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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
NÁDIA RÚBIA DA SILVA REIS
ESTUDO SOROLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C EM AFRO-DESCENDENTES DE
COMUNIDADES ISOLADAS DE GOIÁS
Orientadora:
Profa. Dra. Regina Maria Bringel Martins
Dissertação de Mestrado
Goiânia-GO2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁSINSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
NÁDIA RÚBIA DA SILVA REIS
ESTUDO SOROLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C EM AFRO-DESCENDENTES DE
COMUNIDADES ISOLADAS DE GOIÁS
Orientadora:
Orientadora:
Profa. Dra. Regina Maria Bringel Martins
Dissertação submetida ao PPGMT/UFG; como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Medicina Tropical na área de concentração de Microbiologia.
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro do CNPq, processo Nº 477319/2003-3.
Goiânia-GO
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2007
Dedico a concretização deste trabalho a:
Deus, pela vida, família e oportunidade de crescimento;
Meus pais, Nilson e Marly, pelo amor, carinho e, por terem me
ensinado o valor da vida e da humildade;
Meus irmãos, Sérgio e Leandro, pelo carinho, apoio e exemplo;
Ao meu amor, Sérgio Reis, pelo carinho, paciência e por me
ensinar a ter perseverança em tudo que faço;
Aos Kalungas, que humildemente participaram do projeto.
3
AGRADECIMENTOS
À Deus, presença constante em todos os momentos de minha vida.
À professora Doutora Regina Maria Bringel Martins, pelo carinho, orientação e
exemplo fundamentais na concretização deste trabalho.
À Comunidade Kalunga, pelo aceite em participar deste trabalho.
À Renata Carneiro Ferreira, por todo o seu carinho, auxílio e palavras de apoio,
essenciais não só na realização deste trabalho, mas na minha vida.
À Márcia Alves Dias, pela amizade, exemplo de competência, importantes na
realização deste trabalho, sua presença é muito importante na minha vida.
À Aline Garcia Kozlowski, pela alegria transmitida em todas as manhãs, atenção,
apoio e companheirismo em todos os momentos.
À Viviane Rodrigues Tavares, pelos sorrisos e histórias compartilhadas, que com
certeza, irá fazer falta no meu dia-dia.
À Laura Branquinho do Nascimento, pelo carinho, amizade e incentivo, que
fizeram diferença na realização deste trabalho.
À Nara Rúbia de Freitas, pelo carinho, ajuda e exemplo de paciência, importante
nos momentos difíceis deste trabalho.
À Thaís Augusto Marinho, pela atenção em todos os dias no laboratório.
À Michelle Dias, pela valiosa ajuda na coleta das amostras.
Ao Marcos André de Matos, pelo auxílio e atenção, durante a realização deste
trabalho.
4
Ao Ágabo Macedo da Costa e Silva, pela atenção e apoio, essenciais na
concretização deste trabalho.
Às professoras Carmem Luci Lopes, Megmar Aparecida dos Santos Carneiro e
Sheila Araújo Teles, pelo apoio, carinho, incentivo, ensinamento e contribuição na
realização deste trabalho.
À Ana Rita Motta-Castro, pelo exemplo de paciência e dedicação, além do apoio
nas coletas.
A todos os professores e funcionários do Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública, em especial aos da pós-graduação que me acolheram.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo
apoio financeiro.
5
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS...................................................................viii
RESUMO............................................................................................................ix
SUMMARY..........................................................................................................x
1. INTRODUÇÃO................................................................................................1
1.1. Considerações Gerais..............................................................................1
1.2. Características do Vírus da Hepatite C....................................................2
1.3. Diagnóstico da Hepatite C........................................................................8
1.4. Aspectos Epidemiológicos da Infecção pelo HCV..................................10
1.4.1.Transmissão.....................................................................................10
1.4.2. Soroprevalência e Distribuição Geográfica dos Genótipos.............11
1.5. Aspectos Clínicos e Tratamento da Hepatite C......................................14
1.6. Prevenção e Controle da Infecção pelo HCV.........................................16
1.7. Afro-descendentes de Comunidades Isoladas de Goiás........................17
1.8. Justificativa.............................................................................................20
2. OBJETIVOS...................................................................................................21
3. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................22
3.1. População Estudada...........................................................................22
3.2. Entrevista e Coleta de Sangue............................................................23
3.3. Detecção do Marcador Anti-HCV.........................................................24
3.4. Detecção do RNA-HCV e Genotipagem..............................................25
6
3.5. Processamento e Análise dos Dados..................................................26
4. RESULTADOS.............................................................................................27
5. DISCUSSÃO................................................................................................33
6. CONCLUSÕES............................................................................................38
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................39
ANEXOS............................................................................................................53
7
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Representação do vírus da hepatite C................................................3
Figura 2 - Representação esquemática do genoma e proteínas do HCV...........4
Figura 3 - Árvore filogenética dos tipos e subtipos do HCV................................7
Figura 4 - Prevalência global da hepatite C.......................................................12
Figura 5 - Localização geográfica da população Kalunga.................................18
Figura 6 - Povo Kalunga....................................................................................19
Figura 7 - Mulheres Kalunga trabalhando em artesanato..................................19
Figura 8 - Casa Kalunga feita com adobe e palha.............................................19
ÍNDICES DE TABELAS
TABELA 1 - Características sócio-demografícas de 878 indivíduos da população
Kalunga, Goiás.................................................................................28
TABELA 2 - Características de risco para infecção pelo HCV relatadas pelos
Kalungas em Goiás............................................................................................30
TABELA 3 – Prevalência da infecção pelo HCV em 878 indivíduos da população
Kalunga, no Estado de Goiás...........................................................31
TABELA 4 - Reatividade para anti-HCV pelo line immunoassay (LIA), detecção do
RNA viral e genótipos do HCV dentre as amostras anti-HCV reagentes no ensaio
imunoenzimático, Kalungas-Goiás.........................................................31
TABELA 5 - Características de risco relatadas pelos Kalungas infectados pelo
HCV, Goiás........................................................................................................32
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RESUMO
A hepatite C é um importante problema de saúde pública, sendo a causa mais
comum de doença hepática crônica na atualidade. Estima-se que
aproximadamente 170 milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas
pelo vírus da hepatite C (HCV). Muitos desses são portadores assintomáticos,
porém a cronicidade pode ocorrer em cerca de 85% dos casos. Este estudo teve
como objetivos determinar a prevalência da infecção pelo HCV, verificar os
fatores associados e identificar os genótipos circulantes em afro-descendentes de
comunidades isoladas no Estado de Goiás. Em 2004, foram realizadas entrevista
e coleta de sangue de 878 indivíduos da população Kalunga, que concordaram
em participar deste estudo. Estas amostras foram triadas pela pesquisa de
anticorpos anti-HCV utilizando o ensaio imunoenzimático (ELISA). As amostras
reagentes ao ELISA foram retestadas pelo teste confirmatório line immunoassay -
LIA e, também submetidas à detecção do RNA-HCV pela reação da cadeia da
polimerase (PCR). As amostras RNA-HCV positivas foram genotipadas pelo line
probe assay - LiPA. Um total de cinco amostras foram positivas para os
marcadores anti-HCV e/ou RNA-HCV, resultando em uma prevalência de 0,57%
(CI 95%: 0,21 - 1,40). As três amostras RNA-HCV positivas foram do genótipo 1
(subtipo 1a), e um indivíduo mostrou-se co-infectado pelos genótipos 1 e 3.
Características de risco, como hospitalização, cirurgia, compartilhamento de
objetos cortantes de higiene pessoal e tratamento odontológico, foram relatadas
pelos indivíduos infectados pelo HCV. Os resultados deste estudo mostram uma
baixa endemicidade para a infecção pelo HCV nas comunidades afro-
descendentes isoladas de Goiás, com a circulação dos genótipos 1 e 3 nestas
comunidades.
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SUMMARY
Hepatitis C is an important problem of public health, which nowadays is a major
cause of chronic hepatic disease. It has been estimated that about 170 million
people worldwide are infected with hepatitis C virus (HCV). Although several of
them are assintomatic carriers, chronic infection can occur in approximately 85%
of the cases. This study aimed to assess the HCV infection prevalence, analyse
the factors associated, and identify the genotypes that circulate in Afro-
descendants isolated communities in Goiás state. In 2004, 878 individuals of the
Kalunga population were interviewed and blood samples collected. Informed
consent was obtained from all participants. These samples were tested for
antibodies to HCV (anti-HCV) by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
Reactive samples were retested for confirmation with a line immunoassay-LIA,
and also submitted to HCV RNA detection by the polymerase chain reaction
(PCR). HCV RNA positive samples were genotyped by the line probe assay-LiPA.
