novos testes de dna na investigaÇÃo de … · avaliação do dna pela reação em cadeia da...
TRANSCRIPT
NOVOS TESTES DE DNA NA INVESTIGAÇÃODE PATERNIDADE COM SUPOSTO PAI FALECIDO
MARIA REGINA JOBIMMestre em Genética e Biologia Molecular pela UFRGS.
GISELE EWALDMestre em Genética e Biologia Molecular pela UFRGS.
MARIANA JOBIM WILSONMestre em Medicina pela UFRGS e médica do Serviço de Imunologia
do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
BEATRIZ CHAMUMBióloga do Serviço de Imunologia do Hospital
de Clínicas de Porto Alegre.
LUIZ FERNANDO JOBIMDoutor em Medicina pela UFRGS, Professor da Faculdade de Medicina
da UFRGS e chefe do Serviço de Imunologia do Hospitalde Clínicas de Porto Alegre. Pós-graduado na Universidade
do Texas e de Oxford.
SUMÁRIO: 1. Introdução – 2. Preferências na análise do DNA com suposto paifalecido – 3. Avaliação do DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) – 4.STRs do cromossomo Y – 5. STRs do cromossomo X – 6. Mini-STRs na identifica-ção de material degradado – 7. Considerações finais – 8. Bibliografia.
RESUMO: Novos testes de DNA foram desenvolvidos após a queda das torres gêmeas de Nova York,permitindo a identificação de DNA degradado, fato que acontece após o falecimento devido à decom-posição dos corpos pela umidade, tempo, excesso de calor, entre outros fatores. Nesse artigo, os autoresapresentam os conhecimentos atuais e as precauções necessárias para perícias na qual o suposto pai éfalecido, como a identificação de quem deve ser intimado para o exame de DNA, de acordo com o graude importância na reconstituição do falecido, levando em conta as pessoas disponíveis para análisepericial. A identificação humana pelo estudo do DNA dos cromossomos masculino Y e X é abordadacomo parte dos novos testes de DNA disponíveis para a investigação de paternidade, especialmentequando o suposto pai é falecido. Um caso de perfeita identificação do perfil genético do réu, após 28anos de seu falecimento é analisado, permitindo o conhecimento de como é possível obter-se resultadosdefinitivos à luz dos novos testes de mini-STRs do DNA.
PALAVRAS-CHAVE: DNA após exumação – Investigação de paternidade – DNA e ossos – mini-STRs.RT/Fasc. Civ. Ano 97 v. 874 ago. 2008 p. 55-69
56 RT-874 – AGOSTO DE 2008 – 97.o ANO
ABSTRACT: After the twin towers tragedy in New York, new DNA tests were developed, allowing theidentification of degraded DNA. This process happens after death by the action of time due to the de-composition of the body by humidity, hot excess and other causes. In this article, the authors discuss theactual knowledge and the important precautions to evaluate cases where the supposed father is decea-sed, like the identification of who ought to be part of the case in the reconstitution of the dead person.The identifications of cases by the study of de sexual chromosomes X and Y is considered in the analysisof special cases. The new mini-STRs reagents were describe in a case where the genetic profile wereperfect defined in a man, 28 years after death, allowing a definitive paternity conclusion.
KEYWORDS: DNA after exhumation – DNA and bones – Paternity testing – Mini-STRs.
ÁREA DO DIREITO: Civil; Biodireito
1. INTRODUÇÃO
A identificação de paternidade, nos casos em que o suposto pai é falecido, pode sofrerlimitações pela escassez de indivíduos para análise, tanto na parte autora, quanto na do su-posto pai. As razões podem ser várias, como o falecimento de uma das partes, a falta de loca-lização de outra, a ausência do país ou por não desejarem realizar o exame pericial. Na maio-ria desses casos, acontecem questionamentos sobre “quem deverá ser intimado” para a rea-lização dos testes de reconstrução do DNA do suposto pai (JOBIM, 1996).
O DNA humano está disponível em quantidade suficiente para análise em todas as célulasnucleadas do sangue e tecidos, em menor concentração no soro ou no plasma e no líquidoamniótico placentário (urina da criança). No cabelo, ele está bem representado nos bulboscapilares, enquanto que nos ossos fica enclausurado nas células conhecidas como osteoclas-tos. Em indivíduos falecidos há poucas horas ou dias, podemos recolher facilmente amostrasde sangue puncionando veias ou o próprio coração, além de cabelos que devem conter a raiz(um número não inferior a 20 fios). Com o passar do tempo, até quatro semanas da morte,podemos usar amostras de músculo esquelético (um centímetro quadrado).
Quando o indivíduo faleceu há mais tempo, os cabelos já perderam a raiz e os tecidosremanescentes costumam ter o DNA degradado, não sendo adequados. Nesses casos, os ossose os dentes são de grande importância. Os últimos podem ser decisivos se houve morte porfogo, pois a raiz dentária fica protegida, até certo ponto, pela estrutura dentária. O fêmur e osdentes molares e pré-molares costumam ser as peças preferidas após a exumação de indiví-duos falecidos para a finalidade de análise do DNA (JOBIM, 1998). É possível também iden-tificar pessoas falecidas pela análise de antigas escovas de dente, a partir da extração do DNAde células bucais que ficam com seu esqueleto preso nas cerdas, possibilitando testes confiá-veis (JOBIM, 2004).
