neyza emilia de oliveira salomÃo...2016 salomão, n.e.o. agradecimentos 4 salomão, n.e.o....

NEYZA EMILIA DE OLIVEIRA SALOMÃO

AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL LEISHMANICIDA DE DERIVADOS DE

ALDIMINAS E ADUTOS DE HANTZSCH

OURO PRETO - MG

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO - UFOP Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB

Programa de Pós Graduação em Biotecnologia

NEYZA EMILIA DE OLIVEIRA SALOMÃO

AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL LEISHMANICIDA DE DERIVADOS DE

ALDIMINAS E ADUTOS DE HANTZSCH

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Biotecnologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas

da Universidade Federal de Ouro Preto como requisito para

obtenção do título de Mestre em Biotecnologia na área de

concentração de Biotecnologia aplicada à saúde humana e

animal.

Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.

Coorientador: Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo

de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.

Coorientador: Dr. Diogo Garcia Valadares – Carver College of Medicine - University of Iowa –

USA.

Ouro Preto – MG

2016

Salomão, N.E.O. Agradecimentos

4

Salomão, N.E.O. Colaboradores

i

Dra. Cláudia Martins Carneiro1

Ms. João Filipe Vieira1

Dr. Ângelo de Fátima2

Dr. Cleiton Moreira da Silva2

Ms. Taniris Cafiero Braga2

Dra. Nádia das Dores Moreira3

Dr. Bruno Mendes Roatt4

1. Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais.

2. Grupo de Estudos em Química Orgânica e Biológica (GEQOB) Departamento de Química

do Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,

Minas Gerais.

3. Laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado

do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.

4. Universidade Federal de Minas Gerais/COLTEC, Belo Horizonte, Minas Gerais.

Suporte Financeiro

Capes/CNPq– Bolsa de Pós-Graduação Institucional de Assistência ao Ensino

PRONEX – Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais

Apoio e Instituições Parceiras

Universidade Federal de Ouro Preto, UFOP/MG

Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG/MG.

Salomão, N.E.O. Epígrafe

ii

É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas mesmo expondo-se ao fracasso,

do que alinhar-se com os pobres de espirito, que nem gozam muito, nem sofrem muito,

porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.

(Theodore Roosevelt)

Salomão, N.E.O. Dedicatória

iii

Dedico,

Aos meus pais, Francisca e Nildo, pelo apoio, amor e exemplos de caráter, dos quais tenho

imenso orgulho de ser filha.

Aos meus sobrinhos Lucas e Albert, por fazer meus dias mais alegres. São a luz da minha

vida.

Ao meu irmão, Clayton, pelo incentivo e apoio durante essa fase.

Amo vocês


iv

Ao meu orientador Dr. Alexandre Reis, pela oportunidade que me foi dada e importante

contribuição em minha formação acadêmica. Pelo acolhimento, atenção e ajuda prestada, pelo

exemplo de dedicação e comprometimento com a Ciência. Sempre terá minha admiração,

respeito e agradecimento.

Ao meu coorientador e eterno “chefinho” Dr. Rodrigo Dian, a quem não tenho palavras

suficientes para expressar o que fez por mim. Por todo suporte e paciência. Por me coorientar

e fazer isso com responsabilidade, seriedade e comprometimento. Aprendi muito com você.

Pelo apoio, risadas e palavras de incentivo, como: “Calma, que no fim tudo dá certo!”. Ao

respeito e educação nos momentos em que precisou chamar minha atenção. Tudo isso faz de

você um excelente profissional, um ser humano humilde e de coração gigante. Tem minha

eterna gratidão.

Ao meu coorientador Dr. Diogo Valadares, pela disponibilidade e pelos ensinamentos

científicos.

Ao Programa de Pós Graduação em Biotecnologia/NUPEB e ao coordenador Dr. William de

Castro, pela presteza nos serviços do programa e auxílio nos trâmites.

Ao secretário do programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Josino Barbosa, pela

prontidão e empenho em resolver nossas dúvidas.

A Capes/CNPq pela concessão da bolsa.

Ao Dr. Ângelo de Fátima, do Grupo de Estudos em Química Orgânica e Biológica da UFMG,

pelo fornecimento dos compostos químicos testados em nosso estudo e pela disponibilidade

em discutir e prestar informações sobre os mesmos.

À toda equipe do LIMP, pelos ensinamentos e convivência. Com vocês, aprendi que trabalhar

em uma equipe tão grande requer paciência, respeito e humildade. Parecemos uma família que

briga, discute, estressa, mas que sempre temos com quem contar. Muito obrigada por tudo!!


v

À minha família. Em especial aos meus pais, pelo exemplo de força e perseverança. Por todo

amor.

À minha mãe, que é minha amiga e confidente, por ser tão presente e forte. Por nunca me

deixar desanimar, mesmo nos momentos mais difíceis desta nossa caminhada. Pelas vezes em

que deixou de realizar os seus sonhos para que eu conquistasse os meus. Eu jamais teria

conseguido sem você. Te amo!

À minha avó Francisca que, mesmo distante, acalmava-me com suas lindas palavras.

À Carolzinha, Gleise e Luciana, que me acolheram desde o primeiro momento e foram tão

presentes em minha vida, tanto acadêmica quanto pessoal, vocês foram essenciais. Não

poderia deixar de agradecer à Jamille, ao Fernando, ao Rory, ao Levi e ao João Português,

pelo auxílio no desenvolvimento da minha dissertação, pelas melhores risadas e tantos

apelidos que recebi. Jamais me esquecerei de vocês.

À Nádia Moreira, por todo apoio desde a seleção do mestrado, pela disposição em sempre

ajudar e pelas palavras de fé e incentivo. Tem meu eterno agradecimento.

Ao professor Wendel, pela atenção, colaboração e disposição em ajudar.

Aos alunos e ex-alunos de IC (Diogo Albert, Élcio, Jéssica, Luiza, Mariana Laiz, Marcelo,

Paula, Thaís Ostolin e Valéria) pela ajuda e disposição. Em especial, à Narjara pela

colaboração e comprometimento durante os meus experimentos. Muito obrigada a todos!

Aos meus amigos Edivan Jr., Kelly, Miura e Morgana que, mesmo distante, estão presentes

com a amizade, afeto e amor. Foi como se estivessem sempre ao meu lado. Amo vocês!

À Walerryne Same, pelo companheirismo, amizade e carinho. Por tentar me acalmar nos

momentos mais difíceis deste mestrado, por acreditar em mim e em meu potencial e por me

incentivar a alcançar meus objetivos. Com você, ficou mais fácil esta caminhada. Amo você!


vi

Aos meus amigos colombianos, por todos os nossos momentos nessa cidade. Em especial à

minha amiga Ivon, que foi de extrema importância nesta caminhada em Ouro Preto. Sempre

presente em todos os momentos! Obrigada pela amizade sincera e por existir em minha vida!

À Maria Josiane, pela grande amizade, por ser tão presente nos momentos mais críticos e

alegres e ser uma pessoa de coração enorme. Tem meu eterno agradecimento.

Às meninas da “República Poucas & Boas”, pela convivência, paciência, amizade, risadas e

pelos “rocks”. Jamais me esquecerei dos momentos compartilhados. Vocês são ótimas!

A Deus, por me dar força e determinação para prosseguir na busca dos meus objetivos.

A todos aqueles que, de uma maneira ou de outra, colaboraram para que este trabalho se

concretizasse. Têm meus sinceros agradecimentos!

Salomão, N.E.O. Sumário

vii

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1

2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 4

2.1 Leishmanioses .............................................................................................................. 5

2.2 Leishmaniose Visceral ................................................................................................. 6

2.3 Quimioterapia Empregada no Tratamento da Leishmaniose Visceral ...................... 10

2.4 Antimoniais Pentavalentes ......................................................................................... 11

2.5 Anfotericina B ............................................................................................................ 13

2.6 Miltefosina ................................................................................................................. 16

2.7 Outras Drogas ............................................................................................................ 18

2.8 Terapia Combinada .................................................................................................... 21

2.9 Novas Formulações .................................................................................................... 22

2.10 aldiminas ................................................................................................................ 22

2.11 adutos de Hantzsch ................................................................................................. 24

3 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 27

4 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 29

4.1 Objetivo Geral ............................................................................................................ 30

4.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 30

1ª Etapa: Testes de drogas clássicos in vitro .................................................................... 30

2ª Etapa: Testes de drogas in vitro por citometria de fluxo .............................................. 30

5 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 31

5.1 Organismos e células ................................................................................................. 32

5.1.1 Cultivo de Leishmania infantum ........................................................................ 32

5.1.2 Cultivo dos macrófagos imortalizados ............................................................... 32

5.1.3 Transfecção das promastigotas de L. infantum cepa OP46 com o Gene Repórter

GFP...................................................................................................................................33

5.2 Compostos químicos: aldiminas, adutos de Hantzsch e Anfotericina B Desoxicolato

de Sódio ................................................................................................................................ 36

5.3 Delineamento experimental ....................................................................................... 36

5.4 Ensaio de citotoxicidade ............................................................................................ 38

5.4.1 Avaliação in vitro da citotoxicidade: Macrófagos Caninos DH82 e em

Macrófagos Murinos J774.A1 .......................................................................................... 39

5.5 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em

formas promastigotas ............................................................................................................ 40

Salomão, N.E.O. Sumário

viii


formas amastigotas de L. infantum ....................................................................................... 41

5.6.1 Método clássico: microscopia ótica .................................................................... 41

5.6.2 Citometria de Fluxo ............................................................................................ 43

5.7 Análise estatística ...................................................................................................... 45

6 RESULTADOS ................................................................................................................ 46

6.1 Apresentação de resultados ........................................................................................ 47

6.2 Avaliação in vitro da citotoxicidade .......................................................................... 47

6.2.1 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de aldiminas em

culturas secundárias de macrófagos ................................................................................. 48

6.2.2 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de adutos de

Hantzsch em culturas secundárias de macrófagos ............................................................ 50


promastigota de L. infantum da cepa OP46 .......................................................................... 52


formas amastigotas de L. infantum ....................................................................................... 55

6.4.1 Método clássico: Microscopia ótica ................................................................... 55

6.5 Citometria de fluxo .................................................................................................... 60

6.5.1 Atividade leishmanicida de aldiminas em macrófagos caninos (DH82)

infectados com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente (GFP) ................. 60

6.5.2 Atividade leishmanicida de adutos de Hantzsch em macrófagos caninos (DH82)

infectados com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente

(GFP).................................................................................................................................63

7 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 65

8 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 78

9 PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 80

10 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 82

11 ANEXOS ....................................................................................................................... 94

Anexo 1: ............................................................................................................................... 95

Anexo 2: ............................................................................................................................... 99

Salomão, N.E.O. Lista de Abreviaturas

ix

AmB - D Anfotericina B desoxicolato de sódio

ANVISA Agência Nacional De Vigilância Sanitária

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

FDA Food and Drug Administration

g Gramas

GFP Proteína verde fluorescente

IC50 Concentração Inibitória 50%

Kg Quilograma

LIT Liver infusion tryptose médium

LV Leishmaniose Visceral

LVC Leishmaniose Visceral Canina

LVH Leishmaniose Visceral Humana

mg Miligrama

mL Mililitro

MS Ministério da Saúde

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazólio

OMS Organização Mundial de Saúde

PBS Phosphate buffer saline (tampão fosfato salina)

PVC - LV Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral

RFP Proteína vermelha fluorescente

rpm Rotação por minuto

RPMI Meio de Cultura com Vermelho de Fenol

Sb5+ Antimoniais pentavalentes

SDS Detergente dodecil sulfato de sódio

SFB Soro fetal bovino

SUS Sistema Único de Saúde

WHO World Health Organization (OMS)

Μg Microgramas

µl Microlitros

Salomão, N.E.O. Lista de Figuras

x

Figura 1: Ciclo de vida das espécies de Leishmania causadoras de LV ................................... 6

Figura 2: Aspectos Epidemiológicos da leishmaniose visceral no mundo................................8

Figura 3: Estrutura química dos Antimoniais Pentavalentes (Sb5+) ........................................ 13

Figura 4: Estrutura química da Anfotericina B ....................................................................... 15

Figura 5: Estrutura química da Miltefosina............................................................................. 18

Figura 6: Outras drogas empregadas na terapia da leishmaniose ............................................ 21

Figura 7: Estrutura Geral das Aldiminas ................................................................................. 23

Figura 8: Síntese da 1,4-dihidropiridinas de Hantzsch ........................................................... 25

Figura 9: Avaliação da morfologia e fluorescência de promastigotas de Leishmania infantum

OP46 e OP46GFP por citometria de fluxo. .............................................................................. 35

Figura 10: Delineamento experimental referente aos experimentos desenvolvidos neste

estudo. ....................................................................................................................................... 38

Figura 11: Sequencia de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de

macrófagos infectados com leishmania GFP+ após o tratamento in vitro com diferentes

compostos de aldiminas e adutos de Hantzsch. ........................................................................ 45

Figura 12: Avaliação da citotoxicidade das aldiminas em Macrófagos Murino (J774.A1) e

Macrófagos Canino (DH82) ..................................................................................................... 49

Figura 13: Avaliação da citotoxicidade dos adutos de Hantzsch em Macrófagos Murino

(J774.A1) e Macrófagos Canino (DH82) ................................................................................. 51

Figura 14: Avaliação da atividade Leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em

Promastigotas de L. infantum OP46 ......................................................................................... 54

Figura 15: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com

amastigotas de L. infantum (OP46) por microscopia óptica. .................................................... 57

Figura 16: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82)

infectados com amastigotas de L. infantum (OP46) por microscopia ópitica. ......................... 59

Figura 17: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com

amastigotas de L. infantum (OP46 GFP) por Citometria de Fluxo. ......................................... 62

Figura 18: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82)

infectados com amastigotas de L. infantum (OP46 GFP) por Citometria de Fluxo. ................ 64

Salomão, N.E.O. Lista de Tabelas

xi

Tabela 1: Valores de Concentração Inibitória de 50% (IC50) para os macrófagos, nos tempos

de 24, 48 e 72 horas de tratamento, de cada droga e da AmB-D. ............................................ 52

Salomão, N.E.O. Resumo

xii

A Leishmaniose Visceral (LV) é a forma mais grave e devastadora da doença, que se não

diagnosticada e tratada a tempo leva a óbito. O tratamento convencional da LV é baseado

num repertório terapêutico restrito de fármacos como o antimoniato pentavalente e a

anfotericina B, que apresentam elevada toxicidade. Dessa forma, o desenvolvimento de novas

estratégias terapêuticas e a prospecção de novos fármacos é fundamental para o controle e

tratamento da doença. Uma possível alternativa para novos medicamentos são os compostos

sintéticos, e neste cenário encontram-se os derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch que

demonstraram prévia ação antifúngica e leishmanicida. Assim, nesse estudo propusemos

testar in vitro a ação leishmanicida destes derivados de aldiminas (n=7) e adutos de Hantzsch

(n=5) em diferentes células e por metodologias distintas. Avaliamos a citotoxicidade dos

diferentes compostos pelo método colorimétrico de Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-

difenil tetrazólio (MTT) em macrófagos murino (J774.A1) e canino (DH82) sendo observada

uma maior citotoxicidade nos compostos de Aldiminas 3I5 e 3D7 com IC50 de 15 e 10 μg/ml,

respectivamente. Ao contrário e de maneira satisfatória, os A. de Hantzsch demonstraram uma

baixa citotoxicidade em comparação às formulações de aldiminas. A ação leishmanicida em

promastigotas de L. infantum, cepa (OP46), dos diferentes compostos ocorreu logo após as 24

de tratamento com valores de redução inferiores a 25% da viabilidade, sendo mais

evidenciada, principalmente no tempo de 72 horas de contato com as aldiminas (3H8 e 3G2) e

com os a. Hantzsch (8B5 e 8B6) a viabilidade das promastigotas foi reduzida acima de 50%.

Para a avaliação in vitro da atividade leishmanicida em amastigotas do parasito foram

empregados macrófagos caninos DH82 infectados com promastigotas de L. infantum (OP46)

e tratados com os diferentes compostos químicos por 24, 48 e 72 horas, sendo avaliado por

análise microscópica bem como por citometria de fluxo empregando a L. infantum cepa

(OP46) transfectada com o gene repórter GFP e os resultados encontrados foram semelhantes

entre as duas metodologias empregadas (microscopia e citometria de fluxo). De um modo

geral foi observado redução no percentual de infecção principalmente após 48 horas de

tratamento para os compostos testados. No grupo das aldiminas, os compostos 3H8, 3H9 e

3D7 apresentaram reduções maiores na taxa de infecção dos macrófagos, chegando a

porcentagens de redução próximas ao controle positivo tratado com Anfotericina B. Nos

compostos do grupo de a. de Hantzsch destacam-se os compostos 8A2, 8B5 e 8B6, em que

principalmente o 8B6 mostrou redução significativa no percentual de infecção em relação ao

grupo controle em ambos os testes (microscopia e citometria de fluxo) em todos os tempos de

avaliação (24, 48 e 72 horas). Os resultados in vitro demonstram à baixa citotoxicidade e

satisfatória atividade leishmanicida tanto em promastigotas quanto em amastigotas de L.

infantum de alguns dos compostos químicos de aldiminas (3H7 e 3D7) e a. de Hantzsch (8A4

e 8B6) testados. O conjunto de dados obtidos sugere que os compostos aqui avaliados

possuem o potencial leishmanicida e merecem ser considerados bons candidatos para

prosseguirem em estudos de quimioterapia experimental in vivo para Leishmaniose Visceral.

Palavras-chave: aldiminas, adutos de Hantzsch, macrófagos, promastigotas e amastigotas de

Leishmania infantum GFP, citotoxicidade, atividade leishmanicida, citometria de fluxo.

Salomão, N.E.O. Abstract

xiii

Visceral Leishmaniasis (VL) is the most severe form of Leishmaniasis and when it’s not

diagnosed and treated in time, consistently leads to death. Conventional treatment for VL is

usually limited to a small group of drugs, like pentavalent antimonials and amphoterecin B,

which are known for their high toxicity. Due to this restrictions, it is essential to promote new

therapeutic strategies and drug screening studies for leishmaniasis treatment. A promising

alternative for treatment of VL are syntethic compounds, including Aldimine and Hantzsch

Adutes by-products, which have proved to have antifungal and antileishmanicidal hability. In

this study, we set out to study the in vitro leishmanicidal hability of by-products of Aldimine

(n=7) and Hantzsch Adutes (n=5) in macrophages from different origins using distinct

methodologies. The cytotoxicity of these compounds was evaluated, using (3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium reduction assay (MTT) in

murine (J774.A1) and canine (DH82) macrophages and it was concluded that by-products of

Aldimine, 3I5 and 3D7, have the highest toxicity, with an IC50 of 15 and 10 μg/ml,

respectively. On the contrary and satisfyingly, Hantzsch Adutes, were generaly less toxic

compared with Aldimine derivates. The leishmanicidal activity of these compounds was also

evaluated, using L. infantum (OP46) strain promastigotes, and the it was concluded that there

was some leishmanicidal activity after 24 hours, with less than 25% drops in parasite

viability. In later time points (72h), more than 50% drops in parasite viability were apparent,

particularly with Aldimines (3H8 and 3G2) and Hantzsch Adutes (8B5 and 8B6). To evaluate

in vitro leishmanicidal activity in amastigote forms of L. infantum, DH82 macrophages

infected with L. infantum (OP46) promastigotes were used and subsequently treated with the

full spectrum of drugs for 24, 48 and 72 hours, for this purpose microscopical analysis and

flow citometry (using for this particular methodology the same L. infantum strain transfected

with the reporter gene GFP) were used and similar results were accomplished using both

methodologies. In general, a drop in infection rate was observed, mainly after 48 hours of

treatment. Specifically to Aldimine by-products, 3H8, 3H9 and 3D7 were capable of major

drops in infection rate and their performance was similar to that of Amphoterecin B. With

respect to the Hantzsch Adutes by-products, 8A2, 8B5 and 8B5 demonstrated a remarkable

hability to reduce infection rate, particularly 8B6 which was capable of reducing infection rate

in both methodologies used and through all time points (24, 48 and 72h). In this in vitro

results it becomes apparent that Aldimine by-products 3H7 and 3D7 and Hantzsch Adutes

8A4 and 8B6 demonstrate low toxicity and satisfying leishmanicidal activity, both in

promastigote and amastigote forms. Taking in consideration that some of the compounds

Salomão, N.E.O. Abstract

xiv

tested demonstrated leishmanicidal hability, it is believed that they deserve consideration for

future experimental chemoterapy in vivo studies, regarding Visceral Leishmaniasis.

Key words: Aldimines, adducts Hantzsch, macrophages, Promastigotes and amastigotes forms

from Leishmania infantum GFP, cytotoxicity, Leishmanicidal activity, Flow cytometry.

1 INTRODUÇÃO

Salomão, N.E.O. Introdução

2

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença sistêmica causada por protozoários do

gênero Leishmania. É uma doença endêmica em todos os continentes, com exceção da

Oceania, responsável por cerca de 500 mil novos casos e 59 mil óbitos a cada ano. No

continente americano, a LV humana ocorre desde o México até países da América do Sul,

sendo o Brasil responsável por 90% dos casos registrados em todo o continente. A doença

atinge 26 unidades da federação brasileira e dentre as cinco regiões do país, sua maior

incidência ocorre na região nordeste (Secretaria de Vigilância em Saúde –MS, 2010a).

O controle das Leishmanioses é bastante complexo em função da diversidade de

agentes, reservatórios, vetores e situação epidemiológica, aliadas ao conhecimento

insuficiente sobre vários destes aspectos (MS, 2006a, 2007). Neste sentido, as medidas de

controle da LV existentes no país, estão baseadas em um tripé de medidas de ações que

preconiza o diagnóstico e tratamento imediato de pessoas doentes; controle vetorial através da

pulverização de inseticidas com efeito residual e eutanásia de cães soropositivos (Desjeux,

2004).

O tratamento das leishmanioses em pacientes humanos é feito através de

quimioterapia, que na maioria dos casos proporciona a sua cura (Seifert et al., 2011). No

entanto, quando o assunto são as doenças tropicais há pouca preocupação por parte da

indústria farmacêutica, devido aos grandes investimentos e baixo retorno (Trouiller et al.,

1999). Dessa forma, por se tratar de doenças atreladas a pobreza, o arsenal terapêutico

disponível para o tratamento da LV é bastante precário e restrito (Gil et al., 2008).

Os fármacos disponíveis para o tratamento da doença são os Antimoniais

Pentavalentes (antimoniato de meglumina e o estibogluconato de sódio), Anfotericina B,

pentamidina, miltefosina e paramomicina (WHO, 2010a). Porém, um fator de grande

preocupação no uso das drogas tradicionais é a presença de alta toxicidade e resistência dos

parasitos (Tempone et al., 2005). Outro ponto importante e crítico do tratamento com essas

drogas são as vias de administração que, com exceção da miltefosina (via oral), requerem

aplicações por via intramuscular ou endovenosa, que além de dolorosas, são administradas

por longos períodos, exigindo internação do paciente, acarretando em alto custo (Braga et al.,

2007) e muitas vezes no abandono do tratamento pelo paciente (Croft & Coombs, 2003).

Diante disto, o grande desafio ao longo dos anos tem sido o desenvolvimento de novos

medicamentos ou novas formulações das drogas já existentes. Mediante essa necessidade para

o tratamento de doenças parasitárias e negligenciadas, a OMS, incentiva o estudo de novos

compostos sintéticos ou naturais que visem perspectivas no desenvolvimento de drogas mais

Salomão, N.E.O. Introdução

3

eficazes (WHO, 1990). Isso leva a uma importante estratégia que é o desenvolvimento de

compostos sintéticos e seus derivados, que possibilitam maior viabilidade de produção e

redução de custos (Tiuman et al., 2011).

Nessa perspectiva, nesse porpôs-se a avaliar a ação leishmanicida de 12 compostos

químicos desenvolvidos a partir de dois grupos de compostos sintéticos - aldiminas e adutos

de Hantzsch – comparados a um grupo controle (não tratado) e a um grupo tratado com

Anfotericina B (AmB-D) (controle positivo de tratamento). Na tentativa de êxito na obtenção

de que estes compostos tenham atividade leishmanicida, as diferentes drogas foram avaliadas

por diferentes metodologias in vitro convencionais – para determinação da citotoxicidade

(IC50 pelo ensaio do MTT) e potencial leishmanicida em promastigotas (CC50 pelo ensaio do

MTT) e em amastigotas de L. infantum cepa OP46, (através da análise por microscopia óptica

da redução da infecção em macrófagos) bem como por metodologias in vitro empregando a

citometria de fluxo e a cepa OP46 L. infantum transfectada com gene repórter para GFP com

intuito de melhorar a rapidez e confiabilidade dos resultados.

2 REVISÃO DE LITERATURA

Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura

5

2.1 Leishmanioses

As leishmanioses são um grupo de doenças consideradas antropozoonoses, de

transmissão vetorial, cujos agentes etiológicos são protozoários pertencentes ao gênero

Leishmania (Família: Trypanosomatidae, Ordem: Kinetoplastida), nomeado por Ross em 1903

(Gontijo e Carvalho, 2003).

Entre as Doenças Tropicais Negligenciadas, a leishmaniose é uma enfermidade que

ocupa o segundo lugar em mortalidade e quarto lugar em morbidade no mundo. A doença está

fortemente atrelada à pobreza e as populações mais afetadas vivem em áreas rurais, periferias

urbanas e zonas de conflito, onde os recursos investidos para o tratamento, diagnósticos e

controle da doença são limitados (Yamey & Torreele, 2002). Nas últimas décadas, as

leishmanioses têm se expandido e estabelecido nas áreas urbanas e peri-urbanas, através da

adaptação de seus vetores e a presença de reservatórios aos ambientes artificiais (Ashford, 2000).

O gênero Leishmania possui ciclo biológico heteroxênico, cujas formas de

desenvolvimento alternam-se entre hospedeiros vertebrados e insetos vetores hematófagos que

transmitem o parasito durante o repasto sanguíneo (Killick-Kendrick, 1979). O hospedeiro

invertebrado é o inseto vetor da família Psychodidae, sub-Família Phlebotominae, do gênero

Phlebotomus (Velho Mundo) ou Lutzomyia (Novo Mundo) que se torna infectado durante o

repasto sanguíneo em indivíduos doentes (ciclo antroponótico da LV no Velho Mundo) ou em

reservatórios animais (ciclo zoonótico). O ciclo de vida da Leishmania é caracterizado por duas

diferentes formas: promastigota (células flageladas presente no intestino do vetor) e amastigota

(células imóveis, presente no interior de fagócitos de mamíferos domésticos, silvestres e do

homem), sendo responsável pela patologia da doença (Bates; Rogers 2004).

O ciclo biológico ocorre quando o protozoário na forma promastigota habita o

intestino do flebotomíneo (MS, 2006a). A infecção no hospedeiro vertebrado ocorre após a

picada da fêmea de flebotomíneos infectadas, que inocula a forma infectante – promastigotas

metacíclicas - durante o repasto sanguíneo (Bastien et al., 1992). Após a picada, a Leishmania é

depositada por meio da glândula salivar e juntamente com as secreções salivares que possui

abundancia de proteínas, que auxiliam no sucesso da infecção e na sobrevivência (Ribeiro et

al., 2010). Assim, os parasitos são internalizados por macrófagos, onde perdem os flagelos e

transformam-se em formas amastigotas dando inicio a sua multiplicação. Normalmente, os

macrófagos infectados se rompem e liberam as amastigotas, que serão fagocitadas por outros

macrófagos, gerando um ciclo repetitivo (Basano & Camargo, 2004). A multiplicação binária


6

das amastigotas destrói a célula hospedeira disseminando-se pelo sistema linfático e vascular,

infiltrando-se na medula óssea, fígado e baço. Quando um novo flebotomíneo alimenta-se,

ocorre a sua infecção por ingestão de formas amastigotas. Estas se diferenciam em

promastigotas no estômago dos insetos que após uma metacilogênese, evoluem para formas

metacíclicas que infectarão novo hospedeiro mamífero em um próximo repasto sanguíneo

(Chappuis et al., 2007).

Figura 1: Ciclo de vida das espécies de Leishmania causadoras de LV.

http://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html

A leishmaniose é caracterizada por um amplo espectro de manifestações clínicas,

principalmente leishmaniose visceral (LV) e cutânea (LC), sendo a última subdividida em

leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose difusa (LCDF), leishmaniose disseminada

(LCD) e leishmaniose muco-cutânea (LMC) (WHO, 2010a).

