XV Escola de Verão em Química Farmacêutica e Medicinal

Curso III – Farmacologia Clínica

GenGenéética toxicoltica toxicolóógicagica

Dr. Izabel Vianna VillelaGarantia da Qualidade

Laboratório GENOTOX-ROYAL

MutaMutaçções e agentes mutagênicosões e agentes mutagênicos

O DNA

* Cada molécula de DNA é composta por uma seqüência de nucleotídeos ligados um atrás do outro.

fosfato

açúcar

Nucleotídeo

base

* Cada nucleotídeo consiste de 3 partes:

• grupo fosfato,

• uma desoxirribose (açúcar) e

• uma base nitrogenada.

Pirimidinas Purinas

timina

citosina

adenina

guanina

Estes nucleotídeos podem ser de 4 tipos:

# Em cada fita simples de DNA, o grupo fosfato de um nucleotídeo se liga ao açúcar do outro nucleotídeo formando uma fita contínua.

# As 2 fitas de nucleotídeos são enroladas entre si formando uma dupla-hélice.

# Elas são ligadas por pontes de hidrogênio (que mantém a estrutura estável) entre as bases complementares (A-T) e (C-G).

# Cada cromossomo é composto por uma molécula dupla-fita de DNA.

= exposição das bases

O DNA de um organismo não é uma molécula estática.

Modificações na estrutura ou composição química

transcrição

replicação

Quando essas modificações não são corrigidas pelo Sistema de Reparo de DNA, os erros ficam permanentes e são chamados de

MUTAÇÕES

Duas classes de mutações, segundo o tipo de célula em que ocorrem e

seus efeitos:

mutações somáticas

mutações germinativas

Mutação

Mutação gênica

um alelo de um gene muda, tornando-se um

alelo diferente

Elas podem envolver substituição, adição ou

perda de uma única base

Mutação cromossômica

as modificações são maiores, alterando os

cromossomos

mutações estruturais

mutações numéricas

modificam a estrutura dos cromossomos

alteram o número de cromossomos

1) substituição

MUTAÇÕES GÊNICAS

2) deleção 3) inserção

MUTAÇÕES CROMOSSÔMICAS

A mutação cromossômica é o processo de mudança que resulta em alterações

partes rearranjadas do

cromossomo

números anormais de

cromossomos individuais

números anormais de

conjuntos cromossômicos

estruturais numéricas

se a mutação cromossômica envolver quebra de cromossomos, a quebra pode ocorrer no meio de um gene, perturbando assim o seu funcionamento.

Muitas mutações cromossômicas levam a anomalias de funcionamento da célula e do organismo.

podem resultar em número ou posição anormal de genes

Todos os organismos sofrem um certo número de mutações como resultado de funções celulares normais ou interações com o meio

ambiente.

A taxa em que ocorrem = NÍVEL BASAL

MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS

A ocorrência das mutações pode aumentar com a presença de determinados compostos = Agentes mutagênicos

MUTAÇÕES INDUZIDAS

o efeito de um agente mutagênico émedido pelo grau em que ele ↑ a taxa

de mutação acima do nível basal

São classificados 4 principais grupos de mutágenos químicos, com base em suas reações com o DNA:

1- Agentes alquilantes – interagem com os centros nucleofílicos do DNA, adicionando grupos alquila.

Podem produzir pareamentos errados, levando a transições

2- Análogos de base – são moléculas cuja estrutura é muito parecida com a de uma base estrutural e que às vezes são incorporadas no DNA em seu lugar, mas que têm propriedades de pareamento diferentes.•Podem levar a mutação por substituição de base

5-Bromouracila: Análogo da timina

• Normal- pareia com a adenina

•Ionizado- pareia com a guanina

2-aminopurina (2-AP): análogo de base da adenina

• Normal- pareia com a timina

•Protonada- pareia com a citosina

3- Agentes desaminantes –reagem com as bases que possuem grupo amino (adenina, guanina e citosina), causando desaminação.• Provocam transições CG → TA, em ambas a direções

4- Agentes intercalantes – são compostos que se intercalam no DNA, entre a bases nitrogenadas. • Podem causar inserções ou deleções• Podem intercalar em fita simples

Ponte intracadeia Ponte intercadeias

Monoadição

Mutágenos químicos

•Componentes de alimentos

EX. - derivadas de plantas;

- Dos 5000 a 10000 pesticidas naturais, 63 têm sido estudados, e destes, 35 produziram cânceres em roedores

- O cozimento de comida freqüentemente produz material queimado, alguns dos quais também podem ser carcinogênicos para roedores

- Café torrado contém cerca 1000 químicos diferentes e dos 28 testados, 19 são carcinogênicos para roedores

- aflatoxina B1– causam câncer de fígado em humanos

Formação de sítios apúricos leva a mutações

• Drogas terapêuticas - previnem a divisão celular, sendo a fase de replicação do DNA seu principal alvo.

