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7/25/2019 Modelagem livre de calibração inversa de cromatografia de troca iônica em purificação industrial de anticorpo

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2015 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 107

Eng. Life Sci. 2016, 16 , 107 – 113 www.els-journal.com

Tobias Hahn1

Thiemo Huuk 1

Anna Osberghaus1

Katharina Doninger2

Susanne Nath2

Stefan Hepbildikler2

Vincent Heuveline3

Jürgen Hubbuch1

1Biomolecular SeparationEngineering, KarlsruheInstitute of Technology(KIT), Karlsruhe, Germany

2Pharmaceutical BiotechProduction, RocheDiagnostics GmbH,Penzberg, Germany

3Engineering Mathematicsand

Computing Lab, Heidelberg

University, Heidelberg,Germany

Research Article

Modelagem livre de calibração inversa de cromatografia de troca iônica em

purificação industrial de anticorpo

A identificação de parâmetros de processo ideal para o isolamento de um componente de destino demisturas multicomponentes é especialmente desafiador em aplicações industriais. Comconstantemente crescente pressão de time to Market, um espaço de grande parâmetro de triagem nãoé viável e abordagens de projeto-de-experiência com alguns experimentos podem falhar devido areações de dinâmicas e não lineares para pequenos parâmetro é alterado. Baseado no modelo deotimização pode determinar condições ideais de funcionamento, uma vez que o modelo foi calibrado para a etapa de processo específico. Neste trabalho, os parâmetros para o modelo de ação em massaestérico foram estimados para a proteína do alvo e três impurezas de uma etapa de purificação de permuta catiónica anticorpo industrial usando apenas cromatogramas em diferentes comprimentosde onda e análises de fração adicional com cromatografia de exclusão. Não existem informaçõessobre as concentrações molares ou massas na alimentação. Os resultados de otimização baseada emmodelo coincidam com otimização convencional baseado no cromatograma.

Palavras-chave: Industrial método inverso / aplicação / líquido cromatografia / Mecanicista

modelagem / otimização Received: January 28, 2015; revised: April 13, 2015; accepted: April 29, 2015

DOI: 10.1002 /elsc. 201400248

1 Introduction

Produtos biofarmacêuticos atualmente constituem umdos mercados mais rápido crescimento para a indústriafarmacêutica [1]. Processamento a jusante industrialenfrenta o desafio de purificar eficientemente um

produto fora de uma mistura muito heterogénea.Especialmente para o mAb, a seqüência de purificação écomumente baseada em processos de plataforma quesão apenas ligeiramente adaptados aos novos

componentes de destino [2,3]. Esta abordagem garantedesenvolvimento rápido processo e reduz o tempo demercado, mas é provável que a exploração reduzida do

projeto espaço leva a processos de qualidade inferior[4]. Compreensão do processo, portanto, é uma adiçãoimportante e sensível para o uso de processos

plataforma [5]. Como a integração de ferramentas demodelagem no processo de desenvolvimento é tambémuma parte essencial da estratégia para a implementaçãoda qualidade pelo desenhador proach [6,7], ferramentasde modelagem estão ganhando cada vez mais a atençãoda indústria farmacêutica.

Para alguns modelos de sub de absorção, tais como o modelo

de ação em massa estérico (SMA) por cromatografia de troca

iónica de proteínas [8], protocolos de calibração do modelo para componentes puros existem [8], que permitem determinaros parâmetros específicos do componente de formaconsecutiva. Com não um priori conhecimento sobre ocomportamento dos componentes dentro de misturas, ométodo inverso é opção adequada, que altera a formasistemática de parâmetro seno para conseguir um jogo decromatogramas medida e previsão do modelo. Em um estudocomparativo [9], a abordagem direta e o método inverso foram

encontradas para alcançar qualidade igual previsão, tal que oúltimo é recomendado para desenvolvimento de processorápido.

existiu de calibrações de sensor para todos oscomponentes, permitindo valores de absorvância UVtrans-forma em concentrações em massa ou molares.Este artigo discute os desafios ao aplicar modelagemmecanicista e otimização numérica para um conjunto dedados de cromatografia preparativa industrial sem oconhecimento da composição de alimentos em termos deconcentrações molares. Análises e experimentosadicionais são evitadas empregando a abordagem demodelagem que as estimativas dos coeficientes de

absorção a partir dos dados gravados de UV.