O DNA humano pode ter origem autossômica, ou seja, proveniente de cromossomosnão sexuais, assim como pode existir DNA do cromossomo masculino Y ou do feminino X.A maioria dos testes atuais analisa diversos locos ou locais cromossômicos de DNA autos-sômicos, entretanto os testes de DNA do cromossomo Y e X começam a ter sua importânciaem determinados tipos de perícias.
Os primeiros genes marcadores do DNA humano foram descritos por Jeffreys e cola-boradores, sendo conhecidos como minissatélites. Esses são locos ou regiões onde acon-tecem repetições de conjuntos de oligonucleotídios em tandem, ou seja, consecutivos oulado a lado. Essas repetições têm importância médica somente por serem marcadores bio-lógicos da espécie humana. Os minissatélites não são mais utilizados atualmente devido asua substituição pelos microssatélites ou STRs (short tandem repeats ou repetições curtas
57DOUTRINA CIVIL – SEGUNDA SEÇÃO
em tandem). Esses locos e seus genes são identificados pelo método de polimerase chainreaction (PCR), (MULLIS, 1987).
Analisando-se um número suficiente de locos genéticos de STRs podemos concluirpela inclusão da paternidade ou pela sua exclusão. A última acontece quando um marcador(alelo) do DNA do autor não existir no perfil do DNA paterno. No caso da existência dessainconformidade podemos estar frente a uma exclusão de paternidade ou pode ter acontecidouma mutação. Os laboratórios, na maioria das vezes, concluem pela exclusão somente apósa identificação de mais de dois locos nos quais o alelo paterno do filho não é compartilhadopelo suposto pai.
Quando o suposto pai é falecido, procuramos reconstituir ou identificar os alelos pater-nos pela análise de seus ascendentes ou descendentes. A mãe do autor e a viúva do supostopai são sempre importantes e devem ser incluídas, sendo que a última deve ser intimada quandoos seus filhos com o falecido (supostos meio irmãos) são analisados. A razão é que identifi-camos no autor (em cada loco do DNA) o alelo materno e o segundo alelo é obrigatoriamentepaterno, servindo para comparação com os alelos paternos identificados nos parentes do fa-lecido. Quando analisamos os supostos avós paternos, não necessitamos da viúva, pois oDNA do falecido estará sempre presente em um dos pais. A ausência de um alelo em comumentre o autor e seus supostos avós é indicativa de exclusão de paternidade, embora outrasexclusões devam ser identificadas para a certeza científica.
Mesmo em casos em que as mães não realizam os testes, pretendemos identificar umalelo do autor em comum com um de seus possíveis tios ou irmãos paternos. Nesses casos,a certeza diminui, pois o autor tem dois alelos por loco e estamos considerando os dois alelosao mesmo tempo, pois não sabemos qual é o alelo paterno. Nos cálculos matemáticos, essefato induz a resultados com índice e probabilidade de paternidade menores.
Uma das regras básicas para o entendimento dos casos periciais nos quais o suposto paié falecido é que cada indivíduo apresenta no máximo dois alelos por loco de DNA (heterozi-goto). Caso apresentar somente um é porque herdou o mesmo alelo de seu pai e de sua mãe(homozigoto). Tendo isso em mente, entre supostos irmãos (quando não analisamos a res-pectivas mães) só é possível existir quatro alelos diferentes, dois de herança materna e doispaterna. Um quinto alelo diferente, no autor, representa a exclusão da paternidade. Casoanalisarmos a viúva e seus filhos com o falecido, poderemos identificar ou reconstruir o per-fil dos dois alelos dele. Nessa situação, um terceiro alelo no autor exclui a paternidade.
Uma das dificuldades encontradas em testes de paternidade é a possibilidade de queum irmão do suposto pai seja o verdadeiro pai biológico do autor. Nesse caso é possível cal-cularmos matematicamente essa hipótese. A fórmula fornece o resultado do índice avuncu-lar e permite o cálculo da probabilidade cumulativa avuncular, ou seja, a probabilidade dohomem testado ser tio do autor. Podemos também conhecer quantas vezes o homem testadotem de chances de ser o verdadeiro pai do que ser tio do autor.
2. PREFERÊNCIAS NA ANÁLISE DO DNA COM SUPOSTO PAI FALECIDO
a) O autor, sua mãe (se existente) e ambos os supostos avós paternos.b) O autor, sua mãe, a viúva (se existente) e seus filhos com o falecido, além de um dos
avós paternos (se existente). Quanto maior o número de filhos, melhor a possibilidade deresultados conclusivos. Em casos em que existem muitos filhos, iniciamos com a análise detrês ou quatro. Na eventualidade de somente existir um, incluir um dos avós e supostos tios(irmãos do falecido).
c) O autor, sua mãe, suposta avó e filhos (irmãos do suposto pai –, usar todos possíveis).
