relação estrutura-atividade de lipases comerciais livres e em
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE DE LIPASES
COMERCIAIS LIVRES E EM MICELAS REVERSAS
Karen Medeiros Gonçalves
Orientadores: Rodrigo Octavio M. A. de Souza
Yraima Moura Lopes Cordeiro
Ivana Correa Ramos Leal
Rio de Janeiro
2013
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE DE LIPASES
COMERCIAIS LIVRES E EM MICELAS REVERSAS
Karen Medeiros Gonçalves
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadores: Rodrigo Octavio M. A. de Souza
Yraima Moura Lopes Cordeiro
Ivana Correa Ramos Leal
Colaborações Internacionais: Dr. Aris Xenakis
Dra. Maria Zoumpanioti
Dra. Vassiliki Papadimitriou
Rio de Janeiro
2013
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
G635r Gonçalves, Karen Medeiros.
Relação estrutura-atividade de lipases comerciais livres e em micelas
reversas/ Karen Medeiros Gonçalves; orientadores Rodrigo Octavio Mendonça
Alves de Souza, Yraima Moura Lopes Cordeiro. – Rio de Janeiro : UFRJ,
Faculdade de Farmácia, 2014.
144f. : il. col. ; 30cm.
Tese (Doutorado em Ciências Fermacêuticas) – Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, 2014.
Inclui bibliografia.
1. Lipase de Thermomyces lanuginosus. 2. Lecitase ultra. 3. SAXS.
4. Micelas reversas. 5. EPR. I. Souza, Rodrigo Octavio Mendonça Alves de.
II. Cordeiro, Yraima Moura Lopes. I. Título.
.
CDD 574.19253
iv
v
“O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são.” Aristóteles
“Nossa maior fraqueza está em desistir. O caminho mais certo de vencer é
tentar mais uma vez.” Thomas Edison
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus pela força, saúde e proteção
Aos meus pais pela paciência nos meus momentos de ausência, estudo e estresse e pelo apoio
em todas as circunstâncias. Pelos momentos bons em que me trouxeram tranquilidade e por
me ajudarem a superar os ruins.
À minha irmã pelos momentos de apoio, de motivação e força e seu marido pelos momentos
engraçados.
Ao meu namorado pela compreensão, companheirismo e suporte. Por conseguir me fazer tirar
quinze dias de férias e por aceitar meu jeito louco e sincero (até demais!).
Ao inesquecível e genial professor Octavio Antunes, que infelizmente não está mais entre nós.
Grande idealizador do projeto que confiou no meu trabalho e sempre me deu apoio e me fez
acreditar na minha capacidade.
Aos meus amigos do BossGroup, os que ficaram e os que saíram, pelos momentos divertidos,
pelo apoio, pelo suporte técnico com os equipamentos, pelas longas discussões científicas e
por aquelas bobeiras na hora do almoço, aquelas discussões sem nexo que levam às opiniões
mais engraçadas que alguém já ouviu. Ao meu amigo Ivaldo Júnior pelos momentos
engraçadíssimos e pelas cenas mais hilárias na Grécia, e, principalmente por aturar meus
momentos de estresse e de loucura, e olha que foram 6 meses. Meu querido amigo Felipe,
Tchê garoto, sempre divertido e com piadas desconcertantes, mas compartilhando todos os
dias possíveis soluções e pesquisas científicas para resolver nossos problemas e pelos
planejamentos experimentais que não acabam nunca.
Aos meus amigos do Labime pela recepção maravilhosa no laboratório e por me aceitarem
como parte da família. À Mariana Pierre pelas caronas e conversas de horas no
engarrafamento, por me fazer carregar caixas com vários camundongos e compartilhar com
minha impaciência, rs, e ouvir minhas loucuras. Ao Bruno Macedo por ser tão neurótico
quanto eu e sempre achar que vai morrer ou tem uma doença fatal quando é só uma dor de
garganta, pelas festas da SBBq, dançar o tchutcha, rs, e compras no Paraguai, com direito a
atravessar a Ponte da Amizade à pé e voltar de van que se desmancha pelo caminho. Ao meu
querido Ícaro Marques, que sempre amável e de coração enormeee, ficou rico nos EUA e
voltou melhor do que antes; um amigo maravilhoso! À Nathália pelas inúmeras conversas,
almoços e por fazer a gente ser parado na fronteira por causa do Xbox. À Stéphannie que está
sempre disposta a ajudar e me perdoou por eu derrubar seu tampão no fim da tarde. À
Patrícia, uma doida.
À minha amiga Juliana Alvim pelos momentos divertidos, histórias engraçadas e ajuda com
os equipamentos e técnicas.
À Priscila Ferreira que me ajudou demais com HPLC e com as enzimas que tiravam meu
sono. Que se mostrou uma pessoa amiga e verdadeira, com força para dar a volta por cima em
qualquer situação. À Cínthia Lima que tem uma bondade inexplicável e um coração que cabe
o mundo.
Ao Rodrigo por todo o suporte e confiança e por fazer seu trabalho de forma brilhante, sempre
mantendo seus alunos com clima de amizade e um laboratório muito bem equipado, com
churrascos excelentes também.
À Yraima por se arriscar e me receber em seu laboratório de braços abertos e confiar no meu
trabalho. Por todo o aprendizado e novas oportunidades que me deu com toda sua inteligência
e capacidade. E todo o auxílio, apoio e esforço durante o meu doutorado.
vii
À Ivana que é super competente e eu adoro tanto.
Ao Leandro Soter pelas contribuições nos seminários e auxílio no laboratório.
Aos pesquisadores da Grécia Vassiliki Papadimitriou, Maria Zoumpanioti e Aris Xenakis. E a
todos que me receberam no doutorado sanduíche: Giorgious, Maria, Iro...
Ao pesquisador Leandro S. R. Barbosa pelas auxílio nas análises de SAXS realizadas para a
TLL
À professora Juliana Cortinês pelo auxílio nas análises de espectrometria de massas
Ao professor e pesquisador Dario Kalume pela avaliação das proteínas em eletrospray e pela
disponibilidade e paciência para os experimentos de IMS.
Ao professor Luis Maurício Trambaioli por sempre permitir que eu usasse seus equipamentos,
reagentes e pelo auxílio nas análises de IMS
Ao professor Ronaldo e todos os seus alunos por me receberem muito bem em seu
laboratório, pelo auxílio no dicroísmo circular e pelos empréstimos de reagentes
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas e aos técnicos de linha da
SAXS 2
À CAPES pelo apoio financeiro
viii
RESUMO
A lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL), assim como a fosfolipase Lecitase ultra
estão comercialmente disponíveis em soluções que são amplamente aplicadas na indústria.
Desta forma, neste trabalho, foram avaliadas as mudanças conformacionais nestas enzimas
comerciais tanto em meio aquoso quanto em sistemas AOT/iso-octano, que consistem em
micelas reversas, e são capazes de promover elevada área de contato e ativação interfacial.A
TLL mostrou alta termoestabilidade (Tm de 73,6 ± 0,8°C), retornando à sua estrutura
secundária nativa após resfriamento. A co-existência entre dímeros e monômeros em solução
aquosa foi observada. Os dímeros, de 50 kDa, são resistentes à SDS e apresentaram raio de
giro calculado por SAXS de 28,2 Å, enquanto os monômeros possuem raio de giro de 19,0 Å.
A Lecitase ultra, uma mutante da TLL, apresenta um único sítio ativo que tem atividade
lipásica ótima à 40 °C e perde pouca estrutura secundária a 55 °C, mas não é capaz de
retornar à sua estrutura nativa após resfriamento. SDS-PAGE sugere a presença de isoformas
e da co-existência de forma dimérica com monomérica, como observado para a TLL. Quando
inseridas no ambiente micelar, as enzimas apresentaram espectro de fluorescência deslocado
para a região do azul se comparado ao obtido apenas em tampão, indicando mudanças
conformacionais em sua estrutura terciária. Apesar disso, estudos com EPR indicam que elas
não participam da interface, estando localizadas no centro aquoso. Análises de SAXS
demonstraram raios de giro entre 16 e 38 Å para os diferentes valores de wo e indicaram que
as microemulsões apresentam formas mais alongadas. Os sistemas que apresentaram melhor
atividade de esterificação foram aqueles cujo raio de giro era o mais próximo do Rg da
enzima. Para a TLL os wo de 10 e 15 apresentaram as melhores conversões, 33% em 2h e 43%
em 3h, respectivamente, enquanto wo de 10 teve maior velocidade inicial, 0,4348M-1
. Sendo
que este último sistema possui raio de giro de 19,3 Å, similar ao da TLL monômero. Já para a
Lecitase ultra, wo de 10 e 15 também foram os que demonstraram maior conversão, com 55%
em 2 h e 45,3% em 3 h, respectivamente. Portanto, as enzimas apresentaram atividade quando
inseridas em micelas reversas, mesmo com as mudanças conformacionais observadas, fato
que possibilita sua utilização em sistemas com elevada área interfacial, permitindo o uso de
baixas concentrações de enzima e sua aplicação em diversas reações de esterificação.
Palavras-chave: lipase de Thermomyces lanuginosus, Lecitase ultra, micelas reversas, SAXS,
EPR
ix
ABSTRACT
The Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) and the phospholipase Lecitase Ultra are
commercially available as solutions, which are widely applied in industry. In this study, we
evaluated the conformational changes in these commercial enzymes, both in aqueous systems
and in AOT/isooctane reverse micelles that are able to promote high contact area and
interfacial activation. The TLL showed high thermostability (Tm of 73.6 ± 0.8°C), returning to
its native secondary structure after cooling back to 25 °C. The co-existence between dimers
and monomers in aqueous solution was observed and the dimers of 50 kDa were resistant to
SDS and showed radius of gyration calculated by SAXS of 28.2 Å, while the monomers have
Rg of 19.0 Å. The Lecitase Ultra, a mutant of TLL, has a single active site that has optimum
lipase activity at 40 ° C. Loses of secondary structure increase at 55 °C and the enzyme is
unable to return to its native structure after cooling. The SDS-PAGE suggests the presence of
isoforms and co-existence of monomeric and dimeric form, as observed for TLL. When
inserted in the micellar environment, the fluorescence spectrum was shifted to the blue region
compared to those obtained in buffer, indicating conformational changes in tertiary structure.
Nevertheless, EPR studies indicate that the enzymes do not participate in the interface, being
located in the aqueous center. Analysis of SAXS showed Rg between 16 and 38 Å for
different wo values and it indicates more elongated shapes. The esterification activities were
better when the Rg of the reverse micelles were closest to the Rg of the enzyme. For TLL, wo
of 10 and 15 showed the best conversions of 33% in 2h and 43% in 3h, respectively, while wo
10 had higher initial velocity, 0.4348 M-1
. This latter system has Rg of 19.3 Å, similar to the
TLL monomer. For Lecitase Ultra, wo of 10 and 15 also showed the highest conversion of
55% in 2 h and 45.3% in 3 h, respectively. However, the initial rate was much lower than that
of TLL, suggesting less affinity for these substrates. Therefore, the enzymes inside the reverse
micelles presented activity, even with the conformational changes. This fact endorses the uses
of lipases in these systems applying low protein concentration and allowing distinct substrates
in the esterification reactions.
Key words: Thermomyces lanuginosus lipase, Lecitase ultra, reverse micelles, SAXS, EPR
x
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................... XII
ÍNDICE DE ESQUEMAS ............................................................................................................ XVIII
ÍNDICE DE TABELAS ............................................................................................................... XVIII
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS .......................................................................................... XIX
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1
1.1. Lipases ............................................................................................................................ 1
1.1.1. Estrutura das lipases ....................................................................................................... 3
1.1.2. Lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) .................................................................. 7
1.2. Fosfolipases .................................................................................................................. 10
1.2.1. Lecitase ultra................................................................................................................. 12
1.3. Micelas reversas ........................................................................................................... 15
1.3.1. Aplicações e importância das microemulsões como micelas reversas ......................... 19
1.3.1.1. Proteínas em micelas reversas .................................................................................. 20
1.4. Técnicas espectroscópicas aplicadas a sistemas micelares........................................... 25
1.4.1. Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) ............................................................. 26
1.4.2. Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) ...................................................... 29
2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 36
2.1. Objetivo geral ............................................................................................................... 36
2.2. Objetivos específicos .................................................................................................... 36
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 37
3.1. Materiais ....................................................................................................................... 37
3.2. Avaliação da estrutura das enzimas .............................................................................. 37
3.2.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)......................................................... 37
3.2.2. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD .......................................................... 37
3.2.3. Fluorescência intrínseca e extrínseca ........................................................................... 38
3.2.3.1. Desenovelamento por ação do cloridrato de guanidina ............................................ 38
3.2.4. Atividade de hidrólise ................................................................................................... 39
3.2.5. “In-gel digestion (IGD)” e espectrometria de massas .................................................. 39
3.3. Avaliação das micelas reversas .................................................................................... 40
3.3.1. Preparo de micelas reversas .......................................................................................... 40
3.3.2. Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) ............................................................. 41
3.3.3. Análises por Karl-Fischer ............................................................................................. 43
xi
3.3.4. Atividade de esterificação ............................................................................................ 44
3.3.5. Espalhamento de luz dinâmico (DLS) .......................................................................... 44
3.4. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) ....................................................... 44
3.4.1. Análises para a TLL ..................................................................................................... 44
3.4.2. Análises para as micelas reversas ................................................................................. 45
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 46
4.1. Análise das proteínas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ................ 46
4.2. Ensaios para a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) ......................................... 47
4.2.1. Cromatografia líquida por exclusão molecular e SDS-PAGE...................................... 47
4.2.2. SAXS ............................................................................................................................ 50
4.2.3. DLS ............................................................................................................................... 54
4.2.4. Avaliação estrutural da TLL em solução ...................................................................... 55
4.2.4.1. Desnaturação por cloridrato de guanidina (GdnHCl) ............................................... 55
4.2.4.2. Supressão da fluorescência por acrilamida ............................................................... 59
4.2.4.3. Estabilidade térmica ................................................................................................. 61
4.3. Ensaios para a Lecitase ultra ........................................................................................ 65
4.3.1. Cromatografia líquida por exclusão molecular e SDS-PAGE...................................... 65
4.3.2. DLS ............................................................................................................................... 68
4.3.3. Avaliação estrutural da Lecitase ultra em solução ....................................................... 69
4.3.3.1. Desnaturação por cloridrato de guanidina (GdnHCl) ............................................... 69
4.3.3.2. Supressão da fluorescência por acrilamida ............................................................... 71
4.3.3.3. Estabilidade térmica ................................................................................................. 72
4.4. Micelas reversas ........................................................................................................... 76
5. CONCLUSÕES ................................................................................................................ 97
6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 99
7. APÊNDICES .................................................................................................................. 109
Apêndice A – Espectro de massas (ESI- micro Q-TOF) da TLL e dados da MASCOT
database .................................................................................................................................. 109
Apêndice B - Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12,5 % para a Lecitase ultra ................... 110
Apêndice C – Gráficos demonstrando as funções de autocorrelação para as micelas vazias
(branco) e com a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL)................................................ 111
Apêndice D - Gráficos de p(r) normalizados para as micelas com Lecitase ultra e com a lipase
de Thermomyces lanuginosus (TLL) ...................................................................................... 112
Apêndice E - Espectros de EPR obtidos para as micelas reversas sem enzima e com TLL e
Lecitase ultra ..........................................................................................................................114
8. ANEXOS ........................................................................................................................ 119
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Padrão de enovelamento de lipases (α/β – hidrolases). Cilindros correspondem às α-
hélices, e setas às fitas β. Os círculos pretos referem-se aos resíduos da tríade catalítica
(serina, histidina e aspartato ou glutamato). Extraído e adaptado de Jaeger, Dijkstra e Reetz
(1999). ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 4
Figura 2. Resíduos conservados nas lipases de Rhizomucor mihei (PDB: 3TGL), em roxo,
Thermomyces lanuginosus (PDB: 1TIB), em verde e Burkholderia cepacia (PDB: 3LIP), em
vermelho. Estão coloridos em amarelo, o resíduo de serina do sítio catalítico e, em azul, os
quatro resíduos do pentapeptídeo conservado (Gli-X-Ser-Gli-X). -------------------------------- 5
Figura 3. Estrutura da lipase de Thermomyces lanuginosus (PDB: 1DT3, BRZOZOWSKI et
al., 2000) mostrando os resíduos Asn33 (vermelho), His258 (verde) e Trp89 (laranja). ------- 9
Figura 4. Estrutura cristalina da lipase de Thermomyces lanuginosus em sua forma dimérica
(PDB: 1DT3). Em laranja, o “lid”, uma α-hélice móvel, e, em verde, os resíduos de
aminoácidos que compõem o sítio ativo (Ser146, Asp201 e His258). -------------------------- 10
Figura 5. Possíveis regiões de substituições de resíduos de aminoácidos próximas à tríade
catalítica da TLL (PDB: 1TIB) para a Lecitase ultra. Tríade catalítica da TLL (azul), possíveis
regiões de alteração (laranja). (BOJSEN et al., 2000). -------------------------------------------- 13
Figura 6. Possíveis mutações na tampa (lid) da TLL (PDB: 1TIB) para a Lecitase ultra.
Possíveis regiões de alteração (laranja). (BOJSEN et al., 2000). Na figura menor é possível
observar a tampa destacada em vermelho e indicada pela seta. À esquerda, a estrutura da TLL
(PDB: 1TIB) com possíveis regiões substituídas. -------------------------------------------------- 13
Figura 7. Esquema com as estruturas de microemulsões (A) Micelas comuns, (B) Micelas
reversas e (C) Sistema bicontínuo, lamelar. --------------------------------------------------------- 16
Figura 8. Estruturas químicas dos tensoativos mais utilizados na preparação de micelas
reversas (A) AOT (B) CTAB (C) Brij (D) Lecitina. ----------------------------------------------- 17
Figura 9. Esquema de uma micela reversa AOT/hidrocarboneto demonstrando as diferentes
populações de água presentes. Extraído de Luisi e colaboradores (1988). ---------------------- 18
Figura 10. Modelos de microencapsulação de proteínas (A) “water-shell” (B) forma induzida
e (C) tamanho fixo. Extraído de Carvalho e Cabral (2000). -------------------------------------- 21
Figura 11. Possível localização de proteínas em micelas reversas no centro aquoso (A)
Próximo à interfaces (B) Ancoradas na interface (C). O círculo preto representa a proteína.
Adaptado de Gupte e colaboradores (1995). -------------------------------------------------------- 22
Figura 12. Exemplos de marcadores de spin do grupo dos nitróxidos. (1) 1-oxil-2,2,5,5-
tetrametil-3-pirrolina-3-metil-metanoetiossulfonato (MTSL); (2) 1-oxil-3-(2-iodoacetamida) -
2,2,5,5-tetrametilpirrolidina e (3) Ácido 5- doxil esteárico (5-DSA). -------------------------- 27
Figura 13. Representação da molécula 12-DSA e os respectivos eixos de rotação deste
marcador de spin que representam seu sistema de coordenadas magnéticas. Extraído de
Avramiotis e colaboradores (2007). ------------------------------------------------------------------ 28
xiii
Figura 14. Esquema demonstrando as diferentes técnicas definidas de acordo com o ângulo
de espalhamento de raios-X. USAXS de 0,001 a 0,3°, SAXS de 0,1 a 10° e WAXS >10°.
Adaptado de Dong e Boyd (2011). ------------------------------------------------------------------- 30
Figura 15. Esquema mostrando uma coleta espalhamento de raios-X a baixo ângulo e
obtenção da intensidade de espalhamento em diferentes direções com subtração do
espalhamento do solvente (tampão). Adaptado de Mertens e Svergun (2010). ---------------- 31
Figura 16. Curvas características de SAXS obtidas para a soroalbumina bovina em diferentes
tampões. A. Curva de espalhamento (intensidade de espalhamento em função de q, ou s). B.
Regressão de Guinier demonstrando (1) agregação (2) amostra homodispersa, não-agregada e
(3) repulsão inter-partículas. Extraído de Mertens e Svergun (2010). --------------------------- 32
Figura 17. Gráficos característicos para diferentes formas de macromoléculas em solução
obtidos por análises de SAXS (gráfico de espalhamento) e IFT (p(r)). Extraído de Mertens e
Svergun (2010). ----------------------------------------------------------------------------------------- 33
Figura 18. Curvas de espalhamento (A) obtidas por análises de SAXS e seus respectivos
plots de Kratky (B) em diferentes condições para a lisozima enovelada (1) parcialmente
desenovelada em ureia 8 M (2) parcialmente desenovelada a 90 °C (3) e desenovelada em
uréia 8 M a 90 °C (4). Extraído de Mertens e Svergun (2010). --------------------------------- 34
Figura 19. Curva de calibração com p-nitrofenol em isopropanol (volume final de 1 mL
obtido por tampão TrisHCl 0,1 M. pH 7 contendo 0,005 % de Triton-X).---------------------- 39
Figura 20. Demonstração das regiões utilizadas no espectro de EPR para o cálculo do
(espectro obtido pela análise de micela reversa de w0 10, branco). ------------------------------ 42
Figura 21. Demonstração das regiões utilizadas no espectro de EPR para o cálculo do S
(espectro obtido pela análise de micela reversa de w0 10, branco). ------------------------------ 42
Figura 22. Curva de calibração para a coluna TSK gel 3000 SW (Tampão fosfato de sódio
0,05 M, pH 7,0, fluxo de 1mL/min, absorvância a 280 nm). ------------------------------------- 46
Figura 23. SDS-PAGE (12,5 %) do extrato bruto da lipase comercial de Thermomyces
lanuginosus (TLL) a 3,2 µg/mL (2 µM), coloração por nitrato de prata. A amostra foi fervida
em tampão desnaturante contendo SDS 1 % e β-mercaptoetanol 4 %. MW corresponde ao
padrão de peso molecular. ----------------------------------------------------------------------------- 48
Figura 24. Análises realizadas para a TLL. A. Cromatograma da lipase TL (CLAE com
coluna TSK gel 3000, fluxo de 1 mL/min) B. Gel de poliacrilamida 12,5 % (SDS-PAGE),
corado por prata, para as alíquotas coletadas durante a cromatografia líquida, MW – padrão de
peso molecular, 1 e 2 - Fração eluída correspondente ao número 2 na figura A, 3 e 4 - Fração
eluída correspondente ao número 1 na figura A, 5 – TLL extrato bruto a 2 µg/10 µL (6,25
µM) desnaturada e fervida, 6 e 7 - TLL extrato bruto a 2 µg/10 µL (6,25 µM). As amostras
coletadas não foram tratadas com tampão desnaturante (β-mercaptoetanol 4 %). A seta indica
o dímero da TLL resistente a SDS. ------------------------------------------------------------------- 49
Figura 25. Gráfico obtido por SAXS demonstrando a curva de espalhamento para o extrato
bruto da TLL (27 mg/mL). Inserção representa a regressão de Guinier. ------------------------ 50
Figura 26. Análise da TLL por SAXS. A. Curvas de espalhamento para a TLL a 5,4 mg/mL
A máx
xiv
(quadrados) e a 2,7 mg/mL (círculos). B. Gráfico de Kratky das curvas de espalhamento para
a TLL a 5,4 mg/mL (quadrados) e 2,7 mg/mL (círculos). Inserção: Regressão de Guinier para
as duas concentrações proteicas. ---------------------------------------------------------------------- 51
Figura 27. Curvas teórica e experimental de espalhamento de raios-X a baixo ângulo. A.
Curva de espalhamento da TLL a 5,4 mg/mL (círculos) com a curva de espalhamento obtida
por IFT (linha cinza sólida) e curva de espalhamento da TLL a 2,7 mg/mL (quadrados), com
curva obtida por IFT (linha cinza sólida) e melhor curva teórica obtida através do programa
GENFIT (linha sólida preta). Inserção: funções de p(r) obtidas para a TLL a 5,4 mg/mL
(círculos abertos) e a soma das funções de p(r) teóricas . B. Cálculo teórico de espalhamento
usando o programa GENFIT para a TLL nas formas monomérica (linha sólida) e dimérica
(linha tracejada). Inserção: Respectivas funções de p(r) do monômero (linha sólida) e dímero
(linha tracejada). ---------------------------------------------------------------------------------------- 52
Figura 28. Gráfico das funções de autocorrelação observadas nas medidas de DLS realizadas
para as soluções de TLL (27; 5,4; 2,7; 1,0; 0,54 e 0,27 mg/mL) em tampão TrisHCl 0,2 M,
pH 7,0. A. regularização da leitura B. média das leituras acumuladas. ------------------------- 55
Figura 29. Espectro de emissão de fluorescência da TLL após desnaturação por GdnHCl em
diferentes concentrações. As medidas foram realizadas a 25 °C com excitação a 280 nm com
fendas de emissão e excitação de 5 nm. ------------------------------------------------------------- 56
Figura 30. Espectro de dicroísmo circular obtido para desnaturação da TLL com GdnHCl. As
análises foram realizadas a temperatura ambiente, utilizando cubeta de quartzo de 0,2 cm de
caminho óptico. Foram realizadas 3 acumulações e os resultados expressos em elipcicidade
molar. ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 57
Figura 31. Mudanças na estrutura secundária (dicroísmo circular) e terciária (fluorescência)
da TLL induzidas por desenovelamento químico. Os valores de elipcicidade a 222 nm (222nm)
foram coletados e os resultados expressos na forma de fração desenovelada ( = (222nmobs-
222nmI)/ (222nmF - 222nmI)), onde 222nmI corresponde ao valor de na ausência de GdnHCl e
222nmF ao valor de em GdnHCl 6 M. Para os dados de fluorescência, foram utilizados os
valores dos centros de massa espectral (item 3.2.3.1.). A TLL foi analisada a 100 µg/mL em
tampão fosfato 50 mM, pH 7,0. Os valores representam a média ± erro padrão de
experimentos em triplicata (n = 3).-------------------------------------------------------------------- 57
Figura 32. Emissão de fluorescência do 1,8-ANS em incubação da TLL em diferentes
concentrações de GdnHCl. A TLL a 4 µM em tampão Tris-HCl 100mM, pH 7.5, foi
incubada com 1,8-ANS 40 M em diferentes concentrações de GdnHCl. Inserção: espectro de
emissão do 1,8-ANS em presença de TLL em diferentes concentrações de cloridrato de
guanidina e em tampão. A excitação foi de 360 nm com coleta de emissão de 400 a 600nm.
Os espectros foram subtraídos dos valores dos respectivos brancos (sem enzima). Os valores
representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata (n = 3). --------------------- 59
Figura 33. Resultado obtido pela supressão da fluorescência em TLL com acrilamida em
diferentes concentrações e na presença de GdnHCl 3,5 e 6 M. ---------------------------------- 60
Figura 34. Espectros de dicroísmo circular para a TLL em diferentes temperaturas. Medidas
de dicroísmo circular foram realizadas em espectropolarímetro Chirascan, utilizando cubeta
de quartzo de 0,2 cm de caminho óptico. Foram coletados espectros a cada 5 °C e utilizado
um sensor de temperatura no interior da amostra. A enzima (a 100 µg/mL) foi avaliada em
xv
tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, utilizado como branco e subtraído dos espectros da
enzima. --------------------------------------------------------------------------------------------------- 61
Figura 35. Gráfico obtido através da elipcicidade bruta obtida a 222 nm em diferentes
temperaturas permite o cálculo da Tm. Os valores representam a média ± erro padrão de
experimentos em triplicata (n = 3). O ajuste foi realizado utilizando o programa Sigma-plot
10. --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 62
Figura 36. Gráfico relacionando dados de atividade com elipcicidade molar da TLL. A
atividade foi determinada de acordo com o item 3.2.4 e o valor obtido a 25 °C foi considerado
como 100%. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata (n =
3). --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 63
Figura 37. Quantidade relativa dos componentes da estrutura secundária da TLL em função
da temperatura. O conteúdo estrutural foi estimado com o algoritmo SELCON3 a partir dos
espectros de CD da TLL em diferentes temperaturas. --------------------------------------------- 64
Figura 38. SDS-PAGE (12,5 %) do extrato bruto da fosfolipase comercial Lecitase ultra a 3,5
µg/mL (2 µM), coloração por prata. A amostra foi fervida em tampão desnaturante contendo
SDS 1 % e β-mercaptoetanol 4 %. ------------------------------------------------------------------- 65
Figura 39. Cromatograma da Lecitase ultra (CLAE com coluna TSK gel 3000, fluxo de 1
mL/min). ------------------------------------------------------------------------------------------------- 66
Figura 40. Análises em gel de poliacrilamida 12,5 % (SDS-PAGE) realizadas para a Lecitase
ultra em cromatografia líquida por exclusão molécula; corado por prata. (A) gel original
obtido por coloração com prata (B) Gel com padrões de saturação e contraste alterados para
uma melhor visualização das bandas. PPM - padrão de peso molecular, 1 –fração 2 coletada
diversas vezes e concentrada por liofilização (~3,9 µM), 2 – fração eluída em 9 minutos e 3, 4
e 5 (~0,2 µM) – frações eluídas entre 10 e 12 minutos. As amostras coletadas não foram
tratadas com tampão desnaturante (SDS 1 % e β-mercaptoetanol 4 %), nem fervidas. A seta
indica o possível dímero. ------------------------------------------------------------------------------ 67
Figura 41. Gráfico da função de autocorrelação observada nas medidas de DLS realizadas
para a Lecitase ultra (1,0 mg/mL) em tampão TrisHCl 0,2 M, pH 7,0. Em vermelho, a
regularização da leitura e em preto, a média das leituras acumuladas (n = 30). As setas
representam os tempos de relaxação. ---------------------------------------------------------------- 68
Figura 42. Gráfico com espectros de emissão de fluorescência para a Lecitase ultra (100
µg/mL) em tampão TrisHCl 0,2 M pH 7 com diferentes concentrações de GdnHCl. As
medidas foram realizadas a 25 °C com excitação à 280 nm com fendas de emissão 10 nm e
excitação de 5 nm. -------------------------------------------------------------------------------------- 69
Figura 43. Espectros de dicroísmo circular obtidos para desnaturação da Lecitase ultra com
cloridrato de guanidina. As análises foram realizadas a temperatura ambiente, utilizando
cubeta de quartzo de 0,2 cm de caminho óptico. Foram realizadas 3 acumulações e os
resultados expressos em elipcicidade bruta. --------------------------------------------------------- 70
Figura 44. Mudanças na estrutura secundária (dicroísmo circular) e terciária (fluorescência)
da Lecitase ultra induzidas por desenovelamento químico. Os valores de elipcicidade a 222
nm (222nm) foram coletados e os resultados expressos na forma de fração desenovelada ( =
(222nmobs-222nmI)/ (222nmF - 222nmI)), onde 222nmI e corresponde ao valor na ausência de
xvi
GdnHCl e 222nmF ao valor em GdnHCl 6 M. Para a fluorescência, foram utilizados os valores
dos centros de massa espectral. A Lecitase ultra foi analisada a 100 µg/mL em tampão fosfato
100 mM, pH 7,0. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata
(n = 3). ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 71
Figura 45. Resultado obtido pela supressão da fluorescência em Lecitase ultra com
acrilamida em diferentes concentrações. ------------------------------------------------------------ 72
Figura 46. Espectros de dicroísmo circular para a Lecitase ultra em diferentes temperaturas.
Medidas de dicroísmo circular foram realizadas em espectropolarímetro Chirascan (Applied
Photophysics), utilizando cubeta de quartzo de 0,2 cm de caminho óptico. Foram coletados
espectros a cada 5 °C e utilizado um sensor de temperatura no interior da amostra. ---------- 73
Figura 47. Gráfico obtido através da elipcicidade bruta obtida a 222 nm em diferentes
temperaturas. Uma função sigmoidal, representada pela equação geral: f= y0+a/(1+exp(-(x-
x0)/b)), foi ajustada aos dados. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos
em triplicata (n = 3). ------------------------------------------------------------------------------------ 74
Figura 48. Gráfico relacionando dados de atividade com elipcicidade bruta da Lecitase ultra.
