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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MONOGRAFIA DE CONCLUSÃO DO
CURSO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS
SycH E YopH DE Yersinia enterocolitica
EM DIFERENTES LINHAGENS DE Escherichia coli
Thiago de Salazar e Fernandes
RECIFE
2002.2
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS
SycH E YopH DE Yersinia enterocolitica
EM DIFERENTES LINHAGENS DE Escherichia coli
Thiago de Salazar e Fernandes
Orientador: Osvaldo Pompílio de Melo Neto
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – FIOCRUZ
Monografia apresentada ao
Curso de Bacharelado em
Ciências Biomédicas da
Universidade Federal de
Pernambuco, como parte dos
requisitos para obtenção do
grau de Bacharel em Ciências
Biomédicas.
Ao meu avô José (in
memoriam) e aos meus
pais.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus, por mais uma etapa concluída.
Ao meu pai Pedro Fernandes Neto, por me incentivar o espírito científico e a minha mãe
Vera Lúcia de Salazar e Fernandes, pelo apoio, carinho e compreensão.
Aos meus irmãos Henrique e Rodrigo, por me motivarem cada um da sua maneira, e aos
demais familiares e amigos.
Ao meu orientador, Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto, pelos conhecimentos transmitidos
e pela amizade.
À doutoranda Patrícia Haver, pelo interesse em discutir os resultados, sempre me passando
novas idéias e desta forma me motivando a seguir adiante.
Às Dras. Alzira Maria Paiva de Almeida, Nilma Cintra Leal e Tereza Cristina Leal Balbino,
do Departamento de Microbiologia do CPqAM.
Aos amigos e colegas de bancada: Henrique, Emanuelle, Rodrigo, Tamara, Cheila,
Alessandra, Rodolfo, Christian, Pollyanna, Rafael, Felipe, Marise, Cariri, Jemima, Liciana,
Cláudia, Soraya, Gerlane, Carol, assim como os que fizeram parte do grupo: Mariana,
Suzana, Mirna, Élcio e Raquel.
A Isaac, Yara, Silvana, Nelson e Edson, pelo suporte no preparo de todo o material
utilizado neste trabalho.
Ao grupo de pesquisadores e técnicos dos demais Departamentos, que permitiram a
utilização de certos espaços e equipamentos, que contribuíram para a realização deste
trabalho.
Enfim, a todos os que fazem o Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – FIOCRUZ.
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICO ii RESUMO iii
INTRODUÇÃO 1
REVISÃO DA LITERATURA 2 1. Yersinia enterocolitica 2 1.1 Mecanismo de infecção 2 1.2 Fatores de virulência 3 1.3 Proteínas efetoras: Yops 4 1.4 Chaperones: Sycs 5 2. EPEC (Escherichia coli enteropatogênica 6 2.1 Mecanismo de infecção 6 2.2 Fatores de virulência 7 2.3 Proteínas de virulência: Esps 7 3. Aparato secretório tipo III 8 4. Operon araBAD 10 5. Construção dos plasmídios utilizados neste trabalho 12 JUSTIFICATIVA 12 OBJETIVO GERAL 13 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 13 MATERIAIS E MÉTODOS 14 Linhagens bacterianas, plasmídios e meios de cultura 14 Composição do MGM 15 Transformação das bactérias Escherichia coli TG2 15 Eletrotransformação das bactérias EPEC 16 Expressão da proteína SycH nas bactérias E. coli TG2 em meio glicerol mínimo 16 Indução do gene que codifica para a proteína YopH nas bactérias E. coli e EPEC em meio LB
17
Indução dos genes yopH e sycH na bactéria EPEC cotransformada, a 37oC e adicionando-se arabinose em diferentes concentrações ao meio LB
17
SDS-PAGE e “WESTERN-BLOT” 18
RESULTADOS 19
1- Expressão da proteína SycH nas bactérias E. coli TG2 em meio MGM 19 2- Expressão de SycH na bactéria EPEC em meio LB 20 3- Expressão da proteína YopH em função da temperatura em bactérias EPEC 21 4- Expressão da proteína YopH em função da temperatura e densidade ótica (DO) em bactérias EPEC
22
5- Co-expressão das proteínas YopH e SycH, na EPEC, em função da temperatura e adicionando-se diferentes concentrações de arabinose ao meio LB
23
DISCUSSÃO 26
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 28
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICO
Figura 1 – Mecanismo de infecção das Yersinias enteropatogênicas 3
Figura 2 – Interação entre as proteínas YopH e SycH 5
Figura 3 – Esquema dos sistemas de secreção tipo I, II e III 9
Figura 4 – Regução do “operon” ara 11
Figura 5 – Plasmídio pBAD18Kan 14
Figura 6 – Expressão de SycH na bactéria E. coli TG2 em MGM 19
Figura 7 – Expressão de SycH na bactéria EPEC em LB 20
Figura 8 – Expressão de YopH na EPEC em função da temperatura em LB 21
Figura 9 – Expressão de YopH na EPEC em função da temperatura e DO em LB 23
Figura 10 – Expressão de YopH e SycH em EPEC c adição de arabinose 25
Figura 11 – Efeito da adição do açúcar arabinose na expressão de YopH 25
Gráfico – Curva de crescimento da EPEC a 24oC e 37oC 22
LISTA DE ABREVIAÇÕES
Yop – “Yersinia Outer Protein”
Syc – “Specific Yop Chaperone”
pYV – “Yersinia Virulon Plasmid”
EPEC – “Escherichia coli enteropatogênica”
Esps – “EPEC-Secreted Proteins”
Ces – “Chaperone for E. coli secretion”
TTSS – “Type Three Secretion System”
DO – Densidade Ótica
SDS-PAGE – Gel de poliacrilamida em condições desnaturantes
PBAD – Promotor do operador araBAD
PC – Promotor do gene araC
RESUMO
Várias bactérias Gram-negativas como a Yersinia enterocolitica e Escherichia coli
enteropatogênica (EPEC), são capazes de atravessar o epitélio intestinal e translocar
proteínas citotóxicas para o interior de células eucarióticas, utilizando o aparato secretório
tipo III (TTSS). Em Y. enterocolitica, essas proteínas são conhecidas por Yops, que
necessitam de chaperones, as Sycs, para serem secretadas e translocadas para o interior de
macrófagos. Em estudos anteriores, foram realizadas as amplificações dos genes que
codificam para as proteínas SycH e YopH de Y. enterocolitica, e suas respectivas clonagens
nos plasmídios da série pBAD e no plasmídio pTZ18R. Neste trabalho, foi realizada a
expressão destas proteínas em bactérias EPEC e Escherichia coli TG2. A EPEC foi
utilizada por codificar para TTSS, e visando um posterior estudo da conservação deste
sistema de secreção e translocação de proteínas de virulência entre estas diferentes
bactérias. A expressão de SycH pôde ser obtida tanto no meio glicerol mínimo quanto no
meio LB, sob o controle do promotor PBAD, onde a arabinose estimula a transcrição e a
glicose reprime. Também foi observada a expressão de YopH sob o controle do seu próprio
promotor, que se mostrou regulado pela temperatura e fase de crescimento. A co-expressão
das proteínas SycH e YopH revelou que a adição de arabinose, que leva a expressão de
SycH, provoca a redução de YopH, o que permanece não esclarecido. A otimização das
condições de expressão e secreção destas proteínas é importante, uma vez que a utilização
deste sistema na secreção de proteínas heterólogas fusionadas a YopH, a exemplo de
antígenos de outros organismos, pode ser empregada no desenvolvimento de vacinas.