2.2 Leishmaniose Visceral

A leishmaniose visceral (LV), manifestação clínica mais grave da doença, é endêmica

em todos os continentes, com exceção da Oceania. A LV é caracterizada por febre, perda de

peso, esplenomegalia, pancitopenia, hepatoesplenomegalia, anemia, dentre outras manifestações

mais grave que se não tratadas evoluem o paciente ao óbito (Gontijo & Melo, 2004). Os

http://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html


7

parasitos atacam o sistema fagocitico mononuclear (SFM) principalmente fígado, baço e medula

óssea, sendo isto o responsável pelo aparecimento dos sinais e sintomas clínicos que

caracterizam a LV. A doença é letal em praticamente todos os casos não tratados (Herwaldt,

1999).

A LV, também conhecida como Calazar é uma doença sistêmica causada por

protozoários do complexo donovani: Leishmania (Leishmania) donovani e Leishmania

(Leishmania) infantum (Herwaldt, 1999). Na África e na Índia, o agente etiológico responsável

pela endemia é L. donovani. No Oriente Médio, Ásia, Mediterrâneo é a L. infantum. Nas

Américas a LV é causada pela espécie L. chagasi, sendo o Brasil responsável por 90% dos casos

registrados da doença no continente Americano (Silva et al., 2007). Sabe-se atualmente, que a

Leishmania chagasi é sinônimo de L. infantum, baseado em estudos bioquímicos e moleculares

(Leblois et al., 2011).

A LV é considerada uma doença endêmica em 88 países, aproximadamente 90% dos

casos notificados no mundo ocorre em Bangladesh, Índia, Nepal, Etiópia, Sudão e Brasil (Alvar

et al., 2012). Atrás da malária e da filariose, a LV é considerada a terceira doença mais

importante, mundialmente, transmitida por insetos vetores (Reithinger & Davies, 20b02).

Sabe-se que 59.000 pessoas morrem anualmente de leishmaniose visceral (LV), dentre

as quais 35.000 são homens e 24.000, mulheres. Porém, é importante entender que estes dados

são subestimados, devido às limitações no sistema de notificação de cada país onde a

enfermidade ocorre. Devido à ampla distribuição geográfica e a elevada mortalidade da LV,

especialmente nos países menos desenvolvidos, estima-se que anualmente a incidência é de

500.000 novos casos de LV, com 59 mil óbitos em vários países da Europa, Ásia, Oriente Médio,

África e Américas (WHO, 2010b).

No continente Americano a LV é encontrada desde o México até na Argentina. No

Brasil, a LV é uma doença endêmica, estando atualmente distribuídas em todas as unidades da

federação, atingindo as cinco regiões do país. Devido á grande distribuição, a LV apresenta

aspectos geográficos, climáticos e sociais diferenciados entre as regiões (MS, 2010a).

A primeira suspeita e identificação de LV no continente Americano ocorreu em 1911,

pelo brasileiro Carlos Chagas, que relatou uma esplenomegalia em crianças da Bacia Amazônica

(Chagas et al., 1938). Porém, o primeiro registro da doença no Brasil só ocorreu em 1913,

proveniente do material de necropsia de um paciente oriundo de Boa Esperança, Mato grosso,

descrito por Migone no Paraguai (Migone, 1913).


8

Figura 2: Aspectos Epidemiológicos da leishmaniose visceral no mundo. (WHO, 2013).

A LV era considerada uma doença restrita às áreas rurais, sendo relatadas

principalmente no nordeste brasileiro. Até meados da década de 80, só ocorria em zonas rurais e

municípios de baixo nível sócio econômico. Porém, nos últimos anos, a doença avançou para

outras regiões e alcançou grandes centros urbanos (Costa et al., 2007). Esse processo de

periurbanização e urbanização da LV para os municípios de médio e grande porte resultaram em

vários surtos como, por exemplo, no Rio de Janeiro (RJ) (Marzochi et al., 2009) e Belo

Horizonte (MG) (Silva et al., 2001).

A incidência da LV relatada no Brasil vem crescendo consideravelmente. Enquanto

que, no ano de 1980 foram registrados 1500 casos por ano, no período de 2008-2013 o número

de casos era aproximadamente de 4000 casos por ano e a incidência de 1,6 casos por 100 mil

habitantes. A letalidade também aumentou, passando de 3,4% em 1994 para 7,1% com 231

óbitos em 2013 (MS, 2016).

Em 2009, a região nordeste representou 48% dos casos de LV registrados no Brasil.

Um ano mais tarde, o Estado de Minas Gerais passou a ser o Estado com maior incidência da

doença, contabilizando 692 casos no ano (Karagiannis-Voules et al., 2013). Seguido desse

aumento no número de casos, atualmente em várias cidades de Minas Gerais observa-se grande

prevalência de Leishmaniose Visceral Canina (LVC), bem como alta densidade do vetor Lu.

Longipalpis (França-Silva et al., 2003; França-Silva et al., 2005; Monteiro et al., 2005; Coura-

Vital et al., 2011). O principal reservatório doméstico do parasito, o cão (Canis familiaris) é um

importante destaque na transmissão da doença para o homem (Tesh, 1995). Devido o elevado

parasitismo cutâneo observado até mesmo nos animais assintomáticos, o cão torna-se o principal

reservatório domestico do parasito (de Queiroz et al., 2011).

Número de novos casos

registrados de LV, 2013.

> 1000

500-999

100-499

<100

0

Não foram notificados casos autóctones

Sem dados

Não aplicável


9

O controle das Leishmanioses é bastante complexo em função da diversidade de

agentes, reservatórios, vetores e situação epidemiológica, aliadas ao conhecimento insuficiente

sobre vários destes aspectos (MS, 2006). As medidas de controle da LV existentes no país estão

baseadas em uma tríade de ações que foram estabelecidas primeiramente por Deane (1956) e

posteriormente adotadas pelo Ministério da Saúde brasileiro, através do Programa de Vigilância

e Controle da Leishmaniose Visceral (PVC-LV) (MS, 2006a). O tripé de medidas de ações

preconiza o diagnóstico e tratamento imediato de pessoas doentes; controle vetorial através da

pulverização de inseticidas com efeito residual e eutanásia de cães soropositivos. Outras medidas

de controle incluem uma sistemática vigilância sanitária, acompanhada de atividades educativas

em saúde (MS, 2010b).

O Brasil é o único país de caráter endêmico que mantém e conduz de forma regular

um programa epidemiológico e profilático no combate à doença, baseado na integração das três

medidas de saúde pública do PCLV (Palatnik-de-Souza et al., 2001). No entanto, o controle da

doença é dificultado pela diversidade de situações epidemiológicas e insuficiência de

instrumentos eficientes, e isso influencia para que determinadas medidas não possam ser

aplicadas em algumas situações (Gontijo & Carvalho, 2003). Entretanto, mesmo com a aplicação

destas medidas em centros urbanos, os resultados são detectados apenas a médio ou longo prazo,

e sem garantia de sucesso na redução de LV humana e canina (Palatnik-de-Sousa et al., 2001).

Para que o controle da LV seja realmente eficaz, as medidas devem ser mantidas durante longo

período e, mesmo assim, é frequente a reativação dos focos, uma vez que o combate ao vetor não

tem logrado sucesso (Alvar et al., 2004).

Mediante o exposto, existem inúmeros desafios do controle da LV e o tratamento dos

casos humanos ainda constitui a principal ferramenta no controle da doença (Rocha, 2009).

Um grande problema no tratamento da LV em todo mundo é o crescente número de

casos humanos resistentes aos antimoniais pentavalentes e a anfotericina, drogas de primeira e

segunda escolha, respectivamente, para o tratamento da doença no Mundo. Até o momento,

poucas são as opções terapêuticas para o tratamento da LV, considerando a redução na eficácia

terapêutica e a necessidade de novas alternativas que apresentem necessariamente baixa

toxicidade e custo. Estes aspectos são fundamentais para que novas opções de tratamento possam

ser utilizadas por países pobres, onde a doença é mais prevalente (Roatt et al., 2014).

Outro grande problema no programa de controle da LV está no uso de fármacos

destinados ao tratamento de casos humanos no tratamento de cães com LV, já que

independentemente do protocolo de tratamento, o sucesso terapêutico nestes animais é


10

praticamente nulo, uma vez que, o parasito permanece após o tratamento, com grandes chances

de recidivas e possibilidade de surgimento de cepas resistentes aos fármacos no tratamento da

LV humana (MS, 2006a).

Além disso, até o momento não existe um protocolo terapêutico eficiente, capaz de

curar parasitologicamente um cão infectado (Neogy et al., 1994, Moreno et al., 1999, Rhalem et

al., 1999, Baneth & Shaw, 2002, Nieto et al., 2003, Noli & Auxilia, 2005, Saridomichelakis et

al., 2005, Pasa et al., 2005, Vouldoukis et al., 2006). Nesse sentido, foi proibido o tratamento de

cães com medicamentos de uso humano ou não registrados no Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento (MAPA), de acordo com portaria interministerial do Ministério da

Saúde (n° 1.426 de 11 de Julho de 2008). Considerando a falta de medicamento específico para o

tratamento da doença em cães, até então, os animais contaminados só tinham um destino: a

eutanásia. No entanto, mediante anos de discussão, o MAPA, por meio da Nota Técnica

Conjunta n° 001/2016 MAPA/MS, autoriza o registro do produto MILTEFORAN, sob o número

SP 000175-9.000003, de propriedade da empresa VIRBAC SAÚDE ANIMAL, indicado para o

tratamento da leishmaniose visceral de cães.

Diante dessa situação o desenvolvimento de novas formulações, estratégias

terapêuticas e pesquisas de novos fármacos, vacinas e imunoterápicos que possam ser

empregados no tratamento da LVH e/ou da LVC são imprescindíveis como novas alternativas

para controlar a crescente expansão da doença (Reis et al., 2010; Roatt et al., 2014).

2.3 Quimioterapia Empregada no Tratamento da Leishmaniose Visceral

O tratamento das leishmanioses é baseado em quimioterapia, e em pacientes humanos

proporciona cura clínica na maioria dos casos (Seifert et al., 2011). Entretanto, as doenças

tropicais têm sido negligenciadas ao longo de décadas frente ao desenvolvimento de fármacos

pela indústria farmacêutica. Esse fato ocorre devido à falta de investimentos e ao baixo retorno

financeiro refletindo em um pobre repertório terapêutico para tratar estas doenças (Trouiller et

al., 1999). O arsenal terapêutico disponível para o tratamento da LV, assim como de outras

doenças tropicais é bastante precário e restrito (Gil et al., 2008). Desde o século 20, as drogas

como os antimoniais, anfotericina B, alopurinol e outras, são amplamente utilizadas para o

tratamento contra a LV (Queiroz et al., 2004). Porém, um fator de grande preocupação no uso

das drogas tradicionais é a presença da alta toxicidade e resistência (Tempone et al., 2005) e os


11

fatores que também merecem destaque, são as vias de aplicações dessas drogas, que por serem

intramuscular ou endovenosa, geralmente são dolorosas, desconfortáveis e precisam ser

administradas diariamente por longos períodos e muitas vezes requer hospitalização do paciente,

o que acarreta alto custo ao governo (Braga et al., 2007). Outro obstáculo para o tratamento é a

coinfecção Leishmania/HIV, com maior frequência de falhas terapêuticas e a resistência em

larga escala ao antimonial pentavalente na Índia (Murray, 2001).

Embora, as três categorias da doença sejam causadas por parasitos da família

Trypanosomatidade, as doenças são tratadas com diferentes drogas e/ou protocolos terapêuticos

e os próprios parasitos apresentam sensibilidades diferentes a muitos compostos (Croft, 1997).

Para todos os fármacos utilizados na quimioterapia na LV já há relatos em todo mundo de

pacientes não responsivos ao tratamento e cepas resistentes do parasito (Croft et al., 2005).

Desta forma, uma das questões mais graves relacionadas ao tratamento da LV refere-

se à resistência dos parasitos às drogas convencionais, e um dos fatores que provavelmente

contribui para esta situação, é a limitada quantidade de medicamentos disponíveis para o

tratamento da doença (Croft et al., 2006a). Além disso, é importante mencionar que na LV a

possível contribuição nessa resistência dos parasitos está relacionada ao tratamento não efetivo e

esterilizante em cães (Noli & Auxilia, 2005; Pasa et al., 2005; Vouldoukis et al., 2006; Roatt et

al., 2014). Em países como o Brasil, os cães possuem características clínico-epidemiológicas

muito importantes como reservatório do parasito, uma vez que apresentam uma incidência da

doença maior que a doença humana, além de possuírem um elevado parasitismo cutâneo, sendo

os responsáveis pela manutenção da transmissão da LV em ambientes rurais e urbanos (Molina

et al., 1994; Giunchetti et al., 2006; MS, 2010b; Roatt et al., 2014).

2.4 Antimoniais Pentavalentes

O uso medicinal dos compostos de antimônio é conhecido desde o início do século XX

e já eram usados para fins terapêuticos, mas somente em 1912, Gaspar de Oliveira Viana

observou que o tártaro emético também era eficaz na terapêutica da leishmaniose tegumentar

americana (Braga, 2012). Após três anos, na Itália, esse medicamento foi introduzido no

tratamento da LV (Di Cristina, 1915).

O primeiro fármaco utilizado para o tratamento de LV dessa classe foi o antimonial

trivalente (SbIII). Somente após a década de 40 que as novas formulações dessa classe, os

antimoniais pentavalentes (Sb5+) foram introduzidas na terapêutica e assim obtendo a diminuição


12

no tempo de tratamento da Leishmaniose (Murray et al., 2005). Dessa forma, desde 1940, o

tratamento das leishmanioses inclui os derivados de antimoniais pentavalentes (Sb5+) nas suas

duas formulações disponíveis no mercado (Sundar, 2013). Os fármacos pertencentes ao grupo de

antimoniais pentavalentes (Sb5+) são: o estibogluconato de sódio (SGS) (Pentostam®) e o

antimoniato de N-metilmeglucamina (NMG) (Glucantime®), que são usados, em todo mundo,

até os dias atuais (Soto et al., 2004).

O fármaco de primeira escolha e mais empregado na terapêutica da LV no Brasil é o

Glucantime®, com distribuição gratuita na rede pública de saúde (SUS) (Santos et al., 2008; MS,

2010b), sendo essa classe de fármaco, a mais barata opção terapêutica disponível (Herwaldt,

1999). Apesar de ser um pilar no tratamento da LV, não tem sido utilizado como medicamento

de primeira escolha em alguns países, seja por sua elevada toxicidade, ou pela resistência do

parasito a essa droga. Por exemplo: devido a seus efeitos tóxicos graves, os antimoniatos não são

aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos da América (EUA)

para o tratamento da leishmaniose em pacientes (Buates & Matlashewski, 1999) tendo apenas a

anfotericina B lipossomal como medicamento aprovado para uso. Já em outros países, como por

exemplo, em Bihar, na Índia, quase 60% da população apresenta falha terapêutica com este

medicamento (Sundar, 2001; Guerin et al., 2002; Dube et al., 2009).

O composto referente ao Glucantime® é obtido sinteticamente a partir do ácido

antimônico e da N-metil-glucamina (Rath et al., 2003). Apesar do uso dos compostos no

combate às leishmanioses existir a cerca de um século, seus principais mecanismos de ação são

apenas conhecidos em parte ou totalmente desconhecidos (Frézard et al., 2005). Sabe-se apenas,

que a ação anti-parasitária dessas drogas devem-se á influencia na bioenergética do parasito, pela

inibição da glicólise, da β-oxidação dos ácidos graxos do parasito e da fosforilação do ADP

(Berman et al., 1987).

O esquema terapêutico para LV utilizando o Glucantime® é administrado com doses

de 20mg/kg/dia, via endovenosa juntamente com soro glicosado por um período de 20 dias,

podendo chegar a 30 dias e no máximo a 40 dias, com o limite máximo de três ampolas/diárias

(MS, 2010b; MS, 2014). Dessa forma, é necessário que a administração seja feita em doses

elevadas do fármaco, em regime continuo, a fim de garantir elevado teor de antimônio nos

tecidos e, assim, obter a eficácia do tratamento (Roberts, et al., 1998). Além de ser tóxica, a

administração via intravenosa do Glucantime® requer atendimento ambulatorial, o que dificulta

a adesão do paciente ao tratamento, aumentando o número de abandono dos casos e favorecendo

o surgimento de cepas resistentes (Croft et al., 2005).


13

Dentre todas as drogas que são utilizadas para o tratamento das leishmanioses, os

antimoniais pentavalentes (Sb5+) são as que têm efeitos colaterais mais conhecidos (Rijal et al.,

2003). Alguns efeitos colaterais frequentes são: artralgias, mialgias, náuseas, vômitos, dores

abdominais, dor no local da aplicação, febre, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade,

nefrotoxicidade, pancreatite, além de toxicidade sobre o músculo-esquelético (MS, 2010b; MS,

2014). Estas alterações são observadas entre 10 e 50% dos casos (Navin et al., 1992).

Mesmo com todos esses fatores, a taxa de cura total com Sb5+ é maior que 90% na

maioria das áreas endêmicas do mundo onde não há resistência a este fármaco (WHO, 2010c).

Em casos de insucesso no tratamento com o antimonial pentavalente, como indicação restrita,

resistência ou falha terapêutica, opta-se por drogas de segunda escolha que são Anfotericina B e

Pentamidina, mesmo que estas também apresentem diversos efeitos colaterais (Tiuman et al.,

2011).

Figura 3: Estrutura química dos Antimoniais Pentavalentes (Sb5+) comercialmente disponíveis (Rath et al., 2003)

2.5 Anfotericina B

A anfotericina B (AmB) pertence ao grupo dos antibióticos poliênicos produzidos por

diferentes espécies de Streptomyces e foi obtida a partir do Streptomyces nodosus, isolado da

Bacia do rio Orinoco na Venezuela, em 1956 (Donovlick et al., 1955-1956). A anfotericina é

encontrada sob duas formas: A e B, sendo a B mais ativa e a única usada na terapêutica clínica.


14

Primeiramente, esse antibiótico foi usado no tratamento de infecções fúngicas (Vandeputte et al.,

1956). A primeira atividade leishmanicida da AmB foi demonstrada na década de 50, e a partir

daí vem sendo utilizada no tratamento da doença (Tiphine et al., 1999).

É um fármaco insolúvel em água e com pH neutro. A formulação licenciada para uso

na rotina clínica, produzida e comercializada pela Bristol-Myers Squibb desde 1958 como

Fungizon® é a mistura de anfotericina B com o detergente desoxicolato em tampão fosfato, que

promove a solubilidade da substância (Brajtburg & Bolard, 1996).

O mecanismo de ação deste fármaco decorre de sua ligação ao ergosterol, com

consequente alteração de permeabilidade de membrana e do equilíbrio osmótico do parasito

causando sua morte (Saha et al., 1986; Singh & Sivakumar, 2004). Nesse sentido, a AmB

apresenta grande afinidade pelo ergosterol, o principal esterol da membrana de fungos e dos

parasitos Leishmania spp, e menor afinidade pelo colesterol, o principal esterol da membrana de

mamíferos. A anfotericina B age formando micelas com o ergosterol e promovendo a formação

de canais transmembrana, que modificam a permeabilidade da membrana, com perda de íons e

outros componentes celulares levando a morte destes patógenos (Tiphine et al., 1999).

A descoberta de que Leishmania e fungos como Candida albicans possuem um esterol

substituído no carbono 24, geralmente sendo o ergosterol como produto final dos esteróis,

forneceu um motivo racional para se testar agentes antifúngicos contra esses protozoários

(Berman, 1992). Esse fato é o que provavelmente explica a eficácia da AmB contra Leishmania

spp. (Chappuis et al., 2007).

A AmB é a droga mais potente anti-Leishmania disponível, com efeito demonstrado

tanto in vitro quanto in vivo na destruição deste protozoário, tanto na forma promastigota quanto

amastigota (Thakur et al., 1994). No entanto, a AmB possui baixa capacidade de absorção

gastrointestinal e característica hidrofóbica, podendo também interagir em vias celulares de

mamíferos, causando disfunções, sendo seu principal efeito colateral a nefrotoxicidade (Motta &

Sampaio, 2012). Nesse sentido, o uso da Anfotericina B desoxicolato é limitado pela toxicidade,

em particular por cardiotoxicidade e nefrotoxidade cumulativas. Os efeitos colaterais mais

frequentes com o uso da Anfotericina B ocorrem principalmente durante a infusão venosa.

Dentre os efeitos colaterais que são demonstrados entre 70 a 90% dos pacientes durante o

tratamento, podemos destacar: febre, náuseas, vômitos, calafrios, hipotensão ou hipertensão,

comprometimento da função renal e redução de níveis séricos de potássio (Brajtburg & Bolard,

1996). Também pode-se observar hipopotassemia e flebite no local da infusão, que podem ser

atenuados ou evitados usando-se respectivamente antitérmicos, antieméticos, reposição de


15

potássio e hidrocortisona. Porém, a presença dos sintomas descritos não contra indica a

administração da anfotericina B. Outros efeitos adversos menos frequentes, mas que

contraindicam seu uso são: anorexia, insuficiência renal, anemia, leucopenia e alterações

cardíacas (MS, 2007).

Por ser uma droga extremamente tóxica exige internação e monitoramento de funções

vitais, sendo uma terapia de alto custo (Kafetzis et al., 2005). A dose recomendada é de 0,5

mg/kg/dia com aumento gradativo até 1 mg/kg/dia conforme a tolerância do paciente. Deve ser

administrado via endovenosa com soro glicosado em dias alternados respeitando o limite

máximo de 3g para adultos e 15 a 15mg/kg de peso por criança (Brattacharya et al., 2004).

Figura 4: Estrutura química da Anfotericina B (Ganis et al., 1971)

Devido a grande atividade leishmanicida, a AmB tem se tornado alvo de intensas

pesquisas, com o objetivo de atenuar seus efeitos nefrotóxicos e aumentar seu poder terapêutico.

Sendo assim, a necessidade de redução dos efeitos colaterais com uso desse medicamento levou

ao desenvolvimento de formulações lipídicas com o fármaco (Murray, 2001).

Uma forma de tentar reduzir a toxicidade e resistência aos medicamentos

leishmanicidas, é desenvolver novas formulações com o objetivo de direcionar o medicamento

ao macrófago. A utilização de lipossomos vem sendo utilizada juntamente com a anfotericina B

objetivando a vetorização desta droga à célula alvo. Os lipossomos são sistemas carreadores de

fármacos, que são capazes de levar altas doses do medicamento até a célula alvo (Tempone &

Andrade, 2008). Dessa forma, a necessidade de excluir o desoxicolato como agente dispersante

abriu espaço às vesículas fosfolipídicas conhecidas como lipossomas. O objetivo, neste caso, era

encapsular o fármaco em sistemas lipídicos formando micelas que não o liberariam durante a

infusão e assim, as partículas lipídicas seriam removidas da circulação pelos fagócitos


16

mononucleares, fornecendo grandes quantidades do fármaco nas células alvos infectadas

(Sundar, 2001b).

No final da década de 1990, novas formulações lipídicas de anfotericina B foram

desenvolvidas, visando diminuir sua toxicidade. A partir disso, vários estudos foram realizados e

novos nanofármacos foram desenvolvidos. Nas novas formulações, o desoxicolato foi

substituído por outros lipídios: Anfotericina B lipossomal - Ambisome® (Fujisawa, Deerfield,

IL/EUA), colesterol sulfato de Anfotericina B - Amphotec® (Sequs, MentoPark, CA/EUA) e

complexo lipídico de Anfotericina B -Albecet (Liposome Co, Princeton, NJ/EUA) (MS, 2006a).

A AmB lipossomal reduz os efeitos colaterais e apresenta excelentes índices de

eficácia terapêutica, inclusive em indivíduos sem resposta ao tratamento com antimoniais (Paula

et al., 2003). A partir de estudos conduzidos em centros de pesquisas de referência na Europa e

no Brasil, ambos supervisionados pelo FDA, foram obtidos dados suficientes que permitiram a

aprovação do Ambisome® em 1997 para o tratamento de pacientes imunocomprometidos com

LV (BRASIL, 2010b). A AmB lipossomal é considerada o melhor fármaco disponível para o

tratamento da LV e em muitos países da Europa e Estados Unidos é utilizada como a primeira

linha de tratamento (MS, 2006a). Apesar da elevada eficácia e menor toxicidade dessas novas

formulações lipídicas do fármaco no tratamento das leishmanioses, o alto custo inviabilizava seu

uso no sistema de saúde pública de países em desenvolvimento. No ano de 2007, a OMS

anunciou uma drástica redução do valor da droga, para que pudesse ser utilizada nos serviços de

saúde publica de países onde a LV é endêmica (Chappuis et al., 2007).

2.6 Miltefosina

Um importante avanço no tratamento das leishmanioses foi o desenvolvimento da

miltefosina, que foi o primeiro medicamento leishmanicida aprovado para administração por via

oral efetiva no tratamento da LV (Sundar & Murray, 2005; Dorlo et al., 2012). A Miltefosina

(hexadecilfosfocolina) é um alquifosfolipídeo e foi inicialmente desenvolvida como uma droga

para o tratamento do câncer (Unger et al., 1989). Porém, em 1987, Croft e colaboradores, pela

primeira vez, mostraram a atividade leishmanicida da miltefosina sobre L. donovani (Croft &

Coombs, 2003). O fármaco vem sendo utilizado na Índia para o tratamento de pacientes com

leishmaniose visceral refratária ao tratamento convencional com antimoniais, apresentando

resultados promissores (Sindermann et al., 2004).


17

A droga é comercializada pela empresa Paladin Labs, Inc., Montreal, Canadá, com o

nome comercial Impavido® (WHO, 2010c). Este fármaco ainda não está aprovado para uso

clínico no Brasil em humanos, principalmente pela sua baixa eficácia no tratamento da LVH

apresentado em um ensaio clínico norteado pelo Ministério da Saúde aqui no Brasil. No entanto,

alguns estudos têm revelado a eficiência desse fármaco em relação ao Sbv no tratamento de

Leishmaniose Cutânea na Bahia e Manaus, estados endêmicos para L. braziliensis e L.

guyanensis, respectivamente (Chrusciak-Talhari et al., 2011).

Recentemente, o Mapa e o MS publicaram uma Nota Técnica Conjunta n° 001/2016

MAPA/MS (NOTA TÉCNICA Nº 11/2016/CPV/DFIP/SDA/GM/MAPA, PROCESSO Nº

21000.042544/2016-94) autorizando o registro do produto MILTEFORAN, sob o número SP

000175-9.000003, de propriedade da empresa VIRBAC SAÚDE ANIMAL, para o tratamento da

leishmaniose visceral de cães. O licenciamento do medicamento foi emitido respeitando-se as

determinações da Portaria Interministerial n°1.426 de 11 de julho de 2008, que regulamenta o

tratamento de cães, proibindo tratamento da leishmaniose visceral canina com produtos de uso

humano ou não registrados no MAPA. O MS emitiu o Parecer Técnico favorável ao pleito, uma

vez que a Miltefosina, princípio ativo do medicamento, não é uma droga utilizada para o

tratamento da doença em humanos no Brasil e, de acordo com as evidências científicas geradas

até o momento, não apresenta eficácia para ser incorporada no protocolo terapêutico da

leishmaniose visceral humana. Cabe destacar que o tratamento de cães com LVC não se

configura como uma medida de saúde pública para controle da doença e, portanto, trata-se única

e exclusivamente de uma escolha do proprietário do animal, de caráter individual.

Apesar de mostrar resultados positivos para o tratamento da leishmaniose, seu uso é

limitado devido à eficácia variável em diferentes regiões geográficas do mundo, o que pode estar

intimamente relacionado as variações genéticas entre as cepas o que conferem diferentes graus

de resistência e suscetibilidade a este fármaco (Soto et al., 2008). Seu uso apresenta risco de

resistência devido ao seu longo tempo de meia vida, variando de 100 a 200 horas, no qual os

níveis do fármaco no plasma permanecem constantes após 26 dias de administração contínua

(Berman et al., 2006).