A atividade foi determinada de acordo com o item 3.2.4 e o valor obtido a 25°C foi
considerado como 100%. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos em
triplicata (n = 3). ---------------------------------------------------------------------------------------- 75
Figura 49. Funções de autocorrelação, obtidas por DLS, observadas para as micelas contendo
Lecitase ultra (50 µg/mL) em diferentes valores de wo. ------------------------------------------- 78
Figura 50. Curva de espalhamento obtida por SAXS para as micelas reversas em diferentes
valores de wo com sistemas contendo tampão (A), TLL (B) e Lecitase ultra (C). A quantidade
de proteína nas micelas foi de 50 µg/mL. ----------------------------------------------------------- 79
Figura 51. Regressão de Guinier das curvas de espalhamento de micelas reversas contendo
tampão (branco), TLL e Lecitase. A quantidade de proteína nas micelas foi de 50µg/mL.--- 80
Figura 52. Função p(r) para as micelas com tampão, TLL e Lecitase para valores de wo de 10
e 15, com distância máxima de 50 Å para o wo de 10 e 70Å para wo de 15. ------------------- 81
Figura 53. Gráfico de p(r) normalizado para as micelas sem adição de proteína (branco). -- 82
Figura 54. Espectro de EPR obtido com branco e TLL em micela reversa (w0 10) utilizando o
marcador de spin 5-DSA a 25 °C. -------------------------------------------------------------------- 86
Figura 55. Gráfico de fluorescência da lipase de Thermomyces lanuginosus em tampão
TrisHCl 0,2 M, pH 7,5 (linha em preto) e em micela reversa com distintos valores de wo. As
medidas foram realizadas a 25 °C com excitação a 280 nm com fendas de emissão 10 nm e
excitação de 5nm. A solução de AOT 0,2 M com tampão não apresentou fluorescência (não
mostrado). ------------------------------------------------------------------------------------------------ 88
Figura 56. Gráfico de fluorescência da Lecitase ultra em tampão TrisHCl 0,2 M, pH 7,5
(linha em preto) e em micela reversa com distintos valores de wo. As medidas foram
realizadas a 25 °C com excitação a 280 nm com fendas de emissão 10 nm e excitação de 5
nm. A solução de AOT 0,2 M com tampão não apresentou fluorescência. -------------------- 90
xvii
Figura 57. Centro de massa espectral para a TLL (azul) e Lecitase ultra (branco) em
diferentes ambientes (aquoso e em micelas reversas com diferentes wo). Os valores
representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata (n = 3). --------------------- 91
Figura 58. Gráfico representando a concentração de éster formado em função do tempo para
as micelas AOT/iso-octano 0,2 M com diferentes w0 contendo TLL (50 µg/mL). As curvas
forma obtidas através de uma regressão polinomial de terceira ordem. ------------------------- 92
Figura 59. Gráfico representando a concentração de éster formado em função do tempo para
as micelas AOT/iso-octano 0,2 M com diferentes w0 contendo Lecitase ultra (50 µg/mL). As
curvas forma obtidas através de uma regressão polinomial de terceira ordem. ---------------- 93
Figura 60. Variações observadas no raio hidrodinâmico das micelas reversas contendo TLL
(A) e Lecitase ultra (B) em função da temperatura para diferentes valores de wo.------------- 95
xviii
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1. Representação da reação de hidrólise de acilgliceróis catalisada por lipases -----1
Esquema 2. Representação das reações de esterificação (A) e transesterificação (B) catalisada
por lipases em meios com restrição de água. --------------------------------------------------------- 1
Esquema 3. Exemplos da aplicação de lipases em síntese orgânica. (A) Adição de Michael
(DE SOUZA et al., 2009). (B) Reação aldólica assimétrica de cetonas heterocíclicas com
aldeídos (GUAN, FU e HE, 2012). (C) Epoxidação (MOREIRA e NASCIMENTO, 2007). ---
------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2
Esquema 4. Mecanismo de catálise e os estados de transição durante a hidrólise de éster
catalisada por lipases. Extraído de Bornscheuer e Kazslauskas (2005). -------------------------- 7
Esquema 5. Ação das fosfolipases nos fosfolipídeos. Adaptada de De Maria e colaboradores
(2007). ----------------------------------------------------------------------------------------------------11
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Dependência da atividade da TLL em função da temperatura ----------------------- 63
Tabela 2. Análise dos espectros de dicroísmo circular da TLL em diferentes temperaturas ----
------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 64
Tabela 3. Dependência da atividade da Lecitase ultra em função da temperatura ------------ 74
Tabela 4. Medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) para sistemas em AOT/Iso-
octano 200 mM em diferentes quantidades de água (wo). ----------------------------------------- 76
Tabela 5. Valores de Rg obtidos utilizando o GNOM e a distância máxima aplicada na IFT---
------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 82
Tabela 6. Valores de Rg obtidos por SAXS para os sistemas em AOT/iso-octano 200 mM em
diferentes quantidades de água (wo) e a 25 °C. ----------------------------------------------------- 83
Tabela 7. Valores obtidos através da razão Rg/Rh (ρ) -------------------------------------------- 84
Tabela 8. Parâmetros calculados através dos dados obtidos por EPR usando o marcador
hidrofóbico 5-DSA e o marcador hidrofílico 3-(4-nitrofenoxi carbonil)–proxil. -------------- 86
Tabela 9. Valores de velocidade inicial de reação para TLL e Lecitase em micelas reversas---
------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 94
xix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
TLL – lipase de Thermomyces lanuginosus
GndHCl – cloridrato de guanidina
1,8 ANS – ácido 8-anilino-1-naftaleno sulfônico
DLS – espalhamento de luz dinâmico ou Dinamic Light Scattering
CD – Dicroísmo circular ou Circular Dichroism
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
EPR – Ressonância Paramagnética Eletrônica ou Electronic Paramagnetic Ressonance
AOT – bis(2-etil-hexil) sulfossuccinato de sódio
CTAB – cetiltrimetilamônio
SDS – dodecil sulfato de sódio
SAXS – Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo ou Small Angle X-ray Scattering
1
1. INTRODUÇÃO ___________________________________________________________________________
1.1. Lipases
As lipases representam uma importante classe de enzimas cujo papel biológico
relaciona-se com a digestão e o metabolismo de gorduras (REIS et al., 2008). Por definição,
as lipases são hidrolases (glicerol éster hidrolases, E.C. 3.1.1.3) que atuam em ligações ésteres
de várias substâncias, sendo os acilgliceróis de cadeia longa (n ≥ 10) seus substratos naturais
(JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999). Sua definição mais adequada, entretanto, foi descrita
por Verger (1997): são carboxiesterases que catalisam a hidrólise de acilgliceróis de cadeia
longa (Esquema 1).
R1 OR2
O
OH2R1 OH
O
+ OH R2
Lipase+
Esquema 1. Representação da reação de hidrólise de acilgliceróis catalisada por lipases
Estas enzimas atuam na interface orgânico-aquosa, apresentando alta estabilidade na
presença de solventes orgânicos, e, em meios com restrição de água, a reação inversa é
favorecida, podendo ser de esterificação ou transesterificação (KAPOOR e GUPTA, 2012)
(Esquema 2).
(A) R1 O
R2
OOH2
R1 OH
O
+OH R2
Lipase
+
(B) R1 O
R2
O
+Lipase
+ R3 OR4
O
R1 OR4
O
R3 OR2
O
Esquema 2. Representação das reações de esterificação (A) e transesterificação (B) catalisada
por lipases em meios com restrição de água.
Além de seus substratos fisiológicos naturais, como óleos, gorduras e ácidos graxos, as
lipases reconhecem uma ampla variedade de substâncias (ésteres e bicíclicos aromáticos,
tioésteres, aminas ativadas, entre outros) mantendo alta sua regio, enantio e
quimiosseletividade.
Esta condição conhecida como promiscuidade do substrato, associada à promiscuidade
catalítica, em que o sítio ativo das lipases é capaz de catalisar a formação de transformações
químicas distintas como ligações carbono-carbono, carbono-heteroátomo, heteroátomo-
2
hetereoátomo e processos oxidativos, faz com que as lipases atraiam grande interesse tanto
industrial quanto na área de química fina e síntese (KAPOOR e GUPTA, 2012). Na literatura
são descritas diversas aplicações das lipases com diferentes substratos e na promoção de
diferentes reações em síntese orgânica como, por exemplo, epoxidação, adição de Michael,
reações aldólicas (Esquema 3), entre outras.
(A)
NR2
H
R1 +
N
R2
N
NR1Lipase
Tolueno, 250 r.p.m, 30 ºC
N
O
O
O
+ H
O
N+O
-
O
Lipase
25 ºC, solvente/águaN
O
O
O
OH
N+
O-
O + Isômero sin
(B)
(C)
Esquema 3. Exemplos da aplicação de lipases em síntese orgânica. (A) Adição de Michael
(DE SOUZA et al., 2009). (B) Reação aldólica assimétrica de cetonas heterocíclicas com
aldeídos (GUAN, FU e HE, 2012). (C) Epoxidação (MOREIRA e NASCIMENTO, 2007).
As lipases possuem ainda estabilidade em meios reacionais extremamente diferentes
de sua condição normal de catálise (meio aquoso com presença do substrato insolúvel), como
valores de pH extremos, altas temperaturas, elevadas concentrações de sais, solventes
orgânicos, líquidos iônicos, entre outros (KAPOOR e GUPTA, 2012). Muitas vezes estas
alterações, principalmente a presença de solventes orgânicos e líquidos iônicos, podem
influenciar a regiosseletividade ou inverter a enantioseletividade das lipases (KAPOOR e
GUPTA, 2012).
3
A promiscuidade de condições referentes ao ambiente de catálise, citadas
anteriormente, abre inúmeras possibilidades de aplicação das lipases em biocatálise,
principalmente no que se refere às reações de esterificação ou que necessitam de controle de
água no meio, assim como em casos em que o substrato é altamente insolúvel em água
(STERGIOU et al., 2013 e KAPOOR e GUPTA, 2012).
O uso destas enzimas em solventes orgânicos abriu um campo de estudo envolvendo
meios reacionais não-aquosos e estratégias novas para aumentar a estabilidade e atividade das
lipases, como sua interação não covalente com surfactantes, seu aprisionamento em
microemulsões água em óleo ou micelas reversas, imobilização em suportes insolúveis,
liofilização para uso em suspensão em solventes orgânicos e a aplicação de modificações
estruturais através da engenharia de proteínas (STERGIOU et al., 2013).
Todos estes avanços atraíram ainda mais o interesse pelas lipases para possíveis
aplicações industriais, pois a substituição de catalisadores usuais por estes biocatalisadores
oferece vantagens no processo como menor consumo de energia, maior rendimento e ausência
ou menos subprodutos. Além disso, estas lipases podem catalisar grande variedade de reações
com inúmeras aplicações nas indústrias de alimentos, cosméticos, química e farmacêutica
(BON, FERRARA e CORVO, 2008).
Atualmente, as lipases já se encontram inseridas em diversos processos industriais
como a interesterificação de gorduras (Fuji Oil, Unilever, Japão), hidrólise de ésteres
(Sumitomo), transesterificação (Unilever, Japão), acilação (BASF, Alemanha) (BON,
FERRARA e CORVO, 2008). Também são utilizadas em detergentes e vem adquirindo
importância na indústria de óleos, para enriquecimento de triglicerídeos e ácidos graxos,
produção de biodiesel, na área de alimentos como na fabricação de pães, preparo de queijos e
emulsificantes e no tratamento de efluentes. Em menor escala são aplicadas na síntese de
intermediários de moléculas biologicamente ativas, como, por exemplo, diltiazem e
ibuprofeno (GUPTA, BHATTACHARYA e MURTHY, 2013).
1.1.1. Estrutura das lipases
Até 1990, quando as primeiras lipases tiveram suas estruturas tridimensionais
elucidadas, acreditava-se que a diferença entre lipases e esterases era que as lipases têm
aumento em sua atividade em concentrações de substratos que excedem sua solubilidade,
enquanto as esterases são ativas em ligações éster de moléculas solúveis em água. Desta
forma, concluiu-se que as lipases para serem “ativadas” precisavam de uma interface entre
substratos agregados e a solução aquosa, por isso, foram também chamadas de enzimas
4
interfaciais (VERGER, 1997).
De acordo com Verger (1997), o primeiro estudo cinético referente às lipases foi
feito por Sarda e Desnuelle em 1958, baseado no fenômeno de ativação interfacial,
empregado como único diferenciador entre lipases e esterases por muito tempo. Com os
avanços nas técnicas cristalográficas, porém, foi observado também que as lipases,
consideradas interfaciais, apresentavam um padrão de enovelamento, assim como uma
estrutura encobrindo o sítio ativo. De um modo geral, as lipases apresentam um padrão de
enovelamento de α/β – hidrolase, consistindo em folhas β paralelas compondo oito (8) fitas β,
sendo apenas a segunda fita com organização anti-paralela (Figura 1).
Figura 1. Padrão de enovelamento de lipases (α/β – hidrolases). Cilindros correspondem às α-
hélices, e setas às fitas β. Os círculos pretos referem-se aos resíduos da tríade catalítica
(serina, histidina e aspartato ou glutamato). Extraído e adaptado de Jaeger, Dijkstra e Reetz
(1999).
As fitas β (β3 a β8) são conectadas por α-hélices que podem apresentar diferentes
posições espaciais. Estas fitas β também permitem curvaturas distintas entre si, porém,
geralmente, a orientação destas fitas é para a esquerda, sendo que o ângulo entre a primeira e
a última fica em torno de 90°, mas também pode diferir de uma lipase para outra (JAEGER,
DIJKSTRA e REETZ, 1999).
Embora esta estrutura padrão seja conservada em diferentes lipases, existem pequenas
diferenças observadas nestas enzimas obtidas de bactérias quando comparadas às de fungos.
Lipases de Burkholderia cepacia e Burkholderia glumae, por exemplo, não apresentam as
5
duas primeiras fitas β e na região N-terminal é possível observar uma folha β anti-paralela
entre a fita β3 e a α-hélice A (αA) (Figura 1). Enquanto na região C-terminal há uma curta fita
β adicional antes de β8, na direção oposta à fita β8 (NARDINI e DIJKSTRA, 1999).
O sítio ativo das lipases é comum a todas estas enzimas, sendo composto por três
resíduos de aminoácidos, sendo um resíduo nucleofílico (serina), um ácido catalítico
(aspartato ou glutamato) e um resíduo de histidina, sendo mantida esta ordem na sequência
primária, diferente do que ocorre em outras serino-proteases que possuem a tríade catalítica
(JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999).
O sítio ativo localiza-se no lado C-terminal das fitas β (Figura 1) e o resíduo
nucleofílico (serina) está localizado em um pentapeptídeo altamente conservado (Gli-X-Ser-
X-Gli) que forma uma volta gamma (“γ-like turn”), também chamada de cotovelo nucleofílico
(Figura 2) (COSTA e DE AMORIM, 1999; JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999).
Figura 2. Resíduos conservados nas lipases de Rhizomucor mihei (PDB: 3TGL), em roxo,
Thermomyces lanuginosus (PDB: 1TIB), em verde e Burkholderia cepacia (PDB: 3LIP), em
vermelho. Estão coloridos em amarelo, o resíduo de serina do sítio catalítico e, em azul, os
quatro resíduos do pentapeptídeo conservado (Gli-X-Ser-Gli-X).
As lipases apresentam ainda uma estrutura formada por peptídeos anfifílicos que
cobrem o sítio ativo da enzima em solução, podendo ser uma ou duas α-hélices ou ainda uma
região de loop (JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999). Esta estrutura, conhecida como “lid”
(tampa) precisa sofrer um rearranjo para a enzima ficar em sua conformação ativa (aberta) na
interface lipídeo/água. Quando ocorre o contato da lipase com a interface, a tampa é
deslocada expondo uma larga superfície hidrofóbica, e o sítio catalítico fica então acessível ao
substrato (COSTA e DE AMORIM, 1999), fenômeno conhecido como ativação interfacial
(JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999).
Este mecanismo de abertura da tampa, regido por mudanças conformacionais da
enzima, pode variar de uma lipase para a outra, mas sempre há a formação de uma
conformação ativa (aberta) e outra não (fechada). Contudo, alguns estudos recentes
6
demonstram que, em algumas lipases, como a de Pseudomonas glumae, Pseudomonas
aeruginosa e Candida antarctica B, a abertura da tampa pode ocorrer sem estar diretamente
ligada ao fenômeno de ativação interfacial (COSTA e DE AMORIM, 1999).
A abertura da tampa consiste no seu deslocamento de forma que seu lado hidrofílico
seja encoberto em uma cavidade polar e sua região hidrofóbica seja exposta expandindo a
superfície apolar em torno do sítio catalítico. Estes rearranjos favorecem a formação de uma
superfície própria para contato com o substrato (“bolsos de ligação”) e cria uma região
eletrofílica em torno do resíduo de serina, conhecida como cavidade do oxiânion (KRISHNA
e KARANTH, 2002).
A cavidade do oxiânion é formada por dois grupos NH, de amidas dos resíduos de
aminoácidos, sendo um deles do resíduo ao lado C-terminal da serina nucleofílica (do sítio
catalítico) e outro do resíduo no final de β3, na região N-terminal (Figura 1). Seu papel
fundamental está na estabilização de cargas negativas do intermediário tetraédrico formado
durante a catálise (JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999). São as diferenças de tamanho e
hidrofobicidade/ hidrofilicidade desta cavidade e dos demais bolsos de ligação do substrato
que determinam a especificidade da lipase (KRISHNA e KARANTH, 2002).
Todas estas características estruturais são importantes para que a enzima tenha
atividade catalítica, com exceção da tampa que não está presente em todas as lipases. O papel
destas pode ser mais bem compreendido através do mecanismo de catálise atualmente
proposto para as lipases (Esquema 4).
Esquema 4. Mecanismo de catálise e os estados de transição durante a hidrólise de éster
catalisada por lipases. Extraído de Bornscheuer e Kazslauskas (2005).
(1)
(2) (3)
(4)
7
Para as lipases que possuem tampa, a primeira etapa de hidrólise de um éster consiste
na sua abertura com exposição do sítio ativo e formação dos bolsões de ligação. Seguindo esta
etapa, já no sítio ativo, o aminoácido histidina aumenta a nucleofilicidade do grupo hidroxila
da serina. Desta forma, ocorre um ataque nucleofílico ao átomo de carbono suscetível da
ligação éster do substrato, abrindo a ligação C=O e dando origem ao primeiro intermediário
tetraédrico. O anel imidazólico da histidina fica protonado e carregado positivamente, sendo
estabilizado pela carga negativa do resíduo ácido (Etapa 2, Esquema 4) (BORNSCHEUER e
KAZSLAUSKAS, 2005).
Posteriormente, o intermediário tetraédrico formado é estabilizado por ligações de
hidrogênio com os grupamentos amidas dos resíduos pertencentes à cavidade do oxiânion. O
intermediário tetraédrico é desfeito, pelo retorno da ligação C=O e consequente clivagem da
ligação éster e liberação da porção álcool, cujo oxigênio recebe um próton proveniente da
histidina, que age como ácido gerando assim o intermediário denominado enzima acilada,
onde o componente ácido do substrato encontra-se esterificado com o resíduo serina da
enzima (Etapa 3, Esquema 4) (BORNSCHEUER e KAZSLAUSKAS, 2005).
Para que a quebra da ligação covalente na enzima ocorra, é necessária a presença de
água. Neste caso, a molécula de água que se aproxima é ativada pelo resíduo histidina vizinho
e o íon hidroxila resultante promove o ataque nucleofílico ao átomo de carbono da carbonila
do intermediário covalente. Uma molécula de água, que tem seu caráter nucleofílico
acentuado pela ação básica da histidina protonada, ataca o carbono suscetível do intermediário
acil enzima, abrindo a ligação C=O, gerando um segundo intermediário tetraédrico (Etapa 4,
Esquema 4). O retorno da ligação C=O desfaz o segundo intermediário tetraédrico com a
liberação do ácido carboxílico e da enzima livre (Etapa 1, Esquema 4) (BORNSCHEUER e
KAZSLAUSKAS, 2005).
1.1.2. Lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL)
A lipase TLL é obtida do fungo Thermomyces lanuginosus (TL) e é produzida por
fermentação submersa de um microrganismo geneticamente modificado, o Aspergillus
oryzae. Comercialmente, a Lipozyme® TL100 L ou lipase TL (Sigma-Aldrich, L0777)
consiste em uma preparação líquida contendo 73 % de água, 25 % de propilenoglicol, 2 %
de lipase e 0,5 % de cloreto de cálcio.
Esta lipase é muito utilizada na hidrólise de gorduras, modificação de triglicerídeos
e produção de mono e diacilgliceróis, apresenta alta estabilidade térmica, possuindo maior
atividade na faixa de temperatura entre 20-50 ºC, assim como na faixa de pH entre 6 -11
8
(ZHU et al., 2001a; NOVOZYMES, 2001; FERNANDEZ-LAFUENTE, 2010).
Devido a estas características, a lipase de Thermomyces lanuginosus possui
importantes aplicações na indústria, como, por exemplo, seu uso em detergentes em pó
utilizados para lavar roupas, onde a lipase atua como um facilitador na remoção de
manchas de gordura (MOGENSEN et al, 2005).
Além disso, suas características são vantajosas também para outras aplicações como
a produção de biodiesel, a resolução de misturas racêmicas, a síntese de pesticidas, na rota
quimio-enzimática de medicamentos e na produção de alimentos como os glicerídeos para
margarinas e lipídeos estruturados com propriedades funcionais (FERNANDEZ-
LAFUENTE, 2010). Nestes casos, a enzima é utilizada preferencialmente na sua forma
imobilizada.
A lipase de Thermomyces lanuginosus é extensamente estudada e sua estrutura é
bem conhecida (BRZOZOWSKI et al., 2000; MOGENSEN et al., 2005; FERNANDEZ-
LAFUENTE, 2010). Esta enzima possui em torno de 30 kDa, sendo mono-glicosilada (com
resíduos de N-acetilglicosamina, galactose e/ou manose) no resíduo de asparagina (N33)
(Figura 3), o que adiciona aproximadamente 2 kDa à massa molecular da enzima nativa
(BOEL et al., 1998; PINHOLT et al., 2010).
Figura 3. Estrutura da lipase de Thermomyces lanuginosus (PDB: 1DT3, BRZOZOWSKI et
al., 2000) mostrando os resíduos Asn33 (vermelho), His258 (verde) e Trp89 (laranja).
Em sua estrutura primária, a TLL apresenta 269 resíduos de aminoácidos
(BRZOZOWSKI et al., 2000); dentre estes, possui sete resíduos de lisina (24, 46, 74, 98,
127, 223 e 237) que são importantes para processos de imobilização covalente e cross-
linking (FERNANDEZ-LAFUENTE, 2010), e quatro resíduos de triptofano, um dos quais,
localizado na tampa (Trp 89), próximo ao sítio ativo, que é necessário para uma catálise
eficiente. Enquanto os outros três resíduos (Trp117, Trp221 e Trp260) são relacionados à
estabilidade estrutural desta lipase, contribuindo para sua hidrofobicicidade, como
demonstrado em estudos de espectroscopia de fluorescência no estado estacionário (ZHU et
9
al., 2001, a e b).
O sítio ativo apresenta a tríade catalítica comum às lipases, sendo constituído pelos
resíduos serina (146), ácido aspártico (201) e histidina (258) (ZHU et al., 2001a). Ainda,
segundo Yang e colaboradores (2003), a estrutura tridimensional desta lipase é estabilizada
por três ligações dissulfeto.
Alguns estudos de cristalografia demonstraram que esta enzima apresenta oito fitas-
beta centrais, com predomínio de folhas- paralelas e cinco -hélices circundando as folhas-
. A tampa (lid) trata-se de uma estrutura móvel em -hélice consistindo dos resíduos de
aminoácidos 86 a 92. O lid foi observado na estrutura cristalográfica (PDB: 1EIN) onde
também foi capaz de manter sua mobilidade (BRZOZOWSKI et al., 2000; FERNANDEZ-
LAFUENTE, 2010).
Estes estudos evidenciaram três diferentes estados conformacionais, sendo um
intermediário instável e duas formas estáveis, com a tampa aberta, expondo o sítio ativo, e
fechada, encobrindo esta larga região hidrofóbica (BRZOZOWSKI et al., 2000). Em geral, a
tampa que encobre o sítio ativo nas lipases apresenta-se na sua forma fechada quando em
meio aquoso na ausência de substrato ou inibidor (ZHU, JUTILA e KINNUNEN, 2000).
Entretanto, para a TLL, alguns autores reportaram que esta estrutura encontrava-se aberta em
alguns cristais da proteína formados na ausência de substratos ou inibidores (PALOMO et al.,
2003; WILSON et al., 2006; FERNANDEZ-LAFUENTE, 2010).
Tal fato demonstra a exposição do sítio ativo, que corresponde a uma larga região
hidrofóbica, e, consequentemente, a estrutura cristalina pode ser observada como um dímero,
em função da interação inter-proteica das regiões hidrofóbicas expostas (Figura 4).
Figura 4. Estrutura cristalina da lipase de Thermomyces lanuginosus em sua forma dimérica
(PDB: 1DT3). Em laranja, o “lid”, uma α-hélice móvel, e, em verde, os resíduos de
aminoácidos que compõem o sítio ativo (Ser146, Asp201 e His258).
10
Este comportamento foi sugerido por Palomo e colaboradores (2003) e Fernandez-
Lafuente (2010) para as lipases de Thermomyces lanuginosus e Mucor miehei (MML,
Novozym® 388) e por Wilson e colaboradores (2006) para a Lipase QL de Alcaligenes sp.
Nestes casos, foi demonstrado que as enzimas possuem uma forte tendência em formar
dímeros, mesmo em baixas concentrações (abaixo de 50 µg/mL).
Foi evidenciado que o aumento da força iônica do meio favorece a formação destes
oligômeros, enquanto a presença de detergentes desfavorece esta interação, indicando que
estes dímeros não são formados pela adsorção destes detergentes na estrutura da enzima.
Além disso, a presença de agregados ou oligômeros com três ou mais monômeros não foram
observados durante os ensaios por cromatografia líquida por exclusão molecular, o que
reforça a possibilidade de haver apenas um sítio de interação, possivelmente a extensa região
hidrofóbica presente em torno do sítio ativo (PALOMO et al., 2003).
Apesar de algumas evidências, a presença destes dímeros continua controversa, pois
ainda não foram observados outros estudos que comprovem esta condição estrutural em
solução aquosa. Este fato apresenta extrema importância, uma vez que dímeros e monômeros
apresentam propriedades funcionais distintas, sendo este último mais ativo, porém menos
estável que o primeiro (PALOMO et al., 2003; WILSON et al., 2006).
1.2. Fosfolipases
As fosfolipases têm papel importante em muitos mecanismos biológicos, entre eles a
digestão e a inflamação. Elas hidrolisam fosfolipídeos gerando uma série de produtos como
ácidos graxos livres, diacilgliceróis, liso-fosfolipídeos e fosfatidilcolina. Seus subtipos (A1,
A2, C e D) são classificados pela especificidade de sua ação em posições diferentes dos
fosfolípideos (Esquema 5) (DE MARIA et al., 2007).
Esquema 5. Ação das fosfolipases nos fosfolipídeos. Adaptada de De Maria e colaboradores
(2007).
11
Embora as fosfolipases A2 sejam as mais estudadas, por seu importante papel
biológico como ação nas membranas celulares, inflamação, síntese de eicosanoides e
sinalizadores intracelulares, além de sua aplicação no preparo de queijos e na panificação (DE
MARIA et al., 2007; JEGANNATHAN e NIELSEN, 2013), são as enzimas do subtipo A1
que despertaram o interesse da indústria nos últimos anos, proporcionando uma série de novos
estudos e aplicações (DE MARIA et al., 2007).
Estas fosfolipases (A1) são membros da família da triacilglicerol lipase, possuindo a
capacidade de reconhecer substratos como os triacilgliceróis e outros comuns às lipases.
Também apresentam uma considerável similaridade em sua sequência primária adotando
enovelamento com estruturas secundárias α e β e tendo os resíduos serina, histidina e ácido
aspártico (ou glutâmico) compondo a tríade catalítica. Podem ainda apresentar um pequeno
lid (tampa) (DE MARIA et al., 2007; ARIMA et al., 2012).
Por esta especificidade e variedade de produtos, as fosfolipases despertaram interesse
das indústrias, mas seu amplo uso só foi possível com os avanços da engenharia genética e de
proteínas que permitiu a produção de quantidades comercialmente viáveis e sua otimização.
Industrialmente, estas enzimas são amplamente utilizadas na produção de amido, pães,
óleo e queijo (DE MARIA et al., 2007). Na panificação, o papel das fosfolipases está na
produção de agentes emulsificantes como monoglicerídeos e lisolecitina, por exemplo. Já na
produção de queijos, a enzima realiza a hidrólise de fosfolípideos gerando ácidos graxos
livres e lisofosfolipídeos, sendo estes últimos os responsáveis pela retenção de gordura e
consequente aumento no rendimento; sua aplicação principal está na produção de queijo
mussarela a partir de leite de vaca (JEGANNATHAN e NIELSEN, 2013).
No refino de óleos vegetais (degomagem), a fosfolipase A1 ganhou destaque em
decorrência do aumento na produção e a necessidade de técnicas menos danosas ao meio
ambiente. Desta forma, o processo de degomagem começou a ser realizado por via
enzimática, substituindo os processos cáusticos, através de uma nova enzima: Lecitase® ultra.
Algumas indústrias como a Bunge (Alemanha), e a ADM (Estados Unidos) já utilizam a
Lecitase® ultra em larga escala (NOVOZYMES, 2004).
Sua utilização na etapa física de refino de óleos, remoção de gomas ou degomagem,
consiste em ajustar o pH do meio, geralmente com tampão ácido cítrico/NaOH, adicionar a
solução de enzima, deixar reagir por algumas horas (variável dependente da origem do óleo)
sob agitação vigorosa para formar uma emulsão estável à temperaturas em torno de 50-60 °C,
e a separação ocorre por aquecimento a 75-85 °C para desfazer a emulsão seguida de
centrifugação para extrair a fase aquosa (BOJSEN et al., 2000).
12
Esta degomagem enzimática proporciona um processo seguro para obter óleos com
baixo teor de fósforo, onde os níveis caem de 100 ppm para concentrações que nunca
excedem 6 ppm antes do “branqueamento”, reduzindo então os gastos com sílica, que é
utilizada por algumas indústrias para adsorver o fósforo remanescente, e eliminando a
necessidade de agentes emulsificantes. Também há redução na quantidade de soda cáustica e
água utilizada no refino, reduzindo ainda mais os custos (BOJSEN et al., 2000;
NOVOZYMES, 2004).
A aplicação da Lecitase ultra na degomagem também reduz as perdas de óleo em 2 %
se comparada aos processos tradicionais, o que significa para as indústrias um aumento no
rendimento de, aproximadamente, 500 toneladas por dia. Isto se deve ao fato de que em
processos enzimáticos não ocorre a formação de sabão, muito comum em processos químicos.
Em termos ambientais, há redução na quantidade de água e soda cáustica utilizada no
processo, a enzima é biodegradável, o volume final de água com gomas é menor e o custo
ambiental e a produção de resíduos são menores para a produção de enzimas e ácido cítrico
do que para a soda cáustica.
1.2.1. Lecitase ultra
A Lecitase® ultra é uma enzima comercial produzida por fermentação submersa de
Aspergillus orizae (organismo produtor), sendo uma proteína geneticamente modificada
obtida da fusão de genes da lipase de Thermomyces lanuginosus (organismo doador) e da
fosfolipase A1 de Fusarium oxysporum, tendo pelo menos 80% de similaridade com a TLL
(BOJSEN et al., 2000). O objetivo deste procedimento foi o de obter uma enzima com a
estabilidade da lipase e a atividade da fosfolipase A1 para sua aplicação industrial na
conversão de fosfatídeos não-hidratáveis em sua forma hidratável para que possam ser
separados facilmente do óleo, processo conhecido como degomagem enzimática de óleos
(YANG et al., 2006).
Como esta enzima encontra-se protegida por patente (BOJSEN et al., 2000), não são
claras as alterações realizadas para sua obtenção. Sabe-se que as alterações na sequência
primária foram realizadas principalmente nas regiões obtidas da lipase, onde há alteração,
inserção ou deleção de um resíduo de aminoácido da lipase de Thermomyces lanuginosus que
tenha pelo menos um átomo a 10Å do carbono da posição sn-2 do substrato (triglicerídeo). O
resíduo de aminoácido é identificado pela análise da estrutura tridimensional da lipase e seu
substrato (BOJSEN et al., 2000).
Há possíveis alterações ainda na região entre o resíduo de histidina do sítio ativo (258)
13
e a região C-terminal, que inclui as posições 259 a 269, e também modificações próximas à
tríade catalítica (Figura 5).
Figura 5. Possíveis regiões de substituições de resíduos de aminoácidos próximas à tríade
catalítica da TLL (PDB: 1TIB) para a Lecitase ultra. Tríade catalítica da TLL (azul), possíveis
regiões de alteração (laranja). (BOJSEN et al., 2000).
Os autores (BOJSEN et al., 2000) também afirmam que substituições na tampa (lid)
ou próximas a ela nos resíduos glicina(91), leucina(93), asparagina(94), ácido aspártico(96),
leucina(97), lisina(98) e/ou ácido aspártico(99) (Figura 6) possam ter ocorrido. No total, as
alterações na sequência primária não ultrapassaram 20 resíduos de aminoácidos comparados à
sequência da lipase de Thermomyces lanuginosus.
Figura 6. Possíveis mutações na tampa (lid) da TLL (PDB: 1TIB) para a Lecitase ultra.
Possíveis regiões de alteração (laranja). (BOJSEN et al., 2000). Na figura menor é possível
observar a tampa destacada em vermelho e indicada pela seta. À esquerda, a estrutura da TLL
(PDB: 1TIB) com possíveis regiões substituídas.
Tampa
(“lid”)
14
Além disso, para aumentar a atividade fosfolipásica, a Lecitase ultra pode apresentar
uma extensão de peptídeos na posição N-terminal podendo conter entre 4 e 10 resíduos de
aminoácidos, sendo de 1 a 3 carregados positivamente. As extensões podem ocorrer
adicionando aminoácidos serina-prolina-isoleucina-arginina-arginina (SPIRR) em glutamato
na posição 1 ou substituindo este por arginina-prolina (E1RP) ou serina-prolina-isoleucina-
arginina-prolina-arginina-prolina (E1SPIRPRP) ou serina-prolina-prolina-arginina-arginina-
prolina (E1SPPRRP) ou serina-prolina-isoleucina-arginina-prolina-arginina-prolina
(E1SPIRPRP) (BOJSEN et al., 2000).