A total of five samples were anti-HCV and/or RNA HCV positive, resulting in a
prevalence of 0.57% (95% CI: 0.21-1.40). The three HCV RNA positive samples
were of genotype 1 (subtype 1a). One subject was coinfected with genotypes 1
and 3. Risk characteristics such as hospitalization, surgery, sharing of personal
cutting higienic objects and dental treatment were reported by individuals who
were infected with HCV. The results of this study show a low endemicity of HCV
infection in Afro-descendants isolated communities in Goiás, and the circulation of
genotypes 1 and 3 in these communities.
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1. I N T R O D U Ç Ã O
1.1.Considerações Gerais
Estudos clínicos, realizados na década de 70, documentaram uma forma
crônica persistente de hepatite em pacientes transfundidos com sorologia
negativa para as hepatites A e B. Em 1989, o genoma deste agente foi clonado e
caracterizado por Choo et al., sendo denominado de vírus da hepatite C (HCV)
(Choo et al. 1989). A partir da sua descoberta, uma variedade de testes
sorológicos foi desenvolvida para o diagnóstico, mostrando que o HCV era
responsável pela maioria dos casos de hepatites não-A e não-B de transmissão
parenteral (Clarke 1997, Major & Feinstone 1997, Purcell 1997).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) baseia-se nos estudos de
prevalência em voluntários a doadores de sangue, para estimar a prevalência de
infecção do HCV em todo o mundo, que é de 3%, representando
aproximadamente 170 milhões de pessoas. Dessas, 130 milhões são portadoras
crônicas e, existem cerca de três a quatro milhões de novos casos por ano (OMS
2000).
A hepatite C é uma infecção de ocorrência mundial, mas sua prevalência
difere geograficamente, com padrão de endemicidade mais ou menos relacionado
ao desenvolvimento sócioeconômico, bem como aos diferentes fatores de risco
associados à transmissão da infecção nas diferentes populações (0,6% em
doadores de sangue até 80% em usuários de drogas injetáveis) (Kim 2002,
Wasley & Alter 2000, Yen et al. 2003).
A transfusão de sangue era o meio mais eficiente de transmissão do HCV
(Alter 1995, Giangrande 2000, CDC 2002). Na última década, a triagem para
anticorpos contra o HCV (anti-HCV) em bancos de sangue resultou na redução
substancial do risco transfusional (Prati 2002, Busch et al. 2003). Apesar desta
medida, infecções ocasionais ainda ocorrem devido ao período de janela
11
imunológica nos doadores. A introdução da tecnologia de amplificação de ácidos
nucléicos (NAT) para a detecção do RNA viral tem proporcionado uma maior
segurança do sangue e derivados transfundidos (Kleinman et al. 2006).
A característica mais importante do HCV é sua capacidade de induzir a
persistência da infecção em 75% a 85% dos casos, tornando-a um sério problema
de saúde pública. Aproximadamente 20% dos portadores crônicos desenvolvem
cirrose e, alguns destes, carcinoma hepatocelular (HCC) (Lauer & Walker 2001,
Hoofnagle 2002, Seeff 2002, Kew et al. 2004).
1.2. Características do Vírus da Hepatite C
O vírus da hepatite C pertence à família Flaviviridae, gênero Hepacivirus
(ICTV 2006).
O HCV é um vírus esférico com aproximadamente 50 nm de diâmetro, que
possui um nucleocapsídeo icosaédrico e, externamente, o envelope, derivado da
membrana do retículo endoplasmático (RE) da célula hospedeira, onde as
glicoproteínas E1 e E2 estão presentes (Flint & Mckeating 2000) (Figura 1).
12
Figura 1 - Representação do vírus da hepatite CFonte: www.viralgenomix.com/pdf/VGXP_brochure05.pdf, modificado. Acesso 20 de
setembro de 2006.
A Figura 2 representa o genoma do HCV, que é RNA de fita simples com
polaridade positiva, com aproximadamente 9500 nucleotídeos (nt). Este apresenta
em suas extremidades 5' e 3', regiões não codificantes (NC) e, entre elas, uma
longa seqüência aberta para leitura (ORF) com aproximadamente 9000 nt, que
codifica uma poliproteina de 3000 aminoácidos (aa), precursora das proteínas
estruturais, capsídeo ou core (c) e envelope: E1 e E2, e não estruturais: NS2,
NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B, além de P7, que são clivadas por proteases
celulares e virais no RE durante a replicação (Major & Feinstone 1997, Okamoto
et al. 1997, Purcell 1997, Flint & Mckeating 2000).
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Figura 2 - Representação esquemática do genoma e proteínas do HCVFonte: www_med_uni-heidelberg_de-hyg-hyg5-EN-images-
processing_jpg_arquivos\HCV.htm, modificado. Acesso 20 de setembro 2006.
A região 5' NC, com aproximadamente 340 nt, forma uma estrutura stem-
loop, que contém um sítio de entrada interna para ribossomos (IRES),
responsável pela iniciação e controle da tradução do RNA viral. Esta região é a
mais conservada do genoma, sendo alvo para detecção do RNA-HCV (Clarke
1997, Major & Feinstone 1997, Purcell 1997, Flint & Mckeating 2000).
A região 3' NC tem um comprimento variável (170-250 nt), sendo dividida
em três domínios: uma seqüência de 22-66 nt, uma cauda de poly (U) de 30-180
nt (altamente variável entre os diferentes genótipos) e uma região com 98 nt,
designada de 3'X, altamente conservada entre os genótipos do HCV (Clarke
1997, Major & Feinstone 1997, Purcell 1997, Flint & Mckeating 2000).
As proteínas estruturais são caracterizadas pela presença de domínios
hidrofóbicos na região carboxi-terminal, os quais são importantes para a
14
associação com a membrana e subseqüente clivagem por proteases celulares. A
proteína do core, que é o principal componente do nucleocapsídeo, tem
aproximadamente 191 aa, sendo altamente conservada e imunogênica (Clarke
1997; Major & Feinstone 1997, Flint & Mckeating 2000). Essa proteína tem
capacidade de ligação ao genoma, dado seu papel essencial de encapsidação do
RNA na partícula viral (Cristofari et al. 2004, Lyra et al. 2004). Porém, essa
ligação nem sempre é específica para o RNA do HCV, podendo ocorrer com
inúmeras proteínas da célula hospedeira. Tal fato tem implicações sobre as
funções celulares contribuindo para a patogênese viral, particularmente no
desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (Brass et al. 2006, Nguyen et al.
2006).
As proteínas do envelope E1 e E2 são compostas de 191 aa e 426-432 aa,
respectivamente. Em ambas, as seqüências divergem nos diferentes genótipos. A
região mais variável da proteína E2 é chamada de região hipervariável 1 (HVR 1).
Alguns isolados do HCV apresentam uma segunda região hipervariável (HVR 2).
Essa variabilidade é relevante quanto ao escape viral à resposta imune. A
proteína E2 contém sítios de ligação para o receptor CD81, proteína de
membrana encontrada nos linfócitos, células dendríticas, natural killer, endoteliais,
epiteliais, macrófagos, monócitos e hepatócitos. Essas proteínas são essenciais
para o reconhecimento e adsorção vírus-célula (Clarke 1997, Major & Feinstone
1997, Flint & Mckeating 2000).
A proteína p7, localizada na região carboxi-terminal de E2, é um
polipeptídio altamente hidrofóbico de função desconhecida (Bartenschlanger &
Lohmann 2000). As proteínas não - estruturais estão envolvidas na replicação do
vírus. A NS2 (197 aa) é uma metaloprotease, pois é estimulada por zinco, sendo
responsável pela autoclivagem de NS2/3. A região NS3 (651 aa), a primeira
região do vírus a ser identificada, tem várias funções, como helicase, NTpase e
serinoprotease, promovendo a clivagem das outras regiões da poliproteína
(NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A e NS5A/NS5B). A NS4A (54 aa) funciona
como um co-fator para serinoprotease e também participa da hiperfosforilação da
NS5A. A proteína NS4B (261 aa) tem um importante papel na formação do
15
complexo de replicação (Lindström et al. 2006, Yu et al. 2006). A NS5A (447 - 470
aa) é uma fosfoproteína, que contém uma seqüência conhecida como região
determinante da sensibilidade ao interferon (ISDR) e, por último, a região NS5B
(591 aa) é uma seqüência conservada com função de RNA polimerase RNA
dependente (Clarke 1997, Major & Feinstone 1997, Okamoto et al 1997, Flint &
Mckeating 2000).
A característica mais importante do genoma do HCV é sua
heterogeneidade, que difere em sua extensão. As regiões 5 'NC e 3 'NC são
conservadas, assim como a região do core. Em contraste, as regiões mais
heterogêneas são as que codificam as proteínas do envelope E1 e E2 (Major &
Feinstone 1997, Purcell 1997, Flint & Mckeating 2000).