Os efeitos colaterais relacionados ao uso deste fármaco no tratamento da leishmaniose

são adversos, e entre os mais frequentes estão os gastrointestinais, tais como anorexia, náusea,

vômitos e diarreia, a maioria destes episódios é breve e o tratamento pode ser continuado. Ainda

apresenta efeitos como toxicidade hepática, renal e alergia na pele (WHO, 2010c). Outro fator

que limita o uso desse fármaco é o alto potencial teratogênico, dessa forma, o tratamento em


18

mulheres que não estejam gravidas é somente realizado nas pacientes que aceitem tomar

anticoncepcionais durante e três meses após o tratamento (Croft & Coombs, 2003). Além desses

problemas mencionados, ainda há a resistência facilmente obtida in vitro do fármaco em

linhagens de promastigotas de L. donovani, onde o aumento gradual da concentração de drogas

conduz a seleção de parasitos resistentes (Seifert et al., 2003). Esse fato indica que parasitos

resistentes, também podem ser selecionados durante o tratamento com a droga in vivo (Cojean et

al., 2012).

O mecanismo de ação da miltefosina ainda não foi completamente elucidado, mas em

células tumorais, o fármaco age induzindo apoptose e alterando as vias de sinalização celular

mediada por lipídios (Arthur & Bittiman, 1998). O mecanismo de ação sobre a Leishmania spp.

ainda não está bem esclarecido, mas sua atividade tem sido relacionada também a apoptose

celular do parasito (Verma & Dey, 2004). Outros estudos sugerem que o fármaco tem ação no

metabolismo de lipídeos do parasito (Rakotomanga et al., 2007).

Figura 5: Estrutura química da Miltefosina (Rath et al., 2003)

2.7 Outras Drogas

A pentamidina é uma substância com estrutura aromática derivada de diamidinas, que

apesar de ser tóxica para vários protozoários, mostra-se útil no tratamento de pacientes com

leishmaniose (Rath et al., 2003). Inicialmente, a atividade terapêutica era para o tratamento de

pacientes com pneumonia com infeção por Pneumocystis carinii, posteriormente mostrou-se

efetiva no tratamento da LV, passando a ser considerada uma droga no tratamento da doença, em

casos não responsivos aos antimoniais, mesmo que apresente efeitos colaterais adversos

significantes e sua administração seja parental (Singh & Sivakumar, 2004).


19

Em relação às pentamidinas, dois sais são comercialmente utilizados no tratamento em

humanos: o Isotionato de pentamidina (Pentamidina®), disponível nos EUA e Europa, e o

Mesilato de pentamidina (Lomidine®), disponível apenas na Europa (Sands et al., 1985).

O uso deste medicamento como segunda opção para o tratamento da leishmaniose

visceral vem sendo abandonado devido a sua toxicidade e resistência do parasito na Índia, porém,

ainda pode ser usado para o tratamento de manutenção de co-infecção por HIV (Sundar, 2002).

Este fármaco apresenta diversos efeitos colaterais: dor, náuseas, vômito, tontura,

enrijecimento no local da aplicação, mialgias, toxicidade renal, supressão da medula óssea,

taquicardia, anorexia, distúrbios no metabolismo da glicose (hipoglicemia e hiperglicemia) entre

outros (Croft & Coombs, 2003). O efeito tóxico mais importante é o desenvolvimento de diabetes

insulino-dependente que ocorre em cerca de 10-15% dos casos, que pode se manifestar a partir da

administração total de 1g do fármaco. Outro problema do medicamento está relacionado às altas

concentrações encontradas nos rins, fígado e baço, meses após o tratamento (MS, 2014).

A paromomicina é um antibiótico aminoglicosídeo, também chamado aminosidina,

produzido pelo Streptomyces rimosus, utilizado em infecções bacterianas. Já demonstrou

capacidade de inibir o crescimento de diversos microrganismos, inclusive protozoários do gênero

Leishmania spp. (Iraji F & Sadeghinia, 2005). Inicialmente foi proposta como um tratamento

alternativo para a leishmaniose e testado em diversas preparações, associada com a gentamicina

ou com a monoterapia em diversos estudos para o tratamento de LC na Tunísia, Equador e

Panamá (Ben Salah, 2013). Para o tratamento de LV humana, o fármaco tem sido usado

principalmente na África e Europa (Chunge et al., 1989) e quando associado com o Pentostam®

obteve-se uma taxa de cura acima de 82% (Berman, 1997). Mesmo sendo uma medicação

administrada via intramuscular, a paramomicina ainda é considerada uma alternativa terapêutica

com grande eficiência em menor tempo de tratamento e menor custo que os demais medicamentos

disponíveis (Sundar et al., 2007).

Embora apresente baixa toxicidade comparada aos outros fármacos mencionados,

pode apresentar efeitos colaterais como nefrotoxicidade, ototoxicidade e hepatotoxicidade. O

fármaco também apresenta riscos de afetar o oitavo par de nervos cranianos, o que pode levar o

paciente a ter problemas de controle motor e de equilíbrio (Berman, 1998). Outro efeito colateral é

a possibilidade de causar surdez irreversível e uma desvantagem é a contra indicação durante a

gravidez (Maarouf et al., 1998).

O alopurinol, um análogo da hipoxantina, que inibe o catabolismo das purinas em

mamíferos e o anabolismo em patógenos do gênero Leishmania spp. (Soares-Bezerra et al., 2004).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sundar%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11703838


20

Este fármaco apresenta atividade citotóxica seletiva aos parasitos da Leishmania, que apresentam

deficiência de enzimas que sintetizam purinas, precisando assim, de purinas pré-formadas do

hospedeiro para que possam sobreviver (Singh & Sivakumar, 2004). Geralmente, este

medicamento possui baixa toxicidade, no entanto, é ineficaz no controle da infecção quando

usados de forma isolada (Rath et al., 2003), apresentando aumento da eficácia do tratamento

quando utilizado em combinação com outras drogas (Pasa et al., 2005), associado normalmente

com antimônio pentavalente (Blum et al., 2004).

A azitromicina foi desenvolvida no final dos anos 80 e utilizada no tratamento de

infecções bacterianas como tracomas, ateroscleroses, úlcera péptica, infecções gastrointestinais e

infecções do trato respiratório. Além disso, tem sido usada contra protozoários como Leishmania

sp, Plasmodium sp e Toxoplasma gondii (Pechère, 2001). A azitromicina apresenta a vantagem de

se concentrar nos tecidos, especialmente em macrófagos, com níveis 100 a 200 vezes maiores que

as concentrações encontradas no soro. Esse fármaco apresenta a possibilidade de ser administrado

tanto por via oral quanto injetável, além de ser considerado relativamente seguro para o tratamento

em crianças e mulheres gravidas, uma vez que, demonstra baixo perfil de toxicidade (Krolewiecki

et al., 2002). Mesmo sendo ativo para algumas Leishmanias, este fármaco apresenta atividade

inferior a do antimoniato de meglumina para o controle de lesões e ambos os fármacos

(azitromicina e antimoniato de meglumina) não promovem a esterilização dos parasitos da lesão

(Sinagra et al., 2007).

Os azóis pertencem à classe de antifúngicos e vem sendo testados e avaliados quanto a

sua atividade leishmanicida. Esse grupo tem demonstrado ser efetivo no tratamento das

leishmanioses cutâneas. São representados pelos imidazóis, que incluem o cetoconazol,

itraconazol, fluconazol e as alilaminas (terbinafina) (Alrajhi et al., 2002). O mecanismo de ação

dos compostos azóis baseia-se no bloqueio do metabolismo do ergosterol (Colombo et al., 2002).

Estudos demonstraram que o emprego de cetoconazol, fluconazol, itaconazol, terbinafina e

metronidazol no tratamento de LV por L. infantum apresentam-se com uma variação na

susceptibilidade aos fármacos. Nenhum desse azóis foi considerado mais efetivo que a terapia com

o antimoniato de meglumina (Gangneux et al., 1999). Durante o tratamento, os efeitos colaterais

observados foram náuseas e vômitos, e isso ocorria quando a dosagem era superior a 10mg/kg/dia

(Van Voorhis, 1990).


21

Figura 6: Outras drogas empregadas na terapia da leishmaniose. (Rath et al., 2003; Silva, 2005; Pereira, 2007)

2.8 Terapia Combinada

O grande desafio ao longo dos anos tem sido o desenvolvimento de drogas mais

eficazes, menos tóxicas, com terapia curta e de baixo custo. Dentre as muitas tentativas que já

foram feitas, talvez uma das mais promissoras seja a terapia combinada, que desde a década de

80 vem sendo investigada com forte estímulo da organização mundial de saúde (Croft &

Coombs, 2003; Sesana, 2009).

Com o objetivo de melhorar a terapêutica da leishmaniose, a Organização Mundial da

Saúde – OMS, tem recomendado e incentivado a estratégia da associação de fármacos (WHO,

2012). Dessa forma, nos últimos anos, o uso da associação vem crescendo entre os especialistas

na área de quimioterapia da leishmaniose (Croft et al., 2006a). Uma das razões para o interesse

na combinação é que a associação de fármacos que pertencem a diferentes classes químicas pode

permitir um aumento na eficácia da terapia, acompanha da redução da dose e tempo de

tratamento, resultante de um efeito sinérgico destas associações, o que reflete na diminuição da

toxicidade e maior aceitação do paciente (Van Griensver et al., 2010).

Fórmula Estrutural Nome Químico/ Comercial

Isetionato de Pentamidina®

Lomidina

Paramomicina®

Humatin

Azitromicina

Cetoconazol

Azóis


22

A terapia combinada pode ajudar a evitar e/ou retardar o aparecimento de resistência e

aumentar a vida útil dos fármacos, como tem sido observado para o tratamento de algumas

doenças como tuberculose, malária e AIDS (Mitchison & Davies, 2012). Um dos pontos

considerados mais importantes para os pesquisadores no estudo das combinações é a busca por

resultados satisfatórios para casos mais complicados, como em pacientes co-infectados com

HIV, no qual o tratamento com a monoterapia tem sido inadequado (Alvar, et al., 2008)

Muitos estudos clínicos têm investigado a terapia combinada, principalmente na Índia

e África em pacientes com LV, utilizando os fármacos disponíveis para o tratamento da

leishmaniose, como SBv, anfotericina B, miltefosina, paramomicina e imunomoduladores

(Omollo et al., 2011). Apesar da proposta e recomendação pela OMS da combinação terapêutica

entre os fármacos leishmanicidas, antes de serem introduzidas na rotina prática, estas devem ser

confirmadas como seguras e eficazes em ensaios clínicos (WHO, 2012).

2.9 Novas Formulações

Com o aumento da resistência aos antimoniais pentavalentes e aos fármacos de

segunda geração aqui mencionados, a busca por novos fármacos leishmanicidas tem se

intensificado, além disso, o numero de quimioterápicos disponíveis, principalmente para

tratamento de doenças crônicas está abaixo do satisfatório (Vouldoukis et al., 2006). A ausência

de uma vacina eficaz contra a LV humana leva a uma necessidade urgente de fármacos mais

efetivos que sejam capazes de complementar ou até mesmo substituir as drogas de uso frequente

no tratamento da doença (Rocha et al., 2005). Frente à necessidade de novos fármacos para o

tratamento de doenças parasitárias, a OMS vem incentivando o estudo de novos compostos

sintéticos ou naturais que possam abrir novas perspectivas para o desenvolvimento de

medicamentos mais eficazes (WHO, 1990).

O desenvolvimento dos compostos sintéticos e seus derivados representam uma forte

estratégia na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que, estes compostos

nos disponibilizam maior viabilidade de produção industrial por meio de sínteses químicas, bem

como uma redução do custo (Tiuman, et al., 2011). Neste cenário, o presente estudo buscou

avaliar a citotoxicidade e a ação leishmanicida in vitro de diferentes derivados químicos

originados de duas classes de compostos sintéticos: as aldiminas e os adutos de Hantzsch.

2.10 Aldiminas


23

As aldiminas também são conhecidas como bases de Schiff, e compreendem uma das

classes mais valiosas de substâncias orgânicas (Schiff, 1864).

As aldiminas são compostos obtidos por meio de condensação entre aldeídos e aminas

primárias e apresentam diversas aplicações nos campos da Química. Estes compostos são

amplamente utilizados para fins industriais e possuem uma ampla gama de atividades biológicas

(da Silva et al., 2011a). Desde o primeiro relato da preparação das sínteses de aldiminas em

1864, feita por Hugo Schifft, diversos métodos têm sido estudados e descritos para a sua

obtenção (Zheng, et al., 2009). A síntese clássica desse composto, conforme descrita por Schifft,

consiste na condensação sob a destilação azeotrópica, possibilitando de maneira mais simples a

remoção da água residual, que é liberada durante a reação e consequentemente, deslocando o

equilíbrio no sentido de formação dos produtos. Essa estratégia permite a obtenção de Aldiminas

a partir de uma grande variedade de substratos (da Silva et al., 2011a).

A busca por novas metodologias sintéticas ambientalmente corretas tem recebido uma

forte atenção em laboratórios de pesquisas, possibilitando assim, o desenvolvimento de novas

técnicas para a obtenção de aldiminas. Com isso, o uso da radiação de microondas também

recebeu importante destaque, pois facilitou a obtenção de Aldiminas em rendimentos muitas

vezes superiores aos observados no aquecimento convencional e, principalmente uma

diminuição no tempo das reações (Rathelot et al., 1995).

As aldiminas são substancias conhecidas por apresentarem propriedades biológicas

notáveis, que incluem ação leishmanicida (Al-Kahraman et al., 2010), antifúngica (Magalhães et

al., 2013), antibacteriana (Shi et al., 2007), entre outras. Al-Kahraman e colaboradores, em

2010, testaram uma série de compostos químicos de azometinas, que são sintetizados a partir de

reações de aminas aromáticas primárias. As azometinas sintetizadas foram avaliadas quanto as

suas propriedades leishmanicida in vitro, utilizando cepas promastigotas de L. major. Os

R1, R

2 = Alquil ou Aril

R2

R1

H

C = N

Figura 7: Estrutura Geral das aldiminas (da Silva et al., 2011b)


24

resultados demonstraram que esses compostos sintetizados demonstraram atividade significativa

contra o parasito, pois inibiram o crescimento do parasito e apresentaram ação altamente potente

em relação às promastigotas de L. major. Dessa forma, a elevada atividade leishmanicida destes

compostos sintéticos demonstrados no trabalho de Al-Kahraman e colaboradores, torna-os

promissores para o desenvolvimento de agentes terapêuticos eficazes para a leishmaniose.

Dentre os vários compostos sintetizados a partir das aldiminas, utilizamos nesse

trabalho os compostos químicos que correspondem às siglas: 3H7, 3H8, 3H9, 3D7, 3G2, 3I4 e

3I5.

2.11 Adutos de Hantzsch

Durante as últimas décadas, em meio à comunidade científica, vem aumentando a

consciência ambiental em busca do desenvolvimento de novas metodologias que visem à

diminuição de energia que é usada no momento de produção e que haja menos desperdício, tanto

de matéria-prima quanto de solventes orgânicos (Horvath & Anastas, 2007).

A busca por novas sínteses orgânicas e novas metodologias que fossem capazes de

produzir moléculas inéditas, gastar menos tempo para atingir a molécula alvo, ter menor custo de

produção e menor impacto ambiental, possibilitou maior espaço ás Reações Multicomponentes

(RMC’s), em diversos laboratórios de pesquisas e na indústria farmacêutica, pois apresentavam

as devidas características, além da facilidade em procedimentos experimentais (Dömling & Ugi,

2000).

As primeiras reações multicomponentes foram feitas na segunda metade do século

XIX, com as reações de Strecker (1850), Hantzsch (1882) e Passerini (1921), porém, somente

em 1959, com o trabalho de Dömling e colaboradores, que o conceito de RMC’s apareceu como

uma ferramenta importante na área da química orgânica sintética (Dömling & Ugi, 2000).

Esta ferramenta de RMC’s tem mostrado uma nova possibilidade e nova alternativa

para a indústria farmacêutica relacionada à pesquisa e descobertas de moléculas, com ampliação

de variações estruturais de compostos químicos que apresentem possível atividade biológica

(Bienaymé et al., 2000). Atualmente, é conhecida uma gama de compostos químicos obtidos a

partir de RMC’s que tem como objetivo a obtenção de compostos com alto potencial de

atividade biológica, utilizados para sínteses de grupos farmacoforicos (Dömling & Ugi, 2000).


25

O protocolo dos adutos de Hantzsch foi reportado em 1882 na síntese de 1,4-

dihidropiridinas a partir da ciclocondensação do acetaldeído (1), amônia (2) e dois equivalentes

de acetoacetato de etila (3) (Wendler, 2010).

Figura 8: Síntese da 1,4-dihidropiridinas de Hantzsch (Wendler, 2010)

Pacheco et. al., em 2013, reportou a síntese de 1,4 dihidropiridinas catalisadas pelos

ácidos cítrico e lático, que são biodegradáveis e não apresentam toxicidade. Uma característica

importante na RMC’s de Hantzsch é que dependendo dos reagentes utilizados, o subproduto

formado é apenas água (de Souza, 2010). Os compostos derivados de 1,4 dihidropiridinas tem

ampla atividade biológica, incluindo medicamentos que contem o grupo farmacofórico, tais

como a Nifedina e Nicardina, entre outros (Gordeev et al., 1996), além de serem antidiabéticos

(Debache, et al., 2009), anti-leishmaniose (Reimão et al., 2010), antiviral (Hilgeroth, 2002) e

anti-Alzheimer (Edraki, et al., 2009).

Considerando as múltiplas atividades biológicas dos bloqueadores dos canais de cálcio

e a elevada versatilidade das 1,4 dihidropiridinas, Reimão e colaboradores, em 2010, realizaram

testes de citotoxicidade in vitro contra parasitos de leishmania e T. cruzi, com 8 compostos desse

grupo que já são utilizados (azelnidipina, amlodipina, cilnidipina, lercanidipina, nicardipina,

nifedipina, nimodipina e nitrendipina).

No estudo feito por Reimão, a citotoxicidade foi avaliada utilizando células de rim de

macaco (LLC-MK2) incubadas em microplacas de 96 poços, juntamente com os fármacos, com

concentração mais elevada de 200 µg/ml, por 48 horas. A viabilidade destas células foi avaliada

por MTT e confirmada por análise morfológica, por microscopia ótica comparando ao grupo

controle. Os resultados demonstraram que os compostos testados foram eficazes contra as formas

promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.)

chagasi, e Leishmania (L.) major e forma amastigota de L. (L.) chagasi, com valores de

concentração inibitória de 50% (IC50) na gama de 2,6-181 µM. As 1,4-di-hidropiridinas foram

ativas contra os promastigotas e amastigotas de L. (L.) chagasi, agente de Leishmaniose visceral

na América Latina.

H

O

O

OO O

O

NH

O

O

NH3

+

2

álcool 6-20h

(1)(2)

(3)

(4)


26

Com base nas curvas dose-resposta, obtiveram valores de IC50 na gama de 2,61-146,41

µM após 24 horas de incubação com L. (L.) chagasi na forma promastigota. A atividade dos

compostos testados contra amastigotas intracelulares de L. (L.) chagasi resultou em valores de

IC50% próximos a promastigotas, na gama de 5,35-176,24 µM, confirmando a atividade anti-

Leishmania destes compostos. Utilizou-se antimônio pentavalente como fármaco de referência,

obtendo um valor IC50 de 82,32 µM contra amastigotas intracelulares.

Outro estudo que corrobora resultados de eficácia dos compostos químicos sintéticos

em atividades leishmanicidas, foi realizado por Palit e Ali, em 2008, no qual as 1,4-di-

hidropiridinas amlodipina e lacidipina demonstraram sucesso ao inibir a infecção in vitro de L.

donovani e em camundongos BALB/c. A amlodipina demonstrou atividade in vitro e in vivo

contra L. (L.) donovani, com um efeito oral promissor a 10 mg / kg num modelo de hamster,

mostrando assim, a versatilidade deste grupo de compostos sintéticos.

Com base em resultados já demonstrados anteriormente, utilizamos neste estudo,

vários compostos sintetizados a partir dos adutos de Hantzsch, que correspondem às siglas: 8A2,

8A3, 8A4, 8B5 e 8B6.

3 JUSTIFICATIVA

Salomão, N.E.O. Justificativa

28

A LV é uma doença negligenciada, considerada problema de saúde pública e

responsável por altos índices de óbitos em países da América Latina, África e Ásia. Não existe

um esquema terapêutico único aplicável a todas as formas de leishmaniose existentes ao redor do

mundo. Esquemas terapêuticos estudados em determinadas regiões costumam ser aplicados para

tratar populações residentes em outras áreas geográficas, com resultados variados (Vasconcellos,

2013). As intervenções terapêuticas nessa doença dependem de medicamentos altamente tóxicos

com diversos efeitos colaterais. Atualmente, um dos maiores desafios para minimizar a crescente

expansão e urbanização da doença está baseado na busca de novos fármacos que possam

substituir os já existentes empregados como primeira escolha, visto que um dos problemas é o

pequeno arsenal terapêutico disponível no mercado para uso na quimioterapia da LV, pois já

existe um grande número de pacientes não responsivos ao tratamento convencional e, para todos

os fármacos, há relatos de cepas resistentes do parasito. Dessa forma, a OMS tem incentivado o

desenvolvimento de novos compostos químicos abrindo diversas perspectivas para a pesquisa de

medicamentos mais eficazes contra a LV. Dentro da perspectiva de desenvolvimento de novos

fármacos ou compostos, temos um problema inerente aos testes inicias in vitro de seleção de

potenciais fármacos. Os testes in vitro para seleção de drogas leishmanicidas são muito

trabalhosos, caros e de difícil padronização, execução e reprodutibilidade, limitando ainda o

número de potenciais drogas que podem ser testadas simultaneamente. Uma nova aposta para

otimização dos testes in vitro de potenciais drogas leishmanicidas é o emprego de cepas de

Leishmania fluorescentes transfectadas com genes repórter para proteínas fluorescentes (GFP,

RFP, entre outras), que visam aprimorar e ampliar as técnicas de avaliação in vitro empregando

metodologias e ferramentas automatizadas, tais como a citometria de fluxo.

Nesse sentido, o presente estudo buscou avaliar a citotoxicidade e o potencial

leishmanicida dos compostos químicos dos grupos das aldiminas e dos adutos de Hantzsch

através de metodologias de testes de drogas in vitro clássicas, bem como empregando a

citometria de fluxo. Acreditamos que os resultados gerados no estudo abrem novas perspectivas

para o avanço no desenvolvimento de novos fármacos para LV, além do desenvolvimento de

metodologias in vitro mais acuradas e dinâmicas para o reconhecimento e direcionamento de

potencias drogas anti-LV e que possam direcionar para o prosseguimento de quimioterapia

experimental in vivo.

4 OBJETIVOS

Salomão, N.E.O. Objetivos

30

4.1 Objetivo Geral

Avaliar a citotoxicidade e a atividade leishmanicida in vitro em promastigotas e

amastigotas de L. infantum dos diferentes compostos químicos de aldiminas e de adutos de

Hantzsch.

4.2 Objetivos Específicos

Os objetivos específicos deste estudo foram divididos em duas etapas, conforme descritos a

seguir:

1ª Etapa: Testes de drogas clássicos in vitro

• Avaliar a citotoxicidade dos diferentes compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch)

em macrófagos murinos da linhagem (J774.A1) e macrófagos caninos da linhagem (DH82),

através do ensaio de MTT;

• Avaliar a atividade leishmanicida dos compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch) na

forma promastigota da cepa OP46 de Leishmania infantum, através do ensaio de MTT;

• Avaliar a atividade leishmanicida dos compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch) na

forma amastigota da cepa OP46 de Leishmania infantum em macrófagos caninos (DH82) por

microscopia ótica;

2ª Etapa: Testes de drogas in vitro por citometria de fluxo

• Realizar a transfecção por gene repórter para GFP em promastigotas de L. infantum da cepa

OP46;

• Avaliar da atividade leishmanicida dos compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch)

na forma amastigota da cepa OP46 de Leishmania infantum transfectada com gene repórter para

GFP em macrófagos caninos (DH82) por citometria de fluxo.

5 MATERIAL E MÉTODOS

Salomão, N.E.O. Material e Métodos

32

5.1 Organismos e células

5.1.1 Cultivo de Leishmania infantum

No presente estudo foi utilizada a cepa Leishmania (Leishmania) infantum

(MCAN/BR/2008/OP46) isolada de cães procedentes de área endêmica (Governador Valadares,

MG) por nosso grupo de pesquisa. As células nas formas promastigotas foram inicialmente

criopreservadas em nitrogênio líquido no Laboratório de Imunopatologia/NUPEB-UFOP. Para

uso, as células foram descongeladas e cultivadas em meio líquido Liver Infusion Tryptose – LIT

(CAMARGO, 1964), em tubo de 15 mL (Falcon®, Becton Dickinson, EUA) e mantidas em

Estufa B.O.D. a temperatura de 25º C, durante sete dias para atingirem a fase estacionária de

crescimento. A cultura foi “repicada” para outros dois tubos de 15 mL (Falcon®, Becton

Dickinson, EUA) utilizando 1 mL de cultura contendo entre 107 a 108 promastigotas/mL e

adicionados a 3 mL de meio LIT. Após 7 dias foram “repicadas” novamente, adicionando 10ml

de meio LIT em cada tubo de 15 ml (Falcon®, Becton Dickinson, EUA). Após os sete dias de

cultivo, contendo entre 107 a 108 promastigotas/mL, as culturas foram novamente “repicadas” e

transferidas para Erlemeyer de 250 ml, na proporção de 10 ml de cultura de Leishmania para 30

ml de meio LIT, mantidas por mais sete dias nas mesmas condições até o momento do uso.

Durante esse período as culturas eram examinadas, e as promastigotas avaliadas ao microscópio

ótico quanto á sua morfologia, percentual de morte e ausência de contaminação, para que então

os parasitos fossem re-inoculados em um novo Erlemeyer de 250 mL, sendo feito um repique

semanal destas células, até no máximo de 10 passagens (P10) em meio de cultura.

5.1.2 Cultivo dos macrófagos imortalizados

As células de macrófagos caninos da linhagem DH82 (DS Pharma Biomedical, Osaka,

Japan) e de macrófagos murinos da linhagem J774.A1 (Banco de Dados de Células do Rio de

Janeiro – BCRJ) estavam inicialmente preservadas em nitrogênio líquido no criobanco do

Laboratório de Imunopatologia/UFOP. Para uso, as células foram descongeladas e cultivadas em

garrafas de cultura de 160 mL (Nunc, Roskilde, Denmark) com 40 mL de meio RPMI 1640

Medium (SIGMA) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino - SFB (Vitrocel Embriolife,


33

Campinas, SP) mantidas em Estufa com 5% de CO2, a 37º C. Para a manutenção das células, a

cada três dias era realizada a troca do meio das garrafas e a cada sete dias as mesmas eram

“repicadas”.

5.1.3 Transfecção das promastigotas de L. infantum cepa OP46 com o Gene Repórter

GFP

5.1.3.1 Plasmídeo pIR1-SAT

O plasmídeo contendo o gene da proteína GFP (pIR1-SAT) foi transfectado seguindo

o protocolo do Dr. Stephen M. Beverley, da Washington University, St. Louis (USA). Para a

estratégia de seleção, utilizou-se o gene NAT, que codifica a acetil transferase em pIR1-SAT e

confere melhor resistência para diversas espécies de Leishmania. Existem dois locais de

expressão em pIR1-SAT, localizados nos sítios SmaI ou "a", e Bg/II ou "b". Ambas são

flanqueadas por regiões intergênicas de Leishmania fornecendo informação para trans-splicing e

poliadenilação e ambos os locais produzem altos níveis de expressão. Foi selecionado o sítio de

inserção usando SmaI, pois confere maior expressão em formas amastigotas. Durante o

procedimento, a reação plasmídica foi digerida com SwaI para obter, de forma linear, o

fragmento a ser incluído no genoma do parasito. A transfecção em Leishmania infantum e a

seleção para expressão SAT produz parasitos onde a construção substitui uma cópia do gene

SSU (small subunit RNA gene in rDNA locus– subunidade pequena do gene no locus do DNA

ribossomal) e adquiri o promotor RNA polI ribosomal, conduzindo à transcrição em níveis

elevados. Para a construção plasmídica pIR1-SAT foi utilizada a concentração de 235 ng/mL

volume necessário para fornecer plasmídeo suficiente para realização de duas transfecções. O

plasmídeo foi então incubado over night, a temperatura de 25°C. Posteriormente 200 ng (1 µL)

de plasmídeo digerido e 200 ng (x µL) de plasmídeo não digeridos foram colocados em gel de

agarose a 0,7% com brometo de etídio . Após análise para verificação se a digestão estava

completa, o plasmídeo digerido com SwaI foi armazenado a 4°C até estar pronto para a

transfecção.