EX. - Mitomicina C – usada no tratamento de carcinomas gastrintestinais e câncer de bexiga: causa cross-linking no DNA

- Mostarda nitrogenada: agente alquilante antineoplásico

- Bleomicina – usada em carcinoma testicular, cânceres de cabeça e pescoço: causa a remoção de bases e quebras no DNA

- Inibidores de topoisomerases: As drogas podem inibir a habilidade das topoisomerases, deixando fitas de DNA quebradas, com eventual morte das células afetadas

Mutágenos físicos •Radiações ionizantes

•Utilizados para diagnósticos médicos porque penetram em tecidos vivos por consideráveis distâncias.

•causa a quebra das ligações açúcar-fosfato do DNA, o que pode levar a aberrações cromossômicas estruturais.

Muitos tipos diferentes de oxigênio reativos são produzidos

Radiações Ionizantes X Terapia Anticâncer

- células tumorais estão mais freqüentemente em mitose em relação aos tecidos normais

↑aumenta a freqüência de quebras cromossômicas → letalidade em células que estão em mitose

mais freqüentemente morrem as células tumorais

Radiação não-ionizante

– embora a luz ultravioleta (UV) não tenha energia suficiente para induzir ionizações, carrega energia suficiente para causar mutações na molécula.

- A UV absorvida por muitas moléculas orgânicas como purinas e pirimidinas no DNA, que ficam mais reativas.

Formação de um fotodímero de ciclobutano

Interferem no pareamento normal de bases.

Gera transições, transversões, mudança na matriz de leitura, duplicações e deleções.

Tipos de danos no DNA

Gene, 250:15-30, 2000

Sítio apurínico

Intercalações

Sítio apirimidínico

Dímeros de pirimidina

Quebras duplas

Ponte intercadeia

Quebras simples

Ponte DNA-proteína

Alquilação

Danos de base

Ponte intracadeia

Adutos tipo “bulky”Formação de radical

GenGenéética Toxicoltica Toxicolóógicagica

GenGenéética Toxicoltica Toxicolóógicagica

Disciplina científica que identifica e analisa a ação de um grupo de agentes tóxicos que são capazes de interagir com o material genético dos organismos (agentes genotóxicos).

Ciência Multidisciplinar

Estabelecer a correlação existente entre a exposição a agentes xenobióticos e a indução de alterações genéticas tanto nas células germinativas como nas somáticas, definindo qual o efeito que as toxinas ambientais produzem sobre a integridade genética dos seres vivos.

Agentes genotAgentes genotóóxicos e a induxicos e a induçção de dano genão de dano genééticotico

Agente genotóxico

Agente direto Agente indireto

Interação com o DNA

Reparação

Eficiente

DNA não alterado

Ineficiente

Dano genético

Célula somática

Célula germinativa

Mecanismo bMecanismo báásico de reparasico de reparaçção de DNAão de DNA

Reparação

Livre de erro Sujeita a erro

Eliminação do aducto

Fixação das mutações

Dano genético

Fidelidade Genética

Metabolismo de Agentes XenobiMetabolismo de Agentes Xenobióóticosticos

Xenobiótico

Biotransformação

BiodegradaBiodegradaççãoão

Nucleofílico

BioativaBioativaççãoão

Eletrofílico

Detoxificação

Eliminação

Danos a tecidos

Reações imunológicas

ÁÁcidos cidos NuclNuclééicosicos

CROSBY; 1998

Biotransformação do B[a]P

Fígado

parada de ciclo celular

Apoptose

Inibição da transcrição

Indução gênica

Estabilização de p53

Bloqueio na replicação

* Mutações pontuais* SCE* Translocações* Recombinação* Rearranjos no genoma

Envelhecimento e doenças

degenerativas

Síndromesgenéticas

Câncer

GenotoxinasRadicais livres

Respostas celulares a danos no DNARespostas celulares a danos no DNA

Reparo de DNAReparo de DNA

Mutagênese X Carcinogênese

A maioria dos produtos carcinogênicos são também mutagênicos;

Tumores não são o resultado de um evento genético isolado, mas de múltiplos eventos. Diversas mutações podem ocorrer em uma mesma célula iniciando uma neoplasia.

Por este motivo é tão importante testar a atividade mutagênica de novas drogas.

CarcinogêneseCarcinogênese

Produtos ou processos que influenciam a iniciação, promoção ou expansão do tumor (neoplasia).Neoplasia – crescimento novo e fora de controle de células do próprio organismo.