INTRODUÇÃO
Como parte de sua patogênese, várias bactérias Gram-negativas utilizam um sistema de secreção tipo
III (TTSS de “Type Three Secretion System”) para translocar efetores protéicos diretamente no citosol de
células eucarióticas do organismo hospedeiro (24). Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Yersinia
enterocolitica utilizam este mecanismo para injetar proteínas citotóxicas para o interior de macrófagos e
leucócitos polimorfonucleares, como mecanismo de defesa contra a resposta imune.
Y. enterocolitica expressa uma classe de proteínas conhecidas por Yops (“Yersinia outer proteins”),
que para serem secretadas para o interior de macrófagos necessitam de chaperones individuais chamadas Sycs
(“Specific Yop Chaperone”), que previnem a degradação das Yops, além de guiá-las de seu local de síntese
até a maquinaria de secreção (15). Estas chaperones também são capazes de se ligar a proteínas de fusão,
como foi comprovada com a ligação da SycH e fosfatase alcalina de E. coli, contanto que na região amino-
terminal da mesma estivessem fusionados pelo menos os primeiros 69 aminoácidos da região amino-terminal
da YopH (44).
Outros microrganismos patógenos Gram-negativos, que codificam para TTSS, são capazes de
secretar proteínas Yops de Y. enterocolitica, mostrando que há uma conservação funcional deste sistema. Foi
observada a secreção de YopE na presença da chaperone SycE, em Salmonellae typhimurium, que possui o
locus inv/spa que codifica para TTSS. Não houve secreção da YopE quando uma parte essencial do gene sycE
foi removida ou quando foi introduzida uma mutação no gene inv/spa (35). Isto sugere que a EPEC, que
utiliza este mecanismo de secreção, seria capaz de secretar Yops, na presença da Syc correspondente.
Bactérias dotadas de TTSS foram propostas como carreadoras vivas para vacinas de uso oral, pois
possuem a capacidade de injetar antígenos para dentro de células do sistema imune do hospedeiro vertebrado.
A construção de proteínas heterólogas, a exemplo de antígenos de Leishmania brasiliensis fusionados à YopH
(22), poderia potencializar a resposta imune celular associada com a proteção contra este parasita.
REVISÃO DA LITERATURA
1. Yersinia enterocolitica
1.1. Mecanismo de infecção
Yersinia sp. são bacilos Gram-negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae. Baseado em
características bioquímicas diferentes, 11 espécies tem sido identificadas, das quais apenas 3 são patógenos
humanos: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica.
A infecção por Y. enterocolitica ocorre através da ingestão de água ou comida contaminada, a
exemplo da carne de porco (15). Uma vez ingerida, esta bactéria adere ao muco intestinal e às células
intestinais, produzindo uma enterotoxina que provoca diarréia. A Y. enterocolitica é capaz de atravessar o
epitélio intestinal, através das células M, e se proliferar nos agregados linfóides do intestino, conhecidos como
placas de Peyer. Isso leva a uma infiltração de monócitos, que se maturam em macrófagos inflamatórios e
iniciam a produção de citocinas como a interleucina-12 (IL-12), interferon gama (IFNγ), e o fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α), auxiliando no desenvolvimento da resposta imune (6). Os macrófagos restringem
severamente o ritmo que a Yersinia se multiplica no tecido hospedeiro, permitindo que o hospedeiro
desenvolva uma resposta imune específica. Entretanto, a Yersinia pode impedir que haja fagocitose,
translocando para o interior dos macrófagos proteínas citotóxicas, chamadas Yops, que suprimem a liberação
normal de interleucinas e levam a apoptose. Uma vez estabelecida nas placas de Peyer, a bactéria pode se
disseminar pelo tecido linfóide e eventualmente para o fígado e baço (4).
Figura 1- Mecanismo de infecção das Yersinias enteropatogênicas.
1.2. Fatores de virulência
As Yersinias patogênicas possuem um plasmídio de virulência de 70Kb, denominado pYV
(“Yersinia Virulon”). Este plasmídio codifica para o virulon Yop e inclui os seguintes fatores protéicos:
proteínas Yops; chaperones correspondentes chamadas Sycs; proteínas Yscs, que constituem o aparato de
secreção tipo III (TTSS); e o ativador transcricional VirF (da família AraC), que controla a transcrição da
maioria dos genes envolvidos na síntese e secreção das Yops (20). Este aparato está envolvido na resistência
contra a fagocitose por macrófagos e neutrófilos polimorfonucleares (PMNs), o que induz a morte celular
programada em macrófagos e inibe a liberação de citocinas (7). Nas populações de Yersina que possuem este
plasmídio, apenas 35% das bactérias são fagocitadas, contra 95% das que não possuem o plasmídio. O sinal
fisiopatológico para a secreção das Yops é a aderência à membrana do fagócito, mas in vitro, a síntese de
Yops é controlada pela temperatura, 37oC, e ausência de íons Ca2 (20).
1.3. Proteínas-efetoras: Yops
A maioria das proteínas Yops (“Yersinia Outer Proteins”) pode ser classificada funcionalmente em
Yops translocadoras e Yops moduladoras. As Yops translocadoras (YopB, YopD e LcrV) formam um poro na
membrana da célula eucariótica, através do qual as Yops efetoras (YopE, YopH, YopP, YopO, YopT e
YopM) penetram no citosol da célula hospedeira. Já as proteínas YopN e YopK exercem uma função de
controle do sistema de secreção, controlando a translocação. Após a penetração, YopH inibe a fagocitose bem
como os mecanismos de opsonização dependentes dos receptores do complemento e receptores para a fração
Fc das imunoglobulinas. As proteínas YopE, YopO e YopT alteram o citoesqueleto e a YopP induz apoptose.
Assim, a secreção é polarizada: as proteínas não são meramente secretadas para o meio extracelular, mas
translocadas para o interior dos macrófagos (15, 17).
Um domínio importante para a translocação das Yops é a região amino terminal, com no mínimo 15
resíduos de aminoácidos , onde também se ligam as “chaperones”, o que sugere que as Sycs desempenham
um papel não apenas na secreção, mas também na translocação das Yops para a célula hospedeira (2, 3, 37,
44). Foi sugerido que o sinal para a secreção das Yops poderia estar na região 5’do mRNA e que seria
regulado à nível de tradução, por ter sido verificado que mutações nos genes da YopE e YopN, que alteraram
completamente a seqüência peptídica, não impediu que houvesse secreção destas proteínas (2, 3). Porém, esta
hipótese sobre o sinal do mRNA ainda é contraditória. Em estudo recente, foi demonstrado que a secreção de
YopE ocorre mesmo após os primeiros 11 códons terem sofrido mutação, o que modifica a estrutura do
mRNA mas não a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo formado. Isto sugere que é a região amino
terminal da proteína YopE e não a região 5’do mRNA que serve como sinal de secreção (29). Desta forma, é
bem provável que ambos os sinais podem ocorrer, dependendo da fase da infecção, ou seja,. aquelas Yops que
são requeridas para a formação do poro na célula eucariótica ou as que são componentes estruturais do canal,
necessitam ser secretadas antes das proteínas Yops efetoras, possuindo portanto um sinal no mRNA, enquanto
que as efetoras seriam secretadas mais tardiamente mediadas pelas Sycs (2, 3, 23,33).
