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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Rodrigo Sebba Aires INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B EM PACIENTES COM TUBERCULOSE EM
HOSPITAL DE REFERÊNCIA EM GOIÂNIA-GOIÁS
Orientadora: Profª Drª Regina Maria Bringel Martins
Tese de Doutorado
Goiânia-GO, 2011
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TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [ x ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Rodrigo Sebba Aires
E-mail: [email protected]
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Vínculo empregatício do autor Docente da Faculdade de Medicina da UFG
Agência de fomento: CNPq Sigla:
País: Brasil UF: GO
CNPJ:
Título: Infecção pelo vírus da hepatite B em pacientes com tuberculose em hospital de referência em Goiânia-GO
Palavras-chave: Hepatite B (vírus) – Tuberculose – Pacientes - Goiânia
Título em outra língua:
Palavras-chave em outra língua:
Área de concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 28/11/2011
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical / Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG
Orientador (a): Regina Maria Bringel Martins
E-mail: [email protected]
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Co-orientador (a):*
E-mail:
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
3. Informações de acesso ao documento:
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Data: 06 / 01 / 2014
Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita
justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de
embargo.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Rodrigo Sebba Aires
INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B EM PACIENTES COM TUBERCULOSE EM
HOSPITAL DE REFERÊNCIA EM GOIÂNIA-GOIÁS
Orientadora: Profª Drª Regina Maria Bringel Martins
Este trabalho foi realizado com o auxílio financeiro do CNPq, processo nº 479917/2007-8
Goiânia-GO, 2011
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical/Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Medicina Tropical
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Dedico este trabalho aos meus pais, Divino e Vera,
pelo amor incondicional, exemplo de vida e renúncia.
Minha esposa Andréa, pelo amor eterno, carinho e
incentivo constante nesta jornada.
Meus filhos, Matheus e Ana Clara, presentes de Deus.
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AGRADECIMENTOS
- À Professora Dra. Regina Maria Bringel Martins, primeiramente pela oportunidade de tê-la como orientadora, e ainda por acreditar no projeto, pelo exemplo de dedicação ao trabalho e à pesquisa, pela paciência e incentivo. Muito obrigado por tudo!
- À Professora Dra. Sheila Araújo Teles, pelo apoio fundamental na análise dos dados e sugestões na banca de qualificação.
- À Professora Dra. Megmar Aparecida dos Santos Carneiro, pelo apoio na realização deste trabalho e auxílio na coleta dos dados.
- À colega doutoranda Nádia Rúbia S. Reis, pelo apoio no trabalho conjunto de coleta dos dados e realização dos testes sorológicos e moleculares.
- À Professora Dra. Márcia Alves Dias de Matos e Prof. Dr.João Alves de Araújo Filho pela participação na banca de qualificação.
- À Professora Dra. Carmen Luci Rodrigues Lopes, pela amizade e apoio constante.
- À Dra. Andréia Cecílio, pelo encaminhamento dos pacientes do ambulatório de tuberculose do HDT-HAA.
- À colega de pós-graduação Pollyane, pela ajuda na coleta dos dados.
- A todos os professores do programa de pós-graduação em Medicina Tropical do IPTSP-UFG.
- Aos funcionários da pós-graduação, Kariny e José Clementino.
- Ao Conselho Nacional de Desenvovlvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro.