Para a transfecção foram cultivadas cepas de L. infantum OP46, em volume de 10 ml

de cultura, em concentração de 106 células/mL, incubadas a temperatura de 26°C. Os parasitos


34

na forma promastigotas foram transfectados, cerca de 5 dias após a incubação, quando a cultura

atingiu a fase logarítmica de 8 x 106 células/mL.

5.1.3.2 Eletroporação de Leishmania infantum

Após as promastigotas atingirem a fase logarítmica na concentração ideal de 8 x 106

células/mL, as mesmas foram centrifugadas a 2600 rpm, 25°C durante 5 minutos. Em seguida o

sobrenadante foi retirado e adicionados 15 mL de Cytomix para nova centrifugação. O

sedimento foi ressuspendido novamente em Cytomix para uma concentração de 1x108 de

células/ml. Foram utilizadas 3 cubetas de eletroporação (com abertura de 0,4cm) para realização

do procedimento. Em uma cubeta foi adicionado 50 µL de Cytomix e em outras duas 50 µL do

plasmídeo digerido com 20 µg de SwaI . Em cada cubeta foram adicionados 500 µL (na

concentração de 1x108 de células/mL) de solução contendo L. infantum com Cytomix e agitadas

suavemente para homogeneização. Os parasitos foram então eletroporados a 1500 V por duas

vezes, com intervalos de 10 segundos entre cada eletroporação. Após 24 horas da eletroporaçcão,

cada amostra foi colocada em 10 mL de meio M199 contendo 100 ug/mL antibiótico

Nourseothricin (NTC, Nurseotricin, Nourseotricin, clonNAT, da USBiological) e incubada

durante a noite, em temperatura de 26°C (Ha et al., 1996). As culturas foram mantidas em

pressão em meio líquido por 15 dias, monitorando o controle sem DNA (Mock), até que o

mesmo demonstrou perda de viabilidade celular (analisado por microscopia ótica).

Seguinte a incubação, um volume de 1,8 mL das amostras foram retirados e

transferidos para microtubos com capacidade de 2 mL. As amostras foram centrifugadas a 2000

rpm durante 2 minutos e o sobrenadante descartado, assim o sedimento de células foi

ressuspendido em meio LIT, expandidas e levadas a análise por fluorescência.

5.1.3.3 Avaliação da fluorescência por citometria de fluxo

A avaliação da produção de fluorescência da proteína GFP dos parasitos L infantum

cepa OP46 transfectados foi realizada a partir confecção de lâminas a fresco, das culturas de

promastigotas de L.infantum OP46 GFP em meio LIT, para visualização em microscópio de

fluorescência Zeiss Imager. Z2 AXIO, sendo as imagens armazenadas em arquivo eletrônico

(imagens não mostradas).


35

Também para confirmação da fluorescência foi feita a análise em Citômetro de Fluxo

FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, EUA). Com o intuito de comparar a fluorescência

das promastigotas normais com as transfectadas com o gene repórter para GFP, um volume de

100 µL das culturas de promastigotas de L.infantum OP46 e OP46GFP foram transferidos para

tubos de poliestireno (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) de 12x75mm, adicionados 2mL

de PBS para lavagem, seguida de centrifugação a 3000 rpm, 10 minutos, 24ºC. Em seguida o

sobrenadante foi descartado e as leishmanias ressuspendidas em 200 µL de PBS para leitura e

análise no Citômetro de Fluxo.

Os parâmetros de tamanho e granulosidade na citometria de fluxo foram utilizados

para avaliação biológica da transfecção e verificação de alterações de sua morfologia. A emissão

de fluorescência da cepa normal e da cepa GFP foi comparada pela quantificação da intensidade

média de fluorescência (MFI) emitida no Citômetro de Fluxo, com intuito de confirmar o

sucesso da transfecção dos parasitos (Figura 9). O número de eventos da aquisição de

promastigotas no citômetro FACSCalibur foi de 100.000, e os dados gerados foram analisados

pelo software FlowJo.

Figura 9: Avaliação da morfologia e fluorescência de promastigotas de Leishmania infantum OP46 e

OP46GFP por citometria de fluxo. Na parte superior e inferior á esquerda da figura, estão representados os

gráficos de tamanho (FSC) x granulosidade (SSC), respectivamente, eixo x e y, para avaliação da morfologia das

promastigotas. No cento da figura estão representados os gráficos de histograma para a fluorescência FL-1, das

respectivas populações de promastigotas no “gate” R1 nos gráficos FSC x SSC, onde avaliamos a intensidade

média de fluorescência das populações (MFI) de promastigotas normais OP46 (MFI: 11,4) e transfectadas com

gene repórter Op46 GFP (MFI: 1021). Na direita da figura está representado o gráfico de histograma para FL-1

das duas populações simultaneamente, demonstrando a diferença de MFI e do deslocamento no eixo (FL-1) enre

as duas populações Op46 (cor vermelha) e a OP46 (cor azul).


36

5.2 Compostos químicos: aldiminas, adutos de Hantzsch e Anfotericina B Desoxicolato

de Sódio

Os compostos químicos avaliados (aldiminas e adutos de Hantzsch) foram gentilmente

cedidos pelo Prof. Ângelo de Fátima, do Instituto de Ciências Extas (ICEx) da Universidade

Federal de Minas Gerais (UFMG). No presente estudo foram testados 12 compostos, sendo um

grupo (n=7) de derivados sintéticos de aldiminas, representados pelas siglas: 3D7, 3G2, 3H7,

3H8, 3H9, 3I4 e 3I5; e um grupo de derivados sintéticos de adutos de Hantzsch (n=5), sendo os

compostos representados pelas siglas: 8A2, 8A3, 8A4, 8B5 e 8B6. As informações referentes aos

compostos químicos, pertencentes a estes grupos, como desenvolvimento, composição química,

peso molecular, entre outras, estão demonstradas no Anexo 1.

Inicialmente os compostos derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch foram

mantidos em freezer á temperatura de -20°C até o momento de uso. As diluições dos compostos

foram realizadas em meio RPMI 1640 com 10% de SFB e filtradas em filtro para seringa

0,22µm (Prolab), de modo a obter amostras nas concentrações: (C1: 500 µg/ml; C2: 400 µg/ml;

C3: 300 µg/ml; C4: 200 µg/ml; C5: 100 µg/ml; C6: 50 µg/ml; C7: 25 µg/ml; C8: 12,5 µg/ml; C9:

6,25 µg/ml; C10: 3,125 µg/ml; C11: 1,5625 µg/ml; C12: 0,78125 µg/ml; C13: 0,390635 µg/ml). As

diluições da Anfotericina B Desoxicolato de Sódio (AmB-D) também foram feitas, sempre

previamente antes dos experimentos, em meio RPMI 1640 com 10% de SFB afim de obter

amostras nas concentrações: (C3’: 250 µg/ml; C4: 200 µg/ml; C5: 100 µg/ml; C6: 50 µg/ml; C7:

25 µg/ml; C8: 12,5 µg/ml; C9: 6,25 µg/ml; C10: 3,125 µg/ml; C11: 1,5625 µg/ml; C12: 0,78125

µg/ml; C13: 0,390635 µg/ml). As diluições foram mantidas em geladeira á temperatura de 0°-

10°C durante o período de uso das amostras.

5.3 Delineamento experimental

O delineamento experimental referente aos experimentos desenvolvidos neste trabalho

está representado na Figura 10.

Primeiramente foi realizado o ensaio de citotoxicidade empregando a técnica do MTT

em macrófagos caninos da linhagem DH82 e de macrófagos murinos da linhagem J774.A1, com

intuito de determinarmos o valor da concentração do IC50% para cada um dos 12 compostos

químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch) com potencial leishmanicida. O valor da IC50


37

encontrado para os diferentes compostos testados foi empregado nos testes subsequentes para

determinação do potencial leishmanicida em formas promastigotas e amastigotas de L. infantum.

O potencial leishmanicida em formas promastigotas da cepa OP46 de L. infantum foi

determinado através do ensaio de MTT em placas de 96 poços, onde as culturas em fase

estacionária de crescimento foram encubadas com as diferentes drogas por tempos de 24, 48 e 72

horas.

Para determinação do potencial leishmanicida em formas amastigotas de L. infantum

foram empregadas duas metodologias: ‘‘clássico’’ e ‘‘citometria de fluxo’’. Na metodologia aqui

denominada ‘‘convencional’’, macrófagos caninos imortalizados da linhagem DH82 foram

incubados em lâminas do tipo chamber slide TM (Lab-Tek) com promastigotas de L. infantum por

24 horas (para internalização das formas promastigotas e diferenciação em formas amastigotas

no interior dos macrófagos). Após esse período, os poços foram lavados para retirar as formas

promastigotas não internalizadas e foi realizada a incubação com as respectivas concentrações

dos valores de IC50, previamente determinadas para cada um dos diferentes compostos testados,

durante o período de 24, 48 e 72 horas. Em cada um desses tempos avaliados, as Chamber

SlideTM (Lab-Tek), foram retiradas da estufa e a parte superior destacada para realizar a

coloração por Giemsa, fixação das lâminas para a contagem em microscópio ótico para

determinação do percentual de macrófagos infectados, além da frequência do número de

amastigotas por macrófagos infectados, tanto para os 12 compostos químicos testados, bem

como para o controle positivo sem tratamento e para o controle com Anfotericina B-

desoxicolato.

Com o intuito de aprimorarmos a capacidade de detecção do número de macrófagos

infectados e verificarmos com maior precisão a verdadeira contribuição na redução no número

de macrófagos infectados após incubação com os diferentes compostos testados, empregamos a

cepa OP46 de L. infantum transfectada com gene reporte para GFP juntamente com a citometria

de fluxo. Nesse sentido, macrófagos da linhagem DH82 foram incubados com a cepa OP46 de

L. infantum GFP em tubos de poliestireno por 24 horas (para internalização das formas

promastigotas e diferenciação em formas amastigotas dentro dos macrófagos), após esse período

as formas promastigotas não internalizadas foram retiradas por lavagem e centrifugação e então

foi realizada a incubação com as respectivas concentrações dos valores de IC50, previamente

determinadas para cada um dos diferentes compostos testados, durante o período de 24, 48 e 72

horas. Em cada um desses tempos avaliados foram retirados tubos para leitura em citômetro de

fluxo, para determinação do percentual de macrófagos infectados, tanto para os 12 compostos


38

químicos testados bem como para o controle positivo sem tratamento e para o controle com

Anfotericina B.

5.4 Ensaio de citotoxicidade

Os ensaios de citotoxicidade foram realizados utilizando as células de macrófagos

caninos da linhagem DH82 e de macrófagos murinos da linhagem J774.A1, a partir do método

colorimétrico de MTT, conforme protocolo proposto por MOSMANN (1993) e adaptado por

Valadares et. al (2012). Esses testes permitiram a identificação do IC50 de cada droga testada

para que fossem posteriormente realizados os testes de atividade leishmanicida em formas

promastigotas e formas amastigotas (internalizadas em macrófagos).

L. Infantum OP46Promastigota

+

Compostos químicos [IC50]

MTT

Formas promastigotas

Delineamento Experimental

Atividade Leishmanicida

Infectividade in vitro(Clássica)

Infectividade in vitro(Citometria de Fluxo)

+

Avaliação in vitroda citotoxicidade

Mø J774.A1 / Mø DH82

+

aldiminas e a. Hantzsch –12 concentrações

MTT

Determinação do [IC50]

Formas amastigotas

Mø DH82 + L. Infantum OP46

Mø DH82 + L. Infantum OP46 GFP

+



Figura 10: Delineamento experimental referente aos experimentos desenvolvidos neste estudo. Avaliação in

vitro da citotoxicidade em macrófagos canino (DH82) e macrófagos murino (J774.A1) empregando a técnica de

MTT, para determinação de valores de IC50 de cada composto químico (Adultos de Hantzsch e Aldiminas).

Avaliação da atividade leishmanicida em formas promastigotas da cepa OP46 de L. infantum a partir do ensaio de

MTT. Para a avaliação do potencial leishmanicida em formas amastigotas de L. infantum foram empregadas duas

metodologias: ‘‘clássica’’ através de análise microscópica de amastigotas internalizadas em macrófagos caninos

(DH82) e por ‘‘citometria de fluxo’’ para análise de amastigotas da cepa OP46 de L. infantum transfectada com

gene reporte para GFP internalizadas em macrófagos caninos (DH82).


39

5.4.1 Avaliação in vitro da citotoxicidade: Macrófagos Caninos DH82 e em Macrófagos

Murinos J774.A1

Para a avaliação da citotoxicidade dos compostos a serem testados, foram utilizadas

células imortalizadas de macrófagos caninos da linhagem DH82 bem como em macrófagos

murinos da linhagem J774.A1.

Ambas as linhagem de células foram utilizadas no quinto dia após o repique, momento

em que apresentava confluência aproximada de 90%. O meio de cultura das garrafas contendo as

células foi desprezado, com objetivo de descartar as células não aderidas. Em seguida, 20 mL de

PBS + EDTA (2mM) (gelado, 4ºC) foi adicionado a garrafa de cultura para suspensão das

células, através da raspagem com o auxílio do Cell Scraper (SPL 90020 LIFE SCIENCES) para

desagregação das células do fundo das placas, sendo essas então transferidas para tubo de 50 ml

(Falcon®, Becton Dickinson, EUA), para centrifugação a 1400 RPM, durante 10 minutos em

temperatura de 18°C. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionado ao tubo

com 10 ml de RPMI 1640 com 10% de SFB e homogeneizado em vórtex. Para a contagem, em

microtubo Eppendorf Graduado Neutro – Volume de 1,5 ml, foi feita a diluição de 1:20, com

volume de 120 µL de Trypan Blue Solution 0,4% (SIGMA), 60 µL de PBS+EDTA e 20 µL da

suspensão de macrófagos, e em seguida 10 µL desta diluição foi adicionado em câmara de

Neubauer. Após a contagem, o volume contido no tubo foi ajustado de forma que as células da

linhagem DH82 ou da linhagem J774.A1 tivessem na concentração final de 2x106 de macrófagos

por ml, sendo plaqueados 1x105 de macrófagos por poço. Desta forma, em seguida foram

adicionados 50 μL de macrófagos (1x105) em placa de 96 poços de fundo chato (NUNCTM,

Roskilde, Dinamarca). Após a adição dos macrófagos, foi então adicionado 50 μL dos compostos

químicos, nas diferentes concentrações testadas (C1: 500 µg/ml a C13: 0,390625 µg/ml). Como

controle negativo foram utilizados 50 μL de macrófagos (1x105) + 50 µL de meio RPMI 1640

com 10% de SFB nos respectivos poços, de acordo com o desenho experimental da placa para

cada droga avaliada. Além do grupo controle negativo, foram feitas placas com os macrófagos

em contato com a AmB-D, nas concentrações entre C3’: 250 µg/mL a C13: 0,390625 µg/mL, para

comparação com os compostos químicos. As placas foram incubadas em estufa de CO2, pelos

tempos de 24, 48 e 72 horas. Após os determinados tempos, as placas eram retiradas para adição

de 150 µL da solução de MTT na concentração de 2µg/ml e incubada por mais 4 horas para que

então fosse feita a dição de 60 µL da solução de SDS 10% em HCL 0,01 M (SDS – HCl) em

cada poço e incubadas novamente. Posteriormente, após 16 horas de incubação foi realizada a

leitura das placas, em espectrofotômetro do tipo leitor de ELISA no comprimento de onda de


40

490 nm. Cada concentração dos compostos químicos, da AmB-D e dos grupos controles, foram

realizadas em triplicatas e o experimento foi repetido 3 vezes, em dias diferentes.

5.5 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch

em formas promastigotas

Após a análise e obtenção dos resultados dos experimentos de avaliação de

citotoxicidade, tanto em macrófagos caninos (DH82) quanto macrófagos murinos (J774.A1), foi

determinado o valor de IC50 de cada composto químico testado. Em seguida, foi realizado o teste

de avaliação leishmanicida com o objetivo de avaliar a capacidade de cada composto na

eliminação/morte da forma promastigota do parasito. Nesta etapa as formas promastigotas foram

expostas in vitro a diferentes concentrações dos compostos a serem testados e a taxa de

viabilidade dos parasitos foi determinada após 24, 48 e 72 horas de incubação pelo método de

MTT conforme protocolo proposto por Mosmann (1993) e descrito abaixo.

Para a realização desse experimento, foram utilizados parasitos de L. infantum da cepa

OP46. Os parasitos estavam com sete dias (em fase estacionária crescimento), sendo cultivados

em no máximo dez passagens (P10) de crescimento em meio de cultura LIT. Para esta etapa

foram utilizadas células cultivadas em Erlemeyer de 250 ml, na proporção de 30 mL de L.

infantum OP46 para 80 ml de meio LIT, a fim de obter volume suficiente para a realização do

experimento. Foram retirados 2 mL da cultura e colocada em tubo de 50 ml (Falcon®, Becton

Dickinson, EUA) para preparação da diluição de 1:50, sendo utilizado o volume de 490 µl de

formalina 4% e 10 µl de Leishmania, colocado em microtubo de 1,5 mL, homogeneizado e

adicionado em câmara de Neubauer para a contagem. Após a contagem, o volume contido no

tubo de 50 mL foi ajustado de forma que as células tivessem na concentração de 2x108 por mL e

na concentração de 1x107 /poço (50 μL) e então centrifugado para a retirada do excesso de meio

LIT e adicionado o volume necessário de RPMI 1640 com 10% de SFB para a realização do

experimento. Em placas de 96 poços de fundo chato foram adicionados 50 μL da Leishmania em

cada poço. Em seguida, foram adicionados 50 μL dos compostos químicos nas diferentes

concentrações (Tabela 1). Os poços referentes ao grupo controle das placas receberam 50μL

RPMI 1640 com 10% de SFB, de acordo com o desenho experimental. As placas foram vedadas

com parafilme e incubadas em Estufa B.O.D., em temperatura de 25ºC nos tempos de 24, 48 e 72

horas de tratamento. Após cada um dos tempos, as placas eram retiradas da estufa para adição de

150 µL de solução de MTT na concentração de 2µg/mL e em seguida lacradas, envolvidas com

papel alumínio e incubadas novamente. Seguido o tempo de incubação, foram adicionados 60 µL


41

de SDS 10% em HCL 0,01 M (SDS – HCl) em cada poço e novamente incubadas.

Posteriormente, após 16 horas foi feita a leitura das placas, em espectrofotômetro do tipo leitor

de ELISA em compimento de onda de 490 nm.

Também foram feitas placas com diferentes concentrações de AmB-D (250 µg/mL a

0,390625 µg/mL) como parâmetro de comparação (controle positivo de morte das formas

promastigotas) com os compostos químicos dos grupos de aldiminas e adutos de Hantzsch.


em formas amastigotas de L. infantum

5.6.1 Método clássico: microscopia ótica

5.6.1.1 Infecção de macrófagos caninos (DH82) com Leishmania infantum cepa OP46

Com o objetivo de selecionar os compostos químicos com ação leishmanicida em

formas amastigotas, macrófagos caninos imortalizados da linhagem DH82 foram infectados com

Leishmania infantum OP46 e foram incubados com cada um dos compostos químicos dos grupos

das aldiminas e adutos de Hantzsch testados, além da droga AmB-D, ambos com as

concentrações previamente determinadas do valor do IC50 obtido do experimento anterior de

avaliação de citotoxicidade (Tabela 1). Neste experimento foi usado apenas uma concentração de

cada composto químico dos grupos estudados e para a droga AmB-D (Tabela 1).

Os macrófagos DH82 foram cultivados em garrafas de cultura de 160 mL (Nunc,

Roskilde, Denmark) com volume de 40 mL de meio de cultura RPMI 1640 sendo utilizados no

momento em que a confluência aproximada era de 90%. Para a transferência das células, o meio

RPMI 1640 da garrafa de cultura foi descartado e adicionado 15 mL de Solução de PBS + EDTA

(2 mM) para melhor desaderência das células do fundo da garrafa, com auxílio do Cell Scraper

para raspagem das células. Posteriormente as células da linhagem DH82 foram transferidas para

um tubo de 50 mL (Falcon®, Becton Dickinson, EUA). Em seguida o tubo foi submetido à

centrifugação em 1400 RPM, durante 10 minutos a 18°C. O sobrenadante foi desprezado e o

sedimento foi homogeneizado em vórtex e suspenso em meio RPMI 1640 com 10% de SFB.

Para a contagem as células foram diluídas em Trypan Blue Solution, seguindo o protocolo da


42

diluição de 1:20, onde foram utilizados 120 μL de Trypan Blue Solution, 70 μL de PBS + EDTA

e 10 μL da célula ressuspendida em meio de cultura para contagem em câmara de Neubauer.

Após a contagem, a concentração no tubo foi ajustada para 1x105 macrófagos/mL, de forma que

ao adicionar 100 μL em cada poço da placa de 16 poços em lâminas do tipo Chamber SlideTM

(Lab-Tek), houvesse 1x104 macrófagos por poço. Em seguida, as placas foram incubadas em

estufa de CO2 para fixação dos macrófagos por 1 hora, para posterior infecção com as formas

promastigotas.

As formas promastigotas de Leishmania infantum foram cultivadas em meio LIT,

como descrita anteriormente (item 5.1.1). Dessa forma, foram retirados 10 mL da cultura de

promastigotas de L. infantum do Erlemeyer, transferidos para tubo de 50 mL (Falcon®, Becton

Dickinson, EUA) e submetidos à centrifugação em 3000 RPM, durante 10 minutos a 18°C. Em

seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi homogeneizado em vórtex e suspenso

em 10 mL de meio RPMI 1640 com 10% de SFB e novamente homogeneizado em vórtex para a

contagem em câmera de Neubauer. Para a contagem foi feita a diluição de 1:50, sendo utilizados

490 μL de Formalina a 4% e 10 μL da cultura ressuspendida. Após a contagem, a concentração

foi ajustada para 1x106 promastigotas/mL.

Posteriormente, as placas com macrófagos foram retiradas da estufa de CO2 e sem

desprezar o sobrenadante foram adicionados 100 μL da cultura de Leishmania [1x106

promastigotas/ml], ou seja, 1x105 promastigotas em cada poço da placa Chamber SlideTM, com o

intuito de ocorrer a incubação na proporção 1 macrófago para 10 promastigotas (1:10) (poço -

1x104 macrófago: 1x105 promastigotas). Em seguida, as placas foram incubadas por 24 horas

para que ocorresse a internalização e infecção dos macrófagos com as formas promastigotas do

parasito e sua transformação em formas amastigotas. Após as 24 horas de infecção, o

sobrenadante das placas foi retirado e de acordo com o desenho experimental das placas

Chamber SlideTM, cada composto químico, foi adicionado em sua respectiva concentração do

valor de IC50, em um volume final de 200 μL/poço, bem como para os poços referentes a AmB-

D. O grupo controle positivo da infecção recebeu 200 μL de meio RPMI 1640. Em sequência, as

placas foram incubadas novamente em estufa de CO2 (37ºC com 5% de CO2), e foram retiradas

para avaliação do tratamento após os tempos de 24, 48 e 72 horas de contato com os compostos

químicos (Sesana, 2009). Para cada composto testado, AmB-D e controles foram feitos três

poços distintos na placa de Chamber SlideTM, e o experimento foi repetido três vezes (triplicata).


43

5.6.1.2 Preparo e análise das lâminas da infectividade in vitro

Após os respectivos tempos de tratamento 24, 48 e 72 horas, o sobrenadante de cada

placa foi desprezado e adicionados 50 μL de Corante nº 1 do Kit Panótico Rápido InstantProv

(Newprov®) permanecendo por 1 minuto. Após esse tempo, o corante foi retirado e a parte

superior da placa removida, bem como o silicone de aderência dos poços, ficando somente a

lâmina contendo as células aderidas e fixadas. As lâminas foram então coradas utilizando o

mesmo kit Panótico Rápido InstantProv (Newprov®), sendo emergidas por 30 segundos em cada

corante (2 e 3) do kit e em seguida lavadas em água. Depois do tempo de secagem das lâminas,

as mesmas receberam lamínulas que foram aderidas com Entellan® (Merck, Alemanha).

Posteriormente, foi realizada a análise e contagem das lâminas com o auxílio de

microscópio óptico (Olympus Optical, Japão), com auxílio de óleo de imersão na objetiva com

aumento de 100x. Foi então realizada a contagem total de 300 macrófagos por poço, sendo

discriminado o número de macrófagos infectados dos não infectados, além do número de

amastigotas encontradas dentro dos macrófagos infectados. Os resultados desta infecção foram

expressos em: porcentagem de macrófagos infectados, razão do número de amastigotas por

macrófagos infectados e porcentagem da redução de amastigotas intracelulares.

5.6.2 Citometria de Fluxo

5.6.2.1 Infecção de macrófagos caninos (DH82) com Leishmania infantum cepa OP46

transfectada com o gene repórter GFP

Os macrófagos DH82 e as promastigotas de Leishmania infantum cepa OP46 GFP

foram preparados seguindo as mesmas etapas do item 5.5.1.1, porém, após a contagem dos

mesmos, eles foram incubados em estufa de CO2 por 24 horas em tubos de poliestireno (Becton

Dickinson, Franklin Lakes, USA) de 12x75mm, com capacidade para 5mL, para que não

ocorresse adesão dos macrófagos. A mesma proporção 1 macrófago para 10 promastigotas (1:10)

(tubo - 1x105 de macrófago DH82: 1x106 de promastigotas de L. infantum cepa OP46 GFP) foi

seguida para que ocorresse a infecção, internalização e diferenciação das formas promastigotas

em amastigotas.


44

Após o tempo de incubação (24horas), foi adicionado 1 mL de PBS 10% (Phosphate-

Buffered Saline) para lavar os tubos, centrifugando a 3000 rpm, durante 7 minutos, 23ºC, e

descartando o sobrenadante. Em seguida foi adicionado 300 μL das drogas e da AmB-D nos

respectivos tubos (respeitando o valor da concentração IC50% de cada composto, idem item

5.5.1.1 e Tabela 1) e 300 μL de RPMI com 10% de SFB nos tubos do grupo controle e

novamente incubados para posterior leitura nos tempos de 24, 48 e 72 horas de tratamento. Após

os tempos de tratamento, os tubos foram lavados com 1 ml de PBS + EDTA (2mM) e

centrifugados a 3000 rpm, durante 7 minutos, 23ºC,, em seguida ao descarte do sobrenadante, os

tubos foram ressuspendido em 200 μL de PBS e procedeu-se a leitura (20.000 células/eventos

por tubo) em Citômetro de Fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, EUA).

5.6.2.2 Estratégias para análise da infecção dos macrófagos DH82 por cepa de L.

infantum transfectada com gene GPF por Citometria de fluxo

Os resultados referentes ao potencial leishmanicida de diferentes compostos de

Aldiminas e Adultos em formas amastigotas do parasito foram obtidos através da frequência (%)

de macrófagos DH82 fluorescentes (verde – GFP/FL1)

A análise da frequência (%) de macrófagos DH82 fluorescentes (verde – GFP+ – FL1)

foi realizada utilizando-se a estratégia de análise convencional. Esse tipo de análise consistiu na

seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos morfométricos, através de

gráficos de distribuição pontual de FSC (tamanho) versus SSC (complexidade) (Figura 11). Após

a seleção da região de interesse (R1) contendo células da cultura de macrófagos imortalizados

DH82, o percentual de macrófagos não infectados (GFP-) e infectados (GFP+), dentro da

população selecionada, foi obtido em gráficos unidimensionais do tipo histogramas para a

fluorescência GFP/FL1, como exemplificado na Figura 11. Na tentativa de mensurarmos

indiretamente a “carga parasitária” ou o número de amastigotas dentro dos macrófagos

infectados foi calculado a média da intensidade de fluorescência (MFI-FL1) dos macrófagos

infectados (GFP+). Os parâmetros descritos acima dos macrófagos (20 mil eventos/células)

foram determinados no citômetro de fluxo (FACScalibur® – Becton Dickinson). O programa

CELLQuest® foi utilizado para a aquisição de dados e para a análise dos resultados foi

empregado o software FlowJo® das estratégias descritas.