A variação na seqüência é resultado de erros que são casualmente
introduzidos no genoma devido à incapacidade de reparo na leitura pela RNA
polimerase RNA dependente durante o processo de replicação do RNA. Muitas
dessas pequenas incorporações são silenciosas, causando mudanças somente
na seqüência nucleotídica, já outras alteram a seqüência de aminoácidos,
possibilitando ao vírus da hepatite C escapar à resposta imune e, estabelecer
infecção crônica, permitindo a seleção de variantes mais resistentes (Major &
Feinstone 1997, Rodes & Tapias 2000).
De acordo com o sistema proposto por Simmonds et al. (1994), o vírus da
hepatite C foi classificado com base na variabilidade entre os isolados; em grupos
maiores chamados de tipos ou genótipos. Sua melhor distinção é encontrada nas
regiões C, E1 e NS5B, apresentando divergência de 30-50% entre os mesmos
(Major & Feinstone 1997). Os genótipos são subdivididos em subtipos, que
mostram entre si variabilidade de 15-30%. Os isolados de um mesmo subtipo
podem apresentar variações de 5-15%, e quasispécies divergem em 1-5% entre
seqüências do HCV obtidas de um mesmo indivíduo (Major & Feinstone 1997,
Zein 2000, Simmonds et al. 2005).
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Figura 3 - Variação dos tipos e subtipos do HCV
Figura 3 - Árvore filogenética dos tipos e subtipos do HCVFonte: http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/Distances/HCV_variability.html. Acesso 20
setembro de 2006.
Uma total de seis genótipos foram identificados e caracterizados e, uma
grande variedade de subtipos foi descrita. Os genótipos do HCV não são apenas
relevantes para estudos epidemiológicos, mas também para a prática clínica.
Todos os genótipos têm potencial para causar doença no fígado, mas alguns
apresentam menor resposta ao tratamento, como o genótipo 1 quando
comparado aos genótipos 2 e 3 (Okamoto et al. 1997, Kew et al. 2004, Simmonds
et al. 2005).
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62
1.3. Diagnóstico da Hepatite C
Os testes diagnósticos são divididos em duas categorias. Testes indiretos,
baseados na detecção de anticorpos, e testes diretos, que podem detectar,
quantificar e caracterizar o RNA-HCV (Pawlotsky 2002). A detecção de anticorpos
contra antígenos específicos do HCV é a estratégia mais utilizada no diagnóstico
e na triagem em bancos de sangue para hepatite C (Brandão et al. 2001).
O ensaio imunoenzimático (ELISA) de primeira geração tinha apenas um
antígeno como alvo, o polipeptídio c100-3 (NS4). Em 1992, surgiu o ELISA de
segunda geração, que incorporou mais proteínas recombinantes, a c-22-3 (core) e
c33-c (NS3), aumentando a sensibilidade e especificidade, bem como reduzindo o
tempo médio de soroconversão de 16 para 10 semanas. Atualmente, o teste
utilizado é o de terceira geração, o qual foi adicionado antígeno da região NS5,
permitindo a detecção de anticorpos anti-HCV com sete semanas de infecção. A
sua sensibilidade e especificidade chegam a mais de 99% em indivíduos
imunocompetentes (Gretch et al. 1992, Gretch 1997, Colin et al. 2001).
Resultados falso-positivos ocorrem no ELISA, especialmente em
populações com baixa prevalência. Daí a importância dos testes suplementares
ou confirmatórios, como o recombinant immunoblot (RIBA) ou line immunoassay
(LIA), que, ao identificarem anticorpos para antígenos individuais do HCV,
eliminam falso-positivos. Apesar da especificidade ser maior, a sensibilidade é
menor nesses testes (Erensoy 2001).
Resultado anti-HCV reagente ou positivo não indica infecção ativa pelo
HCV, pois pacientes que eliminam o vírus podem permanecer como positivos por
anos. Para tanto, a pesquisa do RNA viral é necessária. O RNA - HCV pode ser
detectado no soro uma a duas semanas após a infecção, sendo indicado em
casos de imunossupressão, resultados indeterminados nos teste confirmatórios,
monitoramento em paciente sob terapia e investigação da infecção em recém-
nascidos, entretanto os níveis de RNA podem flutuar com períodos nos quais o
mesmo não é detectado. Os testes moleculares podem ser influenciados por
18
vários fatores, como a facilidade de degradação do RNA no soro, falso-positivo
devido à contaminação laboratorial e falso-negativo pela ação de inibidores da
reação da cadeia da polimerase (PCR) (Gretch 1997, Erensoy 2001).
Técnicas moleculares são utilizadas para a detecção qualitativa e
quantitativa do RNA viral. Os testes qualitativos informam a presença do RNA. A
RT-PCR é um teste sensível que utiliza a enzima transcriptase reversa para
catalisar a síntese do DNA complementar (cDNA) da região 5' NC do RNA viral, a
seguir a PCR amplifica o cDNA (Medina & Schiff 1995). Outro método
empregado é a amplificação mediada pela transcrição (transcription - mediated
amplification, TMA), destacando-se por sua elevada sensibilidade (Pawlotsky
2002, Gorrin et al. 2003). Os testes quantitativos determinam a carga viral, ou
seja, a concentração do RNA-HCV em UI/ml. O teste branched DNA (bDNA) e a
PCR em tempo real são exemplos de ensaios quantitativos (Erensoy 2001).
A genotipagem do HCV pode ser feita pela análise de seqüências do
genoma viral completo ou das regiões 5' NC, core ou NS5B, sendo a última a
mais indicada. Outras metodologias têm sido empregadas, como a hibridização
reversa com sondas genótipo-específicas (line probe assay - LiPA - região 5’ NC),
RFLP (restriction fragment length polymorphism - 5’ NC) e a amplificação
genótipo-específica com primers da região core (Nakao et al. 1991, Stuyver et al.
1995, Ohno et al.1997). Esses ensaios podem identificar os seis tipos e principais
subtipos do HCV (Pawlostky 2002). Além desses, a sorotipagem, baseada na
detecção de anticorpos para os antígenos das regiões core ou NS4, permite a
identificação dos seis tipos, mas não dos subtipos do HCV (Tisminetzky et al.
1995, Beld et al. 1998).
O antígeno do core do HCV é um outro marcador viral, que está sendo
testado, podendo ser detectado e quantificado por ensaio imunoenzimático
(Ortho-Clinical Diagnostics Raritan, NJ). Os níveis desse antígeno correlacionam-
se com os do RNA-HCV, logo o mesmo parece ter potencial para ser usado como
um marcador de replicação viral nas várias situações que o RNA viral é detectado
(Bouvier-Alias et al. 2002).
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A biópsia hepática é indicada quando há marcadores virais (anti-HCV e
RNA viral) positivos e aumento dos níveis de alanina aminotransferase (ALT),
mostrando o grau de fibrose e da atividade inflamatória (Strauss 2001).
1.4. Aspectos Epidemiológicos da Infecção pelo HCV
1.4.1.Transmissão
A transmissão do HCV ocorre principalmente por via parenteral, isto é,
contato com sangue infectado. A transfusão de sangue foi o principal veículo de
transmissão viral até o início da década de 90, quando se tornaram obrigatórios
testes sorológicos para anti-HCV nos bancos de sangue. De acordo com Yen et
al. (2003), o risco atual de transmissão do HCV é de 0,001% por unidade de
sangue transfundido. Apesar do decréscimo na incidência da transmissão pós-
transfusional do HCV, a prevalência continua elevada devido a ocorrência de
outros meios de transmissão, sendo o principal o uso de drogas ilícitas, com
destaque para os usuários de drogas injetáveis, que são responsáveis por
aproximadamente 50% dos novos casos de hepatite C (Hahn et al. 2001,
Verachai et al. 2002, Rhodes et al. 2006, Shapatava et al. 2006).
Uma outra forma parenteral de transmissão é a ocupacional, cuja
incidência média de soroconversão para anti-HCV é de 1,8%, variando de 0% -
7% em profissionais de saúde, após exposição percutânea (CDC 2001).
Procedimentos como tatuagem, acupuntura e percing, isto é, que utilizam material
perfuro-cortante, podem ser responsáveis pela transmissão do HCV (Bruguera &
Tapias 2000, Rodés & Tapias 2000, Strauss 2001, Yen et al. 2003).
A transmissão nosocomial é importante, principalmente, em pacientes sob
hemodiálise, com taxas de prevalência variando de 3% a 70% entre os centros de
diálise (Vladutiu et al. 2000, Finelli et al. 2005). Os principais fatores de risco para
a ocorrência de infecção pelo HCV nesses pacientes incluem antecedentes de
20
transfusão, tempo de hemodiálise e tipo de diálise. O risco de adquirir o HCV em
hemodiálise está estimado em 10% por ano (Meyers et al. 2003).