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SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS..................................................................................................vii
ÍNDICE DE TABELAS E QUADRO...........................................................................viii
RESUMO........................................................................................................................ix
SUMMARY.....................................................................................................................x
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................01
1.1- BREVE HISTÓRICO DA HEPATITE B.............................................. 01
1.2- O VÍRUS DA HEPATITE B...................................................................02
1.2.1- CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO VÍRUS.......................02
1.2.2- CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E ORGANIZAÇÃO DO GENOMA....................................................................................02
1.2.3- VARIABILIDADE DO GENOMA DO HBV............................ 05
1.3- DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA INFECÇÃO PELO HBV......09
1.4- HISTÓRIA NATURAL E APRESENTAÇÃO CLÍNICA DA HEPATITE B..........................................................................................12
1.5- IMUNOPATOGÊNESE DA INFECÇÃO PELO HBV..........................14
1.6- EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO HBV..................................17
1.6.1- VIAS DE TRANSMISSÃO..........................................................18
1.6.2- PREVALÊNCIA...........................................................................19
1.6.3- DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DOS GENÓTIPOS................22
1.7- PREVENÇÃO E CONTROLE DA HEPATITE B.................................24
1.8- TUBERCULOSE ....................................................................................26
1.9- INFECÇÃO PELO HBV E TUBERCULOSE........................................30
1.10- JUSTIFICATIVA.....................................................................................32
2. OBJETIVOS.............................................................................................................34
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3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................35
3.1- DELINEAMENTO E POPULAÇÃO DO ESTUDO..............................35
3.2- ENTREVISTA E COLETA DE SANGUE.............................................35
3.3- TESTES SOROLÓGICOS......................................................................36
3.3.1- Detecção do HBsAg......................................................................36
3.3.2- Detecção do anti-HBc total...........................................................36
3.3.3- Detecção do anti-HBs...................................................................37
3.3.4- Detecção do HBeAg e anti-HBe...................................................37
3.3.5- Detecção do anti-HIV...................................................................38
3.3.6- Detecção do anti-HCV..................................................................39
3.4- DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO HBV-DNA.................................41
3.4.1- Extração do HBV-DNA................................................................41
3.4.2- Reação em cadeia pela polimerase (PCR)....................................41
3.4.3- Eletroforese em gel de agarose.....................................................42
3.4.4- Genotipagem pela análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP)..............................................................42
3.4.5- Genotipagem por seqüenciamento nucleotídico e análise filogenética..............................................................................................43
3.5- ANÁLISE DOS DADOS........................................................................45
4. RESULTADOS........................................................................................................46
4.1- CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA......................46
4.2- MARCADORES SOROLÓGICOS DO VÍRUS DA HEPATITE B.......46
4.3- FATORES DE RISCO ASSOCIADOS À INFECÇÃO PELO HBV.....48
4.4- CARACTERÍSTICAS SOROLÓGICAS E MOLECULARES DOS PACIENTES HBsAg REAGENTES.....................................................52
4.5- INFECÇÃO OCULTA PELO HBV.......................................................54
10
5. DISCUSSÃO............................................................................................................55
6. CONCLUSÕES........................................................................................................61
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................62
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ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1- Microscopia eletrônica mostrando as partículas virais...........................................................................................................................03
FIGURA 2- Representação esquemática do genoma do HBV...........................................................................................................................04
FIGURA 3- Evolução dos marcadores sorológicos na hepatite B aguda..........................................................................................................................11
FIGURA 4- Evolução dos marcadores sorológicos na hepatite B crônica........................................................................................................................12
FIGURA 5- Árvore filogenética da região S do vírus da hepatite B, incuindo sequências obtidas
de pacientes com tuberculose em Goiânia-GO e sequências do Genbank dos genótipos A-
H......................................................................................53
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ÍNDICE DE TABELAS E QUADROS
TABELA 1- Características sócio-demográficas dos 402 pacientes com tuberculose estudados em Goiânia, Goiás......................................................................................47
TABELA 2- Prevalência dos marcadores sorológicos do vírus da hepatite B em 402 pacientes com tuberculose em Goiânia, Goiás............................................................48
TABELA 3- Análise univariada dos fatores de risco associados à infecção pelo HBV em pacientes com tuberculose em Goiânia, Goiás .....................................................49
TABELA 4- Análise multivariada dos fatores de risco associados à infecção pelo HBV em pacientes com tuberculose em Goiânia, Goiás......................................................51
TABELA 5- Características sorológicas e moleculares das amostras HBsAg reagentes......................................................................................................................52
TABELA 6- Características dos pacientes com infecção oculta pelo HBV...............54
QUADRO 1- Estudos sobre a prevalência da infecção pelo vírus da hepatite B em Goiânia-GO..................................................................................................................23
QUADRO 2- Primers utilizados na amplificação da região S e seqüenciamento.....45
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RESUMO
A hepatite B e a tuberculose (TB) são importantes problemas de saúde pública. Este estudo teve
como objetivo investigar o perfil epidemiológico e molecular da infecção pelo vírus da hepatite B
(HBV) em pacientes com tuberculose atendidos no hospital de referência para doenças infecciosas
em Goiânia, Goiás. Um total de 402 pacientes com TB foi entrevistado sobre características sócio-
demográficas, fatores de risco para infecção pelo HBV e vacinação prévia contra hepatite B.