58 RT-874 – AGOSTO DE 2008 – 97.o ANO
d) O DNA do cromossomo Y deverá ser analisado em casos nos quais não se conseguiuuma exclusão definitiva, existindo mutações ou a probabilidade positiva de paternidade nãoalcançou pelo menos 99%. Dessa maneira podemos identificar se o autor e o suposto paipertencem à mesma família de homens. Além do autor, podemos analisar comparativamenteoutros indivíduos masculinos pertencentes à mesma linhagem do falecido suposto pai. Entreeles, um filho, um irmão, um primo (filho de um irmão do falecido), um neto (filho de umfilho do falecido) entre outros. O importante é que a corrente de indivíduos seja sempre dehomens, não podendo ser intercalada por uma mulher.
e) A análise do DNA do cromossomo X poderá ser utilizada em casos difíceis em quenão se conseguem exclusões e os índices e probabilidades são baixos (menos de 99%). Nemtodos os casos podem ser avaliados pelo DNA do X. Nos casos nos quais existe somente aautora e uma suposta irmã, existirá sempre um alelo em comum entre as duas se forem filhasdo mesmo pai. Isso se deve ao fato que o pai biológico sempre passa o mesmo DNA do Xpara suas filhas, o que não acontece para os filhos homens, quando passa o próprio DNA doY. É crescente a utilização desses marcadores como veremos mais adiante.
f) Outra opção seria a da análise do autor e de um suposto irmão. Nesse caso nunca seráobtida a exclusão da paternidade e a parte ré estará sendo prejudicada. Isso é devido ao fatode que existindo dois alelos por loco, o autor poderá ter dois alelos detectados. O supostoirmão poderá ter um dos alelos com identidade com o autor, mas esse pode ser de origemmaterna e não de seu pai biológico. Além disso, quando não existirem identidades, podemosestar frente a dois alelos diferentes do suposto pai presentes um em cada filho, o que nãoexclui a paternidade, mas também não inclui. O mais lógico, em nossa opinião é observar-mos o valor dos índices e adicionarmos a análise do DNA do Y se forem dois supostos ir-mãos. Nesse caso, podemos excluir a paternidade ou afirmar que somente pertencem à mes-ma família de homens somente.
g) A exumação do cadáver do suposto pai é necessária sempre que não existam ascenden-tes ou descendentes ou quando esses sejam escassos, ou os resultados obtidos com os métodosanteriores (indiretos) não alcançarem probabilidades de paternidade aceitáveis ao perito e aojuiz. Nesses casos, podemos analisar o DNA do autor e o extraído diretamente do suposto pai.No caso de dúvida que o cadáver pertença ao suposto pai, podemos incluir um reconhecidofilho biológico na avaliação. Também devemos ter cautela, pois já participamos de casos emque incluíram uma filha registrada que a família sabia não ser filha do suposto pai.
h) A exumação deverá ser realizada por médico legista ou pelo perito. As partes devemcomparecer no local da exumação. Os novos métodos dos mini-STRs devem ser utilizados.A extração do DNA deve ter qualidade, pois caso contrário, os resultados não serão confiá-veis. As imagens ou eletroesferogramas dos perfis genéticos dos indivíduos devem ser in-cluídas no laudo, pois permitem análise pelo juiz e pelos assistentes técnicos (Figura 2).
3. AVALIAÇÃO DO DNA PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A PCR é um método extremamente poderoso na avaliação da individualidade humana.Ela permite a amplificação seletiva, in vitro, de seqüências específicas do DNA alvo que sedeseja estudar. O princípio da reação está no conhecimento da seqüência do DNA alvo e emreação bioquímica complexa. A ciência básica forneceu as seqüências das regiões de milhares demicrossatélites de importância em genética forense. Os locos de microssatélites conhecidos comoSTRs apresentam alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 400 pares de bases. Esses são os prefe-ridos na análise pericial de casos de identificação humana. Os STRs permitem a amplificação de
59DOUTRINA CIVIL – SEGUNDA SEÇÃO
milhares de cópias de fragmentos específicos de DNA, sendo o método utilizado na maioriados laboratórios (GONZÁLEZ-ANDRADE, 2008).
A identificação dos fragmentos amplificados é realizada após eletroforese capilar, se-guida pela detecção de sinal fluorescente. O sinal fluorescente acontece quando marcamosos primers com fluorocromos. Dessa maneira podemos usar analisadores de DNA (seqüen-ciadores automáticos) que identificam os fragmentos por intermédio de um laser. Um com-putador com programa dedicado permite observarmos curvas ou picos de DNA que são com-parados entre as partes (Figuras 1, 2 e 3).
Figura 1 – Seqüenciador de DNA (ABI-3.110).