1.4. Chaperones: Sycs
A secreção de algumas Yops requer a presença de pequenas “chaperones” (14 a 15 KDa) de
uma família chamada de proteínas Syc (“Specific Yop Chaperone”) (44). Estas são proteínas ácidas (pI 4,4 a
5,2) com pouca ou nenhuma seqüência similar entre elas, mas com uma alfa-hélice anfifílica carboxi-terminal
em comum. As Sycs se ligam às Yops específicas, e na ausência delas a secreção de Yop é severamente
reduzida, se não interrompida. Em geral, as proteínas Sycs são codificadas por genes adjacentes aos das
proteínas Yops correspondentes, porém cada uma controlada pelo seu próprio promotor. A função exata das
proteínas Sycs permanece misteriosa. Foi demonstrado que a secreção de YopE depende da presença tanto da
chaperone SycE quanto do sistema de secreção tipo III (35). A análise da estrutura cristalizada do domínio de
ligação da YopE com a sua chaperone específica SycE, revelou uma conservação estereoquímica, apesar da
ausência de similaridade da seqüência, indicativo de um modo universal de interação entre chaperones e
efetores (5). Acredita-se que essas “chaperones” previnem a degradação das Yops, além de guia-las de seu
local de síntese até a maquinaria de secreção (16). Sendo assim, a secreção das Yops provavelmente não
envolveria o reconhecimento de uma seqüência comum no terminal amino, que pode ser compensada pela
existência de chaperones individuais. Então, a seqüência da proteína Syc envolveria pelo menos dois
domínios adjacentes: um domínio variável, envolvendo o reconhecimento da Yop, e um constante, requerido
para a interação específica com o aparato secretório (44).
Figura 2: Modelo proposto para a secreção de YopH, na presença da SycH, pela maquinaria de
secreção tipo III.
Foi observado em cepas de Y. enterocolitica mutantes deficientes em SycH, que estas bactérias
secretam todas as Yops, exceto a YopH. Ao mesmo tempo, tais bactérias contêm em seu citoplasma uma
quantidade bem maior de YopH que a cepa selvagem. Portanto, a mutação no gene da SycH bloqueia
especificamente a secreção da YopH, que se acumula no citoplasma da bactéria (44). Entretanto, em outro
estudo realizado com cepas mutantes que codificam somente para a proteína YopE, verificou-se que esta é
yop mRNA
Syc
Yop
Receptor
Yop
translocada mesmo na ausência da SycE, sugestivo de que a “chaperone” só é necessária quando a Yop
específica concorre com outras para ser translocada, como se houvesse uma “hierarquia da translocação”. Isso
está de acordo com a observação de que nem todas as Yops possuem Sycs correspondentes (10).
2. EPEC (Escherichia coli enteropatogênica)
2.1. Mecanismo de infecção
A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) pertence a uma família de organismos patógenos
conhecidos por causar uma lesão denominada A/E (“Attaching and Effacing” lesion), incluindo a E. coli
enterohemorrágica (EHEC) e vários patógenos que causam doenças em animais (p. ex., REPEC em coelhos e
PEPEC em porcos) (13). Estes organismos causam um desarranjo do citoesqueleto da célula hospedeira,
formam ‘um pedestal com células epiteliais, e codificam proteínas conservadas que mediam estes efeitos. As
lesões A/E são caracterizadas pela dissolução da borda intestinal e perda da microvilosidade intestinal no
local onde a bactéria aderiu. A associação de diarréia com EPEC tem sido atribuída a perda da superfície
absortiva devido a perda da microvilosidade das células epiteliais (25). A ativa secreção de íons também está
envolvida no desenvolvimento de doenças diarréicas infecciosas (36). Estudos recentes demonstram que a
EPEC causa uma despolarização significante em culturas de células epiteliais HeLa e Caco-2, alterando a
distribuição de íons através da membrana celular, o que estaria envolvido na perda de fluido e diarréia (40). O
decréscimo da resistência elétrica transepitelial também seria devido a fosforilação da cadeia de miosina, que
leva a um desarranjo na citoaquitetura da célula (31).
2.2. Fatores de virulência
O desenvolvimento da lesão provocada pela EPEC tem sido dividido em três estágios. O primeiro
estágio é caracterizado pela ligação da EPEC a superfície da célula epitelial numa região denominada LA
(“adesão localizada”), que é associada com a produção de uma fímbria tipo IV conhecida por BFP (“Bundle-
Forming Pili”). Durante o secundo estágio, um grupo de proteínas secretadas pela EPEC (Esps), ativam um
sinal que leva a desarranjos no citoesqueleto da célula hospedeira. Finalmente, durante o terceiro estágio, uma
proteína de membrana externa conhecida por “intimin” permite a EPEC ligar-se intimamente a membrana da
célula hospedeira em interação com o receptor de “intimin” chamado Tir, uma proteína que é secretada pela
bactéria e inserida na membrana da célula eucariótica do organismo hospedeiro (13).
EPEC possui um plasmídio de 69Kb que codifica para BFP, necessária para a aderência inicial entre
a bactéria e a célula eucariótica, e o locus Per, que regula a expressão dos fatores de virulência da EPEC. Os
fatores de virulência da EPEC são codificados numa região do DNA cromossomal chamada LEE (“Locus for
enterocyte effacement”). A região LEE por sua vez pode ser subdividida em três regiões funcionais: uma
codifica para o sistema de secreção tipo III; outra é necessária para a adesão com a célula eucariótica (codifica
Tir e Intimin), e por fim a que codifica para os efetores protéicos que são secretados (Esps) e suas chaperones
chamadas Ces (“Chaperone for E. coli secretion”) (41).
2.3. Proteínas efetoras: Esps
As proteínas Esps estão envolvidas com o desarranjo do citoesqueleto das células eucarióticas e com
a resposta antifagocítica (17). Como outros efetores tipo III de bactérias patogênicas, as Esps possuem um
sinal na região amino-terminal que requer uma chaperone para a secreção apropriada (25, 43). EspA é uma
proteína secretada com um peso molecular de 25 Kda. Foi proposto que esta estrutura serve como um sistema
de liberação para outras Esps e Tir, pois mutantes do gene da EspA não conseguem liberar estas moléculas no
interior das células hospedeiras (26). EspA não parece ser injetada dentro da célula hospedeira. Estes
filamentos promovem uma primeira etapa no contato entre a célula bacteriana e a célula hospedeira. Portanto,
o papel da EspA é crítico para a virulência, pois mutações no gene espA tornam a EPEC avirulenta (1). Já a
EspB é translocada diretamente para o interior da célula hospedeira. Linhagens com mutação do gene espB
são incapazes de ativar sinais nas células hospedeiras, como o desarranjo do citoesqueleto, ou de produzir as
lesões A/E. (26, 46). EspD, de 40 KDa, é inserida dentro da membrana da célula hospedeira, mas
aparentemente não é translocada para dentro do citoplasma. Por analogia com a proteína YopB de Yersinia, a
EspD parece ser parte do aparato de translocação da EPEC (42). Outra proteína Esp secretada é a EspF,
identificada em 1998 (33). Não foi observado papel in vitro para esta proteína, o que não exclui a
possibilidade de que exerça alguma função in vivo. A maior proteína Esp é a EspC, que possui 110 KDa,
secretada mesmo em linhagens com mutação no sistema de secreção tipo III, o que sugere que esta proteína
também media sua própria secreção utilizando um mecanismo de autotransporte (39). Assim como ocorre no
sistema de secreção tipo III de Y. enterocolitica, a secreção das Esps requerem chaperones individuais para
serem secretadas de maneira eficiente, codificadas na região LEE do cromossomo bacteriano. Por exemplo, a
chaperone para EspD, CesD (chaperone for E. coli secretion D), já foi descrita. Foi observado num estudo que
a mutação no gene que codifica para CesD aboliu a secreção de EspD e reduziu a de EspB, mas teve pouco
efeito na quantidade de EspA secretada (43).