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108 C 2015 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

O estudo de caso baseia-se em uma permuta catiónicacromatográfica (CEX) etapa do processo (resina Poros 50HS). A mistura de anticorpo alimentada em CEX é eluído

uma proteína A após condicionamento e incubação de baixo pH. A mistura contém diversas variantes deanticorpo, diferindo em tamanho e a carga, que todoseluir em um pico comum. Fração de recolha e análise temde ser realizada também blain obter informações sobre alocalização das impurezas. Pode ser distinguida usandocromatografia de exclusão, o alvo monômero e trêsimpurezas, duas espécies de um baixo peso molecular(HBPM) e alto peso molecular (HMW). Os parâmetrosdo modelo encontrado foram usados na otimização desilico e eventualmente coincidam com otimizaçãoconvencional pela avaliação do cromatograma.

2 Materiais e métodos

Iniciais experimentos foram conduzidos para determinar

como a empresa sistema, foram Fonte posteriormenteseis experimentos sem modo de ligação/ebulição. Asseções a seguir descrevem a montagem experimental,

processamento de dados e estimação de parâmetros.

Table 1. Measured and calculated column parameters.

Parameter Symbol Value Unit Proceeding Diameter D 10 mm From manufacturer

Length L 246 mm From manufacturer Bead radius rp 0.025 mm From manufacturer System dead volume V d 1.98 mL Acetone pulse injection without

column Retention volume acetone VRetAc 16.94 mL Acetone pulse injection with

column Retention volume dextran VRetDex 10.29 mL Dextran pulse injection with

column SD of dextran σ Dex 0.161 mL Akta¨ peak integration Volume of HCl VHCl 130.2 mL Acid/base titration Molarity of HCl cHCl 0.01 M Manually controlled Flow rate u 0.69 mm/s Manually controlled

Volume V 19.32 mLFluid volume V f 14.96 mL V RetAc V d Interstitial volume V int 6.43 mL V RetDex − V d

V

Total column porosity εt 0.77 V f

Interstitial porosity εb 0.43 V

V int

Particle porosity

Interstitial flow

ε p

uint 0.6

1.61 mm/s

V −Vint

u εb

V f −Vint

Axial dispersion Dax 0.124 mm²/s 1 (σV Dex

int )2

HCl ·

2 · L · u int · Ionic capacity 0.3 M c V HCl

V (1 − ε b )(1 − ε )





2.1 Determinação de parâmetros de coluna

Uma coluna de 20 mL, com Poros 50 HS (Applied

Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) resina foi analisada

primeiro com um pulso de acetona e o segundo com

dextran usando um Avant Akta¨ parâmetros de

todeterminetheessentialmodel de sistema (GE

Healthcare, LittleChalfont, Reino Unido), conforme

descrito em [17] e apresentado na tabela 1. Acidbase-

titulação foi realizado para determinar a capacidade total

de iônica: A coluna foi lavada com uma solução de HCl

0,5 M até um constante UV e sinal de condutividade foi

alcançado. Depois a coluna foi lavada com água ultrapura

até uma linha de base UV e condutividade constante foiatingida. Depois que a coluna foi titulada com um caudal

de 100 cm/h com uma solução de NaOH 0,01 M até

registou-se um aumento no sinal de condutividade. A

concentração de íons nd do titulante e o volume de

titulante a aplicada, calculou-se o número total de íons

trocáveis. Todos os produtos químicos utilizados foram

obtidos mais de alta qualidade. Com este conjunto de

parâmetros de todos os parâmetros de sistema específicos

ocorrem na matemática...

2.2 Bind elute experiments

Como o líquido do sistema que utilizou-se um tampãode acetato de 50mm em pH 4,95, para a eluição foiempregado um buffer de elevado-sal de acetato de 50mM e 750 mM de NaCl. Os diferentes perfis de sal aseguir foram misturados destes dois buffers. Um volumede amostra de 81,3 mL = 4.2 volumes de coluna (CV) foiinjetado para cada experimento. Primeiro, o experimentogradiente foi decorreu de 50mm (tampão de 0% salelevado) a 550 mM (66% highsalt tampão), com o

gradiente começando com 8,4 CV e terminando em 18,1CV. Como o pico de eluição alcançou seu máximo emuma concentração de sal total de 210 mM, cinco elutions

passo com concentrações 190, 200, 210, 220 e 230 mMforam realizadas para otimização. Cada passo foiinduzido a 7 CV e foi seguido por uma lavagem com

buffer de elevado-sal 100% assim que o sinal de 280nanômetro UV caiu abaixo de um limite de 100 mAU. Os

picos de eluição de todas as experiências foramcapturados em amostras de 3 mL e analisados porcromatografia de exclusão-tamanho (SEC) paradeterminar a contribuição relativa das duas

espéciesHMW, themonomer... lavagem subseqüentetambém foi fracionada e analisada. A mesma análise foirealizada para o material da alimentação. Como agradiente eluição resultou em um top sem corte (Fig. 2)e não um pico distinto, uma eluição gradiente mais foirealizada para verificar se há variantes de carga

.