Após a amplificação de DNA utilizamos uma escada alélica (ladder) na identificaçãode fragmentos na reação de PCR. Todas as possibilidades de alelos dos locos amplificadospodem ser observadas e comparadas com o produto amplificado. Dessa maneira, é possívelconhecer o tamanho do fragmento em pares de base (pb) e seu correspondente alelo existenteno indivíduo analisado. Os casos de exumação devem ser analisados com reagentes conhe-cidos como mini-STRs.
Os STRs são muito utilizados na análise de investigação de paternidade, devendo-seanalisar um número suficiente de locos, geralmente 12 ou mais locos. Os STRs e mini-STRssão valiosos no estudo de casos em que exista necessidade de análise de ossos, dentes, fiosde cabelo, manchas de sangue, entre outros (MAYNTZ-PRESS, 2007).
A técnica da PCR permite também a identificação do sexo do indivíduo. O loco daamelogenina apresenta um alelo de 106 pares de bases nas mulheres (XX) e um de 106 eoutro de 112 pares de bases nos homens (XY).
60 RT-874 – AGOSTO DE 2008 – 97.o ANO
D851179
A1P7651 (...ma Brussa 2 Blue
D21511
P7651(A) Autora
D75820 C5F1PO
A3P7651 (...inha Lima 3 Blue P7651(V) Viúva
A5P7651 (..ma Bonapa 4 Blue P7651(P11) Possível irmã
A7P7651 (..ma Bonapa 5 Blue P7651(P12) Possível irmão
12 14 30 33.2 9 11 1112
1213
2931.2
9 11 9 12
1213
3131.2
11 12
1112
2829
9 1210
9
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
15001000500
15001000500
2000
1000
2000
1000
Figura 2. Caso simples de avaliação da paternidade com amostras da autora, viúva e doissupostos irmãos unilaterais da autora. No loco D21S11, a possível irmã da autora (PI1) herdouo alelo 31,2 de sua mãe (viúva), sendo que o alelo 31 é de origem paterna e ausente na autora.Completa esse resultado a análise do possível irmão da autora (abaixo) que herdou o alelo 29 desua mãe (viúva), sendo que o alelo 28 é de origem paterna e ausente na autora. Nesse caso,identificamos os dois alelos paternos do falecido (31 e 28), excluindo a paternidade nesse loco.
* C7*Allelic Ladder 3 Green Allelic Ladder
12 15
13.3
1000500
3000
2000
B4 9 Green Mother
B6 10 Green Putative son
D351358 TH01 0135317 D165539
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
D251338
1000
6000
4000
2000
1813 16 19
14 17
114 6 85 7 9
9.310
8 11 14 59 12 1510 13
8 11 149 12 1510 13
15 18 21 24 2716 19 22 25 28
17 20 23 26
D351358 TH01 D135317 D165539
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
D251338
1517
7 9 1112 11
9 17 22
15 99.3
1011
1214
19 24
Figura 3. Caso de exclusão de maternidade pela análise do DNA extraído da escova dedente da falecida mãe e do DNA de seu suposto filho. Observam-se exclusões nos locosD16S539 onde a mãe apresenta os alelos 9 e 11 e o pretenso filho, os alelos 12 e 14. No locoD2S1338 a mãe apresenta alelos 17 e 22 e o suposto filho os alelos 19 e 24.
61DOUTRINA CIVIL – SEGUNDA SEÇÃO
4. STRs DO CROMOSSOMO Y
Recentemente foram descritos STRs no cromossomo masculino Y. Algumas caracte-rísticas desse cromossomo fazem com que seus microssatélites (STRs) sejam importantesna análise forense do DNA (PONTES, 2006). Devido à falta de um cromossomo homólogo,não existe recombinação durante a meiose. Sendo assim, só identificamos alelos de origemmasculina herdados em bloco dos antepassados masculinos. A herança em bloco de alelosde diferentes STRs do mesmo cromossomo é denominada herança haplotípica e o conjuntodos alelos chama-se haplótipos (BUTLER, 2002 e 2003).
Dessa maneira, é possível a identificação de diversos locos de STRs em um homem,sendo os mesmos alelos encontrados em seu pai, irmãos, tios, primos, avô e demais antepas-sados masculinos. Estudos apontam um baixo índice de mutação, podendo os mesmos ha-plótipos ser encontrados em várias gerações de homens, alcançando talvez várias centenasde anos (GILL, 2001).
Cada alelo ou marcador do Y de determinado local do DNA apresenta uma freqüência napopulação, existindo bancos de dados especializados (disponível em: <www.ystr.org/index.html>).Se examinarmos sete ou mais locos do DNA do Y, poderemos conhecer matematicamente a exis-tência ou não de uma relação genética entre indivíduos, no entanto nunca poderemos afirmar ograu de parentesco (KAISER, 2004).
Os STRs do cromossomo Y permitem reconhecer a exclusão de paternidade quando opossível pai é falecido, analisando-se o pretenso filho e homens aparentados com o supostopai (Figura 4).