Outras formas de transmissão não-parenterais incluem a transmissão
sexual, menos freqüente que na hepatite B e mais restrita às pessoas com
múltiplos parceiros, que não usam preservativos, apresentam história de doença
sexualmente transmissível (DST) e outras atividades sexuais de risco. A
transmissão vertical também é pouco eficiente, com uma prevalência menor que
5%. Já em mães co-infectadas com HIV, esse índice é de aproximadamente 20%
(Bruguera & Tapias 2000, Rodés & Tapias 2000, Strauss 2001).
1.4.2. Soroprevalência e Distribuição Geográfica dos Genótipos
A Organização Mundial de Saúde estima uma prevalência global da
infecção pelo HCV de 3%, representando aproximadamente 170 milhões de
pessoas (OMS 2000). Essa estimativa é baseada em estudos de prevalência em
voluntários a doadores de sangue. Na população em geral, as taxas da infecção
são mais altas, devido a não exclusão de pessoas com mais de 60 anos de idade
e que apresentam fatores de risco (Wasley & Alter 2000).
Embora o HCV tenha uma distribuição mundial, as taxas de prevalência
diferem geograficamente. Os países mais desenvolvidos, em geral, apresentam
taxas baixas a intermediárias, já os países em desenvolvimento mostram índices
altos de infecção pelo HCV. Nessas populações, a manutenção da prevalência
alta resulta do desconhecimento da infecção, suas vias de transmissão e dos
cuidados preventivos (Shepard et al. 2005).
21
Figura 4 - Prevalência global da hepatite C
Fonte: C/WHO 1999.
O Egito é o país com a maior prevalência no mundo (17% a 26%). As altas
taxas encontradas naquele país são devido à transmissão por seringas utilizadas
nas campanhas de tratamento da esquistossomose entre 1960 e 1970, assim
como na Índia, cuja prevalência também está associada às campanhas para o
tratamento do kalazar (Kew et al. 2004, Shepard et al. 2005).
Por outro lado, índices baixos (0,01% a 0,02%) de infecção pelo HCV
foram verificados em doadores de sangue no Reino Unido e norte da Europa. Já
taxas intermediárias (1% a 5%) são observadas no sul da Europa, Oriente Médio
e Índia subcontinental (Conte 2000, Jain et al. 2003, Yen et al. 2003).
22
Na América Latina, os dados sobre prevalência são limitados. A
prevalência mais baixa (0,7%) foi encontrada no Equador e na Venezuela, e a
mais alta (2,3%) na Colômbia (Robinson et al. 1996). Posteriormente, Munoz et
al. (1998) avaliaram doadores de sangue no Chile e encontraram uma prevalência
de 0,3% para o anti-HCV.
No Brasil, as taxas de prevalência variam entre as regiões geográficas.
Estudos em doadores de sangue mostraram índices de 0,34% na Região Sul
(Santa Catarina) a 5,9% na Região Norte (Amazônica) (Rosini et al. 2003,
Fonseca & Brasil 2004).
Em Goiás, os índices diferem dependendo do grupo de estudo, sendo de
0% em crianças provenientes de creches, 0,2% em escolares, 0,7% em
profissionais de hemodiálise, 0,9% em gestantes, 1% e 3% em meninos na/de
rua, respectivamente, 1,4% em doadores de sangue, 1,9% em indivíduos com
doença reumática, 16,1% em transplantados renais, 16,5% em pacientes em
hemodiálise, 63,3% em hemofílicos (Martins et al. 1994, 1995a, b, Barbosa et al.
2002, Lopes et al. 2002, Barbosa et al. 2005, Carneiro et al. 2005, Botelho 2005).
Os genótipos 1, 2 e 3 e seus subtipos são distribuídos mundialmente. Já o
genótipo 4 é mais encontrado no Zaire e Egito e, os genótipos 5 e 6 e suas
variantes, na África do Sul e Ásia, respectivamente. Na Europa, o subtipo 1a é
mais prevalente em indivíduos jovens, que têm como fator de risco o uso de
drogas injetáveis. Já o subtipo 1b é mais comum em adultos que relataram
transfusão de sangue, sendo responsável por aproximadamente 73% dos casos
de hepatite C no Japão (Zein 2000, Nakano et al. 2004).
No Brasil, foram encontrados os genótipos 1, 2, 3, 4 e 5. Em todas as
regiões, o genótipo 1 foi o mais freqüente. Já os genótipos 4 e 5 foram detectados
somente na Região Sudeste (São Paulo) (Martins et al. 1998, Oliveira et al. 1999,
Levi et al. 2002, Campiotto et al. 2005, Martins et al. 2006).
23
1.5. Aspectos Clínicos e Tratamento da Hepatite C
A infecção pelo HCV pode apresentar diferentes formas clínicas de
gravidade variável. O HCV causa, inicialmente, hepatite aguda, que apresenta
duas características marcantes, ser assintomática e evoluir para a cronicidade. O
período de incubação é de oito semanas, podendo variar de 2 a 26 semanas. A
infecção é assintomática em 75% a 85% dos casos, e, quando sintomática, as
manifestações clínicas observadas são mal-estar, distúrbios digestivos, colúria e
ocasionalmente acompanhada de icterícia. A hepatite fulminante pelo HCV é rara
(Rodes & Tapias 2000, Kew et al. 2004). A hepatite C aguda apresenta cura em
aproximadamente 15% a 25% dos casos (Castellano 2000).
O início da hepatite C crônica é raramente identificado, sendo
caracterizado pela persistência do RNA-HCV no soro por mais de seis meses. A
cronicidade pode causar cirrose e/ou HCC, que é a maior causa de transplante
hepático (Poynard et al. 2003). A intensidade dessas alterações pode variar de
paciente para paciente. Ao longo do tempo, a hepatite C crônica pode acometer
diversos órgãos, como a pele, o sistema músculo - articular, os nervos periféricos
e os rins, culminando com várias manifestações extra-hepáticas (Conte 2000,
Rodes & Tapias 2000).
Vários estudos demonstraram a influência de alguns fatores na rápida
progressão para a cirrose, como sexo masculino, idade avançada (>40 anos),
consumo de álcool, co-infecção HCV/HIV e HCV/HBV e alto grau de fibrose no
início da infecção. Em pacientes com intensa fibrose, o desenvolvimento da
cirrose é mais freqüente e mais rápido, podendo ser menor que 20 anos. Em
pacientes com progressão intermediária, a cirrose pode aparecer dentro de 20 a
50 anos (Catellano 2000, Conte 2000, Rodes & Tapias 2000, Kew et al. 2004).
Indivíduos com hepatite C crônica sem tratamento raramente eliminam o
vírus espontaneamente. O objetivo principal do tratamento é a eliminação do
HCV, contudo outros são importantes, como prevenção da cirrose e suas
24
complicações, redução das manifestações extra-hepáticas e prevenção da
transmissão para outros indivíduos (Poynard 2003).
O interferon-alfa (IFN-α) foi o primeiro medicamento indicado para o
tratamento da hepatite C crônica, sendo licenciado em 1991 (Lau et al. 1998). As
taxas de resposta virológica com o uso da monoterapia com IFN-α foram de 6% a
12%, depois de 24 semanas de tratamento, e de 12% a 20% após o curso de 48
semanas. Com a adição da ribavirina (RB), um antiviral que interfere na
biossíntese da guanosina trifosfato, a resposta virológica aumentou para 38% a
43% (Meyers et al. 2003).
O tratamento com IFN-α e RB está associado a diversos efeitos colaterais,
tais como: anemia, alterações de comportamento, depressão, dentre outros.
Desse modo, o tratamento não é indicado para todos os indivíduos. Pacientes
com recomendação para tratamento não devem apresentar contra-indicações que
compliquem com os diversos efeitos adversos, no entanto devem apresentar
níveis elevados das transaminases, fibrose progressiva e elevada carga viral
(Heathcote & Main 2005).
