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NÁDIA DAS DORES MOREIRA

HISTÓRIA NATURAL DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM HAMSTER “Mesocricetus auratus”

EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS POR DUAS CEPAS DE Leishmania infantum COM

PERFIS DISTINTOS DE VIRULÊNCIA E PATOGENICIDADE

OURO PRETO, MG

2012

NÁDIA DAS DORES MOREIRA

HISTÓRIA NATURAL DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM HAMSTER “Mesocricetus auratus”

EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS POR DUAS CEPAS DE Leishmania infantum COM

PERFIS DISTINTOS DE VIRULÊNCIA E PATOGENICIDADE

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas como parte das exigências para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Ouro Preto na área de concentração Imunobiologia de Protozoários

Orientador: Alexandre Barbosa Reis

Co-Orientadores: Cláudia Martins Carneiro

Rodolfo Cordeiro Giunchetti

OURO PRETO, MG 2012

Catalogação: [email protected]

M838h Moreira, Nádia das Dores.

História natural da leishmaniose visceral em hamster “Mesocricetus

auratus” experimentalmente infectados por duas cepas de Leishmania

infantum com perfis distintos de virulência e patogenicidade [manuscrito] / Nádia das Dores Moreira. – 2012.

145 f.: il., color; grafs.; tabs. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.

1. Leishmaniose visceral - Teses. 2. Leishmania - Estudos experimentais - Teses. 3. Hamster como animal de laboratório - Teses. 4. Baço - Teses. 5. Fígado - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 616.993.161

i

“Nenhum de nós chegou onde está exclusivamente através do impulso de nossos próprios pés. Chegamos aqui porque alguém se inclinou e nos

alavancou. ’’ Thurgood Marshal

Moreira, N. D. Dedicatória

ii

Dedico,

A Deus, amor infinito

Aos meus pais, Manoel e Maria, pelo apoio irrestrito, amor imensurável e exemplos de honestidade e caráter, dos quais sempre procurei

espelhar-me.

À minha Irmã e segunda mãe, Meire, pelo amor incondicional, compreensão, bondade e apoio nas horas difíceis.

Ao meu sobrinho Gustavo, luz da minha vida.

À minha cunhada Elaine e meu irmão Marcone por estarem sempre perto da minha mãe, fazendo por ela o que eu não pude fazer, por estar tão distante.

Ao meu noivo Danilo, foi tudo mais fácil com você ao meu lado.

A Paula, Carol e em especial ao Bruno e Juliana vocês são fundamentais em minha vida. Ao Alexandre, por me conceder um trabalho tão importante, objeto de minha tese. Palavras não exprimem o que você fez por mim. Eterna gratidão A Jamile, minha cópia... sem palavras!

Moreira, N. D. Agradecimentos

iii

Agradecimentos

A Deus, em primeiro lugar, pelo dom da vida. Hoje devo esta vitória a ti e tenho a certeza

de que, sem tua presença, teria sido impossível continuar e chegar aonde cheguei.

Agradeço a ti pelas provocações, pois através delas pude amadurecer; pelas lágrimas

derramadas, pois elas me tornaram mais fortes; pela ausência das pessoas que amo, pois

através dela pude ver o quanto são importantes na minha vida. Obrigada Senhor!

Ao Papai e Mamãe, amores da minha vida, e que fazem de tudo pela minha felicidade,

realizando todos os meus sonhos. Só tenho a agradecer a Deus todos os dias por tudo que

fazem por mim. Obrigada pela compreensão em suportar pacientemente uma filha distante

da vida familiar durante anos. No entanto, são vocês a razão de tudo isso, e é a vocês que

ofereço esta conquista. Papai e Mamãe, amo vocês.

À Elaine minha cunhada, amiga, irmã. Ela que me deu forças para continuar e não desistir

no primeiro ano de doutorado, momento mais difícil que enfrentei até hoje. O meu sonho e

vontade de fazer o doutorado não eram suficientes para que eu prosseguisse se não fosse o

apoio dela.

Ao Danilo, pelas palavras de incentivo, seu gesto de compreensão, sua atitude de

segurança, mesmo nos períodos de desânimo. Obrigada por caminhar ao meu lado.

Obrigada pelo amor, pela paciência e pelo companheirismo.

Ao Dr. Alexandre, exemplo de dedicação e profissionalismo, de quem tive a honra de ser

orientada. Aliado aos seus profundos conhecimentos científico você tem contribuído

sobremaneira em minha formação profissional e humana.

À Drª. Cláudia Martins Carneiro, a ausência do professor Alexandre foi menos dolorida

com você por perto. As inúmeras tarefas não a impediram de desejar sempre boa sorte a

cada experimento, pra mim isso foi fundamental. Obrigada por todos os ensinamentos

desde o mestrado. Muita coisa do que sou hoje devo a você.

Ao Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti pelo convívio e ensinamentos que foram (e são) muito

importantes para meu crescimento profissional e pessoal. Obrigada por tudo.


iv

À Drª. Marta de Lana pela colaboração e imenso carinho.

À Maria Chaves, o que seria de mim sem ela no LIMP, é minha mãe... Amo muito.

À Juliana, pela transparência, sinceridade e por ter me ensinado o valor de uma amizade

verdadeira, onde sempre existiu o respeito e a confiança mútua e também por ter estado

presente nos momentos mais críticos e mais felizes destes últimos anos... as pessoas

entram na nossa vida por acaso, mas não é por acaso que elas permanecem... Você foi e é

um presente de Deus em minha vida. Muito obrigada por tudo, minha amiga.

Ao Bruno, o que dizer de uma pessoa como o Bruno, sempre disposto a ajudar todo

mundo, uma pessoa com enorme motivação pela ciência, me ajudou desde o primeiro

experimento até o ultimo, abraçou este projeto como se fosse seu. Não existem palavras

para expressar tudo o que você fez por mim durante estes nove anos de convivência, mas

se pudesse caracterizaria como um respeito mútuo, admiração e confiança. A você Bruno

minha eterna gratidão.

À Paula, querida amiga, que fiz durante essa longa caminhada e não me esquecerei nunca,

muito obrigada, por todo o apoio é pouco. Estou certa de que, sem você, a minha

caminhada seria mais difícil. Você é um exemplo a ser seguido, tem um coração do

tamanho do mundo... Alegria imensa por tê-la como minha amiga.

À Jamille, impossível descrever tudo que Jam fez e faz por mim. Além do que, ela é minha

cópia. Jam é a única pessoa que consegue ler meus pensamentos e entender meu jeito

introspectivo e volúvel de ser. É amiga, irmã. Amo demais minha filha!

À Carolzinha, uma doçura de pessoa, obrigada pelo carinho, ensinamentos, convivência,

ajuda, paciência e pelas tardes de descontração em que demos boas risadas. É um

privilégio ser sua amiga. Obrigada por tudo. Você mora em meu coração. Te Adooooooro!

À Kátia, a alegria de viver desta garota não existe, é muito cativante. É bom demais ter

pessoas como você ao nosso lado principalmente em um ambiente de trabalho. Tudo fica

mais fácil quando você está por perto. Muito obrigada pelo auxílio nos experimentos.


v

Ao Henrique, Rodrigo, Levi, Flávia e Fernando pelo imensurável apoio durante o

doutorado. A vocês minha eterna gratidão.

À Larissa, no momento em que mais precisei lá estava ela, não mediu esforços em me

ajudar... Quanta dedicação, quanta responsabilidade, a você minha eterna gratidão.

À Amanda, Luiza, Lucilene, Ana, Nathália, Aline, Renata, Leoneide, Sheller, e Wendel

pela agradávél convivência e colaboração em todos os momentos.

À Tânia, pela presteza e precisão nos serviços burocráticos do LIMP.

À Renata Guerra por permitir que eu realizasse os experimentos de qRT-PCR em seu

laboratório.

À todos do Laboratório de Enzimologia e Proteômica, em especial à Karina pela presteza.

À todos do Laboratório de Doença de Chagas em especial a Lívia e Ivo Caldas.

Aos funcionários do biotério, pelo carinho que sempre tiveram comigo nos momentos em

que precisei. Luciana muito obrigada, eu te adoro.

À Érika, menina de Ouro, orgulho de ser sua amiga. Palavras não exprimem tudo que você

fez por mim. Não foi nada fácil montar a colônia de hamsters se não fosse sua dedicação e

calma, não sei o que seria de mim. Muito Obrigada.

Aos docentes e colegas do Curso de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas, pelos ensinamentos e convivência.

A CAPES pela concessão da bolsa. A FAPEMIG e CNPq pelo financiamento do projeto.


vi

A todos aqueles que por um momento de distração deixei de mencionar os nomes, mas de

uma maneira ou de outra, colaboraram para que este trabalho se concretizasse,

contribuindo de modo efetivo para a sua realização.

A todos,

minha sincera gratidão.

Moreira, N. D. Sumário

vii

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 4

2.1 Aspectos gerais da leishmaniose ................................................................................. 5

2.2 Aspectos imunopatológicos e curso da infecção em modelos experimentais na LV .. 8

2.3 O hamster como modelo experimental na leishmaniose ........................................... 14

3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 22

4. OBJETIVOS .................................................................................................................... 24

4.1 Objetivo geral ............................................................................................................ 25

4.2 Objetivos específicos ................................................................................................. 25

5. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 26

5.1 Animais ...................................................................................................................... 27

5.2 Delineamento e protocolo experimental .................................................................... 27

5.3 Crescimento in vitro de formas Promastigotas .......................................................... 29

5.4 Parasitos e inóculos ................................................................................................... 29

5.5 Taxa de sobrevida ...................................................................................................... 30

5.6 Procedimentos de coleta de amostras biológicas ....................................................... 30

5.7 Avaliação sorológica ................................................................................................. 31

5.7.1 Avaliação de IgG-total por ELISA ..................................................................... 31

5.8 Avaliação do quadro hematológico e bioquímico ..................................................... 32

5.9 Necropsia dos animais e obtenção do material biológico.......................................... 32

5.10 Processamento e avaliação histológica do fígado e baço ........................................ 33

5.11 Avaliação da densidade parasitária – LDU (Leishman Donovan Units) ................. 34

5.12 Análise Molecular para quantificação da carga parasitária no fígado e baço pela técnica de qPCR .............................................................................................................. 34

5.12.1 Extração de DNA das amostras de Fígado ....................................................... 34

5.12.2 Extração de DNA das amostras de baço ........................................................... 35

5.12.3 Clonagem dos produtos da amplificação do gene de L. infantum .................... 36

5.12.4 Reação em cadeia da Polimerase - PCR ........................................................... 36

5.12.5 Clonagem .......................................................................................................... 36

5.12.6 Preparo de bactérias competentes e transformação bacteriana ......................... 37

5.12.7 Purificação dos vetores por lise alcalina .......................................................... 38

5.12.8 Construção de curvas-padrão para a qPCR em tempo real .............................. 39

5.13 Avaliação da expressão gênica por qRT-PCR ......................................................... 41

5.13.1 Desenho dos iniciadores (primers) ................................................................... 41

5.13.2 Extração e purificação do RNA total das amostras de baço ............................. 42

5.13.3 Quantificação e avaliação do grau de pureza do RNA total extraído ............... 43

5.13.4 Integridade do RNA extraído ........................................................................... 44

5.13.5 Transcrição reversa (síntese da 1ª fita de DNA complementar- cDNA) .......... 44

5.13.6 Avaliação da curva de eficiência dos primers .................................................. 45

5.13.7 Expressão de citocinas por qRT-PCR .............................................................. 46

5.14 Análises estatísticas ................................................................................................. 47

6. RESULTADOS ............................................................................................................... 48

6.1 Avaliação do perfil de crescimento in vitro das formas promastigotas de L. infantum das cepas PP75 e selvagem (C46) ................................................................................... 49

6.2 Avaliação da taxa de sobrevida nos diferentes grupos experimentais....................... 50

6.3 Avaliação clinicopatológica ...................................................................................... 50

6.4 Avaliação da resposta humoral .................................................................................. 53

6.5 Avaliação de parâmetros clínicos laboratoriais ......................................................... 54

6.5.1 Hemograma: série branca e vermelha ........................................................................ 54

Moreira, N. D. Sumário

viii

6.6 Avaliação dos parâmetros Bioquímicos .................................................................... 60

6.6.1 Provas de função renal ........................................................................................ 60

6.6.2 Prova de função hepática .................................................................................... 62

6.6.3 Proteinograma ..................................................................................................... 63

6.6.4 Proteína total ....................................................................................................... 64

6.6.5 Albumina ............................................................................................................ 64

6.6.6 Globulina ............................................................................................................ 66

6.6.7 Relação Albumina Globulina: A/G .................................................................... 67

6.8 Avaliação anatomopatológica do fígado ................................................................... 69

6.8.1 Alterações macroscópicas e microscópicas ........................................................ 69

6.9 Avaliação anatomopatológica do baço ...................................................................... 76

6.9.1 Alterações macroscópicas e microscópicas ........................................................ 76

6.10 Avaliação da carga parasitária no fígado e baço: LDU (Leishmam donovam Units) e PCR em tempo real .......................................................................................................... 82

6.10.1 LDU (Leishmam Donovam Units) .................................................................... 82

6.11 Análise de correlação: parasitismo no baço X IgG total ......................................... 85

6.12 PCR em tempo real .................................................................................................. 86

6.13 Avaliação da expressão relativa de mRNA das citocinas proinflamatórias TNF-α e IFN-γ e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β) no baço ...................................................... 92

6.13.1 Citocinas proinflamatórias TNF-α e IFN-γ ...................................................... 92

6.13.2 Citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β ..................................................... 94

6.14 Razão de TNF-α/TGF-β e TNF-α/IL-10 no baço de hamsters infectados com promastigotas de L. infantum .......................................................................................... 96

6.15 Razão de IFN-γ/TGF-β e IFN-γ/IL-10 no baço de hamsters infectados com promastigotas de L. infantum .......................................................................................... 98

7. DISCUSSÃO ................................................................................................................. 101

8. CONCLUSÃO ............................................................................................................... 124

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 128

10. ANEXO ....................................................................................................................... 144

Moreira, N. D. Lista de Abreviaturas

ix

ALT Alaninaminotransferase APCs Células apresentadoras de antígeno AST Aspartatoaminotransferase BOD Biochemical oxygen demand

CaCl Cloreto de cálcio CCA Centro de Ciência Animal CCL2 Chemokine (C-C motif) ligand 2

CCL3 Chemokine (C-C motif) ligand 3

CCZ Centro de Controle de Zoonoses Ct Ciclo Threshold CTAB Brometo de Cetiltrimetilamônio CXCL10 C-X-C motif chemokine 10

DEPC Dietilpirocarbonato DNA Ácido desoxirribonucléico dNTP Desoxirribonucleotídeos EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA Enzyme linked immunosorbent assay g Gramas GAPDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase HCl Ácido Clorídrico HE Hematoxilina eosina IC Intracardíaca ID Intradérmica IFN-γ Interferon gama IgG Imunoglobulina da classe G IL Interleucina IL-10 Interleucina 10 IL-12 Interleucina 12 IL-2 Interleucina 2 IL-4 Interleucina 4 iNOS Óxido nítrico sintase induzida IP Intraperitoneal IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB Luria Bertani LDU Leishman Donovan Units

LIT Liver infusion tryptose medium LT Linfócitos T LV Leishmaniose Visceral LVC Leishmaniose Visceral Canina LVH Leishmaniose Visceral Humana MCP-1 Monocyte chemotactic protein-1 mg Miligrama MgCl Cloreto de maganésio MIP-1α Macrophage Inflammatory Proteins alfa

mL Mililitro MnCl Cloreto de manganês MOPS 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid

mRNA RNA mensageiro mRNA RNA Mensageiro

Moreira, N. D. Lista de Abreviaturas

x

NaCl Cloreto de sódio NCB National Center for Biotechnology Information

ng Nanograma NK Natural Killer

NNN Nicole, Novy & Neal (Meio de cultivo bifásico) NO Óxido Nítrico NUPEB Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas OMS Organização Mundial de Saúde OPD Orthophenylenediamine

PBS Phosphate buffer saline (tampão fosfato salina) PCLV Programa de Controle da Leishmaniose Visceral PCR Reação em Cadeia da Polimerase pmol Picomol qRT-PCR Real Time quantitative Reverse Transcription PCR

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta RNA Ácido ribonucléico RPM Rotação por minuto SFB Soro fetal bovino TGF-β Fator de transformação do crescimento beta Th1 Células T CD4+ secretoras do padrão 1 de citocinas Th2 Células T CD4+ secretoras do padrão 2 de citocinas Tm Temperatura de fusão TNF-α, Fator de necrose tumoral-α Tris Tris (Hidroximetil aminometano) UFOP Universidade Federal de Ouro Preto WHO World Health Organization (OMS) X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

µm Micrômetro µg Micrograma µL Microlitro

Moreira, N. D. Lista de Figuras

xi

Figura 1: Mapa do vetor p-GEM®-T Vector.. ................................................................... 37 Figura 2: Exemplo da curva padrão referente ao gene da DNA polimerase de L. infantum.. ............................................................................................................................................. 41 Figura 3: Curva padrão referente ao gene GAPDH utilizando diluição seriada de 5x de cDNA. .................................................................................................................................. 45 Figura 4: Plot de amplificação referente à curva de eficiência do GAPDH utilizando diluição seriada de 5x de cDNA. ......................................................................................... 46 Figura 5: Curva de crescimento das formas promastigotas de L. infantum das cepas PP75 e selvagem acompanhadas por 20 dias, com contagens diárias.. ........................................... 49 Figura 6: Taxa de sobrevida de hamsters pertencentes ao grupo controle e experimentalmente infectados com as cepas de L. infantum. .............................................. 50 Figura 7: Alterações macroscópicas observadas em hamsters após a infecção com a cepa selvagem em 9 meses após a infecção. ................................................................................ 51 Figura 8: Reatividade de IgG total no soro de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum. ................................................................ 54 Figura 9: Níveis séricos de uréia e creatinina de hamsters dos grupos controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ......................................................................... 61 Figura 10: Níveis séricos de AST e ALT de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum. ........................................................................ 63 Figura 11: Níveis séricos de proteínas totais de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ......................................................................... 64 Figura 12: Níveis séricos de albumina de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ...................................................................................................... 66 Figura 13: Níveis séricos globulina de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ...................................................................................................... 67 Figura 14: Relação de albumina globulina de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ................................................................. 68


xii

Figura 15: Peso dos hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L.

infantum ............................................................................................................................... 69 Figura 16: Alterações macroscópicas do fígado de hamsters controle e experimentalmente inoculados pela via intracardíaca com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum, avaliados no tempo de 9 meses após infecção ..................................................................................... 70 Figura 17: Peso do fígado e peso relativo (peso fígado/peso corporal) de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ............................................ 71 Figura 18: Avaliação do processo inflamatório no fígado de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ...................................................................................................... 73 Figura 19: Fotomicrografias de secções histológicas do fígado de hamsters Mesocricetus

auratus inoculados com as cepas PP75 e C46 (selvagem) de L. infantum pelas vias intradérmica, intraperitoneal ou intracardíaca avaliados aos 6 ou 9 meses após inóculo ... 74 Figura 20: Fotomicrografias de secções histológicas do fígado de hamsters Mesocricetus

auratus inoculados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum pelas vias intraperitoneal ou intracardíaca avaliados aos 6 ou 9 meses após inóculo .................................................. 75 Figura 21: Alterações macroscópicas do baço de hamsters controle e experimentalmente inoculados pela via intracardíaca com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum, avaliados no tempo de 9 meses após infecção ..................................................................................... 76 Figura 22: Peso absoluto e relativo do baço (peso baço/peso corporal) de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ........................................... 77 Figura 23: Percentual de animais apresentando capsula normal e periesplenite de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ........................................ 79 Figura 24: Percentual de animais apresentando aspecto histológico normal; hiperplasia da polpa vermelha variando de discreta, moderada e intensa de hamsters do grupo controle e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. ............................................................................................................................ 79 Figura 25: Fotomicrografias de secções histológicas do baço de hamsters Mesocricetus

auratus inoculados com a cepa PP75 de L. infantum pelas vias intradérmica, intraperitoneal ou intracardíaca avaliados aos 6 ou 9 meses após a infecção ............................................. 80 Figura 26: Fotomicrografias de secções histológicas do baço de hamsters Mesocricetus

auratus infectados com a cepa selvagem de L. infantum pelas vias intradérmica, intraperitoneal ou intracardíaca avaliados aos 6 ou 9 meses após a infecção. .................. 81


xiii

Figura 27: Densidade parasitária no fígado de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ........................................................................................................................... 83 Figura 28: Densidade parasitária no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L.

infantum ............................................................................................................................... 84 Figura 29: Densidade parasitária no fígado e baço de hamsters experimentalmente infectados com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum inoculados pelas vias IP e IC, avaliados aos 9 meses após a infecção ................................................................................ 85 Figura 30: Análise de correlação entre o número de amastigotas no baço de hamsters experimentalmente inoculados pela via intracardíaca com as cepas PP75 e selvagem de L.

infantum. Os índices de correlação de Pearson (r) e os valores p estão representados nos gráficos. ............................................................................................................................... 86 Figura 31: Número de amastigotas no fígado de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca ...................................................... 88 Figura 32: Número de amastigotas no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca....................................................... 90 Figura 33: Expressão relativa de mRNA das citocinas proinflamatórias TNF-α e IFN-γ no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ............................................ 93 Figura 34: Expressão relativa de mRNA das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ............................................ 96 Figura 35: Razão TNF-α/TGF-β e TNF-α/IL-10 no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum ...................................................................................................... 98 Figura 36: Razão IFN-γ/TGF-β e IFN-γ/IL-10 no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum .................................................................................................... 100

Moreira, N. D. Lista de Tabelas

xiv

Tabela 1: Sequências de primers forward e reverse referente aos genes avaliados, função, tamanho do amplicon gerado e número de acesso das sequências no GeneBank. .............. 42 Tabela 2: Análise anatomoclínica de hamsters experimentalmente infectados com L.

infantum. .............................................................................................................................. 52 Tabela 3: Leucograma de hamsters controle e experimentalmente infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum. ......................................................................................... 56 Tabela 4: Eritrograma de hamsters controle e experimentalmente infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum. ......................................................................................... 59 Tabela 5: Número de amastigotas a partir de 20ng de DNA em amostras de fígado e baço de hamsters experimentalmente infectados com promastigotas de L. infantum.................. 91

Moreira, N. D. Resumo

xv

A leishmaniose visceral humana (LVH) é a mais temida e devastadora dentre as várias formas clínicas das leishmanioses. Esta doença negligenciada, tem ganhando grande importância devido as altas taxas de mortalidade. A espécie do parasito, imunidade, características genéticas e estado nutricional do hospedeiro desempenham papel crucial no desenvolvimento espectral das formas clínicas, podendo evoluir de uma infecção assintomática inaparente para uma forma clínica letal, em casos extremos. O tratamento quimioterápico, não é suficiente para controlar e deter a LVH em todo mundo. Um agravante importante, é a ausência de uma vacina que possa ser empregada em programas de controle da LV. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias profiláticas e terapêuticas contra a LV se faz necessário e urgente. Muitos modelos animais experimentais, como roedores e primatas não humanos ja foram avaliados, cada um apresentando características específicas, sendo que nenhum destes, reproduz com precisão o que acontece na LV humana e canina. Neste contexto, no presente estudo, o modelo hamster (Mesocricetus auratus) foi usado, e os animais foram divididos em dois grandes grupos experimentais: um grupo infectado com a cepa padrão da OMS (MHOM/BR/74/PP75; n=120) e outro infectado com a cepa selvagem (n=120) de L.

infantum, além de um grupo controle não infectado (C; n=80). Estes dois grandes grupos foram subdivididos em três subgrupos referentes às vias de inóculo utilizada: intradérmica (ID), intracardíaca (IC) e intraperitoneal (IP). Os animais foram avaliados durante nove meses após a infecção para a análise da sobrevida. Para cada tempo, dez animais/grupo foram avaliados. Amostras de sangue, soro, fragmentos de fígado e baço foram colhidos para realização de diferentes análises laboratoriais. As características clinicopatológicas, hematológicas, o perfil bioquímico da função renal e hepática além do quadro histopatológico foram alvos deste trabalho. Além disso, foram utilizadas abordagens moleculares empregando a PCR em tempo real quantitativa (qPCR e qRT-PCR) para determinar a carga parasitária no fígado e baço, bem como, para avaliar a expressão de citocinas no baço, respectivamente. Nossos principais resultados revelaram o aparecimento de sinais clínicos e a presença de biomarcadores laboratoriais típicos em ambas as cepas empregadas. No entanto, de um modo em geral, a cepa selvagem foi capaz de induzir doença grave, com evolução fatal principalmente nos hamsters inoculados pela via IC. As principais alterações hematológicas encontradas em hamsters que evoluíram para infecção ativa da LV foram: anemia, leucopenia acompanhada de neutropenia, linfopenia, e em alguns casos monocitopenia e eosinopenia. Os parâmetros bioquímicos relacionados à avaliação da função renal mostraram elevação de uréia e creatinina em ambas às cepas utilizadas. Já em relação à função hepática observou-se elevação nos níveis de ALT e AST nos diferentes grupos e tempos avaliados. No compartimento hepático, observou-se a instalação de processo inflamatório nos espaços-porta com a evolução da infecção, acompanhada pela formação de granulomas, com maior frequência e intensidade no grupo IC. A hipoplasia dos folículos linfóides, associada à proliferação de macrófagos da polpa vermelha, destruição da arquitetura esplênica foram mais evidentes no grupo IC, por apresentar maior gravidade da doença. A qPCR mostrou-se sensível na detecção do DNA de L. infantum tanto no fígado como no baço, em todos os grupos experimentais independente da cepa utilizada e do período de avaliação. Como observado na análise do índice de LDU o qPCR também evidenciou maior parasitismo no fígado e baço principalmente nos animais infectados com a cepa selvagem, pela via IC. Além disso foi verificado forte correlação entre parasitismo tecidual e produção de anticopos anti-IgG. A predominância da expressão de mRNA para IFN-γ, nos animais infectados com a cepa PP75 no fim do período de avaliação no grupo IC, sugere maior expressão desta citocina em resposta à replicação parasitária, induzindo um perfil inflamatório concomitante e

Moreira, N. D. Resumo

xvi

intenso. A resposta imune observada em hamsters infectados com a cepa selvagem pela via IC durante o período inicial (3 meses) foi relacionada com a expressão aumentada de IL-10 e TGF-β. Este fenômeno parece suprimir estes animais permitindo o estabelecimento da infecção ativa bem como a proliferação do parasito no baço. Neste sentido, a inoculação por via IC é rapidamente seguida pela proliferação de parasitos, exibindo sinais clínicos típicos da LV semelhantes aos observados em seres humanos e/ou cães naturalmente infectados. Os resultados obtidos no presente estudo, sugerem o uso de hamsters como modelo experimental para avaliar os aspectos imunopatológicos durante o curso da LV ativa. Além disto, considerando que os hamsters experimentalmente infectados apresentaram muitas das características clínicas e imunopatológicas como observado na LVH e LVC, este modelo experimental é altamente relevante em avaliações pré-clínicas de potenciais drogas leishmanicidas e vacinas.

Moreira, N. D. Abstract

xvii

Human Visceral Leishmaniasis (HVL) is the most dreaded and devastating parasitic disease amongst the various forms of leishmaniasis. This neglected disease, has gained immense importance because of its high mortality rate. The parasite acts on the hosts immune status and plays a crucial role in the manifestation of a spectrum of clinical syndromes, which can, in most extreme cases, go from an asymptomatic infection to a fatal form of HVL. Chemotherapy alone is not sufficient to control and contain VL spreading around of the world. The lack of vaccines to prevent and/or treat this infection, as well as the emergence of drug resistant parasites, is a serious impediment to controlling VL. Therefore, developing new prophylactic and therapeutic strategies against VL is urgently required. Many experimental animal models like rodents and monkeys have been developed, each with specific features, but none accurately reproduce what happens in humans and canine VL. The prerequisite of a reliable animal model is that it should have a considerably good correlation with the clinical situation. Moreover, it also should mimic the pathological features and immunological responses observed in humans and dogs when exposed to a strain variety of L. infantum with different virulent and pathogenicity characteristics. In this respect, herein we use hamsters (Mesocricetus auratus) subdivided into two major experimental groups according to the strain applied: 120 animals were infected with the reference L. infantum strain (WHO/MHOM/BR/74/PP75) and 120 animals were infected with the wild strain. For each strain, three different routes of inoculation were used: intradermal (ID, n=40), intraperitoneal (IP, n=40) and intracardiac (IC, n=40). Animals not infected were used as a control group (C, n=80). The animals were followed for a nine month post-infection evaluation for survival analysis. For each time point of the follow-up, ten animals per group were evaluated. Samples of blood, serum, liver and spleen were collected for the different laboratorial analysis. Clinicalpathological, hematological, the seric biochemical profile (renal and hepatic) and histopathological picture were also evaluated. In addiction we quantified the parasite burden in the liver and spleen and the cytokines immunological profiles in the spleen were also investigated throughout the study. Furthermore, molecular approaches using quantitative Real Time PCR for DNA and RNA, respectively were carried out. Ours major results revealed the appearance of the many typical clinical laboratorial biomarkers in both strains. However, in general the wild strain was more able to induce a severe disease with fatal evolution mainly occurring in hamsters inoculated by the IC route. Anemia, leukopenia accompanied by neutropenia, lymphopenia, and in some cases monocytopenia and eosinopenia were the main hematological alteration found in hamsters that evolved into an active VL infection. Considering the biochemical parameters related to the renal function an increase in urea and creatinine in both strains, were detected. Regarding liver function, it was observed an increase in the levels of ALT and AST in different groups and times points evaluated. The installation of inflammatory process in the liver compartment occurred in the portal spaces with the evolution of infection, accompanied by the formation of granulomas, with higher frequency and intensity in the IC group. Hypoplasia of lymphoid follicles was associated with the macrophages proliferation in red pulp and the destruction of tissue architecture was more evident in the IC group. The qPCR showed a higher sensitive enough to detect the presence of DNA of L. infantum in both, spleen and liver, in all experimental groups (ID, IP and IC) independent of the strain used and the period evaluated. As observed in LDU index analysis, the qPCR also demonstrated that the higher parasitism in liver and spleen when the animals were infected with the wild strain by IC route. Moreover it was found a strong correlation between tissue parasitism and production of anti-IgG total L.

infantum. The predominant expression of mRNA for IFN-γ in hamster infected with PP75 strain were detected at the end of evaluation in IC group, suggesting higher expression of

Moreira, N. D. Abstract

xviii

this cytokine in response to the parasite replication inducing an intense concomitant inflammatory profile. The cytokine immune response observed in hamsters infected with the wild strain in the IC group during the initial period (3 months) was related to highly increased expression of IL-10 and TGF-β. Τhese finding appear to suggest suppression of these animals and the establishment of the active infection and parasitic tissue proliferation. In this sense, the inoculation by IC route is rapidly followed by a fulminating parasite proliferation and displaying a typical VL clinical signs similar of the pattern observed in humans or dogs. Taken together the results obtained in the present study, it is possible suggest the use of hamsters as experimental model to evaluate the immunopathological findings during ongoing active VL. Considering that the infected hamster presented many the clinicoimmunopathological features as observed in HVL and CVL we recommend this experimental model for preclinical evaluation of potential antileishmanial drugs and vaccine.

1. INTRODUÇÃO

Moreira, N. D. Introdução

2

Um dos grandes desafios atuais dos pesquisadores para vencer a crescente

urbanização da leishmaniose visceral (LV), em diversas áreas do mundo, é a busca de

estratégias imunoprofiláticas empregando vacinas imunoprotetoras e/ou esquemas

terapêuticos capazes de promover a cura parasitológica que possam ser empregados como

alternativas aos tratamentos de primeira escolha. Entretanto, poucas são as opções para o

tratamento da LV, considerando que os atuais fármacos têm perdido a capacidade de cura

devido ao surgimento de cepas resistentes e, necessariamente, precisam compor um

tratamento de baixo custo, fundamental aos países pobres, onde a doença é mais

prevalente. No que diz respeito à imunoprofilaxia, as vacinas existentes para LV ainda não

conquistaram confiança da comunidade científica nem dos órgãos de saúde pública para

serem utilizadas em cães e humanos, em campanhas de controle governamentais (WHO,

2010; Reis et al., 2010).

Neste cenário, os investimentos realizados nos últimos anos em pesquisas pré-

clínicas e clínicas para testes com novas drogas e vacinas ainda se mostram insuficientes.

Neste sentido, torna-se evidente a necessidade da caracterização de modelos experimentais

que reflitam a história natural da LV favorecendo o desenvolvimento de ensaios pré-

clínicos e clínicos, visando avaliar novos fármacos e vacinas contra o agente etiológico da

LV e/ou LVC (Leishmaniose Visceral Canina). Neste contexto, o hamster (Mesocricetus

auratus) também conhecido como hamster sírio dourado tem sido resgatado como um dos

mais promissores modelos experimentais para o estudo da LV. No entanto, até algumas

décadas atrás este modelo só havia sido explorado no estudo de sítios imunológicos

privilegiados, em meados dos anos 40. As décadas de 60, 70 até meados da década de 80

representaram o apogeu das pesquisas utilizando a bolsa alimentar de hamster,

posteriormente substituída pela utilização de camundongos isogênicos e knokout.

