da medida de um grande número de partículas. Em um processo de adsorção

enzimática esse parâmetro fornece informações importantes, pois está relacionado com

quantidade de atividade enzimática retida.

A importância de se obter materiais com elevada área específica, no campo da

catálise, é que a razão catalítica (moléculas produzidas por segundo) é proporcional à

área ativa disponível (Albanez, 1996). Quando se trabalha com imobilização de enzimas

o conhecimento deste parâmetro permite correlacionar à atividade enzimática, bem

como a quantidade de proteína adsorvida por m2 de suporte. Assim, teoricamente,

quanto maior a área do suporte, maior a quantidade de proteína adsorvida e maior a

atividade biocatalítica do suporte. Entretanto, no caso de imobilização enzimática esta

hipótese nem sempre é verdade, visto que, um suporte pode apresentar uma elevada

quantidade de proteína imobilizada e a mesma não apresentar atividade, já por outro

lado uma pequena quantidade pode ter sido adsorvida e estar extremamente ativa.

108

No caso de biocatalisadores, contendo enzimas imobilizadas, além da área

específica do suporte, outras propriedades devem ser levadas em consideração, tais

como hidrofobicidade, diâmetro dos poros, porosidade, dentre outras. Normalmente

suportes porosos particulados apresentam área específica mais elevada do que as

observadas em membranas.

A determinação da área específica teve por objetivo, além de avaliar a superfície

disponível para imobilização, padronizar os resultados de adsorção enzimática. Desta

forma foi possível interpretar mais facilmente os resultados e avaliar a interação da

enzima com o material testado.

A área específica da membrana de PEI obtida a partir da solução contendo 3%

m/m LiNO3 (PN) e a do suporte accurel MP 100 foram obtidas por adsorção de

nitrogênio, através do ensaio de BET. Os resultados obtidos foram:

Área específica da membrana de PEI: 2,7 m2/g

Área específica do accurel: 38 m2/g

Como esperado a área específica da membrana foi muito baixa quando comparada

a do suporte poroso comercial de polipropileno, Accurel MP 100, cerca de 14 vezes

maior. Além disso, valores abaixo de 10 m2/g de área específica são considerados

imprecisos por esta técnica, pois não se encontram dentro do limite de confiança do

aparelho utilizado. Uma alternativa foi o uso de picnometria, já que além de ser prático

e rápido fornece instantaneamente os valores de área específica. A Tabela 4.7 apresenta

os resultados obtidos utilizando-se picnometria para determinação da área específica das

membranas contendo 3% m/m de PVP (PV), 1,5% de PVP + 1,5% de LiNO3 (PH),

Nylon (N) e Polipropileno (PP).

Tabela 4.7: Áreas específicas das membranas utilizadas na imobilização da lipase Amano AK.

Material Área específica (m2/g)

Membrana com 1,5% de PVP e 1,5% de

LiNO3 (PH) 2,80

Nylon 6,6 (N) 3,15

Membrana com 3% de LiNO3 (PN) 3,39

Polipropileno (PP) 4,20

Membrana com 3% de PVP (PV) 6,47

109

Apesar de impreciso, o valor de área específica obtido pelo método de BET foi

bastante similar ao gerado por picnometria para a membrana contendo 3% m/m de

LiNO3. É importante mencionar que apesar de visivelmente parecer ter maior área

específica (ver fotomicrografias) que a membrana com LiNO3, a membrana preparada

com dois aditivos (PH) apresentou dentre os materiais analisados o menor valor para tal

parâmetro. Tal fato pode estar relacionado a presença de poros com pouca

interconectividade (células fechadas) que dificultam a entrada de líquido na medida por

picnometria. Cabe ressaltar que, com exceção da membrana PV, os valores obtidos para

as áreas específicas das demais membranas estão relativamente próximos, sendo difícil

diferenciá-los.

4.3. Estudo de diferentes suportes no ensaio de

imobilização da lipase Amano AK

4.3.1. Polipropileno

Muitos autores têm utilizado como suporte para imobilização de enzimas

partículas microporosas de polipropileno, accurel MP 100, tendo em vista seu elevado

grau de hidrofobicidade e elevada área, cerca de 40 m2/g (Oliveira et al., 2006; Almeida

et al., 2008).

A cinética de adsorção da lipase Amano AK a 4oC em polipropileno microporoso

(Accurel MP 1000) está descrita na Figura 4.26.

110

Figura 4.26: Cinética de adsorção da lipase Amano AK sobre o accurel a 4°C.

A lipase foi quase que totalmente adsorvida em cerca de 20 minutos de contato

enzima/suporte a baixas temperaturas. O sobrenadante após 30 min de processo de

imobilização apresentou cerca de 7,8% de atividade inicialmente colocada, o que gerou,

teoricamente, um suporte com 91,2% de atividade. já que o ensaio em branco (sem

suporte) não apresentou queda na atividade enzimática. A adsorção da proteína sobre o

suporte também apresentou comportamento bastante similar, resultando no

sobrenadante apenas 8% de proteína adicionada. Estes resultados já haviam sido

observados por Bevilaqua (2005) imobilizando-se a enzima Lipozyme

10.000 sobre o

mesmo suporte. Por outro lado a adsorção completa da lipase de Burkholderia cepacia

LTEB11 só foi completa em 6 horas de contato (Salum (2010)). Já neste trabalho, para

fins comparativos os experimentos de imobilização por adsorção foram conduzidos por

24 h, desta forma foi garantido adsorção completa da lipase sobre o suporte.

Definido o tempo de imobilização, um estudo de pH foi efetuado na faixa de 5-7.

A Figura 4.27 apresenta os resultados, E (eficiência de imobilização), η (rendimento de

imobilização) e Ra (retenção de atividade) obtidos após a imobilização da lipase Amano

AK em accurel com diferentes pH's.

111

Figura 4.27: Efeito da variação do pH nos parâmetros de imobilização (( ) E; ( ) Ra e ( ) η) da

lipase Amano AK (2,6 U) a 4°C.

Os parâmetros de imobilização não foram afetados pelo pH do meio indicando que

as forças de adsorção predominantes são as hidrofóbicas e não as interações

eletrostáticas . Do mesmo modo, Gitlesen e col. (1997) observaram que a adsorção da

mesma enzima sobre este suporte não foi alterada pela variação do pH.

Isotermas de adsorção em diferentes suportes, no pH 7,0, foram obtidas. Após

cada processo de adsorção removeu-se o sobrenadante e lavou-se o biocatalisador

gerado, que foi mantido em tampão fosfato também em pH = 7, com o objetivo de

evitar o fechamento dos poros. Foram preparadas as soluções enzimáticas de modo a se

obter concentrações de proteína e atividade enzimáticas na faixa de 0,027 a 0,62 mg de

proteína/mL e 0,679 a 14 U/mL, respectivamente. A Figura 4.28 apresenta as isotermas

de adsorção, real e teórica, padronizadas pela área superficial do suporte, em termos de

atividade e de proteína.

112

Figura 4.28: Isotermas de adsorção (A) para os dados experimentais de atividade (0,679-14 U/mL)

(B) para os dados experimentais de proteína (0,027-0,62 mg/mL), ambas em accurel e a 4°C.

A área disponível para a adsorção da proteína, neste caso a lipase Amano AK

depende da natureza da superfície, como, por exemplo, porosidade e tamanho de poro.

Em seu trabalho Gitlesen e col. (1997) estudaram a imobilização da mesma lipase sobre

o mesmo material utilizado neste trabalho, entretanto com uma área 2,4 vezes maior.

Segundo os autores, os dados gerados a partir da adsorção da lipase sobre o suporte se

ajustaram melhor ao modelo de Langmuir e os parâmetros resultantes do ajuste foram,

2,6 mg/mL e 2,8 mg/m2 para a constante de afinidade e capacidade máxima adsortiva,

respectivamente. Observando-se a Figura 4.30 (b) é possível verificar que a afinidade da

enzima pelo suporte é de fato elevada, visto que a constante de afinidade obtida foi de

17,3 mg/mL (6,6 maior do que obtido por Gitlesen e col. (1997)).

Estes resultados, aparentemente contraditórios, podem estar relacionados com a

condição de imobilização escolhida pelos autores, neste caso pH= 6 e concentração do

tampão 20 mM. Para uma comparação mais efetiva seria necessário que os autores

fornecessem a retenção de atividade, pois desta forma seria possível discutir os

resultados baseados na atividade real do biocatalisador obtido.

Comparando-se os dados gerados a partir das isotermas de atividade foi possível

observar que a quantidade de atividade máxima teórica retida no suporte foi de 43,7

U/m2 no trabalho de Gitlesen e 8,34 U/m

2 neste trabalho (5,2 vezes menor).

Segundo o modelo de Langmuir a quantidade de atividade máxima retida e a

constante de afinidade foram 0,55 U/m2 e 6,5 U/mL, respectivamente. Estes resultados

demonstram claramente que há grande perda de atividade durante o processo de

(b)

Isoterma de Atividade: Accurel

0 1 2 3 4 5

U* (U/ml)

0

1

2

3

4

5

6

7

Q* (U

/m2

)

_____Isoterma de Langmuir Teórica: Adsorção hidrofóbica Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Real: Adsorção hidrofóbica Dados Experimentais

(A) Isoterma de Proteína: Accurel

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

C* (mg/ml)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Q*(m

g/m

2)

(B)

113

imobilização, já que o biocatalisador gerado apresentou 15,2 vezes menos atividade do

que deveria apresentar. Dentre as hipóteses mais prováveis, além da pureza enzimática,

a lipase pode ter perdido sua atividade após a imobilização no suporte, função de

modificações estruturais, efeitos estereoquímicos ou difusionais que podem ocorrer nos

processos de imobilização.

Para avaliar o efeito da concentração de proteína no biocatalisador gerado optou-

se em se trabalhar em uma faixa mais ampla de proteína (0,667 a 5,3 mg de

proteína/mL) e atividade enzimática (10 a 100 U/mL) como ilustrado na Figura 4.29.

Figura 4.29: Isotermas de adsorção (A) para os dados experimentais de atividade (10-100 U/mL)

(B) para os dados experimentais de proteína (0,667-5,3 mg/mL), ambas em accurel e a 4°C.

O aumento na concentração de proteína fez com que houvesse um aumento de 75

% em relação à quantidade de proteína adsorvida comparativamente à adsorção

realizada em menores concentrações (Figura 4.29 (b)), o que ocasionou também um

aumento na atividade máxima teoricamente retida sobre o suporte (35,2 %). Entretanto,

em relação à atividade máxima real retida sobre o suporte nenhum parâmetro pode ser

estimado, visto que a atividade ficou próxima de zero, provavelmente pelo fenômeno de

adsorção em multicamada (Branco,2010).

A Figura 4.30 apresenta os parâmetros de imobilização da lipase de Pseudomonas

fluorecens (Amano AK) sobre o accurel MP 100 nas duas situações discutidas acima,

ou seja, em menor (até 0,62 mg) e maior (até 5,3 mg) concentração de proteína.

(b)

Isoterma de Proteína: Accurel

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4

C* (mg/ml)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Q*(m

g/m

2)


(B) Isoterma de Atividade: Accurel

0 5 10 15 20 25 30

U* (U/ml)

0

2

4

6

8

10

12

14

Q* (U

/m2

)



(A)

114

Figura 4.30: Parâmetros de imobilização do biocatalisador obtido pela imobilização da lipase de

Pseudomonas fluorecens (Amano AK), (a) concentração enzimática até 0,62 mg de proteína e (b)

concentração enzimática até 5,3 mg de proteína, sobre o accurel MP 100.

Observando-se a Figura 4.30 é possível verificar que nos ensaios de adsorção

sobre o accurel ocorreu um aumento tanto na retenção de atividade quanto na eficiência

de imobilização conforme a solução enzimática tornou-se mais diluída. Possivelmente,

quanto menor for a concentração de enzima disponível para a imobilização, menor a

possibilidade de formação de agregados protéicos, que promovem a perda de atividade

enzimática, além da dificuldade de imobilização. Assim pode-se concluir que em

soluções mais concentradas a adsorção proteíca foi menor, cerca de 60-70%, enquanto

que nas mais diluídas passou de 90% na maioria dos casos.

Além disso, quanto maior a concentração de enzima oferecida ao processo de

imobilização maior a possibilidade de ocorrer um fenômeno conhecido como

“overcrowding” (multicamadas), ou seja, proteína adsorvendo sobre proteína,

impedindo a exposição do sítio ativo à catálise. Assim, ocorre uma diminuição

considerável da retenção de atividade e o fenômeno de hiperativação não é observado

(Almeida et al., 2008; Branco et al., 2010).

Bon e col. (1986) observaram o mesmo efeito em relação à retenção de atividade

quando imobilizaram a β-glucosidade proveniente de Aspergillus niger em dois suportes

distintos, a saber: quitina e alumina. Em ambas as situações os valores de Ra

expressivos foram obtidos em soluções enzimáticas mais diluídas, provavelmente pelos

efeitos discutidos acima.