45

5.7 Análise estatística

As análises estatísticas dos dados obtidos nos ensaios de viabilidade celular nas

avaliações in vitro de citotoxicidade dos macrófagos caninos DH82 e murinos J774.A1 e da

atividade leishmanicida com a cepa OP46 foram realizadas com o auxílio do software GraphPad

Prism 5 (Prism Software, Irvine, CA, USA), utilizando a análise de correlação entre os dados.

Nos experimentos com o teste clássico por microscopia de infectividade in vitro com as células

de macrófagos caninos DH82 infectados com as cepas de Leishmania OP46, os resultados foram

analisados no software GraphPad Prism 5 (Prism Software, Irvine, CA, USA), utilizando o teste

t não paramétrico (one-tailed) considerando estatisticamente significativos os resultados com os

valores de p <0.05. Para os experimentos de infectividade in vitro com as células de macrófagos

caninos DH82 infectados com as cepas de Leishmania OP46(GFP) os resultados foram obtidos a

partir do FACS Calibur (Becton Dickinson Mountain View, CA) e foram analisados no

programa FlowJo 7.6.4 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA).

Figura 11: Sequencia de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de macrófagos infectados com

leishmania GFP+ após o tratamento in vitro com diferentes compostos de aldiminas e adutos de Hantzsch. No gráfico da

esquerda está representada a distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de interesse –

R1, macrófagos caninos imortalizados DH82. No gráfico da direita, do tipo histograma, temos a representação unidimensional

para a fluorescencia GFP/FL, contendo as células selecionadas na região R1, empregados para quantificar o percentual de

macrófagos não infectados (GFP-) e infectados (GFP+). Nesse tipo de análise tambpem verificamos a média de fluorescência

(MFI-FL1) dos macrófagos infectados (GFP+), para quantificarmos indiretamente o número de amastigotas dentro dos

macrófagos infectados.

6 RESULTADOS

Salomão, N.E.O. Resultados

47

6.1 Apresentação de resultados

O presente trabalho traz como resultados um conjunto de dados da avaliação

leishmanicida in vitro de novos composto sintéticos pertencentes ao grupo das aldiminas e

adutos de Hantzsch. Nossos resultados refletem um esforço focado em experimentos de

avaliação comparativa entre a metodologia in vitro da microscopia ótica

usualmente/tradicionalmente utilizada na avaliação leishmanicida de testes in vitro de drogas,

com uma nova metodologia empregando a citometria de fluxo conjuntamente com a tecnologia

de transfecção de um gene repórter fluorescente aos parasitos de L. infantum especificamente de

uma cepa isolada em nosso laboratório, com o intuito de aperfeiçoarmos os estudos de testes in

vitro de potenciais drogas leishmanicidas. Inicialmente serão descritos os resultados da

citotoxicidade in vitro através da técnica do MTT, para obtenção dos valores de IC50% dos

diferentes compostos testados. Na segunda parte, serão descritos os resultados da atividade

leishmanicida em formas promastigotas (ensaio de MTT) e amastigotas (microscopia ótica) do

parasito através de metodologias usualmente empregadas em testes in vitro. Na terceira parte,

serão descritos os resultados da ação leishmanicida avaliados por citometria de fluxo.

6.2 Avaliação in vitro da citotoxicidade

As figuras 12 e 13 contem os gráficos com os resultados obtidos pelo teste de

citotoxicidade, que representam o valor do percentual da redução de viabilidade dos macrófagos

murinos (linhagem J774.A1) e macrófagos caninos (linhagem DH82), após o tratamento durante

os tempos de 24, 48 e 72 horas. Estes resultados são apresentados, através das curvas com as

diferentes concentrações dos compostos químicos dos grupos das Aldiminas e dos Adutos de

Hantzsch testados (C1: 500 µg/mL; C2: 400 µg/mL; C3: 300 µg/mL; C4: 200 µg/mL; C5: 100

µg/mL; C6: 50 µg/mL; C7: 25 µg/mL; C8: 12,5 µg/mL; C9: 6,25 µg/mL; C10: 3,125 µg/mL; C11:

1,5625 µg/mL; C12: 0,78125 µg/mL; C13: 0,390635 µg/mL) e da Anfotericina (AmB-D) (C3’:

250 µg/mL; C4: 200 µg/mL; C5: 100 µg/mL; C6: 50 µg/mLl; C7: 25 µg/mL; C8: 12,5 µg/mL; C9:

6,25 µg/mL; C10: 3,125 µg/mL; C11: 1,5625 µg/mL; C12: 0,78125 µg/mL; C13: 0,390635

µg/mL). É importante salientar que cada concentração de cada droga foi testada em triplicata e

que cada experimento completo foi repetido por pelo menos três vezes, em dias diferentes.

Inicialmente, as diferentes concentrações foram testadas com o objetivo de estabelecer

a concentração inibitória de 50% (IC50) de cada composto, no qual, o valor de IC50 é o valor

padrão utilizado em testes de drogas e que permite encontrar um “valor ideal” que viabilize ou


48

cause a morte de 50% das células. Dessa forma, os valores de IC50 foram utilizados nos

experimentos seguintes de avaliação de atividade leishmanicida em promastigotas e amastigotas

(através dos testes de infecção de macrófagos caninos (linhagem DH82) infectados com L.

infantum OP46).

6.2.1 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de aldiminas em

culturas secundárias de macrófagos

Os resultados apresentados nos gráficos da figura 12 mostraram nos compostos de

aldiminas um perfil de citotoxicidade um pouco semelhante nas duas culturas secundárias de

macrófagos empregadas (caninos DH82 e murinos J774.A1), como podemos observar nos

valores obtidos do IC50 para cada droga ao longo dos tempos 24, 48,72h (Figura 12 e Anexo 2) e

a maioria das formulações de aldiminas testadas apresentou uma maior citotoxicidade ao longo

dos tempos avaliados, em ambos os sistemas de células macrofágicas imortalizadas empregadas,

como é o caso dos compostos 3I4 (DH82: 20µg/mL e J774.A1: 15 µg/mL), 3I5 DH82: 15 µg/mL

e J774 J774.A1: 1,5 µg/mL), 3H8 (DH82: 45 µg/mL e J774.A1: 15 µg/mL), 3H9 (DH82: 40

µg/mL e J774.A1: 10 µg/mL), 3D7 (DH82: 10 µg/mL e J774.A1: 20 µg/mL), 3G2 (DH82: 20

µg/mL e J774.A1: 5 µg/mL), que apresentaram assim um menor valor de concentração capaz de

matar 50% das células (IC50) (Figura 12 e Anexo 2). Podemos destacar o composto de Aldiminas

3H7 como o menos tóxicos, pois apresentou maiores valores de concentração de IC50 (DH82: 85

µg/mL e J774.A1: 40 µg/mL) em relação aos demais compostos (Figura 12 e Anexo 2) ao longo

dos tempos de avaliação. Para a determinação dos valores de IC50% em cada composto de

Aldiminas testada foi escolhido o menor valor de IC50 (maior citotoxicidade) encontrado nos 3

tempos de avaliação (24h, 48h e 72h) (Tabela1). O valor do IC50 obtido para a AmB-D foi de

aproximadamente 100 µg/mL em ambas células testadas ao longo dos tempos avaliados.


49

25

50

75

100

-1 0 1 2 3

25

50

75

100

-1 0 1 2 3 -1 0 1 2 3

24 Horas 48 Horas 72 Horas

Log da concentração [500 - 0,1953125 µg/ml]

MA

CR

ÓF

AG

O J

774

.A1

Via

bili

dade

(%)

MA

CR

ÓF

AG

O D

H82

Via

bili

dade (

%)

Figura 12: Avaliação da citotoxicidade das aldiminas em Macrófagos Murino (J774.A1) e Macrófagos Canino (DH82):

Porcentagem da viabilidade dos Macrófagos Murino (J774.A1) e Canino (DH82) tratados com diferentes concentrações das

aldminas e da AmB-D, durante os tempos de 24, 48 e 72 horas de tratamento. O log das concentrações das aldiminas

correspondem a diluições entre 500 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. O log das concentrações da AmB-D correspondem a diluição

seriada entre 250 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. Legenda:


50

6.2.2 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de adutos de

Hantzsch em culturas secundárias de macrófagos

Os resultados apresentados nos gráficos da figura 13 não demonstraram nos

compostos de adutos de Hantzsch um perfil de citotoxicidade semelhante nas duas culturas

secundárias de macrófagos empregadas (caninos DH82 e murinos J774A.1), como podemos

observar nos valores obtidos do IC50 para cada droga ao longo dos tempos 24, 48 e 72h (Figura

13 e Anexo 2). De maneira geral, em todas as formulações de adutos de Hantzsch foi observada

uma baixa citotoxicidade ao longo dos tempos avaliados, com concentração capaz de matar 50%

das células (IC50), muitas vezes, acima da concentração máxima de 500 µg/ml (primeiro ponto

da curva de IC50) testadas, nos tempos de 24, 48 e 72 após o tratamento (Figura 13 e Anexo 2).

Desta forma os valores de IC50 nos macrófagos DH82 para os compostos de Adultos de Hantzsch

(considerando o menor valor foram: IC50 entre os tempos de 24, 48 e 72h): 8A2 (IC50:

>500µg/mL); 8A3 (IC50: >500µg/mL); 8A4 (IC50: 170µg/mL); 8B5 (IC50: >500µg/mL); 8B6

(IC50: >500µg/mL) (Tabela 1).

Já nos macrófagos murinos J774A.1, somente nas concentrações mais altas (C1: 500

µg/ml; C2: 400 µg/mL; C3: 300 µg/mL; C4: 200 µg/mL; C5: 100 µg/mL) que os adutos de

Hantzsch demonstram algum percentual de citotoxicidade considerável. Pode-se observar que

apenas a partir de 48 horas de tratamento, os compostos químicos de Adultos, em suas maiores

concentrações começam a matar mais de 50% dos macrófagos, chegando a um percentual de

morte em torno de 90% após 72 horas de tratamento. Nota-se, para estas células, que os

compostos químicos dos adutos de Hantzsch apresentaram um comportamento na curva de

citotoxicidade semelhante ao da AmB-D (IC50: 100 µg/mL). Desta forma os valores de IC50 para

os compostos de adultos (Considerando o menor valor foram: IC50 entre os tempos de 24, 48 e

72h): 8A2 (IC50: 125µg/mL); 8A3 (IC50: 60µg/mL); 8A4 (IC50: 50µg/mL); 8B5 (IC50:

140µg/mL); 8B6 (IC50: 115µg/mL) (Tabela 1).

Já para os macrófagos caninos da linhagem DH82 os resultados apresentados nos

gráficos da figura 13 do perfil de citotoxicidade demonstraram que nenhuma dos compostos de

Adultos atingiu o valor de IC50 na concentração máxima de 500 µg/mL, nos tempos de 24, 48 e

72 após o tratamento, demonstrando menor citotoxicidade quando comparadas a curva da AmB-

D. Com exceção do composto 8A4 que em 48h apresentou um valor de IC50 169,8 µg/mL.


51

MA

CR

ÓF

AG

O J

774

.A1

Via

bili

dade

(%)

MA

CR

ÓF

AG

O D

H82

Via

bili

dade (

%)

25

50

75

100

-1 0 1 2 3

25

50

75

100

-1 0 1 2 3 -1 0 1 2 3


Figura 13: Avaliação da citotoxicidade dos adutos de Hantzsch em Macrófagos Murino (J774.A1) e Macrófagos Canino

(DH82): Porcentagem da viabilidade dos Macrófagos Murino (J774.A1) e Canino (DH82) tratados com diferentes concentrações

dos adutos de Hantzsch e da AmB-D, nos tempos de 24, 48 e 72 horas de tratamento. O log das concentrações dos adutos de

Hantzsch correspondem a diluições entre 500 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. O log das concentrações da AmB-D correspondem a

diluição seriada entre 250 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. (p ˂ 0,05). Legenda:


52


em promastigota de L. infantum da cepa OP46

A figura 14 representa os valores do percentual da redução de viabilidade das

promastigotas de L. infantum cepa OP46, após o tratamento durante os tempos de 24, 48 e 72

horas, com os compostos químicos dos grupos das aldiminas e dos adutos de Hantzsch. As

concentrações testadas dos diferentes compostos de aldiminas e dos adutos de Hantzsch foram os

valores ≤IC50 (curva de titulação feita a partir do valor de IC50 determinado para cada composto -

Tabela1 - previamente estabelecidos no experimento anterior de citotoxicidade - item 5.1). Os

gráficos da figura 14 também apresentam os resultados obtidos da atividade leishmanicida em

promastigotas da AmB-D nas concentrações entre C3’: 250 µg/mL e C13: 0,390635 µg/mL. É

importante destacar que da mesma forma que o experimento anterior, para determinação da

atividade leishmanicida em promastigotas através do teste de MTT, a concentração de cada

droga foi testada em triplicata nas placas e cada experimento completo foi repetido por pelo

menos três vezes, em dias distintos.

A redução da viabilidade em formas promastigotas nos diferentes compostos testados

ocorreu logo em 24 horas de tratamento, entretanto, com valores de redução inferiores a 25% da

viabilidade das promastigotas de L. infantum. Já nos tempos subsequentes de acompanhamento

(48 e 72h) foi mais evidenciado o potencial leishmanicida dos compostos, principalmente no

tempo de 72 horas após o tratamento.

De maneira geral, em 48 horas do tratamento foi observado uma redução entre 25% e

50% da viabilidade das formas promastigotas em todos os compostos estudados.

Interessantemente, essa redução, na maioria dos compostos, foi observada em todos os pontos de

ALDIMINAS ADUTOS DE HANTZSCH

DROGA AmB-D 3I4 3I5 3H7 3H8 3H9 3D7 3G2 8A2 8A3 8A4 8B5 8B6

IC50[μg/mL](DH82)

100 20 15 85 45 40 10 20 >500 >500 170 >500 >500

IC50[μg/mL]

(J774.A1) 100 15 1,5 40 15 10 20 5 125 60 50 140 115

Tabela 1: Valores de IC50: Valores de Concentração Inibitória de 50% (IC50) para os macrófagos, nos tempos de

24, 48 e 72 horas de tratamento, de cada composto químico e da AmB-D.


53

diluição das concentrações testadas. Já para os compostos 3D7, 3H8 e 8B6, em 48 horas a

relação de diminuição da concentração das drogas com diminuição da atividade leishmanicida

foi mais evidenciado.

Já em 72 horas, foi possível observarmos valores de redução da viabilidade acima de

50%. No grupo das aldiminas, as drogas 3H8 e 3G2, após 72 horas mostraram um alto percentual

de morte dos parasitos, sendo de 64,52% na concentração mais alta da 3H8 e de 64,32% para o

composto 3G2.

Em relação ao grupo dos adutos de Hantzsch, pode-se observar que, mesmo estes

compostos não tendo demonstrado citotoxicidade aos macrófagos, a atividade leishmanicida

aumentou consideravelmente quando tratadas com os compostos 8B5 e 8B6, que após 72 horas

de tratamento, demonstraram um percentual de morte de 71,15% e 67,90%, respectivamente,

contra as formas promastigotas do parasito da cepa OP46 de L. infantum.

Em relação à AmB-D, foi possível evidenciar valores da atividade leishmanicida

próximos de 100%, nas concentrações mais altas empregadas em todos os 3 tempos avaliados.

Os resultados mostraram que os diferentes compostos de Aldiminas e dos Adutos de Hantzsch

apresentaram menor capacidade leishmanicida, empregando o teste de MTT em forma

promastigota do parasito, quando comparadas a atividade da AmB-D.


54

25

50

75

100

-1 0 1 2 3

25

50

75

100

-1 0 1 2 3 -1 0 1 2 3

Figura 14: Avaliação da atividade Leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em Promastigotas de L. infantum

OP46: Redução da viabilidade celular da forma promastigota de L. infantum (cepa OP46) em razão do log das concentrações das

drogas com o valor ≤ ao valor de IC50 descritos na tabela 1 para cada composto químico. As concentrações da AmB-D

correspondem a diluição entre 250 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. Resultados obtidos a partir de 24, 48 e 72 horas de tratamento.

(p ˂ 0,05). Legenda aldiminas: , adutos de

Hantzsch:

AL

DIM

INA

S

AD

UT

OS

DE

HA

NT

ZS

CH


55


em formas amastigotas de L. infantum

6.4.1 Método clássico: Microscopia ótica

Para avaliar a ação leishmanicida em amastigotas de L. infantum, dentro de

macrófagos caninos DH82, dos diferentes compostos químicos de aldiminas e adutos de

Hantzsch testadas, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, foi realizada a contagem em

microscópio óptico dos macrófagos infectados, do número de amastigotas e dos macrófagos não

infectados para compararmos o percentual de infecção nos macrófagos expostos aos compostos

químicos testados, com o percentual de infecção do grupo controle (macrófagos infectados com

a cepa OP46 de L. infantum em meio de cultura e não submetidos a nenhum tipo de tratamento)

bem como ao grupo com macrófagos infectados com a cepa OP46 de L. infantum expostos ao

tratamento com AmB-D.

Para isto, foram usadas as concentrações de IC50, previamente estabelecidas no

experimento inicial de citotoxicidade (ver tabela 1), para cada um dos diferentes compostos

químicos. Igualmente aos demais experimentos, este também foi repetido por três vezes e as

concentrações feitas em triplicatas.

Após a contagem das lâminas e análise dos resultados, foram obtidos os dados

demonstrados na figura 15 e 16, o qual, para cada composto químico testado, está representado

na parte superior das figuras 15 e 16: percentual de infecção dos macrófagos (porcentagem de

macrófagos infectados, do total de 300 macrófagos contados); e na parte inferior das figuras 15 e

16: razão do número de amastigotas internalizadas por macrófago infectado (número de

amastigotas/número de macrófagos infectados – OP46/DH82).

6.4.1.1 Atividade leishmanicida de aldiminas em macrófagos caninos (DH82) infectados

com L. infantum OP46

Nossos resultados do percentual de infecção dos macrófagos caninos DH82 pelas

formas amastigotas de L. infantum após 24 horas do tratamento com os compostos de Aldiminas

3I4 (41,33%); 3I5 (48,62%) e 3H8 (9,52%) demonstraram uma redução significativa (p<0,05)


56

quando comparados com o percentual de infecção do grupo controle (70,09%) (macrófagos

infectados com a cepa OP46 de L. infantum em meio de cultura e não submetidos a nenhum tipo

de tratamento) (figura 15). De forma interessante, o composto 3H9 apresentou menor percentual

de infecção (18,05%), estatisticamente significativo (p<0,05), quando comparado ao grupo

controle (70,09%) e ao percentual de infecção da AmB-D (63,11%).

Após o período de 48 horas de infecção e tratamento, o percentual de infecção teve

uma redução significativa (p<0,05) nos compostos 3H8 (5,26%), 3H9 (17,44%) e 3D7 (12,69%)

em relação ao controle (38,42%) e demonstraram uma taxa de infecção semelhante a da AmB-D

(5,69%).

No tempo de avaliação após 72 horas do tratamento, todos os compostos químicos do

grupo das aldiminas apresentaram redução significativa (p<0,05) no percentual de infecção (3I4:

41,45%; 3I5: 47,38%; 3G2: 38,16%) em relação ao grupo controle (73,72%). Importante

ressaltar que a redução do percentual de infecção nos compostos 3H8 e 3H9 foram ainda

maiores, 12,43% e 10,23%, respectivamente, demonstrando um resultado mais próximo ao

obtido no grupo tratado com AmB-D (3,52%).

Na figura 15, na parte inferior, temos os resultados referentes à razão do número de

amastigotas por macrófagos infectados. Não foi possível observamos diferenças significativas

(p<0,05) no tempo de 24 horas entre os diferentes compostos e os grupos controles. Após as 48

horas do tratamento os compostos químicos que tiveram redução significativa (p<0,05) no

número de amastigotas internalizadas foram: 3I4 (1,42), 3I5 (1,5), 3H9 (1,66) e 3G2 (1,19)

comparados ao grupo controle (2,17). O grupo controle da AmB-D apresentou valores médios

(da razão do número de amastigotas por macrófagos infectados) de 1,53, bem próximos aos

compostos acima [(3I4 (1,42), 3I5 (1,5), 3H9 (1,66)], entretanto, destacamos o comportamento

do composto 3G2 (1,19) que apresentou também uma redução significativa (p<0,05) em relação

ao grupo tratado com AmB-D(1,53). Já para o tempo de 72 horas de tratamento apenas o

composto 3H8 (0,43) apresentou redução significativa (p<0,05) no número de amastigotas

internalizadas em relação ao grupo controle (1,45).

Para os compostos de aldiminas 3H7 e 3D7 não foi possível obter três experimentos

diferentes, com contagem de 300 macrófagos, para o tempo de 72 horas (barras vermelhas).


57


% D

E IN

FE

CÇ

ÃO

O

P4

6/D

H82

0

20

40

60

80

100

a a

a a,b a

a a

a

Con

trol

e

Am

B3I

43I

53H

73H

83H

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73G

2

0

2

4

6

8

Con

trol

e

Am

B3I

43I

53H

73H

83H

93D

73G

2

a

Contr

ole

Am

B 3I4

3I5

3H7

3H8

3H9

3D7

3G2

a a a a

a a

a a

a

a

Figura 15: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L. infantum (OP46) por

microscopia óptica. Parte superior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 e tratados com aldiminas, nas concentrações

correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente estabelecidos, comparados ao grupo controle contendo somente

Leishamania, macrófgos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta). Analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte

inferior: Razão do número de amastigotas L. infantum OP46 internalizadas nos Macrófagos DH82 infectados, após 24, 48 e 72 horas de tratamento,

tratados com aldiminas, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente estabelecidos, comparados ao

grupo controle contendo somente Leishmania, macrófgos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta).


58

6.4.1.2 Atividade leishmanicida de adutos de Hantzsch em macrófagos caninos (DH82)

infectados com L. infantum OP46

Nossos resultados do percentual de infecção dos macrófagos caninos DH82 pelas

formas amastigotas de L. infantum após 48 horas e 72 horas do tratamento com os compostos de

adutos de Hantzsch demonstraram uma redução significativa (p<0,05) de todos os compostos

químicos (48h- 8A3: 18,54%; 8A4: 11,08%; 8B5: 24,81% e 8B6: 14,34%) (72h- 8A3: 20,54%;

8A4: 18,35%; 8B5: 29,60% e 8B6: 25,13%), com exceção do composto 8A2 (48h: 37,13%; 72h:

63,14%), em comparação ao grupo controle (48h: 38,42%; 72h: 73,72%) em ambos os tempos

(Figura 13). Não foi possível observamos diferenças significativas (p<0,05) no tempo de 24horas

entre os diferentes compostos e os grupos controles.

Na parte inferior da figura 16, estão os resultados obtidos da razão da contagem do

número de amastigotas internalizadas nos macrófagos infectados. Apenas a partir de 48 horas foi

possível observar a redução desta razão para todos os compostos químicos: 8A2 (1,61); 8A3

(1,75); 8A4 (1,90) e 8B6 (1,91); em relação ao controle (2,17) no mesmo tempo, com exceção do

composto 8B5 (1,95) que não apresentou diferença significativa. Não foi possível observamos

diferenças significativas (p<0,05) nos tempos de 24 horas e 72 horas entre os diferentes

compostos e os grupos controles em relação a razão da contagem do número de amastigotas

internalizadas nos macrófagos infectados


59

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Figura 16: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L.

infantum (OP46) por microscopia ópitica: Parte superior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 e tratados

com adutos de Hantzsch, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente

estabelecidos, comparados ao grupo controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo

tratado com AmB-D (barra preta), analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte inferior: Razão do número de amastigotas L. infantum

OP46 internalizadas nos Macrófagos DH82 infectados, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, tratados com adutos de Hantzsch, nas

concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente estabelecidos, comparados ao grupo

controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta).


60

6.5 Citometria de fluxo

Os resultados da análise por citometria de fluxo da avaliação do percentual de infecção

dos macrófagos com a Leishmania infantum OP46GFP expostos aos diferentes compostos

químicos (concentrações de IC50%), também foram avaliados nos tempos de 24, 48 e 72 após o

tratamento e comparados com os resultados obtidos nos grupos controle positivos (macrófagos

infectados com OP46GFP em meio de cultura e não submetidos a nenhum tipo de tratamento) e

no grupo controle AmB-D (macrófagos infectados com OP46GFP expostos ao tratamento com a

droga de referência AmB na concentração - 4µg/mL).

Com o intuito de corroborar e comparar os resultados obtidos no experimento

convencional feito por microscopia do número médio de amastigotas nos macrófagos infectados

foi traçada a estratégia de análise por citometria de fluxo da avaliação da média da intensidade

de fluorescência (MFI) dos macrófagos infectados com os parasitos de L.infantum GFP.

6.5.1 Atividade leishmanicida de aldiminas em macrófagos caninos (DH82) infectados

com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente (GFP)

Na figura 17 está demonstrado o percentual de infecção nos macrófagos DH82

tratados com os diferentes compostos químicos do grupo das aldiminas. Após 24 horas de

tratamento, somente o composto 3D7 foi capaz de promover uma redução significativa (p<0,05)

na porcentagem da infecção (20,80%) em relação ao grupo controle (32,35%). No entanto, após

as 48 horas do tratamento, pode-se observar uma redução significativa (p<0,05) na taxa de

infecção promovida por diferentes compostos: 3H7 (18,6%), 3H8 (19,45%) e 3D7 (4,86%) em

comparação ao grupo controle (33%), semelhantemente ao grupo controle AmB-D (11,15%) que

também foi capaz de promover uma redução no percentual de infecção. De forma satisfatória,

como ocorreu com o grupo controle AmB-D (11,85%), o composto 3H7 conseguiu manter uma

redução significativa (p<0,05) no percentual de infecção (24,7%) após as 72 horas de tratamento,

em comparação ao grupo controle (36,8%).

Os resultados da parte inferior da figura 17 trazem os achados do MFI dos macrófagos

infectados com L.infantum GFP nos diferentes compostos de aldiminas e tempos avaliados. Não

foi possível observar uma diferença significativa (p<0,05) na estratégia de análise por citometria

de fluxo da avaliação do MFI dos macrófagos infectados nos diferentes compostos de aldiminas,


61

nem no grupo AmB-D em relação ao grupo controle nos diferentes tempo estudados. Entretanto,

é possível observar uma tendência na diminuição do MFI nos macrófagos infectados em 24

horas de tratamento nos grupos AmB-D e 3H7, em 48h nos grupos AmB-D, 3H7 e 3H8, e em

72h no grupo AmB-D.


62


% D

E IN

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CÇ

ÃO

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40

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3H8

3H9

3D7

3G2

Figura 17: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L. infantum

(OP46 GFP) por Citometria de Fluxo: Parte superior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 GFP e

tratados com aldiminas, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, comparados ao grupo

controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta).

Analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte inferior: Intensidade Média de Fluorescência (MFI) Razão do número de amastigotas L.

infantum OP46GFP internalizadas nos Macrófagos DH82, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, tratados com aldiminas.


63

6.5.2 Atividade leishmanicida de adutos de Hantzsch em macrófagos caninos (DH82)

infectados com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente (GFP)

O resultado da infecção nos macrófagos DH82 com a L. infantum GFP e tratados com

os compostos químicos do grupo dos adutos de Hantzsch está representado na figura 18 Após 24

horas de tratamento, os compostos 8B5 (26,2%) e 8B6 (25,5%) foram capazes de promover uma

redução significativa (p<0,05) na porcentagem da infecção em relação ao grupo controle

(32,35%). Entretanto em 48 horas do tratamento foi observada uma redução significativa

(p<0,05) na taxa de infecção promovida pelos compostos 8A4 (22,65%) e 8B6 (19,5%) em

comparação ao grupo controle (33%), semelhantemente ao grupo controle AmB-D (11,15%). Já

em 72 horas do tratamento foi observada uma redução significativa (p<0,05) na taxa de infecção

promovida pelos compostos 8A2 (22,95%) e 8B6 (28,05%) em comparação ao grupo controle

(36,8%), semelhantemente ao grupo controle AmB-D (11,85%),. É importante destacar que o

composto 8B6 teve uma redução na taxa de infecção em todos os tempos de tratamento, 24, 48 e

72 horas (25,5%; 19,5% e 28,05%, respectivamente), quando comparado ao grupo controle,

respectivamente nos mesmos tempos (32,35%, 33% e 36,8%).

