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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Maria Eduarda de Souza Menezes da Costa
NOVOS ALVOS MOLECULARES PARA DETECÇÃO E
GENOTIPAGEM DE TOXOPLASMA GONDII
Natal/2016
MARIA EDUARDA DE SOUZA MENEZES DA COSTA
NOVOS ALVOS MOLECULARES PARA DETECÇÃO E
GENOTIPAGEM DE TOXOPLASMA GONDII
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área de Parasitologia.
Daniel Carlos Ferreira Lanza
Natal/2016
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Costa, Maria Eduarda de Souza Menezes da.
Novos alvos moleculares para detecção e genotipagem de toxoplasma gondii / Maria Eduarda de Souza
Menezes da Costa. – Natal, RN, 2016.
116 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Carlos Ferreira Lanza.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de
Pós Graduação em Biologia Parasitária.
1. Toxoplasma gondii. – Dissertação. 2. Marcador molecular. – Dissertação. 3. Virulência. – Dissertação. I.
Lanza, Daniel Carlos Ferreira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616.993.1
Maria Eduarda de Souza Menezes da Costa
Novos Alvos Moleculares para Detecção e Genotipagem de Toxoplasma gondii
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área de Parasitologia.
Aprovada em 27 de Janeiro de 2016
Banca examinadora:
___________________________________________
Professora Doutora Paula Vivianne de Souza Queiroz Moreira
Departamento de Ciências Biomédicas – UERN
___________________________________________
Professor Doutor Paulo Marcos da Matta Guedes
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
___________________________________________
Professor Doutor Daniel Carlos Ferreira Lanza
Departamento de Bioquímica - UFRN
NATAL
2016
"All mentors have a way of seeing more of our faults than we would like. It's the only way we grow."
–Padmé Amidala
AGRADECIMENTOS
Gostaria de começar agradecendo aos meu pais, Franci e Eduardo, que desde sempre me ensinaram que educação é a chave para o futuro e que fizeram de tudo para eu seguir esse caminho.
À Thiago, meu namorado, que sempre me apoiou e incentivou em todos os momentos, desde o início da graduação até agora.
Aos meus amigos do laboratório, Fanny, Márcia, Allan, Jéssica Paiva, Jéssica Cândido, Emília e Gustavo, por se tornarem verdadeiros companheiros.
Ao Prof. Dr. Valter Andrade Neto, Thatiany, Cláudio e Joelma, pela colaboração com esse trabalho.
Ao meu orientador Prof. Dr. Daniel Lanza, por me aceitar como aluna no mestrado e me mostrar o verdadeiro significado do que é ser professor, sempre me incentivando a superar os meus limites.
RESUMO
O Toxoplasma gondii é um parasito mundialmente distribuído, que pode causar desde
sintomas parecidos com a gripe até problemas neurológicos. As cepas do T. gondii
apresentam grande variabilidade genética na América do Sul, sendo fundamental a
análise de sequências para auxiliar no diagnóstico confiável e para classificação dos
diferentes genótipos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver dois métodos
moleculares, um para detecção e o outro para genotipagem do T. gondii,
possibilitando a identificação de todas as cepas conhecidas e a geração de dados que
possam ser correlacionados com a virulência. Inicialmente, foi utilizado o programa
MUSCLE para alinhamento de 685 sequencias nucleotídicas obtidas do GenBank, em
seguida os alinhamentos foram analisados no programa MEGA 6.0 para determinação
de sua variabilidade genética. O gene GRA7 foi selecionado como alvo para os
iniciadores, que foram desenhados em regiões conservadas do gene utilizando os
programas Geneious 9.0 e Primer BLAST. O protocolo de amplificação utilizando-se
os primers para o gene GRA7 foi então comparado a outros protocolos padronizados
para amplificação do gene B1 e do elemento repetitivo de 529 pb, que são os
marcadores mais utilizados para o diagnóstico do T. gondii. Para o desenvolvimento
do sistema para genotipagem foram selecionados os genes ROP5, ROP18 e GRA7,
que estão relacionados ao mecanismo de virulência melhor descrito em T. gondii. O
sistema para genotipagem desenvolvido se baseia na análise de polimorfismos
presentes em fragmentos sob seleção positiva desses genes, que permite identificar
cepas pertencentes as linhagens clonais e cepas atípicas. Utilizando-se essa nova
abordagem para a seleção de marcadores, será necessário investigar um número de
regiões do genoma consideravelmente menor que o utilizado pelo método utilizado
tradicionalmente, simplificando o processo. Concluindo, o desenho de primers em
regiões conservadas do gene GRA7 permitiu o desenvolvimento de um sistema de
detecção utilizando PCR com excelente especificidade e sensibilidade, principalmente
para detecção de cepas atípicas do T. gondii. Ainda, a genotipagem baseada na
detecção de polimorfismos em genes de virulência permitiu a diferenciação genotípica
das diferentes cepas de forma mais simples do que por meio da técnica de RFLP
utilizada atualmente.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii. Marcador molecular. Virulência. Cepa atípica.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii is a parasite distributed worldwide, causing symptoms similar to
the flu to neurological problems. The strains of T. gondii exhibit great genetic variability
in South America, being essential the sequence analysis to assist in the reliable
diagnosis and classification of different genotypes. The objective of this study was to
develop two molecular methods, one for detection and the other for genotyping of T.
gondii, enabling the identification of all known strains and generating data that can be
correlated with virulence. Initially, we used the MUSCLE program for alignment of 685
nucleotide sequences obtained from GenBank, and then the alignments were analyzed
using the MEGA 6.0 program to determine their genetic variability. The GRA7 gene
was selected as a target for the primers, which were designed to conserved regions of
the gene using Geneious 9.0 and Primer-BLAST programs. The amplification protocol
using primers for GRA7 gene was then compared to other standardized protocols for
amplification of the B1 gene and the repetitive element of 529 bp, which are the most
commonly used markers for diagnosis of T. gondii. For the development of genotyping
system ROP5, ROP18 and GRA7 genes were selected, which are related to virulence
mechanism most described in T. gondii. The genotyping system developed is based
on the analysis of polymorphisms in fragments under positive selection of these genes,
which identifies strains belonging to clonal lineages and atypical strains. Using this new
approach for the selection markers, it will be necessary to investigate a number of
regions of the genome that considerably lower than the method used traditionally used,
simplifying the process. In conclusion, the primer design in conserved regions of the
gene GRA7 allowed the development of a detection system using PCR with positivity
and great sensitivity, especially for the detection of atypical strains of T. gondii. Further,
genotyping based on detecting polymorphisms in virulence genes allowed the
differentiation of different genotypic strains more simply than the RFLP technique
currently used.
Key words: Toxoplasma gondii. Molecular marker. Virulence. Atypical strain.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Soroprevalência global de T. gondii............................................................12
Figura 2. Ciclo biológico do T. gondii.........................................................................14
Figura 3. Ultraestrutura do taquizoítos de T. gondii...................................................16
Tabela 1. Genes envolvidos com mecanismos de virulência em T. gondii..................17
Figura 4. Modelo de inibição das proteínas IRG pelos efetores de virulência do T.
gondii..........................................................................................................................18
Figura 5. Exemplo de análise de PCR-RFLP de amostras de T. gondii usando 12
marcadores................................................................................................................19
Figura 6. Variabilidade genética dos genes de T. gondii selecionados.....................29
Figura 7. Análise estrutural in silico de GRA7............................................................20
Tabela 2. Lista dos primers usados para as amplificações por PCR.........................31
Tabela 3. Ciclos de PCR usados neste estudo..........................................................32
Figura 8. Teste de sensibilidade.................................................................................32
Figura 9. Teste de cobertura.......................................................................................34
Figura 10. Teste de especificidade do protocolo que utiliza os primers para B1..........34
Figura 11. Análises in silico de ROP5, ROP18 e GRA7.............................................36
Tabela 4. Primers usados na amplificação dos fragmentos de ROP5, ROP18 e
GRA7..........................................................................................................................37
Tabela 5. Sítios de substituições não-sinônimas dos fragmentos de ROP5, ROP18 e
GRA7..........................................................................................................................37
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
GRA Granulo denso
ROP Roptrias
SAG Antígeno de superfície
NCBI National Center for Biotechnology Information
Nt Nucleotídeo
MLEE Multilocus Enzyme Electrophoresis
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism
MAT Modified Agglutination Test
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assays
ISAGA Immunosorbent Agglutination Assay
IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test
IHA Indirect Haemagglutination Assays
MLST Multilocus Sequence Typing
MVLST Multi-Virulence-Locus Sequence Typing
RE Elemento repetitivo de 529 pb
LAMP Loop-mediated Isothermal Amplification
DHPS Diidropteroato sintase
DHFR Diidrofolato redutase
BTUB Beta-tubulina
IVG Índice de Variabilidade Genética
Tm Temperatura de melting
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 11
1.1. Toxoplasmose: Epidemiologia ............................................................................... 11
1.2. Classificação e ciclo biológico do Toxoplasma gondii ............................................ 13
1.3. Aspectos moleculares da toxoplasmose e Tratamento .......................................... 15
1.4. Diversidade genética do Toxoplasma gondii .......................................................... 19
1.5. Diagnóstico ............................................................................................................ 20
2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 23
2.1. Objetivo geral ........................................................................................................ 23
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................. 23
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 24
3.1. Comitê de Ética ..................................................................................................... 24
3.2. Delineamento experimental ................................................................................... 24
3.3. Parasitas e manutenção dos isolados in vivo ......................................................... 24
3.4. Seleção e análise de sequências e desenho de primers........................................ 25
3.5. Extração de DNA, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Eletroforese.......... 26
3.6. Análise das sequências de ROP5, ROP18 e GRA7 ............................................... 27
4 RESULTADOS ............................................................................................................. 28
4.1. Identificação de sequências conservadas no genoma do T. gondii ........................ 28
4.2. Desenho de primers e otimização dos protocolos para os nested-PCRs ............... 29
4.3. Comparação de sensibilidade entre os protocolos de B1, RE e GRA7 .................. 32
4.4. Comparação de cobertura entre os protocolos de B1, RE e GRA7 ........................ 33
4.5. Identificação de novos marcadores moleculares para genotipagem do T. gondii ... 35
4.6. Análise dos polimorfismos das regiões sob seleção positiva ................................. 36
5 DISCUSSÃO ................................................................................................................ 38
6 CONCLUSÃO ............................................................................................................... 42
7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 43
APÊNDICE A – Números de acesso das sequências utilizadas nesse estudo .................... 60
APÊNDICE B – Números de sequências, sítios polimórficos e tamanho de sequência usados
para calcular o Índice de variabilidade genética (IGV) ......................................................... 63
APENDICE C – Tabela com primers descritos na literatura para B1 e RE ........................... 65
ANEXO A – Artigo em processo de revisão (Revista Acta Tropica) ..................................... 67
ANEXO B – Depósito de Pedido de Patente ........................................................................ 87
ANEXO C – Artigo em fase final de preparação ................................................................. 105
11
1 INTRODUÇÃO
1.1. Toxoplasmose: Epidemiologia
A Toxoplasmose é uma zoonose causada pelo parasito Toxoplasma gondii que
causa grande impacto na saúde pública e na pecuária, pois pode causar abortos e
doenças congênitas em seres humanos, com sequelas neurológicas em seus
hospedeiros intermediários, e causar a morte de animais de criação como bovinos,
ovinos e caprinos (HILL; CHIRUKANDOTH; DUBEY, 2005; TENTER; HECKEROTH;
WEISS, 2000). Atualmente a toxoplasmose tem distribuição mundial (DUBEY;
BEATTIE, 1988; TENTER; HECKEROTH; WEISS, 2000) e em humanos, é estimado
que um terço da população esteja infectada com T. gondii (MONTOYA; LIESENFELD,
2004). A prevalência da toxoplasmose varia muito entre os países, (10 a 80 %),
podendo apresentar grande variação também dentro de um país ou entre diferentes
comunidades de uma mesma região (PAPPAS; ROUSSOS; FALAGAS, 2009). As
maiores prevalências são observadas nos países da América Latina, África e em
alguns países do Sudeste da Ásia, enquanto que países da América do Norte e Norte
da Europa apresentam as menores prevalências (Figura 1) (PAPPAS; ROUSSOS;
FALAGAS, 2009). Essas diferentes taxas de prevalência observadas no mundo estão
relacionadas a fatores que envolvem localização geográfica, hábitos alimentares,
ocupação, saneamento básico e higiene (JONES et al., 2001, 2009; SPALDING et al.,
2005).
Países que se localizam em grandes altitudes ou possuem climas áridos ou
com frequente congelamento e descongelamento tendem a ter uma menor taxa de
infecção pois o clima influencia diretamente na viabilidade de cistos e oocistos
presentes no ambiente (DUBEY; BEATTIE, 1988; DUBEY, 1974; WALTON; ARJONA;
BENCHOFF, 1966). Já o clima tropical da América Latina e da África subsaariana
favorece a alta prevalência de infecção por T. gondii (DUBEY; BEATTIE, 1988;
GARCIA BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003; HAMMOND-ARYEE; ESSER; VANHELDEN,
2014; ROSSO et al., 2008), assim como o hábito de ingerir carnes cruas ou
malcozidas também está relacionado com prevalência alta em alguns países, como
França (JEANNEL et al., 1988; LAURENCE BARIL, THIERRY ANCELLE, 1999).
12
Figura 1. Soroprevalência global de T. gondii. Vermelho escuro significa prevalência acima de 60%,
vermelho claro significa prevalência entre 40-60%, amarelo de 20-40%, azul de 10-20% e verde, menor
que 10%. Branco significa ausência de dados. Fonte: PAPPAS; ROUSSOS; FALAGAS, 2009
Existem poucos estudos que relatam os impactos econômicos causados pela
toxoplasmose no mundo. Os estudos disponíveis, demonstram que a toxoplasmose
causa perda econômica, tanto em relação à saúde pública quanto nos segmentos
econômicos que envolvem animais de criação, como a pecuária. Em um estudo
conduzido por onze anos nos Estados Unidos, a perda de produtividade gerada pelas
mortes por toxoplasmose foi estimada em US$ 814,500,000 (CUMMINGS et al.,
2014). Em 2010, estimou-se que os gastos gerados pela toxoplasmose nos EUA
foram em torno de 3 bilhões de dólares (SCHARFF, 2012). No Uruguai, em 1997, foi
estimada perda entre 1,4 a 4,7 milhões de dólares em decorrência da incidência de
toxoplasmose em criações de ovinos e caprinos para o abate (FREYRE et al., 1997).
No Brasil, estudos epidemiológicos mostram que a prevalência de T. gondii em
humanos varia de 20 a quase 100%, dependendo do grupo avaliado (BARBOSA;
HOLANDA; DE ANDRADE-NETO, 2009; COSTA et al., 2010; DE AMORIM GARCIA
et al., 2004; SANTOS et al., 2009). Entre crianças de 0 a 15 anos, a faixa etária que
apresenta maior prevalência de infecção é de 11 a 15 anos, sendo acima de 50%.
13
(COSTA et al., 2010; FRANCISCO et al., 2006). No grupo de grávidas/mulheres em
idade fértil, a prevalência também é alta, variando de 45 a 92% (DUBEY et al., 2012).
E mesmo com essas altas taxas, o Brasil não possui nenhum programa nacional de
triagem para toxoplasmose em mulheres e crianças (DUBEY et al., 2012).
Em relação aos animais, o cenário se repete: estudos sorológicos mostram que
até 90% dos animais domésticos/animais de produção estão infectados, sendo a
carne de porco a principal fonte de infecção para humanos (DUBEY, 2009; DUBEY et
al., 2012). Transmissão por carne de cavalo foi relatada em um caso na França, por
ingestão de carne malcozida importada do Brasil (POMARES et al., 2011). Além de
contaminar a carne, o parasito ainda pode causar abortos em ovelhas e cabras,
gerando perda econômica (DUBEY; ADAMS, 1990). Não existem estimativas
econômicas do impacto de toxoplasmose no Brasil (DUBEY et al., 2012).
1.2. Classificação e ciclo biológico do Toxoplasma gondii
O T. gondii foi descrito em 1908 no roedor Ctenodactylus gundi por Nicolle e
Manceaux e em coelhos por Splendore, concomitantemente. Inicialmente foi
denominado de Leishmania gondii devido à similaridade com o gênero, mas um ano
depois teve seu nome mudado para T. gondii (NICOLLE; MANCEAUX, 1909).
Atualmente o T. gondii pertence ao Reino Protista, Sub-reino Protozoa, Filo
Apicomplexa, Classe Sporozoa, Subclasse Coccidia, Ordem Eucocciciida, Gênero
Toxoplasma e Espécie Toxoplasma gondii (TENTER; JOHNSON, 1997).
O T. gondii apresenta potencialmente a capacidade de infectar todas as
espécies de aves e mamíferos (ELMORE et al., 2010; MONTOYA; LIESENFELD,
2004), e apresenta ciclo de vida heteroxêno facultativo, sendo os hospedeiros
definitivos membros do táxon Felidae, nos quais ocorrem as fases sexuada e
assexuada do ciclo, e os hospedeiros intermediários, os demais animais
homeotérmicos, nos quais ocorre apenas a fase assexuada do ciclo (ASHBURN,
1992; JACKSON; HUTCHISON, 1989).
A ingestão de T. gondii por felinos resulta na infecção das células epiteliais do
intestino delgado, onde ocorre divisão por ezquizogonia e formação de gametas, que
irão dar origem a oocistos que vão ser liberados nas fezes (Número 1 da Figura 2)
(FRENKEL; DUBEY; MILLER, 1970; HUTCHISON et al., 1971; JACKSON;
14
HUTCHISON, 1989). Os hospedeiros intermediários se infectam principalmente
através da ingestão de oocistos ou cistos teciduais, que se diferenciam em taquizoítos
e invadem diversos tipos celulares, multiplicando-se rapidamente dentro delas
(Número 2 da Figura 2). Essa etapa caracteriza a fase aguda da infecção, cuja
gravidade pode depender da cepa, susceptibilidade do hospedeiro e quantidade de
formas infectantes ingeridas. Na segunda etapa, os taquizoítos se diferenciam em
bradizoítos e formam os cistos teciduais, caracterizando a fase crônica da infecção
(Número 3 da Figura 2) (BLACKMAN; BANNISTER, 2001; HILL; DUBEY, 2002;
JACKSON; HUTCHISON, 1989).
Figura 2. Ciclo biológico do Toxoplasma gondii. Esquema mostrando as vias de infecção entre
hospedeiros e replicação dos estágios do parasito em seus respectivos hospedeiros. Número 1
representa a fase sexuada do ciclo; Número 2 representa a fase aguda da fase assexuada do ciclo;
Número 3 representa a fase crônica da fase assexuada do ciclo. Modificado de FERGUSON, 2002.