Bosley (1997) observou em seu trabalho o efeito da concentração de diferentes

proteínas sobre o accurel. Segundo o autor, baixas concentrações enzimáticas, geram

intensas interações com o suporte causando deformações nas moléculas, enquanto que,

(b) (a)

115

elevadas concentrações proteícas causavam limitações difusionais. Isotermas de

Langmuir descreveram bem o equilíbrio de adsorção de 5 diferentes tipos de proteínas

(lipase de Candida rugosa, albumina, α-quimotripsina, lipase pura de Thermomyces

lanuginosus e lipase bruta de Psedomonas fluorecens).

Gitlesen e col. (1997) observaram em seu estudo que de fato a natureza não iônica

bem como a elevada hidrofobicidade do polipropileno microporoso (accurel) fazem com

que a adsorção de proteínas neste suporte seja governada apenas por interações

hidrofóbicas.

Este mesmo suporte foi empregado por Al-Duri e col. (2001) para a imobilização

de lipase de Rhizomucor miehei. O biocatalisador foi empregado em sistema utilizando

CO2 supercrítico como solvente e foi caracterizado quanto à estabilidade e à atividade.

As variações de pressão (pressão máxima 18 MPa) não causaram efeito significativo em

nenhum desses dois parâmetros, comprovando a boa resistência mecânica do suporte e a

qualidade da imobilização; já o aumento de temperatura (até 60oC) favoreceu a

atividade enzimática porém não a estabilidade do biocatalisador. Neste trabalho os

efeitos de difusão interna e externa foram considerados desprezíveis.

Madalozzo (2011) imobilizou a lipase recombinante de Rhizopus oryzae em

accurel e observou um aumento na estabilidade em relação à temperatura comparando-

se com a enzima na forma livre. Segundo a autora este fato deve estar relacionado à

maior rigidez da enzima, conferida pela sua ligação com o suporte.

Como discutido anteriormente o uso de imobilização pode fazer com que a

atividade enzimática aumente consideravelmente (hiperativação), entretanto, nos

trabalhos acima citados não se observou este efeito. Persson e col. (2002) verificaram

um aumento de 400x na atividade da lipase de Humicola lanuginosa quando a mesma

foi imobilizada em accurel, atribuindo o resultado ao espalhamento da enzima pela

ampla área superficial do suporte, previnindo a agregação das moléculas, facilitando o

acesso aos substratos. Além disso, vários autores têm observado que ao adsorver em

suportes hidrofóbicos a área hidrofóbica ao redor do sítio ativo são envolvidas na

imobilização, deixando a lipase estabilizada em sua forma aberta, gerando, portanto o

aumento da atividade (Mateo et al., 2007).Um exemplo é a lipase de Mucor miehei, que

quando imobilizada em um suporte altamente hidrofóbico (Octadecyl Sepabeads)

apresentou uma atividade 20 vezes maior do que a lipase livre (Palomo et al., 2002).

116

Já Almeida e col. (2008) observaram o fenômeno de hiperativação (340 %)

quando utilizaram o mesmo suporte para a imobilização de uma lipase recombinante de

Pyrococcus furiosus. Além disso, os autores verificaram também a purificação da lipase

através de uma adsorção seletiva, ou seja, apenas a proteína de interesse adsorveu sobre

o suporte.

Com o objetivo de verificar o efeito do par suporte/enzima no processo foi

realizada a imobilização da lipase de Thermomyces lanuginosus e de Candida

antarctica livre sobre este suporte (Accurel) a partir de uma solução 0,787 U/mL.

Os resultados mostraram 100% de eficiência de imobilização e 243% de retenção

de atividade para a lipase de T lanuginosus, indicando a existência do fenômeno de

hiperativação. Por outro lado a lipase de Candida antarctica fração B apesar de ter sido

imobilizada com 100% de eficiência de imobilização, a retenção de atividade foi de

apenas de 28%. Comparando-se as três lipases, Amano AK, de Thermomyces

lanuginosus e Candida antarctica fração B, fica claro que cada par enzima-suporte

apresenta um comportamento completamente diferente mesmo quando submetidos as

mesmas condições de imobilização. Assim, possivelmente por razões estruturais

relacionadas a arquitetura do sitio ativo de cada enzima o mesmo pode ficar mais ou

menos exposto, auxiliando ou prejudicando o valor de atividade retida no suporte ao

final do processo.

Desta forma, ao se definir o par “enzima-suporte” é importante fixar os parâmetros

reacionais, tais como temperatura e pH, dentre outros, visto que o comportamento da

enzima pode ser alterado devido a condição de trabalho.

Quando se estuda um fenômeno de adsorção da enzima, um dos principais

parâmetros que deve ser levado em consideração é área do suporte disponível para

imobilização, como discutido anteriormente. Desta forma, o mesmo material,

polipropileno, foi utilizado sob a forma de membrana, ou seja, menor área disponível

para adsorção enzimática. As Figuras 4.31 e 4.32 apresentam os resultados obtidos após

a imobilização da enzima de Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de

polipropileno.

117


(B) para os dados experimentais de proteína (0,027-0,62 mg/mL), ambas em membrana de

polipropileno (PP) a 4°C.


Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de PP a 4°C.

É importante enfatizar que os parâmetros obtidos nas isotermas são importantes

para comparações, entretanto não devem ser os únicos analisados para escolha do

suporte, já que um dado modelo sempre busca se adequar aos dados experimentais. Os

principais problemas que podem levar a inadequação do ajuste são: a adsorção de uma

proteína em diversos sítios, tornando o processo de adsorção irreversível; a natureza

heterogênea de superfícies sólidas, fazendo com que não ocorra homogeneidade no

processo de adsorção e as interações cooperativas entre os sítios de adsorção e os sítios

vizinhos, o que no caso de interações negativas pode dificultar o processo de adsorção

(Sharma & Agarwal, 2001).

Isoterma de Proteína: PP

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

C* (mg/ml)

0

1

2

3

4

5

Q*(m

g/m

2)


(B) Isoterma de Atividade: PP

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4

U* (U/ml)

0

10

20

30

40

50

60

70

Q* (U

/m2

)



(A)

118

A Tabela 4.8 apresenta os dados obtidos a partir das isotermas de Langmuir

geradas para atividade enzimática quando o polipropileno foi utilizado como suporte,

tanto na forma de microporos quanto na forma de membrana.

Tabela 4.8: Parâmetros da isoterma de Langmuir, em relação a atividade, obtidos pela imobilização

da lipase Amano AK sobre microporos e membranas de polipropileno (PP).

É necessário analisar coerentemente os dados gerados e as curvas ajustadas a fim

de evitar conclusões precipitadas prejudicando assim a avaliação correta do processo de

imobilização, assim, os campos sem valores na Tabela 4.8 representam valores

ajustados de forma não coerente pelo programa utilizado. Daí a necessidade de se

conhecer o processo como um todo, pois desta forma o pesquisador tem plena

consciência do tipo de comportamento que deve esperara em um determinado ensaio.

Além de uma análise detalhada do processo após o ajuste dos dados experimentais

a um determinado modelo de isoterma é importante também avaliar o comportamento

real do biocatalisador produzido. Assim, observando-se a Tabela 4.8 é possível concluir

que membrana de PP (polipropileno) seria sem dúvida o melhor material para adsorção

hidrofóbica quando comparado ao mesmo material na forma microporosa (accurel EP

100). Entretanto, quase não há diferença em relação a atividade real retida na membrana

e no pó conforme pode ser observado nas Figuras 4.30 (a) e 4.32. Essa informação

deixa claro que, neste caso, as propriedades físico-quimicas do material são mais

importantes do que a forma de apresentação do mesmo. Assim, o uso de PP, apesar

de não apresentar hiperativação com a enzima amano AK pode ser utilizado no processo

tanto na forma de pó quanto na de membrana já que os parâmetros que levam em

consideração a atividade real do biocatalisador gerado (E e Ra ) foram praticamente os

mesmos.

Normalmente o processo de imobilização de enzimas sobre PP é sempre via

adsorção hidrofóbica, visto que não há grupamentos disponíveis no suporte para

Material/Tipo de isoterma QMAX.( U/m2) K (mL/mg) R

2

Accurel MP 100/Teórica 8,34 0,96 0,972

Accurel MP 100/Real 0,56 ___ 0,972

Membrana de PP/Teórica 65,07 2,67 0,982

Membrana de PP/Real 3,89 ___ 0,987

119

formação da base de Schiff. Nestes casos o que se faz é a introdução de grupos

hidrofílicos através de ligação covalente do grupamento amina (NH2) (Balcão et al.,

2010). Esses grupamentos introduzidos em suportes hidrofóbicos podem gerar suportes

adequados para estudos de imobilização de enzimas.

Bayramoglu e col. (2010) utilizaram membranas de PP funcionalizadas para

imobilização da lipase de Candida rugosa. Inicialmente dissolveram o cloreto de

polipropileno em tolueno e paralelamente hexametileno diamina em uma mistura de 1:1

de acetona e álcool isopropílico. Posteriormente as soluções foram secas e depois

misturadas em atmosfera de argônio em sistema reacional fechado. Após a preparação

das membranas (Figura 4.33), as mesmas foram submetidas a reação de ativação do

grupo amina através da adição de glutaraldeído, como discutido, posteriormente, em

outros suportes, tais como: nylon 6,6 e poli-éter-imida.

Figura 4.33: Esquema da rota de imobilização enzimática em membranas de PP ativadas com NH2

(Bayramoglu et al., 2010).

Segundo os autores após o processo de otimização do procedimento de

imobilização foi obtido cerca de 70 U/cm2 de atividade a 40°C para o biocatalisador

gerado.

120

4.3.2. Membranas de Poli (éterimida) (PEI)

Na busca por materiais hidrofóbicos candidatos a suporte para a imobilização

enzimática, testou-se a poli(éterimida), que também pode ser utilizada no preparo de

membranas pela técnica de imersão-precipitação.

A poli(éterimida), PEI, é um polímero amorfo obtido a partir da policondensação

de um dianidrido contendo ligações éter e uma diamina aromática. A unidade imida

promove a rigidez, resistências mecânica e térmica, enquanto as ligações contendo o

grupo éter conferem flexibilidade às cadeias, o que permite a processabilidade do

polímero (Silva, 1996).

A PEI, pertence a classe dos polímeros ou plásticos de engenharia. Normalmente

esses polímeros possuem propriedades que competem com materiais metálicos e

cerâmicos, apresentam módulo de elasticidade elevado, resistência a temperaturas

relativamente altas, tenacidade, alta resistência ao impacto, resistência a abrasão, bom

isolamento elétrico, resistência química e à agressão por exposição ao tempo (Silva,

1996).

Nos testes iniciais de imobilização utilizando-se partículas densas do polímero,

observou-se, devido a baixa área específica, baixa atividade do biocatalisador gerado.

Assim, propôs-se a síntese e caracterização de diferentes membranas microporosas com

a PEI. O estudo comparativo entre os materiais foi efetuado em função dos aditivos

utilizados. Assim, definida a quantidade de aditivo necessária, neste caso 3%, estudou-

se os diferentes tipos de aditivos, a saber: nitrato de lítio, polivinilpirrolidona e uma

mistura 1:1 dos dois aditivos anteriores.

A opção em se utilizar um sal inorgânico como aditivo (LiNO3) baseou-se no

trabalho de Borges (1993) que em seus estudos verificou que a baixa massa molar do sal

facilita o seu processo de extração durante a precipitação da membrana, diferentemente

da polivinilpirrolidona (PVP) que fica parcialmente retida na superfície da membrana,

alterando de certa forma as propriedades estruturais da matriz gerada. Além disso, a

solubilidade deste sal em água é relativamente alta, fato que contribui ainda mais no seu

processo de extração.

Além da imobilização via adsorção hidrofóbica, membranas de PEI também foram

utilizadas para imobilizar a lipsase de Pseudomonas fluorecens via ligação covalente,

visto que este polímero apresenta grupamentos disponíveis para a formação de base de

121

Schiff após o processo de ativação com ácido clorídrico (HCl) o que não era permitido

em PP como discutido anteriormente.

Para o processo de imobilização via adsorção hidrofóbica utilizou-se o mesmo

protocolo definido para o polipropileno. Assim, inicialmente foram preparadas soluções

com diferentes concentrações (proteína e atividade) de entrada a saber: 0,027 a 0,62 mg

de proteína/mL e 0,679 a 14 U/mL.

No caso da imobilização por ligação covalente soluções de entrada mais diluídas

foram utilizadas a fim de evitar a formação de agregados enzimáticos via ligação

cruzadas, definidos com CLEA (Cross Linked Enzymes Aggregates) em função do

glutaraldeído presente na membrana.