2.3 Modelo matemático

O modelo de baseado em absorvância UV comodesenvolvido em [18] é usado a seguir. O modeloda taxa geral [17] modelos o transporte de proteínamacroscópica através da coluna. O sistema é do tipode reação (CDR) de difusão de convecção. Aequação (1) descreve a taxa de mudança de umci(x,t) de concentração, medido em [M] para sal e[mAU] para proteínas, no volume intersticial de

uma coluna com comprimento L que consistem detransporte convectivo de massa no espaço com avelocidade intersticial média do fluido u, pico,ampliando os efeitos que são modelados comodispersão no sentido axial, no que diz respeito umcoeficiente de Dax e transição de concentraçãointersticial para a partícula pore cp,i(x,r,t) deconcentração que varia de acordo com a porosidadede ε b a cama, o raio de partículas adsorvente rp eum componente específico filmtransfer coeficientekf ilm, eu. Modelo é complementado comcondições de contorno Danckwerts, Eqs. (2) e (3).Equações (modelo 4) – (6) o acúmulo de massa novolume dos poros...∂ci ∂ci ∂2ci ∂t ( x,t ) = −u (t ) ∂ x ( x,t ) + Dax ∂ x 2 ( x,t )

−1 −εb

k f ilm c p , εb

∂ci u (t )

(0,t ) =cin ,(2)

∂ x Dax

∂ci ( L ,t ) 0 (3)

∂ x =

∂c p 1 −ε p ∂q





∂c k f ilm

c p(5)

∂r ε p D p

∂c p ( x,0,t ) 0 (6)

∂r =

A isoterma de SMA [8], modificada em [18], é uma

isoterma semimechanistic comumente usada em

cromatografia de permuta iónica. É capaz de reproduzir a

influência dos íons do contador sobre o comportamento

de retenção de espécies de proteínas usando νi de

encargos característico das proteínas. Além disso,

considera o adsorvente propriedades tais como a

capacidade total de iônica e blindagem estérica efeitos σi

da proteína que abrange uma quantidade de sítios de

ligação, maiores que o número real de sites interage com.

A UV baseado em absorvância cinética SMA isotérmica

é dada na EQ. (7), com qi e cp, sendo a concentração da

proteína que eu adsorvido e em solução, respectivamente.

CP, sal é a concentração de sal de andkdes a

solution.keq,i, eu

aretheconstantsofequilibriumanddesorption taxa e ai o

coeficiente de absorção que as escalas de concentrações

molares para unidades de absorvância, de acordo com a

lei de Beer. O ai de fatores consistem de coeficiente de

extinção e comprimento de caminho de célula C UV,

onde os coeficientes de extinção...k νi

k , ∂q i = eq,i − ν j +σ j j c p,i − c ν pi, salt qi (7)

∂t j = 1 a j

k ν j

q salt = − q j (8) a j j = 1

O modelo é escolhido por causa de sua capacidade desimular o processo inteiro cromatográfico, incluindoeluição, alterando a concentração de sal induzida àentrada.

2.4 Solução numérica

A simulação numérica é executada usando o pacote desoftware in-house ChromX. Seguindo o método daslinhas, o sistema de equação primeiro é diferenciado noespaço na dada nós, usando o método de elementosfinitos (FEM). FEM é um método altamente versátil comforte base matemática e bem adequado para equações deCDR. O procedimento de soluções começa com aformulação fraca, incorporando as condições de contornoe representando as variáveis com funções básicas dosrespectivos espaços. Aqui, foi utilizado um método dedinamizam-Upwind-Petrov-Galerkin com funções

lineares de base e teste. A discretização no tempo éexecutada com o fracionário passo - esquema, um

∂ t( x , r , t ) − =

ε ∂ t( x , r , t )

+ 1

r 2 ∂

∂ r r 2 D

∂ c

∂ r( x , r , t ) (4)





semiimplicit

Figura 1. Perfis de absorvância do único-componente UV280 nm para a eluição de sal passo de 190 mM. As curvassão geradas multiplicando o cromatograma rácios decomponente encontrados por análise de fração com SEC.