As formas infectantes de T. gondii são os oocistos, taquizoítos e cistos teciduais
sendo a principal forma de infecção por via oral, através da ingestão de oocistos
presentes em água ou alimentos, ou de cistos teciduais presentes em carnes
malcozidas. Também pode ocorrer passagem transplacentária de taquizoítos para o
15
feto e, mais raramente, infecção por transplante de órgãos ou via transfusão
sanguínea (HILL; DUBEY, 2002). O fato do T. gondii possuir diferentes vias de
infecção e infectar permanentemente os hospedeiros com a formação de cistos
teciduais, o tornou um dos parasitos mais bem-sucedidos. Além disso, sua capacidade
de formar cistos teciduais e depois retornar ao estágio de proliferação (taquizoítos)
dispensa a necessidade de o parasito desenvolver a fase sexuada do ciclo, com isso,
o T. gondii pode se disseminar clonalmente entre os hospedeiros (SULLIVAN;
JEFFERS, 2012).
1.3. Aspectos moleculares da toxoplasmose e Tratamento
A maioria das infecções por T. gondii em pessoas saudáveis são
assintomáticas, mas em uma minoria, elas podem apresentar sintomas leves,
parecidos com os sintomas de gripe, ou retinocoroidite (“CDC - Toxoplasmosis -
Disease”, 2014; DUBEY; JONES, 2008; HOLLAND, 2003). Entretanto, o T. gondii
pode causar sintomas mais severos em pacientes imunossuprimidos ou em infecções
congênitas, causando principalmente problemas neurológicos (DUBEY; JONES,
2008).
Os principais sintomas ocorrem pela invasão do parasito em células do cérebro
e retina, mas o T. gondii tem capacidade de infectar qualquer célula nucleada
(DUBEY; BEATTIE, 1988). O processo de invasão se inicia pelo reconhecimento de
moléculas presente na superfície da célula hospedeira, como ácido siálico e
proteoglicanos sulfatados, que são moléculas comumente encontradas em
praticamente todas as células de mamíferos (CARRUTHERS et al., 2000;
MONTEIRO; SOARES; DE SOUZA, 1998). Essas moléculas são reconhecidas pelas
lectinas presentes na superfície do parasito, fornecendo uma ligação inicial (ORTEGA-
BARRIA; BOOTHROYD, 1999). Outras proteínas presentes na superfície do parasito
são necessárias para o início do processo de invasão, os antígenos de superfície
(SAGs), que oferecem adesão a membrana da célula hospedeira (GRIMWOOD;
SMITH, 1996; JACQUET et al., 2001). Em seguida ocorre secreção de proteínas das
roptrias (ROPs) e micronemas (MICs) (Figura 3). As micronemas são fundamentais
para a adesão (GARCIA-RÉGUET et al., 2000; SOLDATI; DUBREMETZ; LEBRUN,
16
2001) e as roptrias são secretadas dentro do vacúolo parasitóforo em formação que
vão ter como destino final o lúmen do vacúolo ou a membrana do vacúolo
(BOOTHROYD; DUBREMETZ, 2008). O vacúolo parasitóforo é o local onde o T.
gondii se desenvolve após a invasão da célula e dentro do vacúolo, o parasito secreta
um conjunto de organelas, denominadas de grânulos densos (Figura 3), cujas
proteínas (GRAs) são responsáveis por modificações no vacúolo parasitóforo
(BLACK; BOOTHROYD, 2000; CARRUTHERS; SIBLEY, 1997). Essas modificações
permitem que o vacúolo não se funda com os lisossomos, permitindo a sobrevivência
do T. gondii no interior da célula (COPPENS et al., 2006). As GRAs também são
responsáveis pelo sequestro de lisossomos da célula hospedeira, ativação de vias
imunológicas e formação de uma rede membranosa dentro do vacúolo (COPPENS et
al., 2006; LECORDIER et al., 1995; ROSOWSKI et al., 2011).
Figura 3. Ultraestrutura do taquizoítos de T. gondii. O conóide define a extremidade apical do parasito.
Micronemas, roptrias e grânulos densos são as três principais organelas secretórias, encontradas
principalmente na extremidade apical. O apicoplasto é uma organela de quatro membranas contendo
um DNA circular de 35 kb. O T. gondii tem um único núcleo e uma única mitocôndria. Adaptado de
AJIOKA; FITZPATRICK; REITTER, 2001.
O T. gondii desenvolveu alguns meios de evadir o sistema imune do
hospedeiro. Existem algumas proteínas do parasito responsáveis por interagir com a
célula hospedeira e inibir seus mecanismos de resistência (Tabela 1). A resistência
em células humanas ainda não está bem compreendida, mas acredita-se que esteja
relacionada com a depleção dependente de IFN-γ de triptofano (PFEFFERKORN,
1984). Nos murinos, os mecanismos são bem estabelecidos, sendo o principal
17
mecanismo, aquele mediado pela a GTPase relacionada a imunidade (IRG –
Immunity-Related GTPase), que promove o rompimento do vacúolo parasitóforo
(ZHAO et al., 2009). O T. gondii possui um complexo de virulência responsável por
inibir as proteínas IRG, complexo esse formado pelas proteínas ROP5, ROP18 e
GRA7 (Figura 4). A ROP5 inibe a oligomerização das IRG, o que facilita a fosforilação
dos resíduos de treonina presente nessas proteínas pela ROP18 (NIEDELMAN et al.,
2012). A GRA7 se une ao complexo para aumentar a eficiência da fosforilação da
ROP18 (HERMANNS et al., 2015).
Tabela 1. Genes envolvidos com mecanismos de virulência em T. gondii
Gene Complexo Mecanismo Referência
ROP5 ROP5/ROP18/GRA7 Interação com IRG Fleckenstein et al., 2012
ROP16 Desconhecido Fosforilação de STAT3/6 Ong et al., 2010; Yamamoto et al., 2009
ROP17 ROP5/ROP17 Fosforilação de Irgb6 Etheridge et al., 2014
ROP18 ROP5/ROP18/GRA7 Fosforilação de Irga6 e degradação de ATF6β
Fentress et al., 2010; Yamamoto et al., 2011
GRA7 ROP5/ROP18/GRA7 Interação com IRG e interação com complexo ROP5/ROP18
Alaganan et al., 2014; Hermanns et al., 2015
GRA15 Desconhecido Ativação de NF-кB Rosowski et al., 2011
GRA16 Desconhecido Ligação a HAUSP e PP2A Bougdour et al., 2013
GRA24 Desconhecido Ativação da kinase P38α MAP Braun et al., 2013
GRA25 Desconhecido Indução de CCL2/CXCL1 Shastri et al., 2014
MAF1 Desconhecido Associação a mitocôndria do hospedeiro
Pernas et al., 2014
18
Figura 4. Modelo de inibição das proteínas IRG pelos efetores de virulência do T. gondii. (A)
Oligomerização das proteínas IRG que ocorre na membrana do vacúolo parasitóforo em cepas
avirulentas de T. gondii. (B) Alelos virulentos de ROP5 se ligam a IRG (Irga6), mantendo-a na forma
monomérica. A interação direta de GRA7 com ROP5 é requerida para a fosforilação específica em dois
resíduos de treonina (círculos vermelhos) e permanente inativação pela ROP18. Para ROP17 foi
mostrada fosforilação preferencial de Irgb6. VP, vacúolo parasitóforo. Adaptado de HERMANNS et al.,
2015
A diferença de virulência observada em camundongos entre as linhagens
clonais se dá pelas diferenças genéticas das cepas (HOWE; SIBLEY, 1995a). Mas
apesar da diferença de virulência das cepas, a toxoplasmose só é tratada em casos
de infecções agudas em gestantes para impedir a infecção do feto, em pacientes
imunossuprimidos e em pacientes imunocompetentes que possuam sintomas
moderados a severos (HALONEN; WEISS, 2013; MCLEOD et al., 2009).
O tratamento da toxoplasmose teve início com o relato de Sabin e Warren, em
1942 mostrando a eficiência de sulfonamidas contra toxoplasmose murina (SABIN;
WARREN, 1942). Após isso, outras drogas foram relatadas como opções de
tratamento para toxoplasmose humana, como pirimetramina, que pode ser usada
juntamente com as sulfonamidas (EYLES; COLEMAN, 1953), espiramicina, usada
profilaticamente durante a gravidez para reduzir a transmissão da mãe para o feto
(DESMONTS; COUVREUR, 1974), e clindamicina, usada em pacientes alérgicos a
sulfonamidas (ARAUJO; REMINGTON, 1974; MCMASTER et al., 1973).
19
1.4. Diversidade genética do Toxoplasma gondii
Existem diferentes abordagens para se classificar geneticamente as cepas de
T. gondii, como o sequenciamento de íntrons (KHAN et al., 2007), análise de
microssatélites (AJZENBERG et al., 2002), eletroforese multilocus de enzimas
(multilocus enzyme electrophoresis - MLEE) (DARDÉ; BOUTEILLE; PESTRE-
ALEXANDRE, 1992) e a principal metodologia, PCR-RFLP, que atualmente se baseia
em até doze marcadores: SAG1, 5’+3’ SAG2, alt. SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8,
c29-2L358, PK1 e Apico (Figura 5) (GAJRIA et al., 2008; HOWE et al., 1997; SU;
ZHANG; DUBEY, 2006). Estudos com isolados da Europa e América do Norte
classificaram as cepas de T. gondii em três linhagens clonais distintas: I, II e III,
determinadas de acordo com estudos moleculares de genotipagem (DARDÉ;
BOUTEILLE; PESTRE-ALEXANDRE, 1992; HOWE; SIBLEY, 1995b).
Figura 5. Exemplo de análise de PCR-RFLP de amostras de T. gondii usando 12 marcadores. Su et al.,
2010
Entretanto, quando amostras provenientes da América do Sul são analisadas,
a maioria se revela divergente das linhagens clonais, sendo denominadas de atípicas,
provavelmente devido a uma recombinação genética frequente entre essas
20
populações (CARNEIRO et al., 2013; RAJENDRAN; SU; DUBEY, 2012). Um estudo
realizado com amostras de T. gondii de galinhas de diferentes áreas geográficas do
Brasil mostrou a diversidade genética existente entre essas cepas isoladas, 58
genótipos em 149 cepas, enquanto que mais da metade das amostras dos Estados
Unidos estavam agrupadas dentro do tipo II, sendo apenas 18 genótipos em 253
cepas (DUBEY; SU, 2009).
É observado nas linhagens clonais uma relação entre o genótipo e perfil de
virulência, onde as cepas da linhagem I são extremamente virulentas, as demais, II e
III, são consideradas avirulentas (HOWE; SIBLEY, 1995b; SIBLEY; BOOTHROYD,
1992). Como as cepas atípicas não são clonais, não é possível correlacionar um
genótipo com um perfil de virulência.
1.5. Diagnóstico
O desenvolvimento do primeiro teste diagnóstico para toxoplasmose em 1948
por Sabin e Feldman, o dye test, permitiu extensos estudos epidemiológicos sobre a
incidência da infecção e se tornou claro que o T. gondii era prevalente em muitos
países (DUBEY, 2008). Em seguida, outros testes sorológicos para dosagem de IgM
foram aplicados, como ELISA, IFAT, ISAGA e MAT (DESMONTS; NAOT;
REMINGTON, 1981; DUBEY; DESMONTS, 1987; NAOT; REMINGTON, 1980;
REMINGTON, 1969), e em 1989, Burg e colaboradores, utilizaram a PCR como
método molecular para detecção de T. gondii, tendo como alvo o gene B1 do parasito.
A partir daí, diversos alvos moleculares vem sendo usados para o diagnóstico de
toxoplasmose (CAZENAVE et al., 1990; HOMAN et al., 2000; SAVVA et al., 1990).
Atualmente, o diagnóstico de toxoplasmose pode ser feito através de
microscopia, bioensaios, testes sorológicos, amplificação específica de DNA (por
exemplo, reação em cadeia da polimerase) ou histologia (LIU et al., 2015;
REMINGTON et al., 2006).
A microscopia é um método pouco sensível, mas que pode ser usado para
detectar T. gondii em amostras de água, solo, fezes e tecidos (LIU et al., 2015). O
bioensaio é utilizado para detecção direta do parasito em casos de diagnóstico pré-
natal e em pacientes imunossuprimidos, através de inoculação intraperitoneal do
21
material biológico em camundongos (BASTIEN, 2002; DESMONTS et al., 1952),
entretanto é uma técnica que demanda tempo, com risco de contaminação para o
manipulador e muito cara (YAI et al., 2003). O diagnóstico por histologia é feito através
da análise de seções de tecidos ou esfregaço de líquidos corporais, usando
principalmente a técnica da imunoperoxidase, que é sensível e específica por usar
anticorpos anti-T. gondii (CONLEY; JENKINS; REMINGTON, 1981; REMINGTON et
al., 2006)
Os testes sorológicos consistem na detecção de anticorpos específicos
produzidos pelo sistema imune contra o T. gondii. Existem diversas metodologias
disponíveis, como prova do corante (dye test), teste de aglutinação modificada
(modified agglutination test – MAT), ensaio de imunoabsorção enzimática (enzyme-
linked immunosorbent assays – ELISA), ensaio de aglutinação imunoabsorvente
(immunosorbent agglutination assay – ISAGA), teste de anticorpo fluorescente indireto
(indirect fluorescent antibody test – IFAT), ensaio de hemaglutinação indireta (indirect
haemagglutination assays – IHA), dentre outros (LIU et al., 2015). A diferenciação de
fase aguda e crônica é fundamental no diagnóstico de gestantes, pois na fase aguda
da doença pode ocorrer infecção do feto e a diferenciação pode ser feita através do
teste de avidez de IgG, já que os anticorpos IgG na fase aguda se ligam mais
fracamente ao antígeno que o IgG de fase crônica (DUBEY; BEATTIE, 1988;
HEDMAN et al., 1989).
Mais recentemente, os métodos moleculares vêm sendo utilizados para
complementar os métodos sorológicos tradicionais, já que esses possuem limitações
quando se tratam de pacientes imunocomprometidos ou em diagnóstico pré-natal (LIU
et al., 2015). A reação em cadeia da polimerase ou PCR (Polimerase Chain Reaction)
é uma amplificação enzimática in vitro de fragmentos específicos de DNA (SAIKI et
al., 1988). Nas últimas décadas, diferentes alvos foram escolhidos para detecção de
T. gondii. Em 1989, Burg et al., introduziram o gene B1 como um eficiente alvo para
PCR, já que era um gene com 35 repetições no genoma do parasito. Desde então, a
amplificação do gene B1 tem sido usada amplamente para detecção de T. gondii.
(HITT; FILICE, 1992; HOHLFELD et al., 1994; HO-YEN et al., 1992; LIN et al., 2000b;
MEGANATHAN et al., 2010). Entretanto, o B1 tem mostrado baixa especificidade, pois
pode amplificar DNA humano (KOMPALIC-CRISTO et al., 2004). Um novo alvo
consistindo de um fragmento de 529 pb repetido de 200 a 300 vezes no genoma (RE)
22
foi descrito por Homan et al., em 2000. Vários trabalhos demonstraram que reações
de PCR usando RE como alvo eram pelo menos 10 vezes mais sensíveis que as
usando o gene B1 (CASSAING et al., 2006; FALLAHI et al., 2014; REISCHL et al.,
2003). Mas apesar do RE ser mais sensível que o B1, existe a possibilidade de
algumas cepas terem perdido total ou parte das unidades de repetição, o que
compromete a eficiência da reação (WAHAB et al., 2010). Outro gene multi-cópia
também é usado, o rRNA, seja o 18S rDNA ou ITS-1 (Internal Transcribed Spacer)
(JAUREGUI; HIGGINS, 2001).
Existem variações da técnica da PCR que visam aumentar a sensibilidade para
que a menor quantidade possível de DNA seja detectada, como nested-PCR e real-
time PCR (LIU et al., 2015). O nested-PCR são duas reações de PCR consecutivas,
onde o produto para primeira serve como molde para a segunda e o real-time PCR
quantifica cada cópia gerada em cada ciclo usando sondas ou corantes intercalantes
(LIU et al., 2015). Além de métodos baseados em PCR, a detecção de T. gondii pode
ser realizada com o auxílio de outros métodos moleculares, como a amplificação
isotérmica em loop (Loop-mediated Isothermal Amplification – LAMP). O LAMP usa
uma DNA polimerase, Bst polimerase, e um conjunto de quatro primers especialmente
desenhados para reconhecer seis distintas sequências no DNA alvo (NOTOMI et al.,
2000).
Em razão da deficiência do diagnóstico em pacientes imunossuprimidos e fetal,
dos problemas já descritos nos primers da literatura, da gravidade da infecção
congênita e alto risco de reativação da doença em indivíduos imunossuprimidos, a
toxoplasmose representa um importante problema de saúde pública e por isso é
necessário um diagnóstico preciso para um tratamento eficaz a fim de evitar
morbidade e mortalidade causadas pela doença. Além disso, a genotipagem de cepas
proporciona informações moleculares além de entendimento sobre epidemiologia,
padrão de transmissão e mecanismos da doença.
23
2 OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Determinar novos alvos moleculares e desenvolver novos sistemas para detecção e
genotipagem de diferentes linhagens do T. gondii.
2.2. Objetivos específicos
Determinar os melhores alvos moleculares para detecção do T. gondii, por meio
da avaliação do índice de variabilidade de sequências de proteínas do T. gondii
disponíveis no GenBank;
Desenhar primers que sejam capazes de se anelar em regiões alvo
conservadas no genoma do T. gondii;
Padronizar um protocolo de PCR para detecção do T. gondii que apresente alta
sensibilidade, especificidade e que seja capaz de detectar o maior número de
variantes do parasita possível, incluindo um controle positivo;
Determinar novos alvos moleculares para genotipagem do T. gondii;
Desenhar primers que possibilitem a amplificação das regiões selecionadas
para genotipagem;
Desenvolver um novo método para genotipagem do T. gondii, que seja mais
simples que o método já existente, e que possibilite o armazenamento das
informações genéticas coletadas a cada análise.
24
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Comitê de Ética
Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte e aprovado sob número 36085414.1.0000.5537 e
submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte e aprovado sob número 46/2013.
3.2. Delineamento experimental
3.3. Parasitas e manutenção dos isolados in vivo
A etapa de isolamento e manutenção dos parasitos foi desenvolvida no
Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose da Universidade Federal do Rio
25
Grande do Norte. Os isolados de T. gondii utilizados foram: TgCkBrRN1 (Ck1),
TgCkBrRN2 (Ck2), TgCkBrRN3 (Ck3), obtidos de abatedouros de João Câmara – RN;
TgPgBrRN1 (Pg1), obtido de abatedouro em Natal – RN; e que foram caracterizados
como cepas atípicas (CLEMENTINO ANDRADE et al., 2013); RH e VEG, cepas
padrão representantes das linhagens I e III, respectivamente. Os isolados foram
mantidos através da inoculação de 150 cistos (para as cepas Ck1, Ck2, Ck3, Pg1,
VEG) ou 105 taquizoítos (para a cepa RH) intraperiotonealmente em camundongos
C57BL/6. Após três dias, os camundongos foram eutanasiados e os taquizoítos foram
recuperados do exsudato peritoneal. Em seguida, os parasitos foram cultivados em
células RAW 264.7 e observados diariamente em microscópio invertido.