3. Aparato secretório tipo III
O sistema de secreção tipo III (TTSS) permite a liberação de proteínas efetoras da célula bacteriana
diretamente para o citosol da célula eucariótica (20). Os componentes responsáveis pela secreção de proteínas
através do envelope da célula bacteriana são geralmente conservados em todos sistemas de secreção do tipo
III, portanto proteínas de uma bactéria podem ser exportadas por outra dotada do mesmo mecanismo de
secreção. Entretanto, as proteínas secretadas através da parede da célula bacteriana variam de sistema para
sistema. Em Yersinia, elas são conhecidas por Yops, de “Yersinia outer-proteins”; em Shigella flexneri são as
Ipas, de “Invasion plasmid antigens”; e em Salmonella Sips e Sops, de “Salmonella inner proteins” e
“Salmonella outer-membrane proteins”, respectivamente (35). Em EPEC, as proteínas conhecidas por serem
exportadas pelo sistema de secreção tipo III são chamadas de Esps, como já foi dito acima.
Revisando rapidamente os tipo I e II, o sistema de secreção tipo I utiliza três proteínas, uma de
membrana interna (proteína transportadora ABC), uma periplasmática (ligada à membrana interna, mas
localizada no espaço periplasmático) e uma de membrana externa (em geral, a proteína TolC) (23). O
mecanismo tipo II é o mais semelhante ao das células eucarióticas. As proteínas são transportadas em duas
etapas: primeiro elas são secretadas para o periplasma e, numa segunda etapa, para fora da célula. No aparato
de secreção tipo III não há fase periplasmática, como ocorre no tipo II (34), e não há clivagem da proteína
durante o processo de secreção (10).
Figura 3: Esquema dos sistemas de secreção tipo I, II e III. O tipo I utiliza três proteínas, uma de membrana interna e uma de membrana externa. No tipo II as proteínas são transportadas em duas etapas: primeiro elas são secretadas para o periplasma e, numa segunda etapa, para fora da célula. No aparato de secreção tipo III não há fase periplasmática, como ocorre no tipo II, e não há clivagem da proteína durante o processo de secreção. Fonte: Hueck, 1998 (24).
O sistema de secreção do tipo III é denominado de “contato-dependente”, pois depende do contato
entre a célula bacteriana e a célula eucariótica. Em Yersinia, 29 genes ysc já foram identificados dentro de um
loci contíguo. Quatro proteínas, LcrD, YscD, YscR, e YscU, preenchem o interior da membrana, enquanto
YscC é uma proteína de membrana externa que pertence a família das secretinas, um grupo de proteínas
envolvidas no transporte de várias macromoléculas e filamentos através da membrana externa (27). A
lipoproteína VirG é requerida para uma eficiente ligação da YscC com a membrana externa, onde este
complexo forma um poro estrutural com um diâmetro externo de cerca de 200 Å e um poro central de 50 Å
(25). YscN contém um domínio de ligação ao ATP que provavelmente gera energia para a secreção de Yops
(45). Quatro proteínas Yscs são secretadas: YopR, codificada pelo gene yscH, YscO, YscP e YscM/’LcrQ.
Estas proteínas estão geralmente envolvidas no controle da síntese e secreção das Yops (38). As proteínas
Yscs do sistema de secreção tipo III apresentam homologia com componentes do aparato de biossíntese
flagelar de bactérias gram-negativas e gram-positivas (24).
4. Operon araBAD
O gene araC, presente em alguns microrganismos como E. coli., codifica para a proteína AraC,
pertencente à mesma família da proteína VirF de Y. enterocolitica. Esta proteína se liga ao indutor L-
arabinose para ativar a transcrição de três “operons” ou operadores ara. Dois destes estão envolvidos no
transporte de arabinose, e o terceiro, o operador araBAD, codifica enzimas que participam do catabolismo
deste açúcar (8). Todos os três operadores ara possuem sítios de ligação à proteína AraC, que consistem em
seqüências de DNA repetidas em “tandem” de 17 pares de base (pb), além de um sítio de ligação ao CAP.
Quando o complexo CAP-cAMP se liga a este último sítio, ativa os promotores PBAD , promotor do operador
araBAD, e PC , promotor do gene araC., que estão em direções opostas na molécula de DNA. O açúcar
glicose exerce uma ação repressora da transcrição destes promotores por ligar-se ao cAMP, impedindo que
este se ligue ao CAP. A proteína AraC é biologicamente ativa em ambas as formas, ligada ou não ao açúcar
arabinose. Na presença de arabinose, a proteína AraC altera sua conformação estrutural para um estado
ativador e se liga à seqüência araI dentro do promotor PBAD, promovendo a transcrição deste promotor (27).
Desta maneira, a proteína regulatória AraC reconhece o substrato indutor e inicia a síntese das proteínas
requeridas. Na ausência do indutor arabinose, a transcrição do promotor PBAD é reprimida pela ligação da
proteína AraC a uma região distante e de baixa afinidade do DNA, chamada operador araO2 (13). Foi
proposto que a repressão requer uma associação entre moléculas AraC com os operadores araO2 e araI,
separados por 210 pares de bases, que forma um “loop” no DNA (31). A habilidade de unir estes operadores é
perdida quando a proteína AraC se liga ao açúcar arabinose. Neste estado ativador, a proteína AraC se liga ao
sítio araI desfazendo o “loop” do DNA, o que facilita a transcrição do promotor PBAD. Esta interação também
produz uma autoregulação negativa do promotor Pc do gene araC que resulta da ocupação de araO2 e araO1,
separados por 170 pares de bases. Deste modo, parece que a atividade de promotores ara é regulada pela
ocupação da proteína AraC em determinados sítios do DNA (21).
Figura 4: Regulação do “operon” ara. (a) Quando a proteína AraC está ausente, o gene araC é transcrito por seu próprio promotor. (b) Quando os níveis de arabinose estão baixos, a proteína AraC se liga a ambos os sítios araI e araO2 e forma um “loop” no DNA aproximando estes sítios. A transcrição do promotor PBAD é reprimida neste estado. A proteína AraC também se liga a araO1, reprimindo ainda mais a síntese de AraC. (c) Quando o açúcar arabinose está presente, a proteína AraC se liga a este açúcar, o que altera a conformação estrutural da proteína para um estado ativador. O “loop” do DNA é aberto, e a proteína AraC atua em conjunto com CAP-cAMP para facilitar a transcrição. Fonte: LEHNINGER, A. L., NELSON, D. L., COX, M. COX. Principles of Biochemistry. 1993. 1013. 5. Construção dos plasmídios utilizados neste trabalho
Este trabalho é a continuidade do projeto que foi iniciado em 2000 pela aluna de
iniciação científica Mariana de Lacerda Guerra (19), cujos resultados incluem a realização
da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) do gene que codifica para a proteína SycH de Y.
enterocolitica, sem a região promotora deste gene. Para isso foram sintetizados dois
oligonucleotídeos: o primer 3116 (5’), contendo o sítio da enzima XbaI, situa-se
imediatamente antes da seqüência SD (“Shine-Dalgarno”) de ligação ao ribossomo e o
primer 3117 (3’), contendo o sítio da enzima PstI, situa-se após a seqüência codificadora.