Decorre de falha no sistema de controle genético, não necessariamente mutação.

Mas…

Por apresentarem uma atividade similar quanto a dose e eficiência de induzir neoplasia pode-se inferir que um produto mutagênico épotencialmente carcinogênico.

Exemplo resumido do processo de carcinogeneseExemplo resumido do processo de carcinogenese

Célula normal

Aducto

Célula iniciada

Célula promovida

Célula tumoral

Neoplasia

Invasão de outros tecidos

IniciaIniciaççãoão

PromoPromoççãoão

ProgressãoProgressão

MetMetáástasestase

CarcinCarcinóógeno diretogeno direto

PrPróó ––mutmutáágeno geno metabmetabóólito reativolito reativo

LatênciaLatência

CocarcinCocarcinóógenogeno

ProliferaProliferaçção celular ão celular autônomaautônoma

Importância de estudos de mutagênese

Mutação: se não mata a célula ela pode se proliferar no corpo em crescimento (mutação somática) ou ser transmitida para as próximas gerações (mutação germinal).

Estima-se que as murações somáticas e germinais são responsáveis por:

50% das mortes fetais,30% dos problemas de aprendizagem,20% dos defeitos congênitos, e2% da infertilidade masculina.

A lesão que parece pior a curto prazo nem sempre é a pior a longo prazo.

Por este motivo é que a avaliação de baixas doses é tão importante.

Nenhum teste isolado é capaz de detectar todos os tipos de mutação induzida.

Baterias de bioensaios genéticos foram desenvolvidas para identificas os três maiores alvos de danos genéticos:

– Muração gênica (mutação gênica) ‏

– Clastogênese (aberrações cromossômicas estruturais) ‏

– Aneugênese (aberrações cromossômicas numéricas) ‏

Bioensaios genBioensaios genééticosticos

In vitro In vivo Assays for Gene Mutations Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames test, bactéria)

X

Escherichia coli reverse mutation assay (bacteria) X Gene mutation in mammalian cells in culture X Drosophila sex-linked recessive lethal assay (fruit fly) X Gene mutation in Saccharomyces cerevisiae (yeast) X Mouse Spot test X Assays for Chromosomal and Genomic Mutations In vitro cytogenetic assay (CHO/SHE/Human lymphocyte) X In vivo cytogenetic assay X Micronucleus test X Dominant lethal assay X Herutable translocation assay X Mammalian germ cell cytogenetic assay X Assays for DNA Effects DNA damage and repair: unscheduled DNA synthesis in vitro X Mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae (yeast) X In vitro sister chromatid exchange(SCE) assay X

Principais ensaios genotPrincipais ensaios genotóóxicosxicos

Bateria de testes de genotoxicidade (de acordo com o ICH*) usadano registro de novas drogas:

• Um teste de mutação gênica em bactéria.

• Um teste in vitro para avaliação citogenética de dano cromossomal com células de mamífero ou o teste in vitromouse lymphoma TK.

• Um teste in vivo para dano cromossômico com células hematopoeticas de roedores.

International Conference on Harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use.Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1).

Boas Práticas de Laboratório (BPL)“... Assegurar a geração de resultados de alta qualidade e

confiabilidade...”

Aplicação dos principios de BPL em estudos de curta duração:1. Organização do pessoal e da Instalação Teste.2. Programa de Garantia da Qualidade.3. Equipamentos, Materiais e Reagentes.4. Sistema Teste.5. Substância teste e referência.6. Procedimentos Operacionais Padrão.7. Condução do Estudo.8. Relatando o Resultado.

Os ensaios devem ser realizados de acordo com guidelines internacionais, como OECD, EPA, ICH, etc.

TESTE DE AMESTESTE DE AMESOECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects. Bacterial Reverse

Mutation Teste: No. 471

Esquema do funcionamento do sistema regulatório SOS

Nas linhagens de Salmonella typhimurium utilizadas no teste

Salmonella/Microssoma, a resposta SOS é otimizada pela presença

do plasmídio pKM101, carregando os genes mucAB, alelos de

umuCD de bactérias, envolvidos na reparação sujeita a erro. Ao se

transformar em co-protease, RecA, além de desreprimir o sistema

SOS, também cliva UmuD, gerando uma forma ativada, UmuD’, que

se complexa com UmuC. Este complexo se liga a sub unidade ε da

DNA polimerase I, permitindo que esta realize a síntese translesão,

levando portanto a mutagênese

Resultado negativo:• N° revertentes/placa do ensaio similar ao n° de revertentes/placa espontâneos

Indício de mutagenicidade:• Quando um dos requisitos não for significativo

Resultado positivo:• Índice Mutagênico > ou = a 2 (> ou = 3 para a linhagem 1535)

IM= n° revertentes placa ensaio/ n° revertentes placa c-• Curva dose resposta significativa (valor de p)• Diferença significativa entre as médias dos revertentes/placa das diferentes doses (Anova)

Resultado Tóxico:• Índice Mutagênico < 0,6

Em resultados positivos:

Teste de revertentes verdadeiros.