O IFN-α apresenta uma meia-vida curta no organismo (aproximadamente 8
horas), ocasionando flutuações do fármaco no plasma durante o tratamento. Nos
pacientes tratados com IFN-α três vezes por semana, foi observado um aumento
intermitente da carga viral nos dias sem medicação. Mais recentemente, foram
introduzidas formas peguiladas de interferon (peginterferon), cuja formulação
resulta da ligação do IFN-α recombinante a uma molécula de polietilenoglicol
(PEG), que forma um “escudo protetor” impedindo a degradação enzimática do
interferon, diminuindo sua taxa de eliminação, além de determinar uma liberação
lenta e progressiva do mesmo, com isto há aumento de sua vida média,
mantendo o nível sérico por mais tempo, permitindo aplicação semanal, e
diminuindo, assim, os efeitos colaterais e consequentemente melhorando a
eficácia do medicamento (Zeuzem et al. 2000, Meyers et al. 2003). Heathcote et
al. (2000), Zeuzem et al. (2000) e Lindsay et al. (2001), em seus estudos com
peginterferon em monoterapia, demonstraram taxas de resposta virológica
25
sustentada de 30%, 39% e 23%, respectivamente, isto é de duas a três vezes
maiores que com o interferon convencional. Hadziyannis et al. (2002)
compararam as taxas de respostas ao peginterferon combinado com diferentes
doses de RB (800, 1000 e 1200 mg) e diferentes durações (24 ou 48 semanas),
mostrando índices melhores de resposta com doses maiores de RB em 48
semanas de tratamento para pacientes com genótipo 1, sendo semelhantes para
os genótipos 2 e 3, por 24 semanas.
Portanto, o genótipo tem um papel importante na resposta à terapia. O
genótipo 1 apresenta menor resposta ao tratamento, variando de 40% a 50%. Já
nos infectados com os genótipos 2 e 3, as taxas foram de 70% a 80% (Fried et al.
2002, Hugle & Cerny 2003).
1.6. Prevenção e Controle da Infecção pelo HCV
A hepatite C continuará sendo um importante problema de saúde pública
neste século, podendo aumentar o número de pessoas com doenças hepáticas
que necessitam de transplantes (Howie & Hutchinson 2004).
Mesmo com os recentes avanços no tratamento da infecção pelo HCV, em
geral, a influência da terapia na população de pessoas com hepatite C crônica é
relativamente pequena, porque a maioria dos pacientes infectados não está sob
tratamento (Kew et al. 2004). A vacinação seria o meio mais efetivo para a
prevenção, mas ainda não está disponível. Alguns fatores dificultam o
desenvolvimento da vacina contra a hepatite C, como a falta de um modelo
animal adequado, alto grau de diversidade genômica e insucesso no cultivo viral
em grande quantidade in vitro (Berzofsky et al. 2004).
Com o advento dos testes de triagem sorológica para anti-HCV em bancos
de sangue, houve uma redução importante do risco de infecção por via
transfusional. No Brasil, a Portaria Nº 1.376 do Ministério da Saúde (MS), de 19
de novembro de 1993, passou a exigir a pesquisa de anti-HCV na triagem dos
26
doadores de sangue, tendo entrado em vigor em dezembro do mesmo ano
(Ministério da Saúde 1993).
A prevenção e o controle da hepatite C procuram reduzir a ocorrência de
novos casos e o risco de doença hepática crônica em pessoas infectadas (Kew et
al. 2004). A estratégia de prevenção baseia-se na orientação dos portadores do
HCV no sentido de minimizar os riscos de transmissão aos susceptíveis. Assim,
todos os portadores deveriam ser referenciados para avaliação e tratamento
médico, informados para não doarem sangue, órgãos, tecidos ou sêmen e não
compartilharem objetos de higiene pessoal (Alter 2002).
1.7. Afro-descendentes de Comunidades Isoladas de Goiás
Quilombos são comunidades de negros originalmente formados por
descendentes de escravos africanos trazidos ao Brasil, que fugiram de seus
cativeiros devido aos maus tratos, exploração e castigos nos engenhos e minas.
Mais tarde, essas comunidades expandiram-se devido à migração de escravos
alforriados (Ministério da Educação 2001).
No nordeste goiano, o povoamento dos vãos e serras por escravos
africanos e seus descendentes originou o território kalunga, no início do século
XVIII. Seus antepassados eram escravos africanos trazidos pelos portugueses ao
Brasil, para as regiões de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Tocantins, Goiás,
Bahia e Minas Gerais. Acredita-se que os kalungas sejam oriundos de tribos da
região do Congo, Sudão, Angola e outras localidades próximas à costa oeste da
África (Baiocchi 1999).
O território Kalunga surgiu na época em que os Bandeirantes paulistas
chegaram até às terras de Goiás, em 1722. Toda a área que eles ocupam, cerca
de 237 mil hectares, foi reconhecida oficialmente, em 1991, como Sítio Histórico e
Patrimônio Cultural Kalunga. Hoje, eles ocupam um território que abrange parte
dos municípios de Cavalcante, Monte Alegre e Teresina de Goiás, no nordeste do
Estado de Goiás (Figura 5) (Baiocchi 1999, Ministério da Educação 2001).
27
Figura 5 - Localização geográfica da população Kalunga Fonte: http://www.agdr.goias.gov.br/prog_desenv_nordeste.htm
A necessidade dos Kalungas formarem uma comunidade representava sua
liberdade. Eles viveram por muito tempo longe das cidades e, até bem pouco
tempo atrás, não conheciam as coisas do mundo moderno. O modo de vida dessa
população é rústico (Figuras 6 e 7), suas casas são simples, feitas de adobe e
madeira, o telhado de palha e o chão de terra batida (Figura 8). O fogão é a
lenha, as panelas e roupas são lavadas nos rios, assim como o banho. Não há
eletricidade, o índice de analfabetismo e a taxa de natalidade são altos, sendo o
alcoolismo um dos maiores problemas (Ministério da Educação 2001, Silva 2003).
28
No dia-a dia, os Kalungas vivem da agricultura de subsistência, com o
cultivo de mandioca, arroz, fumo, milho, feijão, gergelim, inhame, abóbora, além
das hortas e pomares. Eles também criam gado, aves e porcos e praticam a caça
e a pesca. A produção de farinha de mandioca é uma das atividades mais
importantes, envolvendo toda a família, como se fosse um ritual (Baiocchi 1999,
Ministério da Educação 2001).
29
Figura 6 - Povo Kalungahttp://photos1.blogger.com/x/blogger/4879/4291/1600/829055/32.jpg
Figura 7 - Mulheres Kalunga trabalhando em artesanatohttp://www.brasiloeste.com.br/fotosmat/kalunga_01.jpg
Figura 8 - Casa Kalunga feita com adobe e palha http://www.unb.br/acs/bcopauta/arquitetura5.htm
1.8. Justificativa
A infecção pelo HCV é a causa mais comum de doença hepática crônica
na atualidade, representando um sério problema de saúde pública, tanto nos
países desenvolvidos, como nos em desenvolvimento. A hepatite C afeta todos os
segmentos da população, independente da etnia, sexo ou idade, e sua
prevalência varia entre as diferentes regiões e subpopulações (Yen et al. 2003).
No Brasil, as taxas de prevalência da infecção pelo HCV variam entre as
cinco regiões geográficas (Carrilho & Corrêa 1998). Em Goiás, os índices diferem
dependendo do grupo de estudo, sendo de 0% em crianças provenientes de
creches, 0,2% em escolares, 0,7% em profissionais de hemodiálise, 0,9% em
gestantes, 1% e 3% em meninos na/de rua, respectivamente, 1,4% em doadores
de sangue, 1,9% em indivíduos com doença reumática, 16,1% em transplantados
renais, 16,5% em pacientes em hemodiálise e 63,3% em hemofílicos (Martins et
al. 1994, 1995a, b, Barbosa et al. 2002, Lopes et al. 2002, Barbosa et al. 2005,
Carneiro et al. 2005, Botelho 2005).
Até a presente data, nenhuma investigação sobre a infecção pelo HCV foi
conduzida em populações quilombolas brasileiras. Então, além do impacto da
hepatite C na saúde pública, este consiste no primeiro estudo realizado em
comunidades isoladas de afro-descendentes no Brasil, visando conhecer a
prevalência da infecção pelo HCV, os fatores associados e os genótipos virais na
população Kalunga de Goiás.
30
2. OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivo geral analisar o perfil sorológico e
molecular da infecção pelo vírus da hepatite C em afro-descendentes de
comunidades isoladas de Goiás.
Objetivos específicos:
Determinar a prevalência global da infecção pelo HCV na população Kalunga,
através da detecção de anticorpos anti-HCV e do RNA viral;
Verificar as características associadas à infecção pelo vírus C nestes indivíduos;
Identificar os genótipos do vírus C circulantes na população estudada.
31
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. População Estudada
Este é um estudo observacional, analítico, de corte transversal, em afro-
descendentes de comunidades isoladas de Goiás. Os Kalungas ocupam uma
área de 237 mil hectares, a 600 km ao norte de Goiânia, nos municípios de
Cavalcante, Teresina de Goiás e Monte Alegre. A população total é constituída de
aproximadamente 3000 indivíduos (dados fornecidos pelo Governo do Município
de Cavalcante), que vivem isolados nos vãos entre serras as margens de rios,
formando as comunidades de Vão de Almas, Vão do Muleque e Engenho.