Assim, é de fundamental importância ampliar os esforços com ênfase no

estabelecimento de testes de drogas e vacinas oferecendo a comunidade científica um

modelo experimental que antecedesse os testes em cães e em humanos e que permitisse

avaliar a infecção em todo seu curso crônico. Neste sentido, o presente estudo buscou

caracterizar a infecção experimental por L. infantum empregando o hamster (Mesocricetus

auratus) como modelo e duas cepas com perfis distintos de virulência e patogenicidade.

Sendo assim, buscou avaliar o perfil clínico-patológico, bioquímico-hematológico,

sorológico, parasitológico e imunológico, além da taxa de sobrevida, durante nove meses

de infecção experimental. Este trabalho buscou contribuir para a ampliação do

Moreira, N. D. Introdução

3

conhecimento da história natural da infecção experimental em hamster em seus diversos

aspectos evidenciando novos biomarcadores de monitoração laboratorial que permitirão

uma aplicação mais racional do modelo hamster em testes de drogas e vacinas contra LV.

2. REVISÃO DE LITERATURA

Moreira, N. D. Revisão de Literatura

5

2.1 Aspectos gerais da leishmaniose

As leishmanioses são um complexo de doenças causadas por protozoários da ordem

Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e do gênero Leishmania (Ross, 1903; Laison &

Shaw, 1987). Este complexo de doenças apresenta amplo espectro de formas clínicas

dependente de vários aspectos: espécie do parasito, fatores eco-epidemiológicos,

imunidade, características genéticas e estado nutricional do hospedeiro (McMahon-Pratt &

Alexander, 2004).

A Organização Mundial de Saúde (OMS/WHO) classifica as leishmanioses em

quatro formas clínicas: cutânea, mucosa, difusa e visceral. Entretanto, a LV é a forma mais

grave, e é caracterizada em sua forma típica (Calazar) por febre alta, perda de peso,

hepatoesplenomegalia, linfadenopatia. A esse quadro, associam-se alterações laboratoriais

caracterizadas por pancitopenia, leucopenia hipergamaglobulinemia e hipoalbuminemia

(Desjeux, 2004; Piscopo & Mallia Chappuis, 2007). Além disso, a presença de anticorpos

formadores de complexos imunes depositados nos rins pode levar ao desenvolvimento de

glomerulonefrites graves (Sartori et al., 1987). A LV por sua vez pode ser subdividida em

quatro formas clínicas distintas: assintomática ou inaparente, subclínica ou

oligossintomática, LV aguda e LV crônica ou Calazar propriamente dito (Badaró et

al.,1986). No Sudão, na Etiópia e principalmente na Índia encontra-se, ainda, a

leishmaniose dérmica pós-calazar, que se manifesta após a cura da doença com o

tratamento e é caracterizada por lesões cutâneas com presença do parasito (Berman, 2006;

Piscopo & Mallia, 2006).

A leishmaniose é uma das doenças mais negligenciadas do mundo, afetando

principalmente regiões pobres e países em desenvolvimento. Atualmente as leishmanioses

afetam cerca de 12 milhões de pessoas em 88 países, estimando-se que 350-400 milhões

encontra-se em áreas de risco, sendo a incidência anual de 500.000 novos casos para LV. A

incidência da leishmaniose visceral humana é de 1,6 milhões ao ano e apesar deste enorme

número de casos, apenas 500 são notificados (Desjeux, 2004; WHO, 2010). Neste sentido,

vale ressaltar que a LV é uma doença de notificação compulsória na maioria dos países

onde ocorre, entretanto estima-se que mesmo assim, ainda ocorram muitas subnotificações

(WHO, 2010).

Assim, como em outras doenças tropicais, as leishmanioses estão relacionadas às

mudanças ambientais de caráter antroponótico que promovem o contato entre hospedeiros


6

vertebrados e invertebrados. Embora as leishmanioses sejam consideradas doenças

tipicamente rurais, a recente emergência e reemergência em várias cidades do mundo as

posicionam como um grave problema de saúde pública (Ashford, 2000; WHO, 2010).

A LV possui ampla distribuição geográfica ocorrendo na Índia, Bangladesh, Nepal,

Brasil e Sudão, sendo que o Brasil contribui com 90% dos registros que ocorrem no

continente americano (Monteiro et al., 1994; Desjeux, 1996). No Brasil, em função da sua

ampla distribuição geográfica, a LV apresenta aspectos climáticos, geográficos e sociais

diferenciados, envolvendo as regiões Norte, Nordeste, Centro-oeste, Sudeste e Sul. Na

década de 90, aproximadamente 90% dos casos notificados de LV ocorreram na região

Nordeste. Na medida em que a doença expandiu para as outras regiões, essa situação vem

se modificando e, recentemente a região Nordeste representa 48% dos casos do país

(Brasil, 2009). Estes dados mostram uma forte mudança no perfil epidemilógico da LV em

nosso país que se expande e urbaniza nos últimos anos, passando a ocorrer em diversos

estados da federação que eram livres da doença.

O agente etiológico da LV no velho mundo (Índia e Leste da África) é a

Leishmania (Leishmania) donovani; na China, Ásia Central, Sudeste da Europa,

Mediterrâneo é a Leishmania (L.) infantum e América Latina a Leishmania (L.) chagasi

(Lainson & Shaw, 1987; Lukes et al., 2007). Embora diferentes no nome e localização

geográfica, técnicas moleculares e bioquímicas confirmaram que a L. infantum e L.

chagasi tratam-se da mesma espécie (Maurício et al., 2000; Lukes et al., 2007).

Atualmente a OMS tem empregado a denominação de L. infantum para o agente etiológico

da LV nas Américas, passando então a considerar apenas estas duas espécies (L. donovani

e L. infantum) como agente etiológico da LV no mundo (WHO, 2010). Diante do exposto,

neste estudo optou-se pela utilização de L. infantum.

A principal forma de transmissão do parasito ocorre por meio da picada de fêmeas

de dípteros da família Psychodidae, subfamília Phebotominae, sendo a Lutzomyia

longipalpis a principal espécie transmissora da L. infantum no Novo Mundo, embora já

tenha sido demonstrado que outras espécies de Lutzomyia, como L. evansi e L. cruzi

estejam atuando como vetores (Travi et al., 1996; dos Santos et al., 1998). No ciclo

silvestre da L. infantum as raposas são conhecidas até o momento, como supostos

reservatórios silvestres do parasito no Brasil. Duas espécies de raposas foram encontradas

naturalmente infectadas: Lycalopex vetulus no Ceará; e Cerdocyun thous no Pará e em

Minas Gerais (Shaw, 2003).


7

É importante resaltar que os cães (Canis familiaris) são considerados o principal

reservatório doméstico do parasito, ocupando uma posição de destaque na cadeia

epidemiológica devido à sua proximidade com o homem no ambiente doméstico

principalmente em áreas rurais e urbanas, apresentando elevado parasitismo cutâneo

observado até mesmo nos animais assintomáticos (Tesh, 1995; Giunchetti et al, 2006; de

Queiroz et. al, 2011). Este hospedeiro apresenta uma série de manifestações da doença,

variando desde animais aparentemente sadios (assintomáticos), passando por uma fase de

sinais moderados como pequena perda de peso, adenopatia linfóide e pêlo opaco

(oligosintomáticos), podendo atingir estágios graves da doença, com intenso parasitismo

cutâneo, diferentes alterações clínicas na pele (alopecia, dermatite furfurácia, úlceras e

hiperqueratose), ceratoconjuntivite, onicogrifose, paresia dos membros posteriores,

emagrecimento e caquexia (polissintomáticos) (Abranches et al., 1991; Costa et al., 1999;

Reis, 2001; Reis et al., 2006a, 2006b, 2006c ; Giunchetti et al., 2006; Reis et al., 2009).

Além disso, podem apresentar alterações hematológicas e bioquímicas com aumento sérico

das atividades das enzimas hepáticas e elevação da uréia e creatinina (Ciaramella et al.,

1997). Além disto, tem sido observado que o agravamento dos sinais clínicos no cão

apresenta relação direta com a carga parasitária em diferentes tecidos (Reis, 2001; Reis et

al., 2006a, 2006b, 2006c; Giunchetti et al., 2006, 2008a, 2008b, 2008c).

Sendo assim, o cão representa uma abundante fonte de infecção para os

hospedeiros invertebrados, confirmando a sua importância na manutenção da transmissão

da infecção para o homem, sendo encontrado em todos os focos da doença humana,

caracterizando o principal elo na cadeia de transmissão da LV (Deplazes et al., 1995; Maia

et al., 2010).

O processo de expansão geográfica e urbanização da LV têm levado à necessidade

de se estabelecer medidas mais eficazes de controle. Hoje as estratégias de controle são

centradas no diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos, redução da população

de flebotomíneos no peri e intradomicilio, eliminação dos reservatórios e atividades de

educação em saúde. Além disso, o Programa de Controle da Leishmaniose Visceral

(PCLV) busca uma melhor definição das áreas de transmissão ou de risco e propõe ações

de vigilância para os municípios considerados silenciosos (Tesh, 1995).

O tratamento da LVC vem sendo estudado por vários pesquisadores, desde a

descoberta de que LV humana e canina são causadas pelo mesmo agente (Oliva et al.,

2004). Entretanto, as drogas leishmanicidas usadas com sucesso na terapia da LV humana,


8

tem se mostrado de eficácia controversa no tratamento da LVC. Este fato sustenta a

posição da OMS que não recomenda a terapia antimonial convencional em cães

naturalmente infectados por Leishmania infantum (WHO, 2010). Além disto, tem sido

descrito que o uso de fármacos anti-Leishmania em cães, induz a remissão temporária dos

sinais clínicos, mas não previne a ocorrência de recidivas, por não levar a cura

parasitológica, o que pode acarretar séria consequência no âmbito epidemiológico, como

desenvolvimento de cepas resistentes a estes fármacos (Baneth et al., 2002; Moreno et al.,

2002; Oliva et al., 2004).

Diante do exposto, fica clara a necessidade do estabelecimento de um modelo

experimental que possa contribuir em estudos de terapêutica e imunoprofilaxia contra a LV

humana e canina (Nieto et al., 2011; Reis et al., 2010). Isto poderia subsidiar estudos que

possam contribuir diretamente com as estratégias de controle da LV em nosso país e no

mundo. Neste sentido, destaca-se em importância o modelo experimental hamster, que é o

foco central deste estudo.

2.2 Aspectos imunopatológicos e curso da infecção em modelos experimentais na LV

Na leishmaniose a resposta imune protetora é mediada pela imunidade celular e

resulta na morte do parasito por macrófagos ativados Scott (2003). A utilização de modelos

experimentais em estudos da leishmaniose tem apontado questões importantes relacionadas

à evolução da doença e desenvolvimento da resposta imune de resistência e

susceptibilidade. Assim, estes modelos têm admitido a avaliação de componentes do

sistema imune envolvidos na resolução da infecção e permitido obter e ampliar as

perspectivas e propor novas estratégias terapêuticas e vacinais (Hommel et al., 1995;

Carríon et al., 2006). Entretanto, os mecanismos que influenciam o direcionamento da

resposta imune ainda precisam ser esclarecidos no modelo hamster. Evidências sugerem

que, fatores como as citocinas presentes no meio durante os eventos iniciais da

diferenciação celular, a interação com células apresentadoras de antígeno (que podem

preferencialmente apresentar diferentes classes de antígenos) podem comprometer esse

processo durante a infecção por Leishmania.

Modelos experimentais como o cão e o hamster geralmente exibem diversos sinais

clínicos tipicos de LV durante a infecção experimental, à semelhança da doença humana;

em contrapartida, camundongos apresentam poucos ou nenhum sinal (Melby et al., 2001;

Requena et al., 2000; Garg & Dub, 2006; Carríon et al., 2006; Nieto et al., 2011). A


9

condição de susceptibilidade ou de resistência em cada animal é controlada por fatores

genéticos próprios, mas também é característica de cada espécie de Leishmania (Hommel

et al., 1995; Nieto et al., 2011). Sabe-se que a evolução da doença visceral experimental é

dependente de uma série de fatores. Dados indicam que a capacidade de infectividade do

parasito, as vias de inóculo e a dose utilizada, bem como a forma biológica do parasito

(amastigota e promastigota) podem influenciar no curso da história natural da LV

experimental. Estes aspectos dificultam a seleção de um modelo experimental ideal, que

seja capaz de reproduzir a doença na sua forma visceral exibindo diferentes manifestações

clínicas e evoluindo da forma aguda a crônica (Melby et al., 1998; Kaye et al., 2004;

Carríon et al., 2006). Entretanto, a influência do inóculo é particularmente importante em

modelos experimentais e uma variedade de vias tem sido utilizada. Embora as vias

subcutânea e intradérmica sejam as mais próximas do que ocorre naturalmente, são poucos

os estudos com a sua utilização (Miralles et al., 1994; Handman, 2001; Rolão et al., 2007).

Nas infecções experimentais da LV, as vias intracardíaca e intraperitoneal, são as mais

empregadas para inoculação dos parasitos. A maioria dos estudos que empregam o modelo

hamster e mesmo camundongos utiliza preferencialmente as formas promastigotas do

parasito para compor a infecção experimental.

Considerando os diferentes modelos existentes nos estudos da LV experimental, o

camundongo Balb/c e o hamster (Mesocricetus auratus) tem sido os mais utilizados (Garg

& Dube, 2006). Em camundongos Balb/c a infecção por Leishmania pode variar

consideraravelmente em diferentes órgãos (baço e fígado) no mesmo animal (Engwerda &

Kaye, 2000).

Neste sentido, camundongos Balb/c são geralmente utilizados para estudar a doença

visceral devido à sua susceptibilidade. Entretanto, em camundongos infectados com L.

donovani ou L. infantum a LV crônica é estabelecida com sucesso após a infecção

endovenosa ou intradérmica, mas estes não reproduzem as características da LV humana

ou canina ativa. Neste sentido, embora a infecção progrida clinicamente durante as duas

primeiras semanas após o desafio, o parasito é controlado pela resposta imune do

hospedeiro, possivelmente devido a uma resposta do tipo 1 inerente a estes camundongos

que é montada após o inóculo experimental (Nieto et al., 2011). Desta forma, acredita-se

que seja determinante para o padrão auto-resolutivo do curso da infecção por Leishmania

no modelo murino a produção de IFN-γ pelas células T (Murray et al., 1982; Engwerda &

Kaye, 2000; Zanin et al.,2007; Nieto et al., 2011) estimuladas por uma produção elevada


10

de IL-12 (Murray, 1997). Além disto, a geração de óxido nítrico sintase induzida (iNOS)

por IFN-γ seria um dos mecanismos efetores crítico envolvido no controle da replicação do

parasito (Stenger et al.,1994).

Este curso auto-limitante da LV no modelo murino pela infecção por L. donovani

ou L. infantum tem sido considerado um bom modelo de replicação inicial do parasito,

seguido por controle imunológico e infecção subclínica, mas não é um bom modelo para a

progressão da doença capaz de reproduzir a história natural da LV humana e/ou canina

ativa (Melby et al., 2001). As diferenças entre a carga parasitária no fígado, baço e medula

óssea após a infecção tem se mostrado como importante marcador de susceptibilidade e

resistência no modelo murino (Kaye et al., 2004). Na maioria das linhagens de

camundongos, os parasitos são eliminados do fígado, e a resistência à infecção hepática

resulta de uma resposta coordenada do hospedeiro envolvendo uma variedade de vias

efetoras e reguladoras específicas dentro das estruturas definidas, os granulomas.

Entretanto, os parasitos persistem no baço e medula óssea por mecanismos que ainda não

são totalmente compreendidos. Sugere-se que a persistência do parasito no baço esteja

realacionado a um defeito na formação de granulomas, acompanhada por uma variedade de

alterações patológicas, incluindo esplenomegalia, destruição da microarquitetura do tecido

linfóide e atividade hematopoiética aumentada (Kaye et al., 2004). Estudos experimentais

em camundongos utilizando a via intracardíaca de infecção, tem mostrado que o controle

da infecção no fígado provavelmente esteja relacionado a síntese de IFN- γ e TNF-α,

enquanto que a progressão da infecção no baço, a síntese inadequada destas citocinas

principalmente IFN- γ durante o estágio inicial da infecção (Mukherjee et al., 2003).

Buscando avaliar biomarcadores de susceptibilidade e resistência na LV no modelo

BALB/c foi possível determinar que tanto IFN-γ como IL-2 são fatores chave para o

desenvolvimento de uma resposta imune protetora. Contrariamente as descobertas em

modelos de leishmaniose cutânea, a IL-4 não parece ser importante fator em mediar à

susceptibilidade na LV. Outra citocina, a IL-10 com perfil anti-inflamatório e

imunomodulador, encontrada na infecção ativa também pode estar relacionada à

susceptibilidade no BALB/c assim como no homem (Goto et al., 2004). Modelos

experimentais tem claramente demonstrado o papel central desempenhado pela IL-10 na

imunopatologia e persistência de parasitos durante a história natural da LV (Kane et al.,

2001; Murphy et al., 2001). Esta citocina suprime muitas funções de células NK e de


11

células T por inibir a apresentação de antígenos e a produção de citocinas proinflamatórias

como IFN-γ e IL-12 (Trinchieri et al., 2007; Nylén & Sacks et al., 2007).

A citocina TGF-β também tem revelado importante papel na modulação de

moléculas co-estimulatórias na LV murina (Gomes et al., 2000). Estudos mostraram que

TGF-β inibe a produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos de camundongos infectados

por via intracardíaca, sugerindo que sobrevivência de parasitos no baço destes animais

esteja relacionada à elevada síntese desta citocina (Mukherjee et al., 2003).

Entretanto, a infecção experimental do hamster dourado reproduz vários aspectos

da doença humana e canina, tais como: pancitopenia marcada por leucopenia e anemia,

caquexia, hipergamaglobulinemia e ausência de resposta de células T Leishmania-

específicas após a infecção experimental (Bunn-Moreno et al., 1985; Gifawesen et al.,

1989; Mathias et al.,2001). Sendo assim, esta última disfunção tem sido atribuída à

incapacidade de células apresentadoras de antigéno (APCs) em estimular células T

específicas (Fruth et al., 1993). Isto tem sido considerado por diversos pesquisadores como

elemento chave na progressão da LV no modelo hamster, o que poderia reproduzir a forma

grave da doença humana bem como a LVC (Rodrigues et al., 1998, Vasconcellos et al.,

1996; Nieto et al., 2011). Portanto, apesar de uma forte produção de citocinas Tipo 1 (IL-2,

IFN-γ, e TNF-α) no fígado, baço e medula óssea destes animais, há replicação

descontrolada do parasito, conduzindo a um padrão de doença progressiva neste modelo

(Melby et al., 2001). Por outro lado, a produção de citocinas proinflamatórias durante a LV

ativa, não é um achado exclusivo de hamster, sendo também já demonstrado por alguns

pesquisadores em esplenócitos de cães com elevação de INF-γ simultaneamente a IL-10

(Lage et al., 2007) e em células mononucleares do sangue periférico de pacientes com LV

(Peruhipe-Magalhães et al., 2006).

Neste sentido, a hipoplasia da polpa branca do baço, granulomas hepáticos e a

deposição de substância amilóide secundária tanto no baço como no fígado tem sido

relatada como as principais características histopatológicas detectadas durante a LV

experimental em hamster (Wilson et al., 1987; Riça-Capela et al., 2003). Também foi

demonstrado que a infecção visceral em hamsters induz alterações nos hepatócitos,

principalmente no sistema endomembrana e compartimento peroxissomal, levando a

distúrbios no metabolismo do fígado (Vianna et al., 2002). Estudos recentes realizados por

Nieto et al. (2011) mostraram que após a infecção por L. infantum por via intracardíaca,

hamsters exibiram alterações histopatológicas graves tanto no baço quanto no fígado com o


12

aumento da carga parasitária. Entre essas alterações, detectou-se a presença de granulomas

hepáticos em diferentes estágios de maturação, granulomas com células gigantes

parasitadas por amastigotas, assim como destruição da arquitetura esplênica a qual foi

acompanhada por uma depleção linfóide. Além disso, Mathias et al. (2001) demonstraram

que o aumento na carga parasitária no baço e fígado e dos níveis de anticorpos em

hamsters infectados com amastigotas de L. infantum aumentou progressivamente com a

evolução da infecção.

A LV experimental é marcada pelo desenvolvimento de uma resposta imune órgão-

específica, sendo o fígado e baço os principais órgãos alvos atingidos (Rousseau et al.,

2001). O fígado é resistente a reinfecção, apresenta poucos danos teciduais, sendo um local

onde a resolução da infecção aguda está associada ao desenvolvimento de granulomas

inflamatórios em torno das células de Kupffer (Stanley & Engweda, 2007). Neste sentido,

uma resposta imune eficiente em infecções por Leishmania no fígado depende da formação

destes granulomas, processo dependente da produção de quimiocinas, subsequente

recrutamento de monócitos e neutrófilos, além de linfócitos T CD4+e T CD8+ e produção

de citocinas inflamatórias gerando ativação das células infectadas (Murray et al., 2000;

Stanley & Engweda, 2007). Vale ressaltar que as células de Kupffer, macrófagos

encontrados no fígado são os principais alvos para infecção por Leishmania, possivelmente

secretam quimiocinas incluindo CCL3 (MIP-1α), CCL2 (MCP-1) e CXCL10 (IP-10) após

a infecção experimental, resultando no recrutamento inicial de monócitos e neutrófilos,

críticos no controle efetivo do crescimento do parasito (Smelt et al., 2000).

Segundo Giunchetti et al. (2008c) as principais alterações histopatológicas

observadas no compartimento hepático de cães com LV, são inflamação da cápsula,

inflamação portal, hipertrofia e hiperplasia das células de Kupffer e presença de granuloma

intralobular hepático. Em um estudo realizado com cães com classificação clinica definida

de regiões endêmicas para LV no Brasil, foram observados granulomas de tamanhos

variáveis e estes eram constituídos por macrófagos, parasitados ou não, com formas

amastigotas de L. infantum, algumas células epitelióides, pequeno número de linfócitos e

plasmócitos, e raros neutrófilos (Sant’Ana et al., 2007). Este estudo demonstrou que, cães

assintomáticos apresentaram maior número de granulomas do que os animais

oligossintomáticos e sintomáticos (Sant’Ana et al., 2007). Estudos experimentais em

modelos murinos têm mostrado que, embora o fígado seja resistente à reinfecção após a

cura, o baço mostra nenhuma proteção contra reinfecção (Murray et al., 1992; Engwerda &


13

Kaye, 2000; Rousseau et al., 2001). Os parasitos infectam o baço em período mais tardio,

proliferando mais lentamente neste e na medula óssea, onde podem persistir por toda a

vida do animal (Engwerda & Kaye, 2000).

O baço desempenha um papel central na LV, pois é um sítio inicial para a geração

de resposta imune específica contra o parasito mediada por células, podendo se tornar

também um local de persistência do parasito apresentando inúmeras alterações

imunopatológicas. O baço é um órgão linfóide muito parasitado, representando um local de

interação entre a resposta do parasito e o sistema imune do hospedeiro. Esse cenário torna

o baço um importante órgão para analisar as alterações imunológicas, que levam à

disfunção da imunidade celular e à ativação de uma resposta humoral ineficaz, que são de

extrema importância na patogênese da LV (Riça-Capela et al., 2003; Santana et al., 2008).

A persistência do parasito é acompanhada por um defeito na formação do granuloma

esplênico, esplenomegalia, alteração da microarquitetura do tecido linfóide incluindo

folículos e zona marginal. O desenvolvimento das alterações histopatológicas do baço vem

sendo associado aos altos níveis de TNF-α e IL-10, simultaneamente. Neste contexto,

Stanley & Engwerda (2007) relataram que parece existir certo equilíbrio imunológico

determinando respostas que efetivamente promoverão a eliminação do parasito no fígado e

a persistência da infecção no baço.

Na leishmaniose visceral canina (LVC) os parasitos induzem uma desorganização

na estrutura celular do órgão, com a hiperplasia da polpa branca e polpa vermelha,

formação de granulomas e atrofia de folículos linfóides, que determinam a esplenomegalia

em diversos graus. A esplenomegalia parece estar associada, também, ao aumento de

células do órgão, em especial no número de monócitos e macrófagos, juntamente com

alterações na estrutura da microvasculatura e aumento do número das fibras reticulares

(Santana et al., 2008).

Diante do exposto, faz- se necessário um estudo mais detalhado da LV, com ênfase

especial nas alterações da arquitetura esplênica e hepática, bem como a investigação dos

perfis de citocinas no modelo hamster buscando evidenciar semelhanças e diferenças entre

estas alterações e biomarcadores com a doença humana e canina.


14

2.3 O hamster como modelo experimental na leishmaniose

O hamster (Mesocricetus auratus) é uma espécie também conhecida como hamster

sírio dourado ou esquilo libanês porque sua origem é de uma região no norte da Síria perto

do rio Eufrates, chamado Aleppo. O hamster sírio dourado foi descrito como uma nova

espécie e originalmente nomeado “Cricetus auratus” por Walterhouse em 1839

(Walterhouse, 1840) e por razões desconhecidas no início da década de 20 ele foi

considerado extinto em seu ambiente natural. A sua utilização como modelo experimental

para estudos na LV advém da descoberta da susceptibilidade à infecção por L. donovani,

fato observado inicialmente por Yong et al. (1919) ao utilizar o hamster chinês (Cricetulus

griseus) em estudos do Kala-azar no norte da China, momento em que demonstrou vários

aspectos importantes da patologia. No final de 1920 Dr. Saul Adler famoso médico

tropicalista da Universidade Hebraica de Jerusalém foi estudar o calazar indiano. O único

modelo experimental adequado para tal naquela época era o hamster chinês. Entretanto,

este modelo tinha que ser importado do oriente e não reproduzia em cativeiro. Devido a

necessidade de um modelo para uso experimental surgiu a idéia de obter o “Cricetulus

phaeus”, um parente próximo do hamster chinês.

Em 1930, o Professor Aharoni, catedrático do Departamento de Zoologia da

Universidade Hebraica de Jerusalém, foi em uma expedição à Síria e concordou em coletar

e fornecer espécimes de “Cricetulus Phaeus” para a pesquisa do Dr. Saul Adler. Neste

mesmo ano ele coletou uma fêmea de hamster dourado com sua ninhada e apresentou a

Benachen na Universidade Hebraica. Um mês após, Benachen conseguiu produzir as

primeiras ninhadas, nascidas em cativeiro. Depois disso, uma colônia foi estabelecida no

laboratório. Dr. Saul Adler, rapidamente percebeu a importância do estabelecimento e

manutenção do hamster sírio em condições de laboratório. Alguns dos exemplares desta

linhagem foram enviados para diversos países (Inglaterra, França, Reino Unido e Estados

Unidos), afim de evitar problemas com a perda da colônia. As espécies facilmente

adaptáveis a países ocidentais tornaram-se mais comuns entre todos os hamsters (Adler,

1948). Hoje em dia, todos os animais existentes das espécies de hamsters são descendentes

dessa linhagem criada em Jerusalém (Adler, 1989).

Desde a sua descoberta, o animal tem sido largamente empregado na manutenção

de parasitos, nos estudos de seus ciclos biológicos e da relação parasito-hospedeiro

(Pearson et al., 1990). Em 1931, após um ano de criação, Adler e Theodor introduziram o

hamster “Mesocricetus auratus” na comunidade científica. Dentre os inúmeros


15

protozoários, Leishmania infantum foi o primeiro parasito a ser experimentalmente

inoculado neste animal e, com êxito obtiveram a infecção do hamster para seus estudos do

calazar indiano. Ele foi rapidamente aceito e posteriormente utilizado como animal

experimental em diversos trabalhos, como estudos em febre amarela (Findlay, 1934), sífilis

(Bessemans & De Wilde, 1935), brucelose (Hoffman et al., 1968), hanseníase (Adler,

1937), pneumonia virótica (Pearson & Eaton, 1940) e tuberculose (Tchernomoretz et

al.,1940).

Desde então, o hamster “Mesocricetus auratus” se estabeleceu junto a diversos

modelos (gato, camundongo, rato, coelho e cão) como um trunfo importante entre os

animais comumente usados em trabalhos experimentais. Bruce e Hindle (1934) elegeram o

hamster como um excelente modelo para estudos em leishmaniose. Antes de 1954, foram

estudados praticamente todos aspectos da relação parasito-hospedeiro infectados por cepas

do complexo donovani, o que proporcionou uma vasta bibliografia, cobrindo aspectos

relacionados com a clínica, biologia, fisiologia, imunologia, patologia, diagnóstico e

terapêutica (Magalhaes, 1954). Aproximadamente em 1963 a utilização do hamster em

estudos da área microbiológica, odontológica e parasitológica começou a declinar, mas

estavam sendo ainda ativamente usados na pesquisa de câncer e fisiologia reprodutiva

(Magalhaes, 1968). Um estudo sistematizado do hamster em relação a outros animais foi

publicado em 1958 por Stauber. Neste trabalho, o hamster foi considerado, ao lado do

chinchila (Chinchila laniger), como extremamente susceptível à infecção por Leishmania,

ao contrário de ratos brancos e coelhos, que são resistentes a infecção (Stauber et al.,

1958).

A bolsa alimentar do hamster foi utilizada em um trabalho pioneiro para estudos da

relação parasito-hospedeiro e foi consagrado bom modelo para estudos experimentais com

Leishmania (Michalick, 1996). Neste sentido, Michalick (1996) avaliou duas espécies de

Leishmania pertencentes aos complexos braziliensis e mexicana. Neste estudo, foi

inoculado promastigotas de L. braziliensis e L. amazonensis na porção terminal da bolsa

alimentar e na pele do focinho do hamster. Resultados demonstraram que L. braziliensis,

além de determinar a infecção de ambos os locais foi capaz de disseminar para os

linfonodos, baço, fígado e pele com aumento dos níveis de IgG independente do local de

ínóculo. Em contrapartida, L. amazonensis não foi infectante para este sítio embora na pele

do focinho do animal tenha mostrado evolução clínica.


16

O hamster apresenta características clínico-patológicas da LV que se assemelha a

doença humana ativa. A infecção sistêmica do hamster com amastigotas de L. donovani

resulta em aumento na carga parasitária tecidual (baço e fígado), caquexia,

hepatoesplenomegalia, pancitopenia, hipergamaglobulinemia e consequente morte

(Pearson et al., 1990). Estudos realizados por Melby et al. (2001) mostraram aumento da

carga parasitária em órgãos viscerais (baço, fígado e medula óssea) de hamsters após a

infecção com promastigotas de L. donovani. Embora detectada uma forte expressão de

citocinas Th1 (IL-2 e IFN-γ) no fígado, baço e medula óssea, a replicação de parasitos

nestes sítios levaram a uma doença progressiva, onde não foi detectada expressão de

mRNA para a enzima iNOS. Além disto, foi observada produção de TGF-β e IL-10, que

possivelmente estariam agindo na inibição dos macrófagos na geração de NO,

possibilitando a evolução da doença neste modelo experimental (Melby et al., 2001).

Além disto, estudos avaliando a cinética histopatológica da celularidade na pele

de hamsters infectados por L. donovani foram importantes para ampliar a compreensão dos

aspectos imunopatológicos envolvidos nos eventos iniciais do estabelecimento da infecção.

Neste sentido, Wilson et al. (1987) observaram que o inóculo de promastigotas de L.

donovani em hamster por via intradérmica, proporcionou a ocorrência de um infiltrado

inflamatório caracterizado por presença de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares

após 24 horas do inóculo, com uma modificação 48 horas após o inóculo, passando a

observar então predomínio de células mononucleares (Wilson et al., 1987). Neste estudo, a

formação do granuloma foi observada entre a quarta e sexta semana após a infecção, com

predomínio de células gigantes, células epitelióides, eosinófilos e parasitos no interior de

macrófagos levando a ocorrência de necrose (Wilson et al., 1987). Este perfil do infiltrado

inflamatório dérmico seria compatível com a multiplicação de L. donovani no local do

inóculo, com subsequente visceralização do parasito e evolução da doença no modelo

hamster.

A formação do granuloma foi à principal alteração histopatológica observada no

pulmão, intestino e em especial no fígado de hamsters experimentalmente infectados com

promastigotas de L. infantum por via intradérmica (Mangoud et al., 1997). Neste estudo

observou-se que o infiltrado inflamatório no espaço porta teve início quando surgiram os

primeiros granulomas, aleatoriamente distribuídos no parênquima. Com a evolução da

infecção os granulomas mostraram-se aumentados em número e tamanho constituídos

principalmente por macrófagos com áreas de necrose e poucos linfócitos. Embora não


17

tenha sido observado aumento significativo de granulomas no pulmão e intestino nas duas

últimas semanas de infecção, a lâmina própria do intestino e placas de Peyer apresentaram-

se infiltradas por macrófagos parasitados causando a ulceração da mucosa (Mangoud et al.,

1997).

A fim de avaliar a sequência da formação de granulomas hepáticos após a

infecção com amastigotas de L. infantum por via subcutânea, Laurenti et al. (1990)

demonstraram a presença de infiltrado inflamatório com muitos parasitos 7 e 15 dias após a

infecção. Neste estudo, foi observada formação inicial do granuloma após 30 dias do

inóculo com a presença de granulomas epitelióides bem definidos contendo poucos

neutrófilos entre os macrófagos e poucos parasitos após 45 dias da infecção. Neste mesmo

período foram observadas células gigantes com citoplasma contendo corpos de

Schaumann. Estes resultados apontam o importante papel do granuloma na tentativa de

controlar a infecção no sítio do inóculo, indicando que a disseminação do parasito deve

ocorrer nos primeiros 45 dias, antes do estabelecimento dos granulomas.