Ativação Metabólica (S9):

Aroclor 1254

S9 S9mix

LinhagensLinhagens

Strain Type of Mutation

S. typhimurium TA97a frameshift

S. typhimurium TA98 frameshift

S. typhimurium TA100 base-pair substitution

S. typhimurium TA1535 base-pair substitution

S. typhimurium TA102 base-pair substitution

E. coli WP2 base-pair substitution

Linhagens:

TA98 - Erro no quadro de leiturahisD3052 - CGCGCGCG -

- GCGCGCGC -TA100 - Substituição em pares de baseshisG46 de prolina - GGG - por leucina - GAG -

- CCC - - CTC -

Mutação rfa - aumento da permeabilidade

Mutação uvrB - inativação do sistema de reparo por excisão do DNA

Plasmídeo pkM101 - aumento do sistema de reparo sujeito a erro e confere resistência a ampicilina

LinhagensTA97a TA98 TA100 TA102 TA1535

Gene Mutado hisD6610his01242

hisD3052 hisG46 hisG428 hisG46

Aminoácido requerido

HistidinaBiotina

HistidinaBiotina

HistidinaBiotina

Histidina HistidinaBiotina

Mutação rfa rfa rfa rfa rfaCaracterística PBL* PBL PBL PBL PBL

Mutação uvrB uvrB uvrB - uvrBCaracterística Sensibilidade à luz

uvrBSensibilidade à luz

uvrBSensibilidade à luz

uvrBResistência à luz

uvrA e uvrBSensibilidade à luz

uvrBPlasmídeo pKM101 pKM101 pKM101 pKM101

pAQ1-

Característica Resistência àampicilina

Resistência àampicilina

Resistência àampicilina

Resistência àampicilina etetraciclina

Sensibilidade àampicilina etetraciclina

Taxa de mutação espontânea

90 - 180 30 - 50 120 - 200 240 - 320 5 - 30

Tipo de mutação detectada

Deslocamento do quadro de leitura

Deslocamento do quadro de leitura

Substituição de pares de bases

Substituição de pares de bases

Substituição de pares de bases

* PBL: perda parcial da barreira de lipopolisacarídeos, aumentando a permeabilidade da membrana a moléculas grandes, que normalmente não passariam pela mesma.

CaracterCaracteríísticas genotsticas genotíípicas das linhagens de picas das linhagens de S. typhimuriumS. typhimurium utilizadas no Teste de Amesutilizadas no Teste de Ames

ControlesControles

Químico Solução estoque (µg/ml)

Concentração final

(µg/plate)

Linhagem S-9

Azida Sódica (NaN³) 100 10 TA100 -

TA1535 -4-Nitroquinolina

1-oxide (NQO)**10 0.5 TA97a

-TA98

-TA102

-WP2 -

Aflotoxina B1 (AFB1) 100 10 Todas as linhagens +

Strains S9 n Mean nºSpontaneous

S.D. Range

Revertants Lower Upper

TA97a - 167 112,96 27,94 42 195TA97a + 156 121,47 36,15 55 346TA98 - 180 19,30 11,07 5 69TA98 + 180 26,12 26,20 8 77TA100 - 151 139,41 32,10 89 274TA100 + 151 131,13 32,76 73 264TA102 - 155 251,76 54,34 95 479TA102 + 137 292,24 64,23 180 497

TA1535 - 128 8,71 6,88 1 39TA1535 + 121 8,85 5,20 1 25

WP2 - 18 130.44 64.76 80 336WP2 + 18 128.66 40.49 99 240

HistHistóórico de mutarico de mutaçção espontâneaão espontânea

µg/placa Revertentes HIS+/placa Média ± S.D. IM0a 200 183 196 193,00 ± 8,89 -4 181 195 171 182,33 ± 12,06 0,9420 181 178 220 193,00 ± 23,43 1,00

100 121 118 141 126,67 ± 12,50 0,65500 107 130 134 123,67 ± 14,57 0,64

2500 125 135 124 128,00 ± 6,08 0,661 (NaN3)b 608 640 644 630,67 ± 36,00 3,26

Freqüência de mutação reversa HIS+ em S. typhimurium TA100 após tratamento com x no teste de pré-incubação sem metabolização.

Teste de Ames

Variações de método:

-Incorporação em placas: cultura bacteriana, amostra (volume máximo 200 µl) e S9 são misturados em tubo com ágar de superfície e plaqueados imediatamente em meio mínimo.