Amostras de sangue foram coletadas e os soros testados para detecção dos marcadores HBsAg,
anti-HBc total e anti-HBs por ensaio imunoenzimático (ELISA). Nas amostras HBsAg reagentes,
foi realizada a pesquisa do HBeAg e anti-HBe por ELISA. O HBV-DNA foi pesquisado nas
amostras HBsAg e anti-HBc reagentes pela reação em cadeia pela polimerase (PCR), e as amostras
positivas foram genotipadas pela análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de
restrição (RFLP) e seqüenciamento da região Pré-S/S. A prevalência global da infecção pelo HBV
foi de 25,6% (IC 95%: 21,5-30,2). Idade maior ou igual a 50 anos e uso de drogas injetáveis ou
não injetáveis foram fatores de risco associados à infecção pelo HBV. O DNA viral foi detectado
em 10 (76,9%) amostras HBsAg reagentes, sendo oito genotipadas como dos genótipos A (n = 7) e
D (n = 1). Foi encontrado um índice de infecção oculta pelo HBV de 14,4% nos pacientes anti-
HBc reagentes. Apenas 10,9% dos pacientes apresentaram evidência sorológica de vacinação
prévia contra hepatite B. A prevalência elevada e os fatores de risco como uso de drogas injetáveis
ou não injetáveis, somados a baixa cobertura vacinal contra hepatite B verificada, indicam a
necessidade de intervenções que visem à prevenção e controle da hepatite B em pacientes com
tuberculose.
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SUMMARY
Hepatitis B and tuberculosis (TB) are important public health problems. This study aimed to
investigate the epidemiological and molecular profile of the hepatitis B virus (HBV) infection
among patients with TB who were attended at the reference hospital for infectious diseases in
Goiânia, Goiás. A total of 402 patients were interviewed for socio-demographic characteristics,
risk factors for HBV infection and previous hepatitis B vaccination. Blood samples were collected
and sera were tested for HBsAg, anti-HBc, and anti-HBs markers by an enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA). HBsAg reactive samples were tested for HBeAg e anti-HBe
markers by ELISA. HBV DNA was detected in HBsAg and anti-HBc reactive samples by
polymerase chain reaction (PCR). HBV DNA positive samples were genotyped by restriction
fragment length polymorphism (RFLP) and sequencing of the Pre-S/S region. The overall HBV
prevalence infection was 25.6% (95% CI: 21.5-30.2). Age higher or equal 50 years old and
injecting or non-injecting drug use were risk factors associated with HBV infection. HBV DNA
was detected in ten (76.9%) HBsAg reactive samples. Of these, eight were genotyped as genotypes
A (n = 7) and D (n=1). HBV occult infection rate of 14.4% was found among anti-HBc reactive
patients. Only 10.9% had serological evidence of previous HBV vaccination. The high prevalence
and risk factors such as injecting or non-injecting drug use, in addition to the low HBV vaccine
coverage found, should indicate that there is a need for interventions aimed at improving hepatitis
B prevention and control in patients with tuberculosis.
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1. INTRODUÇÃO
1.1- BREVE HISTÓRICO DA HEPATITE B
O termo “hepatites virais” é convencionalmente utilizado para designar as doenças
causadas por vírus hepatotrópicos. As primeiras descrições dessa doença vêm de períodos
anteriores à Era Cristã, como relatos de surtos de icterícia na Babilônia há mais de 2500 anos, além
da descrição de icterícia epidêmica por Hipócrates em 400 a.C. (Freitas 2003).
Desde então, muito se discutiu sobre a etiologia das hepatites. Entretanto, apenas no final
do século XIX e início do século XX, passou-se a especular sobre um possível agente de
transmissão parenteral como etiologia da doença, visto que vários casos foram observados após
administração de vacinas preparadas a partir de linfa humana (Lürmann 1885) ou de medicação
para tratamento de sífilis administrada por via endovenosa (Bigger 1943).