Foi obtido então o fragmento 3116/3117, que corresponde ao gene sych sem o promotor.
Este fragmento foi clonado no plasmídio pGEM3zf+ e em seguida realizado o
sequenciamento automático no laboratório de Bioquímica da Universidade de Cambridge,
Inglaterra, que confirmou que este fragmento codifica para a proteína SycH. Para os
ensaios de expressão da proteína SycH, o gene sycH sem a seqüência promotora foi
subclonado nos plasmídios pBAD18Kn e pBAD33Cm, que conferem resistência à
Kanamicina e à cloranfenicol, respectivamente, estando sob o controle do promotor PBAD
presente nestes plasmídios (29).
JUSTIFICATIVA
A expressão e secreção de proteínas pela Y. enterocolitica ainda é um assunto pouco conhecido.
Tendo em vista o interesse do grupo em utilizar estas bactérias como vetores para a secreção de antígenos de
outros organismos, é essencial entender melhor como esse processo ocorre. Para isso, a proposta deste
trabalho é definir quais as melhores condições para a expressão das proteínas SycH e YopH em bactérias E.
coli TG2 e EPEC. Utilizou-se a bactéria EPEC para a expressão destas proteínas de Y. enterocolitica, com a
finalidade de estudar posteriormente se há conservação funcional do sistema de secreção tipo III (TTSS)
codificado por estas bactérias.
OBJETIVO GERAL
O objetivo geral consiste em colaborar para o melhor entendimento dos mecanismos
envolvidos com a regulação transcricional da proteína YopH e regulação do promotor PBAD
dos plasmídios da série pBAD, onde está subclonado o gene sycH. Posteriormente
pretende-se secretar proteínas heterólogas fusionadas à YopH na presença da chaperone
SycH, por exemplo antígenos de Leishmania brasiliensis, no intuito de gerar novas vacinas
contra patógenos humanos, além de verificar se EPEC é capaz de secretar proteínas de Y.
enterocolitica utilizando a maquinaria de secreção tipo III compartilhada por estes
patógenos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Diante destes objetivos gerais, a proposta deste trabalho é definir quais as melhores
condições de expressão das proteínas YopH e SycH, ambas de Yersinia enterocolitica, em
bactérias Escherichia coli TG2 e EPEC. Para tanto, foram definidos os seguintes objetivos:
1- Expressar a proteína YopH, cujo gene está clonado no plasmídeo pTZ18R, sob o controle do seu
próprio promotor e regulado pela temperatura e fase de crescimento.
2- Expressar a proteína SycH, cujo gene sem a região promotora está subclonado nos plasmídios da
série pBAD, sob o controle do promotor PBAD.
3- Analisar a expressão simultânea de ambas as proteínas na mesma bactéria.
MATERIAIS E MÉTODOS
Linhagens bacterianas, plasmídios e meios de cultura
As bactérias utilizadas foram a Escherichi coli TG2 e EPEC (Escherichia coli
enteropatogênica). O plasmídio pTZ18R/yopH que confere resistência ao antibiótico
Ampicilina, contendo o inserto do gene yopH, foi obtido durante tese de Mestrado de
Suzana Costa (12). Já os plasmídios pBAD18Kan/sycH e pBAD33Cm/sycH, que conferem
resistência aos antibióticos Kanamicina e Cloranfenicol, respectivamente (30), que contém
o gene sycH sem a região promotora, foi subclonado pela aluna de iniciação científica
Mariana de Lacerda Guerra (19).
Figura 5: Plasmídeo pBAD18Kan. Este é um dos plasmídios da série pBAD no qual foi subclonado o gene da sycH sem a região promotora no sítio MCS2, sob o controle do promotor PBAD.. O mesmo confere resistência a kanamicina e tem origem de replicação derivada do pBR322. Fonte: Guzman, 1995 (30).
As bactérias cresceram em meio de cultura LB (“Luria Bertani”) e MGM (Meio
Glicerol Mínimo), suplementados com antibióticos nas seguintes concentrações:
Ampicilina (Amp) 100 µg/ml; Cloranfenicol (Cm) 30 µg/ml; Kanamicina (Kan) 20 µg/ml.
Composição do MGM
Para o preparo de cada litro do meio M63 cinco vezes concentrado adicionou-se 10g
de (NH4)2SO4, 68 g de KH2PO4 e 2,5 mg de FeSO4.7H2O com o pH ajustado para 7,0 com
KOH. A partir desta solução concentrada, foi feita a diluição para a concentração de uso
com água estéril e adicionando-se as seguintes soluções, também estéreis e para um volume
final de um litro: 1ml de 1M de MgSO4.7H2O; 10 ml de fonte de carbono a 20% (açúcar ou
glicerol); e se for requerido: 0,1 ml de vitamina B1 (Tiamina) a 0,5%; 5 ml de aminoácidos
caseína ou aminoácidos L a 20% para 10 µg/ml ou aminoácidos DL para 80 µg/ml e
Antibiótico.
Transformação das bactérias Escherichia coli TG2
Essas bactérias foram transformadas com os plasmídios pBAD18Kan/sycH, que confere resistência
ao antibiótico Kanamicina, e pTZ18R/yopH, que confere resistência a Ampicilina, seguindo o protocolo
abaixo:
Adicionaram-se 5 µl do DNA para 20 µl de tampão de transformação (MgCl2 5M e Tris-Cl pH 7.4
5M), seguido de 50 µl de células competentes preparadas com cloreto de cálcio 100mM/glicerol a 15%. Após
homogeneizar brevemente foi deixado no gelo por 30 minutos. A seguir, colocou-se em banho-maria a 37oC
por 5 minutos, resfriado brevemente e semeado em meio LB sólido acrescido do antibiótico nas
concentrações que já foram especificadas. Caso o antibiótico não seja Ampicilina, existe uma etapa adicional,
que consiste em, passados os 5 minutos no banho-maria, adiciona-se 0,4 ml de LB, homogeneíza e incuba o
tubo por mais 1 hora a 37oC, para só então semear
Eletrotransformação das bactérias EPEC
Esta linhagem também foi transformada com os plasmídios citados acima, com a diferença de que a
transformação foi por eletroporação segundo Conchas & Carniel (9), descrito a seguir:
As cuvetas de 0,2 cm e o recipiente para eletroporação do aparelho “E. coli PulserTM Transformation
Apparatus” da BIORAD, foram colocadas no gelo com 30 minutos de antecedência. Foram adicionados 40 µl
de células eletrocompetentes, preparadas com sacarose 272mM/glicerol a 15%, na cuveta e em seguida 5 µl
do plasmídio. A mistura foi resfriada por um minuto no gelo e as células foram então sujeitas a um único
pulso elétrico de 2,5 kv/cm. Após a descarga elétrica, adicionou-se rapidamente 1 ml de SOC (2% Bacto-
Tryptone/0,5% Bacto yeast extract/10mM NaCl/2,5mM KCl/10mM MgCl2/10mM MgSO4/20mM Gicose) às
cuvetas, e as células foram então transferida para um eppendorf e incubada a 28oC com agitação suave de 225
rpm no “Blood Tube Rotator” por 2 horas. Em seguida, fez-se o semeio em meio suplementado com o(s)
antibiótico(s).