3.4. Seleção e análise de sequências e desenho de primers.
Sequências nucleotídicas de alguns genes de T. gondii (Apêndice A) e do gene
que codifica a proteína actina de humanos e outros mamíferos (Bos taurus, Felis
catus, Capra hircus, Mus musculus) foram obtidas a partir do GenBank (BENSON et
al., 2005) e alinhadas com o auxílio da ferramenta MUSCLE (EDGAR, 2004) usando
as configurações padrão (gap open penalty -12, gap extension penalty -1). As
sequências alinhadas de T. gondii foram analisadas no programa MEGA 6.0
(TAMURA et al., 2013) para determinação do tamanho das sequências, o número de
sítios polimórficos e o número de sequências em cada alinhamento e por conseguinte,
determinação do IVG. Após a seleção da sequência alvo, seu respectivo alinhamento
foi utilizado como input para o desenho dos primers por meio dos softwares do
Geneious 9.0.4 (KEARSE et al., 2012) e primer-BLAST (YE et al., 2012), sendo este
último também utilizado para checar a especificidade dos primers, usando como
banco de dados os genomas de todos os organismos. Os softwares AutoDimer
(VALLONE; BUTLER, 2004) e RNAfold (GRUBER et al., 2008) foram usados para
checar a formação de dímeros e hairpins nos primers, respectivamente. Os critérios
de seleção dos primers foram: conteúdo G+C entre 40 e 60%, Tm próximas entre os
pares de primers, conter G ou C na extremidade 3’, não formarem dímeros e hairpins.
Análises adicionais foram realizadas na sequência alvo escolhida para detecção de T.
gondii, sendo essas realizadas pelos softwares Foldindex (PRILUSKY et al., 2005),
26
PredictProtein (YACHDAV et al., 2014), ProtScale (GASTEIGER et al., 2005) e
NetPhosK 2.0 (BLOM; GAMMELTOFT; BRUNAK, 1999).
3.5. Extração de DNA, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Eletroforese
O DNA utilizado para os experimentos de sensibilidade e cobertura foi extraído
do lisado da cultura de células RAW 264.7 e de sangue de participante humano
soronegativo para toxoplasmose de acordo com as especificações do kit QIAamp DNA
mini kit (QUIAGEN Inc., USA). Após a purificação, o DNA foi quantificado usando o
SpectraMax 190 Microplate Reader (Molecular Devices, USA). As duas reações do
nested-PCR foram realizadas em volume final de 20µl contendo 0,25 µM de cada
primer; 1,5 mM MgCl2; 1X de Buffer; 0,01U de Taq polimerase (Ludwig) e 0,2mM de
cada dNTP.
Os ciclos térmicos foram padronizados utilizando gradientes de temperaturas
para as etapas de anelamento e extensão. Os ciclos utilizados para as amplificações
foram os seguintes:
(1) Para os primers GRA7FE/GRA7RE e GRA7FI/GRA7RI: Desnaturação
inicial a 94ºC por 2 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 40
segundos, anelamento a 59ºC por 40 segundos e extensão a 63ºC por 40 segundos,
e extensão final a 63ºC por 3 minutos.
(2) Para os primers Oligo1/Oligo4 e Oligo2/Oligo3: Desnaturação inicial a
94ºC por 2 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 40 segundos,
anelamento a 63ºC por 40 segundos, extensão 68ºC por 40 segundos, e extensão
final a 68ºC por 3 minutos.
(3) Para os primers NF1/NR1 e NF2/NR2, respectivamente: Desnaturação
inicial a 94ºC por 2 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 40
segundos, anelamento a 68ºC por 40 segundos, extensão 69ºC por 40 segundos, e
extensão final a 69ºC por 3 minutos. Na reação nested, o ciclo térmico correspondeu
a uma desnaturação inicial de 94ºC por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de
desnaturação a 94ºC por 40 segundos, anelamento a 61ºC por 40 segundos, extensão
a 69ºC por 40 segundos, e extensão final a 69ºC por 3 minutos.
27
(4) Para os primers ACTAF/ACTAR: Desnaturação inicial a 94ºC por 2
minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 40 segundos, anelamento
a 53ºC por 40 segundos, extensão a 72ºC por 40 segundos, e extensão final a 72ºC
por 3 minutos.
Os géis de eletroforese foram feitos de agarose a 1,5%, corados com brometo
de etídio a 1%, sendo sempre aplicados 9 µl de amostra e 3 µl de azul 4x.
3.6. Análise das sequências de ROP5, ROP18 e GRA7
A partir dos alinhamentos das regiões codificantes dos genes ROP5, ROP18 e
GRA7, foi usado o DNAsp 5.10 (LIBRADO; ROZAS, 2009) para avaliar a razão de
substituições não sinônimas por substituições sinônimas (Pi(a)/Pi(s)). Para o gene
GRA7, o valor de window length e step size foi de 35. Para os genes ROP5 e ROP18,
os valores foram de 50. Com base na sequência de aminoácidos, algumas
características das proteínas ROP5, RPO18 e GRA7, como hidrofobicidade, presença
de domínios e regiões estruturadas foram preditas utilizando os softwares ProtScale
(GASTEIGER et al., 2005), ScanProsite (DE CASTRO et al., 2006) e Foldindex©
(PRILUSKY et al., 2005), respectivamente. O modelo de hidrofobicidade adotado para
configurar o ProtScale foi o de Kyte e Doolittle (KYTE; DOOLITTLE, 1982). O desenho
de primers para ROP5, ROP18 e GRA7 foi realizado mediante metodologia citada
acima no item 3.2.
28
4 RESULTADOS
4.1. Identificação de sequências conservadas no genoma do T. gondii
Inicialmente, sequências parciais ou completas de genes relacionados a
mecanismo de infecção e persistência foram selecionados do GenBank. As
sequências de micronema, grânulo denso, roptrias e antígeno de superfície foram
priorizadas por serem específicas de parasitos do táxon apicomplexa. (AJIOKA et al.,
1998; BLACKMAN; BANNISTER, 2001). Genes associados a resistência a drogas,
como diidrofolato redutase (DHFR) e diidropteroato sintase (DHPS), gene relacionado
a componente estrutural, beta-tubulina (BTUB) e sequências já usadas como
marcadores para PCR, como B1 e elemento repetitivo de 529 pb (RE) foram
selecionados para compor o conjunto inicial de sequências. Os números de acesso
de todas as sequências usadas nesse estudo estão descritos no Apêndice A. Mais da
metade das sequências selecionadas tem anotações, embora a pesquisa não tenha
sido restrita a sequências curadas.
As sequências selecionadas foram manualmente processadas e as respectivas
regiões codificantes alinhadas. O índice de variabilidade genética (IVG) de cada
sequência codificante foi calculado pela divisão do número de sítios polimórficos pelo
número de sequencias do alinhamento e dividindo o resultado pelo tamanho da
sequência codificante. Os valores de IVG obtidos estão apresentados sob a forma
gráfica na Figura 5 e os valores absolutos estão apresentados no Apêndice B. O
menor IVG observado foi em ROP12 e ROP14, indicando que esses genes são os
mais conservados dentre os analisados. Como mostrado na Figura 6, genes como
BTUB e DHFR também mostraram alta conservação. Dentre os genes mais
conservados, foi escolhido o gene GRA7 como marcador.
29
Figura 6. Variabilidade genética dos genes de T. gondii selecionados. Ranking dos genes selecionados
do menor para o maior IVG.
4.2. Desenho de primers e otimização dos protocolos para os nested-PCRs
Regiões conservadas dentro do gene GRA7 foram selecionadas do
alinhamento de 85 sequencias. O sistema desenvolvido compreende dois pares de
primers, o par externo amplifica um fragmento de 322 pb (do nt 139 ao 460 da
sequência codificante) e o par interno amplifica um fragmento de 222 pb (do nt 210 ao
431). Na Figura 7 está apresentado um esquema da proteína GRA7 com as regiões
conservadas e as regiões de anelamento dos primers destacadas.
30
Figura 7. Análise estrutural in silico de GRA7. Representação da sequência nucleotídica de GRA7,
sendo as regiões em laranja a representação de regiões conservadas e as setas pretas, a
representação da localização dos primers. Gráfico do Foldindex mostrando as regiões estruturadas em
verde e as não-estruturadas em vermelho. Gráfico do ProtScale mostrando os aminoácidos
hidrofóbicos (acima de zero) e hidrofílicos (abaixo de zero). Gráfico do PredictProtein mostrando a
presença de α-hélice em vermelho, possíveis regiões transmembrana em roxo, regiões desestruturadas
em verde e regiões expostas a solvente em azul. Gráfico do NetPhosK mostrando possíveis sítios de
fosforilação de treonina (azul), tirosina (roxo) e serina (verde), sendo a linha vermelha a representação
do treshold.
Conforme observado na Figura 7, a proteína GRA7 apresenta uma região
desestruturada, em vermelho no Foldindex e em verde no PredictProtein; e duas
regiões estruturadas, em verde no Foldindex. Essas regiões estruturadas possuem α-
hélice (em vermelho no PredictProtein) e possuem aminoácidos hidrofóbicos (valores
acima de zero no gráfico do ProtScale). A região onde os primers se anelam (setas
pretas), compreendem regiões conservadas (região laranja) dentro do gene e análise
do NetPhosK mostrou que essas regiões apresentam sítios de fosforilação e o
31
ProtScale mostrou a presença de aminoácidos hidrofílicos. As sequências e demais
características dos primers estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Lista dos primers usados para as amplificações por PCR
As temperaturas ideais de anelamento e extensão para cada par de primers
(Tabela 3) foram definidos com base em um gradiente de nove temperaturas, variando
de 48,8 ºC a 70ºC. A padronização também foi realizada para determinar as melhores
condições de amplificação para os marcadores previamente descritos de B1 e RE
(Tabela 2) (BURG et al., 1989; KONG et al., 2012). A primeira etapa foi padronizada
para permitir o máximo de especificidade. Todas as reações foram padronizadas para
amplificar um único fragmento resultando em uma banda intensa de 322 pb, 420 pb e
198 pb usando os primers para GRA7, RE e B1, respectivamente. A segunda etapa
(também chamada de nested-PCR) foi padronizada de maneira a obter o máximo de
sensibilidade. A presença de aditivos pode eliminar fragmentos inespecíficos, mas
também diminuem a sensibilidade do ensaio e por isso não foram adicionados em
nenhuma das reações durante a padronização.
Primer Alvo Sequência (5’ – 3’) Tamanho do primer
Tm (ºC)
Referência
ACTAF
ACTAR
Actina TGGAAAAGATCTGGCACC
TCCTGTTTGCTGATCCAC
18 pb
18 pb
54,44
54,48 Este estudo
GRA7FE
GRA7RE
GRA7FI
GRA7RI
GRA7
CAAGCACCCGTTGACAGTCT
ACGATGCACCCATACCAACAG
CACCAGCATGGATAAGGCATC
GCGAGCTTCTTCAGCAAGTCT
20 pb
21 pb
21 pb
21 pb
60,53
60,68
59,12
60,94
Este estudo
Oligo 1
Oligo 4
Oligo 2
Oligo 3
B1
GGAACTGCATCCGTTCATGAG
TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC
TGCATAGGTTGCAGTCACTG
GGCGACCAATCTGCGAATACACC
21 pb
20 pb
20 pb
23 pb
59,33
56,41
58,19
64,19
BURG et al.,
1989
NF1
NR1
NF2
NR2
RE
TGACTCGGGCCCAGCTGCGT
CTCCTCCCTTCGTCCAAGCCTCC
AGGGACAGAAGTCGAAGGGG
GCAGCCAAGCCGGAAACATC
20 pb
23 pb
20 pb
20 pb
68,87
66,31
60,91
62,55
KONG et al.,
2012
32
Tabela 3. Ciclos de PCR usados neste estudo
a Os estágios de desnaturação, anelamento e extensão foram repetidos 30 vezes
4.3. Comparação de sensibilidade entre os protocolos de B1, RE e GRA7
A sensibilidade do protocolo de GRA7 foi comparada com os protocolos usados
para amplificar B1 e RE. Uma diluição seriada de 1:40 mostrou que os protocolos para
RE e GRA7 têm sensibilidade semelhante. A presença de DNA de T. gondii pôde ser
detectado até a diluição quatro no nested-PCR (Figura 8 A e B). Em relação ao
protocolo do B1, ele apresentou sensibilidade um pouco melhor, amplificando até a
diluição cinco (Figura 8C).
Figura 8. Teste de sensibilidade. Diluição seriada 1:40 (linhas 1 – 9) usando DNA total extraído de
células RAW 264.7 infectadas com T. gondii como molde para determinar a sensibilidade de (A) nested-
PCR usando primers para GRA7; (B) nested-PCR usando primers para RE; (C) nested-PCR usando
primers para B1. Dentro de cada chave, as figuras dos géis da parte de cima correspondem a primeira
etapa e as figuras de baixo, correspondem a segunda etapa. As setas indicam os amplicons esperados
de cada reação e seus correspondentes tamanhos estão mostrados a direita. M, peso molecular de
100 pb.
Etapa 1 e 2 – B1 Etapa 1 - RE Etapa 2 - RE Etapa 1 e 2 – GRA7 Actina Desnaturação inicial 94ºC – 2 min 94ºC – 2 min 94ºC – 2 min 94ºC – 2 min 94ºC – 2 min
Desnaturação 94ºC – 40s 94ºC – 40 s 94ºC – 40s 94ºC – 40s 94ºC – 40s Anelamento 63ºC – 40s 68ºC – 40s 61ºC – 40s 59ºC – 40s 53ºC – 40 s
Extensão 68ºC – 40s 69ºC – 40s 69ºC – 40s 63ºC – 40s 72ºC – 40 s Extensão final 69ºC – 3 min 69ºC – 3 min 69ºC – 3 min 63ºC – 3 min 72ºC – 3 min
33
4.4. Comparação de cobertura entre os protocolos de B1, RE e GRA7
A eficiência de cada protocolo em detectar cepas geneticamente diversas foi
avaliado usando DNA total de cepas RH, VEG, Ck1, Ck2, Ck3 e Pg1. Os quarto
últimos isolados foram obtidos de animais de fazenda no Brasil e foram previamente
caracterizadas como atípicas (CLEMENTINO ANDRADE et al., 2013). Na Figura 9A,
está claro que o protocolo para GRA7 resultou em bandas fortes quando comparado
com RE (Figura 9B) e B1 (Figura 9C). A eficiência dos primers para GRA7 é mais
evidente na identificação dos isolados atípicos Ck1, Ck3 e Pg1 (linhas 3, 5 e 6 na
Figura 9), que apresentaram bandas mais fracas no protocolo do B1 e RE. As cepas
possuíam concentração de DNA diferentes entre si, mas a mesma concentração de
DNA foi usada para cada nested-PCR. Foi observado amplificação no controle
negativo na segunda etapa do protocolo do B1, por isso, os primers da primeira e
segunda etapa foram testados separadamente e em reação nested-PCR. Quando
testados separadamente, os primers funcionaram normalmente, mas quando testados
em nested-PCR, amplificaram uma banda de ~97 pb quando usado DNA total extraído
de sangue ou água como molde (Figura 10A). Essa amplificação foi intermitente e a
possibilidade de contaminação não foi excluída, mas acredita-se que essa banda seja
proveniente de auto amplificação de primers.
O par de primers para detectar o gene da actina (Tabela 2) foi usado como
controle positivo da extração de DNA, detectando o DNA do hospedeiro na amostra
(Figura 9D).
34
Figura 9. Teste de cobertura. (A) nested-PCR usando primers para GRA7; (B) nested-PCR usando
primers para RE; e (C) nested-PCR usando primers para B1, as reações foram testas com DNA total
de células de cultura RAW 264.7 infectadas com seis isolados de T. gondii (Linhas 2-7). (D) Actina foi
usada como controle positivo da extração de DNA e eficiência da reação. A linha 8 representa o controle
negativo de DNA extraído de sangue humano não-infectado. Os amplicons esperados estão indicados
pelas setas e seus correspondentes tamanhos estão à direita. M, marcador de peso molecular de 100
pb.
Figura 10. Teste de especificidade do protocolo que utiliza os primers para B1. (A) Primers testados
separadamente (externos e internos) e como nested-PCR. A, água; +, DNA de T. gondii; -, DNA
soronegativo (B) AutoDimer mostrando anelamento de primers para B1 na extremidade 3’.
35
4.5. Identificação de novos marcadores moleculares para genotipagem do T. gondii
Inicialmente, foi identificado o maior número possível de proteínas que já
tenham função descrita que esteja relacionada às características de virulência do T.
gondii. Todos os genes identificados e os respectivos complexos de virulência
identificados estão listados na Tabela 1 da introdução desta dissertação.
Os genes ROP5, ROP18 e GRA7 foram selecionados de um conjunto de genes
que estão relacionados com virulência em T. gondii por serem os mais descritos na
literatura. No intuito de se identificar apenas as regiões mais informativas de cada
sequência, as sequências de nucleotídeos desses genes foram analisadas no DNAsp
5.10 e foi observada a presença de regiões dentro das proteínas que estão sob
seleção positiva (Figura 11).
A predição da estrutura secundária das proteínas ROP5, ROP18 e GRA7 foi
analisada com o auxílio dos softwares Foldindex e ProtScale, no intuito de se
caracterizar as regiões proteicas que estão sob seleção positiva. A análise com o
software Foldindex revelou que todas as proteínas mostraram regiões estruturadas
principalmente na extremidade C-terminal (Figura 11), e que essas regiões
estruturadas coincidem com as regiões sob seleção positiva. Além disso, pela análise
utilizando-se o software ProtScale é possível observar que as regiões sob seleção
positiva compreendem principalmente os picos hidrofóbicos, indicando que podem
estar "enterradas" na estrutura das proteínas. Uma análise de domínios feito pelo
ScanProsite revelou que tanto ROP5 e ROP18 apresentam domínios quinase,
entretanto, em ROP5 esse domínio não é ativo (Figura 11), e esses domínios também
coincidem com as regiões de seleção positiva e regiões estruturadas. Já GRA7 não
apresenta nenhum domínio conhecido.
36
Figura 11. Análises in silico de ROP5, ROP18 e GRA7. (A) Gráficos gerados pelo DNAsp 5.10, que
avaliou a razão de substituições não sinônimas por substituições sinônimas (Pi(a)/Pi(s)). Os picos
acima de 1 representam seleção positiva. (B) Gráfico do Foldindex mostrando as áreas estruturadas
em verde e as não-estruturadas em vermelho. (C) Gráfico do ProtScale mostrando a hidrofobicidade
dos aminoácidos. Acima de 0, hidrofóbico; abaixo de 0, hidrofílico. (D) Figura do ScanProsite mostrando
os domínios encontrados.