MacCallum (1947) propôs os termos “vírus da hepatite A” e “vírus da hepatite B”, para
designar os supostos agentes etiológicos das hepatites de período de incubação curto (15 a 33
dias), ou infecciosa, e de período de incubação longo (50 a 160 dias), ou sérica, respectivamente.
Em 1967, Krugman et al. confirmaram a existência dos agentes propostos por MacCallum, os
quais apresentavam características clínicas, epidemiológicas e imunológicas distintas.
Denominaram, então, a primeira de hepatite infecciosa (MS1) e a segunda de hepatite soro-
homóloga (MS2) (Krugman et al. 1967).
Em 1965, Blumberg et al. publicaram o que viria a ser uma das mais importantes
revelações sobre as hepatites, que foi a detecção, no soro proveniente de um aborígene australiano,
de um antígeno que reagia com soros de hemofílicos, denominado antígeno Austrália (Blumberg et
al. 1965).
No Japão, foi relacionada a presença desse antígeno, em doadores de sangue, com o
desenvolvimento de hepatite pós-transfusional nos receptores de sangue também positivos para o
referido antígeno (Okochi & Murakami 1968). Finalmente, em 1969, Blumberg et al. associaram o
antígeno Austrália às hepatites agudas e crônicas, sendo proposta a sua detecção na triagem dos
doadores de sangue. No início da década de 1970, portanto, estava claramente estabelecida a
associação entre a hepatite soro-homóloga e o antígeno Austrália (Blumberg et al. 1969).
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A caracterização do HBV, de seus antígenos e anticorpos correspondentes, estava
praticamente completa no início dos anos 1970, quando Dane et al. identificaram a partícula viral
completa, que era constituída externamente por um envoltório que correspondia ao antígeno
Austrália (Dane et al. 1970).
1.2- O VÍRUS DA HEPATITE B
1.2.1- CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO VÍRUS
O vírus da hepatite B (HBV) pertence à família Hepadnaviridae, gênero
Orthohepadnavirus (ICTV 2009). A partícula completa do HBV é esférica, com diâmetro de
aproximadamente 42 nm, composta de um envelope externo protéico, que constitui o antígeno de
superfície do HBV (HBsAg, denominado anteriormente de antígeno Austrália), e internamente por
nucleocapsídeo icosaédrico, sendo formado pelo antígeno do core (HBcAg) e pelo genoma viral
(Tiollais & Pourcel 1995, Kao & Chen 2002, Liang 2009). A partícula viral completa é também
conhecida como partícula de Dane (Dane et al. 1970). Partículas não infecciosas, compostas
apenas pelo HBsAg, também são encontradas no soro de indivíduos infectados pelo HBV (Figura
1) (Liang 2009).
1.2.2- CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E ORGANIZAÇÃO DO GENOMA
O genoma do HBV é um dos menores dentre os vírus que infectam o homem e possui 3200
pares de base (pb), sendo composto de uma molécula de DNA circular de fita parcialmente dupla.
A fita mais longa é complementar ao RNA pré-genômico e possui polaridade negativa. Na fita de
polaridade positiva, a posição da extremidade 5’ terminal é fixa, enquanto a posição da
extremidade 3’ terminal é variável. Desta forma, o comprimento dessa fita corresponde entre 50 e
90% do comprimento da fita complementar (Ganem 1996). Próximo às extremidades 5’ de ambas
as fitas, observam-se pequenas sequências repetidas de 11 nucleotídeos, que são denominadas
direct repeats (DR1 e DR2), sendo importantes para a iniciação da replicação viral (Seeger &
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Ganem 1986, Will & Reiser 1987). Na Figura 2, observa-se a representação esquemática do
genoma do HBV.
Figura1: microscopia eletrônica mostrando as partículas virais.