As Figuras 4.34-4.36 apresentam as isotermas de Langmuir para a imobilização da

lipase de Pseudomonas fluorecens sobre membranas de PEI contendo 3% de diferentes

aditivos.


(B) para os dados experimentais de proteína (0,027-0,62 mg/mL), ambas em membrana de PEI

contendo 3% de LiNO3 (PN) a 4°C.

(a)

(b)

Isoterma de Atividade: PEI + 3% de LiNO3

0 2 4 6 8 10 12

U* (U/mL)

0

5

10

15

20

25

30

35

Q* (U

/m2

)

_____Isoterma de Langmuir Teórica: Adsorção hidrofóbica

Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Real: Adsorção hidrofóbica

Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Teórica: Ligação covalente

Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Real: Ligação covalente

Dados Experimentais

(A) Isoterma de Proteína: PEI + 3% LiNO3

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

C* (mg/mL)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Q*(m

g/m

2)

_____Isoterma de Langmuir: Adsorção hidrofóbica Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir: Ligação Covalente Dados Experimentais

(B)

122



contendo 3% de PVP (PV) a 4°C.



contendo 1,5% de LiNO3 + 1,5% de PVP (PH) a 4°C.

A Tabela 4.9 sintetiza todos os parâmetros obtidos a partir das isotermas de

Langmuir em relação a atividade geradas com a PEI e os diferentes aditivos.

Isoterma de Atividade: PEI + 3% de PVP

0 2 4 6 8 10

U* (U/mL)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Q* (U

/m2

)



_____Isoterma de Langmuir Teórica: Ligação covalenteDados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Real: Ligação covalenteDados Experimentais

(A) Isoterma de Proteína: PEI + 3% de PVP

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

C* (mg/mL)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Q*(m

g/m

2)



(B)

Isoterma de Atividade: PEI + 1,5% de LiNO3 + 1,5 % PVP

0 2 4 6 8 10 12

U* (U/mL)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Q* (U

/m2

) _____Isoterma de Langmuir Teórica: Adsorção hidrofóbica Dados Experimentais


_____Isoterma de Langmuir Teórica: Ligação covalenteDados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Real: Ligação covalenteDados Experimentais

(A)

Isoterma de Proteína: PEI + 1,5% de LiNO3 + 1,5 % PVP

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

C* (mg/mL)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Q*(

mg

/m2)



(B)

123

Tabela 4.9: Parâmetros da isoterma de Langmuir, em relação a atividade, obtidos pela imobilização

da lipase Amano AK sobre diferentes membranas de PEI através de ligação covalente e adsorção

hidrofóbica.

É possível observar que em relação à adsorção hidrofóbica, praticamente a escolha

do aditivo não alterou significativamente os parâmetros dos biocatalisadores gerados.

Entretanto ao se imobilizar a lipase de Pseudomonas fluorecens via ligação covalente os

dados ficam aleatórios e os ajustes prejudicados. Além disso, comparando-se o mesmo

suporte é possível observar que no caso de uma imobilização via adsorção hidrofóbica

ocorre a perda de aproximadamente 83% de atividade entre a capacidade máxima

adsortiva (Modelo de Langmuir) teórica, que leva em conta apenas as soluções de

entrada e saída de imobilização, e a do biocatalisador obtido. Entretanto, cabe ressaltar

que em relação à quantidade de proteína adsorvida os suportes contendo aditivos

diferenciados apresentaram o mesmo comportamento, ou seja, suportes com maiores

áreas específicas adsorveram uma quantidade maior de proteína. No caso da membrana

de PEI contendo 1,5% de PVP e 1,5% de LiNO3 e a de 3% de LiNO3 apresentaram

comportamento similar, cerca de 40% de adsorção proteíca, já a membrana com 3% de

PVP mostrou uma capacidade média adsortiva maior, ou seja, 80%.

Comparando-se os dados relativos à imobilização via ligação covalente, o ajuste

ficou prejudicado, entretanto houve um aumento na capacidade adsortiva dos dois

suportes anteriormente discutidos (28% a mais de proteína a mais ficou adsorvida em

ambos os suportes).

Aditivo/Método de Imobilização QMAX.( U/m2) K (mL/mg) R

2

LiNO3/Adsorção hidrofóbica teórica 19,79 0,68 0,98

PVP/Adsorção hidrofóbica teórica 20,34 0,55 0,99

PVP+ LiNO3/Adsorção hidrofóbica teórica 28,09 0,95 0,99

LiNO3/Adsorção hidrofóbica real 2,56 1,23 0,97

PVP/Adsorção hidrofóbica real 2,76 1,49 0,97

PVP+ LiNO3/Adsorção hidrofóbica real 3,06 2,82 0,98

LiNO3/Ligação covalente teórica 25,5 3,7 0,97

PVP/Ligação covalente teórica ___ 0,02 0,96

PVP+ LiNO3/Ligação covalente teórica ___ ___ ___

LiNO3/Ligação covalente real 0,2 ___ ___

PVP/Ligação covalente real 0,94 ___ 0,99

PVP+ LiNO3/Ligação covalente real ___ 0,01 ___

124

Na Tabela 4.9 é possível verificar que por se tratar de um processo cujo efeito é

menos deletério para a atividade enzimática, as imobilizações via adsorção hidrofóbica

foram as que apresentaram melhor comportamento em relação ao ajuste dos dados

experimentais ao modelo de Langmuir. Tal fato pode estar baseado na força de ligação

entre a enzima e o suporte, já que ao se optar pela ligação covalente a enzima pode

desativar devido a perda de sua estrutura terciária, importante no seu desempenho

catalítico. Além disso, baseado apenas no modelo de Langmuir, pode-se verificar que o

biocatalisador obtido via ligação covalente com a membrana de PEI (3% de LiNO3)

apresentou bons resultados para os parâmetros de interesse, Qmax. e K. Entretanto, o

parâmetro que deve ser levado em consideração é a Ra, que neste caso só foi maior

comparado com o processo via adsorção hiodrofóbica quando a membrana contendo 3%

de PVP foi utilizada como suporte. A este fato pode estar associado uma falha no pré-

tratamento do suporte, antes da imobilização, ocasionando regiões onde foi favorecida a

adsorção hidrofóbica ao invés da ligação covalente. Além disso, a desativação

enzimática durante o processo de imobilização em função da metodologia utilizada

pode ter sido menor para este suporte.

Na literatura muitos trabalhos relatam a perda de atividade enzimática quando se

utiliza a ligação covalente como processo já que se trata de um processo mais deletério

para a enzima. Assim, a ativação com glutaraldeído forma grupos aldeídos no suporte

ativado que irão reagir com grupos aminos da enzima por meio de ligações covalentes

instáveis (base de Schiff). Embora seja um método de ativação bastante utilizado em

imobilizações enzimáticas, ele apresenta alguns problemas, tais como: moléculas de

enzima podem ser imobilizadas no suporte com diferentes orientações, ou seja,

alteração da estrutura terciária da enzima, tornando o sítio ativo de alguma delas

inacessível para grandes substratos (Tardioli et al., 2003); podem ser formadas

múltiplas camadas de enzima e/ou aglomerações excessivas das moléculas no interior

dos poros, dificultando o acesso ao sítio ativo (Sobral et al., 2002 e 2003); produzem

derivados que são poucas vezes mais estáveis que a enzima solúvel; e a alta reatividade

e instabilidade dos grupos reativos requerem rápido contato com a enzima, não

permitindo estocagem prolongada.

As Figuras 4.37-4.39 apresentam os parâmetros de imobilização reais obtidos a

partir dos biocatalisadores produzidos seguindo as duas metodologias testadas.

125


Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de PEI contendo 3% de LiNO3 (PN) a 4°C.


Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de PEI contendo 1,5% de LiNO3 e 1,5% de PVP (PH) a

4°C.


Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de PEI contendo 3% de PVP (PV) a 4°C.

126

As Figuras 4.37-4.39 demonstram, como confirmado pelas isotermas geradas, que

após o processo de imobilização via ligação covalente que a enzima perde atividade

consideravelmente. Os valores de retenção obtidos são mais baixos quando comparados

aos gerados por um biocatalisador produzido via metodologia de adsorção hidrofobia.

Além disso, verificou-se também que soluções menos concentradas na entrada do

processo de imobilização, principalmente quando se utilizou ligação covalente, geraram

biocatalisadores mais ativos, provavelmente pela não ocorrência de “overcrounding”.

De uma forma geral, independente do suporte (PP ou PEI), os valores de retenção

de atividade foram muito similares, entre 15-20 %, a não ser para o biocatalisador

gerado com a membrana contendo 3% de PVP, cujo valor atingiu 25%. Interações entre

o PVP e a estrutura polimérica podem explicar esse resultado, visto que o PVP não é

100% removido após a confecção da membrana, desta forma, o mesmo pode ter agido

sinergeticamente no aumento de Ra.

A presença do PVP na solução polimérica precursora proporciona à membrana

uma característica hidrofílica, que se torna muito importante em aplicações industriais

com soluções protéicas, pois se sabe que materiais hidrofílicos são menos suceptíveis à

adsorção de proteínas. Estas membranas são bastante interessantes quando se trabalha

com soluções aquosas de um modo geral, pois se obtém maiores fluxos permeados (Di

Luccio, 1997; Perreira 1999; Carvalho 2005). A presença deste aditivo melhorou o

processo de adsorção via ligação covalente (retenções de atividade próximas de 50%),

já que o PVP diferentemente do outro aditivo permanece na estrutura e também deve

reagir com o glutaraldeído favorecendo a reação com a enzima.

Merçon e col. (2000) utilizaram membranas de PEI para imobilização da lipase de

Mucor miehei via adsorção hidrofóbica para hidrólise de óleo de babaçu.

Diferentemente deste trabalho, a imobilização da enzima proposta pelos autores foi

contínua ao longo de um reator de fibras ocas e, segundo os mesmos, quanto maior foi à

concentração de enzima disponibilizada para imobilização, maior a quantidade de

material adsorvido ao longo das fibras. Além disso, o tempo de imobilização para

atingir saturação segundo o modelo de Langmuir foi de apenas 30 minutos. Neste tempo

os autores obtiveram um biocatalisador com cerca de 19,5g/m2 em termos de Qmax. e

atividade de 16,3 U.

Com o objetivo de verificar o efeito da mudança da lipase sobre o valor de

retenção de atividade do biocatalisador gerado a lipase de Candida antarctica fração B

127

foi imobilizada via adsorção hidrofóbica sobre a membrana de PEI contendo 3% de

LiNO3. A faixa de concentração em termos de atividade foi de 1-90 U/mL e os dados

também se adequaram ao modelo de Langmuir com R2 maior que 90%. A Figura 4.40

apresenta os parâmetros de imobilização do biocatalisador gerado.


Candida antarctica fração B (CAL-B) sobre a membrana de PEI contendo 3% de LiNO3 (PN) a

4°C.

Pode-se verificar que a perda de atividade em relação a CALB é muito maior que

em relação a Amano AK, primeiramente porque foram utilizadas maiores concentrações

nas soluções de entrada, intensificando o fenômeno de overcrownding e, além disso, a

própria lipase pode ser mais suscetível a desativação da enzima durante a imobilização,

dificultando a exposição do sítio ativo, que é mais ocluso (localizado numa fenda

estreita) na estrutura da CAL-B (Freire e Castilho, 2008).

4.3.3. Membranas de Nylon 6,6

A fim de obter-se um biocatalisador com maior retenção de atividade (Ra)

membranas de nylon 6,6 foram testadas como suporte. Manjon e col. (1991)

observaram que este suporte, em função de suas características, permite uma melhor

128

expressão da atividade enzimática desde que uma elevada porcentagem de enzima esteja

imobilizada na interface.

Este suporte tem sido utilizado para imobilização enzimática via ligação

covalente para hidrólise enzimática de muitos substratos (Manjon et al., 1991; Carneiro

da Cunha et al., 1999).

A Figura 4.41 apresenta as isotermas de adsorção, proteína e atividade, da

enzima Amano AK na membrana de nylon via adsorção hidrofóbica e ligação

covalente.


(B) para os dados experimentais de proteína (0,027-0,62 mg/mL), ambas em membrana Nylon 6,6

(N) a 4°C.

Apesar de uma quantidade menor de proteína adsorvida sobre a membrana de

nylon é possível observar que os valores em relação a quantidade máxima de atividade

retida são muito próximos. A Tabela 4.10 rapresenta os parâmetros calculados a partir

da isoterma de atividade (Figura 4.41 (a)).

Isoterma de Atividade: Nylon

0 2 4 6 8 10

U* (U/mL)

0

10

20

30

40

50

Q*

(U/m

2)

_____Isoterma de Langmuir Teórica: Adsorção hidrofóbica

Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Real: Adsorção hidrofóbica

Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Teórica: Ligação covalente

Dados Experimentais

_____Isoterma de Langmuir Real : Ligação covalente

Dados Experimentais

(A) Isoterma de Proteína: Nylon

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

C* (mg/mL)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Q*(m

g/m

2)



(B)

129

Tabela 4.10: Parâmetros da isoterma de Langmuir, em relação a atividade, obtidos pela

imobilização da lipase Amano AK sobre membrana de nylon 6,6 através de ligação covalente e

adsorção hidrofóbica.