Em outro estudo, foi avaliada a migração de parasitos para órgãos viscerais de

hamsters após a infecção subcutânea de 107 promastigotas de L. infantum (Corbett &

Laurenti, 1998). Estes autores mostraram macrófagos parasitados no linfonodo poplíteo

logo nas primeiras 2-24 horas após a infecção, sugerindo que existe uma migração de

parasitos da pele para o linfonodo com persistência e replicação inicial nos mesmos, antes

da disseminação para outros órgãos.

Vale ressaltar que a susceptibilidade do hamster à infecção por Leishmania

depende de alguns fatores do hospedeiro (sexo e idade), os quais desempenham papel

importante na modulação do sistema imune (Anuradha, et al., 1990; Singh, et al., 2007).

Deste modo, os hormônios sexuais, tais como andrógenos, estrógenos e progesterona

podem interagir diretamente com as células do sistema imunológico, afetando assim o

desenvolvimento da resposta imune. Neste contexto, macrófagos e linfócitos, os dois

principais tipos celulares envolvidos na resposta imune frente à infecção por Leishmania,

possuem receptores para os hormônios sexuais. Assim, macrófagos e células T possuem

receptores de andrógeno (Cutolo et al., 1996; Benten et al., 1999; Wunderlich et al., 2002),

receptores de estrógeno (Cutolo et al., 1996) e progesterona (Piccinni et al., 2000; Jones et

al., 2008). Com base nestes dados, não é surpreendente inferir que o sexo pode de certo

modo afetar o curso da infecção por Leishmania (Snider et al., 2009). Corroborando com

esta hipótese, o estudo realizado por Travi et al. (2002) mostrou que hamsters machos


18

infectados com L. (V.) panamensis eram mais susceptíveis à infecção, apresentavam lesões

maiores e mais graves e maior carga parasitária em linfonodos, comparados as fêmeas.

Neste sentido, a doença mais grave em hamsters machos foi associada ao aumento da

produção das citocinas IL-4, IL-10 e TGF-β, que favorecem um microambiente favorável a

manutenção e replicação do parasito no hospedeiro. De forma semelhante, Anuradha et al.

(1990) verificaram que hamsters machos infectados com L. donovani são mais susceptíveis

à doença e apresentam maior carga parasitária em relação as fêmeas. No entanto, o papel

dos hormônios sexuais específicos na exacerbação da doença/resistência é um fator que

precisa ser mais estudado.

Poucos estudos da infecção experimental utilizando L. infantum no modelo hamster

tem sido realizados e geralmente a infecção tem sido avaliada usando tanto formas

amastigotas quanto promastigotas destes parasitos (Bories et al., 1998; Rica-Capela et al.,

2003). Sabe-se que a via de inóculo é um fator determinante no curso da infecção e de uma

maneira geral, o desafio de hamsters com L. infantum e L. donovani é realizado pela via

intraperitoneal ou intracardíaca geralmente com 107-108 parasitos, um número

relativamente elevado. A infecção é geralmente estabelecida em todos os animais, mas a

disseminação do parasito e o desenvolvimento de sinais clínicos da doença dependem da

concentração de parasitos no inóculo e da via utilizada (Binhazim et al., 1993; Requena et

al., 2000; Rica-Capela et al., 2003, Kaye et al., 2004). A infecção de hamsters utilizando a

via intracardíaca, com L. donovani, foi demonstrada por Stauber (1955, 1958), em um

estudo pioneiro. Neste estudo foi demonstrado que o inóculo utilizando a via intracardíaca

geralmente induz infecções reproduzíveis enquanto a intraperitoneal promove resultados

mais variáveis (Stauber, 1955, 1958). Entretanto, a preparação e administração de inóculo

pela via intracardíaca é um procedimento que requer treinamento para ser realizado

(Wyllie et al., 2006; Dea Ayuela et al., 2007).

Estudo recente foi realizado em hamster utilizando a veia safena para inóculo de

promastigotas de L. chagasi, com o objetivo de determinar a aplicabilidade desta via de

infecção experimental em relação à via intracardíaca. Resultados mostraram êxito na

infecção em quase 100% dos hamsters avaliados (Lei et al., 2010). Por outro lado, a

facilidade na realização da infecção utilizando a via intraperitoneal, tem sido pré-requisito

para sua preferencial utilização (Ott et al., 1967). Em um estudo comparativo realizado por

Wyllie et al. (2006), utilizando as vias intraperitoneal e intracardíaca na infecção de

hamsters com amastigotas de L. donovani, consideraram a via intraperitoneal como a via


19

de escolha por ser mais simples de ser utilizada, uma vez que ambas as vias foram capazes

de promover sinais clínicos nos animais. Assim, embora a infecção pela via intracardíaca

tenha induzido uma infecção mais rápida, hamsters infectados pela via intraperitoneal

demonstraram maior número de parasitos no baço.

O curso da infecção experimental utilizando diferentes doses (103-107) de L.

donovani em hamster inoculados por via intraperitoneal foi demonstrado em um trabalho

publicado por Ott et al. (1967). Neste estudo, o tempo médio de morte foi comparado a

outro estudo utilizando a via intracardíaca de infecção, Stauber (1955, 1962). Os resultados

demonstraram que em ambas as vias, o tamanho da dose inoculada é inversamente

proporcional ao tempo médio de morte. Além disso, para qualquer inóculo o tempo médio

de morte foi maior quando os parasitos foram inoculados pela via intraperitoneal a via

intracardíaca. Em outro estudo empregando-se a mesma via de inóculo (intracardíaca) e

um grande número de formas amastigotas de L. infantum (107) de origem canina,

resultaram na reprodução da LV no hamster, com elevada carga parasitária no fígado no

início da infecção em relação ao baço, hepatoesplenomegalia, caquexia e reações

inflamatórias granulomatosas (Benhazim et al., 1993).

Outro estudo com hamsters infectados utilizando um número variável (103-105) de

promastigotas de L. infantum, realizado por Requena et al. (2000) verificaram a existência

de uma associação entre a quantidade de parasitas inoculados e a sintomatologia clínica

bem como os parâmetros imunológicos. Sendo assim, alguns dos animais apresentaram

infecções subclínicas, mantendo-se assintomáticos, enquanto outros inoculados com igual

número de parasitos desenvolveram infecções sintomáticas, com sinais imunológicos e

clínicos evidentes. Dea Ayuela et al. (2007) afim de estabelecer parâmetros

imunobiológicos para teste in vivo de novos compostos antileishmanicidas, infectaram

hamsters utilizando alta (107) e baixa (105) dose de formas promastigotas de L. infantum

pela via intracardíaca. Os resultados deste estudo mostraram o estabelecimento da infecção

independente da dose administrada, porém com evolução mais rápida da doença nos

animais inoculados com alta dose (107), com sinais clínicos evidentes três meses após a

infecção e elevada carga parasitária esplênica. Estes resultados demonstram que altas doses

utilizando formas promastigotas metacíclicas por via intracardíaca, induzem infecção

sintomática em todos os animais, permitindo o estabelecimento de grupos uniformes para

tratamentos, de acordo com a condição clínica e seus constituintes.


20

Rica-Capela et al. (2003) realizaram um estudo comparativo empregando formas

amastigotas e promastigotas de L. infantum inoculadas por via intraperitoneal em hamsters,

a fim de avaliar a infectividade e virulência. Estes autores observaram que em comparação

a infecção com promastigotas, o desafio com amastigotas leva a um aumento mais rápido

da carga parasitária tanto no baço quanto no fígado, sendo o baço o primeiro órgão a

revelar o parasito, sugerindo uma invasão precoce deste na infecção visceral. Além disto,

foi relatado que a presença de alguns sinais clínicos como ascite, anemia e caquexia era

independente da forma de infecção utilizada.

A distribuição do parasito em diferentes órgãos de hamsters inoculados com

amostras de medula óssea de pacientes com LV por via intraperitoneal, foi mostrada

recentemente por Oliveira et al. (2011). Os resultados obtidos por estes autores

confirmaram a indução de esplenomegalia, hepatomegalia, perda de peso e ascite, com a

presença do parasito no baço e fígado de todos os animais, além de 83,3% apresentarem

formas amastigotas no encefálo. Poot et al. (2006) infectaram hamsters com promastigotas

de L. infantum e testaram diferentes doses (108, 106, 104 e 102) e vias de inóculo

(intradérmica, intraperitoneal e subcutânea) a fim de determinar a melhor estratégia para

estudos de eficácia vacinal. Os resultados demonstraram que o desafio com alta dose de L.

infantum resultaram na disseminação do parasito independente da via de infecção. Além

disto, sinais clínicos não foram observados, mas os parasitos foram detectados facilmente

em culturas de baço, fígado, linfonodo e medula óssea.

Estes diferentes estudos que procuraram definir aspectos relacionados à infecção

experimental em hamster podem contribuir com a realização de ensaios pré-clínicos para

teste de estratégias vacinais na LV, empregando-se este modelo experimental. Neste

sentido, estudos conduzidos por Gomes et al. (2008), demonstraram que a imunização de

hamsters com plasmídeo que codifica uma proteína da saliva do vetor Lutzomyia

longipalpis, LMJ19, foi capaz de induzir proteção contra a infecção por L.infantum.

Kumari et al. (2008) avaliaram o desempenho da imunogenicidade de frações solúveis de

promastigotas de L. donovani como vacina de subunidades em hamster. Dentre as sete

frações testadas de 97.4-68 kDa, quatro administradas individualmente ou em subgrupos,

estimularam intensa resposta Th1, óxido nítrico, IFN-γ e IL-12 (Kumari et al., 2008).

Neste sentido, considerando a comprovada susceptibilidade do hamster

(Mesocricetus auratus) a diferentes espécies de Leishmania e por desenvolver sinais

clínicos e alterações histopatológicas semelhantes aos observados na LV canina e humana,


21

o presente estudo propõe a avaliação da infecção experimental neste modelo utilizando

diferentes vias de inóculo (intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca) e cepas de L.

infantum (PP75 e selvagem) apresentando diferentes graus de virulência e patogenicidade,

empregando análises histopatológicas, bioquímica/hematológicas, imunológicas e

parasitológicas.

3. JUSTIFICATIVA

Moreira, N. D. Justificativa

23

A LV é considerada um grave problema de saúde pública, pois o tratamento de

escolha desta doença emprega a mesma droga utilizada desde o início do século passado,

extremamente tóxica, e que já vem apresentando diferentes níveis de eficácia em várias

regiões do mundo. Um agravante importante, consiste no fato de não haver ainda uma

vacina que possa ser empregada em programas de controle da LV. Desse modo, a busca

por novas estratégias terapêuticas e/ou imunoprofiláticas que favoreçam o controle do

parasito torna-se de grande relevância em doenças negligenciadas como a LV. No entanto,

uma das grandes limitações para os ensaios pré-clínicos destinados ao teste de esquemas

terapêuticos ou vacinais contra LV consiste na avaliação empregando-se modelos

experimentais que reproduzam o curso progressivo da história natural da infecção. Neste

sentido, destaca-se o hamster como modelo experimental que mimetiza tanto a evolução da

doença humana como canina, podendo desta forma ser empregado em ensaios pré-clínicos

para triagem de novos fármacos ou candidatos vacinais contra LV. Neste contexto, o

presente estudo buscou estabelecer e ampliar o conhecimento de biomarcadores de

prognóstico e monitoração da infecção experimental no modelo hamster. Esta estratégia

permitirá agregar a este modelo novas abordagens investigativas no âmbito das alterações:

anatomoclínicas, bioquímico-hematológicas, histopatológicas, parasitológicas e

imunológicas (resposta celular e humoral), aumentando a amplitude laboratorial nas

avaliações terapêuticas ou vacinais contra LV em ensaios pré-clínicos. Desta forma, o

presente estudo foi determinante para obter uma caracterização detalhada da infecção

experimental do hamster empregando-se num âmbito global análises imunopatológicas que

pretendem subsidiar estudos pré-clínicos com vistas a futuras estratégias terapêuticas e

vacinais contra LV humana e canina.

4. OBJETIVOS

Moreira, N. D. Objetivos

25

4.1 Objetivo geral

• Estudar a história natural da leishmaniose visceral em hamsters (Mesocricetus

auratus) experimentalmente infectados por duas cepas de Leishmania infantum

com perfis distintos de virulência e patogenicidade.

4.2 Objetivos específicos

Nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após infecção com promastigotas de L.infantum,

selecionar o melhor protocolo de infecção experimental em hamster (Mesocricetus

auratus) empregando diferentes vias de inóculo: intradérmica, intraperitoneal e

intracardíaca e duas cepas de L.infantum: MHOM/BR/74/PP75 e Selvagem com a

finalidade de:

• Avaliar a taxa de sobrevida nos diferentes modelos experimentais;

• Avaliar a presença de sinais clínicos;

• Avaliar os níveis de IgG-total;

• Avaliar os parâmetros hematológicos e bioquímicos;

• Determinar as alterações histopatológicas no fígado e no baço;

• Determinar o parasitismo no fígado e baço;

• Determinar a expressão de mRNA das citocinas IL-10 TGF-β, IFN-γ e TNF-α no

baço.

5. MATERIAL E MÉTODOS

Moreira, N. D. Material e Métodos

27

5.1 Animais

Para realização deste estudo, foram utilizados 320 hamsters (Mesocricetus auratus)

machos, com idade variando de 4-6 semanas e peso corporal de entre 50-80g. Os animais

foram nascidos e criados em racks climatizadas no Setor de Criação e após um mês foram

transferidos para o Setor de Experimentação em hamster do Centro de Ciência Animal

(CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

Os animais foram mantidos em temperatura ambiente e alojados em grupos de oito

animais em gaiolas de plástico com dimensões de 40x30x10cm, forradas com maravalha

autoclavada, sendo oferecidos água e ração comercial ad libitum, diariamente.

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no uso de Animais da

Universidade Federal de Ouro Preto/UFOP, registrado sob o parecer Nº. 009/2009 (Anexo

1).

5.2 Delineamento e protocolo experimental

Para a realização da infecção experimental foram utilizadas duas cepas de L.

infantum, sendo uma de referência da Organização Mundial de Saúde (OMS) e outra

selvagem (C46).

A cepa selvagem foi isolada por pesquisadores de nosso grupo de pesquisa de um

cão assintomático e naturalmente infectado procedente do Centro de Controle de Zoonoses

(CCZ) do Município de Governador Valadares, Minas Gerais. Os parasitos foram isolados

por punção de medula óssea e para o isolamento e crescimento foi utilizado meio

NNN/LIT. Posteriormente os parasitos foram expandidos em meio LIT para

criopreservação e posterior caracterização e estudo de infecção experimental, segundo o

procedimento operacional padrão de cultivo de promastigotas de Leishmania do

Laboratorio de Imunopatologia, NUPEB/UFOP. O diagnóstico sorológico deste animal foi

confirmado por três técnicas: RIFI, ELISA e na imunocromatografia em papel com

antígeno rK39. Além disto, foi realizada análise molecular por meio de PCR-RFLP (de

Andrade et al., 2006; Coura-Vital et al., 2011) dos isolados do parasito e os resultados

desta reação confirmaram infecção por L. infantum em função do perfil de digestão das

bandas originadas a partir do produto obtido na PCR convencional.


28

Desta forma, estudos prévios realizados em nosso laboratório caracterizaram a cepa

PP75 como de baixa virulência e patogenicidade e a cepa Selvagem (C46) com alta

virulência e patogenicidade.

No Fluxograma 01 encontra-se o delineamento experimental deste estudo. Os

animais foram divididos em dois grandes grupos experimentais: um grupo infectado com a

cepa (MHOM/BR/74/PP75; n=120) padrão de L. infantum da OMS e o segundo grupo

infectado com a cepa selvagem (n=120), além de um grupo controle não infectado (C;

n=80). Os dois grandes grupos foram subdivididos em três grupos referentes às vias de

inóculo utilizada: intradérmica (ID), intracardíaca (IC) e intraperitoneal (IP). A dose

empregada foi de 1 x 107 promastigotas de L. infantum em fase estacionária de crescimento

Os hamsters inoculados com ambas as cepas de L. infantum e controles foram necropsiados

(mínimo de n=10 por grupo em cada período de tempo) e avaliados 1, 3, 6 e 9 meses após

a infecção.

Fluxograma 1: Delineamento experimental relacionado ao estabelecimento do modelo de infecção para L.

infantum em hamster, utilizando 3 vias de inóculo: intradérmica (ID); intracardíaca (IC) e intraperitoneal (IP).

1x107 promastigotas de L. infantum

(fase estacionária de crescimento)

320 Hamsters (Mesocricetus auratus)

ID (n

=40)

IC (n

=40)

IP (n

=40)

C (n

=40)

MHOM/BR/74/PP75 n=160

Selvagem (C46) n=160

ID (n

=40)

C (n

=40)

Necropsia

Alterações macroscópicas/ anatomoclínicas

1 3 6 9 meses após a infecção

IP (n

=40)

IC (n

=40)

Hemograma e bioquímica

sérica

Alterações laboratoriais

Avaliação parasitológica (baço e fígado)

Alterações microscópicas

histopatológicas

RespostaImune

Histologia: baço e fígado

Microscopia ótica - LDU

qPCR

IgG-ELISAqRT/PCR- baço (TNF-α, IFN-γ, TGF-β e

IL-10)

Sinais e sintomas


29

5.3 Crescimento in vitro de formas Promastigotas

O crescimento das formas promastigotas de L.infantum das cepas

MHOM/BR/1974/PP75 e selvagem foi realizado a partir de um inóculo inicial padrão de

107 promastigotas/mL em meio LIT acrescido de 10% de soro fetal bovino. Foi realizada

contagem diária dos parasitos por 20 dias em câmara de Neubawer a fim de analisar a

curva de crescimento das respectivas cepas definindo qual o período (intervalo de dias) em

que os parasitos se encontrassem em fase estacionária de crescimento para posterior

retirada e inóculo nos hamsters.

5.4 Parasitos e inóculos

Neste estudo foram utilizadas formas promastigotas de L. infantum em fase

estacionária de crescimento em meio LIT (Liver Infusion tryptose) e NNN (McNeal, Novy

& Nicolle). Para obtenção das formas promastigotas em fase estacionária de crescimento a

cultura foi expandida a partir de um inóculo inicial de 10 mL de meio LIT contendo entre

107 a 108 promastigotas/mL de L. infantum em crescimento logarítmico. As promastigotas

foram adicionadas a 40mL de meio de cultura NNN/LIT, distribuídas em condições

estéreis em capela de fluxo laminar (Veco, Campinas, São Paulo, Brasil), sendo

acondicionada em seguida a temperatura de 23°C ± 1°C. Após sete dias do inóculo inicial,

foi realizado o primeiro repique, depois de constatadas a viabilidade e ausência de agentes

contaminantes com auxílio do microscópio óptico, e distribuídos os 50mL de cultura em 5

novos Erlenmeyers nas mesmas condições do inóculo inicial (10mL de cultura em 40mL

de meio LIT). Ao término dos sete dias, foram obtidos 250mL da cultura, na concentração

de 107 a 108 promastigotas/mL. A cultura foi removida em capela de fluxo laminar e

transferida para tubos estéreis de polipropileno de 50mL (Falcon, Becton Dickinson,

EUA), que foram submetidos à centrifugação a 900 x g durante 15 minutos em temperatura

ambiente. Após descartar o sobrenadante, o sedimento de promastigotas foi

homogeneizado em solução salina estéril (NaCl 0,85%), e em seguida foi realizada a

centrifugação na mesma condição. Este procedimento de lavagem foi repetido por mais 1

vez. Após as etapas de lavagem, realizou-se a contagem do número de promastigotas, as

quais encontravam em quinta (cepa PP75) e sexta (Cepa selvagem) passagem.

Para os inóculos com as cepas (MHOM/BR/74/PP75) e selvagem, foi utilizado à

concentração de 1x107 promastigotas de L. infantum em fase estacionária de crescimento


30

240 Hamsters Mesocricetus auratus

Cepa PP75 ou Selvagem (C46)

1x107 promastigotas de L. infantum

(fase estacionária de crescimento)

Intradérmica IntracardíacaIntraperitoneal

20µL 500µL 200µL

de cultura que foram concentradas em um volume final de acordo com cada uma das três

vias utilizadas como demonstrado no fluxograma a seguir:

Fluxograma 2: Vias de infecção experimental, ilustrando os diferentes inóculos empregados neste estudo: intradérmica (ID), intraperitoneal (IP) e intracardíaca (IC).

5.5 Taxa de sobrevida

Para a determinação da taxa de sobrevida os animais foram acompanhados por um

período de 9 meses, através de visitas diárias onde os animais eram vistoriados, contados e

a taxa de sobrevida determinada.

5.6 Procedimentos de coleta de amostras biológicas

A-Obtenção de amostras de sangue Antes do procedimento de necropsia dos animais foi coletado sangue em seringas

descartáveis estéreis de 1mL, através de punção intracardíaca. A coleta foi realizada após

administração de anestésico (tiopental sódico 2,5%) na dose de 30mg/kg de peso por via

intraperitoneal. Do volume total de sangue coletado, 50µL de sangue foram transferidos

para um tubo eppendorf (Hamburgo, Alemanha) destinado à realização do hemograma


31

completo (leucograma, eritrograma e contagem de plaquetas), em contador automático de

células Auto Hematology Analyser (BC-2800 Vet, Bio-Medical Eletronics Co., Ltd.,

Mindray, China). Aproximadamente 10µL de sangue foram destinados a confecção dos

esfregaços sanguíneos em lâminas que depois de coradas pelo Panótico Rápido InstantProv

(Newprov®) serviram para contagem diferencial de células à microscopia óptica. O

restante do volume de sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 10000rpm por 10

minutos para obtenção das amostras de soro, que foram acondicionadas em freezer -80oC

até o momento do uso para a realização dos testes sorológicos e dosagens bioquímicas.

5.7 Avaliação sorológica

5.7.1 Avaliação da IgG-total por ELISA

Foram realizadas reações imunoenzimáticas de ELISA para avaliação do perfil de

imunoglobulinas da classe IgG (Goat Anti-Hmster - Caltag Laboratories). A diluição ótima

dos conjugados foi determinada por titulação, empregando-se soros padrões positivos e

negativos, obtendo-se as diluição padrão de 1:3000 do conjugado anti -IgG.

A sensibilização das placas de poliestireno de fundo chato (MaxiSorpTM Surface,

Nunc-Immuno Plate, USA) foi procedida com 2µg/orifício de antígeno solúvel de L.

infantum (MHOM/BR/1972/BH46) em tampão carbonato e em seguida incubadas

overnight (18 horas) à temperatura de 4°C. O excesso de antígeno foi removido das placas

através de lavagens sucessivas com solução de lavagem (solução salina contendo Tween -

20 a 0,05%). Posteriormente, foi realizado o bloqueio de ligações inespecíficas aplicando

100µL/orifício de solução de PBS com 5% SFB. Em seguida, as placas foram incubadas a

37°C por 1 hora e 30 minutos, e após o término seguiu-se nova lavagem. Os soros, em

duplicata e na diluição de 1:80, foram aplicados às placas e incubados overnight (18 horas)

à temperatura de 4°C. No dia seguinte, procedeu-se a lavagem e subsequentemente o

conjugado foi aplicado. As placas foram incubadas por 2 horas a 21-25ºC seguida de nova

lavagem. Posteriormente, foram adicionados 100µL/orifício da solução de substrato

[tampão citrato fosfato 0,1M + 1µg de O-fenilenodiamino (Tablete – OPD, SIGMA, USA)

e 2µL de H2O2 a 30%], mantendo-as a 37°C, por 10 minutos. Após este período foi

adicionado 32µL/orifício de solução de ácido sulfúrico (H2SO4) a 2,5M para interromper a

reação. As leituras foram realizadas no leitor de ELISA (ELX800 Biotek Instruments VT,

USA) a 490nm para IgG e os resultados foram expressos em valores de densidade óptica


32

(absorbância). Em todas as placas foram utilizados soros controle positivos e negativos de

hamsters. Em todos os ensaios controles (negativo e positivo) foram utilizados. Para cada

placa, o ponto de corte ou “cut off” foi estabelecido a partir da média das leituras de

absorbância de oito soros de hamsters não infectados.

5.8 Avaliação do quadro hematológico e bioquímico

Para a avaliação do perfil hematológico, foi utilizado o aparelho Auto Hematology

Analyzer (Mindray BC-2800 Vet, Hamburgo, Alemanha) para a análise global de

leucócitos, eritrócitos, hematócrito, hemoglobina e plaquetas. O leucograma foi

determinado pelo aparelho hematológico em número de leucócitos/mm3. A contagem

diferencial de células foi realizada em esfregaços sanguíneos corados com Panótico Rápido

InstantProv (Newprov®) e avaliada por microscopia óptica em objetiva de imersão. Desta

forma, foi determinado o número absoluto de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e

monócitos, por meio da contagem de 100 leucócitos/lâmina.

As avaliações bioquímicas consistiram das seguintes análises: dosagem de proteína

total; dosagem de albumina; globulina; relação albumina/globulina; prova de função renal

a partir da dosagem de uréia e creatinina; provas de função hepática, compreendendo a

dosagem das enzimas alanina amino transferase (ALT), aspartato amino transferase (AST).

Para a avaliação dos parâmetros foi utilizado o Sistema Bioquímico Automático (CELM

SBA-200, Barueri, SP, Brasil) e empregado Kits comerciais do Labtest (Labtest

Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, MG, Brasil), seguindo o método descrito pelo fabricante.

5.9 Necropsia dos animais e obtenção do material biológico

Para os procedimentos de eutanásia e necropsia dos hamsters foi realizada a

administração de anestésico (tiopental sódico 2,5%) na dose de 30 mg/kg via

intraperitoneal. Atingido o plano anestésico adequado foi então administrado a dose letal

(120 mg/kg). Imediatamente após a comprovação da morte do animal, os mesmos foram

pesados e em seguida iniciados os procedimentos de necropsia e obtenção do material

biológico. Os hamsters foram necropsiados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após infecção.

Os animais foram pesados individualmente e identificados por grupo. Os hamsters foram

colocados em decúbito dorsal e a cavidade abdominal aberta com auxílio de uma tesoura

cirúrgica. O fígado e baço foram removidos de forma asséptica, analisados


33

macroscopicamente e pesados. Baço e fígado foram subdivididos em fragmentos de

aproximadamente 20mg, sendo estes destinados a: confecção de esfregaços por aposição

para avaliação da densidade parasitária por microscopia óptica em lâminas coradas pelo

Panótico Rápido InstantProv (Newprov®), preservação em formol tamponado a 10% pH

7,2 para avaliação histopatológica e ainda fragmentos para avaliação da expressão gênica

por qRT-PCR e qPCR. Os fragmentos para qRT-PCR e qPCR foram retirados e

previamente lavados com água tratada com Dietilpirocarbonato (DEPC) 1%, envoltos em

papel alumínio autoclavado, identificados e imediatamente imersos em nitrogênio líquido

onde permaneceram até o fim da necropsia. Após conclusão do procedimento da necropsia

os fragmentos foram retirados do nitrogênio e armazenados em freezer a temperatura de -

80ºC até o momento da extração de RNA e DNA total utilizado para avaliação da

expressão gênica por qRT-PCR e carga parasitária por qPCR, respectivamente.

5.10 Processamento e avaliação histológica do fígado e baço

Fragmentos de fígado e baço de hamsters fixados em formol 10% tamponado pH

7,2 foram processados e embebidos em parafina. Sobre lâminas de vidro, previamente

desengorduradas com solução álcool-éter, foram colocados cortes histológicos com

espessura de cinco µm. Estes procedimentos operacionais são padrões do laboratório de

Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP),

seguindo as normas de controle de qualidade do laboratório. As lâminas obtidas foram

coradas pelo método de Hematoxilina e Eosina (HE) para análise rotineira das alterações

histopatológicas. As imagens de fígado visualizadas pela objetiva de 40x foram

digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica

DM5000B e todas as imagens foram analisadas pelo software de análise e processamento

de imagem Leica Qwin no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas/NUPEB da UFOP.

O processo inflamatório no fígado foi quantificado em 20 imagens aleatórias (área

total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2). A escolha pela análise em 20 imagens foi devido a

um estudo piloto no laboratório, onde foi demonstrado que esse número de campos era

suficiente para a obtenção de uma leitura representativa da lâmina inteira.

As alterações histopatológicas do baço e fígado avaliadas de forma qualitativa e

realizadas levando-se em consideração a extensão das alterações observadas em todo o


34

corte histológico. As alterações histopatológicas avaliadas foram: Baço: hiperplasia

nodular, depleção de polpa branca, hiperplasia de polpa vermelha. Fígado: presença de

granulomas, inflamação periportal, fenômenos degenerativos, hiperemia.

5.11 Avaliação da densidade parasitária – LDU (Leishman Donovan Units)

Para a avaliação da carga parasitária por microscopia optica, no momento da

necropsia fragmentos de fígado e baço foram impressos em lâminas previamente limpas e

desengorduradas por método de esfregaços por aposição em lâmina. Em seguida as

lâminas foram coradas pelo Panótico Rápido InstantProv (Newprov®) e após secagem foi

determinado em cada lâmina, por microscopia óptica em objetiva de imersão, o número de

amastigotas em 1000 núcleos de células. O índice de LDU foi determinado conforme

Stauber et al. (1955), e consiste na razão do número de amastigotas/1000 células

nucleadas, multiplicando-se pelo peso do órgão (g).

5.12 Análise Molecular para quantificação da carga parasitária no fígado e baço pela

técnica de qPCR

5.12.1 Extração de DNA das amostras de Fígado

A extração do DNA foi realizada a partir de amostras de tecido do fígado. Para

obtenção do DNA das amostras foi utilizado o método de CTAB (brometo de

Cetiltrimetilamônio). Foram utilizadas quantidades de tecidos com peso de 20mg. Aos

tubos contendo os fragmentos de fígado foram adicionados 250µL de tampão de lise (Tris

5mM pH 7,5; EDTA 1mM; n-lauril sarcosina 1%). A mistura foi posteriormente incubada

em banho seco a 37°C por uma hora, sendo a suspensão homogeneizada em vórtex em

intervalos de 20 minutos. Terminado o tempo, foi adicionado 20µL de Proteinase K

(20mg/mL), homogeneizadas novamente em vórtex e incubadas overnight (18 horas) a

55ºC. Posteriormente foi adicionado 100µL de NaCl 5M e mantido por 10 minutos à 65ºC

e em seguida adicionou-se 50µL de solução CTAB 10% (v/v). As amostras foram

mantidas por 20 minutos a 65ºC e em seguida foi adicionado 400µL de Clorofórmio

(Sigma, St. Louis, MO, USA) sob agitação em vortex e, seguida as amostras foram

centrifugadas a 12000 x g em microcentrífuga (Eppendorf- Modelo 5418, NY, USA) por

10 minutos. A fase aquosa foi transferida para novo tubo e, adicionados 400µL de


35

isopropanol (Merck, Darmstad, Alemanha), sendo precipitado por cerca de uma hora no

freezer. Após precipitação do DNA centrifugou-se novamente por 10 minutos a 12000 x g

descartando o sobrenadante. Em seguida, foi efetuada a lavagem do pellet com etanol 70%

(Merck, Darmstad, Alemanha) gelado. Subsequentemente as amostras foram

homogeneizadas suavemente por inversão do tubo durante um minuto. Em seguida as

amostras foram centrifugadas por cinco minutos a 12000 x g e o sobrenadante descartado.

Posteriormente, o precipitado foi homogeneizado em 50µL de água livre de nucleases. As

amostras foram armazenadas em geladeira a 4°C até o momento da análise da qualidade do

DNA extraído e o início da reação de qPCR.

5.12.2 Extração de DNA das amostras de baço

A extração do DNA foi realizada a partir de fragmentos de tecido do baço. Para

obtenção do DNA das amostras um kit de extração WizardTM Genomic DNA Purification

Kit (Promega, Madison, WI, USA) foi utilizado seguindo recomendações do fabricante

com modificações, conforme brevemente descrito. Foram utilizadas quantidades de tecidos

com peso de 20mg. Aos tubos contendo os fragmentos de baço foram adicionadas

proteinase K (20mg/mL) e a solução de lise nuclear. Em seguida as amostras foram

incubadas overnight (18 horas) em banho seco a 55°C. No dia seguinte foi adicionado 3µL

da solução de RNase ao lisado nuclear, seguida de homogeneização e incubação em banho

seco a 37ºC por 30 minutos. As amostras foram resfriadas por cinco minutos a 25ºC e em

seguida foi adicionado 200µL da solução de precipitação protéica. Com auxílio de um

homogeneizador tipo vórtex, as amostras foram homogeneizadas por 20 segundos em baixa

velocidade e incubadas no gelo por cinco minutos. Em seguida foram centrifugadas a

16000 x g em microcentrífuga (Eppendorf- Modelo 5418, NY, USA) durante cinco

minutos. O sobrenadante foi transferido para novo tubo, onde se adicionou 600µL de

isopropanol (Merck, Darmstad, Alemanha) e as amostras foram homogeneizadas por

inversão dos tubos. Após este procedimento, foi realizada centrifugação a 16000 x g

durante dois minutos e o sobrenadante descartado. Posteriormente foi acrescentado 600µL

de etanol 70% (Merck, Darmstad, Alemanha), a amostra homogeneizada e centrifugada a

16000 g por dois minutos, sendo o sobrenadante desprezado. As amostras foram deixadas

por 1 hora a 21-25ºC para total evaporação do etanol. Posteriormente, foi adicionado

100µL de solução de hidratação e as amostras foram mantidas em banho seco a 37º C por


36

uma hora. Após este tempo as amostras foram mantidas a 21-25ºC por duas horas e em

seguida foram armazenadas em geladeira a 4°C até o momento da análise da qualidade do

DNA extraído e o início da reação de PCR.