Expressão da proteína SycH nas bactérias E. coli TG2 em meio glicerol mínimo
As bactérias E. coli TG2 cresceram no “Shaker” a 37oC durante a noite em 3ml de meio glicerol mínimo
(MGM), acrescido de 0,2% de glicose. No dia seguinte foram transferidos 100 µl para 5ml do mesmo meio. O
crescimento bacteriano foi monitorado até atingir uma DO (densidade ótica) de 0,4 (comprimento de onda
600 nm). A cultura foi então centrifugada e lavada uma vez com meio glicerol-mínimo acrescido de 0,05% de
arabinose e o sedimento ressuspendido neste meio. Coletou-se o tempo zero, onde 200 µl da cultura foram
centrifugados e o sedimento ressuspendido em 100 µl de tampão de amostra para gel de proteína. A partir
desta etapa foram coletadas com 24 e 48 horas de indução.
Para a expressão da proteína SycH nas bactérias EPEC em meio LB, a metodologia empregada é a
mesma da indução em meio MGM, com diferença de que após a bactéria atingir a DO 0,4, retirou-se a
primeira amostra como controle, e foi adicionado o açúcar arabinose na concentração 0,05% e o açúcar
glicose na concentração 0,2% como controle negativo. As amostras seguintes foram coletadas com 1 e 2 horas
de indução.
Indução do gene que codifica para a proteína YopH nas bactérias E. coli TG2 e EPEC em meio LB
Foi realizada a indução do gene YopH no plasmídeo pTZ18R, cuja expressão é regulada através da
temperatura, a 37OC, em bactérias Escherichia coli e EPEC. As bactérias cresceram a 24oC, e no dia seguinte
foram diluídas para uma DO final de 0,4. As colônias foram colocadas na temperatura de 37oC, e um grupo
controle permaneceu a 24oC. As amostras foram então coletadas a cada uma hora até completar 5 horas de
indução.
Em outro experimento, realizou-se a indução do gene yopH comparando a expressão desta proteína a
24oC e a 37oC numa mesma DO. Para isso, o crescimento bacteriano foi monitorado até completar 20 horas
de indução.
Indução dos genes yopH e sycH na bactéria EPEC cotransformada, a 37oC e adicionando-se arabinose em diferentes concentrações ao meio LB
Diluiu-se o pré-inóculo em meio LB para uma DO de 0,05 e então a cultura foi colocada no “Shaker”
para crescer a 37oC. Após atingir uma densidade ótica de 0,4/0,5; retirou-se a primeira alíquota como
controle, e então foi adicionado o açúcar arabinose em diferentes concentrações: 0,02%, 0,2% e 2%. Foram
mantidos dois tubos controles, um onde não se adicionou arabinose e outro que continha bactérias EPEC com
apenas o plasmídio pTZ18R/yopH. Foram coletadas alíquotas a cada uma hora, até completar quatro horas.
SDS-PAGE e “WESTERN-BLOT”
As amostras obtidas foram separadas em gel SDS-PAGE 15%, coradas com Azul de Comassie e
submetidas a uma solução descorante (25% de metanol, 7% de ácido acético e H2O). Para o “Western-blot”,
as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Hybond C – Amersham Pharmacia
Biotech), em sistema semi-seco. A membrana foi então neutralizada com uma solução de TBS (solução salina
tamponada com Tris) acrescida de 2% de leite e Tween 20 a 1%, durante a noite. Após esta etapa, a
membrana foi lavada três vezes com PBS puro e incubada por 2 horas com o anticorpo contra a proteína
YopH (soro anti-YopH obtido de coelhos, no CPqAM, por Bruno Leal A. da Silva), diluído 1:15000 em
TBS/leite 1%/Tween 20 a 1%. A membrana foi então submetida a uma nova lavagem e incubada, por uma
hora e meia, com o segundo anticorpo anti-IgG de coelho conjugado à peroxidase (Jackson Immunoresearch
laboratories INC) diluído 1:5000 em TBS/leite 1%/Tween 20 a 1%, depois lavada com TBS. A revelação foi
realizada por quimioluminescência, adicionando-se a solução de 50 ml de luminol (1,25mM Na-Luminol;
0,1M Tris-HCl, pH 8,5), 0,5 ml de iodofenol (40,9 mM, 9mg/ml; 4-iodofenol; DMSO - dimetilsulfóxido) e
por último 15,3 ml de peróxido de hidrogênio (H2O2).
RESULTADOS
1- Expressão da proteína SycH nas bactérias E. coli TG2 em meio MGM
As bactérias E. coli TG2 foram transformadas com os plasmídios
pBAD18Kan/sycH e pBAD33Cm/sycH, para se analisar a expressão da proteína SycH sob
o controle do promotor PBAD, em meio glicerol mínimo (MGM) suplementado com os
antibióticos kanamicina e cloranfenicol, respectivamente. Este meio de cultura foi
escolhido por tratar-se de um meio pobre em glicose, pois este açúcar exerce um estímulo
repressor sobre o promotor PBAD. Entretanto, na presença de arabinose, este promotor é
estimulado e ocorre a transcrição do gene sycH. Seguindo estes preceitos, realizamos um
experimento em que culturas de E. coli TG2 transformadas com os plasmídios citados
acima cresceram em MGM desprovido de arabinose até atingir a DO de 0,4. A partir daí,
foi adicionado o açúcar arabinose na concentração de 0,05%, e após 24 horas de
crescimento bacteriano a 37oC, observou-se em gel de poliacrilamida a 20% o surgimento
de uma banda entre os marcadores 14 e 20 KDa, correspondente ao tamanho da proteína
M C 24h 48h C 24h 48h946746302014
pBAD18Kn/sycH pBAD33Cm/sycHM C 24h 48h C 24h 48h
946746302014
E. coli
M C 24h 48h C 24h 48h946746302014
pBAD18Kn/sycH pBAD33Cm/sycHM C 24h 48h C 24h 48h
946746302014
E. coli
SycH (19 KDa), tanto no transformante que contém o plasmídio pBAD18Kan/sycH quanto
no que contém o pBAD33Cm/sycH.
Figura 6: Gel SDS-PAGE mostrando a síntese da proteína SycH (seta) em células de E.
coli TG2 transformadas com os plasmídeos pBAD18Kan/sycH e pBAD33Cm/sycH. A letra C indica as culturas de bactérias que foram crescidas em meio MGM desprovido de arabinose até atingir a DO de 0,4. A partir desta DO foi adicionado ao meio o açúcar arabinose na concentração de 0,05%. Alíquotas foram coletadas com 24 e 48 horas, ressuspendidas em tampão de amostra para SDS-PAGE e analisadas em gel a 20%. As setas indicam a banda presumida da proteína SycH (19 KDa). À esquerda da figura estão assinalados em kDa os pesos dos marcadores moleculares.
2- Expressão de SycH na bactéria EPEC em meio LB
A bactéria EPEC foi transformada com o plasmídio pBAD18Kan/sycH, para
verificar se estas bactérias são capazes de expressar SycH. A EPEC é dotada de maquinaria
de secreção tipo III, daí o interesse em se trabalhar com estas bactérias, para que no futuro
possa se analisar a secreção de YopH na presença de SycH através deste sistema de
secreção. Esta expressão foi realizada em meio LB, no intuito de verificar se a expressão de
SycH é possível neste meio, após a adição do indutor arabinose a 0,05% e adicionando-se
também o repressor glicose a 0,2%, como controle negativo, ao meio LB. O interesse de se
utilizar o meio LB é porque o crescimento bacteriano é mais rápido neste meio em
comparação com o MGM, o que encurta o tempo necessário para a expressão protéica.
Apesar da glicose ser um fator de repressão do promotor PBAD e o meio LB conter este
açúcar, observou-se a expressão da SycH após 1 hora e 2 horas de indução a 37oC em meio
LB acrescido do indutor arabinose na concentração de 0,05%.