A Figura 4.42 representa os parâmetros de imobilização real obtidos a partir dos

biocatalisadores produzidos seguindo as duas metodologias adotadas.


Pseudomonas fluorecens sobre a membrana de nylon 6,6 (N) a 4°C.

Dentre os suportes testados o nylon foi o que apresentou maior constante de

afinidade bem como retenção de atividade ao utilizar-se como metodologia de

imobilização o processo via ligação covalente. A adsorção hidrofóbica gerou valores

similares aos obtidos com os outros suportes testados, não apresentando nenhuma

diferenciação significativa. Os baixos valores de Ra para soluções mais diluídas no

processo via ligação covalente demostram que pode ter havido grande perda de

atividade durante o processo de imobilização. Cabe ressaltar que a quantidade de

proteína adsorvida em ambas as metodologias foi em média de 80% para ambos os

processos, entretanto a imobilização via ligação covalente apresentou melhores

resultados de retenção de atividade (Ra > 35%), indicando que para este suporte a

interação covalente é o processo mais adequado.

Material/Tipo de ligação QMAX.( U/m2) K (mL/mg) R

2

Nylon Teórica/Ads. Hidrofóbica 48,72 1,75 0,914

Nylon Real/Ads. Hidrofóbica 3,09 ___ 0,932

Nylon Teórica/Ligação Covalente 13,59 1,61 0,973

Nylon Real/ Ligação Covalente 3,59 2,28 0,967

130

Bruno e col. (2004) utilizando membrana de nylon (1 cm2) para imobilizara uma

lipase de Mucor miehei e obtiveram cerca de 199 U/ g de suporte com uma retenção de

aproximadamente 8% de proteína.. Neste trabalho os autores verificaram que a melhor

imobilização foi gerada ao se utilizar polietilenoimina para fazer a ligação covalente

entre suporte e enzima, entretanto há uma elevada queda de retenção de atividade após o

primeiro ciclo (80 %) e até o quarto ciclo de reuso foram perdidos 98% de atividade.

Segundo os autores há uma perda de atividade muito maior quando o processo de

imobilização seguiu o mesmo protocolo deste trabalho, após o terceiro ciclo de uso o

biocatalisador já havia perdido 96% de atividade.

De uma forma geral, os biocatalisadores gerados ao serem utilizados na

resolução cinética do octanoato de (R,S)-IPG apresentaram conversões abaixo de 4% e

elevada perda de atividade. Por este motivo a lipase liofilizada foi apenas confinada em

um reator de membrana, pois desta forma se garantiu 100% de atividade retida no início

do processo.

4.4. Espectroscopia no Infravermelho (FTIR)

As análises por espectrometria de infravermelho foram realizadas com o objetivo

de investigar o aparecimento de bandas características de grupos químicos resultantes

da reação de adsorção física ou ligação covalente da lipase de Pseudomonas fluorecens

com o material polimérico testado como suporte.

A Figura 4.43 representa os espectros obtidos dos materiais testados como suporte

para imobilização enzimática, a saber: nylon 6,6, poli(éter imida) com 3% de PVP (PV),

poli(éter imida) com 3% de nitrato de lítio (PN), poli(éter imida) com 1,5% de PVP e

1,5% de nitrato de lítio (PH) e polipropileno (PP).

131

(a)

(c)

(b)

132

Figura 4.43: Espectro de infravermelho na faixa de 0 a 5000 cm-1

para diferentes materiais

utilizados como suporte para imobilização enzimática, a saber: (a) PEI+3% de LiNO3, (b)

PEI+1,5% de PVP+1,5% de Lino3, (c) PEI+3% de PVP, (d) Membrana de polipropileno e (e)

membrana de nylon.

A Tabela 4.11 apresenta para a PEI, PP e Nylon os comprimentos relativos às

bandas características de grupos funcionais presentes nestes polímeros. Estas bandas são

observadas nos espectros apresentados na Figura 4.43.

(e)

(d)

133

Tabela 4.11: Comprimento de onda (λ) relativo às bandas características de determinados grupos

funcionais presentes nas moléculas da PEI, PP e nylon 6,6.

Material Grupos funcionais λ (cm-1

)

PEI

C = O 1722

C - N 1356

C - O- C 1274

PP

CH/CH2/CH3 2850-2980

C - C 1167

C - H 890

Nylon 6,6

N- H 3300

C-H2 2930-2860

C = O 1365

C - N 1416

Normalmente, a lipase livre apresenta um espectro típico, ou seja, bandas na faixa

de 1650 cm-1

(amina primária) e 1600 cm-1

(amina secundária). Na Figura 4.43 (acc.) é

possível observar que quando a lipase foi adsorvida hidrofobicamente no suporte houve

o aparecimento de uma banda na faixa de 3400 cm-1

referente ao estiramento da ligação

0-H ou da ligação N-H, provavelmente, devido a presença de água ou material protéico

nos suportes analisados. Comparando-se assim os materiais obtidos a partir da PEI é

possível verificar que de fato há uma modificação no espectro que, provavelmente, está

relacionada a ligação da lipase ao suporte (introdução da banda da amina secundária no

suporte). No caso da ligação covalente é possível verificar que a modificação nesta

região foi menos intensa, como esperado para adsorção na forma de monocamada.

Devido a impossibilidade de se efetuar a ligação covalente da enzima com o

polipropileno (PP) o uso da adsorção hidrofóbica foi a única alternativa. Neste caso é

possível verificar mais claramente a mudança na faixa entre 1600-1700 cm-1

,

comprovando que de fato houve a imobilização da enzima.

No caso da membrana de nylon 6,6 a alteração principal foi observada no espectro

do suporte em que a adsorção foi efetuada por ligação covalente. Em princípio, o

glutaraldeído (utilizado no pré-tratamento da membrana) pode reagir com o nitrogênio

do grupo amida, criando sítios de fixação para a proteína. Por outro lado, a característica

mais hidrofílica do nylon pode ter desfavorecido as interações hidrofóbicas da proteína

134

com o suporte, reduzindo a quantidade adsorvida. Entretanto, a membrana reteve

atividade nas duas condições sob a qual foi exposta.

4.5. Termogravimetria (TG)

A fim de verificar outras diferenças estruturais, decorrentes dos diferentes aditivos

utilizados, as membranas de PEI foram submetidas a uma análise termogravimétrica

onde se acompanhou a perda de massa das amostras em função do aumento da

temperatura. As curvas de termogravimetria das amostras são apresentadas na Figura

4.44.

Figura 4.44: Análise termogravimétrica das membranas de PEI com diferentes aditivos.

A análise da Figura 4.44 mostra que membrana que foi preparada com nitrato de

lítio (PN) apresenta variação de massa correspondente a degradação térmica da PEI. As

membranas preparadas com PVP como aditivo, por outro lado, apresentaram duas

regiões de perda de massa, correspondente ao PVP e ao PEI. A maior quantidade de

PVP na solução utilizada para o preparo da membrana proporcionou uma intensificação

da perda de massa correspondente a degradação térmica deste polímero. Estes

resultados demonstram que o PVP permanece na estrutura da membrana e pode conferir

características mais hidrofílicas a membrana resultante.

135

4.6. Reator enzimático assistido por

membranas

Para possibilitar o escalonamento do processo de resolução enantiosseletiva de

misturas racêmicas, investigou-se a utilização de reatores assistidos por membranas. O

principal objetivo é a remoção do produto gerado pela reação enzimática na fase

orgânica, para isto, optou-se em utilizar a extração para a fase aquosa. A membrana foi

utilizada para manter as fases em contato, mas evitar a dispersão entre elas.

Os ensaios iniciais foram desenvolvidos sem a presença da enzima e em um reator

do tipo batelada dividido em dois compartimentos distintos, um para fase orgânica

(acetato de etila ou tolueno) e outro para a aquosa (tampão fosfato de sódio 50 mM com

pH = 7), separados por uma membrana microporosa, inicialmente de nylon (área= 3,5

cm2, diâmetro de poro = 1,83µm). De cada lado do reator foi adicionado 140 mL

(solvente/tampão), a concentração do álcool em tolueno foi de 5,8 mM, enquanto que

em acetato de etila foi de 4,88 mM. Estes solventes foram os mais eficientes na

resolução do éster nos ensaios cinéticos. Já para o éster essa concentração foi cerca de

4,7 mM em ambos os solventes testados. Para determinar o fluxo do álcool através da

membrana, acompanhou-se através de CG sua concentração na fase aquosa e na fase

orgânica. A solubilidade do éster (octanoato de (R,S)-IPG) na água pode ser considerada

nula e sua concentração permanece constante na fase orgânica. As Figuras 4.45-4.46

representam esse acompanhamento em acetato de etila e tolueno, respectivamente.

136

Figura 4.45: Variação da concentração do (S)-IPG e (R)-IPG na fase aquosa e na fase orgânica

(acetato de etila). Sendo a concentração inicial de (R,S)-IPG na fase orgânica de 4,88 mM, volume

das fases igual a 140 mL e temperatura do processo igual a 23°C.

Figura 4.46: Variação da concentração do (S)-IPG e (R)-IPG na fase aquosa e na fase orgânica

(tolueno). Sendo a concentração inicial de (R,S)-IPG na fase orgânica de 5,88 mM, volume das fases

igual a 140 mL e temperatura do processo igual a 23°C.

Comparando-se as Figuras 4.45 e 4.46 é possível verificar que a transferência do

álcool para a fase aquosa (tampão fosfato) foi mais rápida quando tolueno foi utilizado

como solvente. O fato da transferência de massa do álcool ser mais rápida em tolueno

está relacionada a sua maior hidrofobicidade, ou seja, menor afinidade com o álcool. Tal

fato pode ser comprovado também por meio dos valores dos coeficientes de partição do

137

álcool entre o solvente e a fase aquosa, 0,16 e 1,09 para o tolueno e acetato de etila,

respectivamente.

É importante mencionar também que nestes experimentos a temperatura utilizada

foi a ambiente (23°C). Além disso, agitação foi fornecida ao sistema por meio de

agitadores magnéticos, a fim acelerar a transferência de massa nas regiões adjacentes a

superfície da membrana.

Estes ensaios serviram apenas para o dimensionamento de um reator com

recirculação das fases e maior área de permeação. Para tanto, foi necessário a obtenção

de alguns dados experimentais, como o fluxo do álcool através da membrana e a taxa de

reação.

Desta forma, o contactor de membranas consistiu de um módulo com membranas

planas dividido em várias sessões, cada qual com área nominal de membrana em torno

de 19,64 cm2 e volume morto de 5,9 cm

3. A metodologia aplicada no desenvolvimento

deste sistema seguiu os mesmos propósitos do sistema do com apenas uma membrana.

A Figura 4.47 apresenta o sistema utilizado para a reação e separação do octanoato de

(R,S)-IPG. Membranas comerciais de nylon foram utilizadas no processo, e devido a

baixa retenção de atividade após a imobilização da lipase Amano AK. Desta forma, a

lipase foi mantida apenas confinada no reator pela membrana, que impediu a permeação

da enzima para fase aquosa.

Figura 4.47: Sistema de contactores de membranas utilizado na resolução racêmica do éster

octanoato de (R,S)-IPG.

138

Os ensaios com módulo foram conduzidos com vazão de 2 mL/s, tanto para fase

orgânica, quanto para a aquosa. Entretanto, verificou-se que houve a mistura entre as

fases, o que foi atribuído a diferença de pressão entre os dois lados da membrana

ocasionada pelo escoamento das fases aquosa e orgânica. Para que não haja mistura de

fases em um processo que utiliza membrana como contactor, deve-se obedecer a relação

de La Place:

Eq. 4.1

Onde: ∆P = Diferença de pressão entre os dois lados da membrana; [dina/cm2]

Rp = Raio do poro; [cm]

Ϭ = Tensão interfacial; [dina/cm]

Para os solventes estudados as tensões interfaciais foram de 6,8 dina/cm e 36,1

dina/cm para o acetato de etila e tolueno, respectivamente (Donahuaen e Bartell, 1961).

Baseado nos valores de tensões superficiais e no tamanho médio do poro da membrana

de nylon, (0,92µm), observa-se que da vazão fornecida pela bomba irá ocorrer mistura

entre as fases.