Os principais locos de STR do Y são: DYS19, DYS389 I, DYS389 II, DYS390, DYS391,DYS392, DYS393, GATA H4, DYS437, DYS438 e DYS448 (MAYNTZ-PRESS, 2007).
GeneMapper ID v3.2
10061
Sample Nome
10061F_João Fictício
10061PI_José Fictício Yfilter_v2
Yfilter_v2Panel SQO SQ
R_DYS448R_Y_GATA_H4 R_DYS438R_DYS437
R_DYS437 R_DYS448R_Y_GATA_H4 R_DYS438
120
11
100
3800
3700
0
0
0
160 200 240 280 320
120 160 200 240 280 320
R_DYS448R_Y_GATA_H4 R_DYS438
120 160 200 240 280 320
10 12
11 16 9
14 16 11 13
R_DYS437
GeneMapper ID v3.2
10061
Sample Nomep
10061F_João Fictício
10061PI_José Fictício Yfilter_v2
Yfilter_v2Panel SQO SQ
R_DYS448R_Y_GATA_H4 R_DYS438R_DYS437
R_DYS437 R_DYS448R_Y_GATA_H4 R_DYS438
120
11
100
3800
3700
0
0
0
160 200 240 280 320
120 160 200 240 280 320
R_DYS448R_Y_GATA_H4 R_DYS438
120 160 200 240 280 320
10 12
11 16 9
14 16 11 13
R_DYS437
19
8 9 11 13 13 15 17 8 9 10 12 17 18 19 20 21 22 23 24
181214
Figura 4. Exclusão de paternidade pelo DNA do cromossomo Y entre o autor (JoãoFictício) e um neto de seu suposto pai (José Fictício). No loco DYS437 o autor apresenta oalelo 16 e o José Fictício o alelo 14. No loco DYS438, um apresenta o alelo 9 e o outro o alelo12. No loco DYS448 as diferenças são devidas aos alelos 19 e 18.
62 RT-874 – AGOSTO DE 2008 – 97.o ANO
Um estudo realizado pelo Prof. Chris Tyler-Smith, da Universidade de Oxford, permi-tiu a provável identificação do conjunto de genes do cromossomo Y de Gengis Khan. Asamostras utilizadas foram da população masculina da Mongólia, levando-se em conta que oguerreiro mongol teve mais de 100 filhos, os quais, por sua vez, tiveram outros milhares defilhos, todos com o mesmo perfil genético do cromossomo Y. Esse perfil é encontrado, naatualidade, em grande número de indivíduos mongóis do sexo masculino.
Outro estudo recente de importância foi a identificação de Saddam Hussein, realizadapela comparação do conjunto ou haplótipo do DNA do cromossomo Y entre ele e o DNAextraído dos corpos de seus filhos mortos em combate (Figura 5).
Figura 5. Saddam e seus filhos analisados pelo DNA do Y – BUTTLER, J. M. (2005)em Forensic DNA typing, 2. ed.
5. STRs DO CROMOSSOMO X
Como foi dito anteriormente, o cromossomo X apresenta também locos de microssaté-lites que permitem conhecer a herança sob outra perspectiva. A mãe apresentará em cadaloco dois alelos do DNA do X (XX), enquanto os homens sempre apresentarão um alelo desseDNA, pois o outro pertence ao DNA do Y (XY).
Como exemplo, podemos observar na Tabela 1 os resultados do DNA do cromossomoX de uma perícia na qual a análise de 18 locos de DNA autossômicos chegou a uma proba-bilidade de paternidade de 90%, o que não é satisfatório, pois existem 10% de chance de nãopaternidade. Nesse caso, o suposto pai era falecido e estudamos a autora, sua mãe e duasfilhas biológicas do falecido ou supostas irmãs unilaterais da autora. Devemos levar em con-ta que entre irmãs somente podemos ter três alelos do cromossomo X, um de origem paternae dois de origem materna.
63DOUTRINA CIVIL – SEGUNDA SEÇÃO
Tabela 1: Exclusão de paternidade pelo DNA do X de caso em que o suposto pai é fa-lecido.
Locos DNA-X Mãe Autora Suposta Suposta Resultadosmeia irmã 1 meia irmã 2
DXS101 19/26 19/24 26/27 25/26 ExclusãoDXS7424 14/16 16/18 15/17 15/16 ExclusãoDXS6807 11/14 11/11 11/11 11/15HPRTB 14/15 12/14 13/15 15/15 Exclusão
Nesse caso foi possível a identificação de três exclusões de paternidade. No locoDXS101, a autora herdou o alelo 19 de sua mãe, sendo que o alelo 24 é obrigatoriamente deorigem paterna e que deveria estar presente no falecido suposto pai. As pretensas irmãs uni-laterais apresentam o alelo 26 em comum, sendo esse alelo proveniente do pai (que só podeter um alelo do cromossomo X). Logo, os alelos maternos (da viúva) presentes nas supostasmeio irmãs são o 27 e 25. Os três alelos do cromossomo X possíveis de existir na família sãoos 26, 27 e 25. No entanto, a autora herdou o alelo paterno 24, o que é impossível de aconte-cer ou uma mutação ocorreu (Figura 7).