Para conseguir uma prevalência estimada da infecção pelo HCV em torno
de 0,5%, com uma precisão de 0,4%, fez-se necessário estudar o mínimo de 855
indivíduos, considerando um poder estatístico de 80% (β=20%) e em nível de
significância de 95% (α=0,05). Este estudo foi realizado em 878 afro-
descendentes pertencentes às três comunidades (Vão de Almas, Vão do Muleque
e Engenho) e mais algumas famílias Kalungas que moravam na periferia de
Cavalcante, as quais vieram dessas comunidades em busca de melhores
condições de vida.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade
Federal de Goiás.
32
3.2. Entrevista e Coleta de Sangue
As entrevistas foram realizadas após informação prévia da população
sobre os objetivos, metodologia da pesquisa e a assinatura do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, ou da coleta de impressão digital dos
indivíduos analfabetos. Para menores de idade, o referido termo foi assinado
pelos pais ou responsáveis. Foi usado um questionário padronizado, visando à
obtenção de dados relevantes para o estudo. A primeira parte constituiu-se de
informações sócio-demográficas como idade, sexo, estado civil, escolaridade,
renda familiar, ocupação e, a segunda, de possíveis fatores associados à infecção
pelo vírus da hepatite C tais como: história de transfusão de sangue, cirurgia,
compartilhamento de objetos cortante de higiene pessoal, hospitalização,
tratamento dentário, número de parceiros sexuais e doença sexualmente
transmissível (em anexo).
Em maio de 2004, foi realizada uma visita às comunidades Kalungas, para
divulgação do estudo e agendamento das entrevistas e coletas de sangue,
realizados em julho de 2004, em escolas e centros comunitários da cidade de
Cavalcante.
Após a entrevista, foram coletados 10 ml de sangue e colocados em tubo
de ensaio identificado com as iniciais do nome e o número correspondente ao
questionário. Todas as amostras coletadas foram levadas ao laboratório do
Hospital Municipal de Cavalcante, onde foram centrifugadas e os soros
aliquotados em dois tubos, e a seguir congelados. Posteriormente, foram
transportados para o Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás, em Goiânia, onde foram mantidos a -20º C até a
realização dos testes laboratoriais.
33
3.3. Detecção do Marcador Anti-HCV
Os soros coletados foram testados para a detecção de anticorpos para o
HCV pelo ensaio imunoenzimático (ELISA) de terceira geração, empregando-se
reagentes comerciais (Bioelisa HCV, Biokit). Resumidamente, os soros testes e
os controles negativos e positivos foram incubados em uma placa sensibilizada
com uma mistura dos antígenos core, NS3, NS4 e NS5 do HCV. Quando a
amostra apresentava anticorpos específicos para o HCV, formou-se um complexo
estável com os antígenos do HCV que recobriam cada câmara. Após a lavagem
para remoção de todo o material não ligado, adicionou-se o conjugado (anti-
imunoglobulina humana marcado com peroxidase), que se ligava ao complexo
antígeno-anticorpo. Após a incubação e lavagem, foi adicionada a solução
cromógena de tetrametilbenzidina (TMB) juntamente com substrato da enzima
(peróxido de hidrogênio), o que resultou na aparição de cor azul quando a
amostra era positiva. A cor azul passou à amarela, depois do bloqueio da reação
com o ácido sulfúrico 1N. A intensidade da cor foi proporcional à concentração de
anticorpos anti-HCV na amostra. O resultado foi obtido pela razão entre o valor da
absorbância de cada uma das amostras e o valor do cut-off da placa (este valor
foi obtido somando 0,300 à média de valores dos controles negativos).
As amostras reagentes no Elisa foram retestadas pelo teste confirmatório
line immunoassay -LIA (INNO-LIA HCV Ab, Innogenetics, Bélgica). Estes soros,
assim como os controles negativos e positivos, foram incubados com os
antígenos core, E2, NS3, NS4 e NS5, fixados separadamente em fitas de plástico
recobertas com nylon. Anticorpos específicos do HCV, caso presentes na
amostra, fixaram-se nas linhas antigênicas individuais do HCV das tiras.
Posteriormente, após a lavagem das fitas, adicionou-se o conjugado (anti-
imunoglobulina humana ligada à fosfatase alcalina) e realizou-se novo processo
de incubação e lavagem. Em seguida, as fitas foram incubadas com o substrato
(bromo-cloro-indol-fosfato - BICP em dimetil formamida). A reação foi bloqueada
com a adição de ácido sulfúrico 0,1 M. Os resultados positivos e negativos foram
determinados visualmente, comparando-se a intensidade de cor das linhas
34
correspondentes aos diferentes antígenos com as linhas dos controles, conforme
as especificações do fabricante.
3.4. Detecção do RNA-HCV e Genotipagem
As amostras positivas para a detecção de anticorpos pelo ELISA foram
testadas para a detecção do RNA-HCV pela RT-PCR (transcrição reversa-reação
da polimerase em cadeia). O RNA foi extraído pelo método fenol/clorofórmio e
isotiocianato de guanidina (Chomczynski e Sachi, 1987) usando-se 100 µl do soro
de cada indivíduo. O RNA obtido foi ressuspenso em 12 µl de água tratada com
dietilpirocarbonato (inativador de ribonuclease). A transcrição reversa foi realizada
com o iniciador randômico (Invitrogen), 200 U da transcriptase reversa do vírus de
leucemia de Moloney (Invitrogen) e 0,2 mM de cada dNTP (Armesham,
Bioscience), em um volume final de 24 µl (12 µl de RNA + 12 µl da mistura da TR)
a 42ºC, durante um período de 90 minutos. Aproximadamente 8 µl do cDNA foram
amplificados por nested PCR com iniciadores específicos para a região 5’ NC. Na
primeira PCR, foram utilizados iniciadores externos
{(CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTC) homólogo à posição -305 e
(ATGGTGCACGGTCTACGAAGACCTCC) homólogo à posição 2}. A PCR-1 era
constituída de um volume final de 50 µl, na presença de 0,2 mM de cada dNTP, 3
mM de MgCl2 e 1 U da enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen). Após este
preparo, a reação foi colocada no termociclador, onde o DNA foi desnaturado por
aquecimento a 94ºC por dois minutos, amplificado durante 35 ciclos a 94ºC por 15
segundos, a 50ºC por 45 segundos e a 72ºC por um minuto, seguido por um
alongamento de sete minutos a 72ºC.
Após a realização da primeira PCR, 2 µl do produto obtido foi novamente
amplificado utilizando primers internos {(TTCACGCAGAAAGCGTCTAGCC)
homólogo à posição -279 e (GGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGG) homólogo à
posição -26}, nas mesmas condições descritas acima, exceto pelo aumento da
concentração do MgCl2 para 5 mM, segundo Ginabreda et al. 1997.
35
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
1,5% contendo brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta em um
transluminador.
Para evitar contaminação, a extração e transcrição reversa do RNA, a
preparação de reagentes pré-PCR, amplificação do DNA e a eletroforese em gel
dos produtos da PCR foram realizados em salas separadas.
Todas as amostras positivas para RNA-HCV foram genotipadas pelo
método line probe assay (INNO-LiPA, Innogenetics, Bélgica), que permite uma
fácil e rápida determinação dos seis genótipos do HCV e seus subtipos. As
seqüências genômicas de cDNA destas amostras foram novamente amplificadas
pela PCR com iniciadores biotinilados complementares à região 5’ NC do genoma
do HCV. O princípio deste ensaio consiste na hibridização reversa de produtos
biotinilados da PCR com sondas tipo-específicas previamente imobilizadas em
linhas paralelas nas tiras da membrana de nitrocelulose. Após hibridização, foi
adicionada uma solução de estreptoavidina marcada com fosfatase alcalina que
se liga ao híbrido biotinilado formado anteriormente. A revelação deste método
consiste no desenvolvimento de cor púrpura nas amostras positivas, após a
adição do substrato (BICP e nitro blue tetrazolium - NBT). A reatividade dos
fragmentos amplificados em uma ou mais linhas sobre as tiras permite o
reconhecimento dos seguintes genótipos do HCV: 1a, 1b, 1a/1b, 1, 2a/2c, 2b, 2,
3a, 3b, 3c, 3, 4a, 4b, 4c/4d, 4e, 4f, 4h, 4, 5a e 6a.
3.5. Processamento e Análise dos Dados
Os dados das entrevistas, como também os resultados dos testes
sorológicos e moleculares, foram digitados e analisados no programa Epi-Info
versão 6.04 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta. GA).
Procedeu-se a análise descritiva, por meio de distribuição de freqüências,
cálculo da média de idade e seu desvio padrão. As taxas de prevalência para o
HCV foram calculadas com seus respectivos intervalos de confiança de 95%.