- Pré-Incubação: cultura bacteriana, amostra (volume máximo 200 µl) e S9 são misturados em tubo e pré-incubados (20 a 30 min) antes de receber ágar de superfície e serem plaqueados em meio mínimo.

-Microssuspensão (Kado): cultura bacteriana pré concentrada (5 a 10 vezes), amostra (volumes pequenos: 5 a 10 µl) e S9 (50 µl) são misturados em tubo e pré-incubados (90 min) antes de receber ágar de superfície e serem plaqueados em meio mínimo. Indicado para volumes pequenos de amostra e tem sensibilidade de 5 a 10 vezesmaior que o teste convencional.

- Método Direto: aumento do volume máximo da amostra (2000 µl). Recomendado para amostras líquidas pouco concentradas ou quando existe suspeita da existência de presença de compostos genotoxóxicos que podem não ser recuperados pelos métodos tradicionais de extração orgânica.

Baseia-se na idéia de que quebras nas fitas de DNA ou fibras rompidas do fuso acromático permitem a um cromossomo inteiro ou cromossomos formar núcleos de tamanho menor após uma rodada de divisão celular (Ji, Q. et al,. 1999);

Adiciona bastante velocidade e robustez estatística à análise;

Validado internacionalmente;

Aberrações numéricas e cromossômicas;

Fácil execução e análise

TESTE DE MICRONTESTE DE MICRONÚÚCLEOS (MN)CLEOS (MN)OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects. Erythrocytes

Micronucleus Test: No. 474

MaturaçãoAgentes

GenotóxicosQuebra

Dano no fuso

Fragmento cromossômico

Cromossomo inteiro

Prófase Metáfase Anáfase Telófase

Células com MN

Tratamento in vivo de 5 animais de cada sexo em cada dose. Mínimo 3 doses.

Três dias de tratamento. Abate no quarto dia

Análise dos micronúcleos em eritrócitos de medula óssea.

Preparação de lâminas com esfregaço da medula óssea de ambos os fêmures de cada animal.

Análise em microscópio de 500 células avaliando a proporção de PCE e NCE – Pode indicar toxicidade, quando o número de células jovens decai em relação ao número de células antigas.

Análise de 1000 PCE por lâmina avaliando a presença de micronúcleos – Indica a indução de dano ao DNA.

PCE – Eritrócito Policromático.Célula mais jovem, com maior quantidade de RNA no citoplasma e apresentando coloração roxa.NCE – Eritrócito Normocromático.Célula mais antiga, que já perdeu o RNA do citoplasma e apresenta coloração laranja.

Dose diária (mg/kg) Mortalidade (%)3 X 187,5 Zero

3 X 375 16,67

3 X 750 33,33

Ensaio de toxicidade. Percentagem de sistemas teste mortos em cada grupo teste tratado com substância teste.

Grupo Sexo Número de EPC em 1000 eritrócitos(mg/kg) Individual Por sexo

Média ± dpPor grupoMédia ± dp

C- M 650 720 611 587 626 638,8 ±50,8 630,2 ± 59,8F 671 643 680 614 500 621,6 ± 72,7

D1 M 594 694 727 683 742 688,0 ± 57,7 702,3 ± 49,43 X 87,5 F 755 651 708 740 729 716,6 ± 40,5

D2 M 570 770 558 652 661 642,2 ± 85,3 665,0 ± 63,53 X 175 F 700 694 648 701 696 687,8 ± 22,4

D3 M 675 772 797 776 678 739,6 ± 58,4 693,3 ± 80,83 X 350 F 550 651 740 594 700 647,0 ± 76,9

C+ M 621 668 646 580 625 628,0 ± 32,7 657,9 ± 43,62 X 25 F 706 663 650 726 694 687,8 ± 31,1*

Ensaio de Micronúcleos. Número de Eritrócitos Policromatófilos (EPC) em 1000 eritrócitos, média e desvio padrão por sexo e por grupo.

* P<0,05

Grupo Sexo mEPC em 2000 EPC(mg/kg) Individual Por sexo

Média ± dpPor GrupoMédia ± dp

C- M 4 4 1 3 5 3,4 ± 1,5 3,4 ± 1,5F 3 5 1 5 3 3,4 ±1,7

D1 M 1 2 1 0 1 1,0 ± 0,7 1,5 ± 1,13 X 87,5 F 3 0 3 2 2 2,0 ± 1,2

D2 M 5 2 0 3 1 2,2 ± 1,9 2,8 ± 1,53 X 175 F 4 4 4 3 2 3,4 ± 0,9

D3 M 1 1 2 3 0 1,4 ± 1,1 2,0 ± 1,63 X 350 F 1 1 5 2 4 2,6 ± 1,8

C+ M 27 11 12 27 45 24,4 ± 13,9 25,3 ± 9,6*2 X 25 F 22 29 29 29 22 26,2 ± 3,6

Ensaio de Micronúcleos. Número de Eritrócitos Policromatófilos com micronúcleos (mEPC) em 1000 eritrócitos, média e desvio padrão por sexo e por grupo.