Apesar da importância industrial da Lecitase ultra e sua aplicação em química fina,
não há muita informação sobre sua estrutura sua sequência primária completa não é
conhecida. Por se tratar de uma fosfolipase e pelo fato deste grupo de enzimas, assim como as
lipases, sofrerem ativação interfacial, alguns autores estudaram o sítio ativo da Lecitase ultra e
identificaram apenas um sítio ativo com ambas as propriedades, tanto de fosfolipase quanto
de lipase (FERNANDEZ-LORENTE et al., 2007; MISHRA et al., 2009).
Foi observado ainda que esta enzima é super ativada por alguns detergentes e é capaz
de reconhecer diferentes ésteres, do mesmo modo que as lipases (FERNANDEZ-LORENTE
et al, 2007), o que lhe confere inúmeras aplicações em química fina, principalmente para a
resolução de misturas racêmicas e na hidrólise regiosseletiva de carboidratos acetilados
(FERNANDEZ-LORENTE et al., 2008).
Mishra e colaboradores (2009), por exemplo, descreveram que esta fosfolipase
apresenta massa molecular de 35 kDa, pH ótimo em torno de 8,5 para atividade lipásica e a
presença de íons Ca+2
e Mg+2
aumenta ambas as atividades, tanto de lipase (hidrólise) quanto
de fosfolipase. Porém, em presença de fosfolipídeos e lipídeos, a atividade de fosfolipase
predomina, reforçando a teoria de um único sítio ativo. Embora possa hidrolisar triglicerídeos
e ésteres de para-nitrofenol de cadeia longa, os substratos acetato de para-nitrofenila e
triacetato de glicerila não são hidrolisados por esta enzima.
Já Yang e colaboradores (2006) observaram pH ótimo entre 5 e 6 para ambas as
atividades (hidrólise), porém não estudaram valores de pH acima de 7, além de temperatura
ótima em torno de 40 °C para atividade lipásica com predomínio de sua ação fosfolipásica
quando acima de 50 °C. No processo de degomagem, a sua ação em hidrolisar fosfolipídeos
predominou e não houve hidrólise de triglicerídeos no processo realizado em óleo de colza a
50 °C.
Liu e colaboradores (2012) demonstraram em seus estudos de imobilização que a
enzima Lecitase ultra quando liofilizada e analisada por espectroscopia de Absorção no
15
Infravemelho por Transformada de Fourier (FTIR) apresentava 19,7 % de estrutura
secundária em α-hélice, 34,1 % em folha β, 24,4 % em β-turns e 21,8 % desordenada
(“random coil”). Seus trabalhos de análise termogravimétrica relatam ainda que a enzima
perde aproximadamente 90 % de seu peso entre 200 e 300 °C. A enzima imobilizada ainda
apresentou excelentes resultados na esterificação de ácido oleico e glicerol com 80,5 % de
conversão e a possibilidade de reutilizar os derivados por seis vezes mantendo a conversão em
70 %.
Em um trabalho de nosso grupo de pesquisa, foi promovida a imobilização da Lecitase
ultra em Amberlite XAD 2 e XAD 4 na presença e ausência de ultra-som (GONÇALVES et
al., 2013). Neste estudo, a enzima foi imobilizada de forma eficiente e a presença de ultra-
som não afetou sua estabilidade e atividade lipásica. Além disso, o uso de solvente orgânico
como a acetona, foi capaz de estabilizar a enzima, provavelmente por remover água de sua
estrutura e consequentemente aumentar sua rigidez. Os derivados imobilizados apresentaram
ainda excelente capacidade de promover a esterificação de 1,2-O-isopropilideno glicerol com
resíduos de ácidos graxos obtidos do refino de óleo de palma (GONÇALVES et al., 2013).
Este produto é um importante intermediário na produção de monoacilgliceróis para uso na
indústria de alimentos e cosméticos.
1.3. Micelas reversas
Microemulsões, de um modo geral, são formadas a partir da mistura de água, óleo e
surfactantes, podendo ou não conter um co-surfactante (DONG et al., 2011). Sua formação
envolve a mistura de dois líquidos imiscíveis, onde um deles é compartimentalizado, isto é,
está disperso no interior do outro (DAMASCENO et al., 2011). Esta dispersão pode ser água
em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A) estabilizada por moléculas anfifílicas que reduzem a
tensão interfacial entre as moléculas de água e óleo, além disso pode ocorrer a formação de
sistemas bicontínuos (MOULIK e PAUL, 1998; STAMATIS, XENAKIS e KOLISIS, 1999;
ACHARYA e HARTLEY, 2012).
As microemulsões diferenciam-se das macroemulsões (emulsões) por serem
transparentes, termodinamicamente estáveis, possuir baixa viscosidade, ter partículas com
tamanho médio entre 5 e 100 nm e são formadas com baixo gasto de energia, onde apenas a
relação correta entre as fases e o componente anfifílico pode levar à homogeneização do
sistema, sem a necessidade de agitação ou aquecimento (MOULIK e PAUL, 1998).
As microemulsões podem apresentar diferentes estruturas cuja formação dependerá da
concentração dos seus componentes. Em casos em que a concentração da água ou fase aquosa
16
é maior que a oleosa ou apolar ocorre a formação de micelas comuns, quando esta condição se
inverte, há a formação de micelas reversas e em proporções iguais destas fases, com uma
mínima quantidade de surfactante, ocorre a formação de estruturas lamelares ou tubulares
(sistemas bicontínuos) (Figura 7) (MIHAILESCU et al., 2001).
(A) (B) (C)
Figura 7. Esquema com as estruturas de microemulsões (A) Micelas comuns, (B) Micelas
reversas e (C) Sistema bicontínuo, lamelar.
As microemulsões formadas com a dispersão de água em óleo podem ser chamadas
micelas reversas. Estes sistemas ternários consistem de um solvente orgânico apolar, água e
tensoativo, podendo conter ou não uma mistura deste último ou a presença de um co-
surfactante como um álcool de cadeia longa, por exemplo (ZOUMPANIOTI et al., 2006a).
A decisão de qual solvente orgânico será aplicado para a formação de micelas reversas
dependerá da natureza do surfactante. Os mais utilizados são os hidrocarbonetos de cadeia
entre 5 e 8 carbonos como pentano, hexano, cicloexano, heptano e, principalmente, iso-
octano. Contudo algumas combinações entre estes hidrocarbonetos e álcoois primários
(pentanol, hexanol e octanol) também possuem bastante utilidade (MARTINEK et al., 1989;
STAMATIS et al., 1999; CARVALHO e CABRAL, 2000).
Os tensoativos ou surfactantes são capazes de alterar as propriedades superficiais e
interfaciais de um líquido. São moléculas anfifílicas, apresentando em sua estrutura química,
tanto grupos hidrofílicos quanto grupos lipofílicos. Em geral, a região hidrofóbica
corresponde às longas cadeias carbônicas, enquanto a hidrofílica tende a variar, podendo ser
constituída por hidroxilas, grupos fosfato, sais de amônio quaternário, entre outros (OTZEN,
2011).
Os tensoativos utilizados no preparo de micelas reversas podem ser neutros
(RUCKENSTEIN e KARPE, 1991) como Brijs e Tweens, por exemplo, catiônicos como os
sais de amônio quaternários de cadeias longas, como o brometo de cetiltrimetilamônio
(CTAB), ou aniônicos, como o bis(2-etilexil)succinato de sódio (AOT) ou dodecil sulfato de
sódio (SDS) (DE e MAITRA, 1995; SHIOMORI et al., 1996). Além disso, alguns
17
fosfolipídeos, como a lecitina de soja, também tem sido empregados (AVRAMIOTIS et al.,
1997; AVRAMIOTIS, CAZIANIS e XENAKIS, 1999) (Figura 8).
Estas moléculas anfifílicas formam as micelas quando são capazes de se agregar em
solução. Para que isto ocorra, os surfactantes tem que estar acima de sua concentração micelar
crítica (CMC), isto é, precisam ser adicionados ao sistema contendo duas fases (dois líquidos
imiscíveis) em quantidade suficiente para exceder a sua solubilidade, seja em água, para as
micelas comuns, ou em solventes apolares, para as micelas reversas (TONOVA e
LAZAROVA, 2008).
(A) (B) (C) (D)
Figura 8. Estruturas químicas dos tensoativos mais utilizados na preparação de micelas
reversas (A) AOT (B) CTAB (C) Brij (D) Lecitina.
No caso das micelas reversas, o AOT tem sido o surfactante aniônico mais usado.
Além dele, o brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), catiônico, os Brijs e os Tweens
(neutros) também têm sido aplicados. Estes surfactantes podem ser usados isoladamente ou
combinados entre si, em alguns casos, ou com co-surfactantes. O tamanho destas partículas é
dependente da concentração de surfactante, do pH do tampão utilizado e da razão
água/surfactante (wo), entre outros fatores (RUCKENSTEIN e KARPE, 1991).
O sistema de micelas reversas, então formado com a presença de surfactantes,
apresenta um micro domínio aquoso, onde o grupo polar do tensoativo encontra-se em torno
O
O
O
CH3
O
O
P
O
N+
CH3
CH3
CH3
O
O-
CH3
10
18
desta região contendo água, enquanto sua parte apolar ou lipofílica está voltada para o
solvente orgânico ou fase oleosa utilizada como dispersante (CARVALHO e CABRAL,
2000).
A manutenção deste sistema depende de forças eletrostáticas, como ligações de
hidrogênio e interações de van der Waals, não existindo ligações covalentes, fato que garante
a fluidez das micelas. É imprescindível ressaltar ainda que as micelas reversas são dinâmicas,
elas podem trocar seus constituintes entre si, além da posição de moléculas de surfactantes e
água (CARVALHO e CABRAL, 2000; TONOVA e LAZAROVA, 2008).
O centro aquoso da micela reversa contém duas populações diferentes de água, sendo
uma altamente imóvel, por estar próxima e hidratando a cabeça polar do surfactante, e outra
livre no centro da micela ou solubilizada no solvente com as propriedades normais da água
(Figura 9) (LUISI et al., 1988; MOULIK e PAUL, 1998; STAMATIS et al., 1999; TONOVA
e LAZAROVA, 2008; MARTINEZ et al., 2013).
A quantidade relativa entre estas populações vai depender dos valores de wo, que são
obtidos através da razão entre as concentrações de água e surfactante (wo =
[água]/[surfactante]), e também da natureza do solvente, onde solventes mais polares tendem
a solubilizar água e, consequentemente, aumentar a população livre (TONOVA e
LAZAROVA, 2008).
Figura 9. Esquema de uma micela reversa AOT/hidrocarboneto demonstrando as diferentes
populações de água presentes. Extraído de Luisi e colaboradores (1988).
19
Estas populações distintas apresentam propriedades físicas diferentes e com isso
interferem também nas características de toda a microemulsão (STAMATIS et al., 1999;
TONOVA e LAZAROVA, 2008). Neste caso, o que ocorre principalmente são as alterações
na condutividade elétrica e na viscosidade. Nas alterações em condutividade, o aumento de wo
permite maior quantidade de moléculas de água livre e, consequentemente, quando um campo
elétrico externo é aplicado ocorre maior transporte de carga entre os centros aquosos de cada
uma das micelas formadas no sistema, já que estas tendem a colidir formando dímeros que
rapidamente se redispersam (MOULIK e PAUL, 1998; TONOVA e LAZAROVA, 2008).
Quando os valores de wo são muito baixos, as moléculas de água estão basicamente
comprometidas com a hidratação da porção polar do surfactante inviabilizando estas cargas e
ocasionando a imobilização parcial deste sistema (TONOVA e LAZAROVA, 2008).
O segundo parâmetro que sofre modificação em função da água total presente no meio
refere-se à microviscosidade da micela. O centro aquoso é mais viscoso quando os valores de
wo são muito baixos, fato explicado pela mesma condição de comprometimento das
moléculas de água com a região polar do surfactante. O aumento de água no meio permite que
a estrutura micelar fique mais aberta ou menos densa (MOULIK e PAUL, 1998; TONOVA e
LAZAROVA, 2008).
1.3.1. Aplicações e importância das microemulsões como micelas reversas
A importância da aplicação destes sistemas como micelas reversas envolve o fato de
serem considerados como um modelo de fragmento de biomembranas, importante para
estudos envolvendo proteínas incorporadas em membranas, como ocorre com ATPase,
manosil-transferase e lipases celulares, que apresentam maiores atividades catalíticas quando
a formação de partículas lipídicas intramembranares ocorre (MARTINEK et al., 1989;
KLYACHKO e LEVASHOV, 2003).
As micelas reversas também podem ser aplicadas em processos de purificação de
proteínas, onde ocorre a extração líquido-líquido em apenas uma etapa, o que é bastante
vantajoso em relação às técnicas tradicionais, que exigem uma sequência de operações como
precipitação, concentração, filtração, aplicação de técnicas cromatográficas, entre outros
(MATHEW e JUANG, 2006; TONOVA e LAZAROVA, 2008; GAIKAIWARI et al., 2012).
As purificações são aplicadas principalmente às lipases utilizando os surfactantes AOT
e CTAB (NANDINI e RASTOGI, 2009; GAIKAIWARI et al., 2012) e são necessários
tempos curtos de contato entre as proteínas e a microemulsão para recuperar a atividade
20
máxima destas enzimas sem alterar significativamente sua estrutura (GAIKAIWARI et al.,
2012).
Porém, apesar destas importantes aplicações, a funcionalidade mais explorada e que
ganhou foco em diversos estudos ao longo dos anos foi a capacidade das micelas reversas em
solubilizar uma significante quantidade de água e de dissolver uma grande variedade de
substâncias tanto hidrofílicas quanto hidrofóbicas (ZOUMPANIOTI et al., 2006). Esta
vantagem possibilita um amplo campo de aplicação destas microemulsões, principalmente na
biotecnologia (KLYACHKO e LEVASHOV, 2003).
A síntese bio-orgânica foi a que mais explorou o uso destas microemulsões por sua
capacidade de incorporar substâncias insolúveis em água sem inviabilizar o uso de enzimas
neste sistema, resolvendo um problema que tem sido enfrentado há muitos anos: a utilização
de enzimas em meio não aquoso (KLIBANOV, 2001).
Diferentes enzimas têm sido usadas em micelas reversas, como tirosinase (YANG,
DENG e CHENG, 2007), quimiotripsina (ABUIN, LISSI e DUARTE, 2005), álcool
desidrogenase (MEZIANI et al., 1997), lipoxigenase (RODAKIEWICZ-NOWAK,
MASLAKIEWICZ e HABER, 1996), galactosidase (CHEN e YEH, 1998; CHEN e OU-
YANG, 2004) e lipases (AVRAMIOTIS et al., 1996). Estas últimas têm como principal
característica o fato de atuarem na interface lipídio/água (ou na interface de um solvente
apolar, como iso-octano/água) e de não atuar no interior da fase orgânica (ZOUMPANIOTI et
al., 2006a).
1.3.1.1. Proteínas em micelas reversas
Muitos estudos com diferentes classes de enzimas e proteínas têm sido desenvolvidos
em busca de informações mais completas sobre a localização destas nos sistemas micelares e
na sua relação com atividade e estrutura (CHEN e OU-YANG, 2004; GOCHMAN-HECHT e
BIANCO-PELED, 2006; FRAGOSO, PACHECO e KARMALI, 2012).
O preparo destas micelas reversas para estudos com a proteína incorporada pode ser
realizado através de três distintos métodos: dissolução, transferência de fase e injeção. A
dissolução consiste em preparar o sistema micelar, contendo surfactante, solvente orgânico e
água (ou tampão), e adicionar a enzima liofilizada. O segundo método envolve a transferência
da proteína de uma fase aquosa para o solvente com o surfactante, enquanto o terceiro, a
injeção, é a mistura de uma solução concentrada da proteína com a solução micelar
(STAMATIS et al., 1999; CARVALHO e CABRAL, 2000).
21
Dentre os três métodos, o mais utilizado para catálise é o da injeção. Diferente dos
demais, ele evita a inativação da enzima, que acontece em função de um longo tempo de
contato desta com o solvente orgânico até a completa solubilização no centro aquoso. Ainda
este método permite o controle da concentração de água na micela (wo), o que não é possível
quando se realiza a transferência de fase. Além disso, a injeção promove a solubilização quase
imediata da enzima no sistema (CARVALHO e CABRAL, 2000).
Ainda há muita discussão em torno da formação e localização das proteínas nas
micelas reversas. Diferentes autores sugerem três diferentes modelos de microencapsulação
como descrito por Carvalho e Cabral (2000): “water-shell”, tamanho fixo e forma induzida
(Figura 10).
Figura 10. Modelos de microencapsulação de proteínas (A) “water-shell” (B) forma induzida
e (C) tamanho fixo. Extraído de Carvalho e Cabral (2000).
No primeiro modelo, “water-shell” (Figura 10, A), sempre é considerado um aumento
de tamanho na micela após o encapsulamento da proteína, uma vez que o tamanho da micela
corresponderá à soma desta vazia mais o tamanho da proteína, entretanto não necessariamente
haverá o mesmo conteúdo de água no centro aquoso. O segundo, forma induzida (Figura 10,
B), descreve que a micela só sofre aumento em seu tamanho quando a proteína é maior que o
sistema previamente formado com água, enquanto no terceiro (Figura 10 C), a
microencapsulação só ocorre se as micelas forem de tamanho correspondente ao da proteína,
podendo ou não ocorrer expulsão de água (CARVALHO e CABRAL, 2000).
Apesar da descrição destes três modelos na literatura, o mais aceito e demonstrado por
diversos autores relaciona-se com o de forma induzida, onde tanto o tamanho quanto a
natureza da proteína e do surfactante e a quantidade de água (wo) alteram a forma e tamanho
da micela (CARVALHO e CABRAL, 2000; GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED,
2006; TONOVA e LAZAROVA, 2008).
De acordo com Tonova e Lazarova (2008) e De e Maitra (1995), o tamanho das
micelas reversas é linearmente proporcional ao aumento do valor de wo. Entretanto, esta
relação só é observada quando a quantidade de água é superior à necessária para a hidratação
da região polar do surfactante. A presença de cátions também pode alterar o tamanho das
gotículas, quanto maior o cátion e menor seu grau de hidratação, mais espaço este ocupa na
22
interface, em detrimento do surfactante. Consequentemente há redução do tamanho da micela
e da sua quantidade de água (TONOVA e LAZAROVA, 2008).
As modificações ocasionadas pela proteína estão relacionadas tanto com seu tamanho
quanto com sua hidrofobicidade. Biomoléculas que são mais hidrofílicas tendem a se localizar
no centro aquoso sem contato direto com a interface, enquanto as mais hidrofóbicas podem
encontrar-se próximas à interface ou ancoradas nesta (Figura 11) (GUPTE, NAGARAJAN e
KILARA, 1995; STAMATIS et al., 1999; CARVALHO e CABRAL, 2000; GOCHMAN-
HECHT e BIANCO-PELED, 2006).
Figura 11. Possível localização de proteínas em micelas reversas no centro aquoso (A)
Próximo à interfaces (B) Ancoradas na interface (C). O círculo preto representa a proteína.
Adaptado de Gupte e colaboradores (1995).
Como exemplo para essas interações, temos a ribonuclease A que nesse sistema se
encontra no centro aquoso (Figura 11, A), as lipases, que são ativas na interface e encontram-
se em contato com o surfactante (Figura 11, B) e o citocromo-c que estaria solubilizado na
interface (Figura 11, C) (GUPTE, NAGARAJAN e KILARA, 1995; NAOE et al., 2004;
GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED, 2006).
De acordo com Gupte, Nagarajan e Kilara (1995) e Gochman-Hecht e Bianco-Peled
(2006), a presença da proteína no centro aquoso proporciona um aumento no tamanho da
micela quando comparada à que não apresenta proteína, porém esta alteração não foi superior
a 10% quando a micela apresentava tamanho superior ou igual ao necessário para acomodar a
biomolécula (TONOVA e LAZAROVA, 2008). Já nos dois demais casos (Figura 11, B e C),
em que a biomolécula encontra-se interagindo com a interface, ocorre redução no tamanho
destas micelas, indicando o rearranjo das moléculas de água e surfactante.
1.3.1.1.1. Lipases em micelas reversas
As micelas reversas ganharam destaque na biocatálise pelo fato de apresentarem
algumas vantagens ainda não encontradas em outros sistemas. Estas microemulsões se
formam quase espontaneamente, apresentam equilíbrio termodinâmico, favorecendo
processos sintéticos, permitem o uso de baixos volumes reacionais, possuem elevada área
interfacial, os processos de troca intermicelar são rápidos, a contaminação microbiológica é
23
minimizada, evitam ou minimizam a agregação de enzimas e a atividade e estabilidade pode
ser mantida (CARVALHO e CABRAL, 2000).
Além disso, as micelas reversas possuem a capacidade de incorporar substâncias
insolúveis em água e permitir o controle rigoroso da quantidade de água no meio reacional,
duas condições cruciais para muitos processos reacionais (ZOUMPANIOTI et al., 2006a;
NAOE et al., 2007).
Atualmente, na biocatálise, as lipases são as enzimas mais utilizadas em sistemas de
micelas reversas, isto se deve principalmente ao fato destas atuarem na interface e serem
capazes de reconhecer diversos substratos, abrangendo um enorme campo de possibilidades
na área biotecnológica.
Dependendo da natureza dos substratos, as reações com lipases podem ser
classificadas em três diferentes tipos: no primeiro, ambos os substratos podem entrar em
contato com a interface, como, por exemplo, álcoois de cadeia longa e ácidos graxos e o
produto permanece na fase aquosa; no segundo, um dos substratos é hidrofílico, como o
glicerol, enquanto no terceiro, o substrato permanece na fase aquosa e os produtos podem ser
hidrofílicos ou permanecer na interface, como ocorre na hidrólise de triglicerídeos
(STAMATIS et al., 1999).
Para a eficiência destes sistemas contendo lipases é importante determinar o tipo de
reação a ser aplicada, pois desta forma fica mais fácil otimizar parâmetros importantes como,
por exemplo, a razão água/surfactante (wo), o pH do tampão e a concentração do surfactante e
do co-solvente, importantes para a atividade lipásica.
Papadimitriou e colaboradores (1995), por exemplo, estudaram a influência de
diferentes isômeros de pentanol (1-pentanol e iso-pentanol) na atividade de esterificação da
lipase de Penicillium simplicissimum em micelas reversas de AOT/iso-octano, enquanto
Talukder e colaboradores (2003) avaliaram o uso de polietilenoglicóis como aditivos para
melhorar a atividade de hidrólise do óleo de oliva da lipase de Chromobacterium viscosum.
Fernandes e colaboradores (2004) também fizeram um estudo para otimizar a hidrólise
da tributirina e trioleína, além da síntese de laurato de etila em sistemas micelares AOT/iso-
octano com a lipase de Thermomyces lanuginosa. Foram avaliados parâmetros como wo, pH e
temperatura. Já Wu e colaboradores (2001) promoveram a modificação química do
surfactante AOT e utilizaram a lipase de Candida rugosa para avaliar a interferência da
mudança do surfactante na atividade de hidrólise do azeite de oliva, demonstrando diferenças
entre estes sistemas micelares.
24
Apesar de o AOT ser o surfactante mais utilizado no preparo de micelas reversas, fato
explicado por sua estabilidade e por não precisar de co-surfactante (FERNANDES et al.,
2004), estudos com lipases em sistemas contendo span, tween, lecitina, Brij 35, SDS e CTAB
também apresentaram bons resultados (STAMATIS, XENAKIS e KOLISIS, 1999).
Naoe e colaboradores (2007), por exemplo, realizaram avaliação estrutural da lipase
de Rhizomucor miehei em micelas reversas formadas por CTAB. Em sua avaliação foram
observadas as influências de diferentes parâmetros como o tipo de co-surfactante, a
concentração de água (wo) e surfactante, além do tamanho da micela e do solvente orgânico
apolar utilizado como iso-octano, hexano e octano.
Na literatura, há relacionado ainda a influência do tamanho destas micelas com a
atividade enzimática. Alguns estudos utilizando a técnica de espalhamento de luz dinâmico
são capazes de observar a interferência deste parâmetro na eficiência catalítica destes sistemas
(BORNÉ, NYLANDER e KHAN, 2002; NAOE et al., 2007).
Contudo, com o avanço na aplicação de lipases em micelas reversas, outros estudos de
interferência destes parâmetros, além dos relacionados à atividade, tem despertado a atenção
dos pesquisadores, como as alterações estruturais destas enzimas quando inseridas neste
microambiente. Para monitorar as mudanças conformacionais, muitas técnicas
espectroscópicas podem ser utilizadas, principalmente pelo fato destas microemulsões
apresentarem transparência óptica (STAMATIS, XENAKIS e KOLISIS, 1999). Entre elas, as
principais são a ressonância eletrônica paramagnética (EPR), o dicroísmo circular (CD),
absorção de luz no ultravioleta (UV) e a fluorescência.
Naoe e colaboradores (2007), além de mediram o tamanho de micelas contendo a
lipase de Mucor miehei em CTAB, observaram as alterações na estrutura secundária desta
lipase causada por variações na atividade de água e na presença de solventes orgânicos. Os
autores utilizaram a técnica espectroscópica de dicroísmo circular.
Zoumpanioti e colaboradores (2006a) realizaram estudos estruturais e de interface das
lipases de Rhizomucor miehei e de Candida antarctica B em microemulsões de hexano-
isopropanol-água. As técnicas utilizadas foram ressonância paramagnética eletrônica e
fluorescência e permitiram observar que a estrutura destas enzimas depende da composição
do sistema, assim como a atividade catalítica só é retida quando a concentração de água no
meio é superior a 2 %.
25
1.4. Técnicas espectroscópicas aplicadas a sistemas micelares
As microemulsões possuem diversas aplicações tecnológicas, sendo úteis na área de
cosméticos, alimentos e farmacêutica, sendo estes sistemas utilizados em associação com
fármacos, polímeros e como nanopartículas. Sua constituição permite a formação de várias
estruturas e diferentes comportamentos físico-químicos que interferem diretamente na função
à que são destinadas como, por exemplo, na liberação de fármacos, na formação de
nanopartículas, na biocatálise e na purificação de proteínas (ACHARYA e HARTLEY, 2012).
Desta forma, a caracterização de microemulsões assumiu um papel fundamental no
desenvolvimento e na sua aplicação em novas tecnologias. Contudo, a elucidação da estrutura
não é algo simples e exige o uso de técnicas sofisticadas e muitas vezes combinadas entre si
para que a informação seja mais precisa (MOULIK e PAUL, 1998; LAI e WU, 2008; ROCHE
et al., 2013).
As técnicas que podem ser aplicadas às análises de microemulsões são o espalhamento
de raios-X a baixo ângulo (SAXS), espalhamento de nêutrons a baixo ângulo (SANS),
espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia eletrônica de transmissão (TEM),
ressonância magnética nuclear (RMN) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Além
disso, métodos como a avaliação da condutância, viscosidade, espectroscopia no
infravermelho (IR), calorimetria e simulações computacionais também ganharam importância
para auxiliar na compreensão dos estados das microemulsões (MOULIK e PAUL, 1998;
MARTINEZ et al., 2013).
Atualmente, as técnicas de espalhamento de luz têm sido amplamente utilizadas por
sua capacidade em fornecer informações relativas a nanoestrutura em diferentes ambientes
(TONOVA e LAZAROVA, 2008), assim como as alterações que ocorrem em decorrência da
solubilização de outros componentes nas microemulsões, como nos casos em que há adição
de fármacos e, principalmente, proteínas (ROCHE et al., 2013).
As proteínas podem promover alterações significativas nas microemulsões, incluindo
micelas reversas, pois são capazes de interagir com a interface, sofrendo modificações
estruturais e interferindo no tamanho e forma destes sistemas principalmente em função do
seu sítio de solubilização, na interface ou no centro aquoso (TONOVA e LAZAROVA,
2008).
26
1.4.1. Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR)
A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica, também conhecida como
Ressonância de Spin Eletrônico, é utilizada para estudar a estrutura eletrônica de amostras
paramagnéticas orgânicas e inorgânicas, como radicais livres, presentes em sistemas
biológicos, e metais de transição. A técnica permite caracterizar e quantificar estes sistemas
(GONZÁLEZ et al., 2013; REICHENWALLNER e HINDERBERGER, 2013).
O princípio da técnica consiste na irradiação de uma frequência específica de micro-
ondas em uma amostra que contenha pelo menos um elétron desemparelhado e esteja exposta
a um campo magnético homogêneo. Este campo interage com o momento de dipolo
magnético do elétron desemparelhado provocando a ressonância do elétron entre as diferentes
orientações de seu spin. Quando a diferença de energia para a mudança de estado for igual à
radiação eletromagnética, um sinal de EPR é produzido (KAMERZELL et al., 2011;
REICHENWALLNER e HINDERBERGER, 2013).
Os sinais de EPR consistem na primeira derivada do módulo de absorção de micro-
ondas e podem ser gerados por medidas de absorção de energia feitas em diferentes valores de
campo magnético, porém com a frequência constante. Quando não há um campo magnético,
um elétron desemparelhado tem a mesma energia, não importa qual a direção do seu spin,
porém na presença de um, as duas direções do spin tem energias diferentes, estando paralelos
ou antiparalelos ao campo magnético aplicado, e a radiação eletromagnética pode provocar
uma transição entre os dois níveis de energia, condição que exige absorção de energia
(GONZÁLEZ et al, 2013; REICHENWALLNER e HINDERBERGER, 2013).
Embora a técnica de EPR seja muito importante na obtenção de informações em
sistemas biológicos e na dinâmica de proteínas ou estudo de membranas, existe a limitação de
que são raros os materiais biológicos que possuem centros paramagnéticos, alguns deles são
as metaloproteínas que contenham metais de transição (REICHENWALLNER e
HINDERBERGER, 2013).
Desta forma, estes centros paramagnéticos, ou marcadores de spin, precisam ser
incorporados artificialmente aos sistemas que serão estudados. Esse processo em
macromoléculas pode ser realizado durante alguma etapa de síntese, em mudanças após a
síntese, na adição de resíduos de aminoácidos modificados, na inserção destes marcadores no
sistema ou até mesmo como substrato modificado de enzimas (AVRAMIOTIS et al., 1998;
AVRAMIOTIS et al., 2007; NETO et al., 2009; KEIZERS e UBBINK, 2011; JESCHKE,
2013).
27
Os marcadores de spin são radicais livres estáveis que podem ser acoplados ou
adicionados ao sistema. Os mais simples e mais utilizados são os baseados no radical
nitróxido (Figura 12). São moléculas orgânicas que contêm um elétron desemparelhado e
protegido estericamente por um grupamento nitróxido (KEIZERS e UBBINK, 2011). Os
nitróxidos podem ser quimicamente ligados a proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos ou
macromoléculas sintéticas (JESCHKE, 2013).
NO O
OH
O
(1) (2)
(3)
N
O
OS
O
O
NH
N
O
I
O
Figura 12. Exemplos de marcadores de spin do grupo dos nitróxidos. (1) 1-oxil-2,2,5,5-
tetrametil-3-pirrolina-3-metil-metanoetiossulfonato (MTSL); (2) 1-oxil-3-(2-iodoacetamida) -
2,2,5,5-tetrametilpirrolidina e (3) Ácido 5- doxil esteárico (5-DSA).
Dependendo do marcador de spin selecionado, assim como seu tipo de interação com
as proteínas, diferentes informações sobre os processos dinâmicos internos e externos e sua
condição estrutural no sistema podem ser obtidas. Para estas avaliações, são utilizadas
técnicas combinadas de RMN e EPR, além de simulações computacionais (JESCHKE, 2013).
A técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica, por si só, pode ser usada também
para determinar algumas alterações causadas por interações entre proteínas e surfactantes,
além de estudos sobre membranas (KAMERZELL et al., 2011). Neste último caso, sondas
como o ácido 16- doxil esteárico (16-DSA) são muito úteis, pois se trata de uma substância
hidrofóbica que pode ser usada como marcador para resíduos expostos na membrana. Já o 5-
DSA, serve como sonda para resíduos superficiais porque fica localizado próximo aos grupos
de cabeça polares, importante no caso de micelas (KOEHLER e MEILER, 2011).
De maneira geral, o formato dos espectros de EPR é que descreve a dinâmica das
sondas, que podem apresentar movimentos rápidos, lento e limite rígido, onde o coeficiente
de correlação rotacional no intervalo entre nanosegundos (10-9
) e milissegundos (10-6
)
corresponde ao regime lento. Essa faixa é a mesma em que os radicais nitróxidos apresentam
28
quando se encontram em fases organizadas, como acontece com cristais líquidos e membranas
biológicas (SALMON et al., 2007).
Os nitróxidos possuem três eixos moleculares de rotação, seu sistema magnético de
coordenadas, e estes correspondem ao eixo ao longo da ligação N-O (eixo x), ao longo do
orbital 2p (eixo z) e o eixo perpendicular aos demais (eixo y), como destacado na figura 13
(SALMON et al., 2007; AVRAMIOTIS et al., 2007).