5.12.3 Clonagem dos produtos da amplificação do gene de L. infantum Para a construção da curva padrão foram obtidos controles que possuíam um

número conhecido de cópias do DNA de L. infantum. O produto de amplificação

específico obtido foi clonado. A amplificação do DNA pela PCR convencional foi

realizada de uma amostra de DNA de L. infantum, utilizando o par de iniciadores (direto:

5’ TGT CGC TTG CAG ACC AGA TG 3’, e reverso: 5’GCA TCG CAG GTG TGA GCA

C 3’) que foram descritos por Bretagne et al., 2001 e tem como alvo o gene da DNA

polimerase de L. infantum (acesso no GenBank: AF009147) que é um gene de cópia única

e amplificam um fragmento de 90pb.

5.12.4 Reação em cadeia da Polimerase - PCR

Para a reação, foi utilizado DNA de L. infantum (1,0ng/µL). A reação constituiu de:

tampão 1X, 1,5mM de MgCl2, 2,0µM de dNTP, primer (5pmol), 0,76µL U Taq DNA

polimerase (Fermentas -Sinapse®), 2,5µL de DNA e H2O Milli Q totalizando um volume

de 12,5µL por poço da placa (MicroAmp® Fast Optical 96-Well, Applied Biosystems). As

condições utilizadas na reação de PCR foram: desnaturação inicial a 94°C por um minuto,

seguida por 40 ciclos a 93ºC por 30 segundos, 64°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto e

uma extensão final a 72°C por sete minutos. O equipamento utilizado para a realização de

PCR foi o Verit Termal Cycler 96 well (Applied Biosystems®, Califórnia, USA). Parte do

produto final da reação foi aplicada em um gel de agarose 1,5% (Invitrogen by Life

Technologies, EUA), para comprovar o resultado da amplificação pela visualização da

banda de interesse (90 pb).

5.12.5 Clonagem

Após confirmação da presença e integridade da banda de interesse, e a ausência de

outros amplicons, o produto da PCR foi inserido em um vetor plasmidial com objetivo de


37

realizar a clonagem gênica usando o kit pGEM® T Vector Systems (Promega, EUA). O

Mapa do vetor utilizado encontra-se na Figura 1.

Para cada reação de ligação, foi preparado um mix contendo 5µL de “2X Rapid

Ligation Buffer”, 1µL de “p-GEM-T Easy Vector” e 1µL de “T4 DNA Ligase” e a razão

molar foi 8 de inserto:1 de vetor. Após ser homogeneizado, o tubo foi mantido overnight

4ºC por 16 horas para ocorrer à reação de ligação do inserto no vetor.

Figura 1: Mapa do vetor p-GEM®-T Vector. A sequência representada mostra o sitio de clonagem, região codificadora para o gene de resistência a ampicilina e β galactosidase.

5.12.6 Preparo de bactérias competentes e transformação bacteriana

A- Preparo de bactérias competentes As bactérias DH-5α foram inoculadas em 5mL de meio Luria Bertani (LB)1X

(Bacto triptona 1%p/v; extrato de levedura 0,5%p/v; NaCl 171mM) e incubadas sob

agitação 180rpm (Shaker, Innova 44), a 37ºC por 16 horas. A cultura bacteriana foi

transferida para 500mL de meio LB e novamente incubada a 37ºC a 180rpm. O

crescimento foi acompanhado até a cultura atingir uma A600 nm igual a 0,6,

correspondendo ao crescimento equivalente à metade da fase logarítmica. As bactérias

foram centrifugadas a 5000rpm durante 10 minutos a 4ºC e o sedimento homogeneizado

em 150mL de 75mM de CaCl2,10mM de Tris-HCl pH 8,0. Subsequentemente, a suspensão

bacteriana foi incubada em gelo por 20 minutos e centrifugada, como descrito previamente.

O sedimento celular foi ressuspenso em 30mL da mesma solução, acrescida de 15% de

glicerol e congelado rapidamente em mistura, gelo seco álcool e mantidas a -80ºC, até o

momento do uso.


38

B-Transformação

A transformação bacteriana foi realizada utilizando 5µL da reação de ligação,

adicionadas a 50µL de bactéria Escherichia coli DH5-α quimiocompetentes,

descongeladas em gelo. Esta mistura foi homogeneizada levemente e mantida em gelo por

30 minutos, subsequentemente foi transferida para um banho aquecido a 42ºC por 2

minutos, e em seguida, colocada em banho de gelo por 2 minutos, sendo imediatamente

adicionado a ela 1µL de meio LB 1X sem antibióticos a cada tubo, os quais foram

incubados por 1 hora no Shaker a 200-300rpm a 37ºC. A cultura bacteriana foi

sedimentada em microcentifuga, a 1000rpm por 5 minutos. Em seguida, foi

homogeneizada em 100µL de meio LB e um volume de 50µL foi semeada em placas de

Petri contendo LB-ágar (LB acrescido de 1% de ágar) acrescido de ampicilina

(100mg/mL), 0,4µL de Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 4µL de 5-bromo-

4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) 4%. Após este procedimento foi

incubada em estufa B.O.D. (Estufa D.B.O., EletroLab, Brasil) a 37ºC overnight (16 horas).

No dia seguinte, as colônias brancas, consideradas positivas, foram submetidas à

triagem por PCR conforme especificado no item 5.7.4, para a confirmação do inserto. As

colônias positivas para o inserto foram selecionadas para purificação do DNA plasmidial.

5.12.7 Purificação dos vetores por lise alcalina

Para obtenção de DNA plasmidial em pequena escala foi utilizado o kit Wizard

Miniprep (Promega,USA). O crescimento bacteriano foi feito em 10mL de meio LB com

ampicilina a 37ºC por 16 horas. Posteriormente, a cultura bacteriana foi centrifugada por 5

minutos a 5000rpm, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido

em 250µL de solução de ressuspensão. Em seguida, foram adicionados 250µL de solução

de lise e a mistura foi homogeneizada por inversão 4 vezes. Subsequentemente foram

adicionados 10µL de solução de protease alcalina, a mistura foi invertida quatro vezes e

incubada por cinco minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, foram adicionados

350µL de solução de neutralização e a mistura foi homogeneizada por inversão,

centrifugada a 13000rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, o

sobrenadante foi removido e transferido para uma coluna contida em tubo coletor.

Posteriormente, a coluna foi acoplada a um tubo de microcentrífuga e centrifugada a

13000rpm por 1 minuto, a temperatura ambiente. Foram adicionados 750µL de solução de


39

pmol/µL = µg/µL x 106pg x 1pmol x 11 µg 660pg N

lavagem a coluna, centrifugada a 13000rpm por 1 minuto. Este procedimento de lavagem

foi repetido por mais uma vez. O DNA plasmidial foi eluído em 50µL de água livre de

nucleases e mantido a - 20ºC, para posterior análise por qPCR em tempo real.

5.12.8 Construção de curvas-padrão para a qPCR em tempo real

O produto da clonagem do gene de L. infantum, foi utilizado para a construção da

curva-padrão. Os vetores contendo os insertos foram inicialmente dosados utilizando o

equipamento Nanovue (GE Healthcare Bio Sciences AB Sweden) a 260nm e 280nm. A

partir da dosagem obtida, calculou-se a concentração de DNA em µg/µL, de acordo com a

fórmula:

Onde;

� N é o número de nucleotídeos (plasmídeo e inserto);

� 660pg é a massa molecular média de um ácido nucléico.

Levando-se em consideração o número de Avogadro: 1mol = 6,02x1023 moléculas, e

sabendo-se que a concentração de cada solução de plasmídeo+inserto de interesse em

pmol/µL, foi possível determinar o número de moléculas presentes por microlitro de cada

amostra.

Depois de realizados estes cálculos, as amostras foram diluídas sucessivamente,

sendo que aquelas contendo de 107 até 100 moléculas foram utilizadas para a construção

das curvas-padrão. As reações de qPCR foram realizadas em placas de 96 poços -

MicroAmp®Optical 96 - Well Reaction Plate with Barcode (Applied Biosystems by Life

Technologies, EUA), cobertas com adesivos ópticos- Optical Adhesive Covers (Applied

Biosystems, EUA) e processadas em termociclador ABI Prism 7500 Sequence Detection

System (Applied Biosystems, EUA) do Laboratório de Equipamentos Multiusuários do

NUPEB/UFOP.

Os controles positivos de cada placa foram às amostras diluídas de plasmídeo

contendo o inserto utilizado na curva padrão; e como controle negativo foi usado água livre

de nucleases, ao invés de DNA. A reação de cada amostra foi realizada em duplicata, com

as seguintes condições: uma desnaturação inicial a 95ºC por 10min, seguida por 40 ciclos


40

de 95ºC por 15segundos e 60ºC por 1minuto. Ao final das reações a temperatura da

máquina é elevada gradualmente até que todas as fitas duplas de material amplificado se

dissociem, para a verificação de possível contaminação dos DNA’s das amostras em

estudo com DNA genômico ou dímeros dos iniciadores. As reações foram realizadas

utilizando-se SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, EUA); DNA (5ng/µL);

iniciadores (5pmol/µL) e água livre de nucleases em quantidade suficiente para um volume

final de 10µL por poço. Para a quantificação do número de moléculas de DNA de

Leishmania nas amostras, inicialmente foi determinado para cada poço o número de ciclos

em que a fluorescência cruzou uma linha limiar arbitrária, denominada threshold (Ct),

calculada pelo programa 7500 Software v.2.0.1 for 7500 and 7500 Fast Real-Time PCR

Systems (Applied Biosystems, EUA). A quantidade de cópias de DNA em cada amostra foi

determinada a partir de uma regressão linear usando os valores do Ct das amostras

utilizadas na curva padrão, gerada com quantidades conhecidas dos plasmídeos com os

insertos de interesse.

O procedimento descrito acima foi também realizado para a amplificação e

quantificação do gene de TNF-α, que é expresso de forma constitutiva e por este motivo

foi utilizado para verificar a integridade dos DNA’s analisados. Para a amplificação do

gene TNF-α, foram utilizados os iniciadores direto: 5’ GAG TGG CTG AGC CAT CGT

3’ e reverso: 5’ TGG TTG TCT TTG AGA GAC ATG 3’, que amplificam um fragmento

de 86pb (acesso no GenBank: AF046215). As reações foram realizadas utilizando-se SYBR

Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, EUA); DNA (5ng/µL); iniciador (2,5

pmol/µL) e água livre de nucleases em quantidade suficiente para um volume final de

10µL por poço. Para a análise dos resultados foram consideradas as reações com eficiência

entre 98-100% e curva padrão com valores satisfatórios de coeficiente de linearidade (r2 =

0,99). Segue abaixo como exemplo, a curva padrão referente ao gene da DNA polimerase

utilizada neste estudo (Figura 2).


41

Figura 2: Exemplo da curva padrão referente ao gene da DNA polimerase de L. infantum. Em X estão demonstrados os valores de Log da concentração de parasitos (107 a 100) e em Y os valores de Ct

correspondes a cada diluição. Abaixo do gráfico está representado o valor do slope (-3,32), coeficiente de linearidade (R2 =0,999) e a eficiência (100%).

Os resultados foram expressos pelo número de amastigotas em 20ng de DNA de

tecido (baço ou fígado) bem como, pelo número de amastigotas em 20mg de tecido

multiplicado pelo peso total do órgão (baço ou fígado).

5.13 Avaliação da expressão gênica por qRT-PCR

5.13.1 Desenho dos iniciadores (primers)

Os primers foram desenhados utilizando o software Gene Runner (versão 3.05,

1994). As sequências de nucleotídeos referentes aos genes avaliados nesse estudo foram

obtidas do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando sequências completas de

CDs, e quando não disponível foram utilizadas sequências parciais encontradas. Para os

genes que apresentavam variações de transcritos, foi realizado um alinhamento das

sequências para identificar regiões em comum entre os transcritos, e a partir dessas, foram

desenhados os respectivos primers. Os critérios utilizados para selecionar os iniciadores

foram: conteúdo de C+G entre 50-60%; tamanho de 18-22 pares de bases (bp); temperatura

de fusão (Tm) entre 58-60ºC; evitou-se utilizar primers com mais de quatro bases em

sequência de C e/ou G, e com mais de 2 C ou G nas cinco últimas bases da extremidade 3`;

variação do tamanho dos amplicons de 50 a 150bp, sequências que estavam entre junções

de exons e introns e não ocorrer homologia com outras sequências do hamster

(Mesocricetus auratus). Os primers utilizados nesse estudo estão descritos na Tabela 1,


42

assim como a sequência de nucleotídeos, a função, o número de acesso ao GeneBank

(NCBI) e o tamanho dos amplicons.

Tabela 1: Sequências de primers forward e reverse referente aos genes avaliados, função, tamanho do amplicon gerado e número de acesso das sequências no GeneBank.

5.13.2 Extração e purificação do RNA total das amostras de baço

Na etapa de extração do RNA total, foram utilizadas quantidades de tecidos com o

peso de 20mg. Aos tubos contendo os fragmentos de baço foram adicionados 1mL de

TRIzol® Reagent (Invitrogen São Paulo, SP, Brasil). As amostras foram maceradas

utilizando um homogeneizador de tecidos e todos os instrumentos utilizados no processo

de maceração, foram lavados com água tratada com Dietilpirocarbonato (DEPC) e

posteriormente limpos com gaze embebida com um removedor de nucleases (RNAses)

RNAseAway (Invitrogen São Paulo). Posteriormente, o homogeneizado de cada amostra

foi transferido para um tubo “eppendorf” de 1,5mL e mantidos no gelo até que todas

fossem maceradas. Após o término as amostras foram retiradas do gelo e incubadas à

temperatura de 21-23ºC para permitir a completa dissociação dos complexos de

nucleoproteínas. Foram então adicionados 0,2mL de clorofórmio (Sigma, St. Louis, MO,

USA) para cada 1mL de TRIzol® aos tubos contendo o homogeneizado e em seguida

Gene Sequência de Nucleotídeos (5`-3`) Função Tamanho do

Amplicon (pb)

Número de acesso

GeneBank

GAPDH Constitutivo 80 U10983 F TGGAGTCTACTGGCGTCTTC R GGAGATGATGACCCTCTTG

IFN-γγγγ Citocina 82 AF034482 F CAGATCGTCTCCTTCTACTTC R CCTTGATGGTGTCTATGC

TNF- αααα Citocina 86 AF046215 F GAGTGGCTGAGCCATCGT R TGGTTGTCTTTGAGAGACATG

IL-10 Citocina 150 AF046210 F CTTGAAGACGCCTTTCTC R GAGCATTTGAACTCCCTAG

TGF-ββββ Citocina 125 AF046214 F GGCTGGAAGTGGATTCAC R GGGTTGTGTTGGTTGTAG


43

foram fechados e agitados vigorosamente por 15 segundos e incubado por cinco minutos a

temperatura ambiente. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a

12000 x g em centrífuga (Eppendorf centrifuge 5810 R, NY, USA). A fase aquosa foi

transferida para um novo tubo de 1,5mL, seguido da adição de volume equivalente de

etanol 95% (v/v) (preparado com água tratada com DEPC) e homogeneizado suavemente

invertendo o tubo por três vezes para precipitação do RNA total. Para purificação do RNA

total contido na amostra, utilizou-se o kit de extração de RNA total (SV total RNA

Isolation System - Promega, Madison, WI, USA) com algumas adaptações descritas a

seguir. O RNA obtido como descrito acima, foi transferido para um “spin basket” acoplado

a um tubo coletor de 2mL e centrifugado a 12000 x g por dois minutos em centrífuga. O

líquido residual no tubo coletor foi descartado após as centrifugações. Foram então

adicionados 600µL de solução de lavagem (SV RNA Wash Solution) e em seguida

centrifugado a 12000 x g por dois minutos. As amostras de RNA foram tratadas com

DNase para assegurar a ausência de contaminação por DNA genômico. Para isso, foi

preparado um mix contendo 40µL de “yellow core buffer”, 5,0µL MnCl2 0,09M e 5µL de

DNAse e aplicado sobre a membrana do spin e incubado por 25 minutos a temperatura de

21-25ºC. Posteriormente, foi adicionado 200µL de “SV DNAse Stop Solution” para inibição

da atividade enzimática da DNAse. Realizou-se então a centrifugação a 12000 x g por dois

minutos e o líquido contido no tubo coletor foi descartado. Foram adicionados 600µL de

solução de lavagem (SV RNA Wash Solution) e centrifugado por 12000 x g por dois

minutos. Adicionou-se então, 250µL de solução de lavagem (SV RNA Wash Solution),

seguido de centrifugação a 14000 x g por três minutos. Posteriormente, o spin foi

transferido para um tubo de eluição e adicionou-se 100µL de água livre de nucleases

seguido de centrifugação a 12000 x g por 2 minutos. As amostras foram armazenadas em -

80ºC até o momento do uso.

5.13.3 Quantificação e avaliação do grau de pureza do RNA total extraído

Para a quantificação e avaliação do grau de pureza do RNA extraído as amostras

foram dosadas utilizando o equipamento Nanovue (GE Healthcare Bio Sciences AB

Sweden). Foi utilizado 2µL de RNA total e o grau de pureza em relação à presença de

proteínas, foi avaliado utilizando a relação dos valores de absorbância obtidos

A260/280nm. O grau de contaminação por outros compostos (como sais, polissacarídeos e


44

compostos orgânicos como fenol) foi avaliado pela absorbância A260/230nm. As amostras

que apresentaram absorbância A260/280nm maior ou igual a 2 foram consideradas com

um grau de pureza satisfatório.

5.13.4 Integridade do RNA extraído

A separação eletroforética das amostras de RNA total foi realizada em gel de

agarose em condições desnaturantes e específicas para RNA. Sendo assim, 0,6g de agarose

foram dissolvidas em 40mL de água tratada com DEPC. A mistura foi aquecida com

auxílio de um microondas convencional. Após a agarose atingir uma temperatura de 45º foi

adicionado na mesma uma segunda solução composta por 12,8mL de água tratada com

DEPC, 6mL de tampão MOPS 10X e 1,2mL de formaldeído (Sigma). Após

homogeneização, a solução foi vertida sobre o aparato de eletroforese com pente

apropriado e aguardado a completa solidificação. Paralelamente, foi preparado o tampão de

amostra contendo 93,75µL de formamida (Sigma), 13,75µL de formaldeído, 18,75µL de

MOPS 10X, 21µL de água (tratada com DEPC), 0,25µL de azul de bromofenol (100

mg/mL) e 0,25µL de brometo de etídio (Sigma). Foi utilizado 5µg das amostras de RNA

para 10µL de tampão de amostra e incubado por cinco minutos a 65ºC (desnaturação do

RNA) seguido de banho de gelo por três minutos. Posteriormente, as amostras foram

aplicadas ao gel e corridas a 90V em tampão MOPS 1X. As amostras consideradas

adequadas para avaliação dos níveis de transcritos de mRNA foram as que apresentavam

bandas íntegras referentes as subunidades do RNA ribossomal.

5.13.5 Transcrição reversa (síntese da 1ª fita de DNA complementar- cDNA)

A primeira fita de cDNA, foi sintetizada utilizando o kit “High Capacity cDNA

Reverse Transcription kit” (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) de acordo com

as recomendações do fabricante. Para isso, adicionou-se em um tubo 1µg de RNA total

presente em um volume final máximo de 10µL. Posteriormente, foi adicionado 10µL do

mix de transcrição reversa (RT Buffer 10X, dNTP Mix (100Mm) 25X, RT Random

primers 10X, enzima Multiscribe, Rnase inhibitor e água livre de nucleases) em cada tudo

de 0,2mL contendo o RNA. Além disso, foi adicionado um controle negativo contendo

todos os reagentes menos a amostra, com o objetivo de se verificar possíveis

contaminações dos reagentes. Subsequentemente, os tubos contendo as amostras foram


45

colocados no termociclador (Veriti™ Termal Cycler PE Applied Biosystems) nas

seguintes condições: 1 ciclo de 10 minutos a 25ºC, 1 ciclo de 120 minutos a 37ºC, 1 ciclo

de 15 segundos a 85ºC e 1 ciclo de 5 minutos a 4ºC, consecutivamente. Após o término, os

tubos foram retirados do termociclador e armazenados a temperatura de -20ºC até o

momento da amplificação por PCR em tempo real.

5.13.6 Avaliação da curva de eficiência dos primers

Para avaliar a eficiência da reação de PCR para os diversos iniciadores utilizados

neste estudo, foram construídas curvas padrão utilizando diluições seriadas em uma

amostra de baço. O ensaio foi realizado em duplicata e a concentração dos iniciadores foi

de 2,5pmol/µL. Os valores foram plotados em um gráfico onde log no eixo X apresenta o

das concentrações de cDNA e o eixo Y o valor de Ct para cada diluição. O cálculo da

estimativa de eficiência (E) do ensaio de PCR em tempo real foi determinado pelo slope da

curva aplicado na seguinte formula: E= 10(-1/slope) -1. Segue abaixo como exemplo, a curva

de eficiência referente ao gene GAPDH utilizado neste estudo (Figura 3) e o plot de

amplificação (Figura 4).

Figura 3: Curva padrão referente ao gene GAPDH utilizando diluição seriada de 5x de cDNA. Em X estão demonstrados os valores de log da concentração de cDNA e em Y os valores de Ct correspondes a cada diluição. A direita do gráfico está representada os valores do slope e de coeficiente de linearidade.


46

Figura 4: Plot de amplificação referente à curva de eficiência do GAPDH utilizando diluição seriada de 5x de cDNA.

5.13.7 Expressão de citocinas por qRT-PCR

O ensaio para avaliar a expressão gênica das citocinas (TNF-α, IFN-γ, TGF-β, IL-

10) nas amostras de baço, foi realizado utilizando os iniciadores (primers) na concentração

de 2,5p/mol, SYBR™ Green (Applied Biosystems, EUA) e cDNA diluído 5x em água

livre de nucleases, perfazendo um volume final de 10µL de reação. O ensaio foi realizado

em duplicata para todos os genes e o gene normalizador presente na mesma placa que os

genes avaliados. Os resultados foram expressos pelo método CT comparativo (2-∆∆Ct) que

consiste de uma quantificação relativa que utiliza fórmulas aritméticas para determinar as

diferenças na expressão de um alvo de uma amostra comparando com a sua expressão em

uma amostra controle. Sendo assim, neste tipo de análise é realizada uma normalização de

expressão deste alvo para cada amplificação, ou seja, sua expressão é subtraída pela

expressão de um gene constitutivo que é expresso de maneira semelhante em diferentes

tecidos e em diferentes condições. Assim, para cada amostra alvo foram amplificados os

genes das citocinas (TNF-α, IFN-γ, IL-10 e TGF-β) e o gene constitutivo (GAPDH), de

forma a se obter os valores dos Threshold Cycles (Ct) correspondentes e a realização dos

cálculos para obtenção dos resultados. Para se realizar uma análise com base nos valores

do ∆∆Ct faz-se necessário que as eficiências entre alvos (citocinas) e o gene endógeno

sejam semelhantes. Assim, os cálculos para a determinação do ∆∆Ct foram realizados a

partir do método, onde as diferenças na expressão gênica são calculadas baseando-se


47

apenas nas eficiências das amplificações e as diferenças de Cts do alvo na amostra a no

controle.

5.14 Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism 5.0 (Prism

Software, Irvine, CA, USA). Depois de demonstrada a normalidade dos dados usando o

teste Kolmogorov-Smirnoff, foi realizada análise de variância (ANOVA one-way) seguida

do teste de Tukey para determinar as diferenças específicas entre os grupos. Além disto,

foram realizadas análises de correlações entre as variáveis pelo método de correlação de

Pearson. Em todas as análises estatísticas as diferenças foram consideradas significativas

quando o valor de P foi menor que 0,05.

6. RESULTADOS

Moreira, N. D. Resultados

49

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

0

2

4

6

8

10

Nº d

e p

rom

ast

igo

tas

(x1

07) m

L

Tempo (dias)

Cepa PP75

Cepa selvagem

Neste estudo foram utilizados 320 hamsters alocados em dois grandes grupos

experimentais referentes às cepas de L. infantum (PP75 e selvagem-C46). Foram utilizadas

três vias de inóculo (ID, IP e IC) além de um grupo controle, e as avaliações foram

realizadas nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção.

Os dados obtidos no presente estudo estarão descritos da seguinte forma: primeiro

os resultados obtidos da cepa PP75, levando em consideração a análise comparativa entre

as vias de inóculo, seguido da análise descritiva, ao longo do tempo avaliado (1, 3, 6 e 9

meses). Subsequentemente foi adotado o mesmo padrão de descrição para a cepa

selvagem.

6.1 Avaliação do perfil de crescimento in vitro das formas promastigotas de L. infantum

das cepas PP75 e selvagem (C46)

O crescimento das formas promastigotas de ambas as cepas em cultura foi

acompanhado por um período de 20 dias (Figura 5). Os dados obtidos mostraram que as

cepas apresentaram um perfil semelhante de crescimento. Sendo assim, observou-se que a

cepa PP75 apresentou um pico crescimento no sétimo dia com uma fase estacionária de

aproximadamente dois dias enquanto a cepa selvagem atingiu um pico de crescimento no

sexto dia com uma fase estacionária de aproximadamente cinco dias. Em seguida

observou-se um declínio em ambas as culturas.

Figura 5: Curva de crescimento das formas promastigotas de L. infantum das cepas PP75 e selvagem acompanhadas por 20 dias, com contagens diárias. Os valores estão representados como média de três contagens.


50

0 3 6 9

20

40

60

80

100

0 3 6 90

20

40

60

80

100

Taxa

de

so

bre

vida

meses após a infecção

Cepa SelvagemCepa PP75

6.2 Avaliação da taxa de sobrevida nos diferentes grupos experimentais

Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que tanto os hamsters infectados

com as cepas PP75 e selvagem, pela via ID e os hamsters pertencentes ao grupo C

apresentaram uma taxa de sobrevida de 100%. Entretanto, os hamsters infectados com a

cepa PP75 pelas vias IP e IC apresentaram uma taxa de sobrevida de 90%. Por outro lado,

os animais infectados com a cepa selvagem pela via IP apresentaram uma taxa de

sobrevida de 80% enquanto os inoculados pela via IC a taxa de sobrevida foi de 60%

(Figura 6).

Figura 6: Taxa de sobrevida de hamsters pertencentes ao grupo controle (C;•) e experimentalmente infectados com as cepas de L. infantum: PP75 e selvagem por diferentes vias de inóculo: intradérmica (ID;�); intraperitoneal (IP;�) e intracardíaca (IC;�), avaliados nos tempos de 3, 6 e 9 meses após a infecção.

6.3 Avaliação clinicopatológica

A avaliação da progressão da infecção nos diferentes grupos experimentais foi

realizada através da observação de sinais clínicos 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção com as

cepas PP75 e selvagem de L. infantum (Tabela 2). Foram observados sinais clínicos

sugestivos da LV experimental em hamster nos grupos experimentais inoculados por

diferentes vias, sendo mais evidentes em 6 e 9 meses após a infecção experimental em

ambas as cepas. Todavia, estes foram mais exacerbados nos animais infectados com a cepa

selvagem pela via IC. Assim, hamsters infectados com a cepa PP75 apresentaram sinais

clínicos mais tardiamente enquanto naqueles infectados com a cepa selvagem os sinais

clínicos surgiram precocemente.


51

A B C

Neste sentido, animais inoculados com a cepa PP75 pela via IC, 9 meses após a

infecção, apresentaram esplenomegalia (77%), emagrecimento (22%) e hepatomegalia

(33%) (Tabela 2).

Em contrapartida, em 80% dos hamsters infectados com a cepa selvagem e

inoculados pela via IC, observou-se esplenomegalia aos 3 meses após a infecção.

Adicionalmente, hamsters infectados com a cepa selvagem pela via IP induziu

esplenomegalia em 70% dos animais aos 6 meses após a infecção. Por outro lado, observou-

se, neste mesmo período, que hamsters infectados com a cepa selvagem pela via IC

apresentaram sinais adicionais da LV incluindo, ascite (60%), emagrecimento (90%) e

hepatomegalia (10%). Em 9 meses após a infecção, período em que a presença de sinais

clínicos foi mais pronunciada, observou-se que 87% dos hamsters infectados pela via IP

apresentaram esplenomegalia e 100% dos animais infectados pela via IC apresentaram

ascite, esplenomegalia e emagrecimento/caquexia (Tabela 2).

Curiosamente, aos 9 meses após a infecção com a cepa selvagem utilizando a via IC,

foi possível observar ainda, lesões cutaneomucosas, acompanhada por úlceras localizadas no

focinho e edema nas patas de 100% dos animais Figura 07.

Figura 7: Alterações macroscópicas observadas em hamsters após a infecção com a cepa selvagem em 9 meses após a infecção. Em (A) queda de pelo, (B-C) caquexia intensa, edema da pata e lesões cutaneomucosas localizadas no focinho.


52

(meses)1 - - - - - - -

Esplenomegalia - 1/10 (10%) - - 1/10 (10%) 8/10 (80%)Ascite - 1/10 (10%) - 6/10 (60%) 1/10 (10%) -

Esplenomegalia - - 2/10 (20%) 1/10 (10%) 7/10 (70%) 10/10 (100%)Hepatomegalia 1/10 (10%) - - - - 1/10 (10%)

Ascite 4/10 (40%) 4/10 (40%) 3/10 (30%) 4/10 (40%) 1/10 (10%) 6/10 (60%)*Emagrecimento - - - 1/10 (10%) - 9/10 (90%)

Esplenomegalia 1/10 (10%) - 7/9 (77%) 1/10 (10%) 7/8 (87%) 6/6 (100%)Hepatomegalia - - 3/9 (33%) 1/10 (10%) - 1/6 (16%)

Ascite 1/10 (10%) - 1/9 (11%) - 3/8 (37%) 6/6 (100%)†Emagrecimento - - 2/9 (22%) - - 6/6 (100%)

Lesão cutaneomucosa - - - - - 6/6 (100%)Edema da pata - - - - - 6/6 (100%)

Grupos Experimentais

Tempo/infecçãoSinais Clínicos

Cepa PP75 Cepa Selvagem

ID IP IC ID IP IC

3

6

9

Tabela 2: Análise anatomoclínica de hamsters experimentalmente infectados com L. infantum. Valores absolutos (n) e percentuais (%).

*Emagrecimento com preservação do estado geral do animal. †Emagrecimento acentuado/caquexia (observado apenas no grupo inoculado pela via IC).


53

6.4 Avaliação da resposta humoral

A resposta imune humoral foi avaliada no soro dos animais dos diferentes grupos

experimentais (C, ID, IP e IC). A Figura 8 mostra que os hamsters infectados com a cepa

PP75 pelas vias IP e IC apresentaram aumento nos níveis de IgG-total quando comparados

tanto aos hamsters do grupo C quanto aqueles inoculados pela via ID, 1 mês após a

infecção. Em 3 meses após a infecção este aumento se manteve somente no grupo

infectado pela via IC quando comparado ao grupo C. Adicionalmente, 6 e 9 meses após a

infecção foram observados elevados níveis de IgG nos hamsters infectados pela via IC

quando comparados aos demais grupos.

Na avaliação dos tempos observou-se aumento nos níveis de IgG nos animais

inoculados com a cepa PP75 pela via IC nos períodos de 6 e 9 meses em relação aos

períodos de 1 e 3 meses após a infecção.

Em contrapartida, hamsters infectados com a cepa selvagem apresentaram aumento

significativo nos níveis de IgG nos três grupos experimentais (ID, IP e IC) em relação ao

grupo C durante todo período avaliado (1, 3, 6 e 9 meses após a infecção). Nestes animais,

foi ainda evidenciado, aumento da reatividade de IgG nos grupos infectados pelas vias IP e

IC quando comparados ao grupo infectado pela via ID nos tempos de 3, 6 e 9 meses após a

infecção (Figura 8).

Na avaliação dos tempos observou-se que, hamsters infectados com a cepa

selvagem apresentaram aumento significativo nos níveis de IgG nos grupos inoculados

pelas vias IC e IP nos tempos de 3, 6 e 9 meses quando comparados ao período de 1 mês

após a infecção.


54

Figura 8: Reatividade de IgG total no soro de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como valores de densidade óptica. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras. “Cut off”= 0,056 e 0,060, estão representados no gráfico pela linha tracejada para as cepas PP75 e selvagem, respectivamente.

6.5 Avaliação de parâmetros clínicos laboratoriais

6.5.1 Hemograma: série branca e vermelha

A avaliação da resposta celular contou com a análise dos parâmetros hematológicos

(leucograma, eritrograma e contagem de plaquetas) dos diferentes grupos experimentais.

Foram demonstrados valores absolutos das populações de neutrófilos, eosinófilos,

linfócitos e monócitos bem como a global de leucócitos, eritrócitos, hemoglobina,

hematócrito e plaquetas.

Os dados obtidos em relação a análise da série branca dos hamsters controle e

experimentalmente infectados pelas cepas PP75 e selvagem através de diferentes vias de

inóculo (ID, IP e IC) e avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção estão

apresentados na Tabela 3.

A análise dos dados evidenciaram diferenças estatísticas nos animais infectados

com a cepa PP75, após 3 meses da infecção com redução na população de eosinófilos nos

animais inoculados pela via IP em relação ao grupo C. Além disso, observou-se aos 9

meses uma redução significativa na população de monócitos no grupo IC quando

comparado ao grupo controle após infecção com a cepa PP75 (Tabela 3).