Para evitar a mistura das fases as opções seriam a utilização de outro solvente ou

de membranas com menor tamanho de poros. A troca do solvente necessitaria uma nova

otimização das condições de reação e a utilização de membranas com poros menores

apresenta a dificuldade de fornecimento comercial. Desta foram, optou-se em utilizar

uma membrana composta de PEI recoberta por uma camada densa e fina PVA,

preparada no Laboratório de Processos com Membranas. A escolha por este material se

deu pelo fato do mesmo ser um polímero hidrossolúvel, com baixo potencial a formação

de incrustações, quimicamente estável e de baixo custo. Ademais, utilizando-se uma

membrana densa de PVA, o valor de ∆P poderia ser igual ou até mesmo maior do que o

que estava sendo utilizado anteriormente. O PVA por ser hidrofílico incha na presença

de água, possibilitando a passagem, por difusão, da molécula de álcool, com maior

afinidade pela água.

Para os testes com reação e separação simultâneas, utilizando a membrana de

PVA/PEI, a temperatura foi mantida a 30°C e as vazões da fase aquosa e da fase

orgânica foram de 5,14 e 6,4 L/h, respectivamente. Empregaram-se três sessões no

contactor de membranas, correspondendo a uma área de permeação de 58,92 cm2. Os

139

volumes de fase orgânica e aquosa foram 200 e 50 mL, respectivamente, e a

concentração inicial do substrato cerca de 4mM. Os frascos contendo as fases aquosa e

orgânica foram mantidos fechados para evitar evaporação do solvente. A quantidade de

enzima adicionada na fase orgânica foi de 166 mg, correspondendo a cerca de 30 U.

Para a dispersão da enzima foi adicionado 10% em volume de solução tampão,

formando um sistema emulsionado.

A Figura 4.48 apresenta o perfil de concentrações nas fases aquosa e orgânica,

enquanto a Figura 4.49 apresenta a resolução enantiomérica do octanoato de (R,S)-IPG

em acetato de etila.

Figura 4.48: Variação da concentração do (S)-IPG e (R)-IPG nas fases aquosa e orgânica em

acetato de etila a 30°C. Sendo a atividade inicial da lipase Amano AK igual a 30 U e a concentração

do octanoato de (R,S)-IPG igual a 4mM. Os volumes da fase orgânica e aquosa foram 200 e 50 mL,

respectivamente, e sendo que 10 % da fase orgânica foi água.

Perfil de concentração de (R)-IPG e (S)-IPG

nas fases orgânica e aquosa

140

Figura 4.49: Resolução cinética do octanoato de (R,S)-IPG em acetato de etila a 30°C. Sendo a

concentração inicial do éster 4mM e a atividade enzimática inicial da lipase Amano AK igual a 30

U. ( ) ee(P) e ( ) X e ( )ee(S).

Uma análise da Figura 4.49 mostra que até 6 horas foi possível obter de forma

enantiopura o álcool ((S)-IPG), entretanto, após 20% de conversão o antípoda começou

a se acumular no meio e este foi, então, também continuamente removido, logo, ocorreu

uma queda no valor de ee(P). Além disso, é possível observar que nem todo

enantiômero S foi extraído para a fase aquosa. Este feito pode ser devido a dois fatores:

a produção (taxa de reação x volume da fase) do enantiômero S ser superior à vazão

(fluxo x área de permeação) deste composto através da membrana; ou devido à

existência de limitações difusionais na transferência de massa.

A resolução cinética, utilizando o contactor de membranas com maior área de

permeação mostrou uma queda menos acentuada no valor de ee(P), indicando a

efetividade da remoção simultânea do produto. Assim como no sistema convencional,

enquanto o valor de ee(P) manteve-se elevado (em 99%) foi possível obter de forma

enantiopura ((S)-IPG) e separada do octanoato de (R,S)-IPG.

Um aumento na área efetiva de filtração (contactor de fibras ocas, por exemplo)

poderia aumentar a velocidade de extração do álcool da fase orgânica emulsionada,

deslocando-se desta forma o equilíbrio.

De uma forma geral, os resultados apresentados no estudo do contactor de

membranas mostram a viabilidade, ainda que bastante preliminar, de se efetuar a reação

e a separação simultânea (S)-IPG.

Resolução cinética em sistema de

contactores com membranas

141

CAPÍTULO 5

Conclusões e Sugestões para trabalhos futuros

5.1. Conclusões

O aumento no número de átomos da cadeia carbônica do éster obtido a partir

do álcool aumentou valor de ee(P) na reação de hidrólise do octanoato de

(R,S)-IPG para todas as lipases testadas.

A lipase proveniente de Pseudomonas fluorecens, forneceu tanto o produto

na forma enantiopura, em baixas conversões (< 20 %), quanto o substrato (X

> 85%).

O aumento da atividade de água no meio reacional gerou um aumento na

conversão, visto que trata-se de uma reação de hidrólise. Entretanto esse

aumento não foi acompanhado pelo aumento de ee(P).

A faixa de pH estudada para esta enzima também mostrou que o pH neutro

foi o mais eficaz para o reconhecimento maior pelo produto, neste caso o (S)-

IPG.

O ensaios de resolução cinética mostraram que, além da lipase ter afinidade

por solventes mais hidrofílicos, só há separação enantiomérica quando a

velocidade específica da reação é menor .

Membranas mais hidrofóbicas foram as que mostraram melhores resultados

em relação à imobilização enzimática.

142

Imobilizações via adsorção hidrofóbica, de uma forma geral, foram as que

apresentaram melhores resultados em relação ao parâmetro retenção de

atividade.

O processo via ligação covalente provavelmente gerou perda da estrutura

terciária da enzima gerando valores inferiores de retenção de atividade.

A imobilização da lipase Amano AK por adsorção hidrofóbica não gerou

bons resultados, visto que as atividades retidas ficaram abaixo de 30%. Desta

forma, optou-se pela utilização da enzima confinada no reator de membrana.

A viabilidade em se realizar a reação e a separação simultânea do álcool

proposto neste trabalho, (R,S)-IPG ficou evidenciada, apesar dos ensaios

preliminares, com o uso do contactor de membranas. Entretanto, novos

ensaios variando-se fluxo, área de extração, bem como outros parâmetros

relevantes devem ser avaliados a fim de melhorar o desempenho do processo.

Este trabalho apresentou apenas um estudo inicial, mas a ideia é utilizar

contactores de membranas em uma série de reações de resolução

enantiomérica, imobilizando-se ou não o biocatalisador. Comparando-se com

um processo tradicional, onde todos os substratos e produtos encontram-se

misturados com o biocatalisador, e, portanto, onde a etapa de separação é

essencial, o uso do contactor de membranas é de longe uma alternativa mais

viável, visto que o produto é recuperado isento de subprodutos, necessitando

apenas de uma etapa de concentração que é comum a qualquer processo

escolhido.

143

5.2. Sugestões para trabalhos futuros

Dar continuidade a operação do contactor com membranas planas em modo

contínuo variando-se algumas variáveis de processo tais como a vazão, área e

forma da membrana, dentre outros.

Efetuar as resoluções enantioméricas em sistema com fibras ocas, alterando-

se o diâmetro das fibras, bem como a densidade de empacotamento.

Testar as mesmas concentrações de enzima em temperatura igual ou inferior a

-44°C a fim de confirmar os resultados obtidos por Sakai e col. (1998).

Comparar economicamente o processo de resolução enzimática do octanoato

de (R,S)-IPG via processo tradicional e utilizando-se um contactor de

membranas.

Investigar a otimização do processo de esterificação enantiosseletiva com

enzimas comerciais e não comerciais para o (R,S)-IPG.

Avaliar outros suportes para imobilização desta lipase, tais como os

desenvolvidos no LABIM em conjunto com o laboratório do Professor José

Carlos Pinto da COPPE/UFRJ.

Avaliar o uso de células íntegras no processo contínuo, a fim de diminuir os

custos de produção, recuperação e imobilização da lipase utilizadas no

processo.

144

CAPÍTULO 6

Bibliografia

Akova A., Ustun G.; “Activity and adsorption of lipase from Nigella sativa seeds on

Celite at different pH values”, Biotechnology Letters, v. 22, p. 355-359, 2000.

Al-Duri B., Yong Y.P.; “Lipase immobilization: equilibrium study of lipases

immobilised on hydrophobic and hydrophilic/hydrophobic supports“, Biochemical

Engineering Journal, v. 4, p. 207-215, 2000.

Albanez N. E. F. K.; “Obtenção de óxido de cério com alta area superficial específica”.

Dissertação de Mestrado, Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo,

1996.

Albrecht W., Hilke R., Kneifel K., Weigel Th., Peinemann K.-V.; “Selection of

micropouros hydrophobic membranes for use in gas/liquid contactors: An experimental

approach”. Journal of Membrane Science, v. 263, p.66-76, 2005.

Aires Barros M. R., “Biocatálise em solventes orgânicos”. Boletim Biotecnologia,

disponível online em dequim.ist.utl.pt/bbio/72/pdf/BiocatSolOrg.pdf, capturado em

17/10/2011.

Almeida R. V., “Clonagem, expressão, caracterização e modelagem estrutural de uma

esterase termoestável de Pyrococcus furiosus”. Tese de doutorado, COPPE/UFRJ,

Brasil, pp.109, 2005.

Almeida R. V., Branco R. V., Santos B. C. P., Lima C.S., Campbell S. M., Martins O.

B., Antunes O. A. C., Freire D.M.G.; “Immobilization of a recombinant thermostable

esterase (Pf2001) from Pyrococcus furiosus on microporous polypropylene: isotherms,

145

hyperactivation and purification”. Biochemical Engineering Journal, v.39, p.531 -

537, 2008.

Araújo E. M., Melo T. J. A.; Santana L. N. L., Neves, G. A., Ferreira, H. C., Lira, H. L.,

Carvalho L. H., Á'vila Jr. M. M.; Pontes M. K. G., Araújo I. S.; “The influence of

organo-bentonite clay on the processing and mechanical properties of nylon 6 and

polystyrene composites”. Materials Science and Engineering: B , v.112, p.175, 2004.

Balcão, V. M., Paiva, A. L., Malcata, F. X.; "Bioreactors with immobilized lipases”.

Enzyme and Microbial Technology, v. 18, p. 392-416, 1996.

Balcão, V.M; Malcata, F. X. 1998. "On the performance of a hollow-fiber bioreactor for

acidolysis catalyzed by immobilized lipase", Biotechnology and Bioengineering, v.60,

1, pp.114 – 123, 1998.

Basri M., Yunus W. M. Z. W., Yoong W. S., Ampon K., Razak C. N.A. Razak, Salleh

A. B.; “Immobilization of lipase from Candida rugosa on synthetic polymer beads for

use in the synthesis of fatty esters”. Journal of Chemical Technology &

Biotechnology, v. 66, p. 169-173, 1996.

Basseti F.J.; “Preparação, caracterização e aplicação de membranas poliméricas

microporosas assimétricas”, Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas,

Faculdade de Engenharia Química, Campinas, 2002.

Bastisda A., Sabuquillo P., Armisen P., Fernadez-Lafuente R., Huguet J., Guisán J. M.,

"A single step purification, immobilization, and hyperactivation of lipases via interfacial

adsorptions on strongly hydrophobic supports". Biotechnology and Bioengineering, v.

58,5, p. 486-493, 1998.

Bayramoğlu, G. Hazerb B., Altıntaşa B., Arıcaa M. Y.; “Covalent immobilization of

lipase onto amine functionalized polypropylene membrane and its application in green

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0921510704002429



http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359511310003545#aff0010



146

apple flavor (ethyl valerate) synthesis”. Process Biochemistry, v. 46, n. 1, p. 372-378,

2011.

Beatriz A., Araújo Y. J. K.; Lima D. P.; “Glicerol: um breve histórico e aplicação em

sínteses estereosseletivas”. Química nova, v. 34, 2, p. 306-319, 2011.

Benjamin S., Pandey, A.; “Candida rugosa lipases: molecular biology and versatility in

biotechnology”. Yeast, v.12, p.1069-1087, 1998.

Berglund P; “Controlling lipase enantioselectivity for organic synthesis”. Biomolecular

Engineering, v. 18, p. 13-22, 2001.

Bevilaqua J. V., “Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de

protótipo de fármaco antiasmático”. Tese de Doutorado, pp. 165, COPPE/UFRJ, 2005.

Blanco R. M., Terreros P., Fernandéz-Perez M., Otero C., Diaz-González G.;

“Functionalization of mesoporous silica for lipase immobilization characterization of

the support and the catalysts”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 30, p.

83–93, 2004.

Blaser H. U., Schmidt E.; “Asymmetric catalysis on industrial scale: challenges,

approaches and solutions”. Wiley: Weinheim, Germany 2004.

Boom R.M., “Membrane formation by immersion precipitation: the role of polymeric

additive”, Ph. D. Thesis, Universiteit Twente, Enschede, 1992.

Bon E., Freire D. M. G., Mendes M .F., Soares F. V.; “Immobilization of Aspergillus

niger β-D- glucosidase on aminated chitin and alumina/alginate”. Biomass, v. 11, p.1-

8, 1986.