Figura 13. Representação da molécula 12-DSA e os respectivos eixos de rotação deste
marcador de spin que representam seu sistema de coordenadas magnéticas. Extraído de
Avramiotis e colaboradores (2007).
Estes marcadores, quando em movimento rápido ou em ambiente isotrópico, tem um
espectro característico composto por três linhas bem definidas resultantes do acoplamento
hiperfino do spin eletrônico do elétron não emparelhado com o spin nuclear do nitrogênio
(14
N) (KOMMAREDDI et al., 1993). A largura destas linhas relaciona-se ao tempo de
correlação, onde quanto maior sua largura, menor a mobilidade da sonda (SALMON et al.,
2007).
Outro parâmetro, considerado o parâmetro de ordem S, é utilizado quando o campo
magnético afeta de forma diferente as orientações do elétron. Ele fornece uma medida que
representa a posição da sonda em um conjunto supramolecular com valores variando de 0 a 1,
podendo ser em uma estrutura totalmente ordenada quando S for 1 e desordenada para S igual
a zero (KOMMAREDDI et al., 1993; AVRAMIOTIS et al., 2007). Esses parâmetros são
importantes para estimar a localização de proteínas e avaliar membranas assim como sua
interação com estas.
29
1.4.2. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS)
A técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo provê informações muito
importantes sobre macromoléculas em solução. A grande vantagem, principalmente para as
macromoléculas biológicas, está na extração de informação estrutural das amostras sem a
necessidade de cristalização e em faixa de concentração relativamente baixas em solução.
Desta forma, mudanças conformacionais e a formação de complexos podem ser monitoradas e
seus resultados se aproximam de sua estrutura e comportamento em meios biológicos. Além
disso, trata-se de uma técnica não destrutiva, permitindo o uso da amostra para outras
finalidades ou em diferentes condições (MERTENS e SVERGUN, 2010; PÉREZ e
NISHINO, 2012).
Os dados de espalhamento são obtidos em alguns segundos e o método pode ser
aplicado nos campos da física, ciência de materiais e biologia, principalmente na biologia
estrutural, assim como na análise de sistemas farmacêuticos para a liberação de fármacos
(MERTENS e SVERGUN, 2010; DONG e BOYD, 2011; PÉREZ e NISHINO, 2012).
Os raios-X, assim como os nêutrons, são os tipos de radiação mais utilizados para
análise estrutural, enquanto que o espalhamento de luz visível, como o DLS, é aplicado para
análise da distribuição de tamanho de partícula. Este fato deve-se à condição de que o
comprimento de onda precisa ter tamanho comparável ao que se quer avaliar. Então, para
escala nanométrica, aplica-se mais a luz visível (400 a 700 nm) enquanto na faixa de
ângstrons aplicam-se raios-X e nêutrons (0,05 Å a 1 nm) (DONG e BOYD, 2011).
O espalhamento de raios-X consiste no fato de que estes, quando incididos sobre uma
amostra, sofrem desvios causados pelos elétrons dos átomos presentes em um determinado
sistema. Quando os átomos estão organizados no espaço, uma característica de estruturas
cristalinas e de proteínas, a difração ocorre nas direções de espalhamento seguindo a Lei de
Bragg, equação 1.
n = 2 d sen
De acordo com a Lei de Bragg (equação 1), onde é o comprimento de onda da
radiação incidente, corresponde ao ângulo medido entre o feixe incidente e determinados
planos do cristal, “d” é a distância entre os planos de átomos e “n” a ordem de difração, o
ângulo de espalhamento é inversamente proporcional às distâncias interplanares.
Desta forma, dependendo do ângulo de dispersão (θ), diferentes informações
estruturais podem ser obtidas caracterizando diferentes técnicas (Figura 14), onde estas
diferenças são aplicadas a estruturas de tamanhos distintos: espalhamento de raios-X a ângulo
30
alto (WAXS) < 1 nm, SAXS < 1–100 nm e espalhamento de raios-X a ângulo ultra baixo
(USAXS) > 100 nm (DONG e BOYD, 2011).
Figura 14. Esquema demonstrando as diferentes técnicas definidas de acordo com o ângulo
de espalhamento de raios-X. USAXS de 0,001 a 0,3°, SAXS de 0,1 a 10° e WAXS >10°.
Adaptado de Dong e Boyd (2011).
As ondas espalhadas (raios-X) interferem entre si de forma construtiva ou destrutiva,
dependendo da fase em que se encontram. Estas interferências dependem da posição dos
átomos na macromolécula analisada, por isso, sua amplitude e intensidade dependem da
posição espacial destes átomos na molécula. Quando existe uma alta organização dos átomos
na estrutura, ocorre um espalhamento cooperativo, onde as ondas espalhadas possuem alta
definição (DONG e BOYD, 2011).
A amplitude de espalhamento depende da densidade eletrônica, sendo que, quando
uma macromolécula está em solução, o espalhamento é resultante do contraste entre as
densidades eletrônicas do solvente e da amostra. Para as moléculas biológicas, este contraste é
muito fraco, permitindo a aplicação de radiação síncrotron. Além disso, para se obter o
espalhamento por macromolécula basta considerar a diferença do espalhamento do solvente
(MERTENS e SVERGUN, 2010; PEREZ e NISHINO, 2012).
A radiação síncrotron é emitida por elétrons acelerados e possui um fluxo elevado de
fótons (1012
fótons/s) que incide sobre o material permitindo a realização de medidas em
milissegundos (DONG e BOYD, 2011). Resumidamente, as macromoléculas em solução são
expostas a um feixe de raios-X, com um comprimento de onda específico, e a intensidade I
dispersa é registada por um detector, como uma função do ângulo de dispersão (Figura 15)
(MERTENS e SVERGUN, 2010).
31
Figura 15. Esquema mostrando uma coleta espalhamento de raios-X a baixo ângulo e
obtenção da intensidade de espalhamento em diferentes direções com subtração do
espalhamento do solvente (tampão). O vetor de espalhamento é representado por s (ou q).
Adaptado de Mertens e Svergun (2010).
A intensidade (I) do SAXS depende do vetor de espalhamento q (ou s) (Equação 2),
onde 2é o ângulo de espalhamento.
q = 4sen/ (2)
O primeiro dado obtido corresponde ao espalhamento da partícula em todas as
orientações, é um dado bidimensional (Figura 15, A) que é convertido em uma curva
unidimensional (Figura 15, B) da qual podemos obter informação sobre homogeneidade da
amostra, com diferentes interações inter-partículas, tamanho e raio de giro (MERTENS e
SVERGUN, 2010).
Na figura 15, B é possível observar uma curva de espalhamento com resultados
experimentais da intensidade como função do módulo do vetor de espalhamento “q”. Através
deste dado, parâmetros como massa molecular (MM), raio de giro (Rg) e o diâmetro máximo
da partícula (Dmáx) podem ser determinados (MERTENS e SVERGUN, 2010).
A análise de Guinier, desenvolvida na década de 30, parte de uma curva de
espalhamento (Figura 16, A) e utiliza o plot do logaritmo neperiano da intensidade com o
vetor de espalhamento q ao quadrado (LnI;q²) para descrever sua dependência linear em
baixos valores de espalhamento “q” (Figura 16, B).
A obtenção deste gráfico possibilita uma rápida análise da amostra e demonstra a
qualidade do dado obtido. Uma relação não linear indica uma amostra de baixa qualidade e
que pode estar relacionada a uma subtração inadequada do “background” (análise sem
amostra e sem solvente), presença de interações atrativas (Figura 16, B, 1) e repulsivas
(Figura 16, B, 3) e a polidispersividade da amostra.
32
Figura 16. Curvas características de SAXS obtidas para a soroalbumina bovina em diferentes
tampões. A. Curva de espalhamento (intensidade de espalhamento em função de q, ou s). B.
Regressão de Guinier demonstrando (1) agregação (2) amostra homodispersa, não-agregada e
(3) repulsão inter-partículas. Extraído de Mertens e Svergun (2010).
A presença destas interações interfere significativamente no cálculo do raio de giro e
da massa molecular que são dados extraídos através da equação de Guinier (Equação 3) para
uma solução monodispersa de macromoléculas globulares:
I(q) = I(0) exp (
) (3)
A massa molecular pode ser estimada a partir da interceptação do eixo y, quando x
igual a zero, e o raio de giro através da inclinação da curva, α (equação 4):
α =
(4)
As alterações causadas pelas interações podem ser dribladas ajustando-se a
concentração da amostra até que as interações passem a ser desprezíveis. Porém, para um
dado mais confiável e em decorrência da limitação da aproximação de Guinier, o raio de giro
pode ser calculado através da transformada indireta de Fourier (IFT) (MERTENS e
SVERGUN, 2010).
Este método pode ser aplicado com auxílio de programas como o GNOM para a
transformação de Fourier da intensidade de espalhamento na função de autocorrelação p(r)
que representa a probabilidade de encontrar um par de elétrons separados pela distância r
(ITRI et al., 2004).
33
A função p(r) é uma representação no espaço real do dado de espalhamento e fornece
informações sobre a forma, o raio de giro e a dimensão máxima da macromolécula (Dmáx).
Particularidades da forma podem ser determinadas a partir da característica da p(r) como
demonstrado na figura 17.
Figura 17. Gráficos característicos para diferentes formas de macromoléculas em solução
obtidos por análises de SAXS (gráfico de espalhamento) e IFT (p(r)). Extraído de Mertens e
Svergun (2010).
A vantagem da avaliação da p(r) em relação à aproximação de Guinier consiste no fato
de toda a curva de espalhamento ser utilizada e não apenas uma análise em pequenos valores
de “q” os quais são altamente influenciados pela interação inter-partículas, como por
exemplo, a agregação. Além disso, informação sobre a Dmáx e a forma da macromolécula ou
do sistema podem ser obtidas através do perfil da curva p(r), como demonstrado na figura 17.
Além das informações que podem ser adquiridas com os métodos descritos
anteriormente, uma avaliação da relação Ixq² versus “q”, conhecido como gráfico de Kratky,
permite uma indicação sobre o grau de enovelamento de proteínas em solução (GLATTER e
KRATKY, 1982). Neste caso, um único pico proeminente gerando uma curva em forma de
sino, sugere uma proteína globular enovelada, enquanto um aumento contínuo de Ixq2 em
função do aumento de “q” demonstra perda de globularidade proteica (Figura 18)
(MERTENS e SVERGUN, 2010).
Em algumas condições experimentais, a proteína pode se apresentar parcialmente
desenovelada ou possuir regiões flexíveis, o que desencadearia as duas características
34
presentes no gráfico de Kratky, como observado na figura 18, B nas condições 2 e 3 para a
lisozima. Entretanto, proteínas multi-domínios com regiões flexíveis podem se apresentar
apenas como modelos rígidos (MERTENS e SVERGUN, 2010).
Figura 18. Curvas de espalhamento (A) obtidas por análises de SAXS e seus respectivos
plots de Kratky (B) em diferentes condições para a lisozima enovelada (1) parcialmente
desenovelada em ureia 8 M (2) parcialmente desenovelada a 90 °C (3) e desenovelada em
uréia 8 M a 90 °C (4). Extraído de Mertens e Svergun (2010).
Além destas informações, a técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo
permite, através do uso de diferentes softwares, a redução e processamento dos dados brutos
(GNOM, PRIMUS), a análise de misturas (OLIGOMER) e a reconstrução de um modelo
tridimensional de baixa resolução (KONAREV et al., 2006).
Estes programas podem ser utilizados a partir da plataforma ATSAS. Esta, por sua
vez, corresponde a um pacote de programas que permite uma modelagem avançada a partir do
processamento de dados unidimensionais de espalhamento. Com uma série de programas, é
possível, em alguns casos, realizar uma análise completa e a modelagem dos dados
experimentais (KONAREV et al., 2006).
Para a reconstrução de um modelo tridimensional de baixa resolução, um envelope, a
plataforma ATSAS representa uma ferramenta de rápida caracterização estrutural. Este
processo de modelagem é denominado método ab initio.
Os programas mais utilizados são o DAMMIN (Dummy Atom Model Minimisation)
(SVERGUN, 1999), atualizado para uma versão mais rápida: DAMMIF (FRANKE e
SVERGUN, 2009), e o GASBOR (SVERGUN, PETOUKHOV e KOCH, 2001), sendo este
último mais aplicado para análise tridimensional de proteínas. Ambos partem de uma
estrutura esférica e promovem ajustes através de algoritmos com a curva de espalhamento
35
experimental. São necessários vários modelos para diminuir a discrepância do envelope
original com o calculado.
Outros programas desenvolvidos como SUPCOMB (KOZI e SVERGUN, 2001) e
DAMAVER (VOLKOV e SVERGUN, 2003) permitem uma correlação com a estrutura
cristalina das proteínas depositadas no banco de dados (PDB- Protein Data Bank). Mas de um
modo geral são utilizados apenas para calcular a média dos modelos gerados, realizando sua
superposição e avaliando as estruturas mais persistentes. Seus dados podem servir de base
para outras técnicas de resolução estrutural como volume de partida para proteínas, além de
informações sobre simetria (MERTENS e SVERGUN, 2010).
36
2. OBJETIVOS ___________________________________________________________________________
2.1. Objetivo geral
Avaliação da relação estrutura-atividade das enzimas comerciais e de importância
industrial livres e incorporadas em micelas reversas: lipase de Thermomyces lanuginosus e
fosfolipase Lecitase ultra.
2.2. Objetivos específicos
Estudar o comportamento estrutural destas enzimas nos extratos comerciais que
são utilizados industrialmente;
Avaliar alterações estruturais e de atividade das lipases livres e em sistemas
micelares AOT/iso-octano por técnicas espectroscópicas como fluorescência,
dicroísmo circular (CD), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) e
Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR);
Estudar a possível influência do tamanho e estrutura de nanopartículas (micelas
reversas AOT/iso-octano) contendo lipases em sistemas reacionais modelo;
Avaliar a atividade das lipases em micelas reversas AOT/iso-octano.
37
3. MATERIAIS E MÉTODOS
________________________________________________________________________
3.1. Materiais
As enzimas Lecitase ultra e a lipase de Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) foram
obtidas como extrato bruto da Novozymes® (Bagsvaerd, Dinamarca). O cloridrato de
guanidina (99,9 %) e as enzimas purificadas para padronização das colunas de cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) foram obtidos da empresa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
EUA). Os tampões fosfato de sódio e tris(hidroximetil)amino metano foram comprados da
VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil) e o padrão para eletroforese em gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) foi obtido da Bio-Rad (CA, EUA): “Precision Plus Protein™ Dual Color”
(mistura de 10 proteínas recombinantes, de 10 a 250 kDa).
3.2. Avaliação da estrutura das enzimas
3.2.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A aplicação desta técnica cromatográfica teve por objetivo estimar o peso molecular e
o raio hidrodinâmico (raio de Stokes) das enzimas, utilizando uma curva padrão. Também
visou identificar a fração que apresentava atividade enzimática e analisar a pureza da
preparação proteica.
Foram utilizadas duas colunas: a TSK gel G3000SW, 7,5mmIDx30cmx10µm (TosoH
Corporation, Tóquio, Japão), permitindo a separação de amostras de até 500 kDa; e a
Superdex 75 (GE Healthcare) que permite separação até 70 kDa. A fase móvel correspondeu
ao tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,0, avaliou-se a separação cromatográfica em
cromatógrafo (Jasco, EUA) com o detector UV a 280 nm. Os padrões utilizados para a curva
de calibração foram as seguintes proteínas purificadas (obtidas da Sigma-Aldrich): lisozima
(14,3 kDa), anidrase carbônica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa), albumina bovina sérica - BSA
(66 kDa) e a β-amilase (200 kDa).
3.2.2. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD)
Esta técnica permite o monitoramento e caracterização de estruturas proteica
secundária e terciária (VENYAMINOV e YANG, 1996) e foi aplicada para acompanhar
mudanças conformacionais das lipases em tampão fosfato de sódio, solventes e em micelas
reversas.
Para avaliar a estrutura secundária das lipases foram realizadas medidas na região de
38
ultravioleta distante. Nesta análise, valores negativos máximos de elipcicidade em 222 e 208
nm indicam a presença de uma estrutura predominantemente em -hélice enquanto que um
valor mínimo de elipcicidade entre 215 e 225 nm sugere a presença de estrutura secundária
em folha- (VENYAMINOV e YANG, 1996).
As medidas de dicroísmo circular foram realizadas no espectropolarímetro Chirascan
(Applied Photophysics, Leatherhead, Reino Unido) com um sistema de controle térmico
(Peltier) acoplado, utilizando cubeta de quartzo de 0,2 cm de caminho óptico. Os espectros
finais são resultantes da acumulação de, pelo menos, três medidas consecutivas abrangendo
comprimentos de onda de 250 a 190 nm e da subtração adequada dos espectros de linha de
base acumulados empregando-se os mesmos parâmetros de aquisição. Os resultados estão
expressos como valores de elipcicidade bruta (em miligraus) ou em elipcicidade molar
(mgrau.dmol-1
.cm2).
3.2.3. Fluorescência intrínseca e extrínseca
Nos ensaios de espectroscopia de fluorescência, as amostras foram monitoradas
através de sua fluorescência intrínseca, conferida pelos resíduos aromáticos triptofano e
tirosina. A excitação foi realizada a 280 nm e a emissão coletada de 300 a 420 nm.
Para os ensaios de fluorescência extrínseca foi utilizada uma solução estoque (500 µM
em metanol) de ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfônico (1,8-ANS) (Sigma-Aldrich) com
concentração final na solução de 40 M. A excitação foi realizada a 360 nm e a emissão
coletada de 400 to 600 nm. Ambas as medidas de fluorescência foram realizadas no
espectrofluorímetro Jasco FP 6300 (Jasco Corp. Tóquio, Japão).
3.2.3.1. Desenovelamento por ação do cloridrato de guanidina
Para observar o desenovelamento da proteína, foi preparada uma solução concentrada
de cloridrato de guanidina, com concentração avaliada através do índice de refração. Esta
solução foi diluída para adquirir concentrações de 1 a 6 M. A concentração de enzima foi
mantida a mesma em todos os experimentos. Após obter os espectros de fluorescência, o
centro de massa de cada um deles foi calculado, este cálculo é feito como descrito abaixo
(Equação 5). Os valores de centro de massa (‹λ›) foram obtidos em nanômetros (nm).
‹λ›= ∑ λi Fi/∑ Fi (5)
Onde: λi = comprimento de onda
Fi = Fluorescência
39
Para os ensaios de fluorescência extrínseca, as amostras foram incubadas com 1,8
ANS a 40 M por 10 minutos antes da leitura.
3.2.4. Atividade de hidrólise
Com o intuito de avaliar as enzimas quanto ao seu papel como lipase, foram realizadas
medidas de atividade através do acompanhamento dos valores de absorvância a 410 nm. A
formação de p-nitrofenol através da hidrólise do palmitato de p-nitrofenila é acompanhada por
aumento na Abs 410nm. As medidas foram realizadas em espectrofotômetro UV mini 1240
(Shimadzu, Japão).
O substrato palmitato de p-nitrofenila foi solubilizado em isopropanol na concentração
de 5 mM. Também foi preparado tampão Tris HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo 0,005 % de
Triton-X. A reação de hidrólise foi promovida utilizando 60 µL de solução substrato em
tampão com Triton-X e 100 µL de solução de enzima, o volume final foi de 1 mL e a
absorvância lida durante 3 minutos de incubação (INVERNIZZI et al., 2009).
Para calcular a quantidade de produto formada, em micromol, foi feita uma curva de
calibração utilizando o produto da hidrólise, o p-nitrofenol (Figura 19) e a atividade
enzimática foi definida em unidades internacionais (U) que corresponde à quantidade de
proteína (em miligramas ou gramas) necessária para a hidrólise de 1mol de palmitato de p-
nitrofenila por minuto.
Figura 19. Curva de calibração com p-nitrofenol em isopropanol (volume final de 1 mL
obtido por tampão TrisHCl 0,1 M. pH 7 contendo 0,005 % de Triton-X)
3.2.5. “In-gel digestion (IGD)” e espectrometria de massas
As amostras de TLL analisadas por SDS-PAGE (12,5 %), corado por comassie
Brilliant Blue, tiveram suas bandas correspondentes ao monômero (~30 kDa) e dímero (~50
kDa) extraídas do gel utilizando uma lâmina nova para cada extração.
y = 8.0635x - 0.0106
R² = 0.9938 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.05 0.1 0.15
Ab
s a
41
0 n
m
Micromol de p-nitrofenol
Curva padrão p-nitrofenol
40
A extração e digestão das proteínas no gel foram realizadas de acordo com o protocolo
descrito pela Universidade de San Francisco disponível no site http://msf.ucsf.edu/ingel.html.
As bandas foram cortadas em pequenos pedaços e colocadas em eppendorfs diferentes
com solução de bicarbonato de amônio a 25 mM em acetonitrila 50 % e permaneceram no
vórtex, com troca de solução, até que todo o corante (Comassie Blue) fosse retirado,
aproximadamente 4 h. Em seguida, as amostras com gel foram levadas ao speed vac (20 min)
para retirar toda a solução e secar o gel. Nos pequenos pedaços de gel com proteína foi
realizada a redução por 1hora a 56 °C com ditiotreitol (DTT) a 10 mM em solução NH4HCO3
25 mM. Após a reação, o sobrenadante foi removido e a alquilação realizada com adição de
solução de iodoacetamida a 55 mM em NH4HCO3 a 25 mM durante 45 min a temperatura
ambiente e protegida da luz.
A amostra foi então lavada com solução NH4HCO3 25 mM e com solução 25 mM de
bicarbonato de amônio em acetonitrila 50 % para retirar os reagentes anteriores. Os géis
foram mais uma vez secos com auxílio de speed vac (~ 40 minutos) e receberam solução de
tripsina (Trypsin Gold, Grau espectrometria de massas, Promega, WI, EUA) 25 µM e foram
reidratados no gelo (4 °C) por 10 min. Em seguida uma solução 25 mM de bicarbonato de
amônio foi adicionada e o sistema incubado a 37 °C por 16 horas.
Para a extração do peptídeo, o sobrenadante foi removido e colocado em outro tubo de
polipropileno de 1,5 mL, enquanto uma solução de bicarbonato de amônio a 25 mM em
acetonitrila 50 % com ácido fórmico 5 % foi adicionada aos géis, mantida por 30 min sob
agitação e depois sonicada por 5 min para aumentar a recuperação do peptídeo.
O sobrenadante mais uma vez foi coletado e adicionado ao anterior e as amostras
foram secas e posteriormente ressuspendidas em 10 µL de bicarbonato de amônio a 25 mM. A
amostra digerida foi então dessalinizada em microcoluna C18 (ZIP-TIP, Millipore) e
analisada em um espectrômetro de massas (Waters Corp., EUA) com ionização eletrospray
quadrupolo-tempo de vôo (ESI-Q-TOF) na Unidade de Espectrometria de Massas de
Proteínas (UEMP), do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRJ.
3.3. Avaliação das micelas reversas
3.3.1. Preparo de micelas reversas
Para preparar as micelas reversas, uma solução estoque com AOT (Alfa Aesar) 0,2 M
em iso-octano foi preparada. As lipases são então diluídas em tampão TrisHCl 0,2 M pH 7,5 e
em seguida adicionadas à mistura AOT/iso-octano, sendo a concentração final de 50 µg de
41
proteína por mililitro de solução de micela reversa. A quantidade de água adicionada vai
variar de acordo com a equação 6 abaixo:
wo = [H2O]/[AOT] (6)
Desta forma, os valores correspondentes ao woforam calculados através da relação
concentração de água com a concentração de detergente utilizado, neste caso, AOT, como
descrito por Papadimitriou e colaboradores (1995).
3.3.2. Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR)
O procedimento foi realizado no Institute of Biological Research and Biotechnology,
The National Hellenic Research Foundation, em Atenas, Grécia, durante o período sanduíche
do doutorado. A metodologia foi desenvolvida de acordo com Avramiotis e colaboradores
2007. O equipamento utilizado (ER 200 D, Bruker) consiste em módulos separados com
magneto e micro-ondas e foi operado na região de banda X. As amostras foram inseridas em
uma célula plana WG-813-Q Wilmad Suprasil. Inicialmente, foram preparadas soluções
estoques de dois marcadores de spin: o ácido 5-doxil esteárico (5-DSA, 1 x 10-2
M) em etanol
e o 3-(4-nitrofenoxi carbonil)–proxil (2,6 x 10-2
M) em tampão, um hidrofóbico e um
hidrofílico, respectivamente.
Os espectros foram coletados com a adição do marcador na amostra, após evaporar o
etanol, no caso do 5-DSA, e com diluição de mil vezes. A concentração final das sondas foi
de 1,0 x 10-2
mM e 2,6 x 10-2
mM e a atenuação usada foi de 25 DB. Os parâmetros de
operação dos equipamentos foram os seguintes: centro de campo 3480G, amplitude de
modulação, 4,0 G; varredura do campo magnético, 100 G; tempo de varredura, 5 ms,
constante de tempo de detecção, 163,84 ms e frequência de 9,76 GHz.
Cálculo do R:
A primeira etapa consistiu em identificar as regiões com maior intensidade, tanto para
o pico quanto para o vale dos três sinais característicos do espectro obtido. Os valores foram
somados e h-1, h0 e h+1 serão obtidos, uma vez que estes correspondem à distância entre um
pico e um vale. A segunda etapa envolve o cálculo do Δh0 que se refere à diferença entre o
campo magnético da intensidade máxima do pico e do vale central (Figura 20).
42
Campo magnético (G)
3440 3460 3480 3500 3520
Figura 20. Demonstração das regiões utilizadas no espectro de EPR para o cálculo do
(espectro obtido pela análise de micela reversa de w0 10, branco).
Estes valores devem então ser substituídos na equação 7 abaixo.
⌊( ) ( )
⌋ (7)
Cálculo do S:
Campo magnético (G)
3440 3460 3480 3500 3520
Figura 21. Demonstração das regiões utilizadas no espectro de EPR para o cálculo do S
(espectro obtido pela análise de micela reversa de w0 10, branco).
h-1
Δh0
A min
A máx
h+1
43
Para o cálculo da rigidez de membrana, são usados os valores de campo magnético
observados no espectro (Figura 21). São calculadas duas variáveis: A máximo e A mínimo.
Estas são obtidas através da primeira e da última linha do espectro, onde o campo magnético
mínimo obtido (pico) é subtraído do pico magnético máximo (vale).
Em seguida, estes valores são utilizados para calcular dois parâmetros que serão
aplicados posteriormente à fórmula para determinar a rigidez de membrana (S), equações 8 e
9.
(8)
( ) (9)
Onde: Sapp
= S aparente
Calculado a partir das constantes da sonda utilizada (Equação 10).
((
) (
)) ⌈
( )⌉ (10)
Para o 5-DSA, os valores das constantes são: Azz = 33,6; Axx = 6,3; Ayy = 5,8
A rigidez de membrana é calculada a partir da equação abaixo utilizando os valores
previamente obtidos (Equação 11).
( ) [
( )] (
) (11)
Onde a razão (
) é calculada com os valores das constantes e os obtidos no espectro
e encontram-se descritos a seguir (Equações 12 e 13).
( ) (12)
( ) (13)
3.3.3. Análises por Karl-Fischer
As análises para quantificar água nas micelas reversas foram realizadas a 25 °C
utilizando aparelho de Karl-Fischer Schott, TitroLine e solução estável de reativo Karl-
Fischer VETEC.
44
3.3.4. Atividade de esterificação
A atividade de esterificação foi avaliada através da adição de ácido oleico (50 mM) e
etanol (100 mM) ao sistema micelar pronto. As reações para os diversos valores de wo (5, 8,
10, 15 e 20) foram conduzidas em estufa a 40°C sem agitação. As alíquotas foram coletadas e
a esterificação avaliada através do método Lowry-Tinsley (LOWRY e TINSLEY, 1976).
Este método permite a formação de um complexo de cobre com os ácidos presentes na
mistura reacional, com isso pode-se observar seletivamente o consumo de ácidos graxos
através da leitura em espectrofotômetro a 715 nm, comprimento de onda em que o complexo
absorve. Para estas leituras são coletadas alíquotas de 300 L do sistema micelar e
adicionados em 300 L do reagente de Lowry-Tinsley com 600 L de iso-octano, em seguida
à agitação por vórtex, 100 L da amostra da fase orgânica são diluídas 10 vezes em iso-
octano e a leitura da absorção a 715 nm observada.
3.3.5. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
Esta técnica permite observar o tamanho e a estrutura de partículas (micelas reversas),
estimando a distribuição do raio hidrodinâmico (Rh). O equipamento utilizado foi DynaPro
NanoStar da Wyatt Technology (CA, Estados Unidos, EUA) com laser a 630 nm.
Na cubeta de quartzo, foram adicionados 50 µL de amostra a 25 °C. As medidas foram
realizadas com 10 leituras para cada amostra e/ou temperatura e o valor final obtido em
nanômetros corresponde à média das leituras. O tamanho das partículas também foi
monitorado a cada 5 °C.
3.4. Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS)
3.4.1. Análises para a TLL
As análises de espalhamento de raios-X a baixo ângulo foram realizadas na linha
SAXS 2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas, SP, Brasil). Um feixe de
raios-X monocromático foi utilizado (λ = 1,488 Å) com distância detector-amostra de
aproximadamente 975 mm. Os dados de espalhamento foram coletados cada um durante 300s
usando um detector bidimensional MARCCD.
Foram observados o extrato comercial bruto (27 mg/mL) e as soluções diluídas em
tampão TrisHCl 0,1 M, pH 7 nas concentrações de 5,4 e 2,7 mg/mL. As curvas foram
corrigidas pelo espalhamento do tampão TrisHCl 0,1 M, pH 7.
45
Para o modelo da TLL a intensidade de uma solução isotrópica pode ser descrita
através da equação 14 (GLATTER e KRATKY, 1982; FEIGIN e SVERGUN, 1987).
I(q) = k np P(q) (14)
Neste caso, np corresponde ao número de densidade de partículas e k é um fator
relacionado ao efeito instrumental descrito pela equação 2. Enquanto P(q), conhecido como
fator de forma da partícula, fornece informações sobre o tamanho da partícula e sua forma,
com baixa resolução.
Este fator teórico foi calculado através do uso do programa GENFIT (Global Fit
procedure) (BARBOSA et al., 2010) e a metodologia assume que a estrutura terciária
cristalográfica da proteína (arquivo PDB) é conhecida e é igual à sua estrutura em solução.
No presente estudo, o fator forma foi considerado como a soma dos fatores para
dímero, PD(q), e monômero, PM(q), assumindo que as interações entre monômero-monômero,
dímero-dímero e dímero-monômero são insignificantes e encontram-se em equilíbrio, sem se
alterar ao longo do tempo. Desta forma a equação que descreve os fatores é (Equação 15):
I(q) = knp wmonPmon q( ) +1-wmon( )
2Pdim q( )
æ
èçö
ø÷ (15)
Onde np é a concentração de proteína, wmon é a quantidade de proteína em sua forma
monomérica e Pmon(q), Pdim(q) são os fatores forma teóricos para monômero e dímero,
respectivamente.
3.4.2. Análises para as micelas reversas
As análises de espalhamento de raios-X a baixo ângulo foram realizadas na linha
SAXS 2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas, SP, Brasil). Um feixe de
raios-X monocromático foi utilizado (λ = 1,55 Å) com distância detector-amostra de ~ 974
mm, permitindo análise na faixa de q de 0,0151 a 0,3469 Å. Os dados de espalhamento foram
coletados cada um durante 30s usando um detector bidimensional MARCCD. Todas as
análises foram realizadas a 25 ºC utilizando as micelas reversas sem adição de proteína, com
apenas tampão TrisHCl 0,2 M, pH 7,5, como branco.
Para obtenção dos valores de raio de giro e avaliação da qualidade do dado foi
utilizada a aproximação de Guinier e para avaliação da forma, raio de giro (Rg) e distância
máxima (Dmáx) foi realizada a Transformada Indireta de Fourier (IFT) utilizando o programa
GNOM para obtenção da p(r) (SVERGUN, 1992).
46
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ___________________________________________________________________________
4.1. Análise das proteínas por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE)
A primeira etapa do trabalho consistiu em uma avaliação inicial das enzimas Lecitase
ultra e a lipase de Thermomyces lanuginosus, disponíveis comercialmente, tendo por objetivo
determinar sua pureza e estimar sua massa molecular e o raio hidrodinâmico. Para esta
investigação, realizou-se cromatografia líquida de alta eficiência por exclusão molecular e
também eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Previamente à análise das enzimas, realizou-se uma curva de calibração (Figura 22)
utilizando padrões com massa molecular e raios hidrodinâmicos conhecidos, para esta foi
utilizado o volume vazio da coluna (Vo, “void”). Segundo Michielsen e colaboradores (2006),
a equação para calcular a constante Kav (av = available, disponível) encontra-se a seguir
(Equação 16).