Os resultados da parte inferior da figura 18 trazem os demonstrados do MFI dos

macrófagos infectados com L.infantum GFP nos diferentes compostos de Adultos e tempos

avaliados. Mais uma vez não foi observar uma diferença significativa (p<0,05) na estratégia de

análise por citometria de fluxo da avaliação do MFI dos macrófagos infectados nos diferentes

compostos de Adutos, nem no grupo AmB-D em relação ao grupo controle nos diferentes tempo

estudados. Entretanto, também foi possível observar uma tendência na diminuição do MFI nos

macrófagos infectados em 24 horas de tratamento nos grupos 8A4, 8B5 e 8B6, em 48h nos

grupos 8A4, e em 72h nos grupos 8A2 e 8B6.


64


% D

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48B

58B

6

Figura 18: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L.

infantum (OP46 GFP) por Citometria de Fluxo: Parte supeior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 GFP

e tratados com adutos de Hantzsch, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, comparados ao

grupo controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra

preta), analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte inferior: Intensidade Média de Fluorescência (MFI) Razão do número de

amastigotas L. infantum OP46GFP internalizadas nos Macrófagos DH82, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, tratados com

adutos de Hantzsch.

7 DISCUSSÃO

Salomão, N.E.O. Discussão

66

Em termos globais a leishmaniose é a terceira mais importante doença transmitida por

insetos hematófagos vetores, depois da malária e filariose (Reithinger & Davies 2002) e está

entre as seis maiores endemias mundiais (WHO, 2010). A leishmaniose visceral é uma das

doenças mais negligenciadas no mundo, que afeta principalmente os países menos

desenvolvidos, sendo que 59.000 pessoas morrem anualmente de LV, dentre as quais 35.000 são

homens e 24.000 mulheres, e mesmo com os avanços científicos relacionados ao diagnóstico,

tratamento e prevenção ocorridos nos últimos 10 anos, mostra taxas de morbimortalidade com

preocupante tendência ao crescimento (WHO 2010).

Um problema atual que tem agravado a situação da LV no mundo está associado ao

grande número de pacientes não responsivos a quimioterapia convencional com antimoniais,

sugerindo o aparecimento de cepas resistentes do parasito (Croft et al., 2006). Por estes motivos,

há uma variação regional na resposta ao tratamento em pacientes com LV, e as recomendações

no uso de medicamentos e esquemas terapêuticos, podem variar nas diferentes regiões do globo

acometidas por esta doença (Chakravarty et al., 2010). Estes e outros problemas enfrentados no

tratamento da LV têm levado pesquisadores a buscar por novos fármacos, bem como novas

estratégias de tratamento para a doença (terapias combinadas, imunoterapia e

imunoquimioterapia).

Outro grande problema é que a doença tem sido verificada como infecção oportunista

em pacientes com AIDS, semelhante ao que se observa no sul da Europa, onde cerca de 70% dos

casos de leishmaniose visceral em adultos estão associados com a infecção pelo vírus HIV. De

2001 a 2005 foram notificados 16.210 casos de LV no Brasil, sendo que, dentre estes casos, 315

(2%) apresentaram co-infecção com HIV (Elkhoury et al., 2007). Estima-se que a infecção

HIV/L. infantum aumenta o risco em 100 a 2.320 vezes de se desenvolver uma LV grave (MS,

2006).

Para agravar esses problemas de coinfecções e de resistência do parasito aos fármacos,

o tratamento da LV é baseado no uso dos fármacos de escolha (antimoniato de meglumina e

anfotericina) que apresentam elevada toxicidade, com diversos efeitos adversos, com difícil

administração (necessidade de internação), isso tudo faz com que os pacientes não tenham uma

adequada adesão ao tratamento, com altos índices de abandono ao protocolo terapêutico, além

disso, os efeitos adversos são mais fortes em crianças e se agravam em pacientes idosos, com

interações medicamentosas com outros medicamentos que esses já fazem uso (Sundar, 2001;

Oliveira et al., 2004; Thakur & Narayan, 2004; MS, 2013)


67

Uma das grandes limitações no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento

da leishmaniose visceral são as metodologias empregadas para o rastreamento e a seleção de

potenciais compostos nos ensaios pré-clínicos in vitro. Apesar da realização do teste in vitro ser

indispensável, estes apresentam variações consideráveis na maneira em que a citotoxicidade e o

potencial de ação/atividade das drogas são mensuradas (Feigal, et al., 1985; Nwaka & Hudson,

2006). A falta de padronização e consenso entre a melhor metodologia a ser empregada, além da

falta de reprodutibilidade dos resultados obtidos entre os grupos de pesquisas (Carrió et al., 2000;

Dey et al., 2002; Maia et al., 2013;) corroboraram para que nas últimas décadas tenham se

descoberto poucos fármacos com ação leishmanicida que apresentasse baixa citotoxicidade e alta

eficácia e que pudessem ser empregados na substituição dos tratamentos convencionais

(antimoniato de meglumina e a anfotericina).

Contudo os testes in vitro representam um passo importante e fundamental para testar

novos compostos e fármacos para o uso humano. Os estudos in vitro são realizados para avaliar

principalmente a toxicidade ou dano celular, a genotoxicidade (dano ao DNA) e a viabilidade

celular. Em comparação aos experimentos in vivo, estes testes apresentam vantagens como baixo

custo, condições experimentais controladas, rapidez na obtenção de resultados e não precisa de

aprovação de comitê de ética (Croft, et al., 2006). Os testes in vitro são métodos que podem

substituir e diminuir o uso de animais na experimentação, usando o principio dos 3Rs elaborados

por William Russel e Rex Burch, em 1959, que consiste em: refinamento (refinement), redução

(reduction) e substituição (replacement), visando a diminuição da quantidade de animais em

pesquisas e no desenvolvimento de sistemas experimentais que reproduzam as condições dos

organismos, dispensando modelos vivos (Petroianu, 1996). Por isso, o ideal é a identificação

primária utilizando um método in vitro eficiente para posterior avaliação in vivo.

Nesse sentido, nosso estudo buscou avaliar o potencial leishmanicida in vitro de

diferentes compostos derivados de aldiminas e de adutos de Hantzsch em um modelo

experimental empregando macrófagos imortalizados para estudarmos a citotoxicidade, bem

como ação leishmanicida em formas promastigotas e amastigotas do parasito de L. infantum.

Para isto, um estudo em paralelo entre o ensaio do MTT, convencionalmente empregado em

testes de drogas e a citometria de fluxo. A seguir serão discutidos os resultados obtidos neste

estudo principalmente sob os aspectos da eficácia terapêutica in vitro.

Inicialmente, foram realizados os experimentos de testes de drogas in vitro

empregando o modelo de culturas secundárias de macrófagos, células que foram transformadas


68

ou originadas de tumor como modelo para a resposta celular, e que são empregadas na grande

maioria dos testes de drogas in vitro (Feigal, et al., 1985). Este modelo utilizando células

imortalizadas parece ser mais útil, pois é menos demorado e menos dispendioso em relação às

culturas primárias para obtenção dos macrófagos, tais como os originados do peritônio de

camundongos. Além disso, oferece as vantagens de proporcionar uma fonte ilimitada de células

hospedeiras homogêneas, adequadas para um teste de drogas in vitro que assegure a

reprodutibilidade dos resultados e tolere doses elevadas de fármacos testados, principalmente os

de primeira escolha para o tratamento da leishmaniose visceral (Maia et al., 2007).

Em nossa primeira abordagem investigativa, todos os 12 compostos pertencentes à

classe de aldiminas (7 compostos: 3I4, 3I5, 3H7, 3H8, 3H9, 3D7 e 3G2) e de adultos de

Hantzsch (5 compostos: 8A2, 8A3, 8A4, 8B5, 8B6) foram submetidos a avaliação de

citotoxicidade, pelo método colorimétrico de MTT, com construção de uma curva de diluição em

várias concentrações dos compostos e incubação por 24, 48 e 72 horas, com culturas secundárias

de macrófagos imortalizados (duas linhagens: canina DH82 e murina J774.A1), com intuito de

obtermos os valores de IC50 para cada um dos compostos testados. A utilização de testes in vitro,

por meio de ensaios de viabilidade celular, constitui o primeiro passo para a avaliação da

compatibilidade biológica de uma substância, além de que, estes estudos permitem predizer a

toxicidade, através do calculo do IC50, em modelos experimentais in vivo com a utilização de

micro-organismos como bactérias, fungos, enzimas, proteínas, culturas celulares, entre outras

(Rogero et al., 2003).

Interessantemente, de maneira geral nossos resultados mostraram nos compostos de

aldiminas e adutos de Hantzsch um perfil de citotoxicidade maior nas culturas secundárias de

macrófagos murinos J774.A1 do que nas culturas com os macrófagos caninos DH82, ou seja,

observamos menores valores de IC50, para cada droga ao longo dos tempos 24, 48, 72 h, para

macrófagos murinos J774.A1 do que para os caninos DH82. Esses resultados demonstram a

importância da realização dos experimentos para determinação de IC50 específico nas células que

serão empregadas nos ensaios subsequentes de testes de drogas.

De maneira geral, os compostos de aldiminas apresentaram uma maior citotoxicidade

ao longo dos tempos avaliados (compostos: 3I4, 3I5, 3H8, 3H9, 3D7 e 3G2). Podemos destacar o

composto derivado de aldiminas 3H7 (80 µg/ml) como menos tóxica, pois apresentou um maior

valor de concentração de IC50 em relação aos demais compostos deste grupo, com valor próximo

ao observado para a Anfotericina (100 µg/mL) pelo ensaio de MTT. Mediante esses resultados e


69

tomando como base o valor de IC50 obtido para o grupo controle Anfotericina B, podemos

considerar que os compostos de aldiminas foram muito tóxicos, apresentando valores de IC50

muito abaixo do esperado.

Diferentemente das aldiminas em que quase todos os compostos testados apresentaram

elevada citotoxicidade, no gurpo dos adutos de Hantzsch, foi observada uma baixa citotoxicidade

para todos os compostos ao longo dos tempos avaliados, com valores de IC50 acima da

concentração máxima de 500 µg/mL (primeiro ponto da curva de IC50) testadas nos tempos de

24, 48 e 72 após o tratamento, em macrófagos caninos DH82. Desta forma, para estas células, os

compostos químicos dos adutos de Hantzsch apresentaram um comportamento na curva de

citotoxicidade bem melhor que o grupo controle Anfotericina (AmB-D - IC50: 100 µg/mL). Já

nos macrófagos murinos J774.A1, somente nas concentrações mais altas, foi que os adutos de

Hantzsch demonstraram uma citotoxicidade considerável. Em macrófagos murinos o range

encontrado do IC50 foi entre 50-140 µg/mL, sendo o composto 8A4 (IC50: 50µg/mL) o mais

tóxico e o composto 8B5 (IC50: 140µg/mL) o menos tóxico.

Reimão e colaboradores (2010) avaliaram diferentes compostos derivados de 1,4

dihidropiridinas (obtidos através de Reações Multicomponentes de Hantzsch) e demonstraram

possuir ação Trypanosomatidea (T. cruzi e em diferentes espécies de Leishmania sp), além de

citotoxicidade aceitável in vitro, através de experimentos empregando o ensaio de MTT em

culturas secundárias de células de rim de macacos Rhesus (LLC-MK2) por 48 horas, com uma

variação do IC50% entre 33.48–588.73 µM. O composto pentamidina apresentou valor de

IC50% de 25,61 µM, sendo a maior citotoxicidade dentre os outros derivados das 1,4

dihidropiridinas testados. Esses achados corroboram com os nossos de citotoxicidade

demonstrando uma baixa/aceitável citotoxicidade dos compostos de Hantzsch através do ensaio

de MTT.

As possibilidades de fármacos obtidos de extrato natural ou composto sintético são

praticamente ilimitadas e qualquer um desses produtos pode ser candidato a fármaco para o

tratamento de uma doença. Em vista dessa vasta gama de candidatos, a triagem inicial requer

testes que sejam simples de manipular, reprodutíveis, fácil de quantificar (Sereno et al., 2007).

Nesse sentido, para verificação da citotoxicidade e “screening” de novas moléculas

farmacologicamente ativas (com ação direta contra protozoários) diferentes metodologias têm

sido empregadas: MTT, MABA, ODC, Vermelho Neutro, Citometria de Fluxo (fluoróforos

naturais - IP e 7-AAD).


70

Com os avanços da citometria de fluxo vários marcadores fluorescentes vêm sendo

desenvolvidos para os mais diversos estudos biológicos (Fouchet et al., 1993; Azas et al.,1997).

Alguns fluoróforos naturais, como o iodeto de propídio (IP) e o 7-amino-actinomicina D (7-

AAD), são os principais marcadores utilizados em testes de drogas contra Leishmania quando

realizados por esta tecnologia (Sereno et al., 2005, Rathelot et al., 2002). Estes compostos

fluorescentes ligam-se ao DNA das células intercalando-se inespecificamente entre as bases e

não atravessam a membrana celular por serem lipossolúveis. Portanto, quando isso ocorre é

indício de perda do potencial de membrana e assim da viabilidade celular.

A triagem inicial de compostos candidatos a drogas anti-Leishmania, de maneira

clássica, utiliza as formas promastigotas do parasito, devido à simplicidade e baixo custo do

cultivo durante os testes (Fumarola et al., 2004). Nesse sentido, nossa segunda abordagem

investigativa, uma vez determinado o valor de IC50 para cada um dos compostos estudados, foi

avaliar a eficácia terapêutica in vitro através da verificação do potencial leishmanicida em

formas promastigotas de L. infantum (cepa OP46) das drogas durante os tempos de tratamento de

24, 48 e 72 horas, através do ensaio de MTT.

A redução da viabilidade em formas promastigotas nos diferentes compostos testados

ocorreu logo em 24 horas de tratamento, entretanto, com valores de redução inferiores a 25% da

viabilidade das promastigotas de L. infantum. Já nos tempos subsequentes de acompanhamento

(48 e 72h) foi mais evidenciado o potencial leishmanicida dos compostos, principalmente no

tempo de 72 horas após o tratamento. Nos diversos trabalhos de testes de drogas contra

Leishmania sp não há um consenso sobre o quanto tempo ideal para avaliar o tratamento in vitro:

por 24 horas, 48 horas (Reimão et al., 2010; Maia et al., 2013) ou 72 horas (Rathelot et al., 2002;

Tasdemir et al., 2006; Palit & Ali, 2008). Neste estudo, o que se observa de maneira geral, em

48 horas após tratamento é uma redução entre 25% e 50% da viabilidade das formas

promastigotas em todos os compostos estudados. Se pensarmos que o valor de IC50 nos

macrófagos foi o primeiro ponto da curva sigmoide de dose-resposta construída para avaliação

da atividade leishmanicida em promastigotas, e que observamos resultados de valores de

percentual de inibição das promastigotas próximos ou igual a 50%, para as diferentes drogas,

temos um baixo índice de seletividade, ou seja, baixa ou nenhuma ação leishmanicida em 24 e

48 horas de tratamento (IC50 em células de mamíferos semelhante ao IC50 nas formas

promastigotas). O que nos chamou atenção, de forma interessantemente, é que o percentual de

redução das formas promastigotas, de maneira geral na maioria dos compostos, foi observado em


71

todos os pontos de diluição das concentrações testadas. Esse comportamento, diminuição da

concentração (<IC50) com permanência da redução da viabilidade em formas promastigotas, nos

evidencia um potencial leishmanicida em formas promastigotas dos compostos testados.

Já em 72 horas, foi possível observarmos valores de redução da viabilidade acima de

50%. No grupo das aldiminas, os compostos 3H8 (64,52%) e 3G2 (64,32%), e no grupo dos

adutos de Hantzsch, os compostos 8B5 (71,15%) e 8B6 (67,90%), após 72 horas mostraram um

alto percentual de morte contra as formas promastigotas do parasito da cepa OP46 de L.

infantum. Nossos resultados corroboram com outros ensaios in vitro que encontraram ação

leishmanicida de diferentes formulações de aldiminas e adutos de Hantzsch em promastigotas de

Leishmania (Palit & Ali, 2008; Al-Kahraman et al., 2010; Remião et al., 2010). Já Al-Kahraman

e colaboradores, em 2010, testaram uma série de compostos químicos de azometinas (que são

sintetizados a partir de reações de aminas aromáticas primárias) quanto as suas propriedades

leishmanicida in vitro e demonstraram inibição do crescimento do parasito com ação altamente

potente em relação às promastigotas de L. major. Palit & Ali, em 2008, testando 1,4-di-

hidropiridinas (amlodipina e lacidipina) demonstraram ser capaz de matar in vitro promastigotas

de L. donovani após 72 horas de tratamento. Já Reimão e colaboradores, 2010, demonstraram

que diferentes compostos testados de 1,4-di-hidropiridinas foram eficazes contra as formas

promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.)

major e Leishmania (L.) chagasi, bem como em forma amastigota de L. (L.) chagasi.

Diferente desse comportamento tardio de ação (72 horas) nas formas promastigotas

encontradas em alguns compostos das aldiminas e dos adutos de Hantzsch, na anfotericina

(AmB-D) foi possível evidenciar valores da atividade leishmanicida (próximos de 100%) em

todos os 3 tempos avaliados (24, 48 e 72 horas). Vale ressaltar que a AmB-D é a droga mais

potente anti-Leishmania disponível, com efeito demonstrado tanto in vitro quanto in vivo na

destruição de parasitos do gênero Leishmania tanto na forma promastigota quanto amastigota

(Thakur et al., 1994). Nossos resultados mostram claramente a importância de um maior tempo

de acompanhamento da ação dos fármacos (até 72 horas) para confirmação do real potencial

leishmanicida em formas promastigotas de diferentes drogas em testes in vitro (Tasdemir et al.,

2006; Palit & Ali, 2008; Sesana, 2009).

A maioria dos testes de drogas relatados na literatura quando não utilizam apenas a

avaliação sobre as formas promastigotas (Chan et al., 2003), empregam formas amastigotas

axênicas, cultivadas in vitro para avaliação da atividade leishmanicida in vitro (Shimony & Jaffe,


72

2008). Estes dois modelos de “screening” in vitro são válidos, mas não representam a forma do

parasito encontrada no hospedeiro vertebrado (amastigotas internalizadas em macrófagos).

Nesse sentido, nossa terceira abordagem investigativa contou com duas metodologias

(convencional por microscopia ótica e por citometria de fluxo) para a avaliação da eficácia

terapêuticas in vitro das drogas em formas amastigotas do parasito dentro de macrófagos. No

primeiro momento, discutiremos os resultados envolvendo a análises convencionais por

microscopia óptica.

Após 24 horas do tratamento, nossos resultados da análise por microscopia óptica

demonstraram uma redução no percentual de infecção nos macrófagos caninos DH82, com os

compostos de aldiminas 3I4, 3I5, 3H8 e 3H9, demonstrando “precocemente” um potencial

leishmanicida contra as formas amastigotas de L. infantum. De forma diferente, nenhum dos

compostos de adultos de Hantzsch testados e nem o grupo AmB-D apresentou redução no

percentual de infecção nas 24 horas de tratamento, demonstrando mais uma vez a importância de

ao desenharmos o delineamento experimental de avaliações de novos compostos com potencial

leishmanicida, para as diferentes condições e novas estratégias de experimentação, não devemos

escolher apenas um único tempo de avaliação.

Após o período de 48 horas de infecção e tratamento, observamos uma redução no

percentual de infecção nos compostos de aldiminas 3H8, 3H9 e 3D7 semelhante a redução

promovida pela AmB-D. No tempo de avaliação após 72 horas do tratamento, todos os

compostos químicos do grupo das Aldiminas apresentaram redução no percentual de infecção,

sendo importante destacar que a redução nos compostos 3H8 e 3H9 foram os maiores, com

resultados mais próximos ao obtido no grupo tratado com AmB-D. Nossos resultados

corroboram com os achados de Rathelot e colaboradores (2002) que também observaram através

de análises por microscopia optica a atividade leishmanicida in vitro em diferentes compostos

químicos derivados de azometinas, em macrófagos humanos imortalizados (THP-1) infectados

com L. infantum, após um período de 96 horas de tratamento.

Na avaliação do tratamento por microscopia óptica, todos os compostos de adultos de

Hantzsch (com exceção do composto 8A2) demonstraram reduzir a infecção nos macrófagos

caninos DH82, das formas amastigotas de L. infantum, após 48 horas e 72 horas. Palit e Ali, em

2008, também observaram após 48 horas de tratamento com 1,4-di-hidropiridinas (amlodipina e

lacidipina) uma inibição da infecção in vitro (bem como in vivo) em macrófagos peritoneais de

camundongos BALB/c infectados com promastigotas de L. donovani. Um perfil mais tardio de


73

ação dos compostos de adultos de Hantzsch também foi evidenciado por Reimão e

colaboradores, 2010, que demonstraram em diferentes compostos testados de 1,4-di-

hidropiridinas a sua eficácia contra as formas amastigota de L. (L.) chagasi em macrófagos

peritoneais, após 120 horas (5 dias) do tratamento e análise por microscopia óptica.

De maneira geral, nossos resultados da diminuição da “carga parasitária de

amastigotas dentro dos macrófagos” (referentes à razão do número de amastigotas por

macrófagos infectados) foi mais bem evidenciado no tempo após as 48 horas de tratamento em

quase todos os compostos testados de Adultos de Hantzsch (exceção para o composto 8B5) bem

como para a maioria das aldiminas (3I4, 3I5, 3H9 e 3G2), interessantemente, com valores

próximos da redução do grupo controle de AmB-D. Destacamos o comportamento do composto

de aldimina 3G2 que apresentou também uma redução em relação ao grupo tratado com AmB-

D. Esses resultados associados aos de redução no número de macrófagos infectados corroboram

entre si e intensificam a hipótese de que as aldiminas e adutos de Hantzsch tem ação

leishmanicida em formas amastigotas do parasito de L.infantum.

É importante ressaltar que para alguns compostos de aldiminas (3H7 e 3D7) não foi

possível obter três experimentos diferentes (com contagem de 300 macrófagos) para o tempo de

72 horas. Isso se deve as dificuldades operacionais da metodologia convencionalmente

empregada para avaliação e obtenção dos resultados dos testes de drogas in vitro. A contagem

manual das células em lâminas pela microscopia óptica é muito trabalhosa e demanda muito

tempo da obtenção do material pronto até a análise dos resultados. Durante o procedimento,

muitas vezes as células podem ser comprometidas ou perdidas, seja no momento da lavagem das

placas com o intuito de retirada das formas promastigotas que não infectaram os macrófagos, ou

no momento da coloração (emersão das lâminas nos corantes, tempo de fixação, corante velho,

etc). Trata-se de uma técnica que demanda muito tempo, trabalho e treinamento. Uma analise

importante que deve ser levada em consideração nas padronizações são a capacidade de volume

da placa, razão/proporção da quantidade de macrófagos e Leishmania, número de células que se

pretende contar ao microscópio óptico, o possível crescimento das células de culturas

secundárias no decorrer dos tempos de tratamento - podendo formar grumos ou rompimento das

mesmas - inviabilizando a contagem de um número celular ótimo e dificultando a

reprodutibilidade da técnica. Outro fator que deve ser levado em consideração é o tempo de

contagem das lâminas, que dependendo do número de compostos a serem testados e tempos de

avaliação, serão gerados um volume muito grande de lâminas podendo exigir que a contagem


74

seja feita por mais de uma pessoa, o que pode gerar um viés do observador/contador, devido ao

fator humano inserido na contagem das células, diretamente relacionado à experiência e treino

do contador (Sanches et al., 2007).

Ainda na terceira etapa das abordagens investigativa do estudo para a avaliação da

eficácia terapêuticas in vitro das drogas, em formas amastigotas do parasito, foi empregada como

ferramenta metodológica a citometria de fluxo. Para possibilitar a avaliação pela citometria de

fluxo, as promastigotas de L. infantum da cepa OP46 foram transfectadas com o gene repórter

para GFP. O intuito da produção da Leishmania infantum GFP e seu emprego na avaliação dos

testes de droga in vitro através da citometria de fluxo se faz necessário devido à carência de

testes mais rápidos e sensíveis que ajudaria na identificação de novos fármacos leishmanicidas.

Através da detecção do fenótipo de tais genes repórteres é possível detectar o parasito

indiretamente através da medida da fluorescência emitida em um aparelho (como o citômetro de

fluxo), o que removeria o sistema manual de análise (como convencionalmente é feita por

microscopia óptica), aumentando a sensibilidade, confiabilidade, reprodutibilidade e

conveniência, além de possibilitar a triagem em larga escala de novas drogas (Sereno et al.,

2007). Desta forma, a citometria de fluxo simplifica a etapa de triagem de drogas, possibilitando

a investigação da ação de drogas sobre as formas amastigotas de diferentes espécies de

Leishmania no interior dos macrófagos, além de ser facilmente reproduzível para descrever os

efeitos das drogas sobre os parasitos (Plock et al., 2001). A utilização de parasitos fluorescentes

(transfectados com GFP) associados à técnica de citometria de fluxo impulsiona o

desenvolvimento de testes de drogas mais rápidos e viáveis, tanto para drogas já conhecidas

como para novas moléculas e diferentes compostos químicos contra parasitos (Dube A & Gupta

R, 2009).

A proteína GFP que foi transfectada não possui atividade endógena e é auto

fluorescente em Leishmania, não necessitando de substrato, podendo ser facilmente detectada em

um fluorímetro ou citômetro de fluxo (Fouchet et al., 1993) e os parasitos mutantes não alteram

suas características morfológicas básicas (Chalfie, 1995; Rocha, 2009). Neste trabalho foi

demonstrado que a transfecção permitiu separar com sucesso a população de Leishmania

infantum cepa OP46GFP da população normal de Leishmania infantum cepa OP46. O forte sinal

da intensidade de fluorescência verde emitida pelos parasitos permitiu a análise pela citometria

de fluxo com separação completa entre a população transfectada (GFP) e a normal. Nossos

resultados demonstram que a transfecção não alterou o tamanho e a granulosidade dos parasitos


75

(gráficos FSC x SSC), bem como o perfil de crescimento e divisão celular (curva de crescimento

– dado não mostrado). Apesar de não termos avaliado se a transfecção do gene repórter para o

GFP promoveu alguma diferença na susceptibilidade a medicamentos, Rocha (2009) demonstrou

em um teste de droga in vitro empregando Glucantime e Anfotericina B, que a transfecção em

diferentes espécies de Leishmania não promoveu susceptibilidade as drogas, sendo semelhante

entre as espécies de Leishmania transfectadas (GFP) e seus respectivos controles não

transfectados.

Na avaliação por citometria de fluxo do percentual de infecção nos macrófagos

notamos uma maior ação dos diferentes compostos de Aldiminas no tempo de 48 horas do

tratamento, seja com uma maior redução na taxa de infecção dos macrófagos, seja no maior

número de compostos com atividade leishmanicida: aldiminas (3H7, 3H8, 3D7). Contudo,

também foi observada uma redução no percentual de infecção em 24 horas com o composto 3D7

e manutenção da redução em 72 horas pelo composto derivado de aldimina 3H7. Já na avaliação

por citometria de fluxo do tratamento in vitro com os diferentes compostos de adutos de

Hantzsch, destaca-se o composto 8B6 que apresentou e manteve uma diminuição no percentual

de infecção dos macrófagos em todos os tempos de tratamento, 24, 48 e 72 horas. Também foi

possível evidenciarmos redução promovida pela formulação do Aduto de Hantzsch em 24 horas,

além dos compostos 8A4 em 48 horas e 8A2 em 72 horas. Esses resultados obtidos confirmam o

potencial leishmanicida dos diferentes compostos de aldiminas e adultos de Hantzsch testados,

corroborando com nossos resultados de microscopia optica, bem como de outros trabalhos na

literatura (Rathelot et al., 2002; Palit & Ali, 2008; Reimão et al., 2010; Al-Kahraman et al.,

2010).

Não conseguimos obter resultados satisfatórios na estratégia de análise por citometria

de fluxo da avaliação do MFI dos macrófagos infectados com L.infantum cepa OP46 GFP nos

diferentes compostos de aldiminas e adultos nos diferentes tempos avaliados. De maneira geral

foi possível observar uma tendência de diminuição do MFI (dos macrófagos infectados) naquelas

drogas onde foi possível observar uma redução no número de macrófagos infectados. Nós

achamos que alterando a estratégia de análise dos dados da MFI, através de uma análise

específica do MFI dentro das subpopulações (high e low) de macrófagos infectados

(fluorescentes FL1- GFP) poderemos encontrar diferenças significativas entre os grupos nos

diferentes tempos.