4.6. Análise dos polimorfismos das regiões sob seleção positiva
As regiões sob seleção positiva foram escolhidas para serem analisadas pois
estão associadas a regiões estruturadas das proteínas que podem estar envolvidas
diretamente com seus mecanismos de ação e, consequentemente, a virulência. Com
isso, seria possível separar a linhagens clonais umas das outras e das cepas atípicas
e correlacionar com o fenótipo de virulência. Para cada gene, foi desenhado um par
de primers, que estão listados na Tabela 4, assim como as respectivas temperaturas
de melting (Tm) e os tamanhos dos amplicons, para serem aplicados na prática. Os
polimorfismos de cada fragmento foram mapeados para serem usados para
diferenciar cada cepa (Tabela 5). Usando as informações de cada fragmento, foi
possível determinar se determinada cepa pertence a alguma linhagem clonal ou é uma
cepa atípica. Além disso, a informação contida no fragmento de GRA7 foi suficiente
para diferenciar todas as seis cepas usadas como exemplo (Tabela 5).
37
Tabela 4. Primers usados na amplificação dos fragmentos de ROP5, ROP18 e GRA7
Tabela 5. Sítios de substituições não-sinônimas dos fragmentos de ROP5, ROP18 e GRA7
Nome do Primer
Sequência 5’ – 3’ Tm (ºC) Tamanho
do amplicon
ROP5F CACGGCAACATTTACACACG 58,3 227 pb
ROP5R GCCTATCGAAGTTGAGGAACC 58,4
ROP18F TCAAGCTCAGGGAATTGTGC 58,5 365 pb
ROP18R GGAGCATCCGTTTCTGAGG 57,9
GRA7FI CACCAGCATGGATAAGGCATC 59,1 442 pb
GRA7R CTGCCGTGATCTGTTTTTGC 58,3
ROP5
ROP5A
Cepas 452 453 460 472 473 480 488 490 491 493 494 495 500 503
Tipo I S I F G S L S F P A P V E I Tipo II S I V R T R L D S I P V Q T Tipo III S I V G S L S F P A P V E I P89 S I V G S L S F P A P V E I CAST S I F G S L S F P A P V E I GUYKOE S I V G S R P F S T R L Q I
ROP18
Cepas 413 432 433 439 442 451 454 455 456 457 458 459 463 481 498 510 515
Tipo I A R I R G R Q A T G I T P R P S D Tipo II A R I P G R Q T T D I T T R P N E Tipo III P K T P G Q H S Y G V T A S S N E P89 P K T P G Q H S Y G V T A S S N E CAST A R I R G R Q A T G I T P R P S D GUYKOE A R I R G R Q A T G I I P R P S D
GRA7
Cepas 83 96 106 115 120 129 160 161 167 170 172 176 178 182 185 194 197 199 201 202
Tipo I P E R N H K L V E R D T G G L A L M L T Tipo II P E R N H K I L Q T E T G S L A L M L T Tipo III P E G H N K I L Q T D S G S I A L L I K P89 P E G H N K I L Q T D S G S I V L L I K CAST P E G H H M I M Q A D T G N L V L L I K GUYKOE P E R N H K I L Q A E T S N L A L M L T
38
5 DISCUSSÃO
Nesse estudo, o gene GRA7 foi escolhido como um alvo promissor para
identificação do T. gondii, dentre os genes avaliados, pelos seguintes fatos: (i) o gene
GRA7 possui o maior número de sequencias disponíveis, fornecendo uma
representação significativa de vários isolados, incluindo sequencias de cepas clonais
e atípicas de vários países; (ii) GRA7 é específico de T. gondii e Hammondia
hammondi sem nenhum outro homólogo conhecido entre os apicomplexa. Em uma
análise no primer-BLAST por especificidade dos primers, foi encontrada uma
equivalência (primers GRA7FE e GRA7RE) com H. hammondi, que é um organismo
relacionado ao T. gondii (FRENKEL; DUBEY, 1975; WALZER et al., 2013).
Entretanto, apesar da equivalência, na extremidade 3’ de ambos os primers existe
uma disparidade dos nucleotídeos, o que pode diminuir a eficiência da amplificação
(HUANG; ARNHEIM; GOODMAN, 1992); (iii) Regiões conservadas estão distribuídas
por toda extensão do gene, fornecendo excelentes alvos para o desenho de primers.
As regiões conservadas onde os primers foram desenhados correspondem a
regiões não-estruturadas da proteína GRA7 que é rica em aminoácidos hidrofílicos e
que apresentam sítios de fosforilação. Formas fosforiladas de GRA7 já foram descritas
e essa fosforilação ocorre dentro da célula hospedeira e isso pode estar regulando a
associação da GRA7 a outras proteínas (DUNN et al., 2008). Como essa região é
conservada em todas as sequências analisadas, a fosforilação da GRA7 deve ser um
evento fundamental para o desenvolvimento do parasito dentro da célula.
Apesar de na literatura ser relatado que primers para o elemento repetitivo
podem ser até 10 vezes mais sensíveis que primers para B1, devido ao seu grande
número de repetições encontrados no genoma do T. gondii (CASSAING et al., 2006;
FALLAHI et al., 2014; REISCHL et al., 2003), os primers desenhados neste estudo
para o gene GRA7 mostraram a mesma sensibilidade que os usados para o elemento
repetitivo. Esse fato evidencia a eficiência desses primers, principalmente por não
haver relatos do gene GRA7 ser um gene com várias cópias no genoma do T. gondii,
como os citados acima (BURG et al., 1989; HOMAN et al., 2000). Como foram usadas
as mesmas concentrações de DNA de cada cepa para cada nested-PCR e mesmos
volumes de amostras aplicadas no gel, as bandas mais fortes vistas na primeira etapa
39
do GRA7 reforçam a eficiência da amplificação com esses primers. Possivelmente, a
conservação das regiões onde eles foram desenhados permitiu um aumento na
sensibilidade da reação.
A amplificação do controle negativo no protocolo do B1 levantou a hipótese de
auto amplificação de primers, já que o resultado do AutoDimer mostrou anelamento
entre duas moléculas do primer forward com a extremidade 3’ livre, que poderia levar
à amplificação de um fragmento inespecífico. Outros problemas já foram relatados
para primers para B1, como baixa especificidade do primer para B1, descrito por Burg
et al., em que ele anela ao DNA humano (KOMPALIC-CRISTO et al., 2004). Os
primers para RE também podem apresentar problemas, pois foi relatado que, em
algumas cepas, as unidades de repetição do RE podem ter sido deletadas parcial ou
totalmente, comprometendo a detecção do T. gondii (WAHAB et al., 2010). Associado
a isso, muitos dos primers já descritos foram desenhados ou em sítios polimórficos ou
com base em uma única sequência (Apêndice D). Consequentemente, os primers
desenvolvidos anteriormente podem não ser efetivos na detecção de cepas
geneticamente diversas e é nesse ponto onde os primers para GRA7 se destacam,
na detecção de cepas atípicas, que são predominantemente isoladas na América do
Sul (CARNEIRO et al., 2013; RAJENDRAN; SU; DUBEY, 2012).
Com essa informação, o diagnóstico preciso é fundamental principalmente em
casos nos quais o diagnóstico sorológico não é recomendado: em pacientes
imunossuprimidos e na detecção de infecção do feto (LIU et al., 2015). Em pacientes
imunossuprimidos, os títulos de IgG não são capazes de diferenciar infecção aguda
de infecção latente (LUFT et al., 1984) e os testes sorológicos de sangue de cordão
umbilical tem baixa sensibilidade (FOULON et al., 1999). Nesse aspecto, o diagnóstico
por PCR seria a melhor alternativa, já que os métodos utilizados preferencialmente
nesses casos, biópsia e bioensaio, respectivamente, são métodos que demandam
tempo e custo, além de que o bioensaio envolve risco de contaminação para
manipulador e a biópsia é um método invasivo que pode acarretar em danos
neurológicos ao paciente (SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al., 1993; YAI et al.,
2003).
Já em relação à genotipagem, atualmente é feita através do PCR-RFLP, onde
ocorre amplificação de 12 fragmentos de genes do T. gondii, seguido de restrição
enzimática e visualização das bandas em gel de eletroforese (GAJRIA et al., 2008;
40
SU; ZHANG; DUBEY, 2006). O PCR-RFLP envolve quatro etapas até o resultado
final: amplificação por PCR do alvo, gel de eletroforese para conferir a amplificação,
restrição enzimática do produto de PCR e mais um gel de eletroforese para correr o
produto da digestão (SU; ZHANG; DUBEY, 2006). Durante alguma dessas etapas
podem ocorrer erros, principalmente na etapa de restrição, onde se tem 12
marcadores para uma amostra e cada marcador é tratado com enzimas diferentes,
tampões diferentes, com tempo e temperatura de incubação específicas e diferentes
umas das outras. Já o método proposto neste estudo, consiste apenas em
amplificação por PCR do alvo, gel de eletroforese e sequenciamento do produto de
PCR, além de ser utilizado apenas três marcadores.
O PCR-RFLP, por usar enzimas de restrição, se baseia apenas nas mutações
que se encontram nos sítios de restrições das mesmas, ou seja, toda a informação
contida no restante do gene é ignorada. Como o método descrito aqui leva em
consideração fragmentos de genes de virulência que estão sob seleção positiva, o
número de mutações presente é considerável e, com o sequenciamento, é possível
levar em consideração a informação de todas essas mutações. Esse método é bem
semelhante ao MVLST (Multi-Virulence-Locus Sequence Typing), que também
sequencia genes de virulência e é usado principalmente para tipagem de bactérias
(SHARIAT et al., 2013; ZHANG et al., 2004), a diferença é que neste trabalho foram
escolhidas regiões sob seleção positiva e sabe-se que a utilização de genes que são
polimórficos em métodos de tipagem aumentam o poder de discriminação da tipagem
(SU et al., 2010; ZHANG et al., 2004). Acrescenta-se as essas vantagens o fato de se
obter grande densidade de informação em um fragmento relativamente pequeno da
sequência.
O conjunto de genes utilizados neste estudo pode ser modificado, genes que
possuem mais alelos podem substituir ou acrescentar os utilizados, a fim de aumentar
a capacidade de discriminação. Mas vale salientar que o gene GRA7 se mostrou
bastante polimórfico, sendo capaz de distinguir as cepas usadas, isso mostra sua
capacidade informativa e merece ser estudado mais a fundo, a fim de avaliar o quão
bem ele consegue distinguir as cepas de T. gondii. Assim como a abordagem do MLST
(Multilocus Sequence Typing), que possui uma ferramenta on line (disponível em
http://www.mlst.net/) que permite os usuários depositarem os alelos correspondentes
de cada gene e obterem o sequence type dos isolados, ferramenta semelhante está
41
sendo desenvolvida para ser usada para a genotipagem de T. gondii e como um banco
de dados para ROP5, ROP18 e GRA7.
42
6 CONCLUSÃO
Com esse estudo foi possível concluir que a detecção de T. gondii utilizando o
gene GRA7 como marcador molecular é tão sensível quanto aquela utilizando os
marcadores amplamente descritos na literatura, B1 e RE, e que é mais eficiente na
detecção de cepas atípicas.
A genotipagem por meio da análise de regiões sob seleção positiva em genes
envolvidos em mecanismos de virulência se mostrou uma alternativa promissora
para genotipagem, e foi eficiente para discriminar as cepas clonais I II e III com um
número menor de marcadores que o método tradicionalmente usado.
43
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60
APÊNDICE A – Números de acesso das sequências utilizadas
nesse estudo
Gene Número de
sequências
Número de acesso
B1 9 EU340873; EU340877; EU340875; KF413760; KF413761; EU340879;
EU340882; EF564276; EU341712
BTUB 17 JX045461; JX045462; JX045453; JX045454; JX045466; JX045452;
JX045446; JX045447; JX045459; JX045456; JX045457; M20025;
JX045469; JX045455; JX045467; JX045468; JX045460
DHFR 12 GQ397461; GQ397456; GQ397457; GQ397452; GQ395777; GQ397454;
GQ395776; GQ395774; GQ397455; GQ397453; GQ395773; GQ395775
DHPS 10 GQ415585; GQ415577; XM_002365108; GQ415579; GQ415578;
GQ415576; GQ415575; GQ415574; U61852; HM536197
GRA1 4 HM067753; M26007; AK318045; XM_002365660
GRA2 6 HM014012; AK318019; XM_002366354; M99392; L01753; J04018
GRA3 20 JX044177; JX044175; JX044176; XM_002366330; JX044172; JX044173;
JX044164; JX044166; JX044153; JX044154; JX044165; JX044157;
JX044158; EF552406; AF414079; JX044161; JX044159; JX044160;
JX044162; JX044163
GRA4 4 M76432; XM_002364283; AK317865; EU660037
GRA5 6 L06091; XM_002369230; AK318131; EU918733; EU918734; EU918735
GRA6 93 DQ187387; AY964058; AY964059; X96720; EF512264; L33814;
JX044237; JX044241; JX044238; JX044239; AB235431; AF239283;
JN649063; EF512247; EF512248; EF512232; EF512233; AB235433;
AF239287; AF239289; EF512242; EF512241; EF512230; EF512231;
AB235428; AF239286; AF239290; AF239288; AF239292; JN649066;
JN649064; EF512263; EF512249; EF512250; EF512225; EF512226;
AB235429; AF239291; EF512234; EF512258; AB235434; AB235432;
EF512240; XM_002371898; EU180619; EU180620; DQ512729;
AB471758; AF239284; AF239285; AJ635332; AJ635336; AB235430;
AB235426; JX044231; JX044232; JX044198; JX044199; JX044178;
JX044179; JX044226; JX044227; AB235435; JX044229; JX044230;
JX044212; JX044207; JX044208; JX044201; JX044202; JX044197;
EF512227; EF512228; JX044193; JX044194; JX044195; AJ635335;
AJ635333; FJ455444; GU325790; AJ635334; GU325791; JX044186;
JX044187; GU139480; GU139485; GU139483; GU139482; GU139484;
EF585706; EF585707; GU139481; KC928255
GRA7 85 JX045634; JX045635; JX045619; JX045620; JX045608; JX045609;
JX045595; JX045604; JX045605; JX045596; JX045598; JX045585;
JX045586; AK317819; XM_002367572; JX045589; JX045590; JX045578;
JX045579; DQ459452; DQ459456; EU157155; DQ459454; DQ459455;
U79158; EU157156; EU157143; EU157144; EU157171; EU157170;
EU157178; EU157149; EU157167; DQ459453; EU157166; JX045628;
JX045629; Y13863; JX045614; JX045615; EF626965; EF626966;
DQ459445; DQ459446; DQ465955; DQ459450; DQ459451; EU157179;
EF639859; DQ459443; EU157183; EU157141; EU157146; JX045613;
EU157151; EU157152; EU157162; EU157164; EU157153; EU157154;
DQ459448; DQ459449; EU157157; JX045597; EU157163; EU157172;
JX045583; JX045584; EU157142; EU157148; EU157175; EU157150;
EU157177; DQ473315; JX045600; JX045601; HM016952; JX045599;
JX045573; JX045574; DQ872520; HQ852155; HQ852156; HQ852158;
HQ852159
61
GRA8 4 XM_002369485; AK318497; AF150729; DQ835668
GRA9 3 XM_002367354; AY371455; AJ223585
GRA10 2 XM_002365542; AY769952
GRA11 2 XM_002372050; DQ792507
GRA12 2 FJ011096; AK318503
GRA14 2 FJ015061; AK317905
GRA15 3 TGGT1_275470; TGME49_275470; TGVEG_275470
MIC3 9 AJ132530; DQ676961; DQ676960; DQ676959; XM_002369792;
AF509564; EU572718; JF330835; KF153103
MIC4 15 FJ785470; FJ785466; FJ785469; FJ785467; FJ785464; FJ785462;
FJ785468; FJ785463; FJ785465; AF143487; AK318267; XM_002369565;
FJ785461; FJ785460; FJ785459
MIC6 3 AF110270; XM_002370595; AK318343
MIC10 3 AF293654; XM_002367312; AK318393
MIC11 3 AF539702; AK318155; XM_002367684
MIC13 15 JN995561; JN995546; JN995544; JN995557; JN995556; JN995547;
JN995550; JN995551; JN995558; JN995553; JN995560; JN995554;
JN995549; JN995545; JN995559
ROP1 4 M71274; XM_002364175; AY661790; AF350261
ROP2 4 DQ923323; AK318335; XM_002371885; Z36906
ROP4 3 EU047558; AY662677; Z71787
ROP5 60 EF466101; HQ916453; XM_002371884; DQ116423; BK008047;
BK008045; HQ916458; BK008044; BK008043; JQ743764; BK008046;
HQ916457; JQ743777; BK008057; BK008053; HQ916454; JQ743771;
JQ743769; JQ743767; HQ916452; HQ916451; JQ743774; JQ743775;
JQ743772; JQ743776; BK008052; BK008056; JQ743746; JQ743744;
JQ743737; HQ916448; JQ743747; HQ916450; JQ743741; JQ743763;
JQ743743; JQ743739; JQ743762; JQ743757; JQ743758; JQ743761;
JQ743778; JQ743740; JQ743753; HQ916459; HQ916456; JQ743738;
JQ743742; BK008055; HQ916460; HQ916455; JQ743756; JQ743755;
JQ743754; JQ743783; JQ743782; JQ743780; JQ743781; JQ743779;
JQ743745
ROP6 2 AY792971; XM_002365039
ROP7 19 AM056071; JF831539; JF831543; JF831553; JF831537; JF831544;
JF831541; JF831552; JF831551; JF831548; JF831547; JF831542;
JF831540; JF831538; JF831536; FJ194943; JF831554; JF831549;
JF831550
ROP8 5 XM_002370855; HM003613; HM003615; HM003616; HM003614
ROP9 3 AK317939; XM_002366831; AJ401616
ROP10 3 EF447219; XM_002364687; DQ124368
ROP11 3 KC456639; XM_002366363; DQ077905
ROP12 2 XM_002367640; DQ096559
ROP13 15 JN051291; JN051288; JN051285; JN051283; JN051279; JN051282;
JN051280; JN051286; JN051289; XM_002364408; JN051281;
JN051287; JN051278; JN051290; JN051284
ROP14 2 XM_002364660; DQ096565
ROP15 4 EF447218; AK317928; XM_002371223; DQ096561
ROP16 16 GQ24909; GQ249083; GQ249088; GQ249090; GQ249082; DQ116422;
XM_002365332; GQ249081; GQ249092; GQ249087; GQ249089;
GQ249086; GQ249093; GQ249095; GQ249094; GQ249091
ROP17 5 AM075203; XM_002365031; KC997178; KC997176; KC997177
ROP18 24 GQ243216; GQ243210; JX045318; JX045319; GQ243211; GQ243207;
GQ243215; GQ243209; GQ243208; GQ243205; GQ243213; JX045345;
62
AM075204; GQ243202; JX045344; GQ243204; JX045334; JX045335;
GQ243206; GQ243203; JX045346; JX045347; EF092842; JX045354
SAG1 40 AY187278; S63900; AK317969; GQ253080; GQ253083; GQ253074;
GQ253076; FJ455529; DQ872518; JX045363; DQ872517; JX045390;
JX045392; JX045391; JX045393; JX045355; JX045357; JX045397;
JX045398; JX045395; JX045396; JX045394; HM776940; GQ253086;
GQ253075; GQ253073; X14080; JX045356; JX045421; XM_002368164;
S73634; AY217784; AY661791; EF140712; AF110182; AY651825;
DQ077664; DQ077665; EU700308; JX013909