Kav= [Ve− Vo]/[Vt−Vo ] (16)
Onde: Ve = volume de eluição da amostra
Vo = volume vazio da coluna
Vt = volume total da coluna
Figura 22. Curva de calibração para a coluna TSK gel 3000 SW (Tampão fosfato de sódio
0,05 M, pH 7,0, fluxo de 1 mL/min, absorvância a 280 nm).
y = -0.37x + 1.7157
R² = 0.9743
y = -0.8893x + 3.3559
R² = 0.9779
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 1 2 3 4 5
Ka
v
Ln (Peso molecular ou raio de Stokes)
Calibração TSK gel 1mL/min
Peso molecular(kDa)Raio de Stokes(Å)
47
Com a curva padrão estabelecida, as enzimas puderam ser avaliadas por cromatografia
líquida e através das equações obtidas na curva de calibração (Equações 17 e 18), foi possível
estimar a massa molecular da enzima e seu raio hidrodinâmico (raio de Stokes),
respectivamente, tendo em vista que o eixo das abscissas corresponde ao logaritmo neperiano
do peso molecular ou do raio de Stokes e o eixo das coordenadas ao Kav. É importante
ressaltar que os valores de peso molecular são apenas estimados, pois o tempo de retenção
destas enzimas na coluna depende do seu raio hidrodinâmico.
7157,137,0 xy (17)
3559,38893,0 xy (18)
Durante a análise cromatográfica das enzimas, foram coletadas alíquotas referentes a
cada pico obtido durante a análise e sua absorção no UV foi avaliada com varredura de 200 a
350 nm em espectrofotômetro. As alíquotas que apresentaram absorção a 280 nm, região de
absorção de proteínas, foram em seguida avaliadas por SDS-PAGE, a fim de verificar a
pureza e massa molecular das proteínas presentes em cada alíquota. Como se tratavam de
soluções com uma quantidade de proteína relativamente baixa, a coloração foi realizada com
nitrato de prata em função de sua sensibilidade de 10 a 100 vezes maior à do corante comassie
blue.
4.2. Ensaios para a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL)
4.2.1. Cromatografia líquida por exclusão molecular e SDS-PAGE
Inicialmente, a lipase foi analisada por SDS-PAGE a 12,5 %. Após coloração
realizada por nitrato prata, além da presença da proteína, esperada em torno de 32 kDa (para a
forma monoglicosilada) (PINHOLT et al., 2010), foi observada a presença de uma outra
proteína com massa molecular em torno de 50 kDa (Figura 34, seta). Neste caso, como esta
lipase comercial é descrita por encontrar-se pura em solução contendo 25 % de
propilenoglicol e 0,5% de cloreto de cálcio em água (Novozymes) trabalhamos com a
hipótese da presença de um possível dímero resistente a desnaturação por SDS.
48
Figura 23. SDS-PAGE (12,5 %) do extrato bruto da lipase comercial de Thermomyces
lanuginosus (TLL) a 3,2 µg/mL (2 µM), coloração por nitrato de prata. A amostra foi fervida
em tampão desnaturante contendo SDS 1 % e β-mercaptoetanol 4 %. MW corresponde ao
padrão de peso molecular.
Algumas lipases como as de Thermomyces lanuginosus and Mucor miehei (MML,
Novozym® 388) foram descritas por apresentarem uma tendência em formar dímeros, mesmo
em concentrações baixas como 50 µg/mL (PALOMO et al., 2003; FERNANDEZ-
LAFUENTE, 2010). Além disso, a TLL foi identificada como uma proteína resistente à
desnaturação por SDS (FANO et al., 2011), o que reforça a hipótese desta enzima também se
apresentar em sua forma dimérica no gel desnaturante de poliacrilamida contendo SDS.
Nas análises realizadas por cromatografia líquida, foram observados dois picos
majoritários correspondentes à proteína (Figura 24, A), o primeiro, com tempo de retenção em
torno de sete minutos, com baixa intensidade, apresentou um raio hidrodinâmico (Rh)
estimado em 30,2 Å (Kav = 0,325), enquanto o segundo e principal pico observado, com
tempo de retenção em torno de nove minutos, teve seu Rh calculado a partir da curva de
calibração (item 4.1) em 28,8 Å (Kav = 0,4208). O terceiro pico, observado em torno de 13
minutos não corresponde à proteína, podendo estar relacionado a uma das substâncias
presentes no extrato comercial.
Durante a cromatografia líquida, foram coletadas amostras baseadas em seus distintos
tempos de retenção e estas foram submetidas a uma análise por SDS-PAGE (Figura 24, B),
com coloração realizada por nitrato prata, em função da baixa concentração de proteína
obtida. A fração 2 (Figura 24, A), corresponde à enzima pura com concentração final de 46
µg/mL com atividade de 0,2 U/mg, utilizando palmitato de p-nitrofenila como substrato (item
3.3).
49
Figura 24. Análises realizadas para a TLL. A. Cromatograma da lipase TL (Cromatografia
líquida de alta eficiência com coluna TSK gel 3000, fluxo de 1mL/min) B. Gel de
poliacrilamida 12,5 % (SDS-PAGE), corado por prata, para as alíquotas coletadas durante a
cromatografia líquida, MW – padrão de peso molecular, 1 e 2 - Fração eluída correspondente
ao número 2 na figura A, 3 e 4 - Fração eluída correspondente ao número 1 na figura A, 5 –
TLL extrato bruto 2 µg/10 µL (6,25 µM) desnaturada e fervida, 6 e 7 - TLL extrato bruto a 2
µg/10 µL (6,25 µM). As amostras coletadas não foram tratadas com tampão desnaturante (β-
mercaptoetanol 4 %). A seta indica o dímero da TLL resistente a SDS.
Mais uma vez, foram observadas bandas entre 25 e 37 (Figura 24 B, 1 e 2) e outra em
torno de 50 kDa (Figura 24 B, 3 e 4). Para a TLL, baseado em sua sequência primária,
esperam-se valores de massa molecular de 29,3 kDa e 58,6 kDa para monômero e dímero,
respectivamente, sem considerar a presença de uma glicosilação no resíduo asparagina 33. A
realização de uma eletroforese utilizando gel nativo (sem SDS) não apresentou bons
resultados.
A presença de bandas em tamanhos diferentes na região entre 25 e 37 kDa pode
indicar a presença de lipase com diferentes graus de glicosilação ou até mesmo a presença da
enzima não glicosilada. Há ainda a possibilidade de diferentes isoformas, entretanto, esta
condição não foi especificamente estudada.
Baseado nestes resultados, e com a expectativa da identificação de dímeros e que estes
encontram-se presentes em solução, foi realizada uma análise por espectrometria de massas
das bandas extraídas do gel (SDS-PAGE). As amostras obtidas como descrito na seção 3.2.5
foram analisadas utilizando espectrometria de massas (ESI- micro Q-TOF).
Foi obtida uma cobertura de 56 % (banda de alto peso) e 46 % (banda de baixo peso) e
a pesquisa em uma base de dados online (MASCOT database: www.matrixscience.com)
indicou que estes peptídeos correspondem à lipase de T. lanuginosus, confirmando a hipótese
previamente estabelecida de que a proteína encontrada em torno de 50 kDa refere-se a TLL
50
(Apêndice A). Desta forma, podemos supor que esta enzima existe como uma mistura de
dímeros e monômeros. Contudo, para uma melhor correlação desta condição em solução
avaliamos tanto o extrato bruto, quanto soluções diluídas da TLL por Espalhamento de Raios-
X a baixo ângulo (SAXS).
4.2.2. SAXS
Para as análises de SAXS foram realizadas medidas em diferentes concentrações de
TLL, como 27 (extrato bruto), 5,4 e 2,7 mg/mL. Análise do perfil de espalhamento do extrato
bruto indicou agregação proteica, observada em baixos valores de q (Figura 25, inserção:
regressão de Guinier), sendo assim, esta amostra não foi mais investigada.
Figura 25. Gráfico obtido por SAXS demonstrando a curva de espalhamento para o extrato
bruto da TLL (27 mg/mL). Inserção representa a regressão de Guinier.
As curvas de espalhamento obtidas para as concentrações de 2,7 e 5,4 mg/mL foram
semelhantes e, em ambas, não foi possível observar efeitos indesejados como agregação ou
interações repulsivas (Figura 26 A). Além disso, o gráfico de Kratky (Figura 26 B) da TLL
em ambas as concentrações indica uma enzima compacta que apresenta uma forma globular
bem definida com valor máximo de Ixq2 em q ~ 0,08 Å
-1.
51
Figura 26. Análise da TLL por SAXS. A. Curvas de espalhamento para a TLL a 5,4 mg/mL
(quadrados) e a 2,7 mg/mL (círculos). B. Gráfico de Kratky das curvas de espalhamento para
a TLL a 5,4 mg/mL (quadrados) e 2,7 mg/mL (círculos). Inserção: Regressão de Guinier para
as duas concentrações proteicas.
As análises de Guinier para todas as concentrações permitiram o cálculo do raio de
giro (Rg) da enzima, sendo este 30,1 ± 0,1 Å para a enzima comercial no extrato bruto a 27
mg/mL (Figura 26), e 26,5 ± 0,2 e 24,0 ± 0,1 Å para as amostras a 5,4 e 2,7 mg/mL,
respectivamente (Figuras 26 B).
Para avaliar a conformação desta proteína em solução foi aplicada a transformada de
Fourier indireta (IFT). Na figura 27 A, é possível observar os ajustes realizados para as
concentrações de 5,4 (linha sólida sobre círculos) e 2,7 mg/mL (linha sólida sobre os
quadrados).
A p(r) normalizada (círculo, inserção figura 27 A) indica que a proteína apresenta uma
forma levemente anisométrica com seção transversal de 35 ± 3 Å e Dmáx de 95 ± 7 Å. O Rg
calculado foi de 28,2 ± 0,2 Å, sendo consistente com o obtido através da aproximação de
Guinier (26,5 ± 0,2 Å).
52
Como a estrutura cristalina da TLL (PDB: 1DT3) demonstra que ela se associa como
um dímero, o programa GENFIT foi utilizado para calcular o fator forma e avaliar se esta
enzima apresenta o mesmo comportamento em solução. A estrutura cristalográfica da lipase
PDB: 1DT3 foi utilizada como modelo e os fatores foram calculados para o monômero
(Figura 27 B, linha sólida) e para o dímero (Figura 27 B, linha tracejada). O fato interessante
foi que em valores de q maiores que 0,075 Å-1
as curvas possuem perfil similar, apesar do
fator escala (Figura 27 B).
Figura 27. Curvas teórica e experimental de espalhamento de raios-X a baixo ângulo. A.
Curva de espalhamento da TLL a 5,4 mg/mL (círculos) com a curva de espalhamento obtida
por IFT (linha cinza sólida) e curva de espalhamento da TLL a 2,7 mg/mL (quadrados), com
curva obtida por IFT (linha cinza sólida) e melhor curva teórica obtida através do programa
GENFIT (linha sólida preta). Inserção: funções de p(r) obtidas para a TLL a 5,4 mg/mL
(círculos abertos) e a soma das funções de p(r) teóricas . B. Cálculo teórico de espalhamento
usando o programa GENFIT para a TLL nas formas monomérica (linha sólida) e dimérica
(linha tracejada). Inserção: Respectivas funções de p(r) do monômero (linha sólida) e dímero
(linha tracejada)
53
A função p(r) também foi calculada para o dímero (linha tracejada) e monômero (linha
sólida) utilizando o GENFIT (Figura 27 B, inserção), porém nenhuma destas reproduziu a que
foi obtida através da IFT (Figura 27 A, inserção, círculos), o que indica que o sistema pode
conter uma mistura de ambas as formas.
Para estes fatores foram também obtidos os valores de Rg, sendo 19,0 e 28,2 Å, para
monômero e dímero, respectivamente, que, quando comparados com os valores de Rg obtidos
a partir da aproximação de Guinier para as concentrações 5,4 e 2,7 mg/mL (26,5 ± 0,2 e 24,0
± 0,1 Å), sugere que a lipase encontra-se principalmente em sua forma dimérica nestas
condições.
Com base nestas observações, as estruturas cristalográficas de ambas as formas,
dimérica e monomérica, foram utilizadas com o propósito de tentar ajustar aos dados de
SAXS como se apenas uma das espécies estivesse presente. Entretanto, nenhuma das
configurações foi capaz de reproduzir os dados experimentais.
Desta forma, assume-se a possibilidade de que ambas as espécies coexistem em
solução, como sugerido pelos dados de SDS-PAGE e a análise de espectrometria de massas.
Portanto, aplicando o peso molecular obtido por eletroforese e o programa GENFIT
(BARBOSA et al., 2013), as curvas de espalhamento experimentais foram analisadas como
uma mistura de dímeros e monômeros. O melhor ajuste obtido, para a TLL a 2,7 mg/mL e 5,4
mg/mL, pode ser visto na figura 27 A (linha sólida preta).
Para estas concentrações, foram encontrados diferentes percentuais de dímeros e
monômeros em solução, indicando um pequeno aumento de dímeros com elevação da
concentração. Estes valores para o monômero foram de 43 ± 2 % e 38,5 ± 1,5 % e de dímeros
de 57 ± 3 % e 61,5 ± 1,4 % para as concentrações de TLL de 2,7 e 5,4 mg/mL,
respectivamente.
Estes resultados demonstram que a metodologia empregada foi capaz de descrever
ambas as curvas de espalhamento e elucidar as quantidades das diferentes espécies presentes
na solução. Além disso, estas curvas de espalhamento podem ser analisadas através da
combinação linear das funções p(r) descrito por Carvalho e colaboradores (2012). Seguindo
este procedimento, foi possível obter os valores de 40 ± 2 % para wmon e 60 ± 2 % para wdim
que são muito próximos aos obtidos pelo programa GENFIT, e adquirir a p(r) que representa
a soma das funções para as espécies (Figura 27 A, inserção, linha sólida preta).
A importância de se evidenciar a presença de dímeros na lipase TL está diretamente
relacionada ao seu uso industrial e em processos de imobilização. Como descrito
anteriormente para as lipases de Alcaligenes sp. e Pseudomonas fluorescens (FERNANDEZ-
54
LORENTE et al., 2003; WILSON et al., 2006), os dímeros são mais estáveis, porém menos
ativos, portanto o uso de altas concentrações da lipase em solução, como em geral é utilizada,
pode comprometer o rendimento do processo em função da dimerização da enzima, sendo,
então, indicado o uso de detergentes, como por exemplo Triton-X. Por outro lado, quando são
necessárias altas temperaturas durante o processo de biocatálise, o uso de concentrações
elevadas desta enzima, favorecendo a formação de dímeros, pode ser mais eficiente em
função de sua maior estabilidade térmica.
Além disso, novos estudos buscando o uso da TLL em terapias de reposição (WANG
et al., 2013) não seriam favorecidos pela presença da lipase em sua forma dimérica, uma vez
que seu sítio ativo estaria comprometido com a interação hidrofóbica. Desta forma, este
estudo possui relevância em áreas como a biotecnologia e biocatálise, assim como na
bioquímica e fisiologia.
4.2.3. DLS
Com o objetivo de checar a monodispersividade da proteína, assim como obter uma
estimativa do seu raio hidrodinâmico (Rh), com a possibilidade de sua alteração causada pela
presença dos dímeros, diferentes soluções de TLL em concentrações distintas foram
submetidas a análises de Espalhamento de Luz dinâmico (DLS). As concentrações testadas
foram inicialmente as mesmas observadas por SAXS (27,0; 5,4; 2,7 mg/mL) e algumas
amostras ainda mais diluídas (1,00; 0,54 e 0,27 mg/mL).
Apesar das diferenças em suas concentrações, não foram encontradas alterações
significativas nos valores de Rh que ficaram em torno de 34 ± 5 Å. Contudo, ao avaliar os
gráficos da função de autocorrelação (Figura 28), foi possível observar a presença de duas
populações nas amostras mais diluídas, de 2,7, 1,0, 0,54 e 0,27 mg/mL, indicando a presença
de dímeros e monômeros e/ou de conformações distintas de dímeros e monômeros. Porém,
nas concentrações mais altas, de 27 e 5,4 mg/mL, uma população prevaleceu demonstrando
sua homogeneidade, possivelmente pela presença de maior concentração de dímeros que são
bem compactos como demonstrado pelos experimentos de SAXS e cromatografia líquida de
exclusão por tamanho.
55
Figura 28. Gráfico das funções de autocorrelação observadas nas medidas de DLS realizadas
para as soluções de TLL (27; 5,4; 2,7; 1,0; 0,54 e 0,27 mg/mL) em tampão TrisHCl 0,2 M,
pH 7,0. A. regularização da leitura B. média das leituras acumuladas.
Como a diferença de tamanho entre as duas populações, observadas na função de
autocorrelação, encontra-se na faixa de erro de medida do equipamento, não foi possível
calcular o tamanho das partículas individualmente, isto é, diferenciar dímeros de monômeros.
4.2.4. Avaliação estrutural da TLL em solução
4.2.4.1. Desnaturação por cloridrato de guanidina (GdnHCl)
Agentes caotrópicos, como cloridrato de guanidina e ureia, assim como alterações em
pressão e temperatura, são importantes para adquirir informações sobre as interações que
regem a estrutura proteica e também o envolvimento de intermediários e estados de transição
durante o processo de desenovelamento da proteína (ZHU, JUTILA e KINNUNEN, 2000).
O GdnHCl é capaz de causar perturbações na estrutura de proteínas. Possivelmente,
atua formando ligações de hidrogênio com grupos das cadeias laterais dos aminoácidos e das
ligações peptídicas, alguns autores sugerem ainda que ele aumenta a solubilidade de alguns
grupos da proteína em solução aquosa, reduzindo as interações hidrofóbicas (CREIGHTON,
1977; FONSECA et al,, 2006).
As alterações na estrutura de proteínas por ação de agentes caotrópicos podem ser
monitoradas através de técnicas espectroscópicas como fluorescência e CD. No caso da lipase
de Thermomyces lanuginosus estas modificações podem ser observadas por fluorescência pela
presença de seus resíduos de triptofano e fornecem informações muito importantes sobre
56
alterações na estrutura terciária, na região próxima ao sítio ativo em decorrência da presença
do Trp89.
O Trp89, na tampa, é importante para a catálise e é responsável por 60 % da emissão
de fluorescência da TLL, sendo o restante desta emitida pelos outros três resíduos (Trp117,
Trp221 e Trp260), descritos por participar da estabilidade estrutural (JUTILA et al, 2004).
Estas alterações na estrutura terciária da TLL em presença de GdnHCl foram
monitoradas por fluorescência (Figura 29). Como observado, ocorre um aumento na
intensidade de fluorescência com concentrações até 3 M, sugerindo exposição de outros
triptofanos mais internalizados, seguido de um deslocamento do espectro para a região do
vermelho (comprimentos de ondas mais longos) precedido de uma redução na intensidade de
emissão de fluorescência. Estes fatores são indicativos de um aumento na exposição dos
resíduos à fase aquosa consequente do desenovelamento da proteína.
Figura 29. Espectro de emissão de fluorescência da TLL após desnaturação por GdnHCl em
diferentes concentrações. As medidas foram realizadas a 25 °C com excitação a 280 nm com
fendas de emissão e excitação de 5 nm.
Para observar alterações na estrutura secundária da lipase, a enzima em diferentes
concentrações do agente caotrópico foi também submetida às análises de dicroísmo circular
(Figura 30). De acordo com os espectros, fica claro que há um leve aumento (de 4 a 6 %) no
conteúdo de estrutura secundária em baixas concentrações de GdnHCl (1 até 2 M), sugerindo
uma população em estado intermediário, podendo ser um glóbulo fundido (molten globule)
(CHRISTENSEN e PAIN, 1991; BOM et al., 2010), entretanto essa diferença pode não ser
57
significativa. Já em torno de 3 M de GdnHCl inicia-se a perda de estrutura secundária em -
hélice com desenovelamento praticamente completo em 5 M.
Comprimento de onda (nm)
215 220 225 230 235 240 245 250
Eli
pci
cid
ad
e b
ruta
(m
ilig
rau
s)
-20
-15
-10
-5
0
5
0M
1M
2M
3M
3,5M
4M
5M
6M
Figura 30. Espectro de dicroísmo circular obtido para desnaturação da TLL com GdnHCl. As
análises foram realizadas a temperatura ambiente, utilizando cubeta de quartzo de 0,2 cm de
caminho óptico. Foram realizadas 3 acumulações e os resultados expressos em elipcicidade
molar.
Figura 31. Mudanças na estrutura secundária (dicroísmo circular) e terciária (fluorescência)
da TLL induzidas por desenovelamento químico. Os valores de elipcicidade a 222 nm (222nm)
foram coletados e os resultados expressos na forma de fração desenovelada ( = (222nmobs-
222nmI)/ (222nmF - 222nmI)), onde 222nmI corresponde ao valor de na ausência de GdnHCl e
222nmF ao valor de em GdnHCl 6 M. Para os dados de fluorescência, foram utilizados os
valores dos centros de massa espectral (item 3.2.3.1.). A TLL foi analisada a 100 µg/mL em
tampão fosfato 50 mM, pH 7,0. Os valores representam a média ± erro padrão de
experimentos em triplicata (n = 3).
58
As modificações observadas no ambiente do triptofano, por fluorescência intrínseca,
foram correlacionada com a perda de elipcicidade molar a 222 nm, isto é com a perda de
estrutura secundária em -hélice (Figura 31). Neste caso, com o aumento da concentração de
cloridrato de guanidina, a lipase perde tanto estrutura terciária quanto secundária de forma
cooperativa e concomitante.
A partir da figura 31 e dos dados obtidos com os ajustes, foi possível calcular a
concentração de cloridrato de guanidina necessária para induzir 50 % da transição (G1/2). Os
valores referentes aos pontos médios das curvas de transição foram 3,78 ± 0,03 M e 3,86 ±
0,04 M para fluorescência e dicroísmo circular, respectivamente, indicando que as
modificações na estrutura terciária acontecem praticamente ao mesmo tempo que às da
estrutura secundária.
Estes dados foram consistentes com outros estudos que demonstraram que os efeitos
da GdnHCl na lipase de Thermomyces lanuginosus parecem estar completos em torno de 5M
com pontos médios de transição em torno de 4 M (ZHU, JUTILA e KINNUNEN, 2000;
PINHOLT et al., 2010).
Embora o desenovelamento induzido por GdnHCl demonstre um mecanismo de dois
estados (nativo e desenovelado) sem evidências de um intermediário do enovelamento (Figura
31), estes já foram evidenciados através de medidas resolvidas no tempo (ZHU, JUTILA e
KINNUNEN, 2000).
Desta forma, para identificar os possíveis estados intermediários da TLL, a enzima
foi incubada com a sonda fluorescente sal de amônio de 8-anilino-1-naftaleno sulfônico (1,8-
ANS), um marcador hidrofóbico que se liga parcialmente às espécies de proteínas enoveladas,
o que promove aumento em sua emissão de fluorescência (SLAVIK, 1982). Portanto, baseado
na afinidade da sonda por ambientes altamente apolares é possível determinar mudanças
conformacionais em proteínas sob desenovelamento físico ou químico e caracterizar possíveis
intermediários enovelados (HAWE, SUTTER e JISKOOT, 2008).
Para a TLL, previamente à análise durante o desenovelamento, foi realizada uma
titulação com 1,8-ANS. Com base na curva de titulação, foi utilizada a razão molar 10:1
(sonda:TLL) para os ensaios seguintes.
Verificamos um aumento contínuo da emissão de fluorescência do reagente 1,8-ANS
com a elevação da concentração de GdnHCl (Figura 32, inserção), indicando que a TLL não
se desenovela completamente na presença deste agente caotrópico mesmo em altas
concentrações (6 M). Este aumento permaneceu mesmo realizando a subtração dos espectros
do branco (1,8-ANS em GdnHCl na ausência de proteína).
59
Figura 32. Emissão de fluorescência do 1,8-ANS em incubação da TLL em diferentes
concentrações de GdnHCl. A TLL a 4 µM em tampão Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, foi
incubada com 1,8-ANS 40 M em diferentes concentrações de GdnHCl. Inserção: espectro de
emissão do 1,8-ANS em presença de TLL em diferentes concentrações de cloridrato de
guanidina e em tampão. A excitação foi de 360 nm com coleta de emissão de 400 a 600nm.
Os espectros foram subtraídos dos valores dos respectivos brancos (sem enzima). Os valores
representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata (n = 3).
Embora ocorra perda de estrutura secundária (Figura 32), ainda há manutenção de
estrutura residual em GdnHCl 6 M. Além disso, este aumento na fluorescência de 1,8-ANS
também poderia indicar a presença de dímeros em solução, uma vez que estas espécies
poderiam sofrer dissociação induzida pelo cloridrato de guanidina com exposição das
interfaces de monômeros, aumentando a ligação da sonda à TLL.
Este resultado sugere que as espécies oligoméricas (dímeros) estão presentes em
solução e que o aumento na fluorescência do 1,8-ANS poderia estar relacionado à dissociação
dos dímeros seguida pelo desenovelamento parcial dos monômeros, com aumento da
exposição dos bolsos hidrofóbicos.
4.2.4.2. Supressão da fluorescência por acrilamida
Os experimentos de supressão da fluorescência permitem calcular a constante baseada
na Equação de Stern-Volmer (Equação 19). Nesta, pode-se observar o quanto os resíduos de
triptofano presentes na proteína estão expostos para o solvente (LAKOWICZ, 2006). Quanto
maior o valor da constante de Stern-Volmer, mais suscetíveis à ação do supressor os resíduos
60
de triptofanos estão, e, portanto, mais expostos ao meio.
Equação de Stern-Volmer: ][1/ QKsvFFo (19)
Onde: Fo/F = intensidade de fluorescência inicial (sem acrilamida)/Intensidade de
fluorescência final (com diferentes concentrações de acrilamida)
KSV = Constante de Stern-Volmer
[Q] = concentração M do supressor (“quencher”)
Acrilamida (M)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
Fo/F
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18TLL
TLL em GdnHCl 3,5 M
TLL em GdnHCl 6 M
y = 30,0426x + 0,4473
R² = 0,9671
y = 38,9363x + 0,0920
R² = 0,9642
y = 57,6956x- 0,3511
R² = 0,9607
Figura 33. Resultado obtido pela supressão da fluorescência em TLL com acrilamida em
diferentes concentrações e na presença de GdnHCl 3,5 e 6 M.
Com os resultados obtidos para a TLL (5 µM), figura 33, a equação (Equação 20)
determina que a constante de Stern-Volmer é igual a 30,04 M-1
quando a lipase encontra-se no
seu estado nativo, porém esta constante aumenta para 38,94 M-1
e 57,70 M-1
em presença de
GdnHCl 3,5 M e 6 M, respectivamente, demonstrando desenovelamento da lipase TL.
4473,00426,30 xy (20)
Estes resultados são consistentes com dados presentes na literatura, pois apesar de
possuir três triptofanos expostos em sua estrutura, um quarto resíduo está presente na tampa,
mais internalizado e provavelmente com sua fluorescência suprimida pelo contato com
cadeias laterais de aminoácidos vizinhos, ou seja, pelo próprio enovelamento da proteína.
61
4.2.4.3. Estabilidade térmica
Para observar as mudanças na estrutura secundária da lipase em função da variação
de temperatura, um espectro de dicroísmo circular foi coletado a cada 5 °C (Figura 34). A
variação foi de 25 a 90 °C, com mudanças de 1°C a cada minuto. Após alcançar os 90 °C a
solução foi resfriada a 25 °C e mais um espectro coletado, objetivando avaliar se as possíveis
alterações seriam irreversíveis. Em todos os dados, a subtração da linha de base e do espectro
do tampão foi realizada.
Figura 34. Espectros de dicroísmo circular para a TLL em diferentes temperaturas. Medidas
de dicroísmo circular foram realizadas em espectropolarímetro Chirascan, utilizando cubeta
de quartzo de 0,2 cm de caminho óptico. Foram coletados espectros a cada 5 °C e utilizado
um sensor de temperatura no interior da amostra. A enzima (a 100 µg/mL) foi avaliada em
tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, utilizado como branco e subtraído dos espectros da
enzima.
De acordo com o observado na figura 34, a lipase de Thermomyces lanuginosus sofre
perdas gradativas na sua estrutura secundária com o aumento da temperatura, principalmente
a partir de 75 °C. Ocorre uma redução na estrutura secundária nativa em torno de 10% a 65
°C, enquanto esta perda passa a 50 % quando a temperatura chega a 85 °C. Entretanto, é
interessante observar que ao resfriar a 25°C esta lipase retoma quase totalmente sua estrutura
secundária inicial (ZHU et al., 2001a).
Estas alterações na estrutura em -hélice, predominante no espectro, podem ser
demonstradas com mais clareza na figura 35, quando a elipcicidade a 222nm é monitorada a
62
cada intervalo de 5 °C. Fica evidente a perda de estrutura secundária, mais significativa a
partir de 65 °C, e é possível obter o valor da temperatura média de transição (Tm) que
corresponde a 73,6 ± 0,8 °C. O valor obtido de Tm é consistente com o observado na
literatura (ZHU et al., 2001a) e confirma a alta termoestabilidade desta enzima.
Figura 35. Gráfico obtido através da elipcicidade bruta obtida a 222 nm em diferentes
temperaturas permite o cálculo da Tm. Os valores representam a média ± erro padrão de
experimentos em triplicata (n = 3). O ajuste foi realizado utilizando o programa Sigma-plot
10.
Estas mudanças na estrutura secundária foram então relacionadas com as alterações na
atividade de hidrólise da TLL que foi monitorada em diferentes temperaturas (Tabela 1).
Como observado, a atividade não foi significativamente comprometida até 60 °C, porém a 65
°C, quando ocorre a perda de aproximadamente 10 % da estrutura secundária, a atividade é
reduzida a 62 %, indicando que pequenas alterações na estrutura nativa secundária
comprometem a funcionalidade da enzima (Figura 36).
Temperatura (°C)
20 30 40 50 60 70 80 90 100
Eli
pci
cid
ad
e b
ruta
a 2
22
nm
-16
-14
-12
-10
-8
-6
63
Tabela 1. Dependência da atividade da TLL em função da temperatura
*A atividade foi medida através da hidrólise do palmitato de p-nitrofenila 5mM como descrito no item 3.2.4. A
atividade a 25 o
C, com 41µg de proteína, foi de 0,1637 ± 0,01 U/ mg de proteína. aRetorno a 25
oC. Os valores
representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata (n = 3). n.o. – não observada.
Para a TLL, mesmo com a manutenção de parte de sua estrutura secundária em altas
temperaturas, ocorre perda de sua atividade, que não foi detectada a 75 °C (Tabela 1 e Figura
36). Além disso, apesar da enzima recuperar 87,7 % de sua estrutura secundária, apenas 22%
da atividade retorna (Tabela 1 e Figura 36). Provavelmente, esta condição deve-se à mudança
conformacional causada pelo aumento da temperatura, em que há um decréscimo em
estruturas em -helices (de 30 para 25 %) e um ganho em folhas- (de 19 para 21-24 %).
Figura 36. Gráfico relacionando dados de atividade com elipcicidade molar da TLL. A
atividade foi determinada de acordo com o item 3.2.4 e o valor obtido a 25 °C foi considerado
como 100 %. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata (n
= 3).
Temperatura (°C) Atividade (%)
25 °C 100 ± 6,33
35 °C 93,20 ± 6,54
45 °C 86,17 ± 1,96
55 °C 82,89 ± 3,44
60 °C 82,42 ± 3,41
65 °C 62,26 ± 10,86
70 °C 24,75 ± 5,68
75 °C n.o.
25 °Ca 22,41 ± 2,09
64
As alterações no tipo de estrutura secundária da TLL em função da temperatura foram
analisadas através da deconvolução de espectros de CD utilizando algoritmos como o
SELCON3 (Tabela 2) através do sistema online DichroWeb (SREEREMA e WOODY, 1993;
WHITMORE e WALLACE, 2008).
Tabela 2. Análise dos espectros de dicroísmo circular da TLL em diferentes temperaturas
SELCON3*
Temp. (°C) α-hélices folhas- β turns desordenada
25 0,287 0,194 0,228 0,285
35 0,302 0,184 0,215 0,292
45 0,286 0,199 0,223 0,297
55 0,276 0,198 0,213 0,309
65 0,257 0,213 0,224 0,307
75 0,182 0,390 0,207 0,195
85 0,133 0,296 0,218 0,312
Retorno a 25oC 0,250 0,215 0,222 0,294
* Referência utilizada para o dado foi 4
Conforme a temperatura foi aumentando, a TLL sofreu perda de estrutura secundária
em α-hélice e turns e ganhou folhas-β, assim como foi evidente a aumento de estrutura
desordenada (Tabela 2). Com o resfriamento desta enzima (retorno a 25 °C), embora recupere
elevado percentual de estrutura secundária (87,7 %), há uma perda significativa em α-hélice e
um ganho em folhas-β (Figura 37).
Figura 37. Quantidade relativa dos componentes da estrutura secundária da TLL em função
da temperatura. O conteúdo estrutural foi estimado com o algoritmo SELCON3 a partir dos
espectros de CD da TLL em diferentes temperaturas.
65
Estes ganhos em estrutura em folha-indicam agregação, causada com aumento de
interações intermoleculares. Porém, podem estar relacionadas também às alterações em
regiões próximas ao sítio ativo, explicando a perda significativa da sua atividade enzimática.
4.3. Ensaios para a Lecitase ultra
4.3.1. Cromatografia líquida por exclusão molecular e SDS-PAGE
O extrato bruto comercial contendo a enzima Lecitase ultra, e constituído por uma
solução aquosa de sorbitol a 50 %, foi avaliado inicialmente por SDS-PAGE (Figura 38),
onde foram observadas duas bandas relativas à proteína.