Figura 2. Pico do gradiente de eluição gravado no UV,260, 280 e 300 nm. Apenas o sinal de nm 300 mostra todo

o topo. A forma de pico indica que o monômero consistede diferente carga variantes de eluição.

procedimento, proporcionando precisão de segunda

ordem [19]. Finalmente, a não linearidade do sistema de

equação, introduzido pela isoterma deve ser tratada com

um procedimento iterativo, aqui, iteração de Picard. Os

sistemas lineares resultantes são resolvidos por fatoração

LU.

2.5 Estimação de parâmetros

Estimativa de um parâmetro desconhecido de p¯conjunto opt resolve o problema de otimização de

mínimos quadrados p ¯ opt

(9)

onde m(tj) é o valor medido cromatograma em pontono tempo tj. As medições também podem conter o ruído,que pode ser negligenciado quando assumindo o ruídozero-maldade Gaussian e isotrópico. A concentração ci é

simulada em unidades de absorvância. Escala linear paraconcentrações molares foi verificada com amostras deração concentradas. O sinal do sensor éaproximadamente proporcional à concentração dealimentação até o limite de saturação em UV 280, talcomo sugerido pela lei de Beer. Além disso, o UV 300nm captura concentrações aproximadamente quatrovezes maiores do que a UV-280 nm (dados não

mostrados). Os cromatogramas foram também corrigidos pela influência da concentração de sal na fase móvel.Uma variedade de algoritmos está disponível para asolução deste problema de otimização. Neste trabalho,utilizamos um método heurístico, baseado em umalgoritmo genético (ver GAlib. Item 2.4.7,http://lancet.mit.edu/ga). Algoritmos genéticos evitarmínimos locais executando saltos aleatórios e, portanto,explorar uma área maior....

0

1,000

2,000

3,000

4,000

300 250 200 150 350

30

160

Close-up

120

0

90

60

30

Volume [ml]

Monomer

Conductivity

180 200 220 240

20

10

0





3 Resultados e discussão

3.1 Bind-elute experiments

A análise de alimentos pela SEC mostrou monômero96.79%, 2,95% + 0,17% de espécies com maior peso

molecular (HMW 1 e 2 HMW) e 0,09% com HBPM em280 nm. Uma análise mais aprofundada IEC revelou quea composição exata do monômero é 15,4% ácido, 63,3%

principal e básico variante de 21,3%. Um exemplo de umresultado de eluição do passo é apresentado na Fig. 1. Elamostra uma frente íngreme, há muito tempo atrás e um

pico considerável após a alta finalTarget yield [%] Figura 3. Pureza de monômero sobre rendimento ao coletar frações de mMGradient210 consecutivamente. Passos mais levam a coelut190 mM220 mM ing impurezase pureza inferior. Mais baixas etapas permitem separar as impurezas mas não recolher todosdo componente alvo 200 mM230 mM 200 mM230

.





Figure 4. Comparison of measured chromatogram () and simulated sum signal ( – ) for the salt elutions (- -) used for model

calibration. 0.19 mM step elution, UV 280 nm (A) and UV 300 nm (B), 0.23 mM step elution, UV 280 nm (C) and UV300 nm (D), and gradient elution,UV 280 nm (E) and UV 300 nm ( F ). passo de sal. O resultado do gradiente de eluição na Fig.

2 mostra um top sem corte, indicando que as variantes

de monômero eluir diferentemente.

3.2 Referência ideal

Quando não utilizar otimização baseada em modelo emcombinação com concentrações de alimentaçãoconfiáveis ou ensaios alternativos, o ideal tem que ser





definido usando apenas dados de absorbância UV. A pureza é C definido como área de pico de alvo SECmédia de frações envolvidas, dividido pelo totalabsorvância e rendimento da mesma forma é definidocomo a razão entre a área do pico coletados pela áreatotal. Devido a requisitos de desempenho do processo,apenas eluição de passo são considerados cenários queatingir pelo menos 99% de pureza e 80% rendimentocom tamanho da fração menor do que 5 volumes decoluna.

A Figura 3 mostra o desenvolvimento da pureza demonômero sobre rendimento quando começar a recolherda primeira fracção do pico de eluição e adicionandosucessivamente as outras frações. As etapas de 200 e 210mM com base nesses dados, executam melhor. Elutionsgradientes são indesejáveis no processo final e não foramconsiderados. Ao coletar as primeiro 33 fracções (= 99

mL 5 CV), a etapa de 210 mM alcança um grau de purezade 99,3 e 86,5% de rendimento. A etapa de 200 mMalcança um pouco melhor pureza de 99,5%, mas apenas80% de rendimento. A etapa de 220 mM atinge um maiorrendimento com menos fracções mas não atingir a purezadesejada. 3.3 estimação de parâmetros de proteína oalgoritmo de estimação empregado é um algoritmo