76

Ao fazermos uma avaliação comparativa dos resultados entre as duas metodologias

empregadas para avaliação da atividade leishmanicida in vitro dos compostos contra formas

amastigotas do parasito internalizada em macrófagos, observamos algumas similaridade dos

resultados nas duas técnicas. Nossos resultados por citometria de fluxo demonstraram após 24

horas de tratamento que o grupo controle anfotericina (AmB-D) não foi capaz de promover uma

redução na porcentagem de macrófagos infectados, corroborando com nossos achados por

microscopia óptica, onde também não evidenciamos uma redução em 24 horas do tratamento

com a anfotericina AmB-D). Nesse sentido, em 48 horas de tratamento foi observada nas duas

metodologias uma redução do percentual de infecção para os compostos de aldiminas (3H8 e

3D7) e para os compostos de adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6), sendo em 72 horas também

observado a mesma redução para o composto de adutos de Hantzsch (8B6) entre as

metodologias.

A diferença dos resultados encontrados entre a microscopia convencional e a

citometria de fluxo estão diretamente relacionados às vantagens da técnica de citometria. Estudos

demonstraram que a citometria de fluxo melhora e simplifica o procedimento de triagem de

drogas (Plock et al., 2001), com maior rapidez e sensibilidade, permite a contagem mais rápida

de um número muito superior de células (centenas até milhares de células por segundo) quando

comparada à contagem em microscopia. Apesar do preparo do material/experimento da

citometria de fluxo ter um trabalho semelhante ao da microscopia, não exige que as células

sejam fixadas e coradas em lâminas, sendo a contagem feita em tubos que são retirados após os

tempos de tratamento determinados, lavados e levados direto para a leitura em citômetro de

fluxo. Uma grande vantagem é que independente do número de amostras testadas, a leitura

completa é feita no mesmo dia, após cada tempo de tratamento e os resultados são obtidos e

analisados de maneira rápida e dinâmica. É possível observar que a técnica fornece quantificação

mais exata e taxas de infecção mais precisas do que os resultados obtidos por microscopia

convencional (Azas et al.,1997; Di Giorgio, C. et al., 2000).

Uma dinâmica interessante na busca de novas drogas é o aproveitamento máximo de

uma molécula. Com esta finalidade, profissionais químicos trabalham em alterações estruturais

das moléculas na busca da melhor condição de solubilidade e potencial atividade contra

determinado microorganismo. As mais diversas mudanças podem ser realizadas como a troca de

radicais, mudança na polaridade, substituição, inserção ou deleção de uma estrutura. Com este

objetivo, as moléculas testadas neste trabalho sofreram modificações no intuito de melhorar a


77

atividade leishmanicida das mesmas. Após o teste de susceptibilidade das 12 moléculas

derivadas de aldiminas e adultos de Hantzsch verificamos que, principalmente, devido a

similaridade dos resultados em amastigotas na técnica de microscopia e citometria de fluxo, 4

delas (3H8, 3D7, 8A4 e 8B6) mostraram uma atividade leishmanicida comparadas a

Anfotericina uma das drogas de referência. Ao buscarmos drogas com ação em formas

amastigotas quanto em promastigotas do parasito de L.infantum podemos destacar o composto de

aldimina 3H8 e de adultos de Hantzsch 8B6 que apresentaram excelentes de redução da

atividade em ambas as formas do parasito.

Nossos resultados in vitro demonstram à baixa citotoxicidade e satisfatória atividade

leishmanicida tanto em promastigotas quanto em amastigotas de L. infantum, principalmente dos

compostos de aldiminas (3H8 e 3D7) e adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) testados. Nosso

conjunto de dados sugere que os compostos aqui testados possuem ação leishmanicida in vitro e

merecem ser considerados como candidatos para prosseguirem em estudos de quimioterapia

experimental in vivo para leishmaniose visceral. Acreditamos que os resultados gerados no

estudo abrem novas perspectivas para o avanço no desenvolvimento de novos fármacos para

leishmaniose visceral e tegumentar empregando as aldiminas e os adutos de Hantzsch, além do

desenvolvimento através da citometria de fluxo de metodologias in vitro mais acuradas e

dinâmicas para o reconhecimento de potencias drogas anti-Leishmania, e posterior

direcionamento para a quimioterapia experimental in vivo.

8 CONCLUSÃO

Salomão, N.E.O. Conclusão

79

O conjunto de dados obtidos neste estdo que realizou a avaliação in vitro do potencial

leishmanicida dos compostos sintéticos derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch, através da

avaliação da citotoxicidade em macrófagos murino da linhagem (J774.A1) e macrófagos canino

da linhagem (DH82) pelo ensaio de MTT e da avaliação em formas promastigotas (ensaio de

MTT) e amastigotas de L. infantum da cepa OP46 e OP46GFP, por microscopia óptica e por

citometria de fluxo, respectivamente, nos permitiu estabelecer a seguinte conclusão:

Se levarmos em conta a similaridade encontrada nos resultados de microscopia óptica

e citometria de fluxo, na ação dos compostos contra as formas amastigotas de L. infantum, os

compostos 3H8 e 3D7 (aldiminas) 8A4 e 8B6 (adutos de Hantzsch) seriam selecionados para

continuação dos experimentos in vivo. Dentre estes compostos podemos destacar o 8B6 que foi

capaz de promover e manter a redução no percentual de infecção de macrófagos ao longo dos

três tempos de tratamento avaliados (24, 48 até 72 horas) pela técnica de citometria de fluxo.

9 PERSPECTIVAS

Salomão, N.E.O. Perspectivas

81

A partir da realização deste trabalho foi possível obter resultados promissores no

âmbito dos estudos in vitro de testes de drogas, utilizando compostos sintéticos para avaliação da

ação leishmanicida em formas promastigotas e amastigotas de L. infantum, com diferentes

técnicas. Avaliamos a ação dos compostos sintéticos derivados de Aldiminas e Adutos de

Hantzsch e os resultados obtidos nos permitem agregar novas perspectivas que contribuirão para

ampliar os conhecimentos no campo de testes de drogas in vitro. Nesse sentido, a continuidade

desse trabalho tem como principais perspectivas:

✓ Avaliar o potencial leishmanicida in vitro a partir da associação entre os compostos químicos

de Aldiminas (3H8 e 3D7) e Adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) que apresentaram melhor

potencial leishmanicida;

✓ Avaliar a ação leishmanicida dos compostos derivados de Aldiminas e Adutos de Hantzsch

nas formas amastigotas fluorescentes de L. infantum da cepa OP46, transfectadas com o gene

repórter RFP, por citometria de fluxo;

✓ Prosseguir com experimentos de testes de drogas in vivo no modelo hamster, com os

compostos químicos de Aldiminas (3H8 e 3D7) e Adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) que

apresentaram melhor potencial leishmanicida;

✓ Avaliar a susceptibilidade e o potencial leishmanicida dos compostos químicos de Aldiminas

(3H8 e 3D7) e Adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) que apresentaram melhor potencial

leishmanicida em diferentes espécies de Leishmania (L. braziliensis, L. guyanensis,

L.amazonensis) causadoras da leishmaniose tegumentar americana.

10 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Salomão, N.E.O. Referência Bibliográfica

83

AL-KAHRAMAN, Y. M.; MADKOUR, H. M.; ALI, D. & YASINZAI, M. (2010). Antileishmanial,

antimicrobial and antifungal activities of some new aryl azomethines. Molecules, v.15(2), p.660-671.

ALRAJHI, A. A. ET AL. (2002). Fluconazole for the treatment of cutaneous leishmaniasis caused by

Leishmania major. N. Engl. J. Med. V. 346, p. 891-895.

ALVAR J. ET AL.(2012). Leishmaniasis world wide and global estimates of its incidence. PLoS One, v. 7, p.

35671.

ALVAR, J.; CAÑAVATE, C.; MOLINA, R.; MORENO, J.; NIETO, J. (2004). Canine leishmaniasis. Adv.

Parasitol., v. 57, n. 1, p. 1-87.

ALVAR, J. ET AL.(2008). The relationship between leishmaniasis and AIDS: the second 10 years. Clinical

microbiology reviews, v. 21, n. 2, p. 334-359.

ARTHUR, G.; BITTMAN, R. (1998). The inhibition of cell signaling pathways by antitumor etherlipids.

Biochem. Biophys. Acta, v. 1390, p. 85-102.

ASHFORD, R.W. (2000). The leishmaniasis as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for

Parasitology, v. 30, p. 1269-1281.

AZAS, N., DI GIORGIO, C., DELMAS, F., GASQUET, M., AND TIMON-DAVID, P. (1997). Leishmania

infantum promastigotes: Flow cytometry as a possible tool for assessing the effects of drugs and

cellular function. Experimental Parasitology 87,1–7.

BANETH, G.; SHAW, S. E. (2002). Chemotherapy of canine leishmaniosis. Vet. Parasitol, v.106, p. 315-324.

BASANO, S. A.; CAMARGO, L. M. A. (2004).Leishmaniose Tegumentar Americana: histórico,

epidemiologia e perspectiva de controle. Revista Brasileira de Epidemiologia, v. 7, n° 3. São Paulo, set.

BASTIEN, P.; BLAINEAU, C.; PAGES, M. (1992). Leishmaniasis: sex, lies and karyotipe. Parasitol. Today,

v. 8, p. 174-176.

BATES, P. A.; ROGERS, M. E. (2004). New insights into developmental biology and transmission

mechanisms of Leishmania. Current Molecular Medicine,v. 4, p. 601-609.

BEN SALAH, A. ET AL. (2013). Topical paromomycin with or without gentamicin for cutaneous

leishmaniasis. New England Journal of Medicine, v. 368, n. 6, p. 524-532.

BERMAN, J. D (1997). Human leishmaniasis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in

the last 10 years. Clinical Infectious Diseases, v. 24 , n. 4, p. 684-703.

BERMAN, J. D. ET AL. (2006). Miltefosine: issues to be addressed in the future. Trans. R. Soc. Trop. Med.

Hyg, v. 1005, p. 541-544.

BERMAN, J. D. ET AL. (1992). Activity of amphotericin B cholesterol dispersion (Amphocil) in

experimental visceral leishmaniasis. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 36, n. 9, p. 1978-1980.

BERMAN, J. D.; GALLALEE, J. V.; BEST, J. M. (1987). Sodium stibogluconate (Pentostam) inhibition of

glucose catabolism via the glycolytic pathway, and fatty acid beta-oxidation in Leishmania mexicana

amastigotes. Biochem Pharmacol. V. 36, n 2, p. 197-201.

BERMAN, J. (1998). Chemotherapy of leishmaniasis: recent advances in the treatment of visceral

disease. Current opinion in infectious diseases. V. 11, n. 6, p. 707-710.

BHATTACHARYA, S.; GHASH, S.; SHANT, J.; GANGULY, N.K.; MAJUMDAR, S. (2004). Effect of W07-

toxin on gut physiological response in mice. Microbial Pathogenesis, v. 37, n. 1, p. 1-9.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3028425


84

BIENAYMÉ, H.; HULME, C.; ODDON, G.; SCHMITT, P. (2000). Maximizing synthetic efficiency: Multi‐component transformations lead the way. Chemistry–A European Journal, v. 6, n. 18, p. 3321-3329.

BLUM, J.; DESJEUX, P.; SCHUWATZ, E.; BECK, B.; HATZ, C. (2004). Treatment of cutaneous

leishmaniasis among travelers. J. Antimicrob. Chemother, v. 53, n. 2, p. 158-166.

BRAGA, F.G. ET AL. (2007). Antileishmanial and antifungal activity of plants used in tradicional

medicine in Brazil. J. Ethnopharmacol, v.111, p. 396-402.

BRAGA, T.G. (2012). Comparação da heterogeneidade genética e da sensibilidade in vitro ao antimoniato

de meglumina entre amostras de Leishmania braziliensis isoladas de pacientes Respondedores e Não

Respondedores ao tratamento da leishmaniose cutânea. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde).

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro.

BRAJTBURG, J.; BOLARD, J.(1996). Carrier effects on biological activity of amphotericin B. Clin

Microbiol. Reviews, v. 9, n. 4, p. 512-531.

BUATES, S.; MATLASHEWSKI, G.(1999). Treatment of experimental leishmaniasis with the

immunomodulators imiquimod and S-28463: efficacy and mode of action. J Infect Dis.Jun, v. 179, n. 6,

p. 1485-94.

CARRIÓ ET AL. (2000). Leishmania infantum: Stage-Specific Activity of Pentavalent Antimony Related

with the Assay Conditions. Experimental Parasitology 95, 209–214.

COLOMBO AL, MATTA D, ALMEIDA LP (2002). Fluconazole susceptibility of brazilian Candida isolates

assessed by a disk diffusion method. Brazilian Journal Infect Disease, 6:118-23.

COSTA, C. H.; TAPETY, C.M.; WERNECK, G. L.(2007). Control of visceral leishmaniasis in urban areas:

randomized factorial intervention trial. Rev Soc Bras Med Trop, v. 40, p. 415-9.

CHAGAS, E. ET AL. (1938). Leishmaniose Visceral Americana:(Relatorio dos trabalhos realisados pela

commissão encarregada do estudo da Leishmaniose Visceral Americana em 1937). Memórias do

Instituto Oswaldo Cruz, v. 33, n. 1, p. 89-229.

CHALFIE, MARTIN. (1995). Green fluorescent protein. Photochemistry and Photobiology, 62(4), 651-656.

CHAN, M., BULINSKI, C. J., CHANG, K. P., & FONG, D. (2003). A microplate assay for Leishmania

amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology

research, 89(4), 266-271.

CHAPPUIS, F. ET AL. (2007). Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment and

control? Nature Reviews; Microbiol, v. 5, p. 57-516.

CHRUSCIAK-TALHARI, A. ET AL.(2011). Randomized controlled clinical trial to access efficacy and

safety of miltefosine in the treatment of cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (Viannia)

guyanensis in Manaus, Brazil.The American journal of tropical medicine and hygiene, v. 84, n. 2, p. 255-

260.

CHUNGE, C. N. ET AL. (1989). A rapid staining technique for Leishmania parasites in splenic aspirate

smears. Annals of Tropical Medicine & Parasitology, v. 83, n. 4, p. 361-364.

COJEAN, S. ET AL. (2012). Leishmania resistance to miltefosine 189 associated with genetic

marker. Emerging infectious diseases. v. 18, p. 704-706.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Buates+%26+Matlashewski%2C+1999


85

COURA-VITAL, W. ET AL. (2011). Prevalence and factors associated with Leishmania infantum infection

of dogs from an urban area of Brazil as identified by molecular methods. PLoS Negl Trop Dis, v. 5, n.

8, p. e1291.

CROFT, S. L. (1997). The current status of antiparasite chemotherapy. Parasitology, vol 114, p. 3-15.

CROFT, S. L.; COOMBS, G. H. (2003). Leishmaniasis – current chemotherapy and recent advancing the

search for novel drugs. Trends in Parasitology, v. 19, p. 502-508.

CROFT, S.L.; BARRETT, M.P.; URBINA, J. A. (2005). Chemotherapy of trypanosomiases and

leishmaniasis. Trends in Parasitology, v. 21, n. 11, p. 508-512.

CROFT, S. L.; SEIFERT, K.; YARDLEY, V. (2006a). Current scenario of drug development for

leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research, v. 123, n. 3, p. 399.

CROFT, SIMON L.; SUNDAR, SHYAM; FAIRLAMB, ALAN H. (2006b). Drug resistance in

leishmaniasis. Clinical microbiology reviews, v. 19, n. 1, p. 111-126.

DA SILVA, C. M. ET AL. (2011a). Schiff bases: a short review of their antimicrobial activities. Journal of

Advanced research , v. 2.1, p. 1-8.

DA SILVA, C. M. ET AL. (2011b). Synthesis of aryl aldimines and their activity against fungi of clinical

interest. Chemical biology & drug design, v. 78, n. 5, p. 810-815.

DE QUEIROZ, N. M. ET AL. (2011). Detection of Leishmania (L.) chagasi in canine skin. Vet Parasitol,

v.178, n.1-2, May 31, p.1-8.

DE SOUZA, A. C. B. (2010). Estudos Visando à Síntese de Compostos com Potencial Atividade Biológica,

Contendo o Núcleo Naftoquinônico, via Reações Multicomponentes (RMC) do tipo Hantzsch e

Reações de Acoplamento de Sonogashira. Dissertação de Mestrado (Química). Universidade de Brasília.

DEBACHE, A. ET AL. (2009). An efficient one-step synthesis of 1, 4-dihydropyridines via a

triphenylphosphine-catalyzed three-component Hantzsch reaction under mild conditions. Tetrahedron

Letters, v. 50, n. 37, p. 5248-5250.

DESJEUX, P. (2004). Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative Immunology,

Microbiology & Infectious diseases, v. 27, p. 305-318.

DI CRISTINA, G.; CARONIA, G. (1915). Sulla terapia della leishmaniosi interna. Pathologica, v. 7, p. 82-

83.

DI GIORGIO, C. ET AL.(2000). Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-

Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrobial agents and

chemotherapy, v. 44, n. 11, p. 3074-3078.

DÖMLING, A.; UGI, I. (2000). Multicomponent reactions with isocyanides. Angewandte Chemie

International Edition, v. 39, n. 18, p. 3168-3210.

DONOVIICK, R.; GOLD, W.; PAGANO, J. F.; STOUT, H. A. (1955-1956). Amphotericin A and B,

antifungical antibiotic produced by a streptomycete: I in vitro studies. Antibiot. Ann, v. 3, p. 579-586.

DORLO, T. P. C.; BALASEGARAM, M.; BEIJNEN, J. H.; VRIES, P. J. (2012). Miltefosine: a review of its

pharmacology and therapeutic efficacy in the treatment of leishmaniasis. Journal of Antimicrobial

Chemotherapy, v. 67, n. 11, p. 2576-2597.


86

DUBE, A; GUPTA, R; SINGH, N. (2009). Reporter genes facilitating discovery of drugs targeting

protozoan parasites. Trends in Parasitology. Vol. 25, p. 432-439.

DUTTA, A.; BANDYOPADHYAY, S.; MANDAL, C.; CHATTERJEE, M. (2005). Development of a

modified MTT assay for screening antimonial resistant field isolates of Indian visceral leishmaniasis.

Parasitol. Int., v. 54, p. 119-122.

EDRAKI, N.; MEHDIPOUR, A. R.; KHOSHNEVISZADEH, M.; MIRI, R. (2009). Dihydropyridines:

evaluation of their current and future pharmacological applications. Drug Discovery Today, v. 14, n.

21, p. 1058-1066.

FEIGAL, R. J. ET AL. (1985). Differential sensitivity of normal human pulp and transformed mouse

fibroblasts to cytotoxic challenge. Archives of oral biology, v. 30, n. 8, p. 609-613.

FOOD AND DRUG ADMINISTRATION - FDA Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance

for industry. Disponível em:

http://www.fda.gov/iceci/enforcementactions/bioresearchmonitoring/ucm135230.htm> Acesso em: 23 de

julho de 2016.

FOUCHET, P., JAYAT, C., HÉCHARD, Y., RATINAUD, M. H., & FRELAT, G. (1993). Recent advances of

flow cytometry in fundamental and applied microbiology. Biology of the Cell, 78(1-2), 95-109.

FRANÇA-SILVA, J. C. ET AL. (2003). Epidemiology of canine visceral leishmaniosis in the endemic area

of Montes Claros Municipality, Minas Gerais State, Brazil. Veterinary parasitology, v.111, p. 161-173.

FRANÇA-SILVA, J. C. ET AL. (2005). Importance of Lutzomyia longipalpis in the dynamics of

transmission of canine visceral leishmaniasis in the endemic area of Porteirinha Municipality, Minas

Gerais, Brazil. Vet Parasitol, v. 131, p. 213-220

FRÉZARD, F.; SCHETTINI, D. S.; ROCHA, O. G. F.; DEMICHELI, C. (2005). Lipossomas: propriedades

físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova, v.

28, p. 511-518.

FUMAROLA, L.; SPINELLI, R.; BRANDONÍSIO, O. (2004). In vitro assays for evaluation of drug activity

against Leishmania spp. Res. Microbiol., v. 155, p. 224-230.

GANGNEUX, J. P, DULLIN, M.; SULAHIAN, A.; GARIN, Y. J. F.; DEROUIN, F. (1999). Experimental

evaluation of second – line oral treatment of visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum. Amtimicrob. Agents Chemother, v. 43, n. 1, p. 172-174.

GANIS, P. ET AL. (1971). Polyene macrolide antibiotic amphotericin B. Crystal structure of the N-

iodoacetyl derivative. Journal of the American Chemical Society, v. 93, n. 18, p. 4560-4564.

GIL, E. S.; PAULA, J. R.; NASCIMENTO, F. R. F.; BEZERRA, J. C. B.( 2008). Produtos naturais com

potencial leishmanicida. Rev. ciênc. farm. básica apl, v. 29, n. 3, p. 223-230.

GONTIJO, B.; CARVALHO, M. L. R. (2003). American cutaneous leishmaniasis. Revista da Sociedade

Brasileira de Medicina Tropical, v. 36, n. 1, p. 71-80.

GONTIJO, C. M. F.; MELO, M. N. (2004). Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual, desafios e

perspectivas. Revista Brasileira de Epidemiologia, v. 7, p. 338-349.

GORDEEV, M. F.; PATEL, D. V.; GORDON, E. M. (1996). Approaches to combinatorial synthesis of

heterocycles: A solid-phase synthesis of 1, 4-dihydropyridines. The Journal of Organic Chemistry, v. 61,

n.3, p. 924-928.

http://www.fda.gov/iceci/enforcementactions/bioresearchmonitoring/ucm135230.htm


87

GUERIN, P. J. ET AL. (2002). Visceral leishmaniasis: current status of control, diagnosis, and treatment,

and a proposed research and development agenda. The Lancet infectious diseases, v. 2, n. 8, p. 494-501.

HERWALDT, B. L. (1999). Leishmaniasis. Lancet, v. 354, p. 1191-1199.

HILGEROTH, A. (2002). Dimeric 4-aryl-1, 4-dihydropyridines: development of a third class of nonpeptidic

HIV-1 protease inhibitors. Mini Reviews in medicinal chemistry, v. 2, n. 3, p. 235-245.

HORVATH, I. T.; ANASTAS, P. T. (2007). Innovations and green chemistry. Chemical reviews, v. 107, n. 6,

p. 2169-2173.

IRAJI, F.; SADEGHINIA, A. (2005). Efficacy of paromomycin ointment in the treatment of cutaneous

leishmaniasis: results of a double-blind, randomized trial in Isfahan, Iran. Annals of Tropical

Medicine & Parasitology, v. 99, n. 1, p. 3-9.

KAFETZIS, D.A. ET AL (2005). Treatment of paediatric visceral leishmaniasis: amphotericin B or

pentavalente antimony compounds?. International Journal Antimicrobial Agents, v. 25, n. 1, p. 26-30.

KARAGIANNIS-VOULES, D. A. ET AL. (2013). Bayesian geostatistical modeling of leishmaniasis

incidence in Brazil. PLoS Negl Trop Dis, v. 7, n. 5, p. e2213.

KILLICK-KENDRICK R. (1979). Biology of Leishmania in phlebotomine sand fly. In: Biology of the

kinetoplastida. Academic Press, London, New York & San Francisco,v. 2, p.395-460.

KROLEWIECKI, A.; LEON, S.; SCOTT, P.; ABRAHAM, D. (2002). Activity of azithromycin against

Leishmania major in vitro and in vivo. Am. J. Med. Hyg, v. 67, n. 3, p. 273-277.

LEBLOIS, R.; KUHLS, K.; FRANÇOIS, O.; SCHÖNIAN, G.; WIRTH, T. (2011). Guns, germs and dogs: on

the origin of Leishmania chagasi. Infect. Genet. Evol. V. 11, p. 1091–1095.

MAAROUF, M.; ADELINE, M. T.; SOLIGNAC, M.; VAUTRIN, D.; ROBERT-GERO, M. (1998).

Development and characterization of paromomycin-resistant Leishmania donovani promastigotes. Parasite, v. 5, n. 2, p. 167-173.

MAGALHAES, T. F. F. ET AL. (2013). Hydroxyaldimines as potent in vitro anticryptococcal

agents. Letters in applied microbiology, v. 57, n. 2, p. 137-143.

MAIA C., MÓNICA NUNES, MÓNICA MARQUES, SOFIA HENRIQUES, NUNO ROLÃO, LENEA

CAMPINO. (2013). In vitrodrug susceptibility of Leishmania infantumisolated from humans and

dogs. Experimental Parasitology. 135 p (36-41)

MAIA C.; N.ROLÃO, M. NUNES, L. GONÇALVES, L. CAMPINO. (2007). Infectivity of five different types

of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica 103 150–155.

MAIA-ELKHOURY, A. N. S., CARMOI, E. H., SOUSA-GOMES, M. L., & MOTA, E. (2007). Análise dos

registros de leishmaniose visceral pelo método de captura-recaptura. Revista Saúde Pública, v. 41, n.6,

p.931-7.

MARZOCHI, M. C. ET AL. (2009). Visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil: ecoepidemiological

aspects and control. Rev Soc Bras Med Trop, v. 42, p. 570-80.

MIKUS, J.; STEVERDING, D. (2000). A simple colorimetric method to screen drug citotoxicity against

Leishmania using the dye Alamar Blue®. Parasitol. Int., v. 48, p. 265-269.


88

MINISTÉRIO DA SAÚDE. (2006a) de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica.

Manual de vigilância e controle de leishmaniose visceral. Brasília: Ministério da Saúde.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. (2006b). Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância

Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral / Ministério da Saúde,

Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância Epidemiológica. – Brasília: Editora do

Ministério da Saúde. 120 p.: il. color – (Série A. Normas e Manuais Técnicos).

MINISTÉRIO DA SAÚDE. (2007). Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância

Epidemiológica. Manual de vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana. Brasília: Ministério da

Saúde

MINISTÉRIO DA SAÚDE. (2010a). Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual da Leishmaniose tegumentar

Americana. Série A. Normas e Manuais Técnicos. 2 ed. Brasília. Editora do Ministério da Saúde, 180 p.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. (2010b). Secretaria de vigilância em saúde. Departamento de vigilância

epidemiológica. Doenças infecciosas e parasitárias. Guia de bolso. 8ª edição revisada. Brasília.

MINISTERIO DA SAUDE. (2014). Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância

Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral / Ministério da Saúde,

Secretaria de Vigilância em saúde, Departamento de Vigilância Epidemiológica. – 1. ed., 5. reimpr. –

Brasília : Ministério da Saúde,. 120 p.: il.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. (2016). Nota Técnica Conjunta n° 001/2016 MAPA/MS (NOTA TÉCNICA Nº

11/2016/CPV/DFIP/SDA/GM/MAPA).

MINISTÉRIO DA SAÚDE. (2016). <http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/o-

ministerio/principal/secretarias/svs/leishmaniose-visceral-lv> (acesso em 24 /07/2016).

MITCHISON, D.; DAVIES, G.(2012). The chemotherapy of tuberculosis: past, present and future [State of

the art]. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, v. 16, n. 6, p. 724-732.

MONTEIRO, E. M. ET AL. (2005). Visceral leishmaniasis: a study on phlebotomine sand flies and canine

infection in Montes Claros, State of Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop, v. 8, p. 147-152.

MORENO, J. ET AL. (1999). The immune response and PBMC subsets canine visceral

leishmaniasisbefore, and after, chemotherapy. Vet. Immunol. Immunopathology, v. 71, p. 181-195.

MOSMANN, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to

Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of lmmunological Methods, v. 65, p.55-63.

MOTTA, J. O. C.; SAMPAIO, R. N. R. (2012). A pilot study comparing low-dose lipossomal amphotericin B

with N-methyl glucamine for the treatment of American cutaneous leishmaniasis. Journal of the

European Academy of Dermatology and Venereology, v. 26, p. 331-335.

MURRAY, H. W.; BERMAN, J. D.; DAVIES, C. R.; SARAVIA, N. G. (2005). Advances in leishmaniasis.

Lancet; v. 366, p. 1561–1577.

MURRAY, H. W. (2001). Clinical and experimental advances in treatment of visceral

leishmaniasis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 45, n. 8, p. 2185-2197.