Borges C. P., “Fibras ocas compostas para remoção de poluentes orgânicos de soluções

aquosas pelo processo de pervaporação”, Tese de Doutorado, COPPE/UFRJ, Rio de

Janeiro, 1993.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/13595113

http://www.scopus.com/scopus/openurl/link.url?ctx_ver=Z39.88-2004&ctx_enc=info:ofi/enc:UTF-8&svc_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:sch_svc&svc.abstract=yes&rft_id=info:eid/2-s2.0-0032530679&rfr_dat=partnerID:Pp4QhCwO&rfr_dat=md5:14a83bde4a66ebf5a92f4dbbee57a948

http://www.scopus.com/scopus/openurl/link.url?ctx_ver=Z39.88-2004&ctx_enc=info:ofi/enc:UTF-8&svc_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:sch_svc&svc.abstract=yes&rft_id=info:eid/2-s2.0-0032530679&rfr_dat=partnerID:Pp4QhCwO&rfr_dat=md5:14a83bde4a66ebf5a92f4dbbee57a948

147

Bornscheuer U.T; “Microbial carboxyl esterases: classification, properties and

application in biocatalysis”. FEMS microbiology reviews, v. 26, p.73-81, 2002.

Bosley J.A., Peilow A. D.;”Immobilization of Lipases on Porous

Polypropylene:Reduction in Esterification Efficiency at Low Loading”. Journal of the

American Oil Chemists' Society , v.74, n. 2 , p. 107-111, 1997.

Bothun G.D., Knutson B.L., Strobel H.J., Nokes S.E.; “Massa transfer in hollow fiber

membrane contactor extraction using compressed solvents”. Journal of Membrane

Science, v. 227, p.183-196, 2003.

Bradford, M.M.; "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Analytical

Biochemistry, v.72, p.248–254, 1976.

Branco R. V, Gutarra M. L. E., Freire D. M. G., Almeida R. V.; “Immobilization and

characterization of a recombinant thermostable lipase (Pf2001) from Pyrococcus

furiosus on supports with different degrees of hydrophobicity. Enzyme Research, v. 1,

p. 1-8, 2010.

Brígida A. I. S., “Imobilização de lipases utilizando fibra da casca de coco verde como

suporte para aplicações industriais”. Tese de Doutorado, EQ/UFRJ, 2010.

Bruno L. M, Pinto G. A. S., Castro H. F., Lima-Filho J.L., Melo E. H. M.; “Variables

that affect immobilization of Mucor miehei lipase on nylon membrane”. World Journal

of Microbiology & Biotechnology, v. 20, p. 371-375, 2004.

Burton M.E., Shaw L.M, Shaw L. M., Schentag J.J., Evans W. E.; “Applied

pharmacokinetics and pharmacodynamics: principles of therapeutic drug monitoring, 4

ed; Lippincot Willians & Wikins: Pennsylvania, 2006.

Cardoso C. L.; “Imobilização de enzimas em suportes cromatográficos: Uma ferramenta

na busca por substâncias bioativas”. Química Nova, v. 32, n. 1, p. 175-187, 2009.

http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=jaocs&source=web&cd=1&ved=0CB8QFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.springer.com%2Fchemistry%2Fjournal%2F11746&ei=9GDhTuOoHsqSgQeEwIH_BQ&usg=AFQjCNGpchr261tYHITWcILHvkZVqVIDww&sig2=DOmhggNsDtBUqg0u9smhxA

http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=jaocs&source=web&cd=1&ved=0CB8QFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.springer.com%2Fchemistry%2Fjournal%2F11746&ei=9GDhTuOoHsqSgQeEwIH_BQ&usg=AFQjCNGpchr261tYHITWcILHvkZVqVIDww&sig2=DOmhggNsDtBUqg0u9smhxA

http://en.wikipedia.org/wiki/Marion_M._Bradford

http://www.journals.elsevier.com/analytical-biochemistry-methods-in-the-biological-sciences/

http://www.journals.elsevier.com/analytical-biochemistry-methods-in-the-biological-sciences/

http://www.hindawi.com/83047613/




148

Carneiro-da-Cunha M. G., Rocha J. M. S., Garcia F. A. P., Gil M. H., “Lipase

immobilization on to polymeric membranes”. Biotechnology Techniques, v. 13, p. 403-

409, 1999.

Carvalho R.B.; Borges C.P.; Nobrega R., “Membranas celulósicas para osmose inversa

e nanofiltração preparadas pela extrusão simultânea de duas soluções poliméricas”, In:

Anais do XIV Congresso Brasileiro de Engenharia Química, pp. 245, Natal, RN, Brasil,

Agosto, 2002.

Carvalho P. O. Calafati S. A., Marassi M., Silva D. M., Contesini F. J., Bizaco R.;

“Potencial de biocatálise enantiosseletiva de lípases microbianas”. Química Nova, v.

28, 4, p. 614-621, 2005.

Castilho L.R., “Development of a dynamic filter for integrated perfusion cultivation and

purification of recombinant proteins from mammalian cells”, série Fortschritt-

Berichte, VDI-Verlag, Alemanha, 2001.

Castro H. F., Silva M. L., Silva G. L.; “Evaluation of inorganic matrixes as supports for

immobilization of microbial lipase”. Brazillian Journal of Chemical Engineering, v.

17, p. 4-7, 2000.

Chen C.S., Fujimoto Y., Girdaukas G., Sih C. J., “Quantitative analysis of biochemical

kinetic resolutions of enatiomers”. Journal American Chemical Society, v.104, p.

7294-7299, 1982.

Christensen M.W., Andersen L., Husum T.L., Hirk, O.; “Industrial lípase

immobilization”. European Journal of Lipid Science Technology, v. 105, p. 318-321,

2003.

Choi W. J., Lee K. Y., Kamg H. S., Lee S. .; “Biocatalytic enantioconvergent separation

of racemic mandelic acid”. Separation and Purification Technology, v. 53, p. 178-182,

2007.

149

Costa V. E. U., Amorim H. L. N.; “O emprego de lipases como agentes de resolução

cinética de enantiômeros em síntese orgânica: aspectos gerais sobre a influência do

solvente”. Química Nova, v. 22, n.6, p. 863-873, 1999.

Cunha A. G.; “Produção e imobilização de lipases microbianas em suportes com

diferentes graus de hidrfobicidade”. Dissertação de mestrado submetida ao Instituto de

Química da UFRJ, 2007.

Cunha A. G., Fernández-Lorente G., Bevilaqua J. V., Destain J.,Paiva L. M. C., Freire,

D. M. G., Fernández-Lafuente R., Guisán J. M.; “Immobilization of Yarrowia lipolytica

Lipase: a comparison of stability of physical adsorption and covalent attachment

techniques”. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.146, p.49 -56, 2008.

Cunha A. G., Fernández-Lorente G., Gutarra M. L. E., Bevilaqua J. V.,, Almeida R. V.,

Paiva L. M. C, Laduente R. F., Guisan J. M., Freire D. M. G.; “Separation and

Immobilization of lipase from Penicillium simplicissimum by selective adsorption on

hydrophobic supports”. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.156, p.563 - 575,

2009.

Cycler M., Grochulski P., Kazlauskas R. J., Schrag J. D., Bouthillier F., Rubin B.,

Serreqi A. N., Gupta A. K.; “A structural basis for the chiral preferences of

lipases”. Journal American Chemical Society, v. 116, p. 3180-3186, 1994.

Cygler M.; Schrag J. D.;” Structure as basis for understanding interfacial properties of

lípases”. Methods in Enzymoogy, v.284, p.3-27, 1997.

De Castro H. F., Mendes A. A., Santos J. C., Aguiar C. L.; “Modificação de óleos e

gorduras por biotransformação”. Química Nova, v. 27, 1, p. 146-156, 2004.

Dalla-Vecchia R., Nascimento M. G., Soldi V.; “Aplicações sintéticas de lipases

imobilizadas em polímeros”. Química Nova, v.27, 4, p.1-16, 2004.

150

Di Luccio M.; “Membranas microporosas planas e do tipo fibra-oca a partir de sistemas

contendo policarbonato como polímero base”, Dissertação de mestrado, COPPE/UFRJ,

Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 1997.

Dimitriu E., Secundo F., Patarin J., Fechete I.; “Preparation and properties of lipase

immobilized on MCM-36 support”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.

22, p. 119–133, 2003.

Ding H.B., Carr P.W., Cussler P.W.; “Racemic leucine separation by hollow-fiber

extraction”. American Institute of Chemical Engineers Journal, v.38,10, p.1493-

1498, 1992.

Donahuaen D. J., Bartell F. E.; “The boundary tension at water organic liquid

interfaces”. University of Michigan, v. 56, p. 480-484, 1961.

Espeso J., Lozano A. E., De La Campa J. G., Abajo J.; “Effect of substituents on the

permeation properties of polyamide membranes. Journal of Membrane Science, v.

280, p. 659-655, 2006.

Faber, K., “Biotransformation in Organic Chemistry: A textbook”. Third Edition,

Springer Produktions-Gesellschaft, Berlim, cap. 1-3, 1997.

Fai Liu A. M.; “Developing novel lipases from Bacillus thermocatenulatos to improve

enantioselectivitty by direted evolution”. Tese de doutorado, McGill University,

Canada, 1999.

Fernadez-Lafuente R., Armisén P., Sabuquillo P., Fernadéz-Lorente G., Guisán J. M.,

“Immobilization of lipases by selective adsorption on hydrophobic supports”,

Chemistry and Physics of Lipids, v. 93, p. 185-197, 1998.

Fernandez-Lorente G., Terreni M., Mateo C., Bastida A, Fernandez-Lafuente R.,

Dalmases P., Huguet J., Guisán J.M., "Modulation of lipase properties in macro-

aqueous systems by controlled enzyme immobilization: enantioseletive hydrolysis of a

151

chiral ester by immobilized Pseudomonas lipases", Enzyme and Microbial Technology,

v. 28, p. 389-396, 2001.

Ferrato F., Carriere F., Sarda L., Verger R.; “A critical reevaluation of the phenomenon

of interfacial activation”. Methods in Enzimology., v. 284, part B, p. 327-347, 1997.

Freire D. M. G., Sant’anna Jr. G. L., “Hydrolysis of starch with immobilized

glucoamylase: a comparison between two types of expanded-bed reactor”. Applied

Biochemistry and Biotechnology , v.26, p.23 - 33, 1990.

Freire D.M.G.; “Imobilização de amiloglicosidase em quitina – caracterização e testes

em reatores contínuos de leito expandido”, Tese de Mestrado, EQ/UFRJ, Rio de

Janeiro, 1988.

Freire D. M. G., Castilho, L. R.; “Lipases em biocatálise”. Enzimas em biotecnologia:

produção, aplicações e mercado, cap. 16, p.369-385, 2008.

Frings K., Koch M., Hartmeier W.; “Kinetic resolution of 1-phenyl ethanol with high

enantioselectivity with native and immobilized lipase in organic solvents”. Enzyme and

microbial technology, v. 25, p.303-309, 1999.

Gabelman A., Hwang, S.; “A theoretical study of dense gas extration using a hollow

fiber membrane contactor”. The Journal of Supercritical Fluids, v. 37, p. 157 – 172,

2006.

Gabelman A., Hwang, S.; “Hollow fiber membrane contactor”. Journal of Membrane

Science, v. 159, p.61-106, 1999.

Ghanem A., Abou,- Enein H. Y., “Lipase-mediated chiral resolution of racemates in

organic solvents”. Tetrahedrom: Asymmetry, v. 15, p. 3331-3351, 2004.

152

Giorno L., Molinari R., Natoli M., Drioli E., Hydrolysis and regioselective

transesterification catalyzed by immobilized lipases in membrane bioreactors, Journal

of Membrane Science, v.125, p.177, 1997.

Gitlesen T., Bauer M., Adlercreutz P.; “Adsorption of lipase on polypropylene powder”.

Biochimica et Biophysica Acta, v.1345, p.188–196, 1997.

Gotor V. F., Brieva R., Gotor V.; “Lipases: Useful biocatalysts for the preparation of

pharmaceuticals”, Journal of Molecular Catalysis B: enzymatic, v. 40, pp. 111-129,

2006.

Guisán J. M., Sabuquillo P., Fernandez-Lafuente R., Fernandez-lorente G.; “Preparation

of new lipases derivatives with high activity-stability in anhydrous media: adsorption on

hydrophobic supports plus hydrophilization with polyethylemine”, Journal of

molecular Catalysis B: enzymatic, v. 11, p. 817-824, 2001.

Gutarra M. L. E., Mateo C., Freire D. M. G., Torres F. A. G., Castro A. M., Guisan J.

M., Palomo J. M.; “Oriented irreversible immobilization of a glycosylated Candida

antarctica B lipase on heterofunctional organoborane-aldehyde support”.Catalysis, v. 1,

p. 260-266, 2011.