Fonte: www.sciencephoto.com
Quase todo o genoma do HBV é codificante, apresentando quatro fases de leitura aberta
(open reading frames, ORFs) designadas de pré-S/S, pré-C/C, P e X. A região pré-S/S codifica as
proteínas de superfície, enquanto a pré-C/C é responsável pela síntese do HBcAg e do antígeno e
(HBeAg). O gene P codifica a polimerase viral, e a região X é responsável pela síntese de uma
proteína regulatória, denominada HBxAg (Ganem & Varmus 1997, Ganem & Prince 2004).
A ORF pré-S/S, que codifica as proteínas de superfície denominadas L (large), M (middle)
e S (small), inclui as regiões pré-S1, pré-S2 e S, com os três respectivos códons de iniciação na
mesma fase de leitura (Seeger & Mason 2000, François et al. 2001, Kao & Chen 2002). Essas
proteínas de superfície são componentes imunogênicos do HBV, desempenhando, assim, um
importante papel na indução de imunidade contra esse vírus (Kao & Chen 2002). A proteína de
superfície large apresenta importante papel na montagem e adsorção do HBV ao hepatócito. A
proteína middle não tem ainda função bem conhecida, mas sabe-se que sua ausência não impede a
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formação da partícula viral e nem a infectividade da mesma. A proteína small apresenta o
determinante “a”, o qual induz uma resposta protetora em seres humanos, independente do subtipo
do HBV (Glebe 2007, Hollinger 2007).
Figura 2: representação esquemática do genoma do HBV
Fonte: Hunt et al. 2000 (adaptado)
A região pré-C/C possui dois códons de iniciação na mesma fase de leitura aberta,
resultando na síntese do HBeAg e do HBcAg. A sequência da região pré-C codifica para um
domínio hidrofóbico que é responsável pela translocação do HBeAg para o retículo
endoplasmático (Sugiyama et al. 2007). Essa mudança de localização é fundamental para a
alteração da antigenicidade do HBeAg de forma que o mesmo não compartilha homologia com o
HBcAg (Bruss & Gerlich 1988). O HBeAg é um peptídeo solúvel derivado de ambas as regiões
pré-C/C, que é processado e secretado pelas células hepáticas, e serve como marcador de
replicação viral, sendo encontrado durante infecção aguda ou nos portadores crônicos com
replicação viral (Kao & Chen 2002, Hatzakis et al. 2006, Kay & Zoulim 2007). A proteína do core
apresenta capacidade de automontagem para formação do nucleocapsídeo, sendo importante na
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etapa de empacotamento do RNA pré-genômico. Além disso, independente das células T, o
HBcAg induz à produção de anticorpos anti-HBc (Gerlich et al. 2007).
A maior ORF é a região P, que sobrepõe aproximadamente ¾ do genoma e codifica a
polimerase viral, apresentando quatro domínios: (1) amino-terminal, necessário para o início da
síntese da fita de DNA de polaridade negativa; (2) espaçadora, que não tem função definida; (3) de
transcriptase reversa, responsável pela transcrição do RNA pré-genômico em DNA, e (4) carboxi-
terminal, que exibe atividade de RNAse (Seeger & Mason 2000).
A região X codifica o HBxAg, um pequeno polipeptídeo com cerca de 154 aminoácidos,
que pode ser detectado apenas nos hepatócitos infectados, e acredita-se não ser necessário para a
replicação viral (Glebe 2007). Constitui-se em ativador da transcrição de certos genes virais e
celulares (Henkler & Koshy 1996). Alguns autores mostram que a expressão do gene X pode estar
associada ao aparecimento de carcinoma hepatocelular, devido à sua capacidade de interferir no
reparo do DNA e na atividade da proteína p53, que apresenta função supressora de tumor e
ativadora de apoptose (Kim & Koike 1991, Seifer & Hohne 1991, Seeger & Mason 2000, Glebe
2007).
1.2.3- VARIABILIDADE DO HBV
Couroucè-Pauty et al. (1978) classificaram as variantes antigênicas do HBsAg em nove
subtipos diferentes: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- e adrq+. Posteriromente, os
isolados do HBV foram classificados em oito genótipos (A-H), por comparação das sequências
nucleotídicas do gene pré-S/S ou do genoma completo (Okamoto et al. 1988, Norder & Hammas
1992, Norder & Couroucè-Pauty 1994, Stuyver et al. 2000, Arauz-Ruiz et al. 2002).