M C A G G A
1 h 2 h
EPEC + pBAD18Kan/ sycH
9467
46
30
20
14
Figura 7: Expressão de SycH em células EPEC transformadas com o plasmídeo pBAD18Kan/sycH e analisadas em gel SDS-PAGE de 20%. A letra C indica as culturas desta bactéria que cresceram em meio LB desprovido de arabinose até atingir a DO de 0,4 a 37oC. A seta indica a banda induzida após a adição de arabinose a 0,05%, entre os marcadores de peso molecular 20 e 14 KDa, correspondente ao tamanho da SycH, após 1h e 2 horas de indução, indicada pela letra A. A letra G indica a cultura onde foi adicionado o açúcar glicose a 0,2%, como controle negativo. À esquerda da figura estão assinalados em kDa os pesos dos marcadores moleculares.
3- Expressão da proteína YopH em função da temperatura em bactérias EPEC
Tendo já sido realizada a expressão da chaperone SycH em MGM e meio LB,
partimos para a expressão da proteína YopH correspondente na bactéria EPEC em meio
LB. A expressão de YopH é controlada por seu próprio promotor, regulado pela
temperatura. Estas bactérias foram transformadas com o plasmídio pTZ18R/yopH por
eletroporação, e então foi realizada a indução do gene da YopH na temperatura de 37oC.
Bactérias contendo apenas o plasmídio pTZ18R, como controle negativo, e o
pTZ18R/yopH, cresceram a 24°C, até atingir uma DO de 0,4 e foram em seguida
transferidos para 37°C. Pôde ser observado em SDS-PAGE 15% e confirmado por
Western-Blot, que a YopH apresenta uma expressão basal a 24oC mas que, após 2 horas de
indução a 37°C, já ocorre um aumento da intensidade da banda correspondente ao tamanho
da YopH (51 KDa), indicando que a expressão desta proteína é regulada pela temperatura .
Figura 8: (A) Gel SDS-PAGE 15% mostrando a síntese da proteína YopH entre os marcadores de peso molecular 67 e 46 (seta) em células EPEC transformadas com o plasmídeo pTZ18R/yopH. Do lado esquerdo estão as culturas de EPEC transformadas com o plasmídio pTZ18R sem o gene yopH, como controle negativo. A letra C indica as culturas que cresceram a 24oC até uma DO de 0,4. As culturas foram então colocadas na temperatura de 37oC por até 5 horas, tendo sido coletadas alíquotas a intervalos de tempo regulares. À esquerda da figura estão assinalados em kDa os pesos dos marcadores moleculares. (B) Confirmação da expressão da proteína YopH realizada através do Western-Blot, com soro policlonal de coelho específico contra esta proteína.
4- Expressão da proteína YopH em função da Temperatura e densidade ótica (O.D.) em bactérias EPEC
Neste experimento, realizado para confirmar se a fase de crescimento estava
influenciando a expressão da proteína YopH, foi comparado numa mesma densidade óptica
(DO), a expressão a 24oC e a 37oC. Portanto, se a densidade ótica tiver alguma influência,
ocorrerá o aumento na expressão de YopH a 24oC à medida que a bactéria cresce.
As culturas foram inicialmente diluídas para uma DO de 0,05. A curva de
crescimento revelou que nas primeiras horas de indução, o crescimento da cultura de
bactérias a 37oC é maior do que a 24oC, mas se igualam após 8 horas de indução. A partir
daí, o crescimento a 24oC supera o crescimento a 37oC até completar 20 horas de
experimento.
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
EPEC+pTZ18R/yopH
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
(A) (B)
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
EPEC+pTZ18R
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
(A) (B)
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
EPEC+pTZ18R/yopH
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
(A) (B)
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
M C 2h 3h 4h 5h M C 2h 3h 4h 5h
EPEC+pTZ18R
C 2h 4h 5h
Western-Blot
9467
46
30
20
(A) (B)
Gráfico 1: Curva de crescimento da EPEC transformada com o plasmídio pTZ18R/yopH a 24oC e a 37oC. No eixo das abscissas estão os tempos de coleta das amostras. No eixo das ordenadas estão as densidades óticas das culturas a 24oC e 37oC, correspondentes. No que se refere à indução do gene yopH, observa-se que ocorreu tanto a 37oC
quanto a 24oC, porém no início essa expressão é basal nesta última temperatura. Com o
passar do tempo, a expressão de YopH a 24oC e 37oC vão se igualando, o que indica uma
influência da fase de crescimento na expressão desta proteína, já que a expressão de YopH
a 24oC é estimulada com o aumento da densidade ótica. No final do experimento, a
densidade ótica da cultura a 24oC chega a ser o dobro em relação a da cultura a 37oC,
enquanto que a intensidade da expressão de YopH em ambas as culturas é praticamente a
mesma.
Curva de Crescimento
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
11 13 16 19 7
Tempo (h)
O.D.(600nm)
24°C
37°C
Curva de Crescimento
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 5 8 20
Tempo (h)
O.D.(600nm)
24°C
37°C
Figura 9: (A) Análise comparativa da expressão da YopH em diferentes densidades de crescimento. Acima das figuras estão as densidades óticas e logo abaixo as temperaturas em que cresceram as culturas de EPEC transformadas com o plasmídio pTZ18R/sycH. Observa-se que a 37°C há uma maior expressão da YopH quando comparado a expressão a 24°C. (B) Western-blot, confirmando uma expressão basal de YopH na DO de 0.2 a 24oC. No final do experimento a densidade ótica da cultura a 24oC é o dobro da cultura a 37oC, mas a intensidade das bandas em ambas é praticamente a mesma.
5- Co-expressão das proteínas YopH e SycH na EPEC, em função da temperatura e adicionando-se ao meio LB diferentes concentrações de arabinose
Tendo sido demonstrada a indução da expressão tanto da SycH como da YopH
separadamente nas bactérias EPEC, iniciou-se a tentativa de expressar simultaneamente
ambas as proteínas, para no futuro tentar secretar a YopH na presença de sua chaperone
SycH pela maquinaria de secreção tipo III da EPEC. Para isso foram realizadas as
transformações da EPEC com os plasmídios pTZ18R/yopH e pBAD33Cm/sycH, para em
seguida se tentar a expressão das duas proteínas. Houve a preocupação de se utilizar dois
DO= | 0.2 | 0.7 | 3 | 1.5 |M 24oC 37oC 24oC 37oC 24oC 37oC
(A) (B)
24oC 37oC 24oC 37oC 24oC 37oC
DO= | 0.2 | | 0.7 | | 3 | | 1.5 |
plasmídios pertencentes a grupos de compatibilidade distintos para não haver o risco da
bactéria rejeitar um deles. As células foram inicialmente crescidas a 24oC e em seguidas
transferidas para 37oC e incubadas na presença ou ausência de arabinose. Como ainda não
havia sido determinado qual a concentração ideal de arabinose para que haja a síntese de
SycH regulada pelo promotor PBAD, foi realizada uma indução onde este açúcar foi
adicionado ao meio LB nas concentrações 0,02%, 0,2% e 2%, enquanto que a proteína
YopH foi expressa regulada pelo seu próprio promotor. Foi observado que a adição de
arabinose induz a expressão de SycH principalmente na concentração de 0,2%. Contudo,
embora a YopH esteja sendo expressa a 37oC na ausência de arabinose, a adição do açucar
reprime a expressão de YopH, sendo esta repressão maior na concentração de 2%. Mesmo
na ausência de arabinose houve uma diminuição discreta da expressão de YopH quando
comparada com a expressão em EPEC contendo apenas o pTZ18R/yopH (figura 10A). Os
resultados obtidos com a YopH foram confirmados por meio de Western-Blot com o soro
disponível contra esta proteína (figura 10B).