No loco DXS7424, a autora herdou o alelo 16 de sua mãe e o 18 de seu pai biológico.As supostas irmãs unilaterais herdaram o alelo 15 do seu pai. Além disso, elas herdaram osalelos maternos 17 e 16. Os três alelos do cromossomo X possíveis de existir na família são15, 17 e 16. No entanto, a autora herdou o alelo paterno 18, o que é impossível de acontecerou outra mutação ocorreu.
No loco HPRTB novamente aconteceu exclusão da paternidade pelo DNA do X. O ale-lo paterno da autora é o 12 e as supostas meio irmãs apresentam o alelo paterno 15 e doisalelos maternos 13 e 15.
6. MINI-STRS NA IDENTIFICAÇÃO DE MATERIAL DEGRADADO
Amostras de DNA degradadas sempre foram empecilhos na identificação de corposapós desastres ou longo tempo de falecimento. Os testes de identificação humana obtiveramo primeiro avanço na solução desses casos quando foi desenvolvida a reação em cadeia dapolimerase (PCR). Esse já foi um avanço considerável, tendo em vista que os primeiros tes-tes de DNA não o amplificavam, mas somente o identificavam.
No entanto, mesmo amplificando o DNA não se obtinham resultados adequados emamostras muito degradadas, pois nelas o DNA estava muito fragmentado devido a inúmerosfatores.
Na amplificação do DNA usamos reagentes que delimitam o local do DNA que quere-mos amplificar e, na maioria das vezes, os iniciadores ou primers amplificam regiões exten-sas do DNA. A novidade que permitiu os novos testes foi a redução do tamanho das regiõesamplificadas, ou seja, reduzindo-se os fragmentos a serem detectados (COBLE, 2005 e 2006).Logo, com os novos reagentes podemos identificar os mesmos alelos do DNA, mas só quecom tamanhos menores, permitindo definir alelos fragmentados ou degradados (DIXON,2006). Esses reagentes foram chamados de mini-STRs.
64 RT-874 – AGOSTO DE 2008 – 97.o ANO
Como exemplo, um alelo de DNA que identificávamos pelo tamanho de 340 pares debases, com os novos reagentes, podemos identificá-lo em 120 pares de base (DRABECK,2004). Portanto é fácil o entendimento que estamos analisando o mesmo DNA, mas com onúcleo de identidade menor, o que chamamos de região de repetição (HILL, 2007). Sendoassim, a amostra identificada é de tamanho menor, sendo mais fácil ser detectada e compa-rada com a do autor (CHUNG, 2004).
Os primeiros mini-STRs foram desenvolvidos pelo Laboratório Bode (EUA) para aidentificação das vítimas do World Trade Center, tendo suas seqüências de DNA publica-das em 2004. Os testes de mini-STRs são analisados em forma de multiplex, ou seja, épossível a amplificação e a análise de diversos locos de DNA ao mesmo tempo, devido àmarcação dos iniciadores da reação (primers) com cores fluorescentes diversas (fluoro-cromos). Os testes são semelhantes aos que usamos para identificar outros STRs (BUTLER,2003 e 2008).
Realizamos recentemente testes após a exumação do suposto pai, falecido há 28 anos.Utilizamos os mini-STRs (tabela 2, figuras 6 e 8). Os testes alcançaram um índice cumulati-vo de positivo de paternidade de 4.874 e uma probabilidade cumulativa positiva de paterni-dade de 99,97%, sendo que em todos os locos analisados observamos alelos em comum en-tre a filha e o suposto pai (exumado).
Tabela 2. Resultados dos testes de DNA após a exumação do suposto pai. Em todos oslocos observamos identidade entre alelos da autora e do suposto pai (Figura 8).
Mini-STRs Autora Suposto pai Índice de Paternidade
CSF1PO 10 e 11 10 e 11 1,80
FGA 19 e 20 20 e 25 2,10
D18S51 11 e 14 11 e 22 26,70
D13S317 9 e 12 11 e 12 0,90
D2S1338 19 19 e 20 3,80
D21S11 29 e 32,2 29 2,21
D7S820 10 e 11 9 e 10 0,90
D16S539 10 e 11 10 e 11 7,10
Índice Cumulativo 4.874
A complexidade do estudo de ossos reside principalmente na extração, purificação euso de reagentes apropriados (Figura 6). Os resultados atuais são nitidamente superioresaos que se obtiveram na década passada, obtendo-se um perfil genético no material exu-mado em 90% dos casos (Figura 8). A contaminação existente nos ossos que se recebe paraanálise é danosa, tendo em vista à presença de agentes que degradam o DNA, assim comoinibem a reação de amplificação. A terra, os fungos e as bactérias são os principais elemen-tos indesejáveis e que podem acarretar diversos graus de degradação.
65DOUTRINA CIVIL – SEGUNDA SEÇÃO
Figura 6. Osso após 28 anos do falecimento.