Os genótipos do HBV, além da relevância epidemiológica, apresentam diferenças
relacionadas à evolução e prognóstico da hepatite crônica. Vários estudos envolvendo pacientes
asiáticos indicam que o genótipo B, comparado ao C, está associado a soroconversão espontânea
do HBeAg precocemente, menor atividade da doença e índices inferiores de progressão para
cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC) (Kao et al. 2004, Ni et al. 2004, Chu & Liaw 2005,
Livingston et al. 2007). Além disso, pacientes com genótipo C geralmente apresentam índices
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mais elevados do HBV-DNA e maior freqüência de mutações em relação àqueles infectados pelo
genótipo B (Yang et al. 2002, Chan et al. 2004, Chen et al. 2007, Kao 2007, Chou et al. 2008). Em
geral, o genótipo D se associa a piores prognósticos em relação ao A (Kao 2007). Um estudo
indiano mostrou que o genótipo D está mais frequentemente associado à hepatite crônica HBeAg-
negativa, doença hepática mais agressiva e maior risco de evolução para o CHC em pacientes
jovens (Thakur et al. 2002).
Huy et al. (2008) propuseram a circulação de um novo genótipo (I) no Vietnam. Entretanto,
as descrições iniciais não corresponderam aos critérios estabelecidos para definição de genótipos,
pois a diversidade genética desse isolado foi menor que 7,5% em relação ao genótipo C. Outra
investigação, baseada no isolado viral de um paciente com carcinoma hepatocelular no Japão,
revelou uma nova variante genética, com proposta de classificação como genótipo J (Tatematsu et
al. 2009). Entretanto, são necessários mais estudos virológicos, epidemiológicos e clínicos para se
justificar a classificação desses isolados como novos genótipos (Kurbanov et al. 2010).
Variações genéticas dentro dos genótipos têm sido extensivamente estudadas desde que o
conceito de subgenotipagem surgiu a partir de estudos dos genótipos A e B (Kimbi et al. 2004,
Sugauchi et al. 2004). Mais recentemente, variações na sequência de nucleotídeos entre 4 e 7,5%
são usadas como critérios para identificação de subgenótipos (Kramvis et al. 2005, Kurbanov et al.
2010). Todos os genótipos, exceto E, G e H são subdivididos em subgenótipos. Assim, são
descritos sete subgenótipos do genótipo A, denominados A1 a A7, sendo que esse último foi
recentemente identificado na África (Hübschen et al. 2011). O genótipo B apresenta nove
subgenótipos (B1 a B9) (Thedja et al. 2011), enquanto o genótipo C possui doze, sendo o C11 e
C12 também recentemente descritos (Juniastuti et al. 2011, Mulyanto et al. 2011). O genótipo D,
com seus nove subgenótipos (D1-D9), apresenta distribuição geográfica distinta, podendo ser
encontrado em várias partes do mundo (Banerjee et al 2006, Ismail et al. 2011, Thedja et al. 2011).
O genótipo F também possui subgenótipos (F1 a F4), os quais são prevalentes em algumas regiões
da América do Sul, como sul da Argentina e Chile (Torres et al. 2011).
Durante o curso da infecção pelo HBV, erros espontâneos da transcriptase reversa viral
ocasionam mutações no genoma viral (Fattovich et al. 2008). Além disso, outras variantes surgem
de deleções, recombinações ou inserções de nucleotídeos que podem ocorrer nos genes estruturais
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e não-estruturais, ou mesmo nos elementos regulatórios do HBV (Baumert et al. 2007). Serão
descritas a seguir as principais mutações do HBV de interesse clínico:
• Mutações na região pré-C/C
A variante pré-core mais comum resulta da substituição de guanosina (G) por adenosina
(A) na posição 1896 (G1896A), levando à interrupção da síntese do HBeAg, porém mantendo a
produção do HBcAg. O mecanismo mais provável para emergência dessa mutação é a seleção pela
resposta imune (Locarnini 2004). Não se conhece se essas variantes representam um escape da
pressão de células B, de células T auxiliares ou de linfócitos T citotóxicos, mas provavelmente se
trata de uma combinação de todos. Estudando hospedeiros seqüenciais, verificou-se que o vírus
mutante não-produtor de HBeAg pode ser transmitido como uma entidade independente, causando
infecção primária, mas pode também aparecer em indivíduos infectados pelo vírus selvagem
(Carman et al 1989). Achados sugerem a associação da infecção aguda primária por esse mutante
com a hepatite fulminante por HBV (Tanaka et al 1995).