Nenhuma diferença estatística foi observada na infecção com a cepa PP75 ao longo

do tempo avaliado, em relação à global de leucócitos, eosinófilos, linfócitos e monócitos.

Grupos/tempo (meses)

De

nsid

ade

optic

a

ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C 0.000

0.200

0.400

0.600

0.000

0.200

0.400

0.600

Cepa PP75 Cepa selvagem


55

Observou-se apenas aumento na população de neutrófilos no grupo IP no período de 3

meses quando comparado ao período de 1 mês após a infecção.

Por outro lado, após um mês de infecção com a cepa selvagem pelas vias ID e IP

foi observado aumento no número de monócitos em relação ao grupo C. Após 3 meses da

infecção observou-se aumento na população de linfócitos do grupo inoculado pela via IP

quando comparado ao grupo C. Neste mesmo tempo, animais infectados pela via IC

apresentaram leucopenia em relação aos grupos C, ID e IP. Esta leucopenia apresentou

uma marcada redução da população de monócitos, neste mesmo período (após 3 meses da

infecção), para o grupo IC quando comparado ao grupo C. Neste sentido, este grupo

apresentou após 6 meses de infecção redução do número de neutrófilos totais em relação

ao grupo ID; redução do número de eosinófilos em relação aos grupos C e ID, redução do

número de linfócitos em relação aos grupos C, ID e IP; além de redução do número de

monócitos em relação aos grupos C e IP. De forma similar 9 meses após a infecção com a

cepa selvagem, hamsters inoculados pelas vias IP e IC apresentaram leucopenia em

relação aos grupos C e ID, que foi caracterizada pela diminuição de neutrófilos totais,

eosinófilos e monócitos em relação aos grupos C e ID (Tabela 3).

Contudo, na avaliação ao longo do tempo, hamsters infectados com a cepa

selvagem pela via IC, apresentaram redução significativa na global de leucócitos

(leucopenia) no período de 9 meses após infecção quando comparados ao período de 1

mês.

Em relação à população de linfócitos observou-se redução no período de 9 meses

após a infecção nos animais infectados pela via IP quando comparados ao período de 3

meses após a infecção. Ainda em relação a esta população celular, observou-se redução

significativa nos animais infectados pela via IC no período de 3 meses após a infecção

quando comparados ao período de 1 mês.

Já em relação aos monócitos os dados obtidos mostraram redução significativa

desta população nos animais infectados pelas vias ID, IP e IC no período de 9 meses após a

infecção quando comparado ao período de 1 mês após a infecção. No período de 3 e 6

meses em animais inoculados pela via IC observou-se redução significativa desta

população em relação ao periodo de 1 mês após a infecção.

Nenhuma diferença estatística foi observada ao longo do tempo avaliado, em

relação a população de neutrófilos e eosinófilos nos hamsters infectados com a cepa

selvagem.


56

1 3 6 9 1 3 6 9

Global de Leucócitos 3640±521 4810±1638 2700±614 3950±994 3120±1029 3590±1199 4240±1102 3610±1005

Neutrófilos Totais 1597±442 2490±1258 1106±448 1783±803 1467±570 2291±1240 1473±511 1848±774Eosinófilos C 53±16 96±50 25±8 43±12 41±22 53,40±29 47±18 56±32Linfócitos 1943±484 2173±932 1470±470 2066±621 1577±617 1183±495 2655±755 1848±774

Monócitos 47±19 52±18 27±25 52±16 35±16 63±28 65±28 41±13

1 3 6 9 1 3 6 9

Global de Leucócitos 4250±846 4990±1049 3930±1421 3440±1561 4225±504 3678±1266 4910±1171 3980±691

Neutrófilos Totais 1296±776 2349±695 1963±1126 1695±882 1837±363 2487±1315 2022±962 1784±546Eosinófilos ID 42±8 68±24 61±44 30±10 57±18 51±29 61±18 57±26Linfócitos 2859±731 2485±606 1802±803 1665±741 1837±719 1589±812 2274±618 2090±405

Monócitos 53±29 68±21 50±28 33±15 94±31 a 53±32 58±31 49±22

Global de Leucócitos 3890±1366 5590±1664 3690±1002 3867±1280 3889±1554 3867±1057 3210±769 b

2200±1035 a, b

Neutrófilos Totais 1267±685 2722±1060 1394±661 1777±627 1537±454 1879±742 852±422 b

798±337 a, b

Eosinófilos IP 38±15 55±17 a 52±23 38±13 62±43 55±25 39±17

b22±10

a, b

Linfócitos 2516±879 2751±947 2185±880 1995±796 2320±957 2376±1261 a 2259±472 1130±622

Monócitos 43±18 56±17 40±9 41±9 88±41 a 50±23 61±30 18±8

a, b

Global de Leucócitos 3580±1604 4480±1383 3000±1159 3056±2496 3770±1078 2220±797 a, b, c

2480±843 a, b

1617±643 a, b

Neutrófilos Totais 1196±660 2156±932 1305±499 1168±1391 1605±490 1185±696 1082±435 b

565±322 a, b

Eosinófilos IC 40±16 68±32 44±31 36±27 54±33 26±11 25±8 a, b

16±6 a, b

Linfócitos 2303±1058 2203±733 1612±859 1373±677 2168±563 981±450 1346±831 a, b, c 1020±379

Monócitos 41±18 53±20 31±11 26±27 a 74±43 28±13 a

27±11 a, c

16±6 a, b

Selvagem

Parâmetros

hematológicosGrupo

Tempo/meses

Parâmetros

hematológicosGrupos

Cepa/meses após a infecção

PP75

Tabela 3: Leucograma de hamsters do grupo controle e experimentalmente infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum.

Valores absolutos (média±desvio padrão) do leucograma de hamsters controle (C) e infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum por diferentes vias de inóculo: intradérmica (ID); intraperitoneal (IP); intracardíaca (IC). As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c relacionadas ao grupo C, ID, IP, respectivamente.


57

As alterações relacionadas à série vermelha estão apresentadas na Tabela 4. Os

valores do número de eritrócitos, níveis de hemoglobina e hematócrito foram os

parâmetros analisados no âmbito do eritrograma a partir do hemograma completo.

Os resultados obtidos neste estudo demonstraram no primeiro mês de infecção com

a cepa PP75, redução significativa dos níveis de hematócrito considerando as três vias de

inóculo ID, IP e IC, em relação aos animais do grupo C. Além disto, 6 meses após a

infecção foi observado um quadro compatível com anemia, nos animais inoculados pelas

diferentes vias de inóculo (ID, IP e IC), que apresentaram redução significativa do número

de eritrócitos, níveis de hemoglobina e hematócrito em relação ao grupo C. Por outro lado,

9 meses após a infecção, os hamsters infectados pela via IP apresentaram aumento do

número de eritrócitos em relação aos grupos C e ID (Tabela 4).

Outro parâmetro analisado neste estudo focou na contagem de plaquetas sendo

possível identificar trombocitose após 3 meses da infecção com a cepa PP75 no grupo IP

em relação ao grupo C, e trombocitopenia no grupo IC em relação ao grupo IP (Tabela 4).

A avaliação ao longo do tempo demonstrou que animais infectados com a cepa

PP75 apresentaram aumento do número de eritrócitos e nos níveis de hemoglobina nos 3

grupos experimentais (ID, IP e IC) no período de 9 meses quando comparado aos períodos

de 1, 3 e 6 meses após a infecção. Já em relação aos níveis de hematócrito, observou-se

aumento nos períodos de 3 e 9 meses após a infecção no grupo inoculado pela via IP

quando comparado ao período de 1 mês após a infecção. Consequente redução nos níveis

de hematócrito foi observada no período de 6 meses em relação aos períodos de 3 e 9

meses após a infecção. No período de 9 meses após a infecção, o grupo IC apresentou

aumento nos níveis de hematócrito quando comparado aos períodos de 1, 3 e 6 meses.

Em relação à contagem de plaquetas, foi observado aumento no período de 3 meses

após a infecção no grupo inoculado pela via IP quando comparado aos períodos de 1, 6 e 9

meses após a infecção.

As principais alterações da série vermelha nos hamsters infectados com a cepa

selvagem foram observadas 6 e 9 meses após a infecção no grupo IC. Neste sentido, um

quadro de anemia grave foi observado após 6 meses de infecção no grupo IC, com redução

significativa do número de eritrócitos, dos níveis de hemoglobina e hematócrito em relação

aos grupos C, ID e IP. De forma semelhante, após 9 meses da infecção, o grupo IC

apresentou um quadro de anemia, caracterizado pela redução do número de eritrócitos em

relação aos grupos C, ID e IP; redução dos níveis de hemoglobina em relação aos grupos C


58

e ID; bem como redução do hematócrito em relação aos grupos C e ID. Adicionalmente,

quando se avaliou a contagem de plaquetas, foi observada trombocitose no grupo IC, após

6 e 9 meses, em relação aos grupos C, ID e IP (Tabela 4).

Na avaliação dos tempos, hamsters infectados com a cepa selvagem apresentaram

redução no número de eritrócitos no período de 9 meses no grupo inoculado pela via IP

quando comparado ao período de 1 mês após a infecção. Ainda observou-se redução no

período de 9 meses após a infecção no grupo inoculado pela via IC em relação aos

períodos de 1, 3 e 6 meses após a infecção.

Em relação aos níveis de hemoglobina, houve redução no período de 6 meses após

a infecção no grupo inoculado pela via ID quando comparado ao período de 1 mês. Ainda

em relação aos níveis de hemoglobina, observou-se redução nos períodos de 3, 6 e 9 meses

após a infecção no grupo inoculado pela via IC quando comparado ao período de 1 mês

após a infecção. Além disso, observou-se redução no período de 6 meses após a infecção

quando comparado aos períodos de 3 e 9 meses após a infecção.

Por outro lado, em relação aos níveis de hematócrito, observou-se redução no

período de 6 meses no grupo infectado pela via IC quando comparado aos tempos de 1 e 3

meses após a infecção. Ainda mostrou redução destes níveis no período de 9 meses em

relação ao período de 1 mês após a infecção.

Em relação a contagem de plaquetas observou-se aumento nos períodos de 6 e 9

meses após a infecção no grupo inoculado pela via IC quando comparado aos períodos de

1e 3 meses após a infecção.


59

1 3 6 9 1 3 6 9

Eritrócitos (106/mm

3) 7,2±0,3 7,2±1,1 8,5±1,2 8,4±1,0 7,4±0,4 7,0±0,3 7,1±0,2 6,7±0,3

Hemoglobina (g/dL) 13,9±0,6 13,5±0,8 17,6±2,1 17,5±2,3 15,0±1,0 13,3±0,9 13,3±0,5 13,2±0,7Hematócrito (%) 35,5±3,6 34,6±7,2 39,5±5,5 38,4±6,7 32,6±1,5 30,5±2,3 32,5±2,3 33,2±2,0Plaquetas (10

6/mm

3) 165,8±37,4 142,6±33,8 154,9±143 127,4±12,5 139,9±20,8 136,4±16,9 164,7±15,5 174,0±20,5

1 3 6 9 1 3 6 9


3) 6,5±0,4 7,2±0,2 6,5±0,4

a 8,5±0,7 7,4±0,3 6,8±0,3 6,7±0,8 6,9±0,3

Hemoglobina (g/dL) 13,7±1,1 13,6±0,5 12,7±1,0a 19,7±4,5 15,2±0,6 13,3±0,7 12,6±1,6 13,7±0,3

Hematócrito (%) 29,3±2,1a 36,3±3,0 31,1±2,7

a 38,3±3,9 33,9±1,5 31,2±3,0 33,6±3,6 34,0±2,0Plaquetas (10

6/mm

3) 123,8±16,2 168,70±25,2

6138,3±19,2 108,1±18,0 156,8±27,5 141,1±24,4 185,5±24,4 189,4±27,3


3) 6,1±0,1 6,8±0,7 6,7±0,2

a9,8±0,5

a,b 7,5±1,0 7,1±0,4 7,0±0,5 6,2±1,0

Hemoglobina (g/dL) 13,4±0,5 13,1±1,2 13,4±0,4a 21,2±1,3 14,4±0,6 13,6±1,2 12,8±1,1 12,0±2,0

Hematócrito (%) 28,9±1,5a 38,7±3,2 31,2±2,7

a 43,9±2,2 32,0±2,6 31,4±3,2 36,1±2,6 31,0±4,2Plaquetas (10

6/mm

3) 134,1±45,3 221,6±75,0

a 132,2±23,4 126,3±14,5 169,3±35,4 145,6±32,1 184,4±32,7 174,6±87,4


3) 6,6±0,4 7,2±0,7 6,8±0,3

a 9,2±1,0 7,1±0,4 6,7±0,3 4,3±1,4a,b,c

4,7±1,9a,b, c

Hemoglobina (g/dL) 13,7±0,8 13,8±1,2 13,6±0,7a 20,0±2,4 14,5±0,9 12,3±1,6 7,0±1,8

a,b,c10,1±4,2

a,b

Hematócrito (%) 30,1±1,8a 35,0±3,6 31,5±2,4

a 41,5±4,3 31,6±2,1 29,0±4,4 21,0±6,9a,b,c

25,0±9,4a,b

Plaquetas (106/mm

3) 134,1±21,5 144,6±22,3

c 135,4±13,5 108,5±17,5 156,5±17,0 110,9±29,8 329,4±153,5a,b,c

291,3±136,4a,b,c

Parâmetros

hematológicosGrupo

Tempo/meses

C

ID

IP

IC

Parâmetros

hematológicosGrupos


PP75 Selvagem

Tabela 4: Eritrograma de hamsters controle e experimentalmente infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum.

Valores (média±desvio padrão) do eritrograma de hamsters controle (C) e infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum por diferentes vias de inóculo: intradérmica (ID); intraperitoneal (IP); intracardíaca (IC). As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c relacionadas ao grupo C, ID, IP, respectivamente.


60

6.6 Avaliação dos parâmetros Bioquímicos

Os dados referentes ao perfil bioquímico dos hamsters do grupo controle e

submetidos à inóculos com as cepas PP75 e selvagem estão demonstrados nos respectivos

gráficos abaixo. Neste estudo, os valores obtidos nos diferentes grupos experimentais (ID,

IC e IP) acima dos valores obtidos no grupo controle C, foram considerados alterados.

6.6.1 Provas de função renal

Para a avaliação da função renal foram realizadas dosagens de uréia e creatinina no

soro de hamsters do grupo C e infectados com as diferentes cepas de L.infantum. Os

resultados obtidos estão demonstrados na Figura 9.

Os resultados demonstraram no sexto mês de infecção com a cepa PP75, aumento

significativo dos níveis de uréia no grupo IC, em relação aos animais do grupo C e IP. Aos 9

meses após a infecção, foi observado aumento dos níveis de uréia nos 3 grupos

experimentais (ID, IP e IC) quando comparado ao grupo C. Além disso, foi detectado neste

mesmo período níveis aumentados de uréia nos grupos IP e IC em relação ao grupo ID

(Figura 9).

A avaliação ao longo do tempo revelou maiores níveis de uréia no grupo IC nos

períodos de 6 e 9 meses quando comparado ao período de 1 mês após a infecção com a cepa

PP75.

As principais alterações nos níveis de uréia nos hamsters infectados com a cepa

selvagem foram observadas em 3 e 6 meses após a infecção no grupo IC, onde foi

observado aumento significativo quando comparado ao grupo C e aos grupos inoculados

pelas vias ID e IP (Figura 9).

Nenhuma diferença significativa foi observada quando se avaliou cada grupo ao

longo dos tempos, na infecçao experimental pela cepa selvagem.

Os resultados obtidos a partir da dosagem dos níveis séricos de creatinina, revelaram

aumento dos níveis em 9 meses após a infeção com a cepa PP75 nos três grupos

experimentais (ID, IP e IC) quando comparados ao grupo C (Figura 9).


61

A avaliação ao longo do tempo demonstrou que animais infectados com a cepa PP75

apresentaram aumento dos níveis de creatinina nos 3 grupos experimentais (ID, IP e IC) no

período de 9 meses quando comparado aos períodos de 1, 3 e 6 meses após a infecção.

Por outro lado, após 3 e 9 meses de infecção com a cepa selvagem pela via IC foi

observado aumento nos níveis de creatinina em relação aos grupos C, ID e IP (Figura 9).

Na avaliação dos tempos, observou-se redução nos níveis de creatinina em hamsters

inoculados pelas vias ID e IP no período de 3 meses quando comparado ao período de 1 mês

após a infecção, sendo que em 6 e 9 meses observou-se aumento destes níveis quando

comparado ao período de 3 meses após a infecção. De forma semelhante, no período de 9

meses observou-se aumento nos níveis de creatina no grupo IC quando comparado aos

períodos de 1 e 3 meses após a infecção.

Figura 9: Níveis séricos de uréia e creatinina de hamsters dos grupos controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

0

1

2

3


0

20

40

60

80

0

1

2

3

0

20

40

60

80


Cre

atin

ina

) (m

g/d

L)

Uré

ia (m

g/d

L)

ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C


62

6.6.2 Prova de função hepática

A avaliação da função hepática foi realizada a fim de verificar possível

comprometimento hepático nos hamsters infectados com as diferentes cepas de L. infantum

Dentre as principais enzimas hepáticas, foram avaliadas as transaminases: aspartato

aminotranferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT). Os resultados estão demonstrados

na Figura 10.

A partir dos valores obtidos da dosagem de AST, observou-se que em animais

infectados com a cepa PP75, houve aumento nos níveis de AST no grupo IC em 1 mês após

a infecção em relação aos grupos C e ID. De forma semelhante, foi demonstrado em 9 meses

após a infecção aumento significativo nos níveis de AST no grupo IC quando comparado

aos grupos C, ID e IP (Figura 10).

Não foram observadas diferenças quando se avaliou cada grupo ao longo dos

tempos.

Por outro lado, em animais inoculados com a cepa selvagem pela via IC observou-se

aumento nos níveis de AST em 3 meses após a infecção quando comparado aos grupos C,

ID e IP. De forma diferente, em 6 meses após a infecção foi observado aumento

significativo nos níveis de AST no grupo IP quando comparado aos grupos C, ID e IP. Aos 9

meses após a infecção, aumento destes níveis foi observado nos grupos IP e IC, quando

comparado tanto ao grupo C quanto ao grupo ID (Figura 10).

Em relação à avaliação ao longo do tempo, observou-se que, no período de 3 meses

após a infecção com a cepa selvagem pela via IC houve aumento nos níveis de AST, quando

comparado ao período de 1 mês após a infecção.

A avaliação dos níveis de ALT revelou que animais inoculados com a cepa PP75

pelas vias IP e IC 1 mês após a infecção, apresentaram aumento nos níveis de ALT, quando

comparado ao grupo C. Aos 9 meses após a infecção foi observado aumento significativo de

ALT no grupo IC quando comparado aos grupos C, ID e IP (Figura 10).

Em relação à avaliação ao longo do tempo, observou-se que, no período de 1 mês

após a infecção com a cepa PP75 pela via IP houve aumento significativo nos níveis de

ALT, quando comparado aos período de 3, 6 e 9 meses após a infecção. Ainda, observou-se

aumento dos níveis de ALT no grupo IC no período de 1 mês quando comparado ao período

de 3 meses após a infecção.


63

Em animais inoculados com a cepa selvagem, pela via IC ocorreu aumento nos

níveis de ALT em relação aos demais grupos (C, ID e IP) 3 meses após a infecção.

Entretanto, aos 6 meses após a infecção este aumento ocorreu nos três grupos (ID, IP e IC),

quando comparado ao grupo C (Figura 10).

Na avaliação ao longo do tempo, observou-se que, no período de 3 meses após a

infecção com a cepa selvagem pela via IC houve aumento significativo nos níveis de ALT,

quando comparado aos período de 1, 6 e 9 meses após a infecção.

Figura 10: Níveis séricos de AST e ALT de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.6.3 Proteinograma

Outro parâmetro avaliado foi à dosagem sérica das proteínas totais, a concentração

de albuminas e globulinas, bem como a relação albumina globulina: A/G


0

100

200

300

400

0

100

200

300

0

100

200

300

400

0

100

200

300


ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C

ALT

(UI/L

)A

ST

(UI/L

)

ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C


64



Pro

teín

as

tota

is (g

/dL

)

0

2

4

6

8

10

0

2

4

6

8

10

ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C

6.6.4 Proteína total

Em animais infectados com a cepa PP75, observou-se aumento nos níveis séricos de

proteínas totais no grupo IP 3 meses após a infecção quando comparado ao grupo C. Por

outro lado, aos 6 meses após a infecção este aumento foi observado no grupo IC quando

comparado ao grupo C (Figura 11).

Na avaliação dos tempos, observou-se que, nos animais infectados com a cepa PP75,

ocorreu aumento significativo nos níveis de proteínas totais no grupo IP no período de 3

meses após a infecção quando comparado ao período de 6 meses após a infecção.

Em relação à infecção com a cepa selvagem, foi demonstrado aumento significativo

de proteínas totais no grupo IC, 9 meses após a infecção quando comparado aos grupos C,

ID e IP (Figura 11).

Na avaliação dos tempos, observou-se que, nos animais infectados com a cepa

selvagem, ocorreu aumento significativo nos níveis de proteínas totais no grupo IC no

período de 9 meses após a infecção quando comparado ao período de 6 meses após a

infecção.

Figura 11: Níveis séricos de proteínas totais de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como valores de densidade óptica. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.6.5 Albumina

A partir dos valores obtidos da dosagem de albumina, observou-se que em animais

infectados com a cepa PP75, houve aumento nos níveis de albumina nos grupos IP e IC em


65

1 e 9 meses após a infecção em relação aos grupos C e ID. Entretanto aos 6 meses após a

infecção, houve uma inversão com redução nos grupos IP e IC, quando comparado aos

grupos C e ID. Aos 3 meses após a infecção, observou-se aumento nos níveis de albumina

nos três grupos experimentais (ID, IP e IC), quando comparado ao grupo C (Figura 12).

Na avaliação dos tempos, observou-se que, nos animais infectados com a cepa PP75,

ocorreu aumento significativo nos níveis de albumina no grupo ID nos períodos de 3, 6 e 9

meses após a infecção quando comparado ao período de 1 mês após a infecção. Ainda

mostrou aumento no período de 3 meses quando comparado aos períodos de 6 e 9 meses

após a infecção. Além disso, foi demonstrado aumento nos níveis de albumina no período de

3 meses no grupo IP em relação aos períodos de 1 e 6 meses após a infecção; no período de

1 mês em relação a 6 meses; e no período de 9 meses quando comparado ao período de 6

meses após a infecção. Logo, no período de 3 meses após a infecção observou-se aumento

nos níveis de albumina no grupo IC quando comparado aos períodos de 1, 6 e 9 após a

infecção. Este aumento foi observado também no período de 1 e 9 meses, porém, quando

comparado aos períodos de 6 meses após a infecção.

Em relação à infecção com a cepa selvagem, foi demonstrado aumento significativo

de albumina nos grupos ID e IP, 3 meses após a infecção quando comparado aos grupos C e

IC. Logo, aos 9 meses após a infecção, aumento foi observado apenas no grupo IC em

relação ao grupo IP (Figura 12).


infecção com a cepa selvagem pela via ID houve aumento significativo nos níveis de

albumina, quando comparado ao período de 9 meses após a infecção. Além disso, foi

demonstrado aumento nos níveis de albumina no período de 3 meses no grupo IP em relação

aos períodos de 1 e 9 meses após a infecção.


66

Figura 12: Níveis séricos de albumina de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como valores de densidade óptica. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.6.6 Globulina

Em animais infectados com a cepa PP75, observou-se redução nos níveis de

globulinas no grupo IC 3 meses após a infecção quando comparado ao grupo C. Por outro

lado, aos 6 meses após a infecção foi demonstrado aumento nos níveis de globulina nos

grupos IP e IC quando comparado aos grupos C e ID. Além disto, aos 9 meses após a

infecção foi observado o contrário, com redução nos níveis de globulina nos grupos IP e IC

quando comparado aos grupos C e ID (Figura 13).

Na avaliação ao longo do tempo, observou-se que, no período de 1 mês após a

infecção com a cepa PP75 pela via ID houve aumento significativo nos níveis de globulina,

quando comparado ao período de 3 meses após a infecção. Aos 6 meses após a infecção

observou-se aumento nos níveis de globulina no grupo IP, quando comparado aos períodos

de 1, 3 e 9 meses após a infecção. Ainda foi demonstrado no período de 1 e 6 meses

aumento de globulina no grupo IC quando comparado ao período de 3 meses após a

infecção.

Em animais infectados com a cepa selvagem, foi observado após 3 meses da

infecção redução nos níveis de globulina nos grupos ID e IP em relação aos grupos C e IC.

Entretanto, aos 9 meses da infecção observou-se aumento significativo de globulina no

grupo IC quando comparado aos demais grupos (C, ID e IP), (Figura 13).



Alb

umin

a(g/

dL)

ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C 0

2

4

6

8

0

2

4

6

8


67

Em relação à avaliação ao longo do tempo, observou-se que, no período de 9 meses

após a infecção com a cepa selvagem pelas vias ID e IC houve aumento nos níveis de

globulina quando comparado aos períodos de 3 e 6 meses mês após a infecção,

respectivamente. Ainda foi demonstrado aumento no período de 1 mês no grupo IC quando

comparado ao período de 6 meses. Além disso, no período de 9 meses após a infecção

observou-se aumento nos níveis de globulina nos animais inoculados pela via IP quando

comparado ao período de 3 meses após a infecção.

Figura 13: Níveis séricos globulina de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como valores de densidade óptica. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.6.7 Relação Albumina Globulina: A/G Outro parâmetro avaliado foi à razão albumina globulina (A/G). Em animais

infectados com a cepa PP75, observou-se aumento da relação A/G no grupo IC 3 meses

após a infecção quando comparado aos demais grupos (C, ID e IP). Por outro lado, aos 6

meses da infecção, foi demonstrada redução na relação A/G nos grupos ID IP e IC quando

comparado ao grupo C. Ainda neste mesmo tempo, houve redução na relação A/G nos

grupos inoculados pelas vias IP e IC quando comparado ao grupo ID. Em contrapartida, aos

9 meses da infecção foi demonstrado aumento significativo na relação A/G nos grupos ID e

IP quando comparado ao grupo C; e ainda aumento nos grupos IP e IC em relação ao grupo

ID (Figura 14).



0

2

4

6

0

2

4

6

Glo

bu

lina

(g/d

L)

ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C


68



Rel

ação

A/G

(g/d

L)

ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C 0

2

4

6

8

0

2

4

6

8


infecção com a cepa PP75 pela via IP houve aumento da relação A/G, quando comparado

aos períodos de 1 e 6 meses após a infecção. De forma semelhante, no período de 3 meses

da infecção no grupo inoculado pela via IC houve aumento da relação A/G quando

comparado aos períodos de 1, 6 e 9 meses da infecção.

Em animais infectados com a cepa selvagem foi observado 3 meses após a infecção

aumento na relação A/G nos grupos ID e IP em relação aos grupos C e IC (Figura 14).

Na avaliação ao longo do tempo, observou-se que, nos períodos de 3 e 6 meses após

a infecção com a cepa selvagem pelas vias ID e IP houve aumento da relação A/G, quando

comparado aos períodos de 1 e 9 meses após a infecção, respectivamente. Além disso,

mostrou aumento no período de 3 meses no grupo inoculado pela via IP quando comparado

ao período de 9 meses após a infecção. No período de 6 meses após a infecção o grupo IC

mostrou aumento da relação A/G quando comparado aos períodos de 1 e 9 meses após a

infecção.

Figura 14: Relação de albumina globulina de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como valores de densidade óptica. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.7 Peso dos hamsters

Os dados obtidos em relação ao peso dos hamsters estão demonstrados na Figura

15. Em hamsters infectados com a cepa PP75 não foram observadas diferenças


69

significativas entre os grupos avaliados nos diferentes tempos ou quando se avaliou cada

grupo ao longo dos tempos.

Em relação a cepa selvagem observou-se redução significativa no peso dos

hamsters inoculados pela via IC em 6 e 9 meses após a infecção quando comparado aos

demais grupos (C, ID e IP) respectivamente.

Conforme a avaliação ao longo do tempo observou-se que, no período de 6 e 9

meses após a infecção com a cepa selvagem, pela via IC, houve redução do peso corporal

quando comparados aos períodos de 1 e 3 meses após a infecção.

Figura 15: Peso dos hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.8 Avaliação anatomopatológica do fígado

6.8.1 Alterações macroscópicas e microscópicas

Na avaliação macroscópica do fígado foram evidenciadas alterações apenas em

hamsters inoculados pela via IC independente da cepa utilizada, sendo observado aspecto

friável, coloração clara e em alguns casos, pequenos nódulos distribuídos aleatoriamente na

superfície do órgão. Estas alterações foram mais evidentes no período de 9 meses após a

infecção e encontram-se demonstradas na Figura 16.

Pes

o (g

ram

as)



ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C0

50

100

150

200

0

50

100

150

200

ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C


70

A) Controle B) Cepa PP75 C) Cepa Selvagem

Figura 16: Alterações macroscópicas do fígado de hamsters controle (C) e experimentalmente inoculados pela via intracardíaca (IC) com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum, avaliados no tempo de 9 meses após infecção: (A) Fígado de hamsters controle com aspecto macroscópico normal; Fígado de hamsters infectados com as cepas PP75 (B) e selvagem (C), ambos apresentando coloração clara.

Os dados em relação ao peso absoluto e relativo do fígado (peso fígado/peso

corporal) estão demonstrados na Figura 17.

A avaliação do peso relativo do fígado revelou aumento significativo em animais

inoculados com a cepa PP75, pela via IC em relação aos demais grupos (C, ID e IP) 9

meses após a infecção.

Em relação à avaliação ao longo do tempo, observou-se aumento significativo do

peso relativo do fígado no período de 9 meses após a infecção com a cepa PP75 pela via

IC quando comparado ao período de 1 mês após a infecção.

Por outro lado, em animais infectados com a cepa selvagem, aos 6 meses após a

infecção, o grupo IC apresentou aumento do peso relativo do fígado em relação aos grupos

C e ID. Já 9 meses após a infecção, o grupo IC apresentou aumento do peso relativo do

fígado em relação aos grupos C, ID e IP.

Contudo, nenhuma diferença estatística no peso relativo hepático foi observada na

infecção com a cepa selvagem ao longo do tempo avaliado.


71



ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C ID IPIC1

C ID IPIC3

C ID IPIC6

C ID IPIC9

C

0

2

4

6

0

2

4

6

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Pes

o re

lativ

o (%

)P

eso

fíg

ado

(g)

Figura 17: Peso do fígado e peso relativo (peso fígado/peso corporal) de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

Ao exame microscópico, os principais achados histopatológicos foram: processo

inflamatório localizado no espaço-porta hepático, sendo a inflamação caracterizada por um

exsudato celular composto por macrófagos, plasmócitos e linfócitos e raros neutrófilos;

granulomas, sendo estes constituídos, predominantemente, por macrófagos, algumas

células epitelióides, linfócitos e raros granulócitos neutrófilos. Além disto, outras

alterações foram observadas, porém com menor freqüência como a presença de fenômenos

degenerativos, dilatação dos sinusóides e hiperemia em alguns casos.

O fígado dos animais do grupo C de ambas as cepas (PP75 e selvagem)

apresentou-se de um modo geral, ao longo de todo o tempo avaliado (1, 3, 6 e 9 meses),

aspecto histológico normal.

Em relação aos animais infectados com a cepa PP75, foi observado aspecto

histológico normal, em 1 e 3 meses após a infecção nos três grupos experimentais (ID, IC e

IP). Contudo no sexto e no nono mês após a infecção utilizando as vias ID, IP e IC, foi


72

possível observar a presença de alguns fenômenos degenerativos, sendo estes em grau

variado, ora apresentando um perfil discreto ora um perfil intenso com dilatação dos

capilares sinusóides. Os grupos ID e IP apresentaram um infiltrado inflamatório discreto

(Figura 18), (Figura 19 A e B) e (Figura 19 E e F). Além disso, foi observado ainda em 6 e

9 meses no grupo IC um infiltrado inflamatório que variou de discreto a moderado (Figura

19 I e J). A partir do sexto mês após a infecção utilizando a via IC, observou-se a presença

de granulomas intralobulares em alguns casos (Figura 20 A e B).

Neste sentido, quando a cepa selvagem foi inoculada utilizando a via ID, em 6 e 9

meses após a infecção, foi observado o infiltrado inflamatório discreto (Figura 19 C e D).

Por outro lado, em animais infectados com via IP, foi demonstrado infiltrado inflamatório

que variou de discreto a moderado (Figura 18) e (Figura 19 G e H), presença de alguns

granulomas intralobulares durante todo o período de avaliação (1, 3, 6 e 9 meses após a

infecção) sendo mais evidentes no sexto e nono mês (Figura 20 C e D), e ainda, fenômenos

degenerativos e dilatação dos capilares sinusóides em alguns casos. Contudo, em animais

infectados com a cepa selvagem pela via IC, foram observadas as maiores alterações

hepáticas, sendo estas, mais pronunciadas no sexto e nono mês após a infecção. Dentre as

principais alterações histológicas observados neste grupo (IC), destacam-se, presença de

granulomas intralobulares observada logo no primeiro e terceiro mês da infecção,

totalizando 40% do grupo. Em 6 e 9 meses após a infecção a presença de granulomas

abrangeu 90% do grupo (Figura 20 E e F). A avaliação histopatológica evidenciou também

infiltrado inflamatório, o qual variou de moderado a intenso (Figura 18), conforme a

evolução da infecção, além disso, observou-se áreas necrose (Figura 20 E e F), dilatação

dos capilares sinusóides e hiperemia. Ainda, foi possível observar neste grupo a presença

de formas amastigotas.