Tendo em vista que a Lecitase ultra apresenta mais de 80 % de similaridade com a
TLL (BOJSEN et al., 2000) e que esta pode encontrar-se em sua forma dimérica em solução,
como descrito anteriormente, supomos que a banda com maior massa molecular pode ser um
dímero desta fosfolipase.
Figura 38. SDS-PAGE (12,5 %) do extrato bruto da fosfolipase comercial Lecitase ultra a 3,5
µg/mL (2 µM), coloração por prata. A amostra foi fervida em tampão desnaturante contendo
SDS 1 % e β-mercaptoetanol 4 %.
Contudo, para separação destes possíveis componentes, o extrato bruto foi submetido
à cromatografia líquida por exclusão molecular (Figura 39) e seu cromatograma apresentou
três picos de eluição que foram coletados separadamente e avaliados em espectrofotômetro
quanto sua absorção entre 200-350 nm.
66
Figura 39. Cromatograma da Lecitase ultra (CLAE com coluna TSK gel 3000, fluxo de 1
mL/min, a 280 nm).
Apenas os dois primeiros picos (Figura 39) absorveram luz em comprimento de onda
de 280 nm quando analisados nos espectrofotômetro. O terceiro e último teve seu máximo de
absorção entre 236 e 254 nm, sugerindo a presença de nucleotídeos provavelmente
provenientes do processo de extração da enzima. Não foi identificada proteína nessa última
amostra coletada.
O primeiro pico de eluição apresentou tempo de retenção em torno de 9 minutos com
raio hidrodinâmico (Rh) estimado em 27,2 Å (Kav = 0,4183), enquanto o segundo pico
observado, com tempo de retenção em torno de 10 minutos, apresentou Rh de 24, 4 Å (Kav =
0,5150). Estes valores não representam efetivamente o Rh da proteína, sendo apenas uma
estimativa, já que, dependendo do seu grau de compactação, o seu tempo de retenção será
variável. Em termos de peso molecular, os valores calculados foram de 33,3 e 25,6 kDa. As
frações coletadas foram também avaliadas quanto a atividade enzimática, como descrito no
item 3.3. Apenas a fração 2 apresentou atividade que foi de 0,052 U/mg, utilizando palmitato
de p-nitrofenila.
Entretanto, ao avaliar estas amostras coletadas por SDS-PAGE (12,5 %) foi possível
observar que não ocorre uma separação completa das formas e não foi possível visualizar com
clareza a presença de dímeros no gel com a concentração estudada por cromatografia, há
apenas uma leve banda entre 50 e 75 kDa, indicada pela seta na figura 40 B, que também
aparece quando o extrato bruto é analisado por SDS-PAGE (Apêndice B). Essa amostra
67
coletada por cromatografia líquida (Figura 40, poço 1) foi obtida através de diversas coletas e
concentrada por liofilização, indicando a dependência destes dímeros da concentração.
Figura 40. Análises em gel de poliacrilamida 12,5 % (SDS-PAGE) realizadas para a Lecitase
ultra em cromatografia líquido por exclusão molécula; corado por prata. (A) gel original
obtido por coloração com prata (B) Gel com padrões de saturação e contraste alterados para
uma melhor visualização das bandas. PPM - padrão de peso molecular, 1 –fração 2 coletada
diversas vezes e concentrada por liofilização (~3,9 µM), 2 – fração eluída em 9 minutos e 3, 4
e 5 (~0,2 µM) – frações eluídas entre 10 e 12 minutos. As amostras coletadas não foram
tratadas com tampão desnaturante (SDS 1 % e β-mercaptoetanol 4 %), nem fervidas. A seta
indica o possível dímero.
Além disso, os dímeros da Lecitase podem ser sensíveis ao detergente e ao agente
redutor, mas resistentes a SDS, pois apesar de as amostras não terem sido tratadas com
tampão desnaturante e nem terem sido fervidas, havia SDS no gel de poliacrilamida e esta
banda de alto peso foi observada anteriormente na amostra tratada e fervida (Figura 38).
Uma observação interessante consiste na possível presença de isoformas para a
Lecitase. Quando a proteína encontra-se bem diluída, como é o caso das amostras obtidas por
cromatografia líquida, é possível diferenciar três bandas em regiões bem próximas do gel de
poliacrilamida entre 25 e 37 kDa (Figura 40 B, poços 2, 3, 4 e 5).
Não foi possível separar essas isoformas dentro da metodologia aplicada neste
trabalho, sendo considerada a atividade como o conjunto destas diferentes conformações da
proteína. Deve-se considerar ainda, a possibilidade desta enzima ser glicosilada de diferentes
maneiras ou com açúcares distintos como ocorre com a TLL (PINHOLT et al., 2010).
68
4.3.2. DLS
As análises de DLS para a Lecitase ultra demonstraram uma variação bem
significativa nos raios hidrodinâmicos o que pode estar relacionado às diferentes isoformas e
até mesmo à presença de um dímero. A solução comercial (extrato bruto) apresentou
concentração de 3,3 mg/mL, sendo a concentração máxima avaliada, enquanto a menor
diluição foi de 1 mg/mL.
Na concentração mais elevada foi encontrado raio hidrodinâmico médio de 35 ± 11 Å,
sendo identificadas duas populações, uma com ~12 Å e outra com ~53 Å. Neste caso, é
possível que em altas concentrações a Lecitase esteja presente em sua forma dimérica, sendo
esta dependente de concentração como observado para a TLL. Quando a amostra é diluída
para 1 mg/mL o raio hidrodinâmico médio calculado passa a 46 ± 4 Å também com presença
de duas populações, sendo uma com raio 32,4 Å e outra bem pequena de 5,67 Å, que pode
corresponder aos nucleotídeos presentes no extrato bruto, como sugerido anteriormente pelos
dados de CLAE (Figura 40).
Estas duas populações podem ser vistas através do gráfico que representa a função de
autocorrelação. Concentrações mais baixas de enzima apresentaram muito ruído nas regiões
de tempo curto na função de autocorrelação (Figura 41), inviabilizando a medida.
Figura 41. Gráfico da função de autocorrelação observada nas medidas de DLS realizadas
para a Lecitase ultra (1,0 mg/mL) em tampão TrisHCl 0,2 M, pH 7,0. Em vermelho, a
regularização da leitura e em preto, a média das leituras acumuladas (n = 30). As setas
representam os tempos de relaxação.
Além disso, as diferentes populações vistas por SDS-PAGE possuem tamanhos muito
próximos e, provavelmente, o mesmo ocorre em relação ao seu raio hidrodinâmico, onde por
apresentarem diferenças bem pequenas não foi possível diferenciá-los através deste sistema
aplicado.
69
4.3.3. Avaliação estrutural da Lecitase ultra em solução
4.3.3.1. Desnaturação por cloridrato de guanidina (GdnHCl)
De acordo com Bojsen e outros (2000), a Lecitase ultra possui pelo menos 80% de
similaridade com a TLL que apresenta quatro resíduos de triptofanos. Dentre as mutações
realizadas por seu grupo para a produção da Lecitase apenas há a possibilidade da substituição
do Trp 260 que tem papel na estabilidade estrutural, sendo mantidos os demais resíduos deste
aminoácido e, principalmente o resíduo próximo ao sítio ativo (Trp 89). Com isso, a
estabilidade da fosfolipase em relação à agentes caotrópicos pode ser avaliada através de sua
fluorescência intrínseca com importantes informações relacionadas ao sítio ativo.
O espectro de emissão de fluorescência da Lecitase ultra em solução aquosa apresenta
centro de massa espectral entre 350 e 351 nm, sugerindo que seus resíduos de tirosina e,
principalmente de triptofano, não se encontram muito internalizados.
Ao observar a figura 42, quando o cloridrato de guanidina é adicionado à solução de
enzima há um leve aumento na intensidade de fluorescência, mas não é significativo
sugerindo que não há supressão do triptofano. Ao contrário disso, é possível ainda que esse
agente não consiga desfazer as interações intra-moleculares entre os resíduos de tirosina e
triptofano com outros presentes na estrutura.
Figura 42. Gráfico com espectros de emissão de fluorescência para a Lecitase ultra (100
µg/mL) em tampão TrisHCl 0,2 M pH 7 com diferentes concentrações de GdnHCl. As
medidas foram realizadas à 25 °C com excitação à 280 nm com fendas de emissão 10 nm e
excitação de 5 nm.
70
Conforme a concentração do agente caotrópico aumenta, o espectro se desloca para
regiões de maiores comprimentos de onda, um fator indicativo de um aumento na exposição
dos resíduos à fase aquosa e da desnaturação da proteína.
Como esta desnaturação acompanhada por fluorescência indica alterações na estrutura
terciária, a enzima foi avaliada também por dicroísmo circular (Figura 43) para observar as
mudanças em sua estrutura secundária.
Figura 43. Espectros de dicroísmo circular obtidos para desnaturação da Lecitase ultra com
cloridrato de guanidina. As análises foram realizadas a temperatura ambiente, utilizando
cubeta de quartzo de 0,2 cm de caminho óptico. Foram realizadas 3 acumulações e os
resultados expressos em elipcicidade bruta.
Inicialmente, foi observado um ganho de estrutura secundária com GdnHCl até 2,5 M,
com valores de 15 %, para 1 M, 11 % para 2 M e 10 % para 2,5 M. Esta condição sugere uma
população em estado intermediário, podendo ser um glóbulo fundido (CHRISTENSEN e
PAIN, 1991). Porém, em 3 M de GdnHCl já há perda de 12 % de estrutura secundária
passando a 64 % em 3,5 M. Este valor é consistente com o calculado a partir dos ajustes das
frações desnaturadas (Figura 44) para determinar a concentração de GdnHCl necessária para
induzir 50 % da transição (G1/2) que foi de 3,33 ± 0,06 M. No caso da fluorescência esse valor
foi de 3,58 ± 0,04 M.
71
Figura 44. Mudanças na estrutura secundária (dicroísmo circular) e terciária (fluorescência)
da Lecitase ultra induzidas por desenovelamento químico. Os valores de elipcicidade a 222
nm (222nm) foram coletados e os resultados expressos na forma de fração desenovelada ( =
(222nmobs-222nmI)/ (222nmF - 222nmI)), onde 222nmI e corresponde ao valor na ausência de
GdnHCl e 222nmF ao valor em GdnHCl 6 M. Para a fluorescência, foram utilizados os valores
dos centros de massa espectral. A Lecitase ultra foi analisada a 100 µg/mL em tampão fosfato
100 mM, pH 7,0. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata
(n = 3).
A relação entre as ações do agente caotrópico na estrutura terciária e secundária da
Lecitase fica mais clara na figura 45 onde a fração desenovelada foi calculada, indicando que
há inicialmente perda de estrutura secundária seguida da perda de estrutura terciária com uma
diferença muito pequena na concentração de GdnHCl entre ambas, não sendo significativa.
4.3.3.2. Supressão da fluorescência por acrilamida
Apesar de estar mais vulnerável à ação do GndHCl, os triptofanos desta lipase
podem estar mais internalizados do que os da TLL. Isto pode ser observado através do cálculo
da constante de Stern-Volmer em ensaios de supressão da fluorescência por acrilamida
(Figura 45).
72
Acrilamida (M)
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
Fo
/F
0
1
2
3
4
5Lecitase ultra
Lecitase em guanidina 6M
y = 9,3044x + 0,9941
R² = 0,9979
y = 16,6237x + 1,0653
R² = 0,9871
Figura 45. Resultado obtido pela supressão da fluorescência em Lecitase ultra com
acrilamida em diferentes concentrações.
De acordo com os valores obtidos, 9,3 M-1
e 16,6 M-1
, sem e com cloridrato de
guanidina 6 M, respectivamente, os resíduos de aminoácidos estão menos vulneráveis à ação
do supressor quando comparados aos da lipase TL ou a Lecitase apresenta baixa
permeabilidade à acrilamida.
4.3.3.3. Estabilidade térmica
Com o intuito de avaliar as mudanças na estrutura secundária da fosfolipase em função
da variação de temperatura, assim como realizado para a TLL, um espectro de dicroísmo
circular foi coletado a cada 5 °C (Figura 46) e após alcançar os 90 °C a solução foi resfriada a
25 °C e mais um espectro coletado para avaliar se as possíveis alterações seriam irreversíveis
como ocorreu na lipase.
73
Figura 46. Espectros de dicroísmo circular para a Lecitase ultra em diferentes temperaturas.
Medidas de dicroísmo circular foram realizadas em espectropolarímetro Chirascan (Applied
Photophysics), utilizando cubeta de quartzo de 0,2 cm de caminho óptico. Foram coletados
espectros a cada 5 °C e utilizado um sensor de temperatura no interior da amostra.
De acordo com o observado na figura 46, a enzima Lecitase ultra sofre perdas
gradativas na sua estrutura secundária com o aumento da temperatura, principalmente a partir
de 57 °C. As alterações na estrutura em -hélice, predominante no espectro, podem ser
evidenciadas quando a elipcicidade a 222 nm é monitorada. Inicialmente, ocorre perda de 4 %
de estrutura secundária quando a temperatura atinge 52 °C, aumentando para 10 e 20 % de
perda em 57 e 62 °C, respectivamente. Acima desta temperatura, a enzima perde sua estrutura
secundária de forma que o espectro característico de estrutura desordenada (random coil)
predomina. Diferente do observado em estudos anteriores com a lipase TLL (Figura 34), a
Lecitase não recupera sua estrutura secundária com o resfriamento a 25 °C.
Para calcular a temperatura média de transição (Tm), a elipcicidade observada a 222
nm é avaliada em função da temperatura (Figura 47). Estes dados são importantes para
observar a estabilidade térmica da enzima.
74
Figura 47. Gráfico obtido através da elipcicidade bruta obtida a 222 nm em diferentes
temperaturas. Uma função sigmoidal, representada pela equação geral: f= y0+a/(1+exp(-(x-
x0)/b)), foi ajustada aos dados. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos
em triplicata (n = 3).
Observando a figura 47 é possível sugerir que a perda de estrutura secundária em α-
hélice torna-se mais evidente a partir de 60 °C e a temperatura média de transição (Tm)
corresponde à 55,53 ± 1,51 °C.
Estas alterações estruturais foram relacionadas com mudanças na atividade da enzima
através da hidrólise do éster palmitato de p-nitrofenila em diferentes temperaturas. Na tabela
3, é possível observar poucas diferenças na atividade até 40 °C, apenas com um sutil aumento
nesta última temperatura.
Tabela 3. Dependência da atividade da Lecitase ultra em função da temperatura
*100 % de atividade corresponde a 2,89 U/mg. aRetorno a 25
oC
Temperatura (°C) Atividade (%)
25 °C 100,00 ± 2,97*
30 °C 96,95 ± 1,67
40 °C 103,05 ± 0,64
50 °C 93,43 ± 0,25
55 °C 36,42 ± 3,89
60 °C 21,24 ± 7,65
65 °C 16,47 ± 1,43
70 °C 13,42 ± 1,78
25 °Ca 13,42 ± 3,61
75
Este aumento acompanhado da queda brusca da atividade de hidrólise a 55 °C, que
corresponde apenas a 36 % da atividade inicial, corrobora o que foi descrito por Yang e
colaboradores (2006). Os autores afirmam que a Lecitase ultra tem predomínio de atividade
lipásica até 40 °C, sendo esta sua temperatura ótima, enquanto acima de 50 °C, esta enzima
tende a atuar como fosfolipase.
As alterações na especificidade da enzima justificam a queda significativa na atividade
lipásica com uma mudança na estrutura secundária tão pequena, abaixo de 10 % (Figura 48).
Esta modificação estrutural provavelmente está relacionada com regiões do sítio ativo ou em
seu entorno.
Figura 48. Gráfico relacionando dados de atividade com elipcicidade bruta da Lecitase ultra.
A atividade foi determinada de acordo com o item 3.2.4 e o valor obtido a 25 °C foi
considerado como 100 %. Os valores representam a média ± erro padrão de experimentos em
triplicata (n = 3).
Apesar de apresentar perda estrutural e mudança de lipase para fosfolipase, ainda há
uma atividade remanescente de 16 % a 65 °C e em torno de 13 %, a 70 ºC, fato que
provavelmente não ocorreria na presença de fosfolipídios.
Após o resfriamento gradativo da enzima a 25 °C não há recuperação da estrutura
nativa e a enzima possui aproximadamente 13 % de atividade. Diferente da TLL que é capaz
de retomar 87,7 % de sua estrutura secundária (Figura 34).
76
4.4. Micelas reversas
As micelas reversas foram preparadas utilizando-se AOT 0,2 M em iso-octano e
mantendo a quantidade de proteína, tanto para a lipase de Thermomyces lanuginosus quanto
para a Lecitase ultra, em 50 µg/mL de micela, enquanto as quantidades de água (wo) foram
variadas. Os valores de wo partiram de 5 e não ultrapassaram 20, uma vez que menores
quantidades de água não permitem a incorporação da proteína, enquanto em valores
superiores a 20 ocorre a separação das fases, quebra da microemulsão. Para todos os sistemas
o pH foi mantido em 7,5.
Inicialmente, nos sistemas visualmente transparentes, para avaliar se ocorreu a
formação de micela reversa, assim como observar o tamanho do raio obtido, foram realizadas
medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) para cada um dos sistemas (Tabela 4) em
diferentes valores de wo.
Tabela 4. Medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) para sistemas em AOT/Iso-
octano 200 mM em diferentes quantidades de água (wo).
wo
DLS
Raio hidrodinâmico (Å)
branco* TLL Lecitase
5 17 ± 2 17 ± 1 15 ± 2
8 21 ± 1 21± 2 e 9 ± 1 18 ± 3
10 23 ± 2 23 ± 1 20 ± 1
15 22 ± 2 23 ± 1 23 ± 2
20 26 ± 1 25 ± 1 24 ± 2 e 15±2
*micelas sem adição de proteína, apenas tampão. Os valores representam a média ± desvio padrão de
medidas acumuladas (n = 10). A presença de dois valores demonstra a identificação de duas
populações na mesma amostra.
O tamanho mínimo para uma micela deve ficar entre 11 e 12 Å, referentes ao tamanho
do AOT, em alguns casos podem ser formados sistemas de 15 Å devido a associação de
moléculas de AOT na interface ou do par AOT-água (DE e MAITRA, 1995). As micelas
estudadas apresentaram raio entre 15 e 26 Å, sendo que ocorreu aumento no tamanho das
micelas sem proteína (branco) em valores maiores de wo, contudo entre 8 e 15 as diferenças
não foram significativas, principalmente entre 10 e 15.
Nesta faixa, mais especificamente entre wo de 10 e 18, ocorre a hidratação do AOT
77
além da que ocorreu inicialmente, onde passa de três moléculas de água por molécula de AOT
para 12, iniciando a chamada região micelar inchada (DE e MAITRA, 1995). Esta
modificação no grau de hidratação pode fazer com que não ocorram mudanças significativas
no raio hidrodinâmico, pois as moléculas de água estariam ligadas ao AOT (TONOVA e
LAZAROVA, 2008).
Para as micelas reversas com a TLL, foram observadas alterações no tamanho apenas
em wo 5 e 20, sendo 8, 10 e 15 com 23 Å, e as modificações em relação ao branco não são
significativas, indicando pouca interferência da proteína nesse sistema (Tabela 4).
Possivelmente, esta proteína localiza-se no centro aquoso, uma vez que, nestes casos, o
aumento no tamanho em relação ao branco não costuma ultrapassar 10 %, podendo ainda não
ocorrer nenhuma alteração se a proteína tiver tamanho igual ao da micela (GUPTE,
NAGARAJAN e KILARA, 1995; GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED, 2006). Contudo
a sua participação ou interação na interface não pode ser totalmente excluída.
Já no caso da Lecitase, ocorre uma redução no tamanho destas micelas quando
comparados ao branco, excetuando-se wo 15. Tal fato pode indicar sua participação na
interface como descrito por Gupte, Nagarajan e Kilara (1995). Esta modificação estaria
relacionada à indução de forças atrativas mais fortes entre as gotículas, quando comparadas às
micelas sem proteína (PILENI et al., 1995).
Além disso, foi possível observar ainda a presença de duas populações em wo 20,
demonstrando um sistema dinâmico. Este sistema pode conter uma população com lipase e
outra sem lipase, como descrito anteriormente por Gochman-Hecht e Bianco-Peled (2006).
Tal fato explicaria alguns casos em que uma população possui raio significativamente menor
do que o observado na outra, sendo esta primeira a micela vazia, isto é, sem lipase, ou com
concentração menor de água. Estas duas populações ficam evidentes ao se observar a função
de autocorrelação obtida DLS (Figura 49).
78
Figura 49. Funções de autocorrelação, obtidas por DLS, observadas para as micelas contendo
Lecitase ultra (50 µg/mL) em diferentes valores de wo.
Como a técnica de DLS baseia-se na interação do laser com partículas coloidais que se
encontram em movimento, é possível calcular o Rh através do coeficiente de difusão
translacional, o movimento das gotículas na microemulsão. Este movimento promove
oscilação da intensidade de luz ao longo do tempo, fornecendo a função de autocorrelação que
está relacionada ao tamanho das partículas.
Nos casos de valores de wo 5 e 8 para a Lecitase ultra em microemulsão é observada a
polidispersividade da amostra com possíveis variações em tamanho das micelas reversas
(Figura 49). Tal fato poderia indicar a combinação de diversas gotículas sem proteína para
construir uma espaçosa o suficiente para acomodar a proteína, além disso, é provável ainda
que essas variações estejam relacionadas à constante redistribuição de moléculas de água e
surfactante causada por competição pela interface (GUPTE, NAGARAJAN e KILARA,
1995).
Este mesmo comportamento foi observado através da análise da função de
autocorrelação para a TLL em wo 8, com indicativo de duas populações em wo 5 e 10
(Apêndice C), demonstrado pela presença de dois tempos de relaxação, um em torno de 1 µs e
outro em torno de 1000µs. O mesmo não ocorreu para as micelas sem adição de enzima,
demonstrando que estas modificações são consequência da adição de proteína ao sistema.
As alterações nestes sistemas foram estudadas também através da aplicação de outras
técnicas, como EPR e SAXS. Na avaliação destes sistemas por SAXS, as micelas com
diferentes quantidades de água foram estudadas e seus dados de espalhamento de raios-X
79
transformados para a obtenção dos valores do raio de giro destes sistemas. Inicialmente,
foram obtidas as curvas de espalhamento para os sistemas com e sem solubilização de TLL e
Lecitase ultra (Figura 50).
Na figura 50, é possível observar o efeito da adição de água na estrutura das micelas
reversas através do aumento da intensidade em baixos valores de q, além disso a adição de
água ao sistema promoveu a mudança da curva para menores valores de q, visualizada entre
0,1 e 0,2 Å-1
. De acordo com Shrestha e colaboradores (2012), essas mudanças denotam
alterações tanto na dimensão total quanto transversal das micelas reversas.
Figura 50. Curva de espalhamento obtida por SAXS para as micelas reversas em diferentes
valores de wo com sistemas contendo tampão (A), TLL (B) e Lecitase ultra (C). A quantidade
de proteína nas micelas foi de 50 µg/mL.
80
Aparentemente, como observado na figura 50, em baixos valores de q(Å-1
), não há
indicativo de agregação nas micelas, mas estas alterações podem ser visualizadas mais
claramente através da regressão de Guinier (Figura 51). Como demonstrado nestes gráficos, é
possível que ocorra uma influência de interações inter-partículas repulsivas em micelas
reversas com wo de 20, devido a presença de uma interface carregada (AOT), fato que exerce
mais influência em sistemas mais concentrados (LUISI et al., 1988).
Figura 51. Regressão de Guinier das curvas de espalhamento de micelas reversas contendo
tampão (branco), TLL e Lecitase. A quantidade de proteína nas micelas foi de 50 µg/mL.
Embora o raio de giro possa ser determinado através da equação calculada pela
regressão linear do domínio de Guinier, resultados mais confiáveis, onde toda a curva de
espalhamento é analisada, são obtidos através do método de IFT (MERTENS e SVERGUN,
2010). Para tal, o programa GNOM (SVERGUN, 1992) foi utilizado e informações sobre raio
de giro (Rg) e forma das micelas foram obtidas.
Através da representação da estrutura no espaço real, com o gráfico de p(r) (Figura
81
52), foi possível avaliar os possíveis formatos das micelas. Todas elas mantiveram o mesmo
perfil, o qual indica três possíveis formatos: esférico, prolato e oblato.
Figura 52. Função p(r) para as micelas com tampão, TLL e Lecitase para valores de wo de 10
e 15, com distância máxima de 50 Å para o wo de 10 e 70 Å para wo de 15.
Apesar de os autores Gochman-Hecht e Bianco-Peled (2005 e 2006) descreverem as
micelas reversas como esferas cuja forma se altera para cilíndrica apenas em altas
concentrações de água (wo >70), em sistemas sem proteína (branco) ou com baixa quantidade
de proteína e altos valores de wo, as microemulsões contendo TLL e Lecitase ultra
apresentaram formato oblato ou prolato, em decorrência do padrão obtido de espalhamento
(Figura 50), como descrito por Mertens e Svergun (2010).
Ao normalizar os valores de p(r), dividindo pelo valor máximo obtido (p(r máx)),
figura 53, ficam claras as mudanças no raio das micelas, sem alteração do formato
(SHRESTHA et al., 2012). O comportamento foi similar para os sistemas tanto com proteína
quanto com tampão (Apêndice D).
82
Figura 53. Gráfico de p(r) normalizado para as micelas sem adição de proteína (branco).
Observando a figura 53 e comparando os valores de distância máxima (Dmáx)
utilizados no GNOM com a de raio de giro onde ocorre o valor máximo de p(r) normalizada
(Tabela 5) é possível identificar que este último não corresponde à metade da Dmáx (Dmáx/2),
fato que, segundo Mertens e Svergun (2010), indica a forma de esfera. Desta maneira, esta
condição reforça a afirmação de que as micelas apresentam-se no formato de uma elipse.
Tabela 5. Valores de Rg obtidos utilizando o GNOM e a distância máxima aplicada na IFT
wo
SAXS
Branco TLL Lecitase
Dmáx/2 r (Å)* Dmáx/2 r(Å)* Dmáx/2 r(Å)*
5
27,00 19,44 26,50 19,61 22,50 20,25
8
24,00 24,48 25,00 19,61 26,00 24,44
10
30,00 25,30 28,00 24,50 28,50 25,00
15
43,00 33,37 36,50 31,49 37,00 31,68
20
59,00 49,56 44,50 49,56 44,50 39,16
*Valor de r(Å) quando p(r)/p(rmáx) = 1
Para se obter mais informações em relação a localização das enzimas, os valores de
raios de giro obtidos foram tabelados (Tabela 6).
83
Tabela 6. Valores de Rg obtidos por SAXS para os sistemas em AOT/iso-octano 200 mM em
diferentes quantidades de água (wo) e a 25 °C.
wo
SAXS
Raio de giro (Å)
Branco* TLL Lecitase
5
16,2 ± 0,002 17,0 ± 0,001 16,1 ± 0,001
8
18,4 ± 0,001 18,3 ± 0,001 18,5 ± 0,001
10
19,3 ± 0,001 18,8 ± 0,001 18,8 ± 0,001
15
25,4 ± 0,002 24,3± 0,002 24,5± 0,001
20
38,7 ± 0,038 32,5 ± 0,007 31,1 ± 0,009
*micelas sem adição de proteína, apenas tampão (branco).
Os valores de raio de giro das micelas aumentam de acordo com a quantidade de água
adicionada ao sistema provavelmente em função do aumento da curvatura destes sistemas,
isto é, de micelas mais estendidas.
As diferenças entre as micelas com e sem proteína foram significativas apenas em wo
20, onde ocorre uma clara diminuição no raio hidrodinâmico com a adição de proteína. Em
alguns casos, essa redução pode ser relacionada à proteína ancorada no surfactante, através de
interações eletrostáticas, atuando então como o AOT e sendo considerada um aumento na
concentração do surfactante e por isso alterando a relação [H2O]/[AOT], reduzindo wo e o
tamanho da micela (GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED, 2006).
Entretanto, como visto anteriormente, através de análises de DLS, estes sistemas
podem ser multimodais, condição claramente observada nas micelas contendo Lecitase (wo 5,
8 e 20) e TLL (wo 5, 8 e 10). Este fato sugere que as alterações nos valores de Rg não estariam
relacionadas à localização da proteína.
Em sistemas onde o tamanho da micela é menor que o da enzima como em wo 5, 8 e,
possivelmente, 10 ocorre um equilíbrio entre as micelas com e sem proteína, podendo haver a
combinação de n gotículas sem proteína para compor uma com a enzima (PILENI et al.,
1995; GUPTE, NAGARAJAN e KILARA, 1995; GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED,
2006).
Além disso, Gochman-Hecht e Bianco-Peled (2006) demonstraram que o número de
micelas formadas no sistema não é constante, afirmando que na presença de proteína são
formadas mais micelas e, uma vez que não houve variação na concentração de AOT, estas
84
apresentam tamanhos menores. Portanto, em presença de proteína, a fração de micelas
menores é maior do que a em sua ausência (branco), porém esta condição estaria relacionada
a sistemas com valores maiores de wo (wo =20).
Em relação à forma das micelas reversas avaliadas é possível realizar uma relação
entre os raios obtidos: raio hidrodinâmico e raio de giro. Onde o primeiro (Rh), obtido por
DLS, representa os movimentos do centro de massa e inclui variações internas da densidade
de elementos de espalhamento, utilizando ambos os efeitos do solvente e forma, isto é uma
indicação do tamanho aparente da partícula em sua forma hidratada. O segundo (Rg),
calculado por SAXS, representa o segundo momento da distribuição da distância da partícula
em torno do centro (KOCH et al., 2003). A razão entre estes valores (ρ = Rg/Rh) pode
fornecer informações sobre a forma destes sistemas, se são esféricos ou mais alongados
(TANDE et al., 2001) (Tabela 7).
Tabela 7. Valores obtidos através da razão Rg/Rh (ρ)
wo
Rg/Rh (ρ)
Tampão* TLL Lecitase
5 0,95 1,00 1,15
8 0,88 0,80 1,03
10 0,88 0,82 0,94
15 1,10 1,06 1,07
20 1,49 1,30 1,41
De acordo com Burchard e Richtering (1989) e Tande e colaboradores (2001), valores
da razão Rg/Rh (ρ) em torno de 0,77 representam estruturas esféricas rígidas e homogêneas e
conforme esta razão aumenta significa que os sistemas tornam-se mais alongados, muito
parecido com o que ocorre com os polímeros.
Como observado na tabela 7, as micelas não apresentam forma esférica, nem mesmo
no caso dos sistemas sem adição de proteína em que a amostra é homogênea. A inserção da
TLL no sistema promoveu um sutil aumento na curvatura dos sistemas em relação à micela
apenas com tampão, com redução do valor ρ, condição esta que poderia estar relacionada à
presença de micelas também sem proteína ou ao fato de a lipase se apresentar de forma bem
compacta quando em monômero, como visto no item 4.2.2. (SAXS). Já no caso da Lecitase, é
possível que esta enzima possua uma estrutura mais alongada e por isso promova a formação
85
de micelas mais elípticas do que as com TLL ou apenas tampão.
Estes valores confirmam os resultados obtidos por SAXS, indicando a tendência à
forma elipsoide com redução da curvatura conforme se aumenta o wo. De e Maitra (1995)
citaram esta forma elipsoidal para micelas com baixa concentração de água afirmando que ao
aumentá-la essa assimetria se reduz. Contrariamente, Gochman-Hecht e Bianco-Peled (2005)
demonstraram que as micelas contendo AOT 100 mM com wo<70 apresentavam-se
majoritariamente na forma esférica com minoria cilíndrica, enquanto em altas concentrações
de água (wo ≥ 80) tornavam-se predominantemente mais alongadas. Entretanto, estudos
recentes envolvendo diferentes simulações computacionais, com sistemas AOT/iso-octano
(wo 6 e 10), indicam que as micelas reversas passam por flutuações conformacionais fugindo
da condição pré-estabelecida do formato esférico e estabelecendo-se como estruturas mais
alongadas como uma haste ou um disco (oblato), corroborando com os resultados obtidos
anteriormente de SAXS e DLS (MARTINEZ et al., 2013).
Para se obter mais informações sobre a estrutura e a localização destas proteínas nas
micelas reversas, assim como a influência que exercem sobre a forma das microemulsões, a
técnica de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) foi aplicada.
Através do uso de dois tipos de sondas, também chamadas marcadores de spin, a
técnica de EPR permitiu a avaliação de alterações no ambiente hidrofílico, sendo este o centro
contendo tampão, e na interface. No caso marcador de spin 5-DSA, que é uma molécula com
longa cadeia carbônica e anfifílica, quando solubilizado em sistemas micelares, encontra-se
preferencialmente localizado na interface, intercalado com as moléculas do surfactante
(AVRAMIOTIS et al., 2007). Desta forma, sua parte com o grupamento doxil pode mover-se
apenas em uma direção, entretanto este movimento é limitado pela rigidez e formato desta
membrana, que é a interface micelar. Este marcador pode ser ainda ligado covalentemente à
enzima, fato não realizado neste trabalho.