Mutações também ocorrem no promotor basal do core do HBV, sendo as mais freqüentes
as que envolvem os nucleotídeos 1762 e 1764 (Hunt et al. 2000). A mutação dupla
A1762T/G1764A afeta a transcrição dessa região reduzindo a expressão do HBeAg, e
provavelmente aumenta a carga viral na tentativa de compensar esse efeito inibitório (Hunt et
al.2000, Locarnini 2004, Tacke et al. 2004, Gonçales & Gonçales Jr 2006). Essa mutação parece
estar relacionada ao risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (Chen et al. 2008).
Outras mutações responsáveis pela redução da expressão do HBeAg já foram descritas,
como aquelas localizadas nas posições 1817, 1874 e 1897, bem como nos nucleotídeos 1814, 1815
e 1816 (Carman et al. 1989, Brunetto et al. 1990, Daí et al. 2001, Hadziyannis & Vassilopoulos
2001, Locarnini et al. 2003).
• Mutações na região S
Anticorpos que reconhecem o determinante a do HBsAg são os principais componentes da
resposta anti-HBs após infecção ou imunização. A mutação mais comum nessa região é a
substituição da glicina pela arginina no códon 145 do HBsAg (G145R) (Carman et al. 1990). Essa
22
mutação pode afetar o reconhecimento do vírus mutante pelos anticorpos neutralizantes (Weber
2005). Assim, em indivíduos que recebem imunização passiva ou ativa contra hepatite B, os vírus
mutantes escapam do sistema imune e se replicam (Weber 2005, Hatzakis et al. 2006).
Recentemente, foram descritos casos de pacientes com hepatite B crônica tratados com
interferon peguilado, com conseqüente redução do HBsAg, porém permanecendo virêmicos pelo
achado do HBV-DNA no soro, fato que pode ser explicado pelo surgimento de mutações na região
S após o uso deste medicamento (Hsu & Yeh 2011). Mutações nessa região também se relacionam
com a evolução da doença hepática, incluindo um maior risco de desenvolvimento de carcinoma
hepatocelular, principalmente em pacientes jovens, quando se detecta deleções na região pré-S2
(Yeung et al. 2011). Além disso, Weber et al. (2001) descreveram hepatite fulminante pelo HBV
em paciente HBsAg negativo, relacionada também a mutações na região S.
Portanto, tais alterações podem resultar em reativação da doença em portadores crônicos,
falha na detecção do HBsAg e evasão à resposta imune protetora (anti-HBs), podendo, assim,
prejudicar a terapia baseada na utilização de anticorpos específicos na supressão da infecção em
indivíduos transplantados (Carman et al.1990, Blum 1993). Além disso, mutações na região S
podem ter implicação epidemiológica, pois, a falha na detecção sorológica do HBsAg propicia a
disseminação do HBV por transfusão sanguínea, principalmente em locais de alta prevalência e
que não adotam técnicas moleculares para triagem de doadores (Chang 2006, Fang 2006, Lelie &
Heaton 2006, Liu et al. 2006).
• Mutações na região P
Mutações nos cinco domínios (A-E) da transcriptase reversa/polimerase passaram a ser
descritas após o uso de potentes antivirais (análogos de nucleosídeos) na prática clínica
(Bartholomeusz & Locarnini 2006, Zoulim & Locarnini 2009). A lamivudina mostrou-se um
fármaco eficaz na redução da carga viral do HBV (Liaw 2009); entretanto, foram descritos casos
de pacientes nos quais, a despeito do uso continuado da mesma, não houve ação sobre o HBV.