As células inflamatórias no fígado foram quantificadas por morfometria e a Figura

18 ilustra os resultados da quantificação do processo inflamatório hepático, sendo

representado cada um dos grupos (ID, IP e IC) infectados com as diferentes cepas de L.

infantum (PP75 e Selvagem) e avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção.

Em relação aos animais infectados com a cepa PP75, foi observado inflamação,

somente no grupo inoculado pela via IC no sexto mês de infecção, em relação aos grupos

ID e IP. Além disto, o grupo IC apresentou processo inflamatório moderado aos 9 meses

após a infecção quando comparado aos grupos ID e IC.


73



ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9C

élul

asin

flam

atór

ias/

1,5x

106 µ

m2

0

100

200

300

0

100

200

300

ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

A avaliação ao longo do tempo demonstrou aumento do processo inflamatório do

fígado, nos animais infectados com a cepa PP75 pela via IC no período de 9 meses quando

comparados aos períodos de 1, 3 e 6 meses após a infecção.

De modo mais pronunciado, animais infectados com a cepa selvagem apresentaram

processo inflamatório mais precoce e crescente, ocorrendo aumento significativo apenas

nos hamsters inoculados pela via IC.

Neste sentido, a avaliação ao longo do tempo demonstrou aumento do processo

inflamatório hepático, nos animais infectados com a cepa selvagem pela via IP no período

de 9 meses quando comparados aos períodos de 1 e 3 meses após a infecção. Além disso, no

período de 3, 6 e 9 meses após a infecção animais inoculados pela via IC apresentaram

maior infiltrado quando comparado ao período de 1 mês após a infecção. E ainda, nos

períodos de 3 e 6 meses em relação ao período de 9 meses após a infecção.

Figura 18: Avaliação do processo inflamatório no fígado de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.


74

PP75ID

IPIC

6 meses 9 meses

Selvagem

6 meses 9 meses

a b c d

hgfe

i j k l

Figura 19: Fotomicrografias de secções histológicas do fígado de hamsters Mesocricetus auratus inoculados com as cepas PP75 e C46 (selvagem) de L. infantum pelas vias intradérmica (ID), intraperitoneal (IP) ou intracardíaca (IC) avaliados aos 6 ou 9 meses após inóculo: discreto infiltrado inflamatório periportal em animais inoculados por ambas as cepas pela via ID aos 6 (a-c) e 9 (b-d) meses após a infecção ou com a cepa PP75 pela via IP (e-f). Moderado infiltrado periportal aos 6 e 9 meses com a cepa Selvagem pela via IP (g-h) e com a cepa PP75 pela via IC (i-j). Intenso infiltrado inflamatório periportal histiolinfocítico nos animais inoculados com a cepa selvagem pela via IC aos 6 (l) e 9 meses (m) de avaliação. Hematoxilina-Eosina. Barra=50µm.


75

a b

c

e f

d

6 meses 9 mesesP

P75

Sel

vage

m

ICIP

IC

Figura 20: Fotomicrografias de secções histológicas do fígado de hamsters Mesocricetus auratus inoculados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum pelas vias intraperitoneal (IP) ou intracardíaca (IC) avaliados aos 6 ou 9 meses após inóculo: pequenos granulomas intralobulares bem delimitados com presença de linfócitos e macrófagos (a, b, c, d) e grandes granulomas intralobulares com áreas apresentando necrose (setas) em animais inoculados com a cepa selvagem pela via IC aos 6 (e) ou 9 (f) meses de avaliação. Hematoxilina-Eosina. Barra=50µm.


76

Controle Cepa PP75 Cepa selvagem

6.9 Avaliação anatomopatológica do baço

6.9.1 Alterações macroscópicas e microscópicas

As alterações esplênicas macroscópicas observadas com maior frequência incluíram:

aumento de volume do órgão (esplenomegalia), espessamento das bordas, aspecto rugoso e

irregular da superfície e coloração escura, sugerindo um quadro de hiperemia (Figura21).

Figura 21: Alterações macroscópicas do baço de hamsters controle (C) e experimentalmente inoculados pela via intracardíaca (IC) com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum, avaliados no tempo de 9 meses após infecção: Controle: baço com aspecto macroscópico normal; Cepas PP75 e selvagem: baço apresentando aspecto rugoso, coloração escura e diferentes níveis de esplenomegalia.

Os dados obtidos em relação ao peso do baço e, ao peso relativo (peso do baço/peso

corporal) entre os grupos analisados estão demonstrados na Figura 22.

Aos 3 meses de infecção, observou-se um discreto aumento no peso relativo do

baço nos animais infectados com a cepa PP75 pela via IP quando comparado aos grupos

C, ID e IC, normalizando já aos 6 meses de infecção. Em contrapartida, aos 9 meses após a

infecção foi observado aumento expressivo no peso relativo do baço no grupo IC em

relação aos demais grupos.


77



Pes

o re

lativ

o (%

)P

eso

baç

o (g

)

0.0

0.5

1.0

1.5

0.000

0.005

0.010

0.015

0.0

0.5

1.0

1.5

0.000

0.005

0.010

0.015

ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C ID IP IC1

C ID IP IC3

C ID IP IC6

C ID IP IC9

C

A avaliação ao longo do tempo demonstrou aumento no peso relativo do baço nos

animais infectados com a cepa PP75 pela via IC no tempo de 9 meses quando comparados

aos tempos de 1, 3 e 6 meses após a infecção.

Em relação à infecção com a cepa selvagem, o inóculo pela via IP provocou

aumento no peso relativo do órgão 1 e 6 meses após a infecção quando comparado ao

grupo controle ou ao grupo inoculado pela via ID. Nos animais inoculados pela via IC, por

sua vez, apresentaram aumento no peso relativo do baço quando comparado aos demais

grupos, em todos os tempos avaliados (1, 3, 6 e 9 meses).

Em contrapartida, animais inoculados pela via IC com a cepa selvagem

apresentaram aumento progressivo no peso relativo do baço ao longo de todo o tempo

avaliado (1, 3, 6 e 9 meses).

Figura 22: Peso absoluto e relativo do baço (peso baço/peso corporal) de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

Ao exame microscópico, o baço dos animais do grupo C apresentou, ao longo de

todo o tempo avaliado (1, 3, 6 e 9 meses), aspecto histológico normal com polpa branca


78

(PB) organizada em folículos linfóides, bem delimitados apresentando, na maioria das

vezes, centro germinativo e polpa vermelha (PV) constituída principalmente por linfócitos

(Figura 25 e 26 A e E).

De um modo geral, quando a cepa PP75 foi inoculada utilizando as via ID e IP, a

arquitetura histológica do baço foi mantida, ao longo dos nove meses avaliados, com polpa

branca restrita a folículos linfóides primários e secundários. No entanto, aos 3 meses após a

infecção, a polpa vermelha sofreu modificações em decorrência do aumento considerável

de macrófagos. Além disso, na polpa branca, folículos hipertrofiados apresentaram centro

germinativo com depleção de linfócitos e intensa substituição por macrófagos. A partir do

sexto mês após a infecção, apesar de a reatividade estar mantida, a arquitetura apresentou-

se em franca recuperação (Figura 25 B e F) e (Figuras 25 C e G). A infecção com a cepa

PP75 pela via IC provocou acentuada reatividade com aumento do volume e da densidade

linfocitária ao 1, 3 e 6 meses após a infecção. Alterações na polpa vermelha, como

proliferação de macrófagos (Figura 24), variando de discreta a moderada foram

identificadas a partir terceiro mês após a infecção. Estas alterações foram mantidas até o

nono mês, sendo mais frequente neste último mês (Figuras 24) e (Figuras 25 D e H), onde

macrófagos densamente parasitados por formas amastigotas de L. infantum e periesplenite

foram constantemente observados (Figuras 23) e (Figuras 25 D e H).

Na infecção com a cepa selvagem observa-se reatividade e hipertrofia folicular no

primeiro e terceiro mês após o inóculo pelas três vias avaliadas (ID, IP e IC), sendo

mantidas até o nono mês apenas nos grupos onde foram utilizadas as vias ID e IP. Nestes

dois grupos houve proliferação de macrófagos da polpa vermelha, variando de leve a

moderada, a partir do terceiro mês após o inóculo, sendo mais frequente no sexto mês

(Figura 26 B e C). No nono mês, animais inoculados pela via ID apresentaram melhores

níveis de organização tecidual (Figura 26 F) enquanto animais inoculados pela via IP,

mantiveram hiperplasia da polpa vermelha em 60% dos animais (Figura 26 G).

Adicionalmente, aos 6 e 9 meses após inóculo da cepa selvagem pela via IP foi observado

periesplenite (Figura 23) e parasitismo tecidual em 10% e 75% dos animais,

respectivamente. No grupo IC observa-se, nestes dois tempos de avaliação (3 e 6 mês),

atrofia linfóide, relacionada à desorganização histológica onde ocorre perda da definição

ou hipoplasia das regiões da polpa branca, frequentemente associada à proliferação de

macrófagos da PV (Figura 24). Esta associação foi evidenciada principalmente no sexto

mês após o inóculo, onde todos os animais avaliados apresentaram perda da arquitetura


79

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

ID ICC IP

1

ID ICC IP

3

ID ICC IP

6

ID ICC IP

9

ID ICC IP

1

ID ICC IP

3

ID ICC IP

6

ID ICC IP

9



An

imai

s (%

)com substituição parcial à total da PB por células da PV (Figura 26 D e H). Além disto, foi

obervado neste grupo parasitismo tecidual e periesplenite (Figura 23). No nono mês após a

infecção uma recuperação estrutural pode ser observada com níveis menores de

proliferação de macrófagos da PV e redução do parasitismo tecidual. No entanto, a

periesplenite foi um achado constante (Figuras 23) e (Figura 26 D e H).

Figura 23: Percentual de animais apresentando capsula normal ( ) e periesplenite ( ) de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção.

Figura 24: Percentual de animais apresentando aspecto histológico normal ( ); hiperplasia da polpa vermelha variando de discreta ( ), moderada ( ) e intensa ( ) de hamsters do grupo controle (C, n=80) e experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção.

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100


ID ICC IP

1

ID ICC IP

3

ID ICC IP

6

ID ICC IP

9

ID ICC IP

1

ID ICC IP

3

ID ICC IP

6

ID ICC IP

9


Ani

ma

is (%

)


80

6 m

eses

9 m

eses

ICIPIDCC

epa

PP

75

a b c d

e f g h

Figura 25: Fotomicrografias de secções histológicas do baço de hamsters Mesocricetus auratus inoculados com a cepa PP75 de L. infantum pelas vias intradérmica (ID), intraperitoneal (IP) ou intracardíaca (IC) avaliados aos 6 ou 9 meses após a infecção: aspecto histológico normal evidenciando a organização nodular da polpa branca esplênica em hamsters não infectados (a, e) ou inoculados pelas vias ID (b, f) e IP (c, g) aos 6 (a-c) ou 9 (e-g) meses de avaliação; desorganização histológica com hiperplasia discreta (d) ou moderada (h) de macrófagos da polpa vermelha 6 ou 9 meses após a infecção pela via IC, respectivamente, e periesplenite indicada pela linha pontilhada (h). Hematoxilina-Eosina. Barra=50µm.


81

6 m

eses

9 m

eses

ICIPIDCC

epa

sel

vage

m

a b c d

e f g h

Figura 26: Fotomicrografias de secções histológicas do baço de hamsters Mesocricetus auratus infectados com a cepa selvagem de L. infantum pelas vias intradérmica (ID), intraperitoneal (IP) ou intracardíaca (IC) avaliados aos 6 ou 9 meses após a infecção. Aspecto histológico normal evidenciando a organização nodular da polpa branca esplênica em hamsters não infectados aos 6 (a) ou 9 (e) meses de avaliação (cápsula sem alteração – seta em a); hamsters inoculados pelas vias ID (b) e IP (c) mostrando hiperplasia discreta de macrófagos da polpa vermelha 6 meses após a infecção, retornando à normalidade histológica aos 9 meses para o grupo ID (f) e mantendo hiperplasia discreta de macrófagos da polpa vermelha aos 9 meses para o grupo IP (g); hamsters inoculados pela via IC apresentando atrofia linfóide, periesplenite (linha pontilhada em d, h) e hiperplasia intensa de macrófagos da polpa vermelha com perda da organização histológica 6 meses após a infecção pela via IC (d) e manutenção de hiperplasia moderada de macrófagos da polpa vermelha aos 9 meses (h). Hematoxilina-Eosina. Barra=50µm.


82

6.10 Avaliação da carga parasitária no fígado e baço: LDU (Leishmam donovam Units)

e PCR em tempo real

Com a finalidade de avaliar a evolução da infecção em hamsters experimentalmente

infectados com as diferentes cepas (PP75 e selvagem) de L. infantum por diferentes vias

de inóculo (ID, IP e IC), a quantificação da carga parasitária foi realizada em amostras de

fígado e baço, sendo determinada pelas técnicas de LDU e qPCR em tempo real e

avaliados nos tempos de 1,3, 6 e 9 meses após a infecção.

6.10.1 LDU (Leishmam Donovam Units)

Os dados obtidos através do índice de LDU no fígado dos animais infectados com a

cepa PP75 mostraram maior parasitismo em 6 e 9 meses (com 40 e 44% dos animais

apresentado o parasito, respectivamente) após a infecção, nos animais inoculados pela via

IC, quando comparados aos grupos ID e IP. Não foi observado amastigota no fígado dos

hamsters inoculados pelas vias ID e IP após a infecção com a cepa PP75 (Figura 27) e

(Figura 29).

Por outro lado, em animais infectados com a cepa selvagem do grupo IC o

parasitismo do fígado, analisado pelo índice LDU, apresentou aumento em relação aos

grupos ID e IP, em todos os tempos avaliados (1, 3, 6 e 9 meses após o inóculo), com

100% de positividade no sexto e nono mês após a infecção. Entretanto, em hamsters

inoculados pela via IP o parasitismo no fígado iniciou apenas a partir do sexto mês,

seguindo até o nono mês após a infecção, sendo superior ao do grupo ID. Sendo que em 6

meses 60% dos animais apresentaram o parasito e em 9 meses, 87% (Figura 27) e (Figura

29).


83



Índ

ice

de

LD

U (L

og

x 1

0-3

)

a,b

a,ba,b

a,b a

a,ba,b

a

ID IP IC9

ID IP IC6

ID IP IC3

ID IP IC1

ID IP IC9

ID IP IC6

ID IP IC3

ID IP IC1

1

10

100

1000

10000

1

10

100

1000

10000

Figura 27: Densidade parasitária no fígado de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas por “a” e “b” relacionados ao grupo ID e IP, respectivamente.

No baço, os animais infectados com a cepa PP75 pelas vias ID e IP, não

demonstraram parasito na microscopia optica. Entretanto, nos animais infectados pela via

IC, o parasitismo foi observado 6 e 9 meses após a infecção, em relação aos grupos ID e

IP. Sendo que em 6 meses 40% apresentaram parasitismo no baço e em 9 meses 70%

(Figura 28) (Figura 29).

Em contrapartida, animais infectados com a cepa selvagem apresentaram parasito

no baço quando inoculados tanto pela via IP quanto pela IC. Entretanto, nos animais

inoculados pela via IP o parasito foi observado a partir de 3 meses após a infecção em 20%

dos animais seguindo até o nono mês após a infecção atingindo 100%, sendo superior ao

do grupo ID. Por outro lado, nos inoculados pela via IC estes foram observados a partir do

primeiro mês de infecção e apresentou aumento em relação aos grupos ID e IP, em todos

os tempos avaliados (1, 3, 6 e 9 meses após o inóculo). O percentual foi de 70% no

primeiro mês e 100% nos demais (3, 6 e 9 meses após a infecção) (Figura 28) (Figura 29).


84



Índ

ice

de

LD

U (L

og

x 1

0-3

)

1

10

100

1000

10000

*

1

10

100

1000

10000

a,b

a,b

a,ba,b a

a,ba,b

a,b

ID IP IC9

ID IP IC6

ID IP IC3

ID IP IC1

ID IP IC9

ID IP IC6

ID IP IC3

ID IP IC1

Figura 28: Densidade parasitária no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80) com as cepas PP75 ou selvagem de L.

infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas por “a” e “b” relacionados ao grupo ID e IP, respectivamente.


85

Fíg

ado

Baç

o


a b c

d e f

Figura 29: Densidade parasitária no fígado e baço de hamsters experimentalmente infectados com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum inoculados pelas vias IP e IC, avaliados aos 9 meses após a infecção. Presença de poucas amastigotas em animais infectados com a cepa PP75 pela via IC (A) e infectados com a cepa selvagem pela via IP (B-E) e IC (C). Intenso parasitismo esplênico em animais infectados com a cepa PP75 (D) ou selvagem (F) pela via IC. Giemsa. Barra = 10µm.

6.11 Análise de correlação: parasitismo no baço X IgG total

Visando identificar associação entre parasitismo tecidual no baço e fígado medido

pela LDU versus os níveis de IgG, foi realizada uma análise de correlação entre estes

parâmetros.

A Figura 30 representa a correlação entre IgG total e o parasitismo no baço de

hamsters experimentalmente infectados com a cepa selvagem utilizando a via IC. Foi

observada uma associação positiva forte (P= 0,001; r=0,7882); (P= 0,001; 0,7559) entre

estes dois parâmetros no baço, tanto para cepa PP75, quanto para a cepa selvagem,


86

IgG

tota

l

amastigotas no baço

r=0,7882p=0,0001

r=0,7559p=0,0001

0 3000 60000.00

0.25

0.50

0 1500 30000.00

0.25

0.50


respectivamente. Entretanto não foi evidenciada correlação entre IgG total e o parasitismo

determinado pelo índice de LDU no fígado, com as diferentes vias de inóculo avaliadas.

Figura 30: Análise de correlação entre o número de amastigotas no baço de hamsters experimentalmente inoculados pela via intracardíaca (IC;▼) com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum. Os índices de correlação de Pearson (r) e os valores p estão representados nos gráficos.

6.12 PCR em tempo real

Os resultados obtidos pela qPCR em tempo real encontram-se apresentados

utilizando dois métodos de análise. No primeiro, foi determinado o número de amastigotas

obtidas a partir de 20ng de DNA e no segundo, os resultados obtidos foram demonstrados a

partir do cálculo do número de amastigotas em 20mg de tecido multiplicado pelo peso do

órgão.

Os dados obtidos do fígado após a infecção com as cepas PP75 e selvagem estão

representados na Figura 31, sendo que no painel superior, referente às cepas (PP75 e

selvagem), encontram-se os resultados obtidos a partir do número de amastigotas em 20ng

de DNA no fígado e, no painel inferior, o número de amastigotas em 20mg de tecido x

peso do fígado.

Conforme demonstrado na Figura 31A, animais infectados com a cepa PP75,

mostraram redução na carga parasitária no grupo IC em 3 meses após a infecção quando

comparados ao grupo IP. Portanto, em uma segunda análise, onde foi obtido o número de

amastigotas pelo peso do órgão, observou-se ainda neste mesmo período diferença

significativa na carga parasitária no grupo IP em relação ao grupo ID. Além disso, no sexto

mês foi possível observar redução na carga parasitária no grupo IP quando comparado ao


87

grupo ID, além de aumento da carga parasitária no grupo IC em relação aos grupos ID e

IP.

Por outro lado, em animais infectados com a cepa selvagem, no primeiro mês de

infecção foi observado aumento do número de amastigotas no IC quando comparado ao

grupo IP. Além disso, em 3, 6 e 9 meses observou-se aumento significativo no número de

amastigotas no grupo IC quando comparado aos grupos ID e IP. Entretanto quando o

número de amastigotas foi calculado multiplicando pelo peso do fígado, o aumento no

número de amastigotas foi significativo apenas em 6 e 9 meses no grupo inoculado pela via

IC quando comparado aos grupos ID e IP (Figura 31 B).


88

A)

B)

Cepa PP75

Cepa selvagem

nº d

e a

ma

stig

otas

0

20

40

60

80

0

20

40

60

80

0

20

40

60

80

0

20

40

60

80

a

b ab

0

50

100100

200

300

0

50

100100

200

300

0

50

100100

200

300

0

50

100100

200

300

nº d

e a

ma

stig

otas

x p

eso

(10

6 )

0

20

40

60

80

0

100

150

200

40

80

20

60

0

20

40

60

80

0

100

150

200

40

80

20

60

a,b

a,b

0

100

200

300

0

100

200

300

0

100

200

300

0

100

200

300

nº d

e a

ma

stig

ota

sn

º de

ama

stig

ota

s x

pes

o (1

06 )

1 3 6 9

ID IP IC ID IP IC ID IP IC ID IP IC


b

b

a,b a,b

a,b

Figura 31: Número de amastigotas no fígado de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80). Em (A) Cepa PP75 e em (B) Cepa selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas letras “a” e “b” relacionados ao grupo ID e IP, respectivamente.

Os dados obtidos do baço após a infecção com as cepas PP75 e selvagem estão

representados na Figura 32. No painel superior encontram-se os resultados obtidos a partir

20ng de DNA de baço e no painel inferior os resultados obtidos a partir do cálculo do

número de amastigotas em 20mg de tecido x peso do baço.


89

Conforme demonstrado na Figura 32 A, animais infectados com a cepa PP75

apresentaram aumento na carga parasitária no grupo IC em 3 e 6 meses após a infecção

quando comparado aos grupos ID e IP. Por outro lado, em uma segunda análise onde foi

determinado o número de amastigotas em 20mg de tecido x peso do baço, observou-se no

primeiro mês aumento da carga parasitária no baço dos animais inoculados pela via ID em

relação ao grupo IP.

Por outro lado, em animais infectados com a cepa selvagem, pela via IC apresentou

aumento na carga parasitária em relação aos grupos ID e IP, em todos os tempos avaliados

(1, 3, 6 e 9 meses após o inóculo). Entretanto em uma segunda análise quando o número de

amastigotas foi calculado multiplicando pelo peso do baço, o aumento no número de

amastigotas foi significativo apenas em 6 e 9 meses no grupo inoculado pela via IC quando

comparado aos grupos ID e IP (Figura 32 B).


90

0

0.5

1

1.5

2

0

0.5

1

1.5

2

0

0.5

1

1.5

2

0

0.5

10

20

2

30

1.5

1.0

0

1

2

3

5

4

00.5

11.5

2

200

100

300

400

00.5

11.5

2

200

100

300

400

0

1

2

3

5

4

ID IP IC ID IP IC ID IP IC ID IP IC

a,bb

a

a,ba,b

a,b

0

100

200

2000

4000

0

100

200

2000

4000

0

100

200

2000

4000

0

100

200

2000

4000

0

100

200

2000

4000

0

100

200

2000

4000

0

100

2002000

3000

4000

0

100

200

2000

4000

A)

B)

Cepa PP75

Cepa selvagem

nº d

e a

ma

stig

ota

snº

de

ama

stig

otas

nº d

e am

ast

igot

as x

pe

so (

106 )

1 3 6 9


nº d

e a

mas

tigo

tas

x p

eso

(106 )

a,b

a,b

a,ba,b

a,b a,b

a

Figura 32: Número de amastigotas no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=80), intraperitoneal (IP, n=80) e intracardíaca (IC, n=80). Em (A) Cepa PP75 e em (B) Cepa selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas letras “a” e “b” relacionados ao grupo ID e IP, respectivamente


91

1 3 6 9 1 3 6 9

10/10 (100%) 9/10 (90%) 10/10 (100%) 5/10 (50%) 9/10 (90%) 3/10 (30%) 6/10 (60%) 6/10 (60%)

25,7±13,45 29,50±12,21 34±3,9 17±18,64 49,20±36,65 15,80±31,70 24,60±27,90 26,20±27,70

4/10 (40%) 4/10 (40%) 3/10 (30%) 4/10 (40%) 5/10 (50%) 4/10 (40%) 4/10 (40%) 6/10 (60%)

23,40±31,85 7,50±10,47 5,50±8,96 8,4±10,90 8,70±9,95 5,55±8,41 11,50±16,01 20,40±21,04

7/10 (70%) 8/10 (80%) 8/10 (80%) 8/9 (88%) 9/10 (90%) 9/10 (90%) 6/10 (60%) 7/8 (87%)

21±11,72 53±38,10 30,70±2,75 33,80±42,51 26,67±12,91 47,30±34,86 38,75±39,31 77,25±97,67

5/10 (50%) 8/10 (80%) 2/10 (20%) 4/9 (44%) 2/10 (20%) 6/10 (60%) 9/10 (90%) 8/8 (100%)

16,30±20,69 17±10,27 6,90±14,59 11,22±13,63 2,90±6,22 17,70±15,67 61,50±68,20 79,43±43,84 a

9/10 (90%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 6/9 (66%) 10/10 (100%) 9/10 (90%) 10/10 (100%) 6/6 (100%)

15,8±16,51 23,70±13,1 b 24,90±14,70 41,78±29,63 65,20±17,36

b107,60±145,1

a,b190,2±188,1

a,b206,7±118,1

a,b

9/10 (90%) 4/10 (40%) 7/10 (70%) 8/9 (88%) 9/10 (90%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 6/6 (100%)37,20±18,93 8,40±11,91 52,90±100,2

a,b99,56±161,1

a,b39,50±25,41

a,b46,10±13,50

a,b2168±27,02

a,b1508±852,09

a,b

Grupos


PP75 Selvagem

ID

Fígado

Baço

IC

Baço

IP

Baço

Fígado

Fígado

Tabela 5: Número de amastigotas a partir de 20ng de DNA em amostras de fígado e baço de hamsters experimentalmente infectados com promastigotas de L. infantum

Valores absolutos (n), frequencia (%) e valores (média±desvio padrão) do número de amastigotas em 20ng de DNA de amostras de baço e fígado de hamsters infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum por diferentes vias de inóculo: intradérmica (ID); intraperitoneal (IP); intracardíaca (IC). As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a e b relacionadas, ao grupo ID, IP e IC respectivamente.


92

6.13 Avaliação da expressão relativa de mRNA das citocinas proinflamatórias TNF-αααα e

IFN-γγγγ e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-ββββ) no baço

6.13.1 Citocinas proinflamatórias TNF-αααα e IFN-γγγγ

A expressão relativa de mRNA das citocinas TNF-α e IFN-γ foi avaliada

quantitativamente pela técnica de qRT-PCR no baço de hamsters experimentalmente

infectados com L. infantum e os resultados estão representados em expressao relativa de

mRNA/citocinas na Figura 33.

Após 1 mês do inóculo, nos animais infectados com a cepa PP75 observou-se que a

expressão relativa de mRNA da citocina TNF-α α α α nos animais inoculados pela via IC foi

significativamente superior que no grupo ID (Figura 33). Não foi observado diferença

significativa entre os grupos experimentais nos tempos de 3, 6 e 9 meses após a infecção

com esta cepa.

De forma diferente, em hamsters infectados com a cepa selvagem a expressão

relativa de mRNA da citocina TNF-α nos animais inoculados pela via IC foi maior que no

grupo ID, apenas no terceiro mês de infecção(Figura 33).

Não foram observadas diferenças significativas quando se avaliou cada grupo ao

longo dos tempos.

Em relação à citocina IFN-γγγγ, observou-se maior expressão de mRNA nos animais

infectados com a cepa PP75 pela via IC em relação aos demais grupos (ID e IP) nos

tempos de 6 e 9 meses após a infecção (Figura 33).

A avaliação ao longo do tempo mostrou que animais infectados com a cepa PP75

pela via IP, no período de 9 meses após a infecção, apresentam aumento na expressão de

mRNA de IFN-γ quando comparado aos períodos de 1, 3 e 6 meses. Desta maneira, no

período de 6 meses observou-se aumento significativo na expressão de mRNA de IFN-γ

nos animais inoculados pela via IC em relação aos períodos de 1 e 3 meses após a infecção.

Da mesma forma, foi observado maior expressão de mRNA de IFN-γ no grupo IC no

período de 9 meses em relação aos períodos de 1, 3 e 6 meses após a infecção.

Por outro lado, os resultados obtidos em relação à cepa selvagem monstraram

aumento na expressão do mRNA de IFN-γ, nos animais inoculados pela via IP em relação

a via ID, 3 meses após a infecção. Além disto, neste mesmo tempo, observou-se maior


93



0

1

2

3

0

1

2

3

0

5

10

15

20

0

5

10

15

20

Exp

ress

ão

Re

lativ

a

TNF-αααα

IFN-γγγγ

ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

expressão do mRNA desta citocina nos animais infectados pela via IC em relação aos

grupos ID e IP. No sexto e nono mês após a infecção observou-se aumento na expressão de

mRNA de IFN-γ, nos animais inoculados pelas vias IP e IC quando comparado a via ID

(Figura 33).

Ao longo do tempo, maior expressão de mRNA de IFN-γ foi observada nos animais

inoculados pela via IP no período de 6 meses quando comparado aos períodos de 1 e 3

meses após a infecção. Além disto, em 9 meses observou-se uma redução significativa da

expressão de mRNA desta citocina neste mesmo grupo quando comparado ao período de 6

meses. Por outro lado, observou-se aumento da expressão gênica relativa da citocina IFN-

γ no grupo IC nos períodos de 3 e 6 meses quando comparado ao perído de 1 mês.

Entretanto, no período de 9 meses a expressão de mRNA desta citocina diminuiu em

relação aos períodos de 3 e 6 meses após a infecção.

Figura 33: Expressão relativa de mRNA das citocinas proinflamatórias TNF-α e IFN-γ no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=48), intraperitoneal (IP, n=48) e intracardíaca (IC, n=48) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.


94

6.13.2 Citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-ββββ

A expressão relativa de mRNA das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β foi

avaliada quantitativamente pela técnica de qRT-PCR no baço de hamsters

experimentalmente infectados com L. infantum e os resultados estão representados na

Figura 34.

Nos animais inoculados com a cepa PP75 pela via IC foi observado aumento

significativo na expressão relativa da citocina IL-10 quando comparado ao grupo ID no

primeiro mês após a infeção e ID e IP no sexto mês após a infecção. Ao contrário, aumento

de mRNA desta citocina foi observado nos animais inoculados pela via IP quando

comparado aos demais grupos 9 meses após a infecção (Figura 34).

Ao longo do tempo, observou-se que animais inoculados com a cepa PP75

apresentaram redução significativa da expressão de mRNA para de IL-10 no período de 6

meses após a infecção nos animais inoculados pelas vias ID e IP quando comparados aos

períodos de 1 e 3 meses. Por outro lado, no período de 9 meses foi observado aumento

significativo na expressão de mRNA para IL-10 no grupo inoculado pela via IP quando

comparado ao período de 6 meses após a infecção. Além disso, nos períodos de 6 e 9

meses após a infecção o grupo inoculado pela via IC apresentou redução significativa na

expressão de mRNA quando comparado aos perídos de 1 e 3 meses.

Por outro lado, animais infectados com a cepa selvagem apresentaram aumento

significativo na expressão mRNA para IL-10 nos animais inoculados pela via IC, quando

comparado aos demais grupos 3 meses após a infeção. Entretanto, no nono mês após a

infecção, foi observado uma diminuição na expressão de mRNA para essa citocina nos

animais inoculados via IC em relação aos grupos ID e IP (Figura 34).

Animais infectados com a cepa selvagem, apresentaram aumento de mRNA para

IL-10 nos grupos inoculados pelas vias ID e IP no período de 9 meses após a infecção

quando comparados aos tempos de 1, 3 e 6 meses após a infecção. Por outro lado,

observou-se maior expressão de mRNA para IL-10 no grupo IC no período de 3 meses

quando comparado aos períodos de 6 e 9 meses após a infecção.

Animais infectados com a cepa PP75, apresentaram aumento significativo na

expressão de mRNA para a citocina TGF-β, no sexto mês após a infecção, no grupo

inoculado pela via IC em relação aos grupos ID e IP (Figura 34).


95

A análise ao longo do tempo mostrou que em hamsters infectados com a cepa PP75

pelas 3 vias de inóculo nos períodos de 3, 6, 9 apresentaram redução significativa na

expressão relativa de mRNA para a citocina TGF-β quando comparado ao período de 1

mês após a infecção.

De forma diferente, no terceiro mês após a infecção, os animais infectados com a

cepa selvagem pela via IC apresentaram aumento significativo de mRNA para TGF-β

quando comparados aos grupos ID e IP. Entretanto, no nono mês após a infecção foi

observado uma diminuição na expressão de mRNA para essa citocina nos animais

inoculados via IC em relação aos grupos ID e IP (Figura 34).

Ao longo do tempo, observou-se que animais infectados com a cepa selvagem

pelas vias ID e IP apresentaram aumento na expressão de mRNA para a citocina TGF-β no

período de 9 meses quando comparado ao período de 1, 3 e 6 meses. Por outro lado, o

grupo inoculado pela via IC no período de 3 meses apresentou maior expressão mRNA

para TGF-β quando comparado aos períodos de 1 e 3 meses após a infecção.