Já o marcador de spin 3-(4-nitrofenoxi carbonil)–proxil é uma sonda hidrofílica e
tende a ficar no coração da micela, onde se encontra a fase aquosa com a lipase. A função do
uso desta sonda é de observar se ocorrem modificações significativas na região hidrofílica
após adição de água e de lipase no sistema.
Em todos os casos avaliados, um espectro de três linhas (Figura 54 e apêndice E),
característico de nitróxidos, em função do acoplamento do elétron desemparelhado com o
núcleo do nitrogênio, foi obtido. As modificações no ambiente foram observadas através de
alterações destas linhas.
86
Campo magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
wo 10 Branco w0 10 TLL
Campo magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-3e+6
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
Figura 54. Espectro de EPR obtido com branco e TLL em micela reversa (w0 10) utilizando o
marcador de spin 5-DSA a 25 °C.
As modificações nos picos e vales permitem o cálculo dos parâmetros τR (ns), que
corresponde ao tempo de rotação do marcador de spin, e S referente à rigidez e estruturação
de membranas. Estes valores foram calculados para todos os sistemas de micelas reversas e,
no caso da sonda hidrofílica ((3-4-nitroxifenoxi carbonil)-proxil), como não há interação do
marcador com a interface, apenas o parâmetro τR (ns) pôde ser calculado (Tabela 8).
Tabela 8. Parâmetros calculados através dos dados obtidos por EPR usando o marcador
hidrofóbico 5-DSA e o marcador hidrofílico 3-(4-nitrofenoxi carbonil)–proxil.
5-DSA 3-(4-nitrofenoxi
carbonil)–proxil
wo τR (ns) S τR (ns)
Branco TLL Lecitase Branco TLL Lecitase Branco TLL Lecitase
5 1,19 1,17 1,14 0,17 0,17 0,17 0,82 0,82 0,96
8 4,33 4,11 4,28 0,23 0,23 0,23 0,67 0,70 0,72
10 1,74 1,64 1,64 0,17 0,17 0,17 0,62 0,65 0,64
15 3,21 2,86 2,97 0,20 0,20 0,20 0,53 0,49 0,54
20 n.d. n.d. n.d. 0,46 0,49 0,47 0,44 0,43 0,46
Avaliando a tabela 8, nos resultados obtidos com 5-DSA, é possível observar um
aumento nos valores referentes ao tempo de rotação da sonda com o aumento da quantidade
de água no sistema (wo de 5 a 15), com exceção de wo 8. Este comportamento, com
decréscimo na mobilidade do marcador de spin, reflete uma movimentação mais difícil da
87
sonda na interface causada, principalmente, pela redução da curvatura da camada de AOT,
ocasionada por maior quantidade de água. Esta curvatura relaciona-se à forma das micelas,
que tende a ficar mais alongada, como abordado anteriormente e reforçado pelos dados de
espalhamento de luz (SAXS e DLS). Em casos que os valores do τR excedem três
nanosegundos, as modificações são melhores descritas pelo fator S, caso observado em wo de
20 (PAPADIMITRIOU et al., 2008).
A adição de enzima ao sistema não alterou significativamente a mobilidade do
marcador, entretanto, foi possível observar reduções nos valores do τR quando comparado ao
observado na ausência de proteína, tal fato indica uma camada mais curvada e ordenada ou
apenas a consequência da presença de micelas sem a proteína (duas populações). Além disso,
deve-se destacar a possibilidade de uma enzima com estrutura mais compacta, caso da TLL,
fato que levaria a uma micela menos alongada e, portanto, com mais mobilidade para o 5-
DSA. Caso que se oporia ao da Lecitase, possivelmente mais alongada e maior que a lipase.
A presença de ambas as proteínas, contudo, não demonstrou interferir na rigidez e
ordem da membrana, como observado através da manutenção do parâmetro S entre o branco e
a micela com a enzima internalizada. Porém, a presença de água em maior quantidade sugere
a formação de uma membrana mais estruturada, fato identificado com aumento nos valores de
S, onde quanto mais próximo de 1, mais ordenado é o sistema.
As alterações observadas em wo 8 poderiam estar relacionadas ao isomerismo
rotacional do AOT, onde ocorre mudança de sua conformação gauche para trans, que se inicia
nesta concentração de água adicionada ao sistema (DE e MAITRA, 1998). Desta forma, a
mobilidade do marcador de spin na membrana ficaria comprometida.
Entretanto, pelo fato de o marcador não estar ligado covalentemente à enzima, estas
conclusões são gerais e não permitem uma avaliação e um estudo mais detalhado da
localização da proteína. Além disso, a proximidade das lipases com a interface poderia
proporcionar uma ligação da sonda 5-DSA ao sítio ativo, uma vez que sua estrutura química
corresponde a um substrato natural destas enzimas. Esta condição, também explicaria o
decréscimo significativo da mobilidade do marcador em micelas com wo de 8.
Quando a sonda utilizada corresponde a uma molécula hidrofílica, localizada no centro
aquoso da micela, espera-se que o tempo de rotação se reduza, uma vez que este marcador de
spin terá sua movimentação mais livre, fato claramente observado na tabela 8 para todos os
sistemas. Porém, ao comparar as micelas com tampão (branco) com as com proteína, há uma
redução na mobilidade da sonda, principalmente em valores de wo inferiores a 15. Este fato
88
indica que a proteína, tanto a TLL quanto a Lecitase, tende a ficar no centro aquoso, até
mesmo porque não foi observada nenhuma interferência desta na membrana (parâmetro S,
para 5-DSA). Contudo, com a adição de água ao sistema ocorre uma redução na interferência
destas proteínas na mobilidade do marcador de spin (Tabela 8) devido ao aumento da água
livre no centro aquoso.
Apesar de todos os dados avaliados indicarem que nenhuma das enzimas utilizadas
tem participação direta na interface, ou seja, estas não se comportam como surfactantes, tal
fato não determina que estas não interajam com as moléculas de AOT. É importante ressaltar
que o AOT, por se tratar de um surfactante iônico, pode promover modificações na estrutura
proteica através de interações com resíduos de aminoácidos carregados.
De um modo geral, na presença de uma superfície óleo/água, as lipases tendem a
formar um filme para cobrir toda a interface, condição que pode proporcionar
desenovelamento parcial ou a formação de interações intermoleculares (REIS et al., 2008).
Esta condição pode ocorrer dentro dos sistemas de micelas reversas. Desta forma a enzima
pode realizar interações hidrofóbicas ou eletrostáticas com o surfactante, situação em que
ocorre modificação conformacional que pode comprometer a atividade enzimática
(GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED, 2006).
De modo a avaliar estas alterações, no caso, na estrutura terciária, foram realizadas
análises de fluorescência nas enzimas livres (em tampão) e em micelas reversas, em diferentes
concentrações de água (Figura 55).
Figura 55. Gráfico de fluorescência da lipase de Thermomyces lanuginosus em tampão
TrisHCl 0,2 M, pH 7,5 (linha em preto) e em micela reversa com distintos valores de wo. As
medidas foram realizadas a 25 °C com excitação a 280 nm com fendas de emissão 10 nm e
excitação de 5 nm. A solução de AOT 0,2 M com tampão não apresentou fluorescência (não
mostrado).
89
Para ambas as enzimas, foi possível observar alterações na estrutura terciária indicado
pelo desvio nos espectros de emissão de fluorescência para menores comprimentos de onda.
Este fato indica que não ocorreu desenovelamento proteico, mas sim uma possível
internalização de resíduos de triptofano antes parcialmente expostos ao meio (Figuras 55 e
56).
O desenovelamento destas enzimas foi observado anteriormente através da incubação
em diferentes concentrações de GdnHCl, tanto por fluorescência quanto por dicroísmo
circular (Figuras 29, 30, 42 e 43). Quando se trata da estrutura terciária, fica claro o
deslocamento do centro de massa espectral para comprimentos de ondas maiores, sugerindo a
exposição dos resíduos de triptofano. Desta forma, a adição destas proteínas em micelas
reversas não leva ao seu desenovelamento, fato observado com outras proteínas como
lisozima e cutinases (MELO et al., 2000; GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED, 2006).
Observando a figura 55, para a TLL, fica claro um deslocamento para a região do azul
(menores comprimentos de onda) quando a lipase está inserida nas micelas reversas. Esta
condição indica que os resíduos de triptofano, principalmente o Trp 89, encontram-se mais
internalizados, mais protegidos do solvente. Porém, quando em micelas reversas,
principalmente em wo 5 e 8, há uma redução na intensidade de fluorescência, possivelmente
como consequência das interações da proteína com a interface, AOT
A intensidade aumenta com a adição de água o que poderia indicar um certo
afastamento da interface e modificação nas interações com esta e, provavelmente, wo a partir
de 10 seria mais adequado para a TLL e sua manutenção no centro aquoso.
Para a Lecitase ultra (Figura 56), o comportamento foi oposto ao da TLL (Figura 55)
quando relacionado à intensidade de fluorescência. Um claro aumento de intensidade de
fluorescência foi observado de acordo com a redução da quantidade de água (wo) na micela
reversa.
90
Figura 56. Gráfico de fluorescência da Lecitase ultra em tampão TrisHCl 0,2 M, pH 7,5
(linha em preto) e em micela reversa com distintos valores de wo. As medidas foram
realizadas à 25 °C com excitação à 280 nm com fendas de emissão 10 nm e excitação de 5
nm. A solução de AOT 0,2 M com tampão não apresentou fluorescência.
Essa condição indica uma possível interferência nas interações intra-moleculares
quando a enzima está mais próxima da interface. Uma modificação estrutural causada pelo
AOT reduziria interações dos resíduos de triptofano com outros aminoácidos, onde estes
poderiam interagir com o surfactante em detrimento do triptofano. Como visto anteriormente,
através da supressão da fluorescência por acrilamida (item 4.3.3.) os resíduos de Trp da
Lecitase ultra são mais internalizados do que os da TLL.
Contudo, o deslocamento do espectro para regiões de comprimento de onda menores
foi um comportamento comum para ambas as enzimas estudadas. Além disso, com adição de
água aos sistemas, com aumento do wo, promoveu um ligeiro deslocamento para a região do
vermelho (Figura 57), ou seja, para maiores comprimentos de onda. Entretanto, esta
modificação não foi significativa, principalmente para a TLL, mas poderia indicar uma
tendência da enzima a retornar à sua condição observada apenas em tampão quando o sistema
apresenta maior quantidade de água.
91
Figura 57. Centro de massa espectral para a TLL (azul) e Lecitase ultra (branco) em
diferentes ambientes (aquoso e em micelas reversas com diferentes wo). Os valores
representam a média ± erro padrão de experimentos em triplicata (n = 3).
Sabendo das modificações na estrutura terciária que ocorrem para as lipases em
micelas reversas, a atividade destas enzimas foi monitorada para avaliar sua viabilidade e
quais seriam os melhores valores de w0 para cada lipase na esterificação entre ácido oleico e
etanol. A temperatura de 40 °C foi selecionada para garantir que não ocorra inativação e
desenovelamento das proteínas e por ser a temperatura ótima de atividade lipásica para a
Lecitase ultra.
Para a lipase de Thermomyces lanuginosus os melhores resultados foram obtido em
valores de w0 de 10 e 15, com 33 % de conversão em 2h e 43 % em 3h, respectivamente
(Figura 58). Como descrito por Cabral e Carvalho (2000) e Moniruzzaman e colaboradores
(2006), o valor ótimo de atividade está relacionado com a situação em que a micela contendo
tampão apenas apresente tamanho similar ao da enzima que será adicionada ao sistema, uma
vez que tamanhos menores poderiam expor a enzima ao solvente e levar à sua desnaturação
ou desenovelamento. Portanto, os resultados obtidos são consistentes já que estes dois
sistemas (w0 10 e 15) possuem o tamanho mais próximo do da TLL.
92
Figura 58. Gráfico representando a concentração de éster formado em função do tempo para
as micelas AOT/iso-octano 0,2 M com diferentes w0 contendo TLL (50 µg/mL). As curvas
forma obtidas através de uma regressão polinomial de terceira ordem.
Como demonstrado anteriormente, o raio de giro calculado por SAXS para as micelas
contendo tampão em w0 10 e 15 corresponde a 19,3 e 25,4 Å, respectivamente, enquanto para
a TLL monômero, este valor foi de 19 Å. Estes sistemas são, então, compatíveis com o
tamanho da lipase.
No caso do raio hidrodinâmico, alguns outros fatores devem ser considerados como a
camada de solvatação na enzima livre e a presença de sua forma dimérica. Estes contribuem
para o Rh, proporcionando um tamanho médio que junta as duas condições. Neste caso, o raio
hidrodinâmico para as micelas w0 10 e 15 foi de 22 e 23 Å, respectivamente, enquanto para a
TLL em tampão foi de 34 ± 5 Å.
Sistemas contendo maiores quantidades de água, entretanto, permitiriam uma elevada
concentração de água livre e possibilitaria maior mobilidade e, consequentemente, maior
vulnerabilidade estrutural, facilitando processos de desnaturação, principalmente por aumento
de temperatura. Além disso, maiores quantidades de água reduzem a microviscosidade do
centro aquoso, o que permite flutuações da estrutura no meio dificultando a orientação do sítio
ativo na interface para ter contato com os substratos (MONIRUZZAMAN et al., 2006).
Nos ensaios de atividade para a Lecitase, a conversão para w0 de 5 atinge de 36 % (18
mM) em 3 h, porém é logo seguida pela hidrólise do éster. Já para w0 de 20 houve conversão
93
de 11 % (5,5 mM) apenas nos primeiros 30 min com hidrólise a partir de então. Apesar de não
apresentar um resultado de esterificação insatisfatório, as micelas com w0 de 5 logo passam ao
processo de hidrólise, o que torna seu uso bem restrito. Desta forma, os melhores resultados
foram observados para w0 de 8, 10 e 15 dentro do período observado em minutos (Figura 59).
Figura 59. Gráfico representando a concentração de éster formado em função do tempo para
as micelas AOT/iso-octano 0,2 M com diferentes w0 contendo Lecitase ultra (50 µg/mL). As
curvas forma obtidas através de uma regressão polinomial de terceira ordem.
Para w0 de 10 e 15 os resultados foram melhores com conversões 55 % em 2 h e 45,3
% em 3 horas, respectivamente. Demonstrando mais uma vez a compatibilidade entre o
tamanho da micela com o da enzima, uma vez que a Lecitase ultra é muito similar a TLL,
sendo um pouco maior com o seu raio hidrodinâmico entre 30 e 40 Å. Além disso, de acordo
com os dados de DLS (Figura 49), nestas condições foi encontrada apenas uma população,
sendo uma amostra monodispersa, com possível completa inserção da enzima no sistema.
Para comparar as enzimas nestes sistemas, foi realizada uma análise para calcular a
velocidade inicial das reações cuja importância está no fato de desconsiderar a influência de
outros fatores, sendo apenas a concentração do substrato relevante. Para tal, através da curva
concentração de éster formado em função do tempo (Figuras 58 e 59) foi estabelecida uma
regressão polinomial de terceira ordem, que descreve a cinética das lipases. Sabendo que a
velocidade inicial corresponde à tangente da curva, este valor foi facilmente obtido através da
equação de regressão. Os coeficientes de correlação foram todos acima de 0,98. Os valores de
velocidade inicial podem ser observados abaixo (Tabela 9).
94
Tabela 9. Valores de velocidade inicial de reação para TLL e Lecitase em micelas reversas
w0
Velocidade inicial
(µmol/min)
TLL Lecitase
5 0,2726 -
8 0,3391 0,1967
10 0,4348 0,1035
15 0,2753 0,2417
20 0,2609 -
*reação ácido oleico 50mM e etanol (1:2) a 40 °C
É possível observar uma reação mais rápida para a TLL em todos os valores de w0
quando comparada à Lecitase (Tabela 9), fato que indica uma maior afinidade desta lipase
pelos substratos utilizados. Para a TLL, a reação ocorre mais rapidamente em w0 10 enquanto
para a Lecitase em w0 de 15, corroborando as afirmações anteriores em relação ao tamanho
das lipases e do sistema.
A esterificação estudada consistiu apenas na condição de monitorar a atividade destas
enzimas e no grau de comprometimento que a mudança no sistema ocasionaria, inativando ou
não as enzimas. O uso de outros substratos, assim como mudanças nas condições reacionais
como temperatura ou agitação podem promover resultados diferentes até mesmo com
conversões melhores, uma vez que as lipases encontram-se ativas.
A Lecitase ultra imobilizada, por exemplo, apresentou bons resultados de esterificação
com outros substratos como observado por Gonçalves e colaboradores (2013) na esterificação
de 1,2-O-isopropilideno glicerol com resíduos de ácidos graxos obtidos do refino de óleo de
palma. Desta forma, o uso de outras reações poderia ser aplicado a estes sistemas.
Para as micelas reversas é observada ainda a influência da temperatura nos sistemas,
uma vez que apresenta uma forte influência nos mecanismos de transferência de massa.
Alguns autores já relataram (DE e MAITRA, 1995; LUISI et al., 1988; MOULIK et al., 1998;
GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED, 2005) a dependência da temperatura de forças
atrativas, onde estas aumentam com a temperatura, resultando em colisões mais duradouras,
fenômeno conhecido como percolação. Nestes casos, acredita-se que ocorra a formação de
estruturas cilíndricas inter-conectadas em decorrência da agregação de gotículas
(GOCHMAN-HECHT e BIANCO-PELED, 2005).
95
Com o intuito de investigar esse fenômeno, foi realizado um acompanhamento do
tamanho das micelas reversas contendo as enzimas estudadas em diferentes temperaturas para
os diferentes valores de w0 (Figura 60).
Figura 60. Variações observadas no raio hidrodinâmico das micelas reversas contendo TLL
(A) e Lecitase ultra (B) em função da temperatura para diferentes valores de wo.
De acordo com a figura 60, tanto para as micelas com Lecitase (B) quanto para a TLL
(A), o fenômeno é claramente observado com o aumento da temperatura. Esta conexão entre
as gotículas formando micelas maiores em geral é descrita como consequência de forças de
Van der Waals (GUPTE, NAGARAJAN e KILARA, 1995). A percolação pode ainda ser
induzida com adição de água ao sistema contendo uma quantidade fixa de proteína.
A influência da temperatura para que ocorra a percolação também está diretamente
relacionada com sua ação sobre o AOT. Neste caso, o aumento da temperatura faz com que
96
este tenha menos afinidade pela fase contínua, a fase oleosa, sendo praticamente transferido
para a fase aquosa. Isto significa que devido à desidratação da cabeça polar do surfactante, há
indução da formação cilíndrica, e o aumento da temperatura também eleva a interpenetração
de moléculas orgânicas na região lipofílica do AOT (LUISI et al., 1988; SHRESTHA et al.,
2012).
Este fenômeno tem extrema importância na biocatálise que envolve o uso de micelas
reversas, pois tem papel importante na transferência de massa, essencial para que as reações
ocorram. Portanto, em algumas reações, aumentar a temperatura pode ser uma alternativa às
baixas conversões, contudo sempre levando em consideração a estabilidade térmica das
enzimas e o efeito dos surfactantes em sua estrutura.
Além disso, o fenômeno da percolação é uma opção para a separação dos produtos,
uma vez que pode ser induzido até a separação de fases, seja por temperatura ou adição de
água (GUPTE, NAGARAJAN e KILARA, 1995).
97
5. CONCLUSÕES ___________________________________________________________________________
A lipase de Thermomyces lanuginosus mostrou-se resistente à desnaturação térmica e
foi capaz de retornar à sua estrutura secundária nativa após resfriamento. Para esta lipase,
dímeros e monômeros coexistem em solução aquosa e a relação entre eles pode variar de
acordo com a concentração. Os dímeros, de 50 kDa, são resistentes à SDS e apresentaram raio
de giro calculado por SAXS de 28,2 Å enquanto os monômeros possuem raio de giro de 19,0
Å.
A Lecitase ultra, uma mutante da TLL, apresenta um único sítio ativo que tem
atividade lipásica ótima à 40 °C com possível mudança para fosfolipásica acima de 50 °C,
perde pouca estrutura secundária a 55 °C, mas não é capaz de retornar à sua estrutura nativa
após resfriamento. SDS-PAGE sugere a presença de isoformas e a co-existência da forma
dimérica com a monomérica, assim como observado para a lipase de Thermomyces
lanuginosus.
Quando inseridas em micelas reversas, as enzimas apresentaram espectro de
fluorescência deslocado para a região do azul quando comparado ao obtido apenas em
tampão, indicando mudanças conformacionais em sua estrutura terciária. Apesar disso,
estudos com EPR indicam que elas não participam da interface, estando localizadas no centro
aquoso.
Os raios de giro calculados por SAXS para estes sistemas ficaram entre 16 e 38 Å e
quando comparados aos obtidos por DLS, raio hidrodinâmico, indicaram que as
microemulsões apresentam formas mais alongadas, como uma elipse, dado reforçado pelos
gráficos da função p(r).
Os sistemas que apresentaram melhor atividade de esterificação e maior velocidade
inicial para a reação com substratos ácido oleico e etanol foram aqueles cujo raio de giro era o
mais próximo do tamanho da enzima (Rg). Para a TLL os wo de 10 e 15 apresentaram as
melhores conversões, 33 % de conversão em 2 h e 43 % em 3 h, respectivamente, enquanto
wo de 10 teve maior velocidade inicial, 0,4348 M-1
. Sendo que este último sistema possui raio
de giro de 19,3 Å, similar ao da TLL monômero. Já para a Lecitase ultra, wo de 10 e 15
também foram os que demonstraram maior conversão, com 55 % em 2 h e 45,3 % em 3 h,
respectivamente. Porém, a velocidade inicial foi muito inferior a da TLL, sugerindo menos
afinidade por estes substratos.
Além disso, para as micelas reversas AOT/iso-octano, é possível identificar alterações
no raio hidrodinâmico destes sistemas com o aumento da temperatura. Este fenômeno
98
conhecido como percolação pode promover melhorias na transferência de massa entre estes
sistemas e consequentemente aumentar as conversões.
Portanto, demonstrando que as enzimas TLL ou Lecitase ultra não perderam atividade
após incorporação nas micelas, mesmo com as mudanças conformacionais observadas, estes
sistemas são viáveis e podem ser aplicados em outras reações de esterificação e, quando
imobilizados em gel, proporcionar resultados muito significativos com boas conversões e alta
produtividade, além de possibilitar o reciclo do sistema (ZOUMPANIOTI et al., 2006b;
ITABAIANA et al., 2013).
99
6. REFERÊNCIAS ___________________________________________________________________________
ABUIN, E., LISSI, E., E DUARTE, R. Kinetics of N-glutaryl-L-phenylalanine p-nitroanilide
hydrolysis catalyzed by a -chymotrypsin in aqueous solutions of
dodecyltrimethylammonium bromide. Journal of Colloid and Interface Science, 283,
2005, p. 539-543
ACHARYA, D. P., HARTLEY, P. G. Progress in microemulsion characterization. Current
Opinion in Colloid & Interface Science, v. 17, issue 5, 2012, p. 274-280.
ARIMA, N., INOUE, A., MAKIDE, K., NONAKA, T., AOKI, J. Surface loops of
extracellular phospholipase A1 determine both substrate specificity and preference for
lysophospholipids. Journal of Lipid Research Volume 53, 2012, p. 513-521
AVRAMIOTIS, S., BEKIARI, V., LIANOS, P., XENAKIS, A. Structural and Dynamic
Properties of Lecithin–Alcohol Based w/o Microemulsions: A Luminescence Quenching
Study. Journal of Colloid and Interface Science 194, 1997, p. 326–331
AVRAMIOTIS, S., CAZIANIS, C. T., XENAKIS, A. Interfacial Properties of Lecithin
Microemulsions in the Presence of Lipase. A Membrane Spin-Probe Study. Langmuir15,
1999, p. 2375-2379
AVRAMIOTIS, S., PAPADIMITRIOU, V., CAZIANIS, C. T., XENAKIS, A. EPR studies
of proteolytic enzymes in microemulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochemical
and Engineering Aspects 144, 1998, p. 295–304
AVRAMIOTIS, S., PAPADIMITRIOU, V., HATZARA, E., BEKIARI, V., LIANOS, P.,
XENAKIS, A. Lecithin Organogels Used as Bioactive Compounds Carriers. A
Microdomain Properties Investigation. Langmuir, 23, 2007, p. 4438-4447
AVRAMIOTIS, S., STAMATIS, H., KOLISIS, F. N., LIANOS, P., XENAKIS, A. Structural
studies of lecithin- and AOT-based water-in-oil microemulsions, in the presence of
lipase. Langmuir, 12 (26), 1996, p. 6320-6325.
BARBOSA, L.R.S., ORTORE, M.G., SPINOZZI, F., MARIANI, P., BERNSTORFF, S.,
ITRI, R. The importance of protein-protein interactions on the pH-induced
conformational changes of Bovine Serum Albumin: a Small Angle X-Ray Scattering
Study, Biophysical Journal 98, 2010, p.147-157.
BARBOSA, L.R.S., SPINOZZI, F., MARIANI, P., ITRI, R. Small-Angle X-Ray Scattering
Applied to Proteins in Solution, In: Proteins in Solution and at Interfaces: Methods and
Applications in Biotechnology and Materials Science, Wiley, 2013, p. 49 - 72.
BOEL, E., CHRISTENSEN, T., WOLDIKE, H.F., HUGE-JENSEN, I.B., 1998. US PATENT
5,766,912, Humicola lipase produced in Aspergillus
BOJSEN K, SVENDSEN A, FUGLSANG C.C., PATKAR S., BORCH K., VIND J., PETRI
A.G., GLAD S.S., BUDOLFSEN G., SCHRODER G.S.O. (2000) Producing a lipolytic
enzyme variant useful in baking processes and purification of vegetables oils, comprises
altering the parent lipolytic enzyme, preparing a variant and testing its activity on
100
selected ester bond. Novozymes A/S, Denmark. PCT International Patent Application
WO2000/32758
BOM, A.P., FREITAS, M.S., MOREIRA, F.S., FERRAZ, D., SANCHES, D., GOMES,
A.M., VALENTE A.P., CORDEIRO Y., SILVA, J.L. The p53 core domain is a molten
globule at low pH: functional implications of a partially unfolded structure. Journal of
Biological Chemistry 285 (4), 2010, p. 2857-2866
BON, E.P.S., FERRARA, M.A. E CORVO, M.L. Enzimas em Biotecnologia, produção,
aplicações e mercado, Editora Interciência Ltda, capitulo 16, Lipases em Biocatálise,
2008, p. 369-383
BORNÉ, J., NYLANDER, T., KHAN, A. Effect of lipase on monoolein-based cubic phase
dispersion (cubosomes) and vesicles. Journal of Physical Chemistry B, 106 (40), 2002,
p.10492-10500.
BORNSCHEUER, U.T., KAZLAUSKAS, R.J., Hydrolases in Organic Synthesis: Regio- and
Stereoselective Biotransformations, 2nd edition, Wiley-VCH: Weinheim, 2005.
BRZOZOWSKI, M., SAVAGE, H., VERMA, C.S., TURKENBURG, J.P., LAWSON, D.M.,
SVENDSEN, A., PATKAR, S. Structural Origins of the Interfacial Activation in
Thermomyces (Humicola) lanuginosa Lipase, Biochemistry 39, 2000, p. 15071-15082.
BURCHARD, W., RICHTERING, W. Dynamic light scattering from polymer solutions.
Progress in Colloid & Polymer Science 80, 1989, p. 151-163
CARVALHO, C.M.L., CABRAL, J.M.S. Reverse micelles as reaction media for lipases.
Biochimie 82, 2000, p. 1063−1085
CARVALHO, J.W.P., SANTIAGO, P.S., BATISTA, T., SALMON, C.E.G., BARBOSA,
L.R.S., ITRI, R., TABAK, M. On the temperature stability of extracellular hemoglobin
of Glossoscolex paulistus at different oxidation states: SAXS and DLS
studies, Biophysical Chemistry 163-164, 2012, p. 44-55
CHEN, C. W., & OU-YANG, C. C. Bounded water kinetic model of beta-galactosidase in
reverse micelles. Bioprocess and Biosystems Engineering, 26 (5), 2004, p. 307-313.
CHEN, C. W., & YEH, C. W. Kinetic model for enzymatic hydrolysis in reverse micelles.
Biotechnology Letters, 20 (1), 1998, p. 49-52.
CHRISTENSEN, H., PAIN, R.H. Molten globule intermediates and protein folding. European
Biophysics Journal 19, 1991, p. 221-229.
COSTA, V. E. U., DE AMORIM H.L.N. O emprego de lipases como agentes de resolução
cinética de enantiômeros em síntese orgânica: aspectos gerais sobre a influência do
solvente. Química Nova, vol.22, n.6, 1999, p. 863-873
DAMASCENO, B.P.G.L.; SILVA, J.A., OLIVEIRA, E.E.; SILVEIRA, W.L.L.; ARAÚJO,
I.B.; OLIVEIRA, A.G.; EGITO, E.S.T. Microemulsão: um promissor carreador para
moléculas insolúveis. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada 32 (1), 2011,
p. 9-18.
101
DE MARIA, L., VIND, J., OXENBOLL, K. M., SVENDSEN, A., PATKAR, S.
Phospholipases and their industrial applications, Applied Microbiology and
Biotechnology 74, 2007, p. 290–300
DE SOUZA, R.O.M.A., MATOS, L.M.C., GONÇALVES, K.M., COSTA, I.C.R., BABICZ
I., LEITE, S.G.F., OESTREICHER, E.G. E ANTUNES, O.A.C. Michael additions of
primary and secondary amines to acrylonitrile catalyzed by lipases, Tetrahedron Letters
50 (17), 2009, p. 2017-2018
DE, T. K., MAITRA, A. Solution behaviour of Aerosol OT in non-polar solvents. Advances
in Colloid and Interface Science 59, 1995, p. 95-193
DONG, Y.-D., BOYD, B. J. Applications of X-ray scattering in pharmaceutical Science.
International Journal of Pharmaceutics 417, 2011, p. 101– 111
FANO, M., DE WEERT, M. V., MOELLER, E. H., KRUSE, N. A., FROKJAER, S. Ionic
strength-dependent denaturation of Thermomyces lanuginosus lipase induced by SDS.
Archives of Biochemistry and Biophysics 506, 2011, p. 92–98
FEIGIN, L.A, SVERGUN, D.I. Structure Analysis by Small-Angle X-Ray and Neutron
Scattering, Plenum Press, Springer, 1987
FERNANDES, M.L.M., KRIEGER, N., BARON, A.M., ZAMORA, P.P., RAMOS, L.P.,
MITCHELL, D.A. Hydrolysis and synthesis reactions catalysed by Thermomyces
lanuginosa lipase in the AOT/Isooctane reversed micellar system. Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic 30, 2004, p. 43–49
FERNANDEZ-LAFUENTE, R. Lipase from Thermomyces lanuginosus: Uses and prospects
as an industrial biocatalyst. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 62, 2010, p.
197–212
FERNANDEZ-LORENTE, G., FILICE, M., TERRENI, M., GUISAN, J. M., FERNANDEZ-
LAFUENTE, R., PALOMO, J. M. Lecitase® ultra as regioselective biocatalyst in the
hydrolysis of fully protected carbohydrates Strong modulation by using different
immobilization protocols, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51, 2008, p. 110–
117
FERNANDEZ-LORENTE, G., GUISAN, J. M., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., PALOMO,
J. M. Effect of the immobilization protocol in the activity, stability, and enantioselectivity
of Lecitase® ultra, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 47, 2007, p. 99-104
FERNANDEZ-LORENTE, G, PALOMO, J. M., FUENTES, M., MATEO, C., GUISAN, J.
M., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., Self-Assembly of Pseudomonas fluorescens Lipase
Into Bimolecular Aggregates Dramatically Affects Functional Properties. Biotechnology
and Bioengineering 82, 2003, p. 232-237
FONSECA, L.C., CORRÊA, N.C.R., GARROTE-FILHO, M. DA S., DA CUNHA, C.C. E
PENHA-SILVA, N. Efeito da composição do solvente sobre a estabilidade de proteínas
em soluções aquosas. Química Nova, 29 (3), 2006, p. 543-548
FRAGOSO, A., PACHECO, R., KARMALI, A. Investigation of structural effects and
behaviour of Pseudomonas aeruginosa amidase encapsulated in reversed micelles.
102
Process Biochemistry 47, 2012, p. 264–272
FRANKE, D. AND SVERGUN, D.I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape
determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography 42, 2009, p.
342-346
GAIKAIWARI, R.P., WAGH, S.A., KULKARNI, B. D. Efficient lipase purification using
reverse micellar extraction. Bioresource Technology 108, 2012, p. 224–230
GLATTER, O., KRATKY, O. Small Angle X-ray Scattering, Academic Press, New York
119, 1982
GOCHMAN-HECHT, H., BIANCO-PELED, H. Structure modifications of AOT reverse
micelles due to protein incorporation. Journal of Colloid and Interface Science 297, 2006,
p. 276–283
GOCHMAN-HECHT, H., BIANCO-PELED, H. Structure of AOT reverse micelles under
shear. Journal of Colloid and Interface Science 288, 2005, p. 230–23
GONÇALVES, K.M. , SUTILI, F. K., JÚNIOR, I.I., FLORES, M.C., E MIRANDA, L. S.