Gutman A.L., Brenner D., Boltanski A.; “Convenient practical resolution of racemic

alkyl-aryl alcohols via enzymatic acylation with succinic anhydride in organic

solvents”. Tetrahedron Asymmetry, v. 4, p.839-844, 1993.

Halling P. J., “Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media:

theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis”. Enzyme and

Microbial Technology, v. 16, p. 178-206, 1994.

Hasan F., Shah A. A., Hameed A.; “Industrial applications of microbial lipases”.


153

Hilal N., Kochkodan V., Nigmatullin R., Goncharuk V., Al-Khatib L.; “Lipase-

immobilized biocatalytic membranes for enzymatic esterification: comparison of

various approaches to membrane preparation”. Journal of Membrane Science, v.268,

p.198-207, 2006.

Hof R. P., Kellogg R. M; “Synthesis and lipase-catalyzed resolution of 5-

(hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-4-ones: masked glycerol analogs as potential building

blocks for pharmaceuticals”. Organic Chemistry, v. 61, p. 3423-3427, 1996.

Hoq M. M., Yamane T., Shimizu S., Funad T., Ishida S.; “Continuous hydrolysis of

olive oil by lipase in microporous hydrophobic membranes bioreactor”, Journal of the

American Oil Chemists' Society, v.62, p.1016-1021, 1985.

Hult K., Norin T.; “Enantioselectivity of some lipases: control and prediction”. Pure

and Applied Chemistry, v. 64, p. 1129-1134, 1992.

Jaeger K., Dijkstra B. W., Reetz M.T.; “Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-

dimensional structures, and biotechnological applications of lipases”, Annual Review of

Microbiology, v.53, p. 315-351, 1999.

Jaeger K. E., Ransac S., Dijkstra B. W., Colson C., Van Heuvel M., Misset O.; “Bacterial

lipases”. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Reviews, v.

15, p. 29-63, 1994.

Jaeger K. E., Reetz M. T.; “Microbial lipases form versatile tools for biotechnology”.

Trends in Biotechnology, v. 16, p. 396-403, 1998.

Jaeger K. E., Eggert T.; “Lipases for biotechnology”. Biotechnology, v. 13, p. 390-397,

2002.

Júnior I. J. S., Veredas V., Santos M. A. G., Santana C.C.; “Cromatografia em leito

móvel simulado na produção de substâncias enantiomericamente puras ou enriquecidas

em larga escala”. Química Nova, v. 29, 5, p. 1027-1037, 2006.

http://www.springer.com/chemistry/journal/11746

http://www.springer.com/chemistry/journal/11746

154

Kazlauskas R. J., Weissfloch, A. N. E., Rappaport, A. T., Cuccia, L. A. J; The Journal

of Organic Chemistry, v.56, p.2656–2665, 1991.

Kazlauskas R. J., Bornscheuer U. T.; “Biotransformation with Lipases”. A Multi

Volume Comprehensive Treatise in Biotechnology, (ed.) Rehm, H.J., Pihler G., Stadler,

A., Kelly, P. J.W. New York: Wiley VCH Verlag, v. 8, pp. 37-192, 1998.

Kennedy J. F., “Enzyme technology”. In: Rehm H. J., Reed G. Biotechnology, v.7,

Weinheim, 1987.

Keneifel K., Nowak S., ALbrech W., Hilke R., Just R., Peinemann K-V., “Hollow fiber

membrane contactor for air humidity control: modules and membranes”. Journal of

Membrane Science, 276, p. 241-251, 2006.

Koskinen A. M. P., Klibanov A. M.; “ Enzymatic Reactions in Organic Media”. Blackie

Academic & Professional, p.314 ; 1996.

Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat I. M., Marchant R., Koutinas A. A.;

“Immobilizations technologies and supports materials suitable in alcohol beverages

production: review”. Food Microbiology, v. 21, p. 377-397, 2004.

Kronemberger F. A., Santa Anna L. M. M., Fernandes A. C. L. B., Menezes R. R.,

Borges C. P., Freire D. M. G.; “Oxygen-controlled biosurfactant production in a bench

scale bioreactor”. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 147 p. 33-45, 2008.

Laane C., Boeren, S., Vos K., Veeger C.; “Rules for optimization of biocatalysis in

organic solvents”. Biotechnology and Bioengineering, v. 30, p. 81-87, 1987

Lin G.Q, Li Y.M., Chan A. S. C.; “Principles and applications of asymmetric

synthesis”. John Wiley & Sons, New York, 2001.

http://pubs.acs.org/journal/joceah

http://pubs.acs.org/journal/joceah

http://www.springerlink.com/content/120548/?p=aafc36d885ef40bd8d4fc37cc2d8148c&pi=0

155

Lima A. W. O, Angnes L., “Biocatálise em meios aquo-restritos:Fundamentos e

aplicações e química analítica”. Química Nova, v.22, 2, p. 229-245, 1999.

Lima V. M. G., “. Produção e purificação da lipase de Bacillus megaterium CCOC-

P2637 e sua aplicação em biocatálise em solventes orgânicos”. Tese de doutorado,

Universidade Federal do Paraná, pp. 140, 2004.

Liu A.M.F., Somers N.A., Kazlauskas R.J., Brush T.S., Zocher F., Enzelberger M.M.,

Bornscheuuer U.T., Horsman G. P., Mezzetti A., Schimidt-Dannert C., Schimid R. D.;

“Mapping the substrate selectivity of new hydrolases using colorimetric screening:

lipases from Bacillus Thermocatenulatus and Phiostoma piliferum, esterases from

Pseudomonas fluorescens and Streptomyces diastatochromogenes”. Tetrahedron

Asymmetry, 12, 545-556, 2001.

Ilanes A.; “Biotecnologia de enzimas“. Ediciones Universitarias de Valparaíso, Chile,

1994.

Lopez J. L., Madson, S.L.; “A multiphase/extractive enzyme membrane reactor for

production of diltiazen chiral intermediate”. Journal of Membrane of Science, v. 125,

p. 189-211, 1997.

Lourenço T. C., Cassiano N. M., Cass Q. B.; “Fases estacionárias quirais para

cromatografia líquida de alta eficiência”. Química Nova, v. 33, 10, p. 2155-2164, 2010.

Lozano P., Víllora G., Gómez D., Gayo A. B., Sánchez-Conesa J. A., Rúbio M., Iborra

J. L.; “Membrane reactor with immobilized Candida antarctica lípase B for Ester

synthesis in supercritical carbon dioxide”. The Journal of Supercritical Fluids, v. 29,

p. 121-128, 2004.

Lozano P.,Diego T., Larnicol M., Vaultier M., Iborra J. L., “Chemoenzymatic dynamic

kinetic resolution of racemic-phenylethanol in liquids and ionic liquids/supercritical

carbon dioxide systens”. Biotechnoloy Letters, v.28, p.1559-1565, 2006.

156

Long W.L., Knw P.C., Kamaruddin A.H., Bhatia S.; “Comparison of kinetic resolution

between two racemic ibuprofen esters in an enzymatic membrane reactor”. Process

Biochemistry, v.40, p.2417-2425, 2005.

Lundell K., Raijola T., Kanerva L. T.; “Enantioselectivity of Pseudomonas cepacia and

Candida rugosa lipases for the resolution of secondary alcohols: the effect of Candida

rugosa isoenzymes”. Enzyme and Microbial Technology, v. 22, p. 86-93, 1998.

Madalozzo A. D., “Síntese de ésteres etílicos utilizando uma lipase recombinante de

Rhizopus oryzae”. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Paraná, pp. 149,

2011.

Manjon A., Iborra J.L. and Arocas A.; Biotechnology Letters, v. 13, p. 339-344, 1991.

Martín-Matute, B.; Edin, M.; Bogár, K.; Kaynak, B. F.; Bäckvall, J. E. J. Am. Chem.

Soc. , v.127, p.8817-8825, 2005.

Margolin A.L.; “Enzymes in the synthesis of chiral drugs”. Enzyme and Microbial

Technology, v.7, p.113-119, 1996.

Mateo C., Palomo J. M., Fernández-Lorente G., Guisán J. M., Fernández-Lafuente R.; “

Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization

techniques”. Enzyme Microbial Technology, v.40, p.1451-1463, 2007.

Matsushima A., Kodera Y., Hiroto M.; “Bioconjugates of proteins and polyethylene

glycol: potent tools in biotechnological processes”. Journal of Molecular Catalysis B:

enzimatic, v.2, p. 1-17, 1996.

Mavroudi M., Kaldis S. P., Sakellaropoulos G. P.; “Reduction of CO2

emissions by a

membrane contacting process”, Fuel, v. 82, p. 2153-2159, 2003.

157

Mavroudi M., Kaldis S. P., Sakellaropoulos G. P.; 2006, “A study of mass transfer

resistance in membrane gas-liquid contacting processes”, Journal of Membrane Science, v.

272, p. 103-115, 2006.

Mendes A. A.; “Seleção de suportes e protocolos de imobilização de lípases para síntese

enzimática do biodiesel”. Tese de doutorado em Engenharia Química - Universidade

Federal de São Carlos, Brasil, pp. 194, 2009.

Merçon F., Sant’Anna Jr. G.L., Nobrega R., “Enzymatic Hydrolysis of Babassu oil in a

membrane bioreactor”. Journal of American Oil Chemists Society, v.77, p.1043-1048,

2000.

Mezzetti A., Keith C., Kazlauskas R. J., “Highly enantioselective kinetic resolution of

primary alcohols of type Ph-X-CH(CH3)-CH2OH by Pseudomonas cepacia lipase:

effect of acyl chain length and solvent”. Tetrahedron: Asymmetry, v. 14, p. 3917-3924,

2003.

Miyazawa T., Kurita S., Sakamoto H., Otomatsu T, Hirose K., Yamada T.; “Resolution

of 2,2-diphenyl-1,3-dioxolane-4-methanol via Rhizopus sp. lipase-catalyzed

enantioselective transesterification with vinyl butanoate”.Biotechnology Letters , v. 21,

5, p. 447-450 ,1999.

Miyazawa T., Yukawa T., Koshiba T., Ueji S., Yanagihar R., Yamada T.; “Enzymatic

resolution of 2-phenoxy-1-propanols through the enantioselective acylation mediated by

Achromobacter sp. lipase”. Biotechnology Letters, v.23, p.1547–1550, 2001.

Molinari, R., Santoro M. E., Drioli E.; “Study and comparison of two enzyme

membrane reactors for fatty acids and glycerol production”. Industrial & Engineering

Chemistry Research, v. 33, p. 2591–2599, 1994.

Molinari F., Cavenago K. S., Romano A., Romano D., Gandolfi R.; “Enantioselective

hydrolysis of (R,S)–Isopropylideneglycerol acetate with Kluyverromyces marxianus”.

Tetrahedron: Asymmetry, v.15, p. 1945-1947, 2004.

http://www.deepdyve.com/search?author=Toshifumi%2C+Miyazawa

http://www.deepdyve.com/search?author=Sota%2C+Kurita

http://www.deepdyve.com/search?author=Hiroko%2C+Sakamoto

http://www.deepdyve.com/search?author=Toshihiko%2C+Otomatsu

http://www.deepdyve.com/search?author=Katsutoshi%2C+Hirose

http://www.deepdyve.com/search?author=Takashi%2C+Yamada

http://www.deepdyve.com/browse/journals/biotechnology-letters

http://pubs.acs.org/journal/iecred

http://pubs.acs.org/journal/iecred

158

Molinari F., Romano D., Gandolfi R., Kroppenstedt R. M., Marinelli F., “Newly

isolated Streptomyces spp. as enantioselective biocatalysts: hydrolysis of 1,2-O-

isopropylidene glycerol racemic esters. Journal of Applied Microbiology, v. 99, 4, p.

960-967, 2005.

Monti D., Ferrandi E.E., Righi M., Romano D., Molinari F. 2008. “Purification and

characterization of the enantioselective esterase from Kluyveromyces marxianus CBS

1553”. Journal of Biotechnology, v. 133, p.65-72, 2008.

Moreira M. A.; “Utilização de lipases em reações de epoxidação quimio-enzimática”.

Tese de mestrado apresentada no Departamento de Química da Universidade Federal de

Santa Catarina, Florianópolis, Brasil, 2003.

Moura J. M. L. N., Ribeiro A. P. B. R, Grimaldi R., Gonçalves L. A. G; “Reator de

membranas enzimático e fluidos supercríticos: associação de processos”. Química

Nova, v. 30, 4, p. 965-969, 2007.

Nakanishi K., Sakiyama T., Imamura K., “On the adsorption of proteins and solid

surfaces, a common but very complicated phenomenon”.Journal of Bioscience and

Bioengineering, v. 91, 3, p. 232-244, 2001.

D. Nasipuri; Stereochemistry of Organic Compounds; John Wiley & Sons, New York,

1991.