96



Exp

ress

ão

Re

lativ

a

TGF-ββββ

IL-10

ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

0

1

2

3

0

1

2

3

0

1

2

3

0

1

2

3

Figura 34: Expressão relativa de mRNA das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-β no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=48), intraperitoneal (IP, n=48) e intracardíaca (IC, n=48) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.14 Razão de TNF-αααα/TGF-ββββ e TNF-αααα/IL-10 no baço de hamsters infectados com

promastigotas de L. infantum


significativo na razão TNF-α/TGF-β, quando comparado ao grupo ID e IP no nono mês

após a infeção (Figura 35). Não foram observadas diferenças quando se avaliou cada grupo

ao longo do tempo

Em contrapartida, em hamsters infectados com a cepa selvagem não foram

observadas diferenças significativas na razão TNF-α/TGF-β, entre os grupos avaliados nos

diferentes tempos (Figura 35), ou quando se avaliou cada grupo ao longo dos tempos.


97

Em relação à razão TNF-α/IL-10 foi observado redução na razão, nos animais

infectados com a cepa PP75 pela via IP quando comparado aos grupos ID, em 3 meses

após a infecção. Além disso, no nono mês após a infecção foi observado aumento

significativo na razão TNF-α/IL-10 no grupo IC quando comparado aos grupos ID e IP

(Figura 35).


pela via IC, no período de 9 meses após a infecção, apresentam aumento na razão TNF-

α/IL-10 quando comparado aos períodos de 1, 3 e 6 meses infecção.

Contudo, em hamsters infectados com a cepa selvagem não foram observadas

diferenças na razão TNF-α/IL-10 entre os grupos avaliados nos diferentes tempos (Figura

35).

A avaliação ao longo do tempo mostrou que animais infectados com a cepa

selvagem pela via IP, no período de 9 meses após a infecção, apresentam redução na razão

TNF-α/IL-10 quando comparado aos períodos de 1 e 6 meses após a infecção.


98



ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

TN

F-α

/IL-1

0

ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

TN

F-α

/TG

F-β

0

1

2

3

0

1

2

3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Figura 35: Razão TNF-α/TGF-β e TNF-α/IL-10 no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=48), intraperitoneal (IP, n=48) e intracardíaca (IC, n=48) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

6.15 Razão de IFN-γγγγ/TGF-ββββ e IFN-γγγγ/IL-10 no baço de hamsters infectados com

promastigotas de L. infantum


significativo na razão IFN-γ/TGF-β, quando comparado ao grupo IP no sexto mês após a

infeção. Além disso, em 9 meses após a infecção o grupo IC apresentou aumento na razão

IFN-γ/TGF-β, quando comparado aos grupos ID e IP (Figura 36).


pela via IC, nos períodos de 6 e 9 meses após a infecção, apresentam aumento na razão

IFN-γ/TGF-β quando comparados aos períodos de 1, 3 meses após a infecção


99

respectivamente. Ainda mostrou aumento no período de 6 meses quando comparado ao

período de 9 meses após a infecção.

Por outro lado, em animais infectados com a cepa selvagem foi observado aumento

da razão IFN-γ/TGF-β no grupo inoculado pela via IC no terceiro mês após a infecção,

quando comparado as vias ID e IP, além disso, no sexto e nono mês após a infecção este

aumento foi observado no grupo IC apenas em relação ao grupo ID (Figura 36).


selvagem pelas vias IP e IC, no período de 6 meses após a infecção, apresentam aumento

na razão IFN-γ/TGF-β quando comparado aos períodos de 1, 3 e 9 meses após a infecção.

Em relação à razão IFN-γ/IL-10 foi observado aumento significativo nos animais

infectados com a cepa PP75 pela via IC quando comparado aos grupos ID e IP, em 9

meses após a infecção (Figura 36).


pela via IC, no período de 9 meses após a infecção, apresentam aumento na razão IFN-

γ/IL-10 quando comparado aos períodos de 1, 3 e 6 meses após a infecção.

Os animais infectados com a cepa selvagem demonstraram aumento da IFN-γγγγ/IL-

10 no terceiro mês da infecção no grupo inoculado pela via IC em relação aos demais

grupos (ID e IP). Ainda, no sexto e nono mês este aumento foi observado no grupo IC,

porém em relação apenas ao grupo ID (Figura 36).


selvagem pelas vias IP e IC, no período de 6 meses após a infecção, apresentam aumento

na razão IFN-γ/IL-10 quando comparado aos períodos de 1, 3 e 9 meses após a infecção.


100



ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

IFN

-γ/IL

-10

ID IP IC1

ID IP IC3

ID IP IC6

ID IP IC9

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

IFN

-γ/T

GF

-β Figura 36: Razão IFN-γ/TGF-β e IFN-γ/IL-10 no baço de hamsters experimentalmente inoculados pelas vias intradérmica (ID, n=48), intraperitoneal (IP, n=48) e intracardíaca (IC, n=48) com as cepas PP75 ou selvagem de L. infantum, avaliados nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre a infecção com as diferentes vias de inóculo estão representadas pelas linhas conectoras.

7. DISCUSSÃO

Moreira, N. D. Discussão

102

A elevada prevalência, as dificuldades na intervenção em nível de controle e

profilaxia no ciclo de transmissão e a repercussão sócio econômica tornam as

leishmanioses, em especial a LV, um grande problema de saúde pública no Brasil e no

mundo. Um dos atuais e grandes desafios dos pesquisadores para vencer a crescente

urbanização da LV, em diversas áreas do mundo, é a busca de estratégias imunoprofiláticas

e terapêuticas capazes de promover a melhora clínica, a cura parasitológica e reverter

quadros graves da doença. No entanto, uma das grandes limitações para atingir êxito

dessas metas são os ensaios pré-clínicos destinados a testes de esquemas terapêuticos ou

vacinais para LV. Estes testes consistem basicamente na avaliação em modelos

experimentais que reproduzam os principais eventos clínicopatológicos decorrentes do

curso natural da infecção. A necessidade de caracterizar modelos, que reproduzam a LV

humana e canina, na sua forma ativa, é um dos fatores limitantes e extremamente

importante na sua escolha, seja para testes de drogas e ensaios vacinais.

O modelo experimental hamster desempenha importante papel no estudo das

leishmanioses uma vez que diversos autores tem demonstrado em trabalhos anteriores uma

elevada susceptibilidade deste modelo à infecção por espécies de Leishmania, responsáveis

pelas formas clínicas, seja por L. donovani (Duarte et al., 1988; Gifawesen & Farrell,

1989; Ghose et al., 1999), responsável pela LV no Velho Mundo ou por L. infantum

(Bories et al., 1998; Requena et al., 2000) agente etiológico da LV no Novo Mundo. Neste

contexto, o hamster se torna extremamente importante uma vez que, observam-se

caracteristicamente, uma associação entre parasitismo, títulos elevados de anticorpos e

ausência de respostas linfoproliferativas (Evans et al., 1990; Requena et., 2000; Melby et

al., 2001; Riça-Capela et al., 2003). Tais biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e

monitoração apresentam-se com perfis muito semelhantes aos observados na LV humana e

canina. Portanto, um melhor entendimento do desempenho do hamster como modelo

experimental para LV, torna-se fundamental, uma vez que reproduz diversos aspectos

clínico-patológicos da doença humana e canina.

Assim, no presente estudo avaliou-se o estabelecimento da infecção experimental

no modelo hamster, utilizando três diferentes vias de inóculo (intradérmica, intraperitoneal

e intracardíaca) e duas cepas de L. infantum (PP75 e selvagem) com perfis distintos de

virulência e patogenicidade buscando assim, ampliar as abordagens investigativas na busca

de marcadores de prognóstico e monitoração, através da avaliação das alterações

histopatológicas no baço e fígado, bem como análises imunológicas e parasitológicas.


103

Em uma primeira abordagem foi avaliado o perfil de crescimento in vitro das

formas promastigotas pertencentes às cepas PP75 e selvagem de L.infantum. Os dados

obtidos demonstraram que as formas promastigotas de ambas as cepas avaliadas

apresentaram perfis de crescimento semelhante e com um perfil clássico de crescimento e

variando de uma fase lag para logarítmica, passando para estácionária e por fim declínio.

Vale ressaltar que as condições de cultivo de ambas as cepas foram às mesmas durante

todo o experimento. Embora tenha sido demonstrado no trabalho publicado por Schuster et

al. (2002) que cepas de mesma espécie de Leishmania sp., mantidos sob as mesmas

condições de cultivo podem apresentar diferenças em seus perfis de crescimento, em nosso

trabalho não foi observado nenhuma diferença neste perfil. Esta análise inicial do

crescimento das formas promastigotas de ambas as cepas foi extremamente importante

para certificarmos de que as cepas utilizadas para o inóculo no modelo hamster fossem

capazes de induzir uma infecção eficaz, importante para a realização das análises

subsequentes.

Posteriormente ao estabelecimento da infecção foi avaliada a presença de sinais

clínicos em hamsters infectados com as cepas PP75 e selvagem de L. infantum, por meio

de uma cinética de infecção experimental, nos tempos de 1, 3, 6 e 9 meses após a infecção.

Os hamsters apresentaram sinais clínicos clássicos similares aos observados na LV

sintomática humana, tais como: emagrecimento acentuado e esplenomegalia. Estes

achados foram mais evidentes no nono mês após a infecção com a cepa PP75, no grupo IC,

porém com baixa frequência. Logo, a cepa selvagem foi mais infectiva, os sinais clínicos

foram mais frequentes e com maior exacerbação no grupo IC, com 80% (6 meses) e 100%

(9 meses) dos animais apresentando esplenomegalia, sendo este o achado mais prevalente

do grupo, seguido de emagrecimento com consequente caquexia no ultimo mês da

infecção. No entanto, animais infectados pela via IP a presença de sinais foi mais evidente

a partir do sexto mês e com uma frequência inferior ao grupo IC. O achado mais prevalente

no grupo IP foi à esplenomegalia, acometendo 70% do grupo no sexto mês e 87% no nono

mês da infecção. A frequência de sinais clínicos no grupo ID foi relativamente baixa

durante todo período avaliado quando ambas as cepas foram utilizadas.

Sinais clínicos semelhantes aos observados neste estudo, têm sido também

demonstrados por diversos outros pesquisadores (Melby et al., 2001; Requena et al., 2000;

Poot et al., 2006; Riça-Capela et al., 2003; Dea-Ayuela et al., 2007, Nieto et al., 2011),

utilizando este modelo. Embora a frequência destes tenha variado nos trabalhos citados


104

acima, porém a ocorrência dos mesmos está de acordo com nossos resultados, uma vez que

os sinais mais prevalentes encontrados no presente estudo foram: ascite, esplenomegalia e

emagrecimento. Nos animais inoculados pela via ID a presença de sinais clínicos foi

menos frequente e apareceram geralmente no período mais tardio da infecção,

principalmente quando a cepa PP75 foi utilizada. Estudos conduzidos por (Wilson et al.

(1987) ao utilizarem a mesma via de inóculo na infecção experimental em hamster

demonstram presença de sinais clínicos da LV somente a partir de 10 meses após infecção

experimental.

Em ambas as cepas empregadas no presente estudo, a hepatomegalia foi um achado

pouco frequente. Assim, foi relatado aumento no peso relativo do fígado dos animais

infectados com a cepa selvagem pela via IC, no sexto mês após a infecção. Todavia ao

contrário do esperado, ou seja, um quadro clássico de hepatomegalia propriamente dito, os

resultados de nosso estudo apontam sim para uma hepatomegalia em reflexo ao

emagrecimento dos animais, pois não houve diferença em relação ao peso do órgão entre

os hamsters infectados ao grupo controle não infectado neste período. No entanto, a

hepatomegalia não é necessariamente sempre observada durante a doença (Melo et al.,

2008). Estas diferenças, bem como acontece com outras alterações, provavelmente sejam

inerentes da complexidade das alterações geradas pelo parasito e resposta imune do

hospedeiro. Macroscopicamente, o fígado dos animais inoculados pela via IC apresentou

aspecto friável com vários pontos brancos distribuídos em toda a superfície do órgão e ao

longo do parênquima hepático, independente da cepa utilizada no nono mês da infecção.

Estas mesmas alterações macroscópicas foram também observadas por Vianna et al.

(2002), na infecção experimental em hamsters por L.donovani utilizando a via

intracardíaca de inóculo.

Aos 9 meses após a infecção com a cepa selvagem utilizando a via IC, foi possível

observar, lesões cutaneomucosas, acompanhada por úlceras localizadas no focinho bem

como, edema nas patas em 100% dos animais. Estes achados também foram observados

nos estudos conduzidos por Nieto et al. (2011). Estes autores descreveram as mesmas

lesões observadas em nosso estudo, aos 7 meses após a infecção experimental intracardíaca

com 107 promastigotas de L. infantum. Estes dados reforçam a capacidade da via de

inóculo intracardíaca em causar lesões graves em hamsters incluindo tegumentização das

lesões e edemas de membros inferiores. A tegumentização de lesões e edemas de membros

inferiores é um achado frequente na leishmaniose visceral canina (Reis et al., 2009) e


105

também pode aparecer em casos graves da LV humana principalmente em pacientes co-

infectados pelo HIV (Catorze et al., 2006).

Diante do exposto, podemos concluir que sinais clínicos clássicos já observados e

relatados por diversos autores na LV humana (Badaró et al., 1986; Pastorino et al., 2002,

Pedrosa, 2004; Oliveira et al., 2010) e canina (Santos-Gomes et al., 2002; Paranhos-Silva,

et al., 2003; Reis et al., 2006; da Costa-Val et al., 2007; Ikeda-Garcia et al.,2007; Baneth

et al., 2008; Alves et al., 2009; Solano-Gallego et al., 2009; Solano-Gallego et al., 2011)

também ocorrem na LV experimental em hamster. Desta forma, podemos inferir que a

cepa utilizada, a quantidade de parasitos e a via de inóculo podem favorecer na

mimetização da infecção experimental e permitir uma evolução para formas crônicas

graves da doença permitindo assim empregar o modelo para testes de drogas

leishmanicidas, de modo que se possa avaliar a remissão destes sinais clínicos após a

terapêutica específica contra o agente etiológico da LV. Além disso, a avaliação das duas

cepas foi extremamente importante para o entendimento dos distintos padrões de virulência

e patogenicidade apresentados por cada uma.

Um marcador fundamental na LV são os anticorpos anti-Leishmania, de um modo

geral, estes quando produzidos em grande quantidade, não são associados à proteção,

apresentando neste sentido, grande importância como biomarcador de progressão da

doença. Altos títulos de anticorpos são observados em pacientes com LV (Nylén &

Gautam, 2010). Na LVC, os cães sintomáticos geralmente apresentam altos títulos de

anticorpos anti-Leishmania e os cães resistentes à infecção exibem baixos níveis ou

ausência destes como recentemente demonstrados em cães assintomáticos soronegativos e

PCR+ (Carrera et al., 1996; Reis et al., 2006; Solano-Gallego et al., 2009; Reis et al., 2009;

Coura-Vital et al., 2011). Muitos aspectos da patogênese da LVC são atribuídos aos

anticorpos produzidos durante a história natural da doença, os quais formam

imunocomplexos que se depositam em diversos tecidos, principalmente nos glomérulos

renais, gerando lesões inflamatórias graves (Miles et al., 2005). A elevada produção de

anticorpos na LV está intimamente relacionada à expansão policlonal de linfócitos B,

conduzindo um quadro típico de hipergamaglobulinemia e gerando quadros graves de

disfunção renal devido à grande deposição de imunocomplexos, ocasionando óbito de

indivíduos e cães com LV grave (Galvão-Castro et al., 1984; Dutra et al., 1985; Prasad et

al 1992; Alvar et al., 2004; Plevraki et al., 2006; Lima-Verde et al., 2007; Costa-Val et al.,

2007; Reis et al., 2009; Agenor et al., 2009; Clementi et al., 2011).


106

No presente estudo, foi demonstrado que, os elevados níveis de IgG detectados nos

animais inoculados com a cepa PP75 foram observados mais tardiamente, com maiores

picos em 6 e 9 meses após a infecção experimental no grupo IC. Entretanto, em animais

infectados com a cepa selvagem os níveis de IgG foram elevados em todos os grupos

infectados comparado ao grupo controle, apresentando maiores picos nos grupos IP e IC a

partir do terceiro mês. Estes dados demonstraram que a cepa selvagem foi capaz de induzir

níveis mais elevados de IgG e em tempo mais precoce que a cepa PP75, com maior

exacerbação nos grupos IP e IC, o que foi associado a maior densidade parasitária

esplênica observada nestes grupos, principalmente em estágios mais avançados da doença,

além da presença de sinais clínicos evidentes. Estes dados reforçam a idéia de que, no caso

de cepas menos virulentas, como a cepa PP75, a escolha da via de inóculo é extremamente

importante para o estabelecimento da infecção, de forma a reproduzir quadros de LV ativa

neste modelo. Assim, tanto a cepa PP75 quanto a selvagem foram capazes de induzir

aumento nos níveis de IgG, principalmente no grupo IC, demonstrando que

semelhantemente a LV humana e canina, a avaliação de anticorpos anti-Leishmania é uma

ferramenta importante no monitoramento do estabelecimento da infecção no modelo

hamster.

Nossos resultados, estão de acordo com Requena et al (2000) que associaram a

forte resposta humoral em hamsters experimentalmente infectados por L. infantum a

presença de sinais clínicos evidentes e a elevada densidade parasitária tecidual. Além

destes autores, outros estudos tem demonstrado uma relação entre a carga parasitária e

altos títulos de anticorpos em hamster experimentalmente infectados com diferentes formas

e espécies de Leishmania (Evans et al., 1990; Melby et al., 2001; Riça-Capela et al., 2003,

Dea-Ayuela et al., 2007). Achados semelhantes também foram observados em cães

experimentalmente e naturalmente infectados e na LV humana (Genaro, 1993; Reis et al.,

2006; Silveira et al., 2009).

Na literatura, as informações que dizem respeito à mensuração de parâmetros

bioquímicos e hematológicos em hamster são extremamente limitadas. A avaliação

hematológica e bioquímica representa uma importante área de estudo da leishmaniose

visceral seja humana ou canina como fonte de monitoração do diagnóstico e prognóstico

da evolução do quadro clínico bem como na identificação de formas graves da doença.

Embora, a avaliação do quadro hematológico forneça pouco valor para o diagnóstico na

LV, estes parâmetros podem apresentar relevância no acompanhamento do estado clínico,


107

com um forte valor prognóstico, sendo importantes parâmetros de definição de condutas

terapêuticas em protocolos de consenso médico (Nasir et al., 1995; Feitosa et al., 2003;

Reis et al., 2006a; Costa-Val et al., 2007; Reis et al., 2009; Solano-Gallego et al. 2009;

Brasil, 2009; Oliveira et al., 2010).

Vale ressaltar que na LV humana e canina, observa-se a formação de um quadro

hematológico grave, marcado por uma (pancitopenia) que na série vermelha é

caracterizada por anemia normocítica, nomocrômica, e ainda com valores diminuídos de

hemoglobina e hematócrito. Com relação à série branca o quadro se agrava ainda mais,

pois geralmente na LV ativa humana e canina a doença evolui para um nítido quadro de

imunossupressão marcada por uma forte queda nos valores globais de leucócitos

(leucopenia) caracterizados por diminuição de monócitos (monocitopenia), linfócitos

(linfopenia), eosinófilos (eosinopenia) e por vezes ocorre aumento de neutrófilo

(neutrofilia) ou mesmo um esquerda à direita, ou seja, queda de neutrófilo (neutropenia),

como relatado por diversos autores (Pearson, 1996; Bourdoiseau et al.,1997; Ciaramella et

al., 1997; Pastorino et al., 2002; Feitosa et al., 2003; Pedrosa, 2004; Reis et al., 2006a;

Costa-Val et al., 2007; Maia et al., 2010; Oliveira et al., 2010).

Diferentes padrões nos parâmetros hematológicos e bioquímicos podem ser

observados como resultado de lesão celular ou disfunção orgânica. Estes padrões refletem

tanto o extravasamento de constituintes celulares para o soro quanto à produção e excreção

de vários componentes séricos. Grandes variações nos valores hematológicos e

bioquímicos podem alterar em função da idade, sexo, criação, dieta, temperatura, além da

excitação proveniente da contenção do animal no momento da coleta de sangue (Thall,

2007). Além disso, os procedimentos laboratoriais não estão padronizados o que pode

acarretar resultados divergentes. Devido à falta de padronização nos laboratórios e as

diferentes intercorrências para emissão de resultados hematológicos e bioquímicos com

elevada acurácia e qualidade, é recomendável que cada laboratório desenvolva seus

próprios intervalos de referência a partir de amostras de animais normais, levando em

consideração todos estes fatores.

Neste estudo, as alterações nos parâmetros hematológicos dos hamsters infectados

com a cepa PP75 foram pouco expressivas, com redução apenas na população de

monócitos (monocitopenia) no último mês da infecção no grupo IC. Entretanto, em

hamsters infectados com a cepa selvagem as alterações foram evidentes principalmente nos

hamsters infectados pela via IC e IP. O grupo IC, com aparecimento de leucopenia já partir


108

do terceiro mês de infecção acompanhada de redução de monócitos. No sexto mês de

infecção experimental, foi evidenciada uma típica imunossupressão da LV nestes animais,

com uma leucopenia intensa e marcada pela redução de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos

e monócitos. Aos 9 meses após a infecção experimental os hamsters inoculados tanto pela

via IP quanto pela via IC a leucopenia foi caracterizada pela diminuição de neutrófilos,

eosinófilos e monócitos, em relação ao grupo C e ID. Neste sentido, as alterações

hematológicas clássicas observadas na LV humana e canina foram aqui reproduzidas nos

animais infectados pela cepa selvagem. Estes dados sugerem que as alterações observadas

nos grupos IP e IC acompanhadas pela presença de sinais clínicos sugestivos da LV ativa

(em especial a esplenomegalia) e ao elevado parasitismo tecidual (baço e fígado)

observado nestes grupos deve-se a um complexo de interações relacionadas ao potencial de

virulência e patogenicidade de cada uma das duas cepas utilizadas.

Na LV humana, caracteristicamente a leucopenia, neutropenia e eosiponenia são

encontradas com grande frequência em estudos clínicos e laboratoriais envolvendo

pacientes com LV (Campos, 1995; Pearson, 1996; Berman, 1997). Estudos conduzidos por

Queiroz et al. (2004) relataram que 85% das crianças evoluíram com leucopenia e 74%

com neutropenia, provavelmente devido a esplenomegalia, além de hipoplasia ou

depressão medular e hemofagocitose. Da mesma forma a leucopenia esteve presente em

85,5% dos pacientes com LV, no momento da internação, e assim como no trabalho acima

citado, é possível que a esplenomegalia registrada em 71% dos pacientes tenha contribuído

para esta alteração (Maltezou et al., 2000; Cascio et al., 2002; Collin et al., 2006).

Segundo Reis et al. (2006a) o comprometimento do quadro hematológico na LVC,

está associado com manifestações clínicas graves, evidenciadas por leucopenia marcada

por linfopenia, eosinopenia, monocitopenia e intensa anemia. Alguns autores tem

demonstrado ausência de variações no leucograma na maioria dos cães com LVC,

enquanto outros demonstram a ocorrência de leucopenia moderada ou grave (Costa-Val et

al., 2007; Reis et al., 2006a). Sendo assim, Alvar et al. (2004) demonstraram que durante a

fase sintomática da LVC, há uma diminuição na contagem de leucócitos devido

principalmente à queda nos valores relativos e absolutos de monócitos, eosinófilos e

principalmente de linfócitos, sendo este último um dos achados mais relevantes.

Recentemente Coura-Vital et al., (2011) demonstraram que cães assintomáticos

soronegativos e PCR+ apresentam valores normais na contagem diferencial de monócitos e

que esta população declina no sangue circulante logo após a soroconversão caindo


109

dramaticamente no cães sintomáticos. Por outro lado, Bourdoiseau et al. (1997) revelaram

que na fase inicial da doença ocorre leucocitose associada à neutrofilia, enquanto que nos

estágios mais avançados, há leucopenia associada à linfopenia. De fato, é possível obervar

leucocitose na LVC assintomática como a observda por Reis et al. (2006a) que também

evidenciaram linfocitose nesta mesma forma clínica.

No eritrograma, os animais infectados com a cepa PP75 pelas 3 vias de inóculo

apresentaram diminuição de hematócrito em 1 mês após a infecção, provavelmente em

função de alguma alteração que tenha conduzido à disfunção medular. Além disso, foi

evidenciado um quadro de anemia nos grupos ID, IP e IC no sexto mês da infecção. Por

outro lado, nos animais infectados com a cepa selvagem pela via IC foi observado um

quadro de anemia grave, marcada pela redução de eritrócitos, hematócrito e hemoglobina a

partir do sexto mês da infecção. Estes dados mostram que as principais alterações no

eritrograma dos hamsters infectados com a cepa PP75 ocorreram no primeiro e no sexto

mês da infecção nos três grupos experimentais (ID, IP e IC), enquanto nos animais

infectados com a cepa selvagem as alterações foram observadas no sexto e nono mês da

infecção, restritas apenas ao grupo IC. A cepa PP75 por induzir uma infecção mais branda,

quando o parâmetro de avaliação é o eritrograma, não existe diferença nas alterações

apresentada em relação às três vias de inóculo utilizada. Entretanto, quando se usa uma

cepa virulenta e patogênica a resposta a estas alterações tem influência sob a via de inóculo

que é utilizada.

A anemia foi também demonstrada por Riça-Capela et al. (2003) em 70-80% dos

hamsters experimentalmente infectados com diferentes formas parasitárias de L. infamtum

(amastigotas e promastigotas). A anemia ocorre devido à perda de sangue, lise de hemácias

e diminuição da eritropoiese, devido à hipoplasia e aplasia medular (Feitosa et al., 2003).

Na LVH a anemia normocítica e normocrômica é um achado frequente nos pacientes que

apresentam forma crônica da doença (Pearson, 1996). Já na LVC, Costa-Val et al.(2007),

relataram em seu estudo que 42% dos cães avaliados apresentaram anemia normocítica

normocrômica e não regenerativa, estes dados coincidem com os descritos em outros

trabalhos que apontam a anemia normocítica e normocrômica como um achado comum na

LVC ativa (Ciaramella et al.,1997; Feitosa et al., 2003; Reis et al., 2006a).

Nos hamsters infectados com a cepa PP75, no terceiro mês da infecção foi

observada trombocitose no grupo IP. De forma similar, nos animais infectados com a cepa

selvagem o grupo IC, em 6 e 9 meses após a infecção apresentou trombocitose. A


110

trombocitose nos grupos IP e IC podem ser conseqüência do quadro de anemia grave

apresentado ou pode ser também que não tenha nenhuma relação com este quadro clínico.

Os parâmetros bioquímicos relacionados à avaliação da função renal consistem

principalmente na dosagem dos níveis séricos de uréia e creatinina. As análises

bioquímicas do presente estudo revelaram alteração renal uma vez que houve aumento nos

níveis de uréia e creatina em alguns grupos avaliados. Um dos achados observados está

relacionado aos níveis de uréia nos animais infectados com a cepa PP75 que demonstraram

aumentados no sexto mês após a infecção apenas no grupo IC e nono mês nos três grupos

(ID, IP e IC), além de apresentar aumento nos grupos IP e IC em relação ao ID. Além

disso, no nono mês ainda foi demonstrado aumento nos níveis de creatinina nos três grupos

(ID, IP e IC). Por outro lado, nos infectados com a cepa selvagem o aumento tanto de uréia

quanto de creatinina foram observados nos períodos de 3 e em 9 meses após a infecção

apenas no grupo IC. Estes dados sugerem injúrias nos rins destes animais, devido talvez à

deposição de imunocomplexos. A insuficiência renal aguda ou crônica pode estar

relacionada com a deposição dos imunocomplexos em tecidos renais, constituindo uma

importante manifestação patológica na LV (Zatelli et al. 2003).

Em estudo com 50 pacientes humanos portadores da LV sintomática foi

demonstrado que 8,5% destes apresentaram dosagem de uréia elevada e 16,3% com

dosagem de creatinina aumentada (Dutra et al.,1985). Segundo, Nieto et al. (1992), em

estudo com 10 cães infectados, sete apresentaram dosagem sérica de uréia aumentada e três

com dosagem de creatinina elevada. Devido a elevada prevalência de patologia renal, a

azotemia na LVC, típica de insuficiência renal é um achado laboratorial comum, e é

evidente somente quando a maioria dos néfrons torna-se disfuncionais com a progressão da

doença. As glomerulonefrites são alterações mais comuns, enquanto a amiloidose é menos

frequente (Zatelli et al., 2003). Estudos conduzidos por Riça-Capela et al. (2003)

mostraram grande quantidade de amilóide no fígado e baço de hamster experimentalmente

infectados com formas amastigotas e promastigotas de L. infantum.

As alterações na concentração das enzimas aminotransferases séricas (ALT e AST)

são considerados importantes indicadores de lesões nas células hepáticas. A dosagem da

concentração das enzimas ALT, AST permitem averiguar a presença de alterações da

permeabilidade dos hepatócitos quando se observa elevação de níveis séricos de ALT e

AST (Kaneko, 1997).


111

No presente estudo, observou-se que a infecção com a cepa PP75 induziu aumento

nos níveis de AST no grupo IC, no início da infecção (1 mês) e no final (9 meses).

Entretanto nos animais infectados com a cepa selvagem este aumento foi demonstrado no

terceiro e nono mês no grupo IC e a partir do sexto mês no grupo IP. Quanto aos níveis de

ALT, os animais infectados com a cepa PP75 induziu aumento no inicio da infecção (1

mês) nos grupos IC e IP e aos 9 meses apenas no grupo IC. Entretanto, a cepa selvagem

induziu aumento de ALT aos 3 meses após a infecção no grupo IC e em 6 meses em todos

os grupos (ID, IP e IC). Estes dados fornecem subsídios de alterações na função hepática e

que a elevação da atividade de AST e ALT nos grupos IP e IC pode ser indicativa de

alguma lesão, uma vez que a AST e ALT são enzimas que estão presentes em altas

concentrações no compartimento hepático (hepatócitos). O envolvimento hepático tem sido

relatado com maior frequência quando o diagnóstico da LV humana é mais tardio e indica

uma maior gravidade (Queiroz et al., 2004).

A ALT é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito e é considerada

hepatoespecífica, sendo o aumento sérico um indicador sensível e específico de dano

hepatocelular, enquanto que 80% da AST encontram-se presente na mitocôndria dos

hepatócitos. Consequentemente, a ALT sérica eleva-se mais rapidamente e usualmente está

em níveis mais altos que a AST. Em danos hepatocelulares leves a forma predominante no

soro é a citoplasmática, enquanto que em lesões graves há liberação da enzima

mitocondrial. O aumento destas enzimas hepáticas implica na tentativa de manutenção da

viabilidade e regeneração dos hepatócitos, podendo ser usada na interpretação do avanço

da doença (Kaneko, 1997).

Apesar de escassos os estudos que buscaram avaliar alterações nos níveis de AST e

ALT no modelo hamster para LV, diversos autores relatam aumento nos níveis séricos

destas enzimas na LV humana (Queiroz et al., 2004; Oliveira et al., 2010) bem como na

LV canina (Nieto et al., 1992; Solano-Gallego et al., 2009; Solano-Gallego et al., 2011).

Assim, acreditamos que o monitoramento laboratorial do perfil bioquímico enzimático de

AST e ALT deva ser considerado quando se emprega este modelo principalmente para

estudos de testes de drogas para LV. Embora tenham sido demonstradas algumas

diferenças em relação aos níveis de proteínas, albumina, globulina bem como na razão

albumina/globulina não foi possível estabelecer um padrão destas alterações em relação à

sintomatologia observada e as vias de inóculo utilizada neste estudo, onde foi possível

detectar alterações em graus variáveis.


112

A LV experimental é marcada pelo desenvolvimento de uma resposta imune órgão-

específica, sendo o fígado e o baço os principais órgãos alvos atingidos (Rousseau et al.,

2001). O fígado é resistente a reinfecção, poucos danos teciduais, é o local onde a

resolução da infecção aguda esta associada ao desenvolvimento de granulomas hepáticos

intralobulares tipicamente inflamatórios em torno das células de Kupffer (Stanley &

Engweda, 2007). A resposta imune eficiente em infecções por Leishmania no fígado é

intimamente dependente da formação de granulomas hepáticos. Em hamsters com LV, as

alterações hepáticas em geral são decorrentes não somente pela presença de um infiltrado

inflamatório como também pela formação destes granulomas (Wilson et al., 1987; Vianna

et al., 2002). A formação do granuloma foi à principal alteração histopatológica observada

no fígado de hamsters experimentalmente infectados com promastigotas de L. infantum por

via intradérmica (Mangoud et al., 1997).

No presente estudo, o infiltrado inflamatório no espaço porta e parênquima hepático

e formação de granulomas foram às principais alterações observadas. Nos animais

infectados com a cepa PP75 as alterações histopatológicas hepáticas ocorreram a partir do

sexto mês de infecção com maior frequência no grupo IC. Nestes animais foi observado o

desenvolvimento de um processo inflamatório caracterizado pela presença de infiltrado de

células mononucleares nos espaço-porta que variou de discreto a moderado e alguns

granulomas distribuídos aleatoriamente pelo parênquima. Estudos realizados por Riça-

Capela et al. (2003), demonstraram discreto infiltrado inflamatório no espaço porta,

desorganização de trabéculas hepáticas com formação de pequenos granulomas hepáticos

em hamsters infectados com promastigotas de L.infantum.