SAG2 55 AK317818; AF249697; M33572; AF249698; AF249696; AF357578;
AF357582; AF357580; AF357581; AF357577; AF357579; JX045474;
JX045473; JX045472; JX045470; JX045471; JX045492; JX045493;
JX045491; JX045490; JX045489; FJ207520; JX045494; FJ207519;
Y187279; EU650330; EU650329; EU258521; EU258523; EU258533;
EU258520; EU258531; EU258522; EU258528; EU258519; KJ524441;
AB667972; AB667973; AB667974; DQ000461; AY707925; AY707928;
AY941252; AY707930; AY707926; AY707927; KC928258; EU053941;
EU053943; EU053942; EU053944; EF585701; EF585702; EF585703;
AY707929
SAG3 47 L21720; XM_002371878; AK317978; AY187280; HQ291784; AF340227;
HM585285; AF340229; JF312642; AF340228; JX218225; GU249509;
GU139476; GU139477; JX218227; GU249510; JX218226; GU139472;
GU139466; GU139468; GU139479; GU139478; GU139464; GU139463;
EF585688; EF585689; GU139467; GU139475; GU139469; GU139473;
HM133638; GU139471; GU139465; KC928250; EF585685; EF585686;
GU139470; HM133637; EF585694; EF585683; EF585684; KC928251;
GU139474; GU139462; KC928254; KC928253; KC928252
SAG4 5 Z69373; XM_002371410; AF340224; AF340225; AF340226
SAG5A 4 AY190529; AY299532; AY299529; AY299530
SAG5C 5 AY299534; AY299539; AY299535; AY299536; AY299538
SAG5D 7 AY190530; AY299528; AY299523; AY299524; XM_002368526;
AY299527; AY190528
63
APÊNDICE B – Números de sequências, sítios polimórficos e
tamanho de sequência usados para calcular o Índice de
variabilidade genética (IGV)
Genes Nº de
sequências
Nº de sítios
polimórficos
Tamanho da
sequência (nt)
IGV
ROP12 2 0 711 0
ROP14 2 0 3186 0
BTUB 17 6 1349 0.000262
DHFR 12 3 786 0.000318
MIC11 3 1 615 0.000542
ROP4 3 3 1737 0.000576
GRA7 85 37 708 0.000615
GRA9 3 2 957 0.000697
DHPS 10 7 976 0.000717
GRA2 6 3 558 0.000896
SAG3 47 50 1155 0.000921
ROP9 3 3 1062 0.000942
MIC4 15 25 1743 0.000956
GRA6 93 67 693 0.00104
SAG2 55 33 561 0.00107
MIC10 3 2 597 0.001117
SAG1 40 46 1008 0.001141
MIC6 3 4 1050 0.00127
ROP8 5 11 1728 0.001273
GRA12 2 4 1311 0.001526
MIC3 9 15 1080 0.001543
ROP11 3 8 1548 0.001723
ROP5 60 178 1653 0.001795
ROP7 19 66 1728 0.00201
GRA14 2 5 1227 0.002037
ROP6 2 7 1694 0.002066
MIC13 15 47 1407 0.002227
GRA3 20 30 663 0.002262
ROP13 15 44 1203 0.002438
GRA15 3 15 1908 0.002621
ROP16 16 94 2124 0.002766
GRA10 2 15 2687 0.002791
SAG5D 7 22 1089 0.002886
ROP15 4 11 924 0.002976
ROP10 3 16 1761 0.003029
ROP18 24 138 1671 0.003441
ROP17 5 34 1827 0.003722
GRA1 4 10 573 0.004363
64
GRA5 6 10 363 0.004591
GRA4 4 24 1038 0.00578
GRA11 2 27 2259 0.005976
GRA8 4 20 807 0.006196
SAG4 5 16 516 0.006202
RE 16 53 534 0.006203
SAG5A 4 29 1089 0.006657
B1 9 32 502 0.007083
SAG5C 5 40 1104 0.007246
ROP1 4 55 1368 0.010051
ROP2 4 95 1698 0.013987
65
APENDICE C – Tabela com primers descritos na literatura para B1 e
RE
Primers descritos para B1
Primer Sequência 5’ – 3’ Número de sequências disponíveis
Referência
Oligo 1*
Oligo 4*
Oligo 2*
Oligo 3*
GGAACTGCATCCGTTCATGAG
TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC
TGCATAGGTTGCAGTCACTG
GGCGACCAATCTGCGAATACACC
1
1
1
1
Burg et al. 1989
SN
SN
CTGGCAAATACAGGTGAAATG
GTGTACTGCGAAAATGAATCC
21
16 Melo et al. 2010
SN
SN
AGAGACACCGGAATGCGATCT
TTCGTCCAAGCCTCCGACT
ND
ND Fekkar et al. 2011
TOXO-F
TOXO-R
TCCCCTCTGCTGGCGAAAAGT
AGCGTTCGTGGTCAACTATCGATTG
1
1 Lin et al. 2000
SN
SN
TCGAAGCTGAGATGCTCAAAGTC
AATCCACGTCTGGGAAGAACTC
1
1 Lass et al. 2012
Pml/S1
Pml/AS1
Pml/S2
Pml/AS2
TGTTCTGTCCTATCGCAACG
ACGGATGCAGTTCCTTTCTG
TCTTCCCAGACGTGGATTTC
CTCGACAATA CGCTGCTTGA
1
4
1
11
Grigg and Boothroyd 2001
23 mer
25 mer
GGAGGACTGGCAACCTGGTGTCG
TTGTTTCACCCGGACCGTTTAGCAG
1
1 Costa et al. 2000
JW63
JW62
GCACCTTTCGGACCTCAACAACCG
TTCTCGCCTCATTTCTGGGTCTAC
1
1
Pelloux et al. 1997
B22
B23
AACGGGCGAGTAGCACCTGAGGAGA
TGGGTCTACGTCGATGGCATGACAAC
1
1 Hohlfeld et al. 1994
B1-1
B1-2
TCTCTCAAGGAGGACTGGCA
GTTTCACCCGGACCGTTTAG
1
1
Costa and Bretagne 2012
B1F1
B1R1
B1F2
B1R2
CCGTTGGTTCCGCCTCCTTC
GCAAAACAGCGGCAGCGTCT
CCGCCTCCTTCGTCCGTCGT
GTGGGGGCGGACCTCTCTTG
3
17
9
22
Meganathan et al. 2010
Primers para RE
SN
SN
AGGCGAGGGTGAGGATGA
TCGTCTCGTCTGGATCGCAT
16
16 Cassaing et al. 2006
66
TOX4
TOX5
CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG
CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT
11
11 Homan et al. 2000
SN
SN
GAAAGCCATGAGGCACTCCA
TTCACCCGGACCGTTTAGC
ND
ND Fekkar et al. 2011
Toxo-9
Toxo-11
AGGAGAGATATCAGGACTGTAG
GCGTCGTCTCGTCTAGATCG
16
16 Reischl et al. 2003
NF1*
NR1*
NF2*
NR2*
TGACTCGGGCCCAGCTGCGT
CTCCTCCCTTCGTCCAAGCCTCC
AGGGACAGAAGTCGAAGGGG
GCAGCCAAGCCGGAAACATC
15
16
16
16
Kong et al. 2012
a As bases sublinhadas indicam sítios polimórficos no alinhamento * Primers usados neste estudo SN – Sem nome ND – Não disponível
67
ANEXO A – Artigo em processo de revisão (Revista Acta Tropica)
An alternative nested-PCR assay for the detection of Toxoplasma gondii
strains based on GRA7 gene sequences.
Maria Eduarda S. M. Costa1,3; Claudio Bruno S. Oliveira2; Joelma Maria de A.
Andrade2; Thatiany A. Medeiros2; Valter F. Andrade Neto2,3 Ψ; Daniel C. F.
Lanza1,3Ψ*.
1 - Laboratório de Biologia Molecular Aplicada - LAPLIC, Departamento de
Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2 - Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose, Departamento de
Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Natal, RN, Brazil.
3 - Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
Ψ equal contributors
*Corresponding author:
Daniel Carlos Ferreira Lanza
Laboratório de Biologia Molecular Aplicada - LAPLIC
Departamento de Bioquímica
Centro de Biociências
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Natal, RN, Brazil. CEP: 59072-970
Phone: 55-84-3215-3416 Fax: 55-84-32153415
Email: [email protected]
68
Abstract
Toxoplasma gondii is a widespread parasite able to infect virtually any nucleated cells
of warm-blooded hosts. In some cases, T. gondii detection using already developed
PCR primers can be inefficient in routine laboratory tests, especially to detect atypical
strains. Here we report a new nested-PCR protocol able to detect virtually all T. gondii
isolates. Analyzing 685 sequences available in GenBank, we determine that GRA7 is
one of the most conserved genes of T. gondii genome. Based on an alignment of 85
GRA7 sequences new primer sets that anneal in the highly conserved regions of this
gene were designed. The new GRA7 nested-PCR assay providing sensitivity and
specificity equal to or greater than the gold standard PCR assays for T. gondii
detection, that amplify the B1 sequence or the repetitive 529 bp element.
Keywords
Apicomplexa, rhoptry, dense granule protein 7, toxoplasmosis, B1 gene, 529bp region.
1 - Introduction
Toxoplasma gondii is an intracellular apicomplexan protozoon able to infect all
warm-blooded vertebrates, including wild and farm animals. Infections in humans can
evolve to a life-threatening disease in immunocompromised patients (Lewis et al.
2015). In pregnant women can occur infection of the fetus, potentially causing fetal
death or injuries including ocular lesions, hearing deficits and neurological
abnormalities (DELAIR et al., 2011; STILLWAGGON et al., 2011; WALLON et al.,
2004).
Early studies using isolates from Europe and North America classified T. gondii
strains into three lineages designated Types I, II, and III, according to genetic
characteristics and the level of virulence observed in a murine model (DARDÉ;
BOUTEILLE; PESTRE-ALEXANDRE, 1992; HOWE; SIBLEY, 1995a). Subsequent
studies have reported a wide genetic diversity of this parasite, especially in South
American countries. In many cases these new isolates cannot be classified as one of
the classical lineages, and is not possible to establish a correlation between genotype
and virulence (Rajendran et al. 2012; Carneiro et al. 2013; Cañón-Franco et al. 2014;
Silva et al. 2014).
Since the introduction of molecular methods to detect T. gondii has been noticed
that low-level infections cannot be detected by serological tests (CHATTERTON et al.,
69
2011). In some cases in which a rapid and efficient diagnose are determinant to guide
the treatment (i.e congenital toxoplasmosis), the polymerase chain reaction (PCR) has
been introduced as the most promising alternative (BASTIEN, 2002; ROBERT-
GANGNEUX; DARDÉ, 2012). In the past few decades, different primer sets have been
developed to detect T. gondii. In 1989, Burg et al., introduced the B1 gene as an
efficient PCR target, since this sequence presents 35 repeats in T. gondii genome.
Since then, the B1 amplification has been used as a gold standard method for T. gondii
detection, although it has shown low specificity in some cases (KOMPALIC-CRISTO
et al., 2004). A new promising marker consisting of a 529 bp fragment (RE) repeated
200 to 300 fold in the genome of T. gondii was described by Homan et al., in 2000.
Several works have demonstrated that PCR reactions using the RE marker are at least
10 times more sensitive than using B1 (CASSAING et al., 2006; FALLAHI et al., 2014;
REISCHL et al., 2003). Even the 529bp repetitive element showing greater sensitivity,
the possibility of some strains have lost entire or part of the repetitive units was
reported, which can compromise the test efficiency (WAHAB et al., 2010).
Since the available primers may not be effective for the detection of some
variants of the parasite, the main objective of this work was to develop a new nested-
PCR assay able to detect the clonal and atypical strains of T. gondii. To reach this
objective, we analyze a set of 685 sequences of different T. gondii strains and elected
the GRA7 gene as the best target to primer design. The validation of the new GRA7
nested-PCR assay comparing it with the two most widely used protocols indicates that
our new method is a promising solution to detect a wide range of T. gondii strains.
2 - Materials and Methods
Each set of DNA sequences were retrieved from GenBank (BENSON et al.,
2005), aligned using Muscle algorithm (Edgar, 2004) with default parameters (gap
open penalty -12.0) and subsequent analyzed using MEGA software (TAMURA et al.,
2013) to determine the number of sequences in each alignment, the length of the
sequences, and the total number of polymorphisms of each coding region. Primers
were designed using primer-BLAST (YE et al., 2012) and checked using AutoDimer
(VALLONE; BUTLER, 2004). T. gondii isolates TgCkBrRN1 (Ck1), TgCkBrRN2 (Ck2),
TgCkBrRN3 (Ck3) and TgPgBrRN1 (Pg1) were recovered as previously described
(CLEMENTINO ANDRADE et al., 2013). The isolates were maintained inoculating 150
cysts (Ck1, Ck2, Ck3, Pg1, VEG) or 105 tachyzoites (RH) intraperitoneally into
70
C57BL/6 mice (n=3). After three days, the mice were euthanized, and the tachyzoites
recovered from the peritoneal exudate were seeded in RAW 264.7 cells. The DNA
template were extracted using the QIAamp DNA mini kit (QUIAGEN Inc., USA), and
quantified using SpectraMax 190 Microplate Reader (Molecular Devices). The two
steps of nested-PCR assays were performed in 20µl reactions containing 1,5µL of
template DNA, 0,25µM of each primer, 1,5 mM MgCl2, 0,01U Taq DNA pol (Ludwig)
and 0,2mM of each dNTP. The first step PCRs were performed using the primer pairs
GRA7FE/GRA7RE, NF1/NR1 and Oligo1/Oligo4 and nested-PCRs using
GRA7FI/GRA7RI, NF2/NR2, and Oligo2/Oligo3 respectively. PCR products were
resolved in a 1,5% agarose gel stained with ethidium bromide. Each reaction was done
at least in three independent replicates. Primer sequences and thermocycling
parameters are detailed in Tables 1 and 2 respectively. The serial dilution of the DNA
template was prepared starting from a sample containing 196,5 ng/µl of total DNA from
a RAW 264.7 culture infected with RH strain. The coverage tests were performed using
DNA template extracted from RAW 264.7 cultures infected with RH, VEG, Ck1, Ck2,
Ck3 and Pg1 strains.
3 - Results and discussion
3.1 - Identification of conserved coding sequences in T. gondii genome
Initially, entire or partial nucleotide sequences of genes which have been linked
to T. gondii mechanisms of infection and cell persistence were selected from GenBank.
Genes related to microneme, dense granule, rhoptry and surface antigen, were
prioritized since they present known specificity to apicomplexan parasites (AJIOKA et
al., 1998; BLACKMAN; BANNISTER, 2001). Genes associated to drug resistance such
as dihydrofolate reductase (DHFR) and dihydropteroate synthase (DHPS), as well as
sequences already used as PCR markers such as beta-tubulin, B1 and the repetitive
element of 529 bp were also selected, to compose the initial database. The accession
numbers of the 685 sequences used in this study are referenced in Supplementary
figure 1. Selected sequences were manually processed and their respective coding
regions were aligned. The genetic variability index (GVI) was calculated by the division
of the number of polymorphisms by the number of sequences of each alignment, and
dividing this result by the size of the coding sequence. The GVI values were ranked in
Figure 1 and the absolute values are shown in Supplementary Figure 2. Among the
most conserved genes (Figure 1), we choose GRA7 gene as the best marker due to
71
the following reasons: (i) GRA7 has the largest number of available sequences,
providing a significant representation of several isolates, including sequences of clonal
lineages and atypical strains from several countries; (ii) GRA7 gene occurs only in T.
gondii and in the protozoon Hammondia hammondi that not infect humans, without any
other known homologous in apicomplexa (FRENKEL; DUBEY, 1975; WALZER et al.,
2013); (iii) GRA7 protein is crucial to forming the parasitophorus vacuole, has been
implicated in sequestration of host endolysosomes and is expressed in all infectious
forms (tachyzoite, bradyzoite, merozoite and sporozoite), playing an important role in
establishing intracellular infections (COPPENS et al., 2006; FERGUSON et al., 1999);
(iv) Extremely conserved regions are spread in all extension of GRA7 sequence,
providing excellent sites to primer design.
3.2 - Primer design and optimization of nested-PCR assays
Conserved regions inside GRA7 gene, selected from an alignment of 85
sequences retrieved from GenBank, were used to design the "external"
(GRA7FE/GRA7RE) and "internal" (GRA7FI/GRA7RI) primer pairs (Table 1 and
Supplementary Figure 1). Actin primers were also designed to be used as positive
control, sequences of human and other mammals (e.g Bos taurus, Felis catus, Capra
hircus, Mus musculus) were aligned, and the primers were designed prioritizing
conserved regions in sequences of Mus musculus and Homo sapiens (data not show).
A specificity analysis using primer-BLAST appointed a potential annealing of the pair
GRA7FE/GRA7RE also in H. hammondi template. To prevent unspecific amplification,
these primers were designed with a nucleotide at 3' end that is not complementary to
H. hammondi sequence (HUANG; ARNHEIM; GOODMAN, 1992).
The ideal annealing and extension temperatures for GRA7 and previously
described B1 and RE primers (BURG et al., 1989; KONG et al., 2012) were defined
based in a gradient of nine temperatures, ranging of 48,8ºC to 70ºC (data not show).
The first step was standardized to amplify a unique specific fragment of 322bp, 420bp
and 198bp, using the primers for GRA7, RE and B1 respectively (gel pictures at the
top in each correspondent key of the figure 2 A, B and C). The second steps were
standardized to ensure the maximum sensitivity. The unspecific fragments (traces
above the expected size amplicons in each lane) observed in second step assays
(pictures below in each correspondent key of the figure 2 A, B and C) are common,
and could be caused by primers and/or unspecific amplicons from the first step. The
72
presence of additives could eliminate these unspecific fragments but also cause a
decrease in sensitivity. We opted not to use additives once the specific amplicons of
222 bp, 164bp and 97 bp were clearly visible in all reactions.
3.3 - Sensitivity and coverage tests comparing B1, RE and GRA7 nested-PCR
assays
The sensitivity of the GRA7 nested-PCR assay was compared with the protocols
used to amplify B1 and RE. A serial dilution of 40-fold revealed that the protocols for
RE and GRA7 showed similar sensitivity, in both the presence of T. gondii could be
detected up to dilution five in the nested-PCR, corresponding to a dilution of 10,24 x107
of the DNA template (Figure 2A and B). These results were remarkable since there are
no reports of GRA7 as a multiple copy gene in T. gondii genome. Possibly, the wide
conservation of GRA7 allowed a significant increase in the sensitivity of the reaction.