36
4. RESULTADOS
A Tabela 1 mostra as características sócio-demográficas dos 878 afro-
descendentes estudados da população Kalunga, no Estado de Goiás. A média de
idade foi de 28,3 anos, variando de um a 88 anos. Em relação ao sexo, houve
predominância do feminino (60,1%).
Em relação ao estado civil, 52,7% dos entrevistados eram solteiros,
44,1% casados ou relataram união consensual e 3,2% referiram ser separados ou
viúvos.
O nível de escolaridade foi predominantemente baixo, 34,0% referiram
não possuir qualquer instrução, 60,9% o 1º grau, 5,0% o 2º grau e apenas um
indivíduo 0,1% o 3º grau.
Analisando a renda familiar, constatou-se que 94,3% dos indivíduos
estudados relataram renda familiar inferior ou igual a um salário mínimo (sm),
5,6% declararam receber entre dois e quatro sm e somente um indivíduo referiu
um valor acima de cinco sm.
Quanto à ocupação, 66,0% eram lavradores, 14,5% do lar, 10,2%
estudantes e 9,3% desempenhavam outros tipos de funções, tais como:
comerciante, agente de saúde, professor, doméstica, parteira, técnico em
enfermagem e cozinheiro.
37
TABELA 1 - Características sócio-demografícas de 878 indivíduos da população Kalunga, Goiás
Características N %
Média de idade (dp) 28,3 (19,9)
Sexo Masculino 350 39,9 Feminino 528 60,1
Estado Civil Solteiro 463 52,7 União consensual/Casado 387 44,1 Separado/Viúvo 28 3,2Escolaridade* Nenhum 262 34,0 1º grau 471 60,9 2º grau 39 5,0 3º grau 1 0,1
Renda Familiar
≤ 1 salário 828 94,3 2-4 salários 49 5,6 ≥ 5 salários 1 0,1
Ocupação**
Lavrador 399 66,0 Do lar 88 14,5 Estudante 62 10,2 Outra 56 9,3
dp: desvio-padrão. *No cálculo foram excluídas as crianças com menos de 6 anos de idade (n=773). **Foram excluídas as crianças com idade inferior a 14 anos (n=605).
A Tabela 2 apresenta as freqüências para características de risco para
infecção pelo HCV na população Kalunga, sendo que a mais freqüente foi
tratamento dentário (68,1%), realizado em campanhas feitas nas comunidades.
Apesar de hospitalização e cirurgia terem sido relatadas por 49,2% e 21,9% dos
indivíduos, respectivamente, apenas 48 (5,5%) receberam transfusão de sangue,
38
sendo que a maioria destes de uma a três transfusões (42/48) e após 1994
(sangue triado para anti-HCV) (32/48). Compartilhamento de objeto cortante de
higiene foi relatado por 42,7% dos Kalungas, sendo que os objetos mais utilizados
foram: alicates, cortadores de unha, pinças e navalhas. Características de risco
como história de DST (12,5%) e número de parceiros sexuais acima de cinco
(27,8%) foram menos freqüentes. Não se observou relato de uso de drogas
injetáveis, tatuagem e piercing nesta população.
Inicialmente, as 878 amostras provenientes da população Kalunga foram
triadas para detecção de anticorpos para o HCV, sendo seis reagentes pelo
ELISA. A soropositividade para anti-HCV foi confirmada pelo LIA em quatro
amostras. Posteriormente, os soros anti-HCV reagentes pelo ELISA foram
submetidos à detecção do RNA viral pela RT - PCR, resultando em três amostras
RNA-HCV positivas. Destas, duas foram positivas para anti-HCV pelo LIA e a
outra negativa. Dessa forma, cinco amostras foram positivas para os marcadores
anti-HCV e/ou RNA-HCV, resultando em uma prevalência global de 0,57% na
população estudada (Tabela 3).
Dentre as amostras ELISA reagentes, a Tabela 4 mostra a reatividade para
anti-HCV no LIA, a detecção do RNA-HCV e a identificação dos genótipos. As
amostras anti-HCV positivas ou LIA reagentes apresentaram reatividade para os
antígenos das regiões core, NS3 e/ou NS4. O genótipo 1 foi encontrado nas três
amostras RNA-HCV positivas, sendo que, a K-270 mostrou co-infecção pelos
genótipos 1 e 3.
TABELA 2 - Características de risco para infecção pelo HCV relatadas pelos Kalungas em Goiás
Características N %
Transfusão de sangueSim 48 5,5
39
Não 830 94,5
HospitalizaçãoSim 432 49,2Não 444 50,6S/inf 2 0,2
CirurgiaSim 192 21,9Não 686 78,1
Compartilhamento de objeto cortante de higieneSim 375 42,7Não 485 55,2S/inf 18 2,1
Tratamento dentárioSim 598 68,1Não 242 27,6S/inf 38 4,3
Nº de parceiros sexuais *Nenhum 51 8,51 - 5 385 63,76 - 10 75 12,411 - 20 38 6,3> 20 55 9,1
Doenças Sexualmente Transmissíveis**Sim 69 12,5Não 484 87,5
* Foram excluídos os indivíduos com idade inferior a 12 anos (n=604).** Foram excluídos os indivíduos sem atividade sexual (n=553).
TABELA 3 – Prevalência da infecção pelo HCV em 878 indivíduos da população Kalunga, no Estado de Goiás PositivoMarcador N % IC 95%Anti-HCV
ELISA 6 0,68 0,28 - 1,56
LIA 4 0,46 0,09 - 1,10
RNA-HCV 3 0,34 0,09 - 1,10
Anti-HCV e/ou RNA-HCV 5 0,57 0,21 - 1,40
40
TABELA 4 - Reatividade para anti-HCV pelo line immunoassay (LIA), detecção do RNA viral e genótipos do HCV dentre as amostras anti-HCV reagentes no ensaio imunoenzimático, Kalungas-Goiás
Amostras LIA RNA-HCV GenótipoK-74 Positivo Negativo -K-270 Negativo Positivo 1a/1b + 3K-554 Positivo Negativo -K-586 Positivo Positivo 1aK-684 Positivo Positivo 1aK-789 Negativo Negativo -
Características de risco (Tabela 5) como hospitalização (3/5), cirurgia (2/5),
compartilhamento de objetos pessoais (lâmina e/ou alicate) (4/5) e tratamento
odontológico (3/5) foram relatados pelos indivíduos infectados pelo HCV.
Contudo, uma menina com 12 anos de idade não relatou qualquer característica
de risco questionada para infecção pelo HCV.
TABELA 5 - Características de risco relatadas pelos Kalungas infectados pelo HCV, Goiás
Paciente Idade Sexo Hospitalização Cirurgia Objeto Dentista (anos) cortante
74 74 F Sim Sim Alicate/Lâmina Não
270 34 M Não Não Lâmina Sim
554 41 M Sim Sim Lâmina Sim
586 41 M Sim Não Alicate/Lâmina Sim
684 12 F Não Não Nenhum Não
M=sexo masculino, F=sexo feminino.
41
5. DISCUSSÃO
A infecção pelo vírus da hepatite C é a causa mais comum de doença
hepática crônica na atualidade, e isto é devido à habilidade do HCV em induzir à
persistência da infecção em até 85% dos casos. Portanto, a hepatite C crônica
representa um sério problema de saúde pública, tanto nos países desenvolvidos,
como nos em desenvolvimento. Sua prevalência é de aproximadamente 3%, isto
é, 170 milhões de pessoas estão cronicamente infectados pelo HCV em todo o
mundo (OMS 2000). A hepatite C afeta todos os segmentos da população,
independente de etnia, sexo ou idade, e sua prevalência varia entre as diferentes
regiões e subpopulações (usuários de droga, hemodialisados, hemofílicos,
42
população em geral, etc) (Yen et al. 2003). No Brasil, poucos estudos
epidemiológicos com base populacional foram realizados (Foccacia et al. 1998).
Portanto, apesar do impacto da hepatite C na saúde pública, há escassez de
investigações sobre esta infecção na população em geral no País, sobretudo em
afro-descendentes. Assim é importante ressaltar que este consiste no primeiro
estudo realizado em comunidades isoladas de afro-descendentes no Brasil.
Analisando as características sócio-demográficas da comunidade Kalunga,
afro-descendente isolada no Estado de Goiás, observou-se que dados como a
média de idade (28,3 anos), predominâncias de pessoas solteiras e do sexo
feminino, foram semelhantes aos verificados em população similar em Mato
Grosso do Sul (MS) (Motta-Castro et al. 2005). Ainda, as famílias dos afro-
descendentes de GO e MS apresentavam baixo nível sócioeconômico e
educacional, vivendo da agricultura de subsistência e da criação de animais, e
suas casas não possuíam sistema de esgoto, água encanada ou energia elétrica.