No entanto, nos animais infectados com a cepa selvagem a presença de granulomas

ocorreu nos grupos IP e IC. No grupo IP os granulomas estavam presentes durante todo o

período da avaliação, porém com frequência menor comparado ao grupo IC. No grupo IC

foi observado granulomas durante todo o período de avaliação e em maior número no sexto

e nono mês da infecção. Além disso, foi possível observar presença de amastigotas, áreas

intensas de necrose, destruição na morfologia dos hepatócitos e infiltrado inflamatório que

variou de discreto a intenso de acordo com a evolução da infecção. Juntos estes dados

sugerem que as intensidades das alterações histopatológicas observadas no parênquima

hepático neste estudo estão diretamente relacionadas ao parasitismo apresentado por cada

um dos grupos avaliados (ID, IC e IP). O aumento do processo inflamatório e a presença

de maior número de granulomas apresentado no grupo IC podem estar relacionados ao


113

intenso parasitismo que foi observado neste grupo. A infecção visceral em hamsters induz

alterações em hepatócitos, principalmente no sistema endomembrana e no compartimento

peroxissomal levando a distúrbios no metabolismo do fígado (Vianna et al., 2002).

Mangoud et al. (1997) observaram em hamsters experimentalmente infectados por

L.infantum que, o infiltrado inflamatório no espaço porta teve início quando surgiram os

primeiros granulomas, os quais apresentaram distribuídos aleatoriamente pelo parênquima

hepático. Com a evolução da infecção os granulomas mostraram aumentados em número e

tamanho e eram formados principalmente de macrófagos com áreas de necrose e poucos

linfócitos de forma semelhante ao observado por nós. A marcada necrose nos granulomas

hepáticos pode ser devido a efeitos citotóxicos de linfócitos T nos estágios avançados da

infecção (Murray et al., 1982). Nieto et al. (2011) relataram que as alterações, como

formação de granulomas em diferentes estágios de maturação e granulomas com

amastigotas no fígado de hamsters infectados por via IC, foram mais frequentes com o

pico da carga parasitária. Na LVH a presença de granulomas no fígado parece estar

associada ao controle espontâneo e manutenção da infecção em um estado subclínico

(Murray et al., 2001). Dentre as principais alterações histopatológicas observadas no

fígado de cães infectados com LV, tem sido destacada a reação inflamatória exsudativa

com infiltrado linfoplasmocitário nos espaços-porta e interlobulares, inflamação da

capsula, além da presença de granulomas intralobulares, com células epitelióides,

parasitados ou não (Genaro, 1993; Tafuri et al., 1996; Tafuri et al., 2001; Giunchetti et al.,

2008c).

O baço desempenha um papel central na LV, pois é um sítio inicial para a geração

de resposta imune específica contra o parasito mediada por células, podendo se tornar

também um local de persistência do mesmo apresentando inúmeras alterações

imunopatológicas (Kaye et al., 2004).

No presente estudo a avaliação histopatológica esplênica revelou de um modo

geral, que em animais inoculados com cepa PP75 pelas vias ID e IP, a arquitetura

histológica do baço foi mantida ao longo dos 9 meses avaliados. Modificações na polpa

vermelha no terceiro mês da infecção nestes mesmos grupos ocorreram em decorrência do

aumento considerável de macrófagos. Os folículos linfóides do baço de hamsters

inoculados pela via IC mostraram acentuada reatividade folicular com aumento do volume

e da densidade linfocitária e moderada proliferação de macrófagos na polpa vermelha aos 9

meses após a infecção. Além disso, macrófagos densamente parasitados por formas


114

amastigotas de L. infantum e periesplenite foram observados. Estudos conduzidos por

Binhazim et al., (1993), mostraram macrófagos densamente parasitados formando

agregados na polpa vermelha esplênica evidentes após a infecção experimental em

hamsters submetidos a inoculação por via intracardíaca. Apesar de não se conhecerem os

mecanismos que levam a periesplenite, sugere-se que a esplenomegalia pode predispor ao

estresse e trauma mecânico da capsula, mas a gênese real deste achado na LV permanece

desconhecida. A periesplenite é um achado comum na LVC, associada com intenso

parasitismo na região subcapsular. Estes achados tem sido observados em alguns estudos

(Tafuri et al., 1996; Xavier et al., 2006; Santana et al., 2008) e podem indicar o papel da

inflamação na disseminação de parasitos durante o curso clínico da LVC (dos-Santos et al.,

2008) ou que o parasito provoca uma reação inflamatória. De acordo com Santana et al.

(2008), periesplenite esteve presente em 28% dos casos avaliados, sendo mais frequente no

grupo dos animais sintomático.

Na cepa selvagem a proliferação de macrófagos da polpa vermelha, nos grupos IP e

ID foi mais frequente no sexto mês da infecção. Além disso, periesplenite no grupo IP foi

observada a partir do sexto mês da infecção. O grupo IC apresentou atrofia linfóide no

terceiro e sexto mês, relacionada à desorganização histológica com perda da definição ou

hipoplasia das regiões da polpa branca, frequentemente associada à proliferação de

macrófagos da polpa vermelha. Estes achados foram mais evidentes no sexto mês, onde

todos os animais avaliados apresentaram perda da arquitetura com substituição parcial à

total da polpa branca por células da polpa vermelha. Além disso, a maioria dos animais do

grupo IC apresentou intenso parasitismo tecidual e periesplenite.

A atrofia linfóide e a desorganização da arquitetura esplênica é muito frequente

durante a infecção ativa por Leishmania (Veress et al., 1983; Engwerda et al., 2002). As

alterações esplênicas nos animais infectados com a cepa PP75 foram mais evidentes no

grupo IC e embora tenham ocorrido durante todo período de avaliação estas se mostraram

com maior intensidade nos períodos finais da infecção (6 e 9 meses). Entretanto nos

animais infectados com a cepa selvagem, as alterações no grupo IC ocorreram em todo

período avaliado, porém com uma exacerbação ainda maior no sexto e nono mês. Estes

dados sugerem que a hipoplasia da polpa branca, hiperplasia da polpa vermelha, perda da

arquitetura e periesplenite demonstradas nos períodos de 6 e 9 meses no grupo IC estejam

associadas ao intenso parasitismo e sinais mais severos apresentados pelo grupo tais como:

emagrecimento e esplenomegalia.


115

Existem associações entre alterações morfológicas no baço e emagrecimento,

inicialmente inerente à desorganização da estrutura da polpa branca. Estudos conduzidos

por Santana et al. (2008) demonstraram que 70% dos cães com caquexia apresentaram

desorganização da polpa branca. A perda de definição dos folículos linfóides, periesplenite

e alta densidade parasitária foram mais frequentes nos animais que estavam abaixo do

peso. O baço desempenha um importante papel na LVC, sendo acometido em todos os

casos da doença. Em contraste a outros órgãos como o fígado, o baço mantém a infecção

durante todo o curso da doença canina. Entretanto a resposta imunológica no baço dos

animais infectados não está muito bem definida (Sanchez et al., 2004).

Estudos recentes conduzidos por Silva et al. (2012), ao avaliar dois grupos de cães

naturalmente infectados por Leishmania infantum com distinta organização histológica

esplênica, mostraram que cães que apresentavam uma desorganização estrutural do baço

eram os que apresentavam doença mais grave que aqueles que mativeram certa

organização. Neste estudo observou-se que a polpa branca foi reduzida em tamanho, os

folículos e a zona marginal foram os compartimentos da polpa branca mais severamente

afetados. Estas alterações foram associados com diminuição do número de células T e

células dendríticas nos folículos, e as células B nos folículos e zonas marginais.

NA LVH o baço é marcado por esplenomegalia resultante da reatividade do sistema

fagocítico monuclear e congestão sinusoidal esplênica. A hipertrofia e hiperplasia da polpa

branca é uma alteração esplênica frequente em indivíduos portadores da LV. É observado

diminuição significativa nos linfócitos dos folículos linfóides, infiltração de células

plasmáticas e macrófagos densamente parasitados por amastigotas (Drumond & Costa,

2011). De fato um índice de parasitismo esplênico é usado como critério clínico da

resposta terapêutica na LVH.

A hipoplasia dos folículos linfóides, associada à proliferação de macrófagos da

polpa vermelha, destruição da arquitetura esplênica, tem sido demonstrada por alguns

autores na infecção experimental em hamsters (Veress et al., 1983; Mangoud et al., 1997;

Riça-Capela et al, 2002, Nieto et al., 2011). A atrofia e desaparecimento de áreas de células

B esplênicas, foram evidentes com a evolução e progressão da doença (Veress et al., 1997).

Com base no exposto acima podemos afirmar que de fato o modelo experimental

hamster é altamente atrativo para os estudos de imunopatologia experimental, testes de

drogas e vacinas anti-LV uma vez que parece reproduzir diversos achados frequentes na


116

LV humana e canina mesmo no que diz respeito a imunopatologia e histopatologia no

compartimento hepático e esplênico.

No presente estudo foram utilizadas duas técnicas com abordagens investigativas

extremamente distintas para quantificar o parasitismo nos diferentes órgãos alvo (baço e

fígado): LDU (Leishman Donovan Units) e qPCR. O desenvolvimento de uma técnica que

permita quantificar parasitos e que possibilite a comparação dos valores obtidos no baço e

fígado de hamsters experimentalmente infectados por diferentes vias de inóculo (ID, IP e

IC) é de fundamental importância nas investigações científicas que empregam este modelo

experimental. Certamente, a quantificação da carga parasitária é de fundamental

importância para um melhor entendimento das manifestações clínico-patológicas durante a

história natural na LV experimental. Adicionalmente, o desenvolvimento de uma

abordagem molecular para quantificar a carga parasitária no fígado e baço de hamsters

experimentalmente infectados é extremamente relevante, pois, este modelo tem sido

utilizado em estudos de testes de drogas e formulações vacinais contra a leishmaniose

visceral (Carrión et al., 2011; Reimão et al., 2012; Gupta et al., 2012). Neste contexto,

avaliamos o impacto da carga parasitária no baço e fígado após a infecção com diferentes

cepas de L. infantum exibindo perfis distintos de virulência e patogenicidade.

O índice de LDU conforme descrito por Stauber em 1955, apesar de ser uma

técnica que identifica e quantifica a real presença de amastigotas em tecidos tem a

desvantagem por apresentar baixa sensibilidade (Stauber, 1955). Além disso, um agravante

neste método é que a detecção das formas amastigotas requer profissional extremamente

treinado e paciente, o que pode acarretar resultados divergentes quando não realizados pelo

mesmo microscopista. Contudo, possui ainda a desvantagem de depender da dispersão dos

parasitos nos esfregaços por aposição corados pelo Giemsa já que estes se encontram

distribuídos no tecido de uma forma não uniformizada (Bretagne et al., 2001).

Entretanto a técnica de qPCR em tempo real vem sendo utilizada por vários

pesquisadores e tem se tornado nos últimos anos uma ferramenta de fundamental

importância na aplicação de técnicas de biologia molecular para diagnosticar/monitorar a

evolução da LV através da quantificação da carga parasitária tecidual, em substituição a

outras técnicas, por apresentar alta sensibilidade, acurácia e reprodutibilidade (Manna et

al., 2008; Bretagne et al., 2001).

Conforme esperado, em nosso estudo, o LDU apresentou baixa sensibilidade

detectando parasitos apenas nos grupos IP e IC em alguns tempos avaliados. Sendo assim,


117

em animais infectados com a cepa PP75 as amastigotas foram detectadas no sexto e nono

mês de infecção nas amostras de fígado e de baço, apenas no grupo IC. Por outro lado, em

animais infectados com a cepa selvagem, foi possível detectar o parasito a partir do

terceiro mês de infecção no grupo IP e no grupo IC a partir do primeiro mês de infecção.

Assim, foi possível verificar que tanto em animais infectados com a cepa PP75 quanto pela

selvagem, à carga parasitária evoluiu com a progressão da infecção. Além disso, o

parasitismo no baço e fígado com a cepa selvagem foi muito maior comparado aos da cepa

PP75. De acordo com os resultados obtidos pela enumeração de amastigotas por 1000

núcleos de células sem considerar o peso do órgão, o baço foi o órgão mais parasitaddo

que o fígado.

Segundo Ott et al. (1967), o índice de parasitismo no baço é mais consistente em

relação ao fígado uma vez que existe grande diferença de tamanho e peso entre os mesmos.

Estudos conduzidos por Binhazim et al. (1993) utilizando a via IC de infecção,

demonstraram maior parasitismo no fígado de hamster. Por outro lado, maior parasitismo

no baço tem sido demonstrado por diversos pesquisadores em estudos de infecção

experimental em hamsters por diferentes espécies de Leishmania, formas (amastigotas e

promastigotas) e vias de inóculo (Stauber, 1955; Ott et al., 1967; Melby et al., 2001;

Requena et al., 2000; Riça-Capela et al., 2003; Dea-Ayuela et al., 2007). A variabilidade

destes resultados podem ser explicada porque muitos desses autores empregam outra

técnica, a diluição limitante, utilizada para quantificar a carga parasitária no fígado e no

baço, e que não inclui o peso do órgão, dificultado muitas vezes, a comparação entre os

resultados divulgados na literatura.

As diferenças no parasitismo observado neste estudo variaram não apenas em

função da técnica empregada para enumerá-los (LDU ou qPCR), como também da cepa

infectante e as vias de inóculo utilizadas. Isto reforça mais uma vez que nos casos em que

se utilizam técnicas de baixa sensibilidade como a LDU, a via de inóculo e a cepa

infectante que é empregada refletem muito no resultado obtido. No caso dos animais do

grupo IP, foi necessário um maior tempo de infecção para que fosse possível a detecção do

parasito pela microscopia óptica. Embora os parasitos quando inoculados no peritoneo

tenha um período de pré-patência maior, um grande número deles não sobrevive para se

estabelecer no baço ou no fígado (Ott et al., 1967), dificultando assim a sua visualização.

Neste sentido, o tempo após a infecção com a via IP, foi determinante para que parasitos

fossem visualizados e quantificados por microscopia óptica no baço e fígado. Os resultados


118

obtidos através da densidade parasitária demonstraram que a via IC foi capaz de induzir

uma infecção progressiva nos animais, com intensa carga parasitária tecidual. Desde os

trabalhos pioneiros conduzidos por Stauber, tem sido demonstrado em hamsters que a via

intracardíaca, geralmente, induz infecções reproduzíveis com valores mais elevados na

carga parasitária (Stauber, 1955). Estes achados corroboram com os obtidos neste trabalho,

uma vez que em animais infectados com a cepa selvagem, foram demonstradas diferenças

significativas em relação ao número de parasitos obtidos, entre os dois grupos (IP e IC) em

amostras tanto de baço quanto de fígado.

A literatura ainda é escassa em trabalhos que avaliam o uso da PCR quantitativa em

Tempo Real (qPCR) para a quantificação da densidade parasitária em diferentes órgãos na

LV experimental em hamster. Para a quantificação da carga parasitária no baço e fígado de

hamsters experimentalmente infectados, utilizamos curvas-padrão construídas a partir de

concentrações conhecidas do DNA de L. infantum ligado a um plasmídeo, que é uma das

formas mais eficientes na determinação dos resultados obtidos pela qPCR (Cikos et al.

2007). Neste estudo optamos por mostrar os resultados de qPCR empregando duas

abordagens de análise: pelo número de amastigotas em 20ng de DNA e pelo número de

amastigotas multiplicado pelo peso do órgão em cada tempo da cinética avaliada. Estas

abordagens tiveram como finalidade evidenciar melhor o resultado que foi obtido com os

achados clínico-patológicos observados nestes órgãos. Ao comparar estes resultados, o que

se observa é uma maior evidência no número de amastigotas em cada grupo com o peso do

órgão durante a evolução da história natural da infecção experimental em hamster.

No fígado de animais infectados com a cepa PP75, embora tenha sido observado

um percentual alto de animais que efetivamente se infectaram ao longo do período

avaliado a carga parasitária foi baixa, e a infecção ocorreu de forma mais lenta nos três

grupos ID, IP e IC. Por outro lado, em animais infectados com a cepa selvagem pela via

ID, observou-se um pico no período inicial da infecção e à medida que a doença evoluiu

apresentou-se oscilantes no parasitismo durante o período da cinética avaliada, até mesmo

com redução da carga parasitária. O grupo IP atingiu seu pico máximo aos 9 meses após a

infecção. No grupo IC, o aumento do parasitismo foi progressivo e significativo em relação

aos grupos ID e IP a partir do terceiro mês, atingindo pico máximo no sexto e nono mês

após a infecção experimental com L. infantum.

Em relação ao parasitismo no baço mensurados pela qPCR dos animais infectados

com a cepa PP75, observou-se que os grupos ID e IP o mesmo oscilou bastante durante


119

todo o período avaliado, se estabelecendo de forma mais lenta. Entretanto, o grupo IC o

parasitismo progrediu conforme a doença evoluiu atingindo seu pico máximo em 6 e 9

meses após a infecção. Em animais infectados com a cepa selvagem o parasitismo evolui

nos grupos ID e IP, com pico da carga parasitária no sexto e nono mês da infecção,

enquanto o grupo IC atinge um pico máximo em 6 meses com pequena redução no nono

mês após a infecção.

Estes dados mostram mais uma vez que a evolução da infecção experimental

depende de alguns fatores, como a virulência do parasito, a via de inoculação, o órgão

avaliado e até mesmo o tempo após a infecção (Ott et al., 1967; Hommel et al., 1995;

Melby et al., 1998; Kaye et al., 2004; Carríon et al., 2006, Garg &Dube, 2006). No caso de

uma cepa mais virulenta e patogência, como a cepa selvagem a infecção evolui de forma

mais agressiva de acordo com as particularidades de cada uma das vias de inóculo e órgãos

avaliados. A variação encontrada no percentual e número de parasitos nas amostras de

baço e fígado nos diferentes grupos experimentais provavelmente está relacionada à

resposta imunológica dos hamsters à evolução da doença, o que possivelmente contribui

para uma não distribuição homogênea dos parasitos em todos os órgãos acometidos.

Em nosso estudo, a qPCR mostrou-se superior a LDU e sensível o suficiente para

detectar a presença de parasitos em amostras tanto de baço quanto de fígado em todos os

grupos experimentais (ID, IP e IC) independente da cepa empregada, além de acompanhar

a evolução da carga parasitária nestes órgãos durante todo o período de avaliação. Assim

como no LDU, pela qPCR o maior parasitismo no fígado e no baço foi observado quando

utilizou-se a cepa selvagem e a via intracardiáca. A qPCR também demonstrou que a via

IC induziu maior parasitismo no baço e consequentemente uma infecção mais rápida e

sucedida com sinais clínicos evidentes a partir do terceiro mês de infecção, indicando que a

utilização de tal via de infecção pode-se constituir como a mais apropriada para a obtenção

de uma infecção mais vigorosa e progressiva com a espécie L. infantum e em curto

período, principalmente quando o objetivo é testar drogas numa plataforma in vivo

empregando-se este modelo. (Stauber, 1955; Dea Ayuela et al., 2007).

O grupo IP, embora tenha produzido valores variáveis e baixos na carga parasitária

principalmente quando a cepa PP75 foi utilizada, nos períodos finais da infecção com a

cepa selvagem atingiu alguns picos com valores relativamente maiores e presença de sinal

clínico sugestivo da LV. Estes dados sugerem que um maior tempo no estabelecimento da

infecção experimental é requerido quando esta via é empregada (Ott et al., 1967).


120

Embora a via intradérmica, seja considerada a que mais assemelha o que acontece

na infecção natural pela picada de flebotomíneos, observa-se que a doença manifesta de

forma lenta e os animais permanecem sem qualquer sinal clínico por um longo período

(Wilson et al., 1987; Paranhos-Silva et al., 2003; Goto et al., 2004; Gomes et al., 2008).

Sendo assim, apesar de os animais do grupo ID não terem apresentado sinais clínicos

evidentes durante o período avaliado, foi demonstrado parasito no baço e fígado mostrando

que o parasito teve capacidade de se desenvolver e multiplicar, o que comprova a

virulência das cepas utilizadas e sensibilidade da técnica empregada.

As diferenças detectadas entre os resultados do parasitismo obtidos no baço e

fígado de hamsters experimentalmente infectados pelo LDU e os obtidos pela qPCR nos

diferentes grupos experimentais (ID, IC e IP), reforçam o uso da qPCR para quantificar e

determinar a densidade parasitária nestes órgãos.

Finalmente, no presente estudo avaliou-se a expressão de mRNA das citocinas

proinflamatórias (TNF-α e IFN-γ) e anti-inflamatórias (TGF-β e IL-10) exclusivamente no

baço por RT-PCR quantitativa em tempo Real (qRT-PCR). Os fatores que determinam o

controle ou a evolução da infecção na LV não estão totalmente esclarecidos, mas sabe-se

que a resposta imune celular desempenha importante papel na evolução da infecção

(Bittencourt & Barral-Netto, 1995). Diversos trabalhos já demonstraram que o IFN-γ,

desempenha importante papel em limitar a progressão da LV uma vez que é conhecido

como um dos principais ativadores de macrófagos, através da ativação iNOS e

consequentemente produção de óxido nítrico, mecanismos efetores críticos envolvidos no

controle da replicação do parasito (Liew et al., 1989, Melby et al., 1998; Melby et al.,

2001; Basu et al., 2005).

Nos animais infectados com a cepa PP75, observou-se maior expressão de mRNA

para as citocinas TNF-α e IL-10 no grupo IC no primeiro mês após infecção experimental.

Contudo, no sexto mês o grupo IC observou-se tanto a expressão de mRNA para IFN-γ

quanto de IL-10 e TGF-β, no entanto no nono mês da infecção observou-se apenas

expressão de mRNA para IFN-γ. Além disso, neste mesmo grupo foi evidenciado aumento

nas razões TNF-α/TGF-β; TNF-α/IL-10 e IFN-γ/IL-10.

Assim, verificamos que apesar da presença de INF-γ e TNF-α, ocorre um marcante

perfil de resposta tipo 2 gerada pela elevação na expressão de IL-10 e TGF-β conforme

evidenciado nos dados de razões destas citocinas. Sabe-se que a IL-10 desempenha


121

importante papel na modulação da resposta inflamatória e preservação da homeostase

imune (Bacellar et al., 2000). Estes resultados sugerem que, a produção das citocinas está

intimamente associada às variações da carga parasitária nos animais do grupo (IC), tendo

sido observados valores mais elevados de citocinas proinflamatórias e anti-inflamatórias

nos mesmos tempos em que foi evidenciado aumento da densidade parasitária esplênica

neste grupo. O fato de ter sido observado valores aumentados na expressão de mRNA para

IFN-γ, IL-10 e TGF-β no período correspondente aos valores máximos de parasitismo (6

meses após a infecção) seguida da diminuição na expressão de mRNA das citocinas IL-10

e TGF-β, sugere maior expressão da citocina IFN-γ em resposta ao parasito, o que pode ter

contribuído para a menor evidência dos sinais clínicos observados nos animais infectados

com a cepa PP75, sugerindo um controle da multiplicação do parasito em resposta a

imunomodulação observada neste tempo.

Estudos na LV experimental canina, conduzidos por Maia & Campino, (2011)

demonstraram, que IFN-γ foi expresso apenas pelos tecidos com alta carga parasitária

(baço, medula óssea, e fígado) sugerindo que a presença desta citocina não significa

remoção do parasito. Uma possível explicação para a associação entre a presença de IFN-γ

concomintante as altas cargas parasitárias pode ser devido ao fato que os parasitos estão

constantemente migrando para outros tecidos infectados estimulando sua expressão

(Strauss-Ayali et al., 2007).

Osório et al., (2003), compararam a expressão de mRNA de citocinas no focinho e

na pata de hamsters experimentalmente infectados com L. panamensis e observaram que a

expressão de mRNA para IFN-γ, IL-10 e TGF-β foi maior nos animais que apresentaram

lesões mais severas no focinho, indicando que o local de inóculo influência na evolução da

infecção na leishmaniose cutânea.

Nos animais infectados com a cepa selvagem pela via IC, verificou-se que a mesma

induziu aumento na expressão de mRNA para a citocina IFN-γ durante todo o período

avaliado (1, 3 e 6 meses após a infecção), nestes mesmos tempos também foi observado

um aumento gradativo do parasitismo esplênico. Entretanto aos 9 meses houve uma

redução na expressão de mRNA para IFN-γ neste grupo, fato que pode estar diretamente

relacionado a redução na carga parasitária esplênica observada no grupo IC neste período,

evidenciado pela qPCR.

No terceiro mês da infecção o grupo IC apresentou aumento na expressão de

mRNA tanto para as citocinas TNF-α, como para TGF-β e IL-10. Além disso, em 3, 6 e 9


122

meses, verificou-se aumento nas razões IFN-γ/TGF-β e também IFN-γ/IL-10. Estes dados

sugerem que o perfil de resposta imune observada em hamsters infectados com a cepa

selvagem no grupo IC no período inicial (3 meses), com elevada expressão de IL-10 e

TGF-β indica uma supressão destes animais, permitindo o estabelecimento da infecção

ativa e proliferação parasitária tecidual, onde foi observado elevado parasitismo esplênico

implicando uma relação direta entre a expressão de IFN-γ e o aumento de parasitos no

grupo IC, com um perfil unicamente inflamatório.

Estudos experimentais tem demonstrado a coexistência de valores elevados de IFN-

γ com elevado parasitismo em infecções experimentais com espécies viscerotrópicas de L.

donovani, L. infantum (Wilson et al., 1996; Rousseau et al., 2001; Ahmed et al., 2003).

Sendo assim, a expressão de mRNA das citocinas TGF-β e IL-10 detectados no presente

estudo não foram capaz de inibir a produção de IFN-γ nem mesmo a eliminação dos

parasitos. Estes dados corroboram com os de Melby et al (2001), visto que foi

demonstrado aumento na expressão das citocinas (IFN-γ), bem como de (TGF-β e IL-10)

no baço de hamsters experimentalmente infectados por L.donovani.

O grupo IP apresentou aumento na expressão de mRNA para a citocina IFN-γ a

partir do terceiro mês da infecção, com aumento na expressão de mRNA para as citocinas

TGF-β e IL-10 apenas no nono mês da infecção, momento em que foi constatado maior

parasitismo neste grupo pela qPCR.

Contudo, no grupo ID verificou-se aumento na expressão de mRNA apenas para

TGF-β e IL-10 no nono mês da infecção. Este dado sugere que o aumento na expressão

destas citocinas estaria favorecendo o estabelecimento da infecção com multiplicação do

parasito neste grupo e podem justificar o maior parasitismo neste período no grupo ID

como demonstrados pela qPCR . TGF-β tem mostrado desempenhar importante papel na

indução de imunossupressão em hamster com LV progressiva (Rodrigues et al.,1998).

Em estudos conduzidos por pesquisadores de nosso grupo de pesquisa, mostraram

que durante a evolução da LVC cães sintomáticos com altas cargas parasitárias esplênicas

apresentaram aumento de IFN-γ e que 100% destes animais possuíam expressão

aumentada de IL-10 (Lage et al., 2007). Na LVH também foi demonstrado por Peruhipe-

Magalhães et al. (2006) aumento destas citocinas em células mononucleares do sangue

periférico. Apesar de escassos estudos terem avaliado o perfil de citocinas anti e


123

proinflamatória no modelo hamster com LV podemos concluir que muitos dos fenômenos

imunomodulatórios aqui observados também coincidem com os relatados na LVH e LVC.

Neste contexto, buscou avaliar e comparar o comportamento das diferentes vias de

inóculo (intradérmica, intracardíaca e intraperitoneal) em infecções por L. infantum no

modelo hamster. Além disto, o presente estudo foi determinante para obter uma

caracterização detalhada da infecção experimental neste modelo empregando-se num

âmbito global, análises que pretendem subsidiar estudos pré-clínicos com vistas a futuras

estratégias terapêuticas e vacinais contra LV humana e canina. Neste sentido, foi possível

estabelecer um modelo de infecção capaz de reproduzir a fase aguda e crônica da LV com

parâmetros imunopatológicos, hematológico-bioquímicos e carga parasitária similares ao

observado à infecção humana e canina. A qPCR demonstrou-se como uma ferramenta

sensível e importante, pois possibilitou a comparação de resultados de carga parasitária

entre os diferentes grupos experimentais infectados por diferentes cepas de L.infantum,

particularmente aqueles com reduzido número de parasitos, bem como entre os órgãos

(fígado e o baço). Adicionalmente, a ampliação do espectro de análises investigativas por

meio da imunologia molecular empregando a técnica de PCR em tempo Real para avaliar

perfis de citocinas em diferentes tecidos, permitiu um melhor entendimento da história

natural da infecção experimental no modelo hamster para LV. Neste sentido, acreditamos

que o presente estudo irá permitir ampliar o emprego do modelo hamster para testes pré-

clínicos de drogas e vacinas anti-LV, contribuindo para as pesquisas nestas áreas.

8. CONCLUSÃO

Moreira, N. D. Conclusão

125

Neste estudo foi avaliado o estabelecimento da infecção experimental no hamster,

utilizando diferentes vias de inóculo (intradérmica, intraperitoneal e intracardíaca) e duas

cepas de L. infantum (PP75 e selvagem-C46) com perfis distintos de virulência e

patogenicidade. Os resultados obtidos mostraram:

• maior infectividade com a utilização da cepa selvagem e menor taxa de sobrevida

nos animais inoculados pela via intraperitoneal e intracardíaca;

• sinais clínicos similares aos observados na LV sintomática humana e canina

(emagrecimento acentuado e esplenomegalia);

• exacerbação dos sinais clínicos na infecção pela via IC, sendo estes mais

frequentes e intensos em hamsters infectados com a cepa selvagem, reforçando a

influência da via de inóculo na manifestação de sinais clínicos;

• níveis mais elevados e mais precoces de IgG nos animais infectados com a cepa

selvagem e com maiores níveis nos grupos IP e IC;

• alterações hematológicas clássicas da LV humana e canina: anemia e leucopenia,

acentuados em hamsters infectados com a cepa selvagem pelas vias IP e IC;

• alterações renais com elevação nos níveis de uréia e creatina além de alteração

hepática com elevação nos níveis de AST e ALT independente da cepa, via de

inóculo e tempo avaliado;

• intensidade das alterações histopatológicas do parênquima hepático intimamente

relacionadas ao parasitismo apresentado por cada um dos grupos avaliados (ID,

IC e IP). O aumento do processo inflamatório e a presença de maior número de

granulomas apresentado no grupo IC parece estar relacionado ao intenso

parasitismo;

• alterações histopatológicas esplênicas nos animais infectados com a cepa PP75

foram mais evidentes no grupo IC e, embora tenham ocorrido durante todo período

de avaliação, apresentaram ser com maior intensidade nos períodos finais da

infecção (6 e 9 meses). Entretanto nos animais infectados com a cepa selvagem, as

alterações esplênicas no grupo IC ocorreram em todo período avaliado, porém

com maior exuberância a partir do sexto mês.

• a hipoplasia da polpa branca, hiperplasia da polpa vermelha, perda da arquitetura

e periesplenite demonstradas nos períodos de 6 e 9 meses no grupo IC infectado


126

com a cepa selvagem estão associadas ao intenso parasitismo e sinais mais

severos, tais como: emagrecimento e esplenomegalia;

• alta sensibilidade e elevada performance da qPCR em relação a LDU na detecção

e quantificação de DNA de L.infantum em amostras tanto de baço quanto de

fígado, independente da via de inóculo, do tempo e da cepa empregada;

• semelhante ao observado pela LDU, a qPCR também evidenciou maior parasitismo

no fígado e no baço quando utilizou-se a cepa selvagem e a via intracardíaca;

• aumento da expressão de mRNA de citocinas anti e pró-inflamatórias em hamsters

inoculados com a cepa PP75 associada ao aumento do parasitismo esplênico no

sexto e nono mês da infecção;

• predomínio da expressão de mRNA para IFN-γ, nos animais infectados com a cepa

PP75 no fim do período de avaliação no grupo IC, possivelmente em resposta ao

parasitismo;

• O perfil de resposta imune observada em hamsters infectados com a cepa selvagem

no grupo IC no período inicial (3 meses), com elevada expressão de IL-10 e TGF-β

indica uma supressão destes animais, permitindo o estabelecimento da infecção

ativa e proliferação parasitária tecidual;

• durante os períodos em que foram observados picos de alta densidade parasitária

ocorreru elevação de INF-γ, mostrando um perfil tipicamente inflamatório.

Diante do conjunto de evidências acima exposto, pode-se conclui que:

• O modelo hamster reproduz diversas das características clínicas e laboratoriais da

LV humana e canina, principalmente nas alterações clínico e histopatológicas,

bioquímico-hematológicas, parasitológicas e imunopatológicas. A via de inóculo e

a cepa utilizada são elementos fundamentais para o estabelecimento da infecção e

são determinantes importantes na definição de estratégias empregadas em estudos

pré-clinicos seja para testes de drogas e/ou vacinas.

• Nossos resultados permitem também preconizar que para os estudos pré-clínicos de

testes de drogas leishmanicidas é recomendável usar a cepa selvagem (C46) de L.

infantum buscando o estabelecimento da infecção experimental neste modelo,


127

preferencialmente pela via intracardíaca. Por outro lado, em estudos de testes de

vacinas no modelo hamster é recomendável o emprego da via intradérmica

preferencialmente, e ambas as cepas podem ser utilizadas na infecção desafio desde

que se empreguem métodos moleculares quantitativos na avaliação da densidade

parasitária tecidual após o desafio experimental.

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Moreira, N. D. Referências Bibliográficas

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10. ANEXO

Moreira, N. D. Anexo

145

nÁdia das dores moreira - repositorio.ufop.br · À kátia, a alegria de viver desta garota não...

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