Os testes iniciam pela cuidadosa lavagem dos ossos para remoção de terra e outrosmateriais aderidos, seguindo-se da raspagem, com lixa, da superfície do osso até que fiqueclaro ou limpo. Em seguida, usamos uma serra elétrica para separar fragmentos de cerca de1cm2. Esses são colocados em cilindros contendo fragmentos de metal e introduzidos nummoinho eletromagnético com nitrogênio líquido. O instrumento é ligado e o magnetismo acionaa vibração do metal em alta velocidade, pulverizando os ossos. No final, teremos um pó deosso de cor branca. Quanto mais limpo o osso, melhor será a amplificação do DNA extraídode dentro dos osteoclastos. A razão da pulverização com nitrogênio líquido decorre da neces-sidade de baixas temperaturas para o DNA não ser destruído pelo calor.
O DNA deverá ser purificado antes de sua amplificação. Na maioria dos laboratóriosutiliza-se o método de fenol/clorofórmio e precipitação do DNA da solução por álcool composterior concentração em membrana ou filtro.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A análise da individualidade humana iniciou com a tipagem de grupos sangüíneos, ti-pagem HLA (antígenos leucocitários humanos) e identificação dos minissatélites do DNA.Passou, então, para os microssatélites ou STRs e chegou aos mini-STRs. Esses últimos sãoos ideais para a análise de ossos e material degradado, nos quais somente fragmentos peque-nos de DNA são existentes, ao contrário do DNA original em que as moléculas encontram-se íntegras.
As tecnologias para análise do DNA estão em evolução. O próximo passo será a análisede pedaços de DNA conhecidos como SNPs ou “polimorfismo de nucleotídeos de base úni-ca” (single nucleotide polimorphisms). Esses estão surgindo como marcadores de interessepara a comunidade forense devido: à sua abundância no genoma humano; ao seu baixo índi-ce de mutação; por permitirem a análise de pequenos fragmentos de DNA; e pela possibili-dade de automatização das análises com tecnologias superiores (PHILLIPS, 2006).
A vantagem da utilização dos SNPs em relação aos STRs, se deve ao fato que os pro-dutos de amplificação gerados são muito curtos (50 pares de base ou menos), permitindoo estudo de material degradado (como no caso de cadáveres em avançado estado de de-composição ou carbonizados). A tipagem de SNPs é complexa, existindo diversos méto-dos para a análise com fluorescência e luminescência. Um total de 50 locos de SNPs de-vem ser analisados para obter-se a equivalência ao estudo de 15 locos de microssatélitesou STRs. No entanto, em casos de extrema degradação poderemos aceitar um número menor
66 RT-874 – AGOSTO DE 2008 – 97.o ANO
de marcadores, tendo em vista ser a última possibilidade de análise genética (SANCHEZ, 2006 e VALLONE, 2006).
10463M_Maria_Fictícia Identifi cação Sexo Fetal
DXS101
10463F_Ana_Fictícia Identifi cação Sexo Fetal
DXS101
10463PT1_Silvia_Fictícia Identifi cação Sexo Fetal
DXS101
10463PT2_Eva_Fictícia Identifi cação Sexo Fetal
DXS101
180180 190190 200200 210210 220220
26261919
1919 1414
50005000
40004000
30003000
20002000
10001000
0 0
180180 190190 200200 210210 220220
24241919
16001600
140014001200120010001000
400 400
00
800 800
600 600
200200
180180 190190 200200 210210 220220
2727
2525
180180 190190 200200 210210 220220
16001600
12001200
800 800
400 400
00
500500
400400
300300
200200
100100
0 0
2626
Figura 7. Estudo do DNA do cromossomo X (loco DX101). Caso explicado na Tabela 1.
2626
67DOUTRINA CIVIL – SEGUNDA SEÇÃO
Figura 8. Eletroesferograma de parte do DNA (mini-STRs) do osso da Figura 6 e Tabela 2.
10556F_Maria_Fictícia MiniFiler_GS500_v1
CSF1PO FGA
10556F_João_Fictício
10556F_Maria_Fictícia
MiniFiler_GS500_v1
CSF1PO
MiniFiler_GS500_v1
D18S51
10556PP_João_Fictício MiniFiler_GS500_v1
D18S51
FGA
80
3000
2000
1000
0
90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
130 140 150
140 150
160
160
170
170
180
180
190
190
200
200
10 11
10 11
11
11 22
14
19 20
20 25
130
140
120
100
80
60
40
20
0
3000
2000
1000
0
240
200
160
0
120
80
40
10556F_Maria_Ficticia MiniFiler_GS500_v1CSF1PO
10556PP_Joao_Ficticia MiniFiler_GS500_v1CSF1PO
10556F_Maria_Ficticia MiniFiler_GS500_v1
D18S51
10556PP_Joao_Ficticia MiniFiler_GS500_v1
D18S51
22221111
1111 1414
150150140140130130 160160 170170 180180 190190 200200
68 RT-874 – AGOSTO DE 2008 – 97.o ANO
8. BIBLIOGRAFIA
BUTLER, John. Mini-STRs: past, present, and future. Disponível em: <http://marketing.appliedbiosystems.com/mk/get/minifiler_technology_overview>. Acesso em:25.04.2008.