DE M., LEAL, I. C. R., CORDEIRO, Y., LUQUE, R., DE SOUZA, R. O. M. A. A
Comprehensive Study on the Activity and Deactivation of Immobilized Lecitase Ultra in
Esterifications of Food Waste Streams to Monoacylglycerols. ChemSusChem 6, 2013, p.
872 – 879
GONZÁLEZ, P. M., AGUIAR, M. B., MALANGA, G., PUNTARULO, S. Electronic
paramagnetic resonance (EPR) for the study of ascorbyl radical and lipid radicals in
marine organisms. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 165, 2013, p. 439–
447
GUAN, Z., FU, J.-P., HE, Y.-H. Biocatalytic promiscuity: lipase-catalyzed asymmetric aldol
reaction of heterocyclic ketones with aldehydes. Tetrahedron Letters 53, 2012, p. 4959–
4961
GUPTA, S., BHATTACHARYA, A., MURTHY, C.N. Tune to immobilize lipases on
polymer membranes: Techniques, factors and prospects. Biocatalysis and Agricultural
Biotechnology 2, 2013, p. 171–190
GUPTE, A., NAGARAJAN, R., KILARA, A. Enzyme reactions in reverse micelles. Food
Flavors: Generation, Analysis and Process Influence, Charalambous, G., (Ed.),
Elsevier, Amsterdam. 1995, p.1-74
HAWE, A., SUTTER, M., JISKOOT, W. Extrinsic Fluorescent Dyes as Tools for Protein
Characterization, Pharmaceutical Research 25, 2008, p. 1487–1499.
INVERNIZZI, G.; CASIRAGHI, L.; GRANDORI, R.; LOTTI, M. Deactivation and
unfolding are uncoupled in a bacterial lipase exposed to heat, low pH and organic
solvents. Journal of Biotechnology, 141, 2009, p. 42-46
ITABAIANA, I.; GONÇALVES, K.M.; CORDEIRO, Y.; ZOUMPANIOTI, M.; LEAL,
I.C.R.; MIRANDA, L.S.M.; DE SOUZA, R.O.M.A.; XENAKIS, A. . Kinetics and
mechanism of lipase catalyzed monoacylglycerols synthesis. Journal of Molecular
103
Catalysis B, Enzymatic 96, p. 34-39, 2013
ITRI, R., CAETANO, W., BARBOSA, L. R. S., BAPTISTA, M. S. Effect of Urea on Bovine
Serum Albumin in Aqueous and Reverse Micelle Environments Investigated by Small
Angle X-Ray Scattering, Fluorescence and Circular Dichroism. Brazilian Journal of
Physics 34, no. 1, 2004, p. 58-63
JAEGER, K.-E., DIJKSTRA, B. W., REETZ, M. T. Bacterial Biocatalysts: Molecular
Biology, Three-Dimensional Structures, and Biotechnological Applications of Lipases.
Annual Review of Microbiology 53, 1999, p. 315–351
JEGANNATHAN, K.R., NIELSEN, P.H. Environmental assessment of enzyme use in
industrial production - a literature review. Journal of Cleaner Production 42, 2013, p.
228-240
JESCHKE, G. Conformational dynamics and distribution of nitroxide spin labels. Progress in
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 72, 2013, p. 42–60
JUTILA, A., ZHU, K., TUOMINEN, E.K.J., KINNUNEN, P.K.J., Fluorescence
spectroscopic characterization of Humicola lanuginosa lipase dissolved in its substrate,
Biochimica and Biophysica Acta 1702, 2004, p. 181-189
KAMERZELL, T. J., ESFANDIARY, R., JOSHI, S. B., MIDDAUGH, C. R., VOLKIN, D.
B. Protein–excipient interactions: Mechanisms and biophysical characterization applied
to protein formulation development. Advanced Drug Delivery Reviews 63, 2011, p.
1118–1159
KAPOOR, M., GUPTA, M.N. Lipase promiscuity and its biochemical applications. Process
Biochemistry 47, 2012, p. 555–569
KEIZERS, P.H.J., UBBINK, M. Paramagnetic tagging for protein structure and dynamics
analysis. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 58, 2011, p. 88–96
KLIBANOV, A. M. Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature 409, 2001,
p. 241-246
KLYACHKO, N. L. E LEVASHOV, A. V., Bioorganic synthesis in reverse micelles and
related systems.” Current Opinion in Colloid and Interface Science 8, 2003, p. 179–186
KOEHLER, J., MEILER, J. Expanding the utility of NMR restraints with paramagnetic
compounds: Background and practical aspects / Progress in Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy 59, 2011, p. 360–389
KOMMAREDDI, N. S., JOHN, V. T., WAGUESPACK, Y. Y., MCPHERSON, G. L.
Temperature and Gas Pressure Induced Microstructural Changes in AOT Water-in-Oil
Microemulsions: Characterization through Electron Paramagnetic Resonance
Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry 97, 1993, p. 5752-5761
KONAREV, P. V., PETOUKHOV, M. V., VOLKOV, V. V., SVERGUN, D. I. ATSAS 2.1, a
program package for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied
Crystalography 39, 2006, p. 277–286
104
KOZIN, M., SVERGUN, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural
models. Journal of Applied Crystallography 34, 2001, p. 33-41
KRISHNA, S. H., KARANTH, N. G. Lipases and lipase-catalyzed esterification reactions in
nonaqueous media. Catalysis Reviews 44 (4), 2002, p. 499–591
LAI, Z., WU, P. Investigation on the conformations of AOT in water-in-oil microemulsions
using 2D-ATR-FTIR correlation spectroscopy. Journal of Molecular Structure 883–884,
2008, p. 236–241
LAKOWICZ, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd edition, Springer, New
York, 2007
LIU, N., FU, M., WANG, Y., ZHAO, Q., SUN, W. E ZHAO, M. Immobilization of
Lecitase® Ultra onto a Novel Polystyrene DA-201 Resin: Characterization and
Biochemical Properties. Applied Biochemistry and Biotechnology 168, 2012, p. 1108–
1120
LOWRY, R.R., TINSLEY , J.I. Rapid colorimetric determination of free fatty acids. Journal
of American Oil Chemistry Society 53, 1976, p.470-472
LUISI, P.L., GIOMIRFI, M., HLENI, M.P., ROBINSON, B.H. Reverse micelles as hosts for
proteins and small molecules. Biochimica et Biophysica Acta 947, 1988, p. 209-246
MARTINEK, K., KLYACHKO, N.L., KABANOV, A.V., KHMELNITSKY, YU.L. E
LEVASHOV, A.V. Micelar enzymology: its relation to membranology. Biochimica et
Biophysica Acta, 981, 1989, p. 161-172
MARTINEZ, A. V., DOMINGUEZ, L., MAŁOLEPSZA, E., MOSER, A., ZIEGLER, Z.,
STRAUB, J. E. Probing the Structure and Dynamics of Confined Water in AOT Reverse
Micelles. The Journal of Physical Chemistry B 117, 2013, p. 7345−7351
MATHEW, D.S., JUANG, R.-S., Role of alcohols in the formation of inverse microemulsions
and back extraction of proteins/enzymes in a reverse micellar system. Separation and
Purification Technology 53, 2007, p. 199–215
MERTENS, H. D.T., SVERGUN, D. I. Structural characterization of proteins and complexes
using small-angle X-ray solution scattering. Journal of Structural Biology 172, 2010, p.
128–141
MEZIANI, A., TOURAUD, D., ZRADBA, A., PULVIN, S., PEZRON, I., CLAUSSE, M., &
KUNZ, W. Comparison of enzymatic activity and nanostructures in water/ethanol/Brij 35
and water/1-pentanol/Brij 35 systems. Journal of Physical Chemistry B 101, 1997, p.
3620-3625.
MICHIELSEN, E.C.H.J., DIRIS, J.H.C., WODZIG, W.K.W.H. E DIEIJEN-VISSER, M. P.V.
Size-Exclusion Chromatography of Circulating Cardiac Troponin T, Clinical Chemistry
52, 2006, p. 2306-2307.
MIHAILESCU, M., MONKENBUSCH, M., ENDO, H., ALLGAIER, J., GOMPPER, G.,
STELLBRINK, J., RICHTER, D., JAKOBS, B., SOTTMANN, T., FARAGO, B.
Dynamics of bicontinuous microemulsion phases with and without amphiphilic block-
105
copolymers. Journal of chemical physics 115 (20), 2001, p. 9563-9577
MISHRA, M.K., KUMARAGURU, T., SHEELU, G. E FADNAVIS, N.W. Lipase activity of
Lecitase Ultra: characterization and applications in enantioselective reactions.
Tetrahedron: Asymmetry 20, 2009, p. 2854–2860
MOGENSEN, J.E.; SEHGAL, P.; OTZEN, D.E. Activation, inhibition and destabilization of
Thermomyces lanuginosus lipase by detergents. Biochemistry 44, 2005, p. 1719-1730.
MONIRUZZAMAN, M., HAYASHI, Y., TALUKDER, MD. M. R., SAITO, E.,
KAWANISHI, T. Effect of aprotic solvents on the enzymatic activity of lipase in AOT
reverse micelles. Biochemical Engineering Journal 30, 2006, p. 237–244
MOREIRA, M. A., NASCIMENTO, M. G. Chemo-enzymatic epoxidation of (+)-3-carene”,
Catalysis Communications 8, 2007, p. 2043–2047
MOULIK, S.P., PAUL, B.K. Structure, dynamics and transport properties of microemulsions.
Advances in Colloid and Interface Science 78, 1998, p. 99-195
NANDINI, K.E., RASTOGI, N.K., Reverse micellar extraction for downstream processing of
lipase: effect of various parameters on extraction.” Process Biochemistry 44, 2009, p.
1172–1178
NAOE, K., NODA, K., KAWAGOE, K., IMAI, M. Higher order structure of proteins
solubilized in AOT reverse micelles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 38, 2004, p.
179-185.
NAOE, K., TAKEUCHI, C., KAWAGOE, K., NAGAYAMA, K., IMAI, M. Higher order
structure of Mucor miehei lipase and micelle size in cetyltrimethylammonium bromide
reverse micellar system. Journal of Chromatography B 850, 2007, p. 277-284
NARDINI, M., DIJKSTRA, B. W. α/β Hydrolase fold enzymes: the family keeps growing.
Current Opinion in Structural Biology 9 (6), 1999, p. 732–737
NETO, D. S., SALMON, C. E. G., ALONSO, A., TABAK, M. Interaction of bovine serum
albumin (BSA) with ionic surfactants evaluated by electron paramagnetic resonance
(EPR) spectroscopy. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 70, 2009, p. 147–156
NOVOZYMES, “Desengomagem enzimática e os lucros da Bunge”, Biotimes, The quarterly
bioindustrial magazine from Novozymes, março de 2004, p. 4-5
NOVOZYMES®
Product Sheet Lipozyme®
TL 100 L, Oils & Fats, 06951 – 03- 2001.
OTZEN, D. Protein–surfactant interactions: A tale of many states. Biochimica et Biophysica
Acta 1814, 2011, p. 562–591
PALOMO, J.M., FUENTES M., FERNANDEZ-LORENTE G., MATEO C., GUISAN J.M.,
FERNANDEZ-LAFUENTE R. General Trend of Lipase to Self-Assemble Giving
Bimolecular Aggregates Greatly Modifies the Enzyme Functionality. Biomacromolecules
4, 2003, p. 1–6
106
PAPADIMITRIOU, V., PETITI, C., CASSIN, G., XENAKIS, A., PILENI, M.P. Lipase
catalyzed esterification in AOT reverse micelles: A structural study. Advances in Colloid
and Interface Science, 54, 1995, p. 1-16
PAPADIMITRIOU, V., PISPAS, S., SYRIOU, S., POURNARA, A., ZOUMPANIOTI, M.,
SOTIROUDIS, T. G., XENAKIS, A. Biocompatible Microemulsions Based on
Limonene: Formulation, Structure, and Applications. Langmuir 24, 2008, p.3380-3386
PÉREZ, J., NISHINO, Y. Advances in X-ray scattering: from solution SAXS to achievements
with coherent beams. Current Opinion in Structural Biology 22, 2012, p.670–678
PILENI, M. P., CASSIN, G., MICHEL, F., PITRÉ, F. Structural study of AOT reverse
micelles containing native or modified proteins: influence of surfactant-enzyme
interaction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 3, 1995, p. 321 332
PINHOLT, C., FANO, M., WIBERG, C., HOSTRUP, S., BUKRINSKY, J.T., FROKJAER,
S., NORDE, W., JORGENSEN, L. Influence of glycosylation on the adsorption of
Thermomyces lanuginosus lipase to hydrophobic and hydrophilic surfaces, European
Journal of Pharmaceutical Sciences 40, 2010, p. 273–281.
REICHENWALLNER, J., HINDERBERGER, D. Using bound fatty acids to disclose the
functional structure of serum albumin. Biochimica et Biophysica Acta 1830, 2013, p.
5382–5393
REIS, P., MILLER, R., KRӒGEL, J., LESER, M., FAINERMAN, V. B., WATZKE, H.,
HOLMBERG, K. Lipases at Interfaces: Unique Interfacial Properties as Globular
Proteins. Langmuir 24, 2008, p.6812-6819
ROCHE, C. J., DANTSKER, D., HELLER, E. R., SABAT, J. E., FRIEDMAN, J. M. Reverse
micelles as a tool for probing solvent modulation of protein dynamics: Reverse micelle
encapsulated hemoglobin. Chemical Physics 422, 2013, p. 88–97
RODAKIEWICZ-NOWAK, J., MASLAKIEWICZ, P., & HABER, J. The effect of linoleic
acid on pH inside sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate reverse micelles in isooctane
and on the enzymic activity of soybean lipoxygenase. European Journal of Biochemistry
238 (2), 1996, p.549-553
RUCKENSTEIN, E., KARPE, F. Enzymatic super- and subactivity in nonionic reverse
micelles. Journal of Physical Chemistry 93, 1991, p. 4869-4882
SALMON, C. E. G., NETO, D. DE S., TABAK, M., FILHO, A. J. DA C. Simulação de
espectros de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) através do programa NLSL.
Química Nova, 30 (5), 2007, p. 1240-1248
SHIOMORI, K.; ISHIMURA, M.; BABA, Y.; KAWANO, Y.; KUBIO, R.; KOMASAWA, I.
Characteristics and kinetics of lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil in a reverse
micellar system. Journal of Fermentation & Bioengineering. 81(2), 1996, p. 143-147
SHRESTHA, L. K., SHRESTHA, R. G., ARAMAKI, K., HILL, J. P., ARIGA, K. Nonionic
reverse micelle formulation and their microstructure transformations in an aromatic
solvent ethylbenzene. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engeneering
Aspects 414, 2012, p. 140– 150
107
SLAVIK, J. Anilino naphthalene sulfonate as a probe of membrane composition and function,
Biochimica et Biophysica Acta 694, 1982, p. 1-25.
SREEREMA, N., WOODY, R.W., A self-consistent method for the analysis of protein
secondary structure from circular dichroism, Analytical Biochemistry 209, 1993, p. 32-44
STAMATIS, H., XENAKIS, A. E KOLISIS, F.N. Bioorganic reactions in microemulsions:
the case of lipases. Biotechnology Advances, 17, 1999, p. 293-318
SVERGUN, D.I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods
using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography 25, 1992, p. 495-503
SVERGUN, D.I. Restoring low-resolution structure of biological macromolecules from
solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal 76, 1999, p. 2879-
2886
SVERGUN, D.I., PETOUKHOV, M.V. AND KOCH, M.H.J. Determination of domain
structure of proteins from X-ray solution scattering. Biophysical Journal, 80, 2001, p.
2946-2953.
TALUKDER, M.M.R., HAYASHI, Y., TAKEYAMA, T., ZAMAM, M.M., WU, J.C.,
KAWANISHI, T., SHIMIZU, N. Activity and stability of Chromobacterium viscosum
lipase in modified AOT reverse micelles. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic
22, 2003, p. 203–209
TANDE, B. M., WAGNER, N. J., MACKAY, M. E., HAWKER, C. J., JEONG, M.
Viscosimetric, Hydrodynamic, and Conformational Properties of Dendrimers and
Dendrons. Macromolecules 34, 2001, p. 8580-8585
TONOVA, K., LAZAROVA Z. Reversed micelle solvents as tools of enzyme purification
and enzyme-catalyzed conversion. Biotechnology Advances 26, 2008, p. 516–532
VENYAMINOV, S. Y., YANG, J. T. Determination of protein secondary structure. Em:
Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules, Ed. Fasman, G. D.,
Plenum Press, New York, EUA, 1996, p. 69-107
VERGER, R. Interfacial activation of lipases: facts and artifacts. Trends Biotechnology 15
(1), 1997, p.32-38
VOLKOV, V. V., SVERGUN, D. I.. Uniqueness of ab-initio shape determination in small-
angle scattering. . Journal of Applied Crystallography. 36, 2003, p. 860-864.
WANG, H., HAGEDORN, J., SVENDSEN, A., BORCH, K., OTZEN, D.E., Variant of the
Thermomyces lanuginosus lipase with improved kinetic stability: A candidate for enzyme
replacement therapy. Biophysical Chemistry 172, 2013, p. 43–52.
WHITMORE, L., WALLACE, B.A., Protein Secondary Structure Analyses from Circular
Dichroism Spectroscopy: Methods and Reference Databases, Biopolymers 89, 2008, p.
392-400
WILSON, L., PALOMO, J.M., FERNÁNDEZ-LORENTE, G., ILLANES, A., GUISÁN,
J.M., FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R. Effect of lipase-lipase interactions in the activity,
108
stability and specificity of a lipase from Alcaligenes sp. Enzyme and Microbial
Technology 39, 2006, p. 259–264
WU, J.C., HE, Z.M., YAO, C.Y., YU, K.T. Increased activity and stability of Candida rugosa
lipase in reverse micelles formed by chemically modified AOT in isooctane. Journal of
Chemical Technology and Biotechnology 76, 2001, p. 949-953
YANG, J.-G., WANG, Y.-H., YANG, B, MAINDA, G., GUO, Y., Degumming of Vegetable
Oil by a New Microbial Lipase, Food Technol. Biotechnol. 44 (1), 2006, p. 101–104
YANG, J.-G., WANG, Y.-H., YANG, B., MAINDA, G., GUO, Y. Degumming of Vegetable
Oil by a New Microbial Lipase. Food Technology and Biotechnology 44 (1), 2006, p.
101-104
YANG, T.; FRUEKILDE, M-B.; XU, X. Applications of Immobilized Thermomices
lanuginosus Lipase in Interesterification. Journal of the American Oil Chemists’ Society
80 (9), 2003, p. 881-887
YANG, Z., DENG, J., & CHEN, L. F. Effect of ionic and non-ionic surfactants on the activity
and stability of mushroom tyrosinase. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic, 47(1-
2), 2007, p. 79-85
ZHU, K., JUTILA, A., KINNUNEN, P.K.J. Steady state and time resolved effects of
guanidine hydrochloride on the structure of Humicola lanuginosa lipase revealed by
fluorescence spectroscopy. Protein Science, 9, 2000, p. 598–609
ZHU, K., JUTILA, A., TUOMINEN, E.K.J., PATKAR, S. A., SVENDSEN, A.,
KINNUNEN, P.K.J. Impact of the tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on
its thermal stability. Biochimica et Biophysica Acta 1547, 2001a, p. 329-338
ZHU, K., JUTILA, A., TUOMINEN, E.K.J., KINNUNEN, P.K.J. Effects of i-propanol on the
structural dynamics of Thermomyces lanuginosa lipase revealed by tryptophan
fluorescence, Protein Science 10, 2001b, p. 339–351
ZOUMPANIOTI, M., KARALI, M., XENAKIS, A., STAMATIS, H. Lipase biocatalytic
processes in surfactant free microemulsion-like ternary systems and related organogels.
Enzyme and Microbial Technology 39, 2006b, p. 531–539
ZOUMPANIOTI, M., STAMATIS, H., PAPADIMITRIOU, V., XENAKIS, A. Spectroscopic
and catalytic studies of lipases in ternary hexane-1-propanol-water surfactantless
microemulsion systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 47(1), 2006a, p. 1-9
109
7. APÊNDICES ___________________________________________________________________________
APÊNDICE A – Espectro de massas (ESI- micro Q-TOF) da TLL e dados
da MASCOT database
Na amostra analisada por espectrometria de massas com ionização por eletrospray, os
picos dos 3 peptídeos mais intensos foram selecionados e sequenciados por dissociação
induzida por colisão.
MONÔMERO
COBERTURA DE 56%
Peptídeos encontrados na análise estão em vermelho
1 MRSSLVLFFV SAWTALASPI RREVSQDLFN QFNLFAQYSA AAYCGKNNDA
51 PAGTNITCTG NACPEVEKAD ATFLYSFEDS GVGDVTGFLA LDNTNKLIVL
101 SFRGSRSIEN WIGNLNFDLK EINDICSGCR GHDGFTSSWR SVADTLRQKV
151 EDAVREHPDY RVVFTGHSLG GALATVAGAD LRGNGYDIDV FSYGAPRVGN
201 RAFAEFLTVQ TGGTLYRITH TNDIVPRLPP REFGYSHSSP EYWIKSGTLV
251 PVTRNDIVKI EGIDATGGNN QPNIPDIPAH LWYFGLIGTC L
DÍMERO
COBERTURA DE 46%
Peptídeos encontrados na análise estão em vermelho
1 MRSSLVLFFV SAWTALASPI RREVSQDLFN QFNLFAQYSA AAYCGKNNDA
51 PAGTNITCTG NACPEVEKAD ATFLYSFEDS GVGDVTGFLA LDNTNKLIVL
101 SFRGSRSIEN WIGNLNFDLK EINDICSGCR GHDGFTSSWR SVADTLRQKV
151 EDAVREHPDY RVVFTGHSLG GALATVAGAD LRGNGYDIDV FSYGAPRVGN
201 RAFAEFLTVQ TGGTLYRITH TNDIVPRLPP REFGYSHSSP EYWIKSGTLV
251 PVTRNDIVKI EGIDATGGNN QPNIPDIPAH LWYFGLIGTC L
110
APÊNDICE B - Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12,5% para a Lecitase
ultra
Análise em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) realizadas para a Lecitase ultra em
cromatografia líquido por exclusão molécula; corado por prata. (A) gel original obtido por
coloração com prata (B) Gel com padrões de saturação, brilho e contraste alterados para uma
melhor visualização das bandas. PMM - padrão de peso molecular, 1 – Extrato bruto
(~0,5µM), 2 e 3 – Extrato bruto (~0,4µM) 4 – extrato bruto (1,16 µM) e 5 – extrato bruto (3,9
µM) e 7 – extrato bruto com tampão desnaturante (~2 µM) As amostras não foram tratadas
com tampão desnaturante (SDS 1% e β-mercaptoetanol 4%), nem fervidas. A seta indica o
possível dímero.
111
Apêndice C – Gráficos demonstrando as funções de autocorrelação para as
micelas vazias (branco) e com a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL)
112
Apêndice D - Gráficos de p(r) normalizados para as micelas com Lecitase
ultra e com a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL)
113
Apêndice E – Espectros de EPR obtidos para as micelas sem enzima e com
Lecitase ultra e com a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL)
Probe hidrofóbico (5-DSA)
Branco
w0 5 Branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-3e+6
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
w0 8 Branco
Campo magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
wo 10 Branco w0 15 Branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 20 Branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.5e+7
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
2.0e+7
114
Lecitase ultra
w0 5 Lecitase
Campo magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.5e+7
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
Campo Magnético (G)3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
w0 8 Lecitase
w0 10 Lecitase
Campo magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-1.5e+7
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
2.0e+7
w0
15 Lecitase
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.5e+7
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
2.0e+7
w0 20 Lecitase
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.5e+7
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
2.0e+7
115
TLL
w0 5 TLL
Campo Magnético (G)
3440 3460 3480 3500 3520
Inte
nsi
dad
e (u
. a
.)
-3e+6
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de (
u.
a.)
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
w0 8 TLL
w0 10 TLL
Campo magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-3e+6
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6w0 15 TLL
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-3e+6
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
wo 20 TLL
Campo magnético (G)3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.0e+7
-5.0e+6
0.0
5.0e+6
1.0e+7
1.5e+7
116
Probe hidrofílico
Branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
w0 5 Branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-1.5e+6
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
w0 8 Branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 10 Branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 15 branco
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 20 Branco
117
TLL
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
w0 5 TLL
Campo Magnético (G)3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.5e+6
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
2.5e+6
w0 8 TLL
w0 10 TLL
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.5e+6
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
2.5e+6
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 15 TLL
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 20 TLL
118
Lecitase
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-1.5e+6
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
w0 5 Lecitase
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-1.5e+6
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
2.5e+6
w0 8 Lecitase
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-1.5e+6
-1.0e+6
-5.0e+5
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
2.5e+6
w0 10 Lecitase
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
dad
e (u
. a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 15 Lecitase
Campo Magnético (G)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
Inte
nsi
da
de
(u.
a.)
-2e+6
-1e+6
0
1e+6
2e+6
3e+6
w0 20 Lecitase
119
8. ANEXOS ___________________________________________________________________________
Prêmios
2012 - Menção Honrosa por avaliação de pôster, II Latin American Federation of Biophysical
Socieites Congress (LaFeBes). Commercial Enzymes in Reverse Micelles Nanosystems:
Structure-Activity Relationship.
Artigos publicados durante o doutorado
GONÇALVES, K. M., Barbosa, L.R. S., Lima, L. M. T. R., Cortines, J. R., Kalume, D. E.,
Leal, I. C. R., Miranda, L.S. M., de Souza, R. O. M. A., Cordeiro, Y. Conformational
dissection of Thermomyces lanuginosus lipase in solution. Biophysical Chemistry 185, 2014,
p. 88-97
GONÇALVES, K. M.; Sutili, F. K. ; Júnior., I. I. ; Flores, M. C.; Miranda, L.S.M; Leal, I. C.
R. ; Cordeiro, Y.; Luque, R. ; De Souza, R. O. M. A. A Comprehensive Study on the Activity
and Deactivation of Immobilized Lecitase Ultra in Esterifications of Food Waste Streams to
Monoacylglycerols. ChemSusChem 6, 2013, p. 872-879
Itabaiana, I.; GONÇALVES, K.M.; Cordeiro, Y.; Zoumpanioti, M.; Leal, I.C.R.; Miranda,
L.S.M.; De Souza, R.O.M.A.; Xenakis, A. . Kinetics and mechanism of lipase catalyzed
monoacylglycerols synthesis. Journal of Molecular Catalysis. B, Enzymatic 96, 2013, p. 34-
39
Itabaiana, I. Sutili, F. K. ; Leite, S. G. F.; GONÇALVES, K. M.; Cordeiro, Y.; Leal, I. C. R.;
Miranda, L. S. M. ; Ojeda, M.; Luque, R.; de Souza, R. O. M. A. Continuous flow
valorization of fatty acid waste using silica-immobilized lipases. Green Chemistry 15, 2013,
p. 518
GONÇALVES, K. M. ; Sutili, F. K. ; Leite, S. G. F.; de Souza, R. O. M. A.; Leal, I. C. R.
Palm oil hydrolysis catalyzed by lipases under ultrasound irradiation - The use of
experimental design as a tool for variables evaluation. Ultrasonics Sonochemistry 19, 2012, p.
232-236
120
121
Conformational dissection of Thermomyces lanuginosus lipase in solution.
Gonçalves, K. M., Barbosa, L.R. S., Lima, L. M. T. R., Cortines, J. R., Kalume, D. E., Leal, I.
C. R., Miranda, L.S. M., de Souza, R. O. M. A., Cordeiro, Y.
Biophysical Chemistry 185, 2014, p. 88-97
O manuscrito foi publicado na revista Biophysical Chemistry e consiste em parte dos
experimentos realizados durante o doutorado. Neste trabalho, há informações sobre a estrutura
da lipase de Thermomyces lanuginosus e sua capacidade de se manter em sua forma dimérica
quando em solução aquosa. Esta condição foi pela primeira vez demonstrada, assim como o
manuscrito apresenta o primeiro estudo de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS)
para a enzima em solução. Foram ainda aplicadas técnicas altamente sensíveis e sofisticadas
como íon mobility e espectrometria de massas (ESI-Q-TOF) capazes de identificar o dímero
da lipase. Este trabalho contou com a colaboração de pesquisadores com ampla experiência na
área de espectrometria de massas e SAXS.
122
A Comprehensive Study on the Activity and Deactivation of Immobilized Lecitase
Ultra in Esterifications of Food Waste Streams to Monoacylglycerols
Gonçalves, K. M.; Sutili, F. K. ; Júnior., I. I. ; Flores, M. C.; Miranda, L.S.M; Leal, I. C. R. ;
Cordeiro, Y.; Luque, R. ; De Souza, R. O. M. A..
ChemSusChem 6, 2013, p. 872-879
Este trabalho foi realizado a partir de resultados de imobilização da enzima Lecitase
ultra em shaker e em ultra-som obtidos durante o mestrado. Durante o doutorado, os
derivados imobilizados que apresentaram melhores resultados foram aplicados na síntese de
monoacilgliceróis a partir de resíduos industriais de ácidos graxos. Os resíduos foram obtidos
da Agropalma e são oriundos do refino do óleo de palma.
Em colaboração com o grupo do pesquisador Rafael Luque, foram realizadas análises
dos suportes e dos derivados imobilizados para avaliar o tamanho e volume dos poros e se a
presença de ultra-som promovia melhor internalização da enzima. Os derivados imobilizados
foram também analisados quanto a sua estabilidade térmica e reações foram promovidas
também pelo nosso grupo em fluxo contínuo.
123
Kinetics and mechanism of lipase catalyzed monoacylglycerols synthesis.
Itabaiana, I.; Gonçalves, K.M.; Cordeiro, Y.; Zoumpanioti, M.; Leal, I.C.R.; Miranda, L.S.M.;
De Souza, R.O.M.A.; Xenakis, A.
Journal of Molecular Catalysis. B, Enzymatic 96, 2013, p. 34-39
O presente trabalho consistiu na realização da síntese de monoacilgliceróis utilizando
a enzima CaL-B em sistemas AOT/isoctano. Este estudo fornece importantes resultados na
síntese de monoacilgliceróis de interesse industrial e na aplicação de sistemas micelares assim
como no comportamento cinético da lipase e a influência de fatores sobre o sistema, como
água, temperatura e inibição por produtos ou substratos.
O trabalho foi uma das etapas da tese de doutorado do aluno Ivaldo Itabaiana Júnior.
Minha colaboração consistiu na realização de algumas das reações e também em parte do
estudo cinético envolvendo os sistemas utilizados. Parte do trabalho foi desenvolvida durante
o período de doutorado no exterior, que ocorreu em Atenas, na Grécia, durante o ano de 2011.
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Continuous flow valorization of fatty acid waste using silica-immobilized lipases.
Itabaiana, I. Sutili, F. K. ; Leite, S. G. F.; Gonçalves, K. M.; Cordeiro, Y.; Leal, I. C. R.;
Miranda, L. S. M. ; Ojeda, M.; Luque, R.; de Souza, R. O. M. A.
Green Chemistry 15, 2013, p. 518
No presente artigo, o solketal ((±)-1,2-O-isopropilideno glicerol) foi aplicado na
esterificação de resíduos industriais de ácidos graxos para sua valorização, evitando o
descarte. Para a catálise, a lipase Cal-B foi imobilizada em sílica através de um procedimento
rápido e eficiente, possuindo apenas uma etapa, também conhecido como biossilicificação.
Neste trabalho fui responsável pela imobilização da enzima em diferentes condições e
na análise do derivado de maior atividade e rendimento. As reações em shaker em fluxo
contínuo foram realizadas pelo aluno Ivaldo Itabaiana com os planejamentos experimentais
pelo aluno Felipe Sutili. Enquanto a análise das enzimas imobilizadas em sílica foi realizada
pelo pesquisador Rafael Luque.
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Palm oil hydrolysis catalyzed by lipases under ultrasound irradiation - The use of
experimental design as a tool for variables evaluation.
Gonçalves, K. M. ; Sutili, F. K. ; Leite, S. G. F.; de Souza, R. O. M. A.; Leal, I. C. R.
Ultrasonics Sonochemistry 19, 2012, p. 232-236
O presente artigo surgiu como consequência do trabalho realizado durante o mestrado
em que a hidrólise do óleo de palma para obtenção de diacilgliceróis foi realizada em ultra-
som. Os diacilgliceróis podem ser utilizados na indústria alimentícia como alimento contendo
propriedades funcionais em decorrência de sua capacidade de auxiliar na redução do
colesterol.
No trabalho foram utilizadas as lipases comerciais PS IM (lipase de Pseudomonas
cepacia imobilizada) e TL IM (lipase de Thermomyces lanuginosus imobilizada) em
diferentes condições de temperatura, agitação, concentração e tempo. A influência destas
variáveis na hidrólise foi avaliada através do planejamento experimental com três variáveis e
dois níveis CCRD 2³. Todas as reações foram promovidas em ultra-som e com boas
conversões em torno de 1h e 30 min, promovendo a produção de óleo de palma enriquecido
em diacilglicerol.