*P<0.0001 (teste t-Student)

Aplicação desde o início do século 20;

Necessidade de análise criteriosa e demorada;

É, portanto, ainda, o método mais confiável para avaliar danos ao material genético;

Baseia-se na observação em microscópio da morfologia de preparações cromossômicas do material biológico de interesse.

TESTE DE ABERRATESTE DE ABERRAÇÇÕES CROMOSSÔMICAS (AC)ÕES CROMOSSÔMICAS (AC)OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: Health Effects. In Vitro Mammalian

Chromosome Aberration Test: No. 473

48 h incubação4 h tratamento

Cultura celular 70 h

Colchicina (2 h) ‏Tratamento hipotônico

(20 min) ‏

Fixação

Analise Cromossômica Coloração

AB. NUM. ABERRAÇÕES CROMATÍDICAS ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS Aberr.

Endo Poli GAP Del. Trocas Frag. Min. GAP Del. Trocas Frag. Min. Mult.redu. ploid. intra inter Dic Tri Anel

Mais de 7 aberrações

Análise de 2000 células por lâmina avaliando o Índice Mitótico.

Análise de 200 células por dose avaliando Aberrações Cromossômicas.

Aberrações Cromossômicas em linfócitos humanos

Cromossomos normais de linfócitos humanos

Índice Mitótico (%)1Cultura nº

Substância Teste

ConcentraçãoMédia D.P.3

Sobrevivência2

(% do controle)

1 DMSO 0,5 % (v/v) 8,58 1,58 100

2 x 0,8 μg/mL 8,68 1,66 101,083 x 4 μg/mL 8,14 1,66 94,824 x 20 μg/mL 8,88 2,93 103,495 x 100 μg/mL 8,55 2,42 99,596 x 500 μg/mL 18,48 1,73 215,26

Concentrações da substância teste e os Índices Mitóticos obtidos no ensaio de Avaliação de Toxicidade.

Índ. Mitótico1 Sobrev.2 Número de células aberrantes

Substância Teste1

Tratamento Médi

a D.P.3 % Total(por cultura) Média D.P.3

Nº de células aberr /Nº de

célulasDMSO 0,5 % (v/v) 3,70 1,51 100 14 (6, 2, 4, 2) 3,50 1,91 0,070

Etoposideo4 1 μg/mL 1,39 0,67 37,50 139 (44, 46,16,33)

34,75**

13,74 0,808

x 100 μg/mL 9,79 4,51 264,53 7 (0, 4, 2, 1) 1,75 1,71 0,035

x 200 μg/mL 12,16 1,88 328,61 5 (1, 1, 3, 0) 1,25 1,26 0,025

x 300 μg/mL 15,24 2,38 411,82 2 (2, 0, 0, 0) 0,50 1,00 0,010

x 400 μg/mL 16,05 1,72 433,78 2 (0, 1, 0, 1) 0,50 0,58 0,010

x 500 μg/mL 15,32 3,19 414,19 8 (1, 2, 3, 2) 2,00 0,82 0,040

Concentrações da substância teste, Índices Mitóticos e resultados das análises de aberrações cromossômicas obtidos no ensaio de Avaliação de Mutagenicidade na ausência de metabolização e com 4 horas de tratamento.

1Contagem de oito lâminas, 1000 células por lâmina; 2Sobrevivência baseada no índice mitótico do controle negativo; 3desvio padrão; 4172 metáfases analisadas; **P < 0,01, Dunnett´s Multiple Comparison Test.

Aberr.Numéricas Aberrações Estruturais

Aberrações Cromatídicas Aberrações CromosômicasSubstância Teste

Tratamento

End. Polip.GAP

Del. Intra.

Inter.

Frag.

Min. GAP

Del.Dic

Tri. Anel Frag.

Min Ab. Múl.

DMSO 0,5 % 00 00 02 07 00 00 08 00 01 01 00 00 00 04 00 00

Etoposideo1 1 μg/mL 00 00 31 118

00 06 14 02 04 07 00 00 00 57 01 81

x 100μg/mL 00 00 00 06 00 00 02 00 00 01 00 00 00 00 00 00

x 200μg/mL 01 00 00 08 00 00 00 00 00 00 00 00 00 01 00 00

x 300μg/mL 02 00 01 01 00 00 00 00 00 00 00 00 00 01 00 00

x 400μg/mL 01 00 00 04 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00

x 500μg/mL 00 00 00 09 00 00 01 00 00 02 00 00 00 00 00 00

Número e tipo de aberrações cromossômicas encontradas no ensaio de Avaliação de Mutagenicidade em ausência de ativação metabólica e com quatro horas de tratamento.