genético, para cobrir rapidamente um grande espaço. Osvalores de absorvância de entrada são definidos paratodos os componentes usando a área do pico conhecidoem 300 nm, o fator de escala de 300 a 280 nm e osresultados da análise de SEC e IEC do feed em 280 nm.Os dados disponíveis, o gradiente e o sal de maior emenor... o caso de monômero com variante tipo de carga.Fatores estéricos de blindagem e coeficientes de absorçãosubir aproximadamente com o tamanho da molécula,como esperado. Difusão de cinética e filme de sorção sãorápidos, como indicado por todas as frentes de eluiçãoíngreme.

3.4 Otimização

Novamente, o criptato genético foi empregado para

determinar a altura ideal de sal passo juntamente com oslimites de fracionamento. Uma otimização das CEN decarga foi Gião com tradicional através de alto colocartriagem antes da mão. Daí, uma comparação com umacartilagem baseada em no modelo desta escala particularnão foi possível. Resultados algoritmo genético plotagemem Fig.5.Al entanto, o modelo foi calibrado apenas como

Figure 5. Intermediate values of salt step optimization with a genetic algorithm. Step concentrations below 210 mM allowa purity above 99%. Highest yield values are achieved by step concentrations above 200 mM.

Table 2. Estimated model parameters.

Component kf ilm D p

k keq ν σ a [mm/s] [mm²/s] [sM ] [-] [-] [-] [

mAU/M]

Salt LMW Monomer acidic Monomer main Monomer basic HMW 1 HMW 2

0.00830.0083

0.0083 0.0083 0.0083 0.0083 0.0083

7.00·10−−46

3.49 ·10−5

2.10 ·10−6 5.34·10−4 1.57·10−6 3.60·10−6 7.72·10

—

1.61·10−−25

9.00·10−3

1.90·10−4

6.08·10−6

3.50·10−5 3.90·10

— 1.701.981.42

1.91 2.40 5.70

— 3.323.055.21

6.90 8.23 5.20

— 65.075.375.3

75.3 210 287

— 4.4

8.228.22

8.22 2.14 2.10





gradiente e como etapas de 190 e 230 mM, os resultadosassemelham-se os achados na seção 3.2 estreitamente: só

passo concentrações abaixo de 210 mM permitem umgrau de pureza superior a 99% e só passo concentraçõesinferiores a 200 mM achievehighyieldsabove95%. O aresde valores de rendimento de luz ly superior na otimização

baseada em modelo resulta como algumas partes dos picos de eluição de referência não foram analisados pelaSEC e não poderiam ser considerados pará o cálculofazer ideal de referência (cf. Fig. 1). Hum dinamizadoresentre o rendimento e pureza é encontrado em cerca de200 milímetros, seguido de perto por 210 mM, assimcomo uma análise de referência. O volume admissível de100 mL íria ser plenamente explorado por uma etapa de195 a 200 mM. Hum passo de 210 mM está previsto paraalcançar hum rendimento de 91% para uma necessária

pureza de 99% coordenação apenas 60 mL

.

4 Concluding remarks

O benefício da otimização do modelo baseado emcomparação com a abordagem tradicional é maisimportante dado pela rápida adaptação às mudanças dacomposição de alimentos e as possibilidades deotimização mais. Por exemplo, perfis de sal podem serconstruídos, constituído por várias etapas emcombinação com um gradiente. A redução do númerode experiências neste caso não é significativa, como

otimização convencional foi para a frente e o baseadoem modelo ideal teria que ser verificada por umexperimento adicional. Fracionamento em si é umanecessidade para ambas as abordagens, onde completouseus estudos devem examinar se os bons resultados

podem ser obtidos com resolução menor.

Practical application

Este artigo demonstra essa otimização baseada emmodelo pode ser aplicada a um passo de permuta

catiónica industrial, mesmo que as concentraçõesmolares dos componentes de alimentação sãodesconhecidas. Com base em alguns experimentos, que podem já estar disponíveis a partir de seleçõesanteriores, o modelo pode ser calibrado. Paradiferenciação componentes farmacológicos escondidono sinal de soma, single-curvas de eluição decomponentes devem ser geradas para o encaixe de pico. Isso é feito por análises de fração de segundo o mesmocomprimento de onda como o cromatograma.Theresearch leading to these results was partly funded by EURO TRANS-

BIO(grantagreementno.0316071B,EC’sSeventhFramew

ork Programme).

The authors have declared no conflicts of interest .

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