A prevalência de 0,57% encontrada na população isolada de afro-
descendentes em Goiás foi baixa em relação às mostradas previamente na
cidade de Goiânia. Em 1994, Martins et al., ao avaliarem doadores de sangue,
obtiveram uma prevalência de 1,4% para anti-HCV. Em 1995, os mesmos autores
acharam um índice de 0,9% em gestantes, e de 3% e 1% em meninos de/na rua,
respectivamente (Martins et al 1995 a, b). Barbosa et al. (2002) encontraram uma
prevalência de 63,3% para anti-HCV em hemofílicos e, mais recentemente,
Carneiro et al. (2005) observaram um índice de 16,5% em pacientes em
hemodiálise.
Por outro lado, semelhantemente a prevalência para infecção pelo HCV
nos Kalungas, índices baixos foram verificados em populações isoladas rurais de
vários locais. Em 1993, Abdool & Tait, ao realizarem um estudo em KwaZulu-
Natal, na África do Sul, mostraram a prevalência de anti-HCV em comunidades
urbana e rural de 1,7% e 0,9%, respectivamente. Silva et al. (1995), em Salvador
(Bahia), observaram um índice de 1,25% para área urbana e de 0% para a rural.
Em crianças na área indígena de Xicrin em Altamira, no Estado do Pará, a
43
prevalência encontrada foi de 0% para anti-HCV (Nunes et al. 2004). Ainda,
índices de 0,5% e 0,38% foram observados em nativos da reserva indígena de
Xacriabá, MG (Figueiredo et al. 2000) e em moradores de Monte Negro, um
vilarejo do Estado da Rondônia (Khouri et al. 2005), respectivamente. A
prevalência baixa para anti-HCV encontrada em regiões rurais e em tribos
indígenas, assim como a encontrada nos Kalungas, indica ser esta uma infecção
preferencialmente urbana.
A freqüência de resultados falso-positivos é elevada, especialmente em
populações de baixo risco, apesar do aumento da sensibilidade e especificidade
dos testes anti-HCV (ELISA) de terceira geração (Gretch 1997, Erensoy 2001). Os
testes confirmatórios ou suplementares são utilizados para verificar a verdadeira
positividade para anti-HCV, além de identificarem anticorpos individuais para os
antígenos do vírus (Pawlotsky et al. 1996, Gretch 1997). Neste estudo, o índice de
confirmação da positividade para anti-HCV foi de 66,7% (4/6) pelo LIA. Esse
resultado esta entre os valores achados em outras populações de baixo risco, tais
como: 50,8% em doadores sangue no Distrito Federal (Amorim et al. 2004),
72,2% na população geral de adultos no Chile (Gonzalez et al. 2005) e de 82,0%
em doadores de sangue da Região Centro-Oeste (Martins et al. 2006). Já em
populações de alto risco, como hemodialisados e hemofílicos, os índices de
confirmação aumentaram para 90,1% (Carneiro et al. 2001) e 98,2% (Barbosa et
al. 2002), respectivamente.
Além do teste suplementar para a pesquisa de anticorpos específicos,
confirmando a verdadeira positividade para anti-HCV, foi utilizado também teste
molecular para detecção do RNA-HCV, indicando a presença do vírus. A
freqüência do RNA-HCV encontrada nas amostras anti-HCV-LIA positivas foi de
50,0% (2/4). Este valor foi inferior aos de outros estudos realizados em doadores
de sangue ou na população geral, como de 77,0% (Elghouzzi et al. 2000), 71,9%
(Amorim et al. 2004), 80,5% (Martins et al. 2006), 63 e 65% (Mohamed et al.
2005), mas semelhante (47,7%) ao encontrado por Yacheng et al. (2000) em
transplantados. Na presente investigação, das duas amostras que foram
negativas pelo LIA, uma foi positiva para o RNA-HCV, isto talvez seja explicado
44
pela menor sensibilidade do teste suplementar, ou por este indivíduo encontrar-se
na fase de soroconversão, ou ainda, dependendo do “status” imune, ou seja, em
situação de imunodeficiência, a produção de anticorpos pelo indivíduo estaria
reduzida (Fabrizi & Martin 2001).
O padrão de distribuição dos genótipos do HCV difere geograficamente, e
esta diferença tem reflexo na epidemiologia da infecção. No Brasil, os genótipos
1, 2 e 3 do HCV estão distribuídos por todas as regiões, já os genótipos 4 e 5
foram encontrados em uma freqüência baixa na Região Sudeste (Oliveira et al.
1999, Levi et al. 2002, Campiotto et al. 2005). Neste trabalho, o genótipo 1 foi
identificado nas três amostras RNA-HCV positivas, porém, um indivíduo mostrou-
se co-infectado pelos genótipos 1 (1a/1b) + 3. A presença do genótipo 1 está de
acordo com estudos realizados em diferentes regiões do Brasil (Martins et al.
1998, 2006; Vogler et al. 2004, Campiotto et al. 2005). Na região Centro-Oeste,
Martins et al. (1998) também encontraram uma maior prevalência do genótipo 1
(subtipo 1a) (54,6%), seguido pelo genótipo 3 (subtipo 3a) (31,8%), além do
subtipo 1b (9,1%). Posteriormente, os mesmos autores observaram freqüências
similares de 50,0%, 30,9% e 16,7% para os subtipos 1a, 3a e 1b,
respectivamente, em Goiânia - GO (Martins et al. 2006).
O HCV é transmitido principalmente por via parenteral, sendo a transfusão
de sangue considerada como o principal fator de risco para infecção pelo vírus C
(Alter 1995; Giangrande 2000, CDC 2002). Na população estudada, o relato de
transfusão sanguínea foi verificado em uma baixa freqüência (5,5%), e na maioria
dos casos foi relatado de um a três episódios transfusionais, sendo estes após
1994 (sangue triado para anti-HCV). Ainda não se observou relato de uso de
drogas injetáveis nesta população, que atualmente é o principal fator de risco para
esta infecção (Hahn et al. 2001, Verachai et al. 2002, Rhodes et al. 2006,
Shapatava et al. 2006).
As características de risco relatadas pelos indivíduos infectados pelo HCV
foram hospitalização, cirurgia, compartilhamento de objetos cortantes de higiene
pessoal e tratamento odontológico. Vários estudos têm documentado um aumento
no risco da infecção pelo HCV em indivíduos hospitalizados com ou sem cirurgia
45
(Massari et al. 2001, Krause et al. 2003, Forns et al. 2005, Stark et al. 2005,
Tavares-Neto et al. 2005), bem como para os que relataram tratamento dentário
(Enomoto et al. 2001) e, pelo compartilhamento de objetos cortantes de higiene
entre familiares (Brusaferro et al. 1999, Akhtar et al. 2002). No entanto, um deles
não relatou característica de risco. Estudos mostraram que alguns indivíduos anti-
HCV positivos não mencionaram fatores de risco, contudo a maioria apresentava
baixo nível socioeconômico (Ackerman et al. 1998, Rodes & Tapias 2000, Ferreira
2004), como a da população deste estudo, cuja situação pode favorecer a
transmissão do HCV devido ao contato pessoal intrafamiliar, incluindo a
transmissão sexual, vertical e horizontal (pelo compartilhamento de objetos de
higiene pessoal) (Al Nasser 1992, Caporaso et al. 1998, Brusaferro et al. 1999,
Akhtar et al. 2002). A transmissão horizontal entre familiares também é
sustentada pelo fato do RNA-HCV ser frequentemente detectado na saliva de
pacientes virêmicos, isto é, RNA-HCV positivo no soro (Ackerman et al. 1998,
Mastromatteo et al. 2001, Magder et al. 2004 ).
Apesar da baixa prevalência encontrada para infecção pelo HCV na
população Kalunga, os resultados deste estudo reforçam a importância da
investigação epidemiológica em comunidades isoladas com baixo nível
sócioeconômico, onde a manutenção da circulação viral pode resultar do
desconhecimento da infecção, de suas vias de transmissão e de prevenção.
Logo, estratégias de prevenção baseadas na divulgação dos modos de
transmissão do HCV e, principalmente, a orientação dos portadores crônicos,
minimizariam os riscos de disseminação do vírus em comunidades isoladas.
46
6. CONCLUSÕES
A prevalência global da infecção pelo HCV na população Kalunga de
0,57% pode ser considerada baixa quando comparada com a verificada em
doadores sangue (1,4%) em Goiânia-GO;
Características de risco, como hospitalização com ou sem cirurgia,
compartilhamento de objetos cortantes de higiene pessoal e história de
tratamento odontológico, foram relatadas pelos indivíduos infectados, ressaltando,
assim, a importância da transmissão parenteral do HCV;
47
A presença do genótipo 1 nos Kalungas infectados pelo HCV corrobora
os achados de outros estudos no Brasil, que mostram a relevância da circulação
deste genótipo no País.
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