Another curious point was made clear when the tests were performed with B1. At first,
B1 protocol apparently seemed to be extremely sensitive, amplifying a potential
specific fragment of ~97bp in all serial dilutions (Figure 2C). Curiously, B1 primers of
the first and second steps work apparently well when were tested in separate reactions.
However when tested in a nested reaction, the second set of primers generates
amplicons of ~97bp using total DNA extracted from human blood or water as templates
(Supplementary figure 3). This is a strong evidence of self-amplification of the primers,
generating amplicons of similar size of what is expected when the specific DNA
template are present. A careful analysis of the Figure 2C reveals that from the fourth
dilution the self-amplification of primers may have prevailed in the reactions.
The efficiency of each nested-PCR assay to identify genetically diverse isolates
was evaluated using total DNA templates containing RH, VEG, Ck1, Ck2, Ck3 and Pg1
DNA (Figure 3 A, B and C). The primer pair to detect the actin gene (Table 1) was used
as a positive control (Figure 3 D). In Figure 3A is clear that GRA7 protocol showed
stronger amplicons when compared with RE (Figure 3B) and B1 (Figure 3C), especially
in the first step. The efficiency of GRA7 primers is more evident for the identification of
the atypical isolates Ck1, Ck3 and Pg1 (lanes 3, 5 and 6 in Figure 3). The nonspecificity
of B1 primers was confirmed by an amplicon at ~97bp observed in the negative control,
in which total DNA extracted from uninfected human blood was used as template (lane
8). Once all protocols have been standardized to ideal conditions and the same amount
of DNA template was used for each assay, the efficiency of the GRA7 nested-PCR can
73
also be attributed to the highly conserved regions in which the primers anneal, ensuring
an efficient amplification within the first cycles of PCR even when genetically distinct
isolates are present. The early PCR primers to T. gondii detection were designed using
a single of few sequences, and due to the presence of polymorphisms in the annealing
regions they are not effective to detect a wide range of isolates, increasing the number
of false negative results.
4 - Conclusions
We introduce the GRA7 gene as an excellent target for primer design to T.
gondii detection, due to its great conservation. The nested-PCR assay targeting
conserved regions in GRA7 gene showed sensitivity and specificity comparable to the
RE protocol and was more specific than the B1 nested-PCR assay. These findings
contribute to improve the diagnostic of Toxoplasmosis, especially in cases when the
correct and precise diagnosis is fundamental to early treatment in areas where the
genetic diversity of the parasite is great.
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Legends of figures
Figure 1 - Genetic variability of selected T. gondii genes. Selected genes were
ranked from smallest to largest genetic variability, in according to their respective
genetic variability index (GVI).
Figure 2 - Sensitivity test. A 40-fold serial dilution (Lanes 1-9) using total DNA
extracted from infected RAW 264.7 cells as template was performed to determine the
sensitivity of the (A) nested-PCR assay using GRA7 primers; (B) nested-PCR assay
using RE primers; and (C) nested-PCR assay using B1 primers. Within each key, gel
pictures above correspond to the first step and those below to the second step PCR.
77
Black arrows indicate the expected amplicons of each reaction and its corresponding
sizes are shown at right. M, 100bp molecular-weight marker.
Figure 3 - Coverage test. The (A) nested-PCR assay using GRA7 primers; (B) nested-
PCR assay using RE primers; and (C) nested-PCR assay using B1 primers, were
tested using total DNA extracted from RAW 264.7 cultures infected with six T. gondii
isolates (Lanes 2-7). (D) Actin was used as a positive control, confirming the efficiency
of the DNA extraction. The control reactions at lane 8 were performed using total DNA
extracted from uninfected human blood as template. Expected amplicons are indicated
for black arrows and their correspondent sizes were shown at right. M, 100bp
molecular-weight marker. The same amount of DNA template was used in GRA7, RE
and B1 reactions, as described: VEG 173,7 ng; Ck1 150,9 ng; Ck2 109 ng; Ck3 79,6
ng; Pg1 66,5 ng and RH 294,8 ng.
Supplementary figure 1 - Sequences used in this study.
Supplementary figure 2 - Number of sequences, polymorphisms and sequence
lengths used to calculate the genetic variability index (GVI).
Supplementary figure 3 - Test of self-amplification of the B1 primers. The primers
were tested separately (“external” and “internal” primers) and as a nested-PCR. (W)
Reactions using water as template; (+) Total DNA extracted from RAW247.6 culture
infected with T. gondii; (-) Total DNA extracted from toxoplasmosis seronegative
human.
78
Figure 1
Figure 2
79
Figure 3
80
Table 1. Primers designed in this study and primers used to amplify the B1 gene (B1) and the repetitive element of 529 bp (RE)
B1 primers
Primers designed in this study
Primer name
Sequence 5` - 3` Number of available
sequences Tm (ºC) Product size
Actin gene
ACTAF
ACTAR
TGGAAAAGATCTGGCACC
TCCTGTTTGCTGATCCAC
30
30
54,44
54,48 838 bp
GRA7 gene
GRA7FE
GRA7RE
GRA7FI
GRA7RI
CAAGCACCCGTTGACAGTCT
ACGATGCACCCATACCAACAG
CACCAGCATGGATAAGGCATC
GCGAGCTTCTTCAGCAAGTCT
81
85
81
85
60,53
60,68
59,12
60,94
322bp
222 bp
Primer name
Sequence 5’ – 3’ Principal reference
Oligo 1
Oligo 4
Oligo 2
Oligo 3
GGAACTGCATCCGTTCATGAG
TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC
TGCATAGGTTGCAGTCACTG
GGCGACCAATCTGCGAATACACC
Burg et al. 1989
RE primers
Primer name
Sequence 5’ – 3’ Principal reference
NF1
NR1
NF2
NR2
TGACTCGGGCCCAGCTGCGT
CTCCTCCCTTCGTCCAAGCCTCC
AGGGACAGAAGTCGAAGGGG
GCAGCCAAGCCGGAAACATC
Kong et al. 2012
81
Table 2. Thermal cycling parameters used in PCR assays.
* The stages of denaturation, annealing and extension were repeated 30 times
Step 1 and 2 – B1 Step 1 - RE Step 2 - RE Step 1 and 2 – GRA7
Actin
Initial denaturation
94ºC – 2 min 94ºC – 2 min 94ºC – 2 min 94ºC – 2 min 94ºC – 2 min
Denaturation* 94ºC – 40s 94ºC – 40 s 94ºC – 40s 94ºC – 40s 94ºC – 40s Annealing* 63ºC – 40s 68ºC – 40s 61ºC – 40s 59ºC – 40s 53ºC – 40 s Extension* 68ºC – 40s 69ºC – 40s 69ºC – 40s 63ºC – 40s 72ºC – 40 s
Final extension 69ºC – 3 min 69ºC – 3 min 69ºC – 3 min 63ºC – 3 min 72ºC – 3 min
82
Supplementary figure 1 - Sequences used in this study.
Gene Number of sequences
Accession number
B1 9 EU340873; EU340877; EU340875; KF413760; KF413761; EU340879; EU340882; EF564276; EU341712
BTUB 17 JX045461; JX045462; JX045453; JX045454; JX045466; JX045452; JX045446; JX045447; JX045459; JX045456; JX045457; M20025; JX045469; JX045455; JX045467; JX045468; JX045460
DHFR 12 GQ397461; GQ397456; GQ397457; GQ397452; GQ395777; GQ397454; GQ395776; GQ395774; GQ397455; GQ397453; GQ395773; GQ395775
DHPS 10 GQ415585; GQ415577; XM_002365108; GQ415579; GQ415578; GQ415576; GQ415575; GQ415574; U61852; HM536197
GRA1 4 HM067753; M26007; AK318045; XM_002365660 GRA2 6 HM014012; AK318019; XM_002366354; M99392; L01753; J04018 GRA3 20 JX044177; JX044175; JX044176; XM_002366330; JX044172;
JX044173; JX044164; JX044166; JX044153; JX044154; JX044165; JX044157; JX044158; EF552406; AF414079; JX044161; JX044159; JX044160; JX044162; JX044163
GRA4 4 M76432; XM_002364283; AK317865; EU660037 GRA5 6 L06091; XM_002369230; AK318131; EU918733; EU918734;
EU918735 GRA6 93 DQ187387; AY964058; AY964059; X96720; EF512264; L33814;
JX044237; JX044241; JX044238; JX044239; AB235431; AF239283; JN649063; EF512247; EF512248; EF512232; EF512233; AB235433; AF239287; AF239289; EF512242; EF512241; EF512230; EF512231; AB235428; AF239286; AF239290; AF239288; AF239292; JN649066; JN649064; EF512263; EF512249; EF512250; EF512225; EF512226; AB235429; AF239291; EF512234; EF512258; AB235434; AB235432; EF512240; XM_002371898; EU180619; EU180620; DQ512729; AB471758; AF239284; AF239285; AJ635332; AJ635336; AB235430; AB235426; JX044231; JX044232; JX044198; JX044199; JX044178; JX044179; JX044226; JX044227; AB235435; JX044229; JX044230; JX044212; JX044207; JX044208; JX044201; JX044202; JX044197; EF512227; EF512228; JX044193; JX044194; JX044195; AJ635335; AJ635333; FJ455444; GU325790; AJ635334; GU325791; JX044186; JX044187; GU139480; GU139485; GU139483; GU139482; GU139484; EF585706; EF585707; GU139481; KC928255
GRA7 85 JX045634; JX045635; JX045619; JX045620; JX045608; JX045609; JX045595; JX045604; JX045605; JX045596; JX045598; JX045585; JX045586; AK317819; XM_002367572; JX045589; JX045590; JX045578; JX045579; DQ459452; DQ459456; EU157155; DQ459454; DQ459455; U79158; EU157156; EU157143; EU157144; EU157171; EU157170; EU157178; EU157149; EU157167; DQ459453; EU157166; JX045628; JX045629; Y13863; JX045614; JX045615; EF626965; EF626966; DQ459445; DQ459446; DQ465955; DQ459450; DQ459451; EU157179; EF639859; DQ459443; EU157183; EU157141; EU157146; JX045613; EU157151; EU157152; EU157162; EU157164; EU157153; EU157154; DQ459448; DQ459449; EU157157; JX045597; EU157163; EU157172; JX045583; JX045584; EU157142; EU157148; EU157175; EU157150; EU157177; DQ473315; JX045600; JX045601; HM016952; JX045599; JX045573; JX045574; DQ872520; HQ852155; HQ852156; HQ852158; HQ852159
83
GRA8 4 XM_002369485; AK318497; AF150729; DQ835668 GRA9 3 XM_002367354; AY371455; AJ223585 GRA10 2 XM_002365542; AY769952 GRA11 2 XM_002372050; DQ792507 GRA12 2 FJ011096; AK318503 GRA14 2 FJ015061; AK317905 GRA15 3 TGGT1_275470; TGME49_275470; TGVEG_275470 MIC3 9 AJ132530; DQ676961; DQ676960; DQ676959; XM_002369792;
AF509564; EU572718; JF330835; KF153103 MIC4 15 FJ785470; FJ785466; FJ785469; FJ785467; FJ785464; FJ785462;
FJ785468; FJ785463; FJ785465; AF143487; AK318267; XM_002369565; FJ785461; FJ785460; FJ785459
MIC6 3 AF110270; XM_002370595; AK318343 MIC10 3 AF293654; XM_002367312; AK318393 MIC11 3 AF539702; AK318155; XM_002367684 MIC13 15 JN995561; JN995546; JN995544; JN995557; JN995556; JN995547;
JN995550; JN995551; JN995558; JN995553; JN995560; JN995554; JN995549; JN995545; JN995559
ROP1 4 M71274; XM_002364175; AY661790; AF350261 ROP2 4 DQ923323; AK318335; XM_002371885; Z36906 ROP4 3 EU047558; AY662677; Z71787 ROP5 60 EF466101; HQ916453; XM_002371884; DQ116423; BK008047;
BK008045; HQ916458; BK008044; BK008043; JQ743764; BK008046; HQ916457; JQ743777; BK008057; BK008053; HQ916454; JQ743771; JQ743769; JQ743767; HQ916452; HQ916451; JQ743774; JQ743775; JQ743772; JQ743776; BK008052; BK008056; JQ743746; JQ743744; JQ743737; HQ916448; JQ743747; HQ916450; JQ743741; JQ743763; JQ743743; JQ743739; JQ743762; JQ743757; JQ743758; JQ743761; JQ743778; JQ743740; JQ743753; HQ916459; HQ916456; JQ743738; JQ743742; BK008055; HQ916460; HQ916455; JQ743756; JQ743755; JQ743754; JQ743783; JQ743782; JQ743780; JQ743781; JQ743779; JQ743745
ROP6 2 AY792971; XM_002365039 ROP7 19 AM056071; JF831539; JF831543; JF831553; JF831537; JF831544;
JF831541; JF831552; JF831551; JF831548; JF831547; JF831542; JF831540; JF831538; JF831536; FJ194943; JF831554; JF831549; JF831550
ROP8 5 XM_002370855; HM003613; HM003615; HM003616; HM003614 ROP9 3 AK317939; XM_002366831; AJ401616 ROP10 3 EF447219; XM_002364687; DQ124368 ROP11 3 KC456639; XM_002366363; DQ077905 ROP12 2 XM_002367640; DQ096559 ROP13 15 JN051291; JN051288; JN051285; JN051283; JN051279; JN051282;
JN051280; JN051286; JN051289; XM_002364408; JN051281; JN051287; JN051278; JN051290; JN051284
ROP14 2 XM_002364660; DQ096565 ROP15 4 EF447218; AK317928; XM_002371223; DQ096561 ROP16 16 GQ24909; GQ249083; GQ249088; GQ249090; GQ249082;
DQ116422; XM_002365332; GQ249081; GQ249092; GQ249087; GQ249089; GQ249086; GQ249093; GQ249095; GQ249094; GQ249091
84
ROP17 5 AM075203; XM_002365031; KC997178; KC997176; KC997177 ROP18 24 GQ243216; GQ243210; JX045318; JX045319; GQ243211;
GQ243207; GQ243215; GQ243209; GQ243208; GQ243205; GQ243213; JX045345; AM075204; GQ243202; JX045344; GQ243204; JX045334; JX045335; GQ243206; GQ243203; JX045346; JX045347; EF092842; JX045354
SAG1 40 AY187278; S63900; AK317969; GQ253080; GQ253083; GQ253074; GQ253076; FJ455529; DQ872518; JX045363; DQ872517; JX045390; JX045392; JX045391; JX045393; JX045355; JX045357; JX045397; JX045398; JX045395; JX045396; JX045394; HM776940; GQ253086; GQ253075; GQ253073; X14080; JX045356; JX045421; XM_002368164; S73634; AY217784; AY661791; EF140712; AF110182; AY651825; DQ077664; DQ077665; EU700308; JX013909
SAG2 55 AK317818; AF249697; M33572; AF249698; AF249696; AF357578; AF357582; AF357580; AF357581; AF357577; AF357579; JX045474; JX045473; JX045472; JX045470; JX045471; JX045492; JX045493; JX045491; JX045490; JX045489; FJ207520; JX045494; FJ207519; Y187279; EU650330; EU650329; EU258521; EU258523; EU258533; EU258520; EU258531; EU258522; EU258528; EU258519; KJ524441; AB667972; AB667973; AB667974; DQ000461; AY707925; AY707928; AY941252; AY707930; AY707926; AY707927; KC928258; EU053941; EU053943; EU053942; EU053944; EF585701; EF585702; EF585703; AY707929
SAG3 47 L21720; XM_002371878; AK317978; AY187280; HQ291784; AF340227; HM585285; AF340229; JF312642; AF340228; JX218225; GU249509; GU139476; GU139477; JX218227; GU249510; JX218226; GU139472; GU139466; GU139468; GU139479; GU139478; GU139464; GU139463; EF585688; EF585689; GU139467; GU139475; GU139469; GU139473; HM133638; GU139471; GU139465; KC928250; EF585685; EF585686; GU139470; HM133637; EF585694; EF585683; EF585684; KC928251; GU139474; GU139462; KC928254; KC928253; KC928252
SAG4 5 Z69373; XM_002371410; AF340224; AF340225; AF340226 SAG5A 4 AY190529; AY299532; AY299529; AY299530 SAG5C 5 AY299534; AY299539; AY299535; AY299536; AY299538 SAG5D 7 AY190530; AY299528; AY299523; AY299524; XM_002368526;
AY299527; AY190528
85
Supplementary figure 2 - Sequences, polymorphisms and lengths used to calculate the genetic variability index (GVI).
Genes Nº of sequences
Nº of polymorphisms
Sequence length (nt)
IGV
ROP12 2 0 711 0
ROP14 2 0 3186 0
BTUB 17 6 1349 0.000262
DHFR 12 3 786 0.000318
MIC11 3 1 615 0.000542
ROP4 3 3 1737 0.000576
GRA7 85 37 708 0.000615
GRA9 3 2 957 0.000697
DHPS 10 7 976 0.000717
GRA2 6 3 558 0.000896
SAG3 47 50 1155 0.000921
ROP9 3 3 1062 0.000942
MIC4 15 25 1743 0.000956
GRA6 93 67 693 0.00104
SAG2 55 33 561 0.00107
MIC10 3 2 597 0.001117
SAG1 40 46 1008 0.001141
MIC6 3 4 1050 0.00127
ROP8 5 11 1728 0.001273
GRA12 2 4 1311 0.001526
MIC3 9 15 1080 0.001543
ROP11 3 8 1548 0.001723
ROP5 60 178 1653 0.001795
ROP7 19 66 1728 0.00201
GRA14 2 5 1227 0.002037
ROP6 2 7 1694 0.002066
MIC13 15 47 1407 0.002227
GRA3 20 30 663 0.002262
ROP13 15 44 1203 0.002438
GRA15 3 15 1908 0.002621
ROP16 16 94 2124 0.002766
GRA10 2 15 2687 0.002791
SAG5D 7 22 1089 0.002886
ROP15 4 11 924 0.002976
ROP10 3 16 1761 0.003029
ROP18 24 138 1671 0.003441
ROP17 5 34 1827 0.003722
GRA1 4 10 573 0.004363
GRA5 6 10 363 0.004591
GRA4 4 24 1038 0.00578
86
Supplementary figure 3
GRA11 2 27 2259 0.005976
GRA8 4 20 807 0.006196
SAG4 5 16 516 0.006202
RE 16 53 534 0.006203
SAG5A 4 29 1089 0.006657
B1 9 32 502 0.007083
SAG5C 5 40 1104 0.007246
ROP1 4 55 1368 0.010051
ROP2 4 95 1698 0.013987
87
ANEXO B – Depósito de Pedido de Patente
SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS E USO PARA DETECÇÃO DO
PROTOZOÁRIO TOXOPLASMA GONDII
Campo da invenção
O presente invento consiste em sequências de ácidos nucleicos sintéticas,
também designadas oligonucleotídeos ou primers ou iniciadores de DNA, e seu uso
para detecção do protozoário Toxoplasma gondii.
Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um conjunto de
oligonucleotídeos, que se ligam em regiões específicas de um gene conservado do
genoma do parasita Toxoplasma gondii, permitindo detectar a presença deste parasita
em diferentes amostras, utilizando-se a técnica de reação em cadeia pela DNA
polimerase (PCR) ou técnicas correlatas como real time PCR, insulated isotermal PCR
ou hibridização por meio de sondas marcadas (southern blot ou northern blot).
Fundamentos da invenção
O Toxoplasma gondii é um parasita intracelular mundialmente distribuído e
potencialmente capaz de infectar qualquer célula nucleada de animais de sangue
quente. A infecção pelo T. gondii afeta um terço da população mundial sendo
recorrente na maioria dos animais de fazenda, tais como boi, ovelha, cabra, porco e
galinha, e animais domésticos, tais como gato e cachorro. Em seres humanos a
infecção pelo T. gondii pode causar uma doença devastadora em indivíduos
imunocomprometidos, especialmente em pacientes com HIV/AIDS, e em neonatos
infectados durante a gestação, nos quais os sintomas podem evoluir para infecção
ocular, retinocoroidite, encefalite, e distúrbios psiquiátricos, tais como depressão,
ansiedade e esquizofrenia.
O método mais utilizado para o diagnóstico da toxoplasmose é a detecção de
anticorpos das classes IgG e/ou IgM contra Toxoplasma gondii no sangue do paciente.
A detecção desses anticorpos pode ser feita através de reações de
imunofluorescência indireta (IFI), fixação do complemento e inibição da
hemaglutinação e também por meio de técnicas imunoenzimáticas que proporcionam
88
maior sensibilidade analítica em relação às demais. Atualmente, diversos kits para os
testes sorológicos estão disponíveis comercialmente; como exemplo disso tem-se:
Toxoplasma ELISA IgG Kit (Sigma-Aldrich), Biolisa toxoplasmose IgG e IgM (Bioclin),
Anti-Toxoplasma gondii IgG e IgM Human ELISA Kit (Abcam), dentre outros. De uma
forma geral os testes sorológicos apresentam algumas limitações, que são listadas a
seguir. Resultados falso-positivos podem ser observados quando são analisados
soros que apresentem anticorpos antinucleares ou fator reumatoide, e falso-negativos
ou fracamente positivos podem ocorrer pela presença de altos títulos de anticorpos
IgG de alta afinidade anti-toxoplasma, que competem com os anticorpos IgM na
fixação dos antígenos do parasita. Além disso alguns testes sorológicos comerciais
não conseguem detectar baixos níveis de infecção, levando a um aumento de
resultados falso-negativos, dificultando o diagnóstico e prejudicando o tratamento,
especialmente em pacientes grávidas (Chatterton et al., 2011).
Os métodos para detecção do T. gondii, utilizando a reação em cadeia da
polimerase (PCR), representam as alternativas mais promissoras, uma vez que por
meio dessa técnica é possível identificar partes do genoma do patógeno em uma
amostra infectada. Esses testes já são amplamente utilizados em estudos clínicos e
têm apresentado grande eficiência para identificação do parasita em casos de
toxoplasmose congênita.
Nas últimas décadas, diferentes conjuntos de oligonucleotídeos foram
desenvolvidos para detectar o T. gondii. O primeiro trabalho, publicado por Burg et al.
1989, apresentou o gene B1 como um alvo eficiente para PCR, uma vez que esse
marcador está repetido pelo menos 35 vezes no genoma do protozoário. Logo após,
em 1990, Savva et al. mostrou que o gene P30 (surface antigen 1 – SAG1) também
poderia ser um alvo molecular. Entretanto, SAG1 é um gene que possui apenas uma
cópia no genoma, e trabalhos posteriores mostraram que a sensibilidade do SAG1 é
aproximadamente 10 vezes menor, quando comparado ao B1 (Wastling, Nicoll e
Buston, 1993). Desde então, a identificação do gene B1 tem sido considerada um dos
padrões ouro para detecção de T. gondii, embora existam relatos de que os
oligonucleotídeos para o gene B1 não apresentam a especificidade necessária, uma
vez que pode ocorrer amplificação cruzada de DNA humano na reação de PCR.
Posteriormente, outro alvo promissor para detecção do Toxoplasma gondii por PCR
foi descrito por Homan et al., no ano 2000. Esse alvo consiste em um fragmento de
89
529 pb repetido de 200 a 300 vezes no genoma do protozoário, que é chamado de
fragmento RE. Muitos trabalhos mostraram que reações de PCR usando o RE como
alvo são pelo menos 10 vezes mais sensíveis que as reações usando o B1 ( Cassaing
et al., 2006; Fallahi et al., 2014; Reischl et al., 2003). Mesmo o RE mostrando maior
sensibilidade, existe a possibilidade de algumas cepas terem perdido parte ou todas
as unidades repetitivas, o que pode comprometer a eficiência do teste (WAHAB et al.,
2010). Uma busca recente nos principais bancos de patentes mundiais revelou 17
pedidos de patente depositados nos últimos 10 anos, que descrevem sequências de
oligonucleotídeos que podem ser aplicadas para detecção do T. gondii utilizando-se
variações da técnica de PCR, tais como nested PCR, PCR quantitativo e PCR-LAMP.
Esses pedidos são designados pelos códigos: US2015086987 (A1),
CN104120195 (A), CN104117072 (A), CN103952471 (A), CN103789430 (A),
CN103725788 (A), CN103320501 (A), CN103122382 (A), CN102154496 (A),
CN101962674 (A), CN101845505 (A), CN101613751 (A), CN101250577 (A),
CN101245367 (A), US2007218474 (A1), US2007190545 (A1), JP2007282601 (A).
Alguns dos kits comerciais que se baseiam na técnica de PCR para identificação do
T. gondii são o Toxoplasma gondii PCR detection kit (Norgen Biotec Corp.),
genesig®Advanced Kit (genesig®), LSI VetMAX Toxoplasma gondii REal Time PCR
kit (ThermoFisher), Toxoplasma gondii PCR detection kit (SinaClon), LightMix® kit
Toxoplasma gondii (Roche) e VetPCR™ TOXO Detection Kit. Até o momento não
existem kits projetados para detectar de forma eficiente todas as diferentes variantes
do protozoário T. gondii.
O presente invento consiste em um novo conjunto de oligonucleotídeos e o seu
uso combinado em uma PCR, para detecção de T, gondii com alta sensibilidade e
especificidade. Os novos oligonucleotídeos apresentados aqui podem compor um kit
em conjunto com os demais reagentes para PCR, e este kit pode ser utilizado de forma
automatizada nas plataformas para PCR disponíveis comercialmente, facilitando o
trabalho do analista.
Sumario da invenção
A presente invenção consiste em um conjunto de sequências de ácidos
nucleicos sintéticas, também designadas oligonucleotídeos ou primers ou iniciadores
de DNA e seu uso para detecção de T. gondii utilizando-se a técnica de PCR ou suas
90
variações como real time PCR, insulated isotermal PCR ou hibridização por meio de
sondas marcadas (southern blot ou northern blot).
A invenção em comento consiste em um conjunto de oligonucleotídeos
sintéticos, designados pelas sequências nucleotídicas SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2,
SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, que podem ser utilizados em diferentes combinações
em uma reação de PCR para identificação do Toxoplasma gondii.
Outro desenvolvimento desta invenção refere-se ao método de detecção de T.
gondii por meio da técnica de PCR, utilizando um protocolo específico que
compreende as seguintes etapas: (1) Extração de DNA de Toxoplasma gondii, de
amostras clínicas obtidas a partir de humanos ou animais, ou de amostras do
ambiente (água, solo ou de alimentos de origem animal ou vegetal). (2) Amplificação
do fragmento de DNA do parasita uma ou mais de uma vez de forma aninhada,
utilizando-se uma ou mais combinações de oligonucleotídeos em cada reação; (3)
Amplificação de um controle positivo, que permite inferir que a reação ocorreu
adequadamente utilizando-se os oligonucleotídeos designados pelas sequências
SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, os quais atuam na amplificação de parte do gene que
codifica a proteína actina, que também integram a presente invenção; (4) Detecção
do produto de amplificação por meio da técnica de eletroforese, por medição da
fluorescência ou por meio de qualquer procedimento que possibilite detectar o material
amplificado pela PCR.
Descrição das figuras
Figura 1 - Gel de agarose a 1,5% com as bandas resultantes da reação de PCR
utilizando como template DNA extraído de cultura de células Raw 264.7 para detecção
de T. gondii: M, marcador de tamanho; 1 – 4, bandas resultantes da primeira reação
de PCR utilizando os oligonucleotídeos correspondentes às SEQ ID NO 1 e SEQ ID
NO 2 (1, RH; 2, VEG; 3, Ck2; 4, Pg1); 5 – 8, bandas resultantes da segunda reação
de PCR utilizando as SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 (5, RH; 6, VEG; 7, Ck2; 8, Pg1); 9
– 12, bandas resultante da PCR utilizando os oligonucleotídeos correspondentes às
SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 (9, RH; 10, VEG; 11, Ck2; 12, Pg1).
91
Figura 2 - Gel de agarose a 1,5% com as bandas resultantes da reação de PCR
utilizando como template DNA extraído de líquido amniótico para detecção de T.
gondii: M, marcador de tamanho; 1 – 3, bandas resultantes da primeira reação de PCR
utilizando os oligonucleotídeos correspondentes às SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2 (1,
controle negativo; 2, amostra de paciente; 3, controle positivo); 4 – 6, bandas
resultantes da segunda reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos
correspondentes às SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 (4, controle negativo; 5, amostra de
paciente; 6, controle positivo); 7 – 9, bandas resultantes da PCR utilizando os
oligonucleotídeos correspondentes às SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 2 (7, controle
negativo; 8, amostra de paciente; 9, controle positivo).
Descrição detalhada da presente invenção
Em sua aplicação preferencial, a presente invenção compreende um método
para detecção do protozoário T. gondii por meio da técnica de nested-PCR, uma
variação da técnica de PCR em que duas reações de amplificação são realizadas de
forma aninhada (onde a segunda utiliza como DNA template o produto de amplificação
da primeira) de forma a aumentar a sensibilidade e especificidade do teste. O método
compreende as seguintes etapas: (1) Extração de ácidos nucleicos de amostras
clínicas obtidas a partir de humanos ou animais (por exemplo, mas não se restringindo
a amostras de células, tecidos, amostras oriundas de autópsias, aspirados de
medula), incluindo fluidos corporais (por exemplo, mas não se restringindo a sangue,
soro, urina, fluido cerebrospinal, líquido amniótico, linfa, lágrima, saliva e fluidos
oriundos de lavagens), fezes e swabs do sistema orofaríngeo e do reto. Incluem-se
amostras de água, de solo e de alimentos de origem vegetal ou animal, além de outras
amostras oriundas do ambiente (por exemplo, mas não se restringindo a swabs de
paredes, pisos, ou qualquer tipo de superfície). Os ácidos nucléicos podem ser
extraídos utilizando-se os métodos tradicionais, (por exemplo, mas não se restringindo
a extração orgânica com fenol clorofórmio, seguida de precipitação com etanol ou
isopropanol; tecnologias baseadas em sílica recorrentes em kits comerciais,
separação magnética, troca iônica, salting out, gradiente de densidade em cloreto de
césio ou uso de resina Quelex 100); (2) Validação da qualidade do DNA extraído na
etapa 1 por meio de uma reação de PCR utilizando-se os oligonucleotídeos SEQ ID
NO 5 e SEQ ID NO 6 e os reagentes necessários para que a reação ocorra, os quais
92
podem ser compostos por compor um mix (água, magnésio, deoxinucleotídeos
trifosfato, enzima DNA polimerase, sais, tampão adequado, aditivos), sendo esse um
dos controles positivos da reação; (3) Utilização do DNA ou RNA extraído na etapa 1
como template na primeira reação de PCR para detecção do T. gondii, em presença
dos oligonucleotídeos designados pelas sequencias SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2
bem como os reagentes necessários para que a reação ocorra, os quais poderão
compor um mix (água, magnésio, deoxinucleotídeos trifosfato, enzima DNA
polimerase, sais, tampão adequado, aditivos) ; (3) Utilização do produto de
amplificação da etapa 3 na reação nested (reação aninhada) em presença dos
oligonucleotídeos designados pelas sequencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e de um
mix contendo os reagentes necessários para que a reação de PCR ocorra, conforme
já descrito na etapa 2. (4) Visualização do produto de amplificação da segunda reação
(reação nested) utilizando a técnica de eletroforese em gel de agarose ou de
acrilamida corado com brometo de etídio, com nitrato de prata ou com qualquer
molécula que seja capaz de interagir com os ácidos nucleicos e permita a sua
visualização de forma direta ou indireta. Alternativamente, o produto de amplificação
poderá ser detectado por eletroforese capilar ou por fluorescência em equipamentos
de real time PCR, desde que fluoróforos adequados sejam inseridos nos
oligonucleotídeos, em sondas ou nos produtos de amplificação.
Em uma segunda aplicação, os oligonucleotídeos correspondentes às
sequências SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 são utilizados
em diferentes combinações em uma reação de PCR. As etapas do método são
semelhantes às que já foram descritas (1) Extração de ácidos nucleicos de amostras
clínicas obtidas a partir de humanos ou animais; (2) Validação da qualidade do DNA
extraído na etapa 1 por meio de uma reação de PCR utilizando-se os
oligonucleotídeos SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 e os reagentes necessários para que
a reação ocorra; (3) Utilização do DNA ou RNA extraído na etapa 1 como template
na primeira reação de PCR para detecção do T. gondii, em presença dos
oligonucleotídeos designados pelas sequencias SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID
NO 3 e SEQ ID NO 4, conforme combinações apresentadas no QUADRO 2 ou em
multiplex (reações em que mais de um par de oligonucleotídeos é utilizado
simultaneamente).
93
QUADRO 2 - Possíveis combinações dos oligonucleotídeos e os tamanhos dos produtos de amplificação esperados em cada caso. (pb = pares de bases)
SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 3
SEQ ID NO 2 322 pb 251 pb
SEQ ID NO 4 293 pb 222 pb
Os oligonucleotídeos designados pelas sequências SEQ ID NO 1, SEQ ID NO
2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 interagem com regiões extremamente conservadas
(regiões que apresentam poucos ou nenhum polimorfismo) no gene que codifica à
Proteína 7 do Grânulo Denso (Dense Granule Protein 7 - GRA7). As sequências
conservadas foram determinadas a partir de um alinhamento utilizando-se 85
sequências da proteína GRA7 disponíveis no banco de dados público GenBank. Os
oligonucleotídeos designados pelas sequências SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID
NO 3 e SEQ ID NO 4 permitem identificar diferentes variantes do T. gondii, pois
interagem em regiões do genoma que não variam de forma significativa, e aumentam
a eficiência da reação.
Também são objeto desta invenção os oligonucleotídeos designados pelas
sequências SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 os quais foram desenhados a partir de um
alinhamento de sequências dos genes que codificam a proteína actina de diferentes
mamíferos. Estes oligonucleotídeos podem ser utilizados como controle positivo da
reação, uma vez que amplificam um fragmento de 838 pb do gene da actina. O
emprego deste controle é mais indicado quando o DNA extraído provém de amostras
de mamíferos (sangue, células e/ou líquidos corporais). A seguir, são apresentados
alguns exemplos de utilização da invenção, entretanto seu uso não está restrito a
estes exemplos.
Exemplo 1
O DNA foi extraído de cultura de células Raw 264.7 (linhagem de macrófago
de murinos) utilizando o QIAamp® DNA mini kit. A uma alíquota da suspensão de
células, foi adicionado proteinase K e tampão para lise das células e álcool 96%-100%.
Depois, o volume foi transferido para uma coluna contendo uma membrana e
centrifugado. O DNA que ficou retido na membrana da coluna foi lavado e centrifugado
com tampões para purificação e, por fim, com um tampão para remove-lo da
membrana.
94
Para a reação de detecção do Toxoplasma gondii foram utilizados1,5 µl de
DNA, tampão da PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 de dNTP (cada), 0,25 µM de cada
oligonucleotídeo (forward e reverse) e 0,01U de Taq polimerase. O volume foi
completado para 20 µl com água Mili-Q. As mesmas concentrações foram usadas
tanto na primeira, quanto na segunda reação do nested-PCR. Na primeira reação os
oligonucleotídeos usados correspondem às SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2, e na
segunda reação os oligonucleotídeos foram as SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4. O padrão
de termociclagem foi o mesmo para as duas etapas: desnaturação inicial a 94oC por
2 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94oC por 40 segundos, anelamento
a 59oC por 40 segundos, extensão a 63oC por 40 segundos, e extensão final a 63oC
por 3 minutos. Após cada etapa de PCR foi feito um gel de agarose a 1,5% com
brometo de etídio.
A reação do controle positivo aconteceu com as mesmas condições de mix (1,5
µl de DNA, tampão da PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 de cada dNTP, 0,25 µM de
cada oligonucleotídeo e 0,01U de Taq polimerase) usando as SEQ ID NO 5 e SEQ ID
NO 6 como oligonucleotídeos. O ciclo da PCR consistiu em uma etapa de
desnaturação inicial a 94oC por 2 minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94oC por 40
segundos, anelamento a 53oC por 40 segundos, extensão a 72oC por 40 segundos, e
uma etapa de extensão final a 72oC por 3 minutos. Após a etapa de PCR, a verificação
do fragmento de DNA foi observada em gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio.
Exemplo 2
O DNA foi extraído de líquido amniótico que foi centrifugado previamente, para
concentração de células, pois a celularidade deste material é baixa. A extração foi
feita utilizando o QIAamp® DNA mini kit. A uma alíquota do líquido amniótico, foi
adicionada proteinase K e tampão para lise das células e álcool 96%-100%. Depois,
o volume foi transferido para uma coluna contendo uma membrana e, em seguida foi
centrifugado. O DNA que ficou retido na membrana da coluna foi lavado e centrifugado
com tampões para purificação e por fim, com um tampão para removê-lo da
membrana.
Para a reação de detecção do T. gondii foram utilizados1,5 µl de DNA, tampão
da PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 de dNTP (cada), 0,25 µM de cada oligonucleotídeo
95
(forward e reverse) e 0,01U de Taq polimerase. O volume foi completado para 20 µl
com água Mili-Q. As mesmas concentrações foram usadas tanto na primeira, quanto
na segunda reação do nested-PCR. Na primeira reação os oligonucleotídeos usados
correspondem às SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2, e na segunda reação os
oligonucletídeos utilizados foram as SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4. O padrão de
termociclagem foi o mesmo para as duas etapas: desnaturação inicial a 94oC por 2
minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94oC por 40 segundos anelamento
a 59oC por 40 segundos, extensão a 63oC por 40 segundos, e extensão final a 63oC
por 3 minutos. Após cada etapa de PCR foi feito um gel de agarose a 1,5% com
brometo de etídio.