Quando um produto apresenta um resultado positivo

•Um resultado positivo in vitro não é o final do processo de análise.

– >25% das drogas no mercado têm ao menos um resutado positivo na avaliações de Genética Toxicológica.

•Nem todos os resultados positivos são relevantes para humanos, que frequentemente estão expostos a compostos em baixas concentrações.

•Resultados positivos in vivo são mais problemáticos do que resultados positivos in vitro.

•A escolha do teste e a qualidade com que é feito o desenho experimental são muito importantes.

Revisão dos resultados de todos os ensaios (S2 R1):•A resposta preenche todos os requisitos para ser considerada um resultado positivo?•A resposta é dose - resposta?•A resposta é reprodutível?•A resposta ocorre em doses inferiores as condições de cultura aceitáveis, ex. pH, osmolaridade, ou níveis de precipitados?•Para células de mamíferos o efeito é observado somente em níveis extremamente baixos de sobrevivência?•A resposta positiva pode ser atribuída a contaminantes?•Os resultados obtidos para um alvo genotóxico específico são consistentes com os resultados obtidos para outros compostos da mesma classe química?

Resultado positivo in vitro

Resultado positivo in vitro pode requeres uma demonstração de biodisponibilidade in vivo.

– É essencial demonstrar biodisponibilidade em altas doses.

• Resultado positivo in vitro e resultado negativo in vivo (medula óssea) pode requerer um segundo teste in vivo para a obtenção de informações adicionais.

Este segundo ensaio deveutilisar:

– uma espécie diferente,

– um órgão alvo diferente,

– um diferente mode de ação.

Resultado positivo in vivo

Resultados de testes de genotoxicidade in vivo, principalmente teste de citogenética em medula óssea, desempenha um papel vital na avaliação de risco. Aumento em células de medula óssea micronucleadas tem alto poder regulatório, indicando que o composto teste é um carcinógeno genotóxico potencial.

No entanto, existem novas evidências de que distúrbio fisiológicos (alterações na temperatura corporal, aumento na eritropoese, inibição da síntese protéica) induzidos por compostos químicos em roedores usados nestes testes podem ocasionar aumento em células de medula óssea micronucleadas que não estão relacionadas ao potencial genotóxico do composto em teste.

Tweats et al. 2007a and b

Tweats et al. 2007

A avaliação do potencial genotóxico de um composto deve tomar em consideração todos os resultados e

reconhecer o valor intrinseco e as limitações de teste in vitro e in vivo.

ICH S2

Outros testes de genotoxicidade Outros testes de genotoxicidade comumente utilizadoscomumente utilizados

Células de linfoma de camundongo L5178Y tk+/- 3.7.2CHeterozigotas no lócus da timidina kinase Tk1 no cromossomo 11.

Mamíferos normalmente têm duas cópias de cada gene, no entanto esta linhagens possui apenas uma cópia, sendo referida como TK+/TK-.

-Timidina kinase é uma enzima não essencial que permite a uma célula utilizar uma rota metabólica alternada por incorporar timidina no DNA.- Trifluorotimidina (TFT) é uma análogo tóxico da timina que quando incorporado ao DNA no lugar da timidina, interfere no metabolismo do DNA matando a célula. -No entanto se a cópia funcional do gene TK é perdida por uma mutação, o TFT não é metabolizado e não é tóxico, permitindo o -crescimento das colônias.

MOUSE LYMPHOMA ASSAYMOUSE LYMPHOMA ASSAYTeste de mutaTeste de mutaçção gênica em cão gênica em céélulas de mamlulas de mamííferosferos

Plaqueamento para sobrevivência

O plaqueamento de sobrevivência deve ser realizado para o método de micropoços e para tratamento de 24hs.

A concentração celular é ajustada e as culturas são incubadas por 1 – 2 semanas, sendo o número de clones viáveis avaliado.

A dose mais alta a ser utilizadas deve reduzir a sobrevivência para 80 – 90% ou para substâncias não tóxicas deve ser adotado o limite da solubilidade, sendo o limite máximo 5mg/ml.

Período de expressão

As células tratadas são lavadas e crescidas para a fixação da mutação por 48hs (período para expressão e fixação da mutação da mutação). Quando efeito tóxico é observado pode ser aplicado um período de expressão maior para permitir a recuperação de célula.