NAVIN, T. R. ET AL. (1992). Placebo-controlled clinical trial of sodium stibogluconate (Pentostam) versus

ketoconazole for treating cutaneous leishmaniasis in Guatemala. Journal of Infectious Diseases, v. 165,

n. 3, p. 528-534.

http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/o-ministerio/principal/secretarias/svs/leishmaniose-visceral-lv

http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/o-ministerio/principal/secretarias/svs/leishmaniose-visceral-lv


89

NEOGY, A. B.; VOULDOUKIS, I.; DA COSTA, J. M.; MONJOUR, L. (1994). Exploitation of parasite-

derived antigen in therapeutic success against canine visceral leishmaniosis. Veterinary. Group of

Lupino. Vet. Parasitol, v. 54, p. 367-373.

NIETO, J. ET AL. (2003). Pharmacokinetics, toxicities, and efficacies of sodium stibogluconate

formulations after intravenous administration in animals. Antimicrob. Agents Chemother., v. 47, p.

2781-2787.

NOLI, C.; AUXILIA, S. T. (2005). Treatment of canine Old World visceral leishmaniasis: a systematic

review. Vet. Dermatol., v.16, p. 213-232.

NWAKA, S. & HUDSON, A. (2006). Innovative lead discovery strategies for tropical diseases. Nature

Reviews. Drug Discovery. Vol. 5. p (941-955).

OLIVEIRA, MC, AMORIM, RFB, FREITAS, RA, COSTA, ALL. (2004). Óbito em caso de leishmaniose

cutâneo mucosa após o uso de antimonial pentavalente. Parasitol, v.46, p.231-234.

OMOLLO, R. ET AL. (2011). Safety and efficacy of miltefosine alone and in combination with sodium

stibogluconate and liposomal amphotericin B for the treatment of primary visceral leishmaniasis in

East Africa: study protocol for a randomized controlled trial. Trials, v. 12, n. 1, p. 1.

PACHECO, S.R. ET AL. (2013). Biological activities of eco-friendly synthesizes Hantzsch adducts. Medicial

Chemistry, v. 9, p. 889-896.

PALATNIK-DE-SOUSA, C. B. ET AL. (2001). O. Impact of canine control on the epidemiology of canine

and human visceral leishmaniasis in Brazil. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 65, n. 5, p. 510-517,.

PALIT, P.; ALI, N. (2008). Oral therapy with amlodipine and lacidipine, 1, 4-dihydropyridine derivatives

showing activity against experimental visceral leishmaniasis. Antimicrobial agents and

chemotherapy, v. 52, n. 1, p. 374-377.

PAULA, C. D. R.; SAMPAIO, J. H. D.; CARDOSO, D. R.; SAMPAIO, R. N. R. (2003). Estudo comparativo

da eficácia de isotionato de pentamidina administrada em três doses durante uma semana e de N-

metil-glucamina 20mgSbV/kg/dia durante 20 dias para o tratamento da forma cutânea da

leishmaniose tegumentar americana. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 36, p.

365-371.

PASA, T. S.; VOYVODA, H.; OZBEL, Y. (2005). Clinical and serological follow-up in dogs with visceral

leishmaniosis treated with allopurinol and sodium stibogluconate. Veterinary Parasitology, v.128, p.

243-249.

PECHÈRE, J. C. (2001). Azithromycin reduces the production of virulence factors in Pseudomonas

aeruginosa by inhibiting quorum sensing. Japanese Journal of Antibiotics v. 54, p. 87-89.

PEREIRA, DÁRCIO GOMES. (2007). Importância Do Metabolismo No Planejamento De Fármacos.

Quimica. Nova, Vol. 30, No. 1, 171-177.

PETROIANU, ANDY. (1996). Aspectos éticos na pesquisa em animais. Acta cir bras, v. 11, n. 3, p. 157-64.

Belo Horizonte, 1996. Disponível em:

<http://www.medicina.ufmg.br/cememor/arquivos/aspectosEticosAnimais.pdf> acesso em: 23/07/2016.

PLOCK, ANNICK; SOKOLOWSKA-KÖHLER, WANDA; PRESBER, WOLFGANG. (2001). Application of

flow cytometry and microscopical methods to characterize the effect of herbal drugs on Leishmania

Spp. Experimental parasitology, v. 97, n. 3, p. 141-153.

http://www.medicina.ufmg.br/cememor/arquivos/aspectosEticosAnimais.pdf


90

RAKOTOMANGA, M. ET AL. (2007). Miltefosine affects lipid metabolism in Leishmania donovani

promastigotes. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 51, n. 4, p. 1425-1430.

RATH. ET AL. (2003). Antimoniais Empregados no Tratamento da Leishmaniose: Estado da Arte. Quim.

Nova, Vol. 26, No. 4, 550-555, 2003.

RATHELOT, P. ET AL. (1995). Synthesis of novel functionalized 5-nitroisoquinolines and evaluation of in

vitro antimalarial activity. European journal of medicinal chemistry, v. 30, n. 6, p. 503-508.

RATHELOT, P., AZAS, N., EL-KASHEF, H., DELMAS, F., DI GIORGIO, C., TIMON-DAVID, P., JOSÉ

MALDONADO & VANELLE, P. (2002). 1, 3-Diphenylpyrazoles: synthesis and antiparasitic activities

of azomethine derivatives. European journal of medicinal chemistry, 37(8), 671-679.

REIMÃO, J. Q.; SCOTTI, M.T.; TEMPONE, A.G.; (2010). Anti-leishmanial and anti-trypanosomal,

activities of 1,4-dihydropyridines in vitro evaluation and structure-activity relationship study.

Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 18, p. 8044-8053.

REIS, A. B.; GIUNCHETTI, R. C.; CARRILLO, E., MARTINS-FILHO, O. A.; MORENO, J. (2010).

Immunity to Leishmania and the rational search for vaccines against canine visceral leishmaniasis. Trends in Parasitology, v. 26, p. 341-349.

REITHINGER, R.; DAVIES, C.R. (2002). Canine leishmaniasis: novel strategies for control. Trends Parasitol,

v. 18, p. 289-290.

RHALEM, A.; SAHIBI, H.; LASRI, S.; JAFFE, C. L. (1999). Analysis of immune responses in dogs with

canine visceral leishmaniasis before, and after, drug treatment. Vet. Immunol. Immunopathol., v. 71, p.

69-76.

RIBEIRO, J. M. C.; MANS, B. J.; ARCA, B. (2010). An insight into the sialome of blood feeding

nematocera. Insect. Biochem. Mol. Biol, v. 40, n. 11, p. 767–784.

RIJAL, S. ET AL. (2003) Sodium stibogluconate cardiotoxicity and safety of generics. Transactions of the

Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 97, n. 5, p. 597-598.

ROATT BM, AGUIAR-SOARES RD, COURA-VITAL W, KER HG, MOREIRA ND, VITORIANO-SOUZA

J, GIUNCHETTI RC, CARNEIRO CM, REIS AB. (2014). Immunotherapy and immunochemotherapy

in visceral leishmaniasis: promising treatments for this neglected disease. Frontiers Immunology, v. 13,

n. 5, p. 272.

ROBERTS, W. L.; MCMURRAY, W. J.; RAINEY, P. M.; (1998). Characterization of the Antimonial

Antileishmanial Agent Meglumine Antimonate (Glucantime). Antimicrobial Agents And

Chemotherapy. V. 42, N. 5, p. 1076–1082.

ROCHA, L. G.; ALMEIDA J. R. G. S.; MACEDO, R. O.; BARBOSA-FILHO, J. M. (2005). A review of

natural products with antileishmanial activity. Phytomedicine, v. 12, n. 6, p. 514-535.

ROCHA, M. N. (2009). Desenvolvimento de espécies de Leishmania fluorescentes e caracterização da

susceptibilidade de L. amazonenses GFP como modelo para testes quimioterápicos. 83 F. Dissertação

(Mestrado em Ciências) - Centro de Pesquisas René Rachou, Belo Horizonte, MG.

ROGERO, S. O.; LUGÃO, A. B.; IKEDA, T. I.; CRUZ, A. S. (2003). Teste in vitro de citotoxicidade: estudo

comparativo entre duas metodologias. Material Research, v. 6, n. 3, p.317-320.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0223523402013880

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0223523402013880


91

SAHA, A. K.; MUKHERJEE, J.; BRADIERE, A. (1986;). Mechanism of action of amphotericin B on

Leishmania donovani promastigotes. Mol. Biochen. Parasitol, v. 19, p. 195-200.

SANDS, M.; KRON, M. A.; BROWN, R. B. (1985). Pentamidina: A Review. Reviews of Infectious Diseases,

v. 7, p. 625-634.

SANTOS, D. O. ET AL. (2008). Leishmaniasis treatment-a challenge that remains: a review. Parasitol Res,

v. 103, p. 1-10.

SARIDOMICHELAKIS, M. N. ET AL. (2005). Periodic administration of alopurinol is not effective for the

prevention of canine leishmaniosis (Leishmania infantum) in the endemic areas. Vet. Parasitol., v. 130,

p. 199-205.

SCHIFF, H. (1864). Mittheilungen aus dem Universitätslaboratorium in Pisa: eine neue Reihe organischer

Basen. Justus Liebigs Annalen der Chemie, v. 131, n. 1, p. 118-119.

SEIFERT, K. ET AL. (2003). Characterisation of Leishmania donovani promastigotes resistant to

hexadecylphosphocholine (miltefosine). Int. J. Ant. Agents.; v. 22, p. 380-387.

SEIFERT, K.; MUNDAY, J.; SYEDA, T., CROFT, S. L. (2011). In vitro interactions between sitamaquine

and amphotericin B, sodium stibogluconate, miltefosine, paromomycin and pentamidine against

Leishmania donovani. Journal of antimicrobial chemotherapy, v. 66, n. 4, p. 850-854.

SERENO, D; CORDEIRO DA SILVA, A; MATHIEU-DAUDE, F; OUAISSI, A. (2007). Advances and

perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. Vol. 56,

p. 03-07.

SESANA, A. M. (2009). Avaliação do efeito da associação do antimoniato de meglumina e dessoxicolato de

anfotericina B e da atividade anti-leishmania de uma nova formulação de anfotericina B na infecção

experimental com Leishmania (Leishmania) chagasi. 80f. Dissertação (Mestrado em Doenças

Infecciosas) – Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória.

SHI, L. ET AL. (2007). Synthesis and antimicrobial activities of Schiff bases derived from 5-chloro-

salicylaldehyde. European journal of medicinal chemistry, v. 42, n. 4, p. 558-564.

SILVA, FERNANDA DE OLIVEIRA.(2005). Atividade in vitro da azitromicina nas espécies Leishmania

(Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, e Leishmania (Leishmania) chagasi. – Belo

Horizonte: Fundação Oswaldo Cruz / Centro de Pesquisas René Rachou.

SILVA, J. G. D.; WERNECK, G. L.; CRUZ, M. S. P.; COSTA, C. H. N.; MENDONÇA, I. L. (2007). Infecção

Natural de Lutzomyia longipalpis por leishmania sp. em Terezina, Piauí, Brasil. Caderno Saúde

Pública, v. 23, p. 1715-1720.

SINAGRA, A. ET AL. (2007). The activity of azithromycin against Leishmania (Viannia) braziliensis and

Leishmania (Leishmania) amazonensis in the golden hamster model. Rev. Soc. Bras. Med. Trop, v. 40,

n. 6, p. 627-630.

SINDERMANN, H.; ENGEL, K. R.; FISCHER, C.; BOMMER, W. (2004). Oral miltefosine for leishmaniasis

in immunocompromised patients: compassionate use in 39 patients with HIV infection. Clinical

infectious diseases, v. 39, n.10, p. 1520-1523.

SINGH, S.; SIVAKUMAR, R. (2004). Challenges and new discoveries in the treatment of leishmaniasis.

Journal of Infection and Chemotherapy, v. 10, p. 307–315.


92

SOTO, J. ET AL(2004). Miltefosine for New World Cutaneous Leishmaniasis. Clinical Infectious Diseases,

v. 38, p. 1266–1272

SOTO, J. ET AL. (2008). Efficacy of miltefosine for Bolivian cutaneous leishmaniasis. The American journal

of tropical medicine and hygiene, v. 78, n. 2, p. 210-211,

SUNDAR, S. (2001a). Drug resistance in Indian visceral leishmaniasis. Tropical Medicine and International

Health, v. 6, n. 11, p. 849-854.

SUNDAR, S. (2001b). Treatment of visceral leishmaniasis. Medical microbiology and immunology, v. 190, n.

1-2, p. 89-92.

SUNDAR, S. (2002). Drug resistance in Indian visceral leishmaniasis. Trop Med Int Saúde, v. 7, n. 3, p. 293.

SUNDAR, S.; MURRAY, H. W. (2005). Availability of miltefosine for the treatment of kala-azar in

India. Bulletin of the World Health Organization, v. 83, n. 5, p. 394-395.

SUNDAR, S.; JHA, T. K.; THAKUR, C. P.; SINHA, P. K.; BHATTACHARYA, S. K. (2007). Injectable

paromomycin for visceral leishmaniasis in India. New England Journal of Medicine, v. 356, n. 25, p.

2571-2581.

SUNDAR, SHYAM .D., M.D., DIPTI AGARWAL, M.D., MADHUKAR RAI, M.D., AND HENRY W.

MURRAY, M.D. (2010). Single-Dose Liposomal Amphotericin B for Visceral Leishmaniasis in India. The

new England Journal of Medicine; v. 362, p.504-512.

SUNDAR, S.; CHAKRAVARTY, J. (2013). Leishmaniasis: an update of current pharmacotherapy. Expert

Opinion on Pharmacother.;v. 14, p. 53–63.

TASDEMIR, D., KAISER, M., BRUN, R., YARDLEY, V., SCHMIDT, T. J., TOSUN, F., & RÜEDI, P. (2006).

Antitrypanosomal and antileishmanial activities of flavonoids and their analogues: in vitro, in vivo,

structure-activity relationship, and quantitative structure-activity relationship studies. Antimicrobial

agents and chemotherapy, 50(4), 1352-1364.

TEMPONE, A. G. ET AL. (2005). Antiprotozoal activity of Brazilian plant extracts from isoquinoline

alkaloid- families. Phytomedicine, v. 12, p. 382–390.

TEMPONE, A. G.; ANDRADE Jr, H.F. (2008). Nanoformulations of pentavalent antimony entrapped in

phosphatidylserine-lipossomes demonstrate highest efficacy against experimental visceral

leishmaniasis. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v. 67, p. 131-136.

TESH, R. B. (1995).Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am J Trop

Med Hyg, v.52, p. 287-92

THAKUR, C. P. ET AL. (1994). Daily versus alternate-day regimen of amphotericin B in the treatment of

kala-azar: a randomized comparison. Bulletin of the World Health Organization, v. 72, n. 6, p. 931.

THAKUR, CP, NARAYAN, S. (2004). A comparative evaluation of amphoterericin B and sodium

antimony gluconate, as first-line drugs in the treatment of Indian visceral leishmaniasis. Ann Trop

Med Parasitol, v. 98, n. 2, p. 129-138.

TIPHINE, M.; LETSCHER-BRU, V.; HERBRECHT, R. (1999). Amphotericin B and its new formulations:

pharmacologic characteristics, clinical efficacy, and tolerability.Transpl Infect Dis, v. 1, n. 4, p. 273-83.

TIUMAN, T. S.; SANTOS, A. O.; UEDA-NAKAMURA, T.; DIAS FILHO, B. P.; NAKAMURA, C. V. (2011).

Recent advances in leishmaniasis treatment. International Journal of Infectious Diseases, v. 15, n. 8, p.

525-532.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sundar%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11703838


93

TROUILLER, P.; OLLIARO, P. L. (1999). Drug development output from 1975 to 1996: what

proportion for tropical diseases?. Int. J. Infect. Dis., v. 3, p. 61-63.

VALADARES, D. G. ET AL. (2012). Prophylactic or therapeutic administration of Agaricus blazei Murill

is effective in treatment of murine visceral leishmaniasis. Experimental Parasitology, v. 132, n. 2, p.

228-236.

VAN GRIENSVEN, J. ET AL. (2010). Combination therapy for visceral leishmaniasis. The Lancet infectious

diseases, v. 10, n. 3, p. 184-194.

VAN VOORHIS, W. C. (1990). Therapy and prophylaxis of systemia protozoan infections. Drugs, v. 40, n.

2, p. 176-202.

VANDEPUTTE, J.; WACHTEL, J. L.; STILER, E. T. (1956). Amphotericin A and B antifungical antibiotics

produced by streptomyces II. The isolation and properties amphotericins. In: Antibiotics Annual,

1955-1956. New York: Medical Encyclopedia,; p. 581-591.

VASCONCELLOS, E. C. F. (2013). Tratamento intralesional da leishmaniose cutânea com antimoniato de

meglumina no instituto de pesquisa clínica Evandro Chagas, fiocruz, rio de janeiro (2002 a julho

2011). 92 F. Tese (Doutorado em Ciências) – Instituto de Pesquisa Evandro Chagas, Rio de Janeiro,

VERMA, N. K.; DEY, C. S. (2004). Possible mechanism of miltefosine-mediated death of Leishmania

donovani. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 48, n. 8, p. 3010-3015,.

VOULDOUKIS, I. ET AL. (2006). Canine visceral leishmaniasis: comparison of in vitro leishmanicidal

activity of marbofl oxacin, meglumine antimoniate and sodium stibogluconate. Vet Parasitol, v. 135, p.

137-46.

WENDLER, E. P. (2010). Reações multicomponentes na preparação de compostos nitrogenados

polifuncionalizados. Tese (Doutorado em Química) São Carlos, SP.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (1990). Control of Leishmaniasis. WHO Tech. Rep. Ser.v. 793.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (2010ª). Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the

Control of Leishmaniases. Geneva, 22–26.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (2010b). Control of the leishmaniasis. Reporto f a WHO expert

committee. Who Health Organ Tech. Rep. Vol. 949, p. 1 -186. Set.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (2010c). Application for Inclusion of MILTEFOSINE On WHO

Model List of Essential Medicines. Nov.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (2012). Research priorities for Chagas disease, human African

trypanosomiasis and leishmaniasis. Who Health Organ Tech. Rep. Ser. V 975. P. v-xii, 1-100.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (2013). Control of Leishmaniasis.

<http://www.who.int/neglected_diseases/NTD> Acesso em: 22 de julho de 2016.

YAMEY, G.; TORREELE, E. (2002). The world’s most neglected diseases. BMJ, v. 325, p. 176-177.

http://www.who.int/neglected_diseases/NTD

11 ANEXOS

Salomão, N.E.O. Anexos

95

Anexo 1: Informação da síntese dos compostos derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch

SÍNTESE DE ALDIMINAS:

As aldiminas - bases de Schiff – avaliadas neste estudo (n=1-7) sendo: 1:3D7; 2: 3G2; 3: 3H7; 4:

3H8; 5: 3H9; 6: 3I4 e 7: 3I5; foram obtidas pela condensação assistida por micro-ondas entre os

correspondentes aldeídos e aminas aromáticas (Esquema 1). Os reagentes foram solubilizados em

etanol absoluto e as soluções resultantes foram irradiadas em reator CEM Discover® durante um

período de 2 minutos. Concluídas as reações, os produtos foram isolados por recristalização. Os

compostos sintetizados foram completamente caracterizados por IR (infravermelho), RMN

(ressonancia magnética nuclear) (1H and 13C) e espectros de massa (Pacheco et al., 2013).

Esquema 1: Síntese de bases de Schiff (compostos 1-7) utilizando irradiação por micro-ondas.

(Composto 1: 3D7): 2-(((1E,2E)-3-(2-nitrophenyl)allylidene)amino)phenol

Mp (ponto de fusão): 127 ºC. IR (neat, cm-1) (banda do infravermelho): 3075, 2924, 2854, 1627, 1607, 1584,

1518, 1454, 1341, 1293, 1261, 1235, 1158, 1103, 1041, 991, 959, 802, 786, 756, 741, 696, 673. 1H NMR (RMN

ressonancia nuclear magnética ) (200 MHz, DMSO-d6): 6.74-7.26 (m, 5H), 7.51-7.68 (m, 2H), 7.75 (t, 1H, J

= 7.4 Hz), 7.92-8.08 (m, 2H), 8.55 (d, 1H, J = 8.7 Hz, CH=N), 9.13 (s, 1H, OH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-

d6): 116.1, 119.5, 124.6, 127.7, 128.4, 130.1, 133.2, 133.7, 130.2, 137.0, 137.9, 148.0, 151.2, 160.3. HRMS (ESI,

IT-TOF) calculado para: C15H13N2O3+: 269.0921; encontrado: 269.0811.

(Composto 2: 3G2): (1E,2E)-N,3-diphenylprop-2-en-1-imine

_


96

Mp (ponto de fusão): 105-106 ºC. IR (neat, cm-1) : 3049, 1623, 1599, 1571, 1482, 1446, 1148, 1073, 993, 982,

958, 747, 685. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): 7.06-7.53 (m, 10H), 7.58-7.80 (m, 2H), 8.38 (d, 1H, J = 8.5

Hz, CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 120.9, 125.9, 127.6, 128.4, 129.0, 129.2, 129.6, 135.5, 144.2,

151.5, 162.0. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C15H14N+: 208.1121; encontrado: 208.1061.

(Composto 3: 3H7): (1E,2E)-3-(2-nitrophenyl)-N-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-imine

Mp (ponto de fusão): 180 ºC (dec.). IR (neat, cm-1) : 3079, 3031, 1622, 1596, 1576, 1568, 1506, 1339, 1253,

1158, 1103, 996, 967, 857, 786, 755, 740, 695. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 7.23 (dd, 1H, J = 15.7, 8.9

Hz), 7.41 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.67 (td, 1H, J = 7.8, 1.3 Hz), 7.84-7.74 (m, 2H), 8.04-8.04 (m, 2H), 8.27 (d, 2H, J

= 8.9 Hz), 8.54 (d, 1H, J = 8.8 Hz, CH=N). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): 121.8, 124.6, 124.9, 128.7, 129.6,

130.7, 132.1, 133.7, 140.2, 148.2, 157.0, 164.8. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C15H12N3O4+: 298.0822;

encontrado: 298.0614.

(Composto 4:3H8): (1E,2E)-N-(4-methoxyphenyl)-3-(2-nitrophenyl)prop-2-en-1-imine

Mp (ponto de fusão): 97-98 ºC. IR (neat, cm-1) : 3055, 2939, 2842, 1607, 1568, 1523, 1504, 1469, 1444, 1343,

1300, 1294, 1247, 1157, 1105, 1032, 971, 945, 847, 833, 784, 743, 695, 676. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6):

3.76 (s, 3H, OCH3), 6.95 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.07-7.36 (m, 3H), 7.48-7.62 (m, 2H), 7.74 (t, 1H, J = 7.6 Hz)

7.94-8.08 (m, 2H), 8.51 (d, 1H, J = 8.7 Hz, CH=N) . 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 55.3, 114.4, 122.6, 124.6,

_

_

_


97

128.4, 130.0, 130.1, 133.1, 133.6, 136.4, 143.7, 148.0, 158.3, 158.9. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para:

C16H15N2O3+: 283.1077; encontrado: 283.0910.

(Composto 5: 3H9): 2-(((1E,2E)-3-(2-nitrophenyl)allylidene)amino)benzonitrile

Mp (ponto de fusão): 147-148 ºC. IR (neat, cm-1) : 3077, 2226, 1633, 1612, 1589, 1569, 1519, 1475, 1440,

1348, 1159, 1098, 989, 961, 849, 784, 771, 760, 742, 702, 676. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): 7.16-7.52 (m,

3H), 7.56-7.93 (m, 5H), 7.95-8.20 (m, 2H), 8.57 (d, 1H, J = 8.9 Hz, CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6):

107.1, 117.4, 119.1, 124.6, 126.7, 128.8, 129.5, 130.7, 132.0, 133.3, 133.7, 134.4, 140.5, 148.2, 153.6, 165.3.

HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C16H12N3O2+: 278.0924; encontrado: 278.0745.

(Composto 6: 3I4): (1E,2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-imine


1250, 1152, 1102, 1020, 991, 958, 861, 852, 820, 805, 752, 695, 668. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): 3.80

(s, 3H, OCH3), 6.91-7.16 (m, 3H), 7.25-7.50 (m, 3H), 7.65 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 8.22 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 8.35 (d,

1H, J = 8.9 Hz, CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 55.3, 114.5, 121.7, 125.0, 125.6, 127.8, 129.7, 144.6,

146.8, 157.7, 160.9, 165.3. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C16H15N2O3+: 283.1077; encontrado:

283.0908.

(Composto 7: 3I5): 2-(((1E,2E)-3-(4-nitrophenyl)allylidene)amino)phenol

_

_


98


1317, 1243, 1149, 1101, 981, 830, 794, 754, 688. 1H NMR (200 MHz, CDCl3): 6.90 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.01

(d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.12-7.37 (m, 5H), 7.68 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.26 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.45-8.55 (m, 1H,

CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 115.4, 115.6, 120.3, 124.4, 128.1, 129.9, 132.6, 135.2, 140.5, 141.9,

148.1, 152.9, 156.7. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C15H13N2O3+: 269.0921; encontrado: 269.1110.

SÍNTESE DE ADUTOS DE HANTZSCH

Os adutos de Hantzsch avaliados nesse estudo, (n=8-12) sendo, 8: 8A2; 9: 8A3; 10: 8A4; 11:

8B5 e 12: 8B6, foram obtidos de acordo com Pacheco e colaboradores (2013). O aldeído (1

mmol), acetoacetato de etilo (1 mmol), acetato de amonio (1 mmol), e dimedona (1 mmol)

foram dissolvidos em 5 mL de etanol contendo ácido lático (10% molar) e a mistura foi

agitada à temperatura ambiente durante 6 horas. Depois da reação, o resíduo foi extraído com

acetato de etilo e o material foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica

(Pacheco et al., 2013)..

Esquema 2: Síntese de Adutos de Hantzsch 8-12 utilizando ácido láctico como catalisador.

IMPORTANTE: Os adutos de Hantzsch 8A2, 8A3, 8A4, 8B5 e 8B6 correspondem aos

compostos 8, 9, 10, 11 e 12, respectivamente, demonstrados no esquema acima.

_


99

Anexo 2: Tabela com valores de IC50 de cada composto químico derivado de aldiminas e

adutos de Hantzsch, avaliados nos macrófagos murino da linhagem J774A.1 e macrófagos

canino da linhagem DH82, nos tempos de 24, 48 e 72 horas de avaliação.

1) aldiminas - IC50 em macrófago canino (DH82)

Composto AmB 3I4 3I5 3H7 3H8 3H9 3D7 3G2

24 Horas 430810 33.40 20.27 87.92* 49.92* 44.42* 36.60 20.87*

48 Horas 404 21.70* 17.81* 105.8 ˜ 88.07 78.41 27.21 39.06

72 Horas 105,1* 47,62 20.85 131.9 78.31 77.95 11.84* 79.66

2) aldiminas - IC50 em macrófago murino (J774.A1)

Composto AmB 3I4 3I5 3H7 3H8 3H9 3D7 3G2

24 Horas 224,2 14,89* 13,36 2358 22,38 18,49 20,87* 6,257*

48 Horas ~ 255.0 ~ 24.46 ~ 23.51 ~ 49.06 ~ 24.20 21,8 37,49 13,76

72 Horas 102,2* 4,13E-06 1,554* 45,5* 16,5* 14,13* 27,36 6,353

3) adutos de Hantzsch - IC50 em macrófago canino (DH82)

Composto AmB 8A2 8A3 8A4 8B5 8B6

24 Horas 430810 290,1 1081 1633 318,3 7,86E+07

48 Horas 404 4,44E+14 456812 169,8 0 0,008002

72 Horas 105,1* 1,27E-09 não teve 0.0 5.110e- 008 7.265e- 007

4) adutos de Hantzsch - IC50 em macrófago murino (J774.A1)

Composto AmB 8A2 8A3 8A4 8B5 8B6

24 Horas 224,2 129,2 104,9 47,35 181,3 186,9

48 Horas ~ 255.0 1,45E+02 232,1 37,09 250,3 214,2

72 Horas 102,2* 125,1 61,52 51,71 142,9 115,2

neyza emilia de oliveira salomÃo...2016 salomão, n.e.o. agradecimentos 4 salomão, n.e.o....

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