A reação do controle positivo aconteceu com as mesmas condições de mix (1,5
µl de DNA, tampão da PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 de cada dNTP, 0,25 µM de
cada oligonucleotídeo e 0,01U de Taq polimerase) usando as SEQ ID NO 5 e SEQ ID
NO 6 como oligonucleotídeos. O ciclo da PCR consistiu em uma etapa de
desnaturação inicial a 94oC por 2 minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94oC por 40
segundos, anelamento a 53oC por 40 segundos, extensão a 72oC por 40 segundos, e
uma etapa de extensão final a 72oC por 3 minutos. Após a etapa de PCR, a verificação
do fragmento de DNA foi observada em gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio.
Os novos oligonucleotídeos e o método que são objeto da presente invenção
foram desenhados para se anelarem em regiões do genoma do T. gondii que não
apresentam polimorfismos, o que permite a detecção de diferentes variantes do
protozoário, suprindo, assim, as deficiências apresentadas pelas reações que
empregam os oligonucleotídeos descritos previamente. A utilização da presente
invenção oferece vantagens ao analista principalmente em regiões onde variantes
atípicas do protozoário T. gondii ocorrem, por permitir maior eficácia na detecção e
possibilidade de automatização em plataformas para PCR já oferecidas no mercado.
96
REIVINDICAÇÕES
1. Método para detectar a presença do protozoário Toxoplasma gondii
caracterizado por compreender uma ou mais etapas em que um ou mais
oligonucleotídeos designados pelas sequências SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2,
SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, entram em contato com amostra que se pretende
analisar, e a amplificação ou replicação de uma região do gene que codifica a
proteína 7 do grânulo denso (GRA7) ou a detecção da hibridização de um ou
mais oligonucleotídeos indica a presença do protozoário Toxoplasma gondii na
amostra.
2. Método para detectar a presença do protozoário Toxoplasma gondii
caracterizado por compreender uma ou mais etapas em que um ou mais
oligonucleotídeos que apresentem pelo menos 70% de identidade com uma
das sequências SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4,
ou que sejam o seu reverso complementar, entram em contato com amostra
que se pretende analisar, e a amplificação ou replicação de uma região do gene
que codifica a proteína 7 do grânulo denso (GRA7) ou a detecção da
hibridização de um ou mais oligonucleotídeos indica a presença do protozoário
Toxoplasma gondii na amostra.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2 em que um ou mais
oligonucleotídeos designados pelas sequências SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6
entram em contato com amostra que se pretende analisar, e a amplificação ou
replicação de uma região do gene que codifica a proteína Actina ou a detecção
da hibridização de um ou mais oligonucleotídeos indica a presença de DNA ou
RNA na amostra.
4. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2 em que um ou mais
oligonucleotídeos que apresentem pelo menos 70% de identidade com
sequências SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, ou que sejam o seu reverso
complementar, entram em contato com amostra que se pretende analisar, e a
amplificação ou replicação de uma região do gene que codifica a proteína
Actina ou a detecção da hibridização de um ou mais oligonucleotídeos indica a
presença de DNA ou RNA na amostra.
97
5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por conter
oligonucleotídeos não marcados ou marcados com fluoróforos, biotina ou
enzimas.
6. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, em que a amostra a ser
analisada consiste em uma amostra biológica ou em uma amostra do ambiente.
7. Método de acordo com a reivindicação 6 em que a amostra a ser analisada
pode ser sangue, plasma, soro, líquido amniótico, líquido cerebrospinal, saliva,
fezes ou urina.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 em que a amostra a ser analisada
pode ser alimentos de origem animal ou vegetal, água, ou swab de superfícies.
98
FIGURAS
Figura 1
Figura 2
99
RESUMO
O presente invento consiste em sequências de ácidos nucleicos sintéticas, também
designadas oligonucleotídeos ou primers ou iniciadores de DNA, e seu uso para
detecção do protozoário Toxoplasma gondii. Os oligonucleotídeos quem compõem a
presente invenção se ligam em regiões específicas do gene que codifica a proteína 7
do grânulo denso (GRA7) do genoma do parasita Toxoplasma gondii, permitindo
detectar a presença deste parasita em diferentes amostras biológicas ou do ambiente,
utilizando-se a técnica de reação em cadeia pela DNA polimerase (PCR) ou técnicas
correlatas como real time PCR, insulated isotermal PCR ou hibridização por meio de
sondas marcadas (southern blot ou northern blot).
100
101
102
103
104
105
ANEXO C – Artigo em fase final de preparação
Molecular typing of Toxoplasma gondii using regions under positive selection
of the genes ROP5, GRA7 and ROP18
Maria Eduarda S. M. Costa1,3; Daniel C. F. Lanza1,3*.
1 - Laboratório de Biologia Molecular Aplicada - LAPLIC, Departamento de
Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2 - Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose, Departamento de
Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal,
RN, Brazil.
3 - Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
*Corresponding author:
Daniel Carlos Ferreira Lanza
Laboratório de Biologia Molecular Aplicada - LAPLIC
Departamento de Bioquímica
Centro de Biociências
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Natal, RN, Brazil. CEP: 59072-970
Phone: 55-84-3215-3416 Fax: 55-84-32153415
Email: [email protected]
106
Abstract
Recently, our group introduced a new nested-PCR protocol for the detection of T.
gondii with great sensitivity and specificity, based on the detection of the GRA7 gene.
In this work we propose a complement for this initial protocol, introducing a new
possibility for molecular typing of T. gondii strains. Our new test is based in the
identification of the polymorphic sites inside regions under positive selection in the
genes ROP5, ROP18 and GRA7. These genes encodes proteins that form the most
described complex interacting with the main mechanism of resistance in murine cell.
This new procedure is simpler than and as effective as the traditional RFLP method for
characterization of the three clonal lineages, and is quite promising for the
characterization of atypical strains of T. gondii.
Keywords
Apicomplexa, rhoptry, dense granule protein 7, toxoplasmosis, Toxoplasma
genotyping, Toxoplasma RFLP
For the clinical laboratory purposes, the greatest promise of the Toxoplasma
gondii genotyping is the possibility of predicting the potential virulence of different
strains, allowing better decisions about the treatment. Several molecular typing
approaches have been used to differentiate strains of T. gondii, such as polymerase
chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) (HOWE;
SIBLEY, 1995b), sequencing of introns (KHAN et al., 2007), microsatellite analysis
(AJZENBERG et al., 2002) and multi-locus enzyme electrophoresis (MLEE) (DARDÉ;
BOUTEILLE; PESTRE-ALEXANDRE, 1992). Among these, the PCR-RFLP using the
markers SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico and CS3
have shown the best results, primarily for its effectively for identification of clonal and
atypical strains (PENA et al., 2008; SU; ZHANG; DUBEY, 2006). Based on these
markers and virulence characteristics in a murine model, T. gondii strains have been
classified into three clonal lineages, types I (high virulent), II (low virulent) and III (low
virulent) (HOWE; SIBLEY, 1995b). So far, it is not known a direct relationship between
the RFLP markers used for T. gondii genotyping and virulence characteristics in
humans. Even in the widespread murine model, the relationship between RFLP
markers and virulence patterns were characterized by means of simple association;
107
molecular markers directly related to virulence have not yet been reported. This fact,
associated to the increment of atypical isolates described in recent years, has
hampered the precise identification of the new strains, creating a challenge in the
development of molecular markers that can be used to determine genotypic and
phenotypic characteristics of each strain, using an approach more simple and scalable
than the RFLP. (AJZENBERG et al., 2004; LEHMANN et al., 2004; PENA et al., 2008).
In this work we propose that the polymorphisms observed in some sites under
positive selection inside some T. gondii proteins that are involved in virulence are
sufficient informative to be used as markers for genotyping. Since the positive selection
are produced by variations in protein sequence, which confers higher fitness than the
average in the population (Suzuki & Gojobori, 1999), we hypothesized that the variable
regions of the proteins involved in T. gondii infection mechanisms can be used as
markers to infer virulence characteristics, and consequently to typing different strains.
The Table 1 summarizes the 10 proteins and their respective mechanisms involved in
T. gondii resistance and virulence. Taking into account the murine model, the best
characterized complex associated to virulence is constituted by ROP5 and ROP18
(BEHNKE et al., 2015; NIEDELMAN et al., 2012). Recently, was demonstrated that
GRA7 regulate this complex, interacting directly with ROP5 and promoting specific
phosphorylation of a threonine residue from ROP18, in its nucleotide-binding domain.
(FLECKENSTEIN et al., 2012; HERMANNS et al., 2015). The ROP5/ROP18/GRA7
complex are responsible for inhibit the interferon-gamma-inducible immunity-related
GTPases (IRGs) (BEHNKE et al., 2012; FLECKENSTEIN et al., 2012). Additionally,
there are other mechanisms involved T. gondii resistance in the host cell, as activation
of STAT3 and STAT6 by ROP16 (ONG; REESE; BOOTHROYD, 2010; YAMAMOTO
et al., 2009), activation of NF-кB pathway by GRA15 (ROSOWSKI et al., 2011),
regulation of cell cycle by GRA16 (BOUGDOUR et al., 2013), and the modulation of
the immune response by GRA24, GRA25 and MAF1(BRAUN et al., 2013; PERNAS et
al., 2014; SHASTRI et al., 2014) (Table 1).
We elected the ROP5/ROP18/GRA7 complex to validate our hypothesis.
Starting from three alignments referenced in Supplementary Table 1, and using the
software DNAsp (LIBRADO; ROZAS, 2009) we used the sliding window approach
(window length and step size of 35 for GRA7 and window length e step size of 50 for
ROP5 and ROP18) to determine the regions under positive selection inside ROP5,
ROP18 and GRA7 coding sequences. All regions found were also characterized
108
structurally, comparing the entire protein sequences with each respective secondary
structure predictions, as showed in Figure 1. The analysis of nonsynonymous to
synonymous ratio rate (dN/dS) revealed at least nine regions under positive selection
(peaks with values higher than 1) in the ROP5, three in ROP18 and two in GRA7
polypeptidic sequences (Figure 1 and Supplementary Figure 1). Predictions using the
software Foldindex (Prilusky et al., 2005) revealed that, with the exception of the first
two peaks found in ROP5, all regions under positive selection correspond to structured
sites of each protein. Curiously, the ProtScale analysis (GASTEIGER et al., 2005)
appoints that the higher peaks are located at hydrophobic regions, indicating that the
selection is occurring at sites that are inside the protein structures. In agreement, five
peaks of ROP5 and the higher peak found in ROP18 are located in the protein kinase
domain. The predictions schematized in Figure 1 are in agreement with previously
works that demonstrated that the ROP5 pseudokinase active site is under positive
selection (Behnke et al., 2015; Reese, Zeiner, Saeij, Boothroyd, & Boyle, 2011) as well
the entire protein ROP18 (KHAN et al., 2009). The sliding window approach used here
enable to observe that the positive selection can be occurring at the ROP18 kinase
active site and in the C-terminal region of GRA7.
The regions comprising the amino acids 437 - 511, 401 - 521 , 71 - 217 from
proteins ROP5, ROP18 and GRA7 respectively (correspondent respectively to peaks
7 and 8; 2; 1 and 2 in Figure 1) were selected, and primers flanking these regions
were designed in other to allow the amplification of fragments of 227, 365 and 442 bp
(Table 2) . All polymorphic sites which could cause changes in the encoded amino
acid, were determined and mapped in each region and subsequently the specific
amino acids that occur in each polymorphic site from the clonal and atypical lineages
were identified. Surprisingly, analyzing an alignment of all sequences of the clonal
lineages I, II and III we observed that each lineage has a specific amino acid profile.
The same particular amino acid sequence is observed for each of the atypical strains
analyzed (P89, CAST and GUYKOE). These specific patterns are shown in Table 3
referenced by their corresponding polymorphic sites in each polypeptide sequence.
When taken together, these three sequences are sufficient to genotype all clonal
lineages already described. We called these new molecular marker as Positive
Selection of Signature (PSS).
The classification of atypical strains is complex, so far, not even the default
system RFLP showed sufficient efficiency for accurate classification in most cases. We
109
believe that the analysis of the PSS markers will facilitate the classification of atypical
strains.
The possibility of genotype an organism with the genome of 80 Mb using the
information of only three sequences of 227 bp, 365 bp and 442 bp is a major
breakthrough, especially for the clinical routine. The system proposed in this work
should be validated in a larger number of samples, for this we are providing a so-called
software TOXOPLIC where the scientific community can their sub-ether sequences
and receive the results of genotyping (www.laplic.com.br). Positive selection has been
reported for genes SAG2, SAG4, ROP5, ROP18, ROP16, ROP17, GRA6, GRA7
(BEHNKE et al., 2015; KHAN et al., 2009; MINOT et al., 2012), but to date, they have
not been mapped regions under positive pressure in any of these polypeptide
sequences. We are convinced that the selection of new PSS markers will contribute
for the genotyping of T. gondii and other organisms with complex genomes.
Acknowledgements
We would like to thank Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) for financial support. M.E.S.M Costa was supported by a
scholarship from CAPES.
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112
Figure captions
Figure 1. In silico analysis of ROP5, ROP18 and GRA7. (A) Graphics generated by
DNAsp, evaluating the nonsynonymous/synonymous substitutions ratio (Pi(a)/Pi(s)).
Peaks above 1 represents positive selection. (B) Graphic of Foldindex showing
structured areas in green and unstructured in red. (C) Graphic of ProtScale showing
amino acids hydrophobicity. Above zero, hydrophobic; below zero, hydrophilic. (D)
Figure of ScanProsite showing the domains found.
Table 1. Genes related to virulence in T. gondii
Table 2. Designed primers for amplification of ROP5, ROP18 and GRA7
Table 3. Polymorphisms identified in amino acids sequences of ROP5, ROP18 and
GRA7
Supplementary figure 1. DNAsp output. Figure showing tables for ROP5, ROP18 and
GRA7 with values of Pi(a)/Pi(s) for each window. The peaks above 1 are highlighted
in the red squares.
Supplementary table 1. Number accession of the sequences used in this study
113
Figure 1
Table 1
Gene Complex Mechanism Reference
ROP5 ROP5/ROP18/GRA7 IRG binding Fleckenstein et al., 2012
ROP16 Unknown STAT3/6 phosphorylation Ong et al., 2010; Yamamoto et al., 2009
ROP17 ROP5/ROP17 Irgb6 phosphorylation Etheridge et al., 2014
ROP18 ROP5/ROP18/GRA7 Irga6 phosphorylation and ATF6β degradation
Fentress et al., 2010; Yamamoto et al., 2011
GRA7 ROP5/ROP18/GRA7 IRG binding and ROP5/ROP18 complex binding
Alaganan et al., 2014; Hermanns et al., 2015
GRA15 Unknown Activation of NF-кB Rosowski et al., 2011
GRA16 Unknown HAUSP and PP2A binding Bougdour et al., 2013
GRA24 Unknown P38α MAP kinase activation Braun et al., 2013
GRA25 Unknown CCL2/CXCL1 induction Shastri et al., 2014
MAF1 Unknown Host mitochondrial association Pernas et al., 2014
114
Table 2
Primer Name Sequence 5’ – 3’ Tm (ºC) Product
size
ROP5F CACGGCAACATTTACACACG 58,3 227 bp
ROP5R GCCTATCGAAGTTGAGGAACC 58,4 ROP18F TCAAGCTCAGGGAATTGTGC 58,5
365 bp ROP18R GGAGCATCCGTTTCTGAGG 57,9 GRA7FI CACCAGCATGGATAAGGCATC 59,1
442 bp GRA7R CTGCCGTGATCTGTTTTTGC 58,3
Table 3
ROP5
ROP5A
Strains 452 453 460 472 473 480 488 490 491 493 494 495 500 503
Type I S I F G S L S F P A P V E I
Type II S I V R T R L D S I P V Q T
Type III S I V G S L S F P A P V E I
P89 S I V G S L S F P A P V E I
CAST S I F G S L S F P A P V E I
GUYKOE S I V G S R P F S T R L Q I
ROP18
Strains 413 432 433 439 442 451 454 455 456 457 458 459 463 481 498 510 515
Type I A R I R G R Q A T G I T P R P S D
Type II A R I P G R Q T T D I T T R P N E
Type III P K T P G Q H S Y G V T A S S N E
P89 P K T P G Q H S Y G V T A S S N E
CAST A R I R G R Q A T G I T P R P S D
GUYKOE A R I R G R Q A T G I I P R P S D
GRA7
Strains 83 96 106 115 120 129 160 161 167 170 172 176 178 182 185 194 197 199 201 202
Type I P E R N H K L V E R D T G G L A L M L T
Type II P E R N H K I L Q T E T G S L A L M L T
Type III P E G H N K I L Q T D S G S I A L L I K
P89 P E G H N K I L Q T D S G S I V L L I K
CAST P E G H H M I M Q A D T G N L V L L I K
GUYKOE P E R N H K I L Q A E T S N L A L M L T
115
Supplementary figure 1
Supplementary table 1
Gene Number of sequences
Accession number
ROP5 54 EF466101; HQ916453; XM_002371884; DQ116423; BK008047; BK008045; HQ916458; BK008044; BK008043; JQ743764; BK008046; HQ916457; JQ743777; BK008057; BK008053; HQ916454; JQ743771; JQ743769; JQ743767; HQ916452; HQ916451; JQ743774; JQ743775; JQ743772; JQ743776; BK008052; BK008056; JQ743746; JQ743744; JQ743737; HQ916448; JQ743747; HQ916450; JQ743741; JQ743743; JQ743739; JQ743762; JQ743757; JQ743758; JQ743761; JQ743740; JQ743753; HQ916459; HQ916456; JQ743738; JQ743742; BK008055; HQ916460; HQ916455; JQ743783; JQ743782; JQ743780; JQ743781; JQ743779
ROP18 20 GQ243216; GQ243210; JX045318; JX045319; GQ243211; GQ243207; GQ243215; GQ243209; GQ243208; GQ243205; GQ243213; JX045345; AM075204; GQ243202; JX045344; GQ243204; JX045334; JX045335; GQ243206; GQ243203
GRA7 85 JX045634; JX045635; JX045619; JX045620; JX045608; JX045609; JX045595; JX045604; JX045605; JX045596; JX045598; JX045585; JX045586; AK317819; XM_002367572; JX045589; JX045590; JX045578; JX045579; DQ459452; DQ459456; EU157155; DQ459454; DQ459455; U79158; EU157156; EU157143; EU157144; EU157171; EU157170;
116
EU157178; EU157149; EU157167; DQ459453; EU157166; JX045628; JX045629; Y13863; JX045614; JX045615; EF626965; EF626966; DQ459445; DQ459446; DQ465955; DQ459450; DQ459451; EU157179; EF639859; DQ459443; EU157183; EU157141; EU157146; JX045613; EU157151; EU157152; EU157162; EU157164; EU157153; EU157154; DQ459448; DQ459449; EU157157; JX045597; EU157163; EU157172; JX045583; JX045584; EU157142; EU157148; EU157175; EU157150; EU157177; DQ473315; JX045600; JX045601; HM016952; JX045599;