Plaqueamento para viabilidade

Existem dois métodos: plaqueamento em agar e em placas de 96 poços.

Método Agar

Após o período de expressão, a densidade celular é ajustada em meio seletivo contendo agar e TFT. Uma segunda bateria de placas é preparada na ausência de TFT para avaliar a viabilidade das células após o tratamento. As culturas são incubadas por 10 - 14 dias a 370C. O teste normalmente é realizado duas vezes para assegurar reprodutibilidade.As colônias são contadas como no teste em bactérias, a freqüência de mutações é calculada em termos de número de colônias mutantes em 106 células viáveis.

Método de micropoços

Após o período de expressão, as células são diluídas até a densidade padrão meio seletivo TFT na ausência de agar. As células são dispensadas em placas de 96 poços, sendo incubadas por 13 dias. Uma segunda bateria de células é diluída em meio na ausência de TFT para medir a viabilidade celular. No final do período as placas são examinadas para avaliar o número de poços com colônias. A freqüência de mutação é expressa como a eficiência clonogênica em meio seletivo dividido pela eficiência clonogênica em meio não seletivo.Neste método “colônias” são acúmulos de crescimento nos poços.

Colônias grande e pequenas

Quando o gene TK é perdido por mutação, as células crescem relativamente bem e formam colônias grande normais. Quando o gene TK é perdido por uma grande injúria genética como uma quebra cromossômica, outros genes também são negativamente afetados e as células irão crescer com dificuldades resultando em colônias pequenas anormais.

Embora praticamente todos os agentes mutagênicos produzam uma mistura dos dois tipos de colônias, em teoria a proporção de colônias grande e pequenas podem indicar o modo de ação do composto.

Critérios para aceitação dos ensaios

-A freqüência de mutantes no controle negativo deve estar dentro da taxa normal (60 mutantes em 106 células viáveis – não mais do que três vezes este valor).

- Uma dose do controle positivo deve induzir claro aumento na freqüência de mutantes.

- A eficiência de plaqueamento do controle negativo do experimento de mutagênese deve estar entre 60 - 140% no dia 0 e entre 70 – 130% no dia 2.

Avaliação do resultado

A relevância biológica dos resultados deve ser considerada a questão crítica, no entanto a análise estatística pode ajudar na interpretação.

Critérios para um teste ser considerado positivo:

-O ensaio deve ser válido- A freqüência de mutantes em uma ou mais doses deve ser significativamente diferente do controle negativo.- Deve apresentar uma correlação dose-resposta.

ENSAIO COMETA ENSAIO COMETA Eletroforese em gel em cEletroforese em gel em céélula lula úúnicanica

Desenvolvido por Singh e cols. (1988) para detectar o dano primário ao DNA

É bastante sensível, detectando quebras simples e duplas e sítios alcalilábeis nas moléculas de DNA;

Microeletroforese de células suspensas em uma fina camada de agarose disposta sobre uma lâmina e lisadas por detergentes e alta concentração de sais.

Teste indicativo

Simples, sensível e rápido

Danos em células individuais

Pequeno número de células

Pode ser realizado em qualquer célula nucleada

Dano e reparo no DNA

Muito usado em estudos de genética toxicológica

Após a eletroforese as células (nucleóides) adquirem uma morfologia semelhante a de um cometa;

Cabeça representa o arcabouço de DNA intacto e a cauda, fragmentos provenientes de lesões no DNA.

25 μm

Villela et al., 2006

Uma das manifestações do dano a o DNA são os eventos de recombinação (crossing-over) mitótica;

Utilizando-se técnicas apropriadas é possível identificar a composição das cromátides na metáfase;

Cromossomos Arlequim.

Troca de CromTroca de Cromáátides Irmãs (SCE)tides Irmãs (SCE)

Novas tendências em toxicologia

Novos mNovos méétodos para avaliatodos para avaliaçção toxicolão toxicolóógicagica

GenotoxicidadeGenotoxicidadeMutagêneseMutagênese

DNADNA RNARNA

transcriptoma

ProteProteíínana

proteoma

SoluSoluçção de problemasão de problemas-- SusceptibilidadeSusceptibilidade-- TempoTempo-- ExposiExposiçção ão

mmúúltiplaltipla

Biomarcadores,Biomarcadores,AnAnáálise toxicogenômicalise toxicogenômica

Expressão gênicaExpressão gênica(microarranjos)(microarranjos)

Expressão protExpressão protééicaica((chipchip de protede proteíínas)nas)

Projetos pProjetos póóss--genômicosgenômicosmetiloma

RLGS

Contato

Dr. Izabel Vianna Villela

izabel_genotox@institutoroyal.com.br