Outro experimento foi realizado visando verificar o efeito da arabinose em células
EPEC transformadas apenas com o plasmídeo pTZ18R/yopH. Ao adicionar o açúcar
arabinose nesta cultura, que não contém o plasmídio pBAD18Kan/sycH, mesmo assim
houve diminuição da expressão de YopH na ausência deste plasmídio e da chaperone SycH
(figura 11). Resumindo estes experimentos na presença do plasmídeo pBAD a indução da
YopH é levemente reprimida e a arabinose potencializa essa repressão, enquanto que este
mesmo açúcar estimula a transcrição do promotor PBAD e síntese da proteína SycH.
M 0 4h 0 4h 0 4h 0 4h 0 4h
-sycH -Arab 0,02% 0,2% 2%
0 4h 0 4h 0 4h 0 4h 0 4h
-sycH -Arab 0,02% 0,2% 2%
(A) (B)
M 0 4h 0 4h 0 4h 0 4h 0 4h
-sycH -Arab 0,02% 0,2% 2%
0 4h 0 4h 0 4h 0 4h 0 4h
-sycH -Arab 0,02% 0,2% 2%
(A) (B)
94 67 46 30 20 14
Figura 10: Co-expressão de YopH e SycH em células EPEC co-transformadas com os plasmídios pTZ18R/yopH e pBAD33Cm/sycH (A) SDS-PAGE 15% de células crescidas a 24oC até a DO de 0,4 e em seguida transferidas para 37oC por 0 ou 4 horas de incubação. A seta a esquerda do gel indica a banda da YopH enquanto que a seta em diagonal mostra a SycH. (-sycH) refere-se a cultura de bactérias que continham somente o plasmídio pTZ18R/yopH e (-Arab) é a cultura em que não foi adicionado o açúcar arabinose. (B) Western-blo com as amostras analisadas em A testadas com o soro policlonal contra a YopH.
Figura 11: Efeito da arabinose na expressão da YopH em células EPEC transformadas com o plasmídio pTZ18R/yopH. Células crescidas como descrito na figura 10 e amostras analisadas em SDS-PAGE 15%.
DISCUSSÃO E PERSPECTIVAS
A expressão de uma proteína com peso molecular correspondente ao da proteína SycH pôde ser
obtida tanto em meio glicerol-mínimo quanto em meio LB, apesar deste último conter glicose, que é um fator
de repressão do promotor PBAD presente no plasmídio pBAD18Kan/sycH e pBAD33Cm/sycH (19, 30). A
vantagem de se expressar genes clonados em plasmídios da série pBAD em meio LB é que neste meio o
crescimento bacteriano é mais rápido quando comparado ao MGM, além de que é possível realizar a
expressão de YopH a 37o, juntamente com a de SycH, num intervalo de tempo curto. A expressão da proteína
YopH revelou ser regulada pela temperatura e fase de crescimento. Na fase inicial do crecimento (DO=0.4) a
24oC, ocorre uma expressão muito discreta da proteína YopH, quando comparada com a expressão a 37oC, o
que indica que o promotor do gene yopH é regulado pela temperatura. A regulação mediada pela temperatura
decorre do fato de que, em temperaturas menores que 30oC, a molécula de DNA na região do promotor da
YopH se encontra encurvada de maneira que não permite a transcrição, enquanto que temperaturas maiores
desfazem estas curvas (22). Entretanto, a medida que as bactérias crescem, a expressão de YopH a 24oC
0 4h 0 4h 0 4h 0 4h
-Arab 0,02% 0,2% 2%
EPEC + pTZ18R/yopH
YopH
aumenta, o que demonstra que a transcrição do gene yopH clonado no plasmídio pTZ18R depende da fase de
crescimento. No que se refere à curva de crescimento, foi observado que o crescimento da EPEC a 24oC passa
a superar o crescimento da mesma cepa a 37oC, provavelmente porque a expressão de YopH seja tão intensa a
37oC que esta proteína passa a se acumular no interior das células bacterianas, sendo tóxica para as mesmas.
A partir destes estudos, partiu-se para a análise da indução dos genes yopH e sycH, clonados em plasmídios
de grupo de compatibilidade distintos para que não haja o risco de que a bactéria rejeite um deles. Para
expressar ambas as proteína e determinar a concentração ideal de arabinose para que ocorra a expressão da
proteína SycH, as bactérias cotransformadas com os plasmídios pBAD18Kan/sycH e pTZ18R/yopH
cresceram a 37oC em meio LB acrescido do açúcar arabinose nas concentrações 0,02%, 0,2% e 2%. Esta
tentativa gerou um resultado inesperado, pois a adição do açúcar arabinose, que é o indutor do promotor PBAD
responsável pela transcrição do gene da proteína SycH clonado nos plasmídios da série pBAD, acabou por
reduzir a expressão da YopH, por motivos ainda não totalmente esclarecidos. A princípio suspeitou-se de que
a proteína YopH estaria sendo secretada, contudo, mesmo na ausência de arabinose houve diminuição discreta
da expressão de YopH quando se compara com a EPEC contendo apenas o pTZ18R/yopH. O que também
contraria esta hipótese é o fato de que ao se adicionar o açúcar arabinose na cultura que não contém o
plasmídio pBAD18Kan/sycH, mesmo assim há diminuição da expressão de YopH na ausência da SycH. Este
resultado é um indicativo de que a YopH não está sendo secretada, mas na realidade a presença do plasmídeo
pBAD reprime de alguma forma a indução da YopH e a arabinose potencializa essa repressão. Isto ocorre
talvez por que este açúcar serve como substrato indutor para alguma molécula que tenha a propriedade de se
ligar a determinados sítios do DNA, a exemplo da proteína AraC presente em E. coli ou a VirF, da mesma
família da AraC, presente em Y. enterocolitica. Esta ligação poderia ocorrer com o plasmídio pTZ18R ou
diretamente com algum sítio do promotor do gene yopH, a exemplo do próprio sítio de ligação à proteína
VirF, levando a um estímulo repressor (28, 32). Esta interação poderia formar um “loop” na molécula de
DNA, como é observado com a ligação do complexo AraC-arabinose aos sítios araO1 e araO2 do operon
araBAD, que impede a transcrição do gene araC (21), lembrando o que ocorre também em temperaturas mais
baixas.
A utilização destes vetores se mostrou eficiente para a expressão das proteínas SycH e YopH
isoladamente, porém o mesmo não se pode afirmar para a co-expressão de ambas, já que o fator de transcrição
de um gene inesperadamente reprimiu o outro. Para os ensaios de secreção, é mais sensato tentar utilizar
algum outro plasmídio como vetor de expressão. se não clonar os dois genes no mesmo plasmídio sob o
controle do mesmo promotor. A tentativa de secretar a proteína YopH e antígeno de Leishmania braziliensis
fusionado à YopH (22), na presença da SycH, pode ser realizados em bactérias E. coli enteropatogênicas
(EPEC), para verificar a capacidade destas em secretar proteínas de Y. enterocolitica e proteínas de fusão, o
que permite subsídios para o desenvolvimento de futuras vacinas além de se determinar se há conservação
funcional do sistema de secreção tipo III (TTSS) compartilhado por estas bactérias.
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