Oliveira A. C; “Morfologia de membranas microporosas de poli (éterimida) utilizando

nitrato de lítio como aditivo”, Dissertação de mestrado, COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro,

1994.

Oliveira D., Feihrmann A. C., Dariva C., Cunha A. G., Bevilaqua J. V., Destain J.,

Oliveira J. V., Freire D. M. G.; “Influence of compressed fluids treatment on the

activity of Yarrowia lipolytica lipase”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,

v. 39, p. 117-123, 2006.

159

Paiva A. L., Balcão V. M., Malcata F. X.; "Bioreactors with immobilized lipases",


Paiva A. L., Balcão V. M., Malcata F. X.; “Kinetics and mechanics of reactions

catalyzed by immobilized lipases”. Enzyme and Microbial Technology, v. 27, p. 187-

204, 2000.

Palomo J. M., Segura R. L., Mateo C., Terrine M., Fernadéz-Lafuente R., Guisán J.M.;

“Synthesis of enantiomerically pure glycidol via a fully enantioselective lipase-

catalyzed resolution”, Tetrahedron: Asymmetry, v. 16, p. 869–874, 2005.

Pancera S. M.; “Estudo das interações entre enzimas e polímeros: efeito do poli(etileno

glicol) na atividade e na conformação estrutural de enzimas. Adsorção de enzimas sobre

superfícies sólidas”. Tese de doutorado em físico-química-Universidade de São Paulo,

Brasil, pp. 114, 2006.

Pandey A., Benjanmin S., Soccol C. R., Nigan P., Krieger N., Soccol V. T.; “The realm

of microbial lipases in biotechnology”. Applied Biotechnology biochemistry, v.29, p.

119-131, 1999.

Panzavolta F., Soro S., D’amato R., Palocci C., Cernia E., Russo M. V.; “Acetylenic

polymers as new immobilization matrices for lipolytic enzymes”, Journal of Molecular

Catalysis B: Enzymatic v. 32, pp. 67–76, 2005.

Paques F. W., Macedo G.A.; “Lipases de látex vegetais: propriedades e aplicações

industriais”. Química Nova, v. 29, n. 1, p. 93-99, 2006.

Pereira C.C., 1999, Desenvolvimento de fibras ocas anisotrópicas para separação de

gases, Tese de Doutorado, COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 1999.

Persson M., Wehtje E., Adlercreutz P., “Immobilization of lipases by adsorption and

deposition: high protein loading gives lower water activity optimum”. Biotechnology

Letters ,v. 22, 19, p.1571-1575, 2000.

160

Pinto G. F., Abarzúa E. G. O., Antunes O. A. C.; “Catálise enzimática com misturas de

enantiômeros e com substratos pró-quirais: aspectos cinéticos”. Cadernos didáticos de

pós-graduação, Ed. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 1999.

Pissilão C.; “Aminólise enantiosseletiva do (R,S)-mandelato de metila e síntese do

acetato de geranoíla mediada por lipases”.Tese de mestrado, Universidade Federal de

Santa Catarina, 2006.

Pouderoyen G., Eggert T., Jaeger K. E., Dijkstra B. W.; “The crystal structure of

Bacillus subtilis lipase: a minimal α/β hydrolase fold enzyme. Journal of Molecular

Biology, v. 309, p. 215 - 226, 2001.

Reetz, M.T.; “Lipases as practical biocatalysts”. Current Opinion in Chemical Biology,

v. 6, n. 2, p. 145-150, 2002.

Rios G. M., Belleville M. P., Paolucci D., Sanchez J.; “Progress in enzymatic

membrane reactors-a review”. Journal of Membrane Science, v. 242, p. 189-196,

2004.

Romano D., Falcioni F., Mora D., Molinari F., Buthe A., Ansorge-Schumacher M.;

“Enhanced enantioselectivity of Bacillus coagulans in the hydrolysis of 1,2-O-

isopropylidene glycerol esters by thermal knock-out of undesired enzymes”.

Tetrahedron: Asymmetry, v. 16, p. 841-845, 2005.

Sabuquillo P., Reina J., Fernandez-Lorente G., Guisán J. M., Fernandez-Lafuente R.;

“Interfacial affinity chromatography’ of lipases: separation of different fractions by

selective adsorption on supports actived with hydrophobic groups”, Biochimica et

Biophysica Acta, v. 1388, pp. 337-348, 1998.

161

Sharma R., Cristi Y., Banerjee U. C.; “Production, purification, characterization and

applications of lipases”. Biotechnology Advances, v. 19, p. 627-662, 2001.

Sharma S. & Agarwal G.P.; “Interactions of proteins with immobilized metal ions”,

Journal of Colloid and Interface Science, v.243, p.61-72, 2001a.

Sharma S., Agarwal G.P,” Interactions of proteins with immobilized metal íon: a

comparative analysis using various isotherm models”, Analytical Biochemistry, v.288,

p.126-140, 2001b.

Silva, G. A.; “Correlação entre Morfologia e Propriedades de Transporte de

Diclorometano em Filmes de Poli(éterimida) (PEI)”, Universidade Federal de São

Carlos, UFSCAR, Brasil, 1996.

Silva J.E. S., Jesus P.C.; “Evaluation of the catalytic activity of lipases immobilized on

chrysotile for esterification”, Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 75, 2, pp.

157-162, 2003.

Sakai T., Kishimoto T., Tanaka Y., Ema T., Utaka M.; “Low temperature method for

enhancement of enantioselectivity in the lipase-catalyzed resolutions of Solketal and

some chiral alcohols”. Tetrahedron Letters, v. 39, p. 7881-7884, 1998.

Sakai S., Liu Y., Yamaguchi T., Watanable R., Kawabe M., Kawakami K.;

“Immobilization of Pseudomonas cepacia lipase onto electrospun polyacrylonitrile

fibers through physical adsorption and application to transesterification in nonaqueous

solvent”. Biotechnology Letters, v.32, p.1059-1062, 2010.

Salum T. F. C., “Produção e imobilização de lipase de Burkholderia cepacia LTB11

para síntese de ésteres etílicos”. Tese de Doutorado, Universidade Federal do Paraná,

2010.

162

Sánchez A., Ferrer P., Serrano A., Valero O. F.; “A controlled fed-batch cultivation for

the production of new crude lipases from Candida rugosa with improved properties in

fine chemistry”. Journal of Biotechnology, v. 69, p. 169-182, 1999.

Sarda L., Desnuele P.; “Action de la lipase pancreátique sur les esters en émulsion”.

Biochímica et Biophysica Acta, v.58, p. 513-521, 1958.

Simas A. B. C., Silva A. A. T., Cunha A. G., Assumpção R. S., Hoelz L. V. B ; Neves

B. C., Galvão T. C. ; Almeida R. V., Albuquerque M. G., Freire D. M. G., de

Alencastro R. B.; “Kinetic resolution of (R,S)-1,2-O-isopropylidene-3,6-di-O-benzyl-

myo-inositol by lipases: An experimental and theoretical study on the reaction of a key

precursor of chiral inositols”. Journal of Molecular Catalysis. B, Enzymatic , v. 70, p.

32-40, 2011.

Soares C. M. F., De Castro H. F., Zanin G. M., De Moraes F.F., “Characterization and

utilization of Candida rugosa lipase immobilized on controlled pore silica”. Applied

Biochemistry and Biotechnology, v.77/79, p. 745-757, 1999.

Sobral K. C. A., Rodriguez R. M. O., Oliveira R. D.,Moraes F. F., Zanin G. M.;

“Immobilization of cyclodextringlycosyltransferase (CGTase) from Bacillus firmus in

commercial chitosan”. Journal of Inclusion Phenomena and Mycrocyclic Chemistry,

v. 44, p. 383 – 386, 2002.

Sobral K. C. A., Rodriguez R. M. O., Oliveira R. D.; Olivo J. E.; Moraes F. F., Zanin G.

M.; Evaluation of supports and methods for immobilization of enzyme

cyclodextringlycosyltransferase. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 105-108,

p.809 – 819, 2003.

Straathof A. J. J., Jongejam J. A.; “The enantiomeric ratio: origin, determination and

prediction”. Enzyme and Microbial Technology, v. 21, p. 559-571, 1997.

163

Suan C., Sarmidi M. R.; “Immobilised lipase-catalysed resolution of (R,S)-1-

phenylethanol in recirculated packed bed reactor”. Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic, v. 28, p. 11-119, 2004.

Tan T., Wang F., Zhang H., “Preparation of PVA/chitosan lipase membrane reactor and

its application in synthesis of monoglyceride”. Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic, v. 18, p. 325-331, 2002.

Tardioli, P. W.; Fernandez-Lafuente, R.;Guisan, J. M.; Giordano, R. L. C.;” Design of

new immobilized stabilized carboxypeptidase A derivative for production of aromatic

free hydrolysates of proteins”. Biotechnology Progress, v.19, p.565-574, 2003.

Tincom T. T. S.; “Otimização de parâmetros para a obtenção de ácido mandélico a

partir de mandelato de etila utilizando lipases”. Dissertação de mestrado em

Farmacêutica- Universidade Federal do Rio de Janeiro, pp. 85, 2003.

Tischer W., Kaschie V.; "Immobilized enzymes: crystal or carriers". Trends in


Torres R., Ortiz C., Pessela B. C.C., Palomo J. M., Mateo C., Guisán J.M., Fernández-

Lafuente R.; “Improvement of thr enantioselectivity of lipase (fraction B) from Candida

antarctica via adsorption on polyethylenimine-agarose under different experimental

conditions”. Enzyme and microbial Technology, v. 39, p.167-171, 2006.

Tsai S.W., Huang C.M.; “Enantioselective synthesis of (S)-suprofen ester prodrugs by

lipase in cyclohexane.” Enzyme and Microbial Technology, v.25, 8-9, p.682-688,

1999.

Trusek-Holownia A., A. Noworyta; “Catalitic membrane preparation for enzymatic

hydrolysis reactions carried out in the membrane phase contactor”. Desalination, v.144,

p. 427-432, 2002.



164

Uppenberg J., Hansen M. F., Patkar S., Jones T. A.; “The sequence, crystal structure

determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida

antarctica”. Structure, v.15, p.293-308, 1994.

Vallikivi I., Lille U., Lookene A., Metsala A., Sikk P., Tõugu V., Vija H., Villo L.,

Parve O.; “Lipase action on some non-triglyceride substrates”. Journal of Molecular

Catalysis B: Enzymatic, v. 22, p. 279-298, 2003.

Verger R.; “´Interfacial activation’ of lipases: facts and artifacts”. Trends in


Villeneuve P., Muderhwa J. M., Graille J., Haas M. J.; “Customizing lipases for

biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approches”,

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 9, p. 113-148, 2000.

Zimmermann A.; “Aplicação de resolução enzimática na síntese estereoseletiva de

feromornios de agregação de insetos praga de palmáceas”. Tese de mestrado em

Ciências Química, Universidade Federal do Paraná, pp. 102, 2005.

Wang Y., Hu Y., Xu J., Luo G., Dai Y.; “Immobilization of lipase with a special

microstructure in composite hydrophilic CA/hydrophobic PTFE membrane for the

chiral separation of racemic ibuprofen”. Journal of Membrane Science, v.293, p. 133-

141, 2007.

Wilson L., Palomo J. M., Fernadéz-Lorente G., Illanes A., Guisán J. M., Fernadéz-

Lafuente R.; “Improvement of the properties of a thermostable lipase from Alcaligenes

sp. via strong adsorption on hydrophobic supports”, Enzyme and Microbial Tecnology,

v. 38, p. 975-980, 2006.

Yang Z.; Russell A.J.;”Fundamentals of non-aqueous enzymology. In: Koskinen A. M.

P., Klibanov A. M., Enzymatic reactions in organic media. London Blackie Academics

and Professional, p.43-69, 1996.

165

Ye. P., Xu Z., Wang Z., Wu J., Deng H., Seta P.; “Comparison of hydrolytic activities

in aqueous and organic media for lipases immobilized on poly (acrylonitrile-co-maleic-

acid) ultrafiltration hollow fiber membrane”. Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic, v. 32, p. 115-121, 2005.

Zen H. A., Geraldes A. N., Ferreira H. P., Parra D. F., Lugão A. B.; “Preparação e

caracterização de membranas de polipropileno para uso em célula combustível. Nono

congresso brasileiro de polímeros. Capturado em 20/10/2011.

Sites:

http://www.amano-enzyme.co.jp/, capturado em 03/2011.

http://apps.isiknowledge.com, capturado em 20/08/2011.

http://www.wikipedia.org, capturado em 20/08/2011.

http://www.bccresearch.com/report/BIO030F.htmL, capturado em 03/2011.

.

http://www.amano-enzyme.co.jp/

http://apps.isiknowledge.com/

http://www.wikipedia.org/

http://www.bccresearch.com/report/BIO030F.html

obtenÇÃo de intermediÁrios quirais utilizando lipases em...

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