______. A novel multiplex for simultaneous amplification of 20 Y chromosome STR markers.Forensic Science International, n. 129. Amsterdam: Elsevier, set. 2002.
______. Recent developments in Y-short tandem repeat and Y-single nucleotide polymorphismanalysis. Forensic Science International, n. 15. Amsterdam: Elsevier, 2003.
______. Forensic DNA typing. 2. ed. San Diego: Academic Press, 2005.
______; SHEN, Yin; MCCORD, Bruce. The development of reduced size STR amplicons astools for analysis of degraded DNA. Journal of Forensic Sciences, n. 48. West Conshohocken:ASTM Internacional, set. 2003.
CHUNG, D. T. et al. A study on the effects of degradation and template concentration on theefficiency of the STR miniplex primer sets. Journal of Forensic Sciences, n. 49. WestConshohocken: ASTM Internacional, jul. 2004.
COBLE, Michael; BUTLER, John. Characterization of new miniSTR loci to aid analysis ofdegraded DNA. Journal of Forensic Sciences, n. 50. West Conshohocken: ASTM Inter-nacional, jan. 2005.
______ et al. Characterization and performance of new miniSTR loci for typing degradedsamples. Progress in Forensic Genetics, n. 11. Amsterdam: Elsevier, abr. 2006.
DIXON, L. A. et al. Analysis of artificially degraded DNA using STRs and SNPs – results ofa collaborative European (EDNAP) exercise. Forensic Science International, n. 164.Amsterdam: Elsevier, dez. 2006.
DRABECK, Jiri et al. Concordance study between miniplex STR assays and a commercial STRtyping kit. Journal of Forensic Sciences, n. 49. West Conshohocken: ASTM Internacional,jul. 2004.
GILL, Peter. DNA Commission of the International Society of Forensic Genetics:recommendations on forensic analysis using Y-chromosome STRs. Forensic ScienceInternational, n. 124. Amsterdam: Elsevier, jul. 2001.
GONZÁLEZ-ANDRADE, Fabricio et al. Chromosome STR haplotypes in three differentpopulation groups from Ecuador (South America). Journal of Forensic Sciences, n. 53.West Conshohocken: ASTM Internacional, mar. 2008.
HILL, C. R. et al. Concordance study between the AmpFlSTR MiniFiler PCR amplification kitand conventional STR typing kits. Journal of Forensic Sciences, n. 52. West Conshohocken:ASTM Internacional, jul. 2007.
JOBIM, Maria Regina et al. Human identification using DNA purified from residues in usedtoothbrushes. International Congress Series, n. 10. Amsterdam: Elsevier, abr. 2004.
JOBIM, Luiz Fernando et al. Investigação de Paternidade após exumação do possível paifalecido: extração do DNA da cabeça do fêmur e avaliação por amplificação do DNA de11 locos de short tandem repeats (STR). Jornada de Genética Forense, 1998.
______ et al. Perícias médicas em investigação de paternidade pelos principais sistemasgenéticos. Revista do Hospital das Clínicas de Porto Alegre, n. 16. Porto Alegre: HCPA,1996.
69DOUTRINA CIVIL – SEGUNDA SEÇÃO
______; COSTA, Luís Renato; SILVA, Moacyr. Identificação humana. Campinas: Millenium,2006. v. 2.
KAISER, M. et al. A comprehensive survey of human Y-chromosomal microsatellites. AmericanJournal of Human Genetics, n. 74. Pike Bethesda: American Society of Human Genetics,jun. 2004.
MAYNTZ-PRESS, Kathleen; BALLANTYNE, Jack. Performance characteristics of commer-cial Y-STR multiplex systems. Journal of Forensic Sciences, n. 52. West Conshohocken:ASTM Internacional, set. 2007.
MULLIS, K.; FALOONA, F. Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase chain reaction.Methods Enzymology: USA, 1987.
PHILLIPS, C. et al. A compact population analysis test using 32 SNPs with highly diverse allelefrequency distributions. International Congress Series, n. 1.288. Amsterdam: Elsevier,out. 2006.
PONTES, M. L.; ABRANTES, D.; PINHEIRO, M. F. AmpFlSTR®Y-filerTM: A new tool forrapid Y-STR forensic haplotyping. International Congress Series, n. 1.288. Amsterdam:Elsevier, out. 2006.
SANCHEZ, J. J. et al. Development of a multiplex PCR assay detecting 52 autosomal SNPs.International Congress Series, n. 1.288. Amsterdam: Elsevier, out. 2006.
VALLONE, P. M. et al. The evaluation of an autosomal SNP 12-plex assay. InternationalCongress Series, n. 1.288. Amsterdam: Elsevier, nov. 2006.
––––––––––––––