Nesses casos, foram detectadas mutações na região altamente conservada YMDD (tirosina-
metionina-aspartato-aspartato) existente nos domínios C (posição 204), A (posição 80) e B
(posições 173, 180 e 181). Essas mutações aparecem invariavelmente após o uso prolongado da
23
lamivudina (cerca de 20% ao ano, atingindo 80% em quatro anos), o que limita muito o uso desse
antiviral, assim como da telbivudina, devido à resistência cruzada entre esses dois antivirais,
embora a emergência de mutação à telbivudina na posição 204 ocorra em uma freequência mais
baixa (Zoulim & Locarnini 2009).
O adefovir é outro agente antiviral utilizado no tratamento da hepatite B crônica, sendo
indicado, assim como a lamivudina, o uso por longos períodos (Hadziyannis et al. 2006).
Entretanto, a resistência viral também aumenta progressivamente com o tempo de duração da
terapia, porém em taxas bem menores do que as observadas com a lamivudina. A resistência ao
adefovir parece estar relacionada com outras mutações na transcriptase reversa/polimerase do
HBV (posição 181, no domínio B, e/ou 236 no domínio D) (Hadziyannis et al. 2006).
Outro antiviral de uso mais recente, o entecavir, apresenta alta barreira genética, pois a
resistência ao mesmo requer a seleção de duas mutações de resistência à lamivudina e de pelo
menos uma substituição adicional. A taxa de resistência descrita é em torno de 1,2% em quatro
anos de uso (Shouval et al.2009).
1.3- DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA INFECÇÃO PELO HBV
O diagnóstico da infecção pelo HBV e da conseqüente doença hepática se baseia em
critérios clínicos, bioquímicos, histológicos e sorológicos/moleculares. Antígenos virais e seus
respectivos anticorpos podem ser detectados no soro após a infecção, e a interpretação correta
desses resultados é essencial para o diagnóstico das várias formas clínicas da doença. Assim, a
confirmação diagnóstica da hepatite B pode ser realizada pelos testes sorológicos (ensaio
imunoenzimático ou EIA), que buscam identificar no soro os antígenos (HBsAg e HBeAg) e os
anticorpos (anti-HBc, anti-HBe e anti-HBs), e pelos testes moleculares (pesquisa quantitativa e
qualitativa do HBV-DNA). Além disso, pode ser realizada a pesquisa de antígenos HBsAg e
HBcAg no tecido hepático por técnica de imunohistoquímica (Liang 2009).
Na infecção aguda, após o período de incubação de 1 a 6 meses, e antes do aparecimento
da icterícia, podem ser detectados no soro os marcadores HBsAg e HBeAg, que indicam a
presença do HBV e sua replicação, respectivamente (Liang & Ghany 2002). Nesse período pré-
24
ictérico, ocorre elevação gradativa dos níveis das transaminases, alanina aminotransferase (ALT) e
aspartato aminotransferase (AST), expressando a lesão hepatocitária progressiva. No período
ictérico, as dosagens dessas enzimas alcançam seus níveis mais altos. Além dos sintomas de
doença aguda, nota-se o aparecimento, em concentrações crescentes, de anticorpos anti-HBc da
classe IgM dirigidos contra o antígeno do core do HBV. Considerados como importante marcador
para o diagnóstico de hepatite B aguda, esses são os primeiros anticorpos que surgem no soro
desses pacientes, cerca de 2-4 semanas após o aparecimento do HBsAg . A fração IgM também
pode estar presente, de maneira intermitente, em pacientes com hepatite B crônica HBeAg
positivos, que apresentam períodos de elevações de ALT durante episódios de reativação da
doença (Hollinger 1996). O marcador anti-HBc total (fração IgG) geralmente persiste por toda a
vida do indivíduo infectado pelo HBV (Cacciola et al. 1999). O aparecimento de anticorpos anti-
HBe evidencia a recuperação da infecção, pois o mesmo é indicativo de redução da replicação com
consequente menor infectividade (Hollinger 1996). Na fase de convalescença, ocorre aumento
progressivo da concentração de anti-HBs, que indica cura da infecção pelo HBV com o
consequente desenvolvimento de imunidade para o vírus (Liang 2009). A Figura 3 mostra a
evolução dos marcadores sorológicos na hepatite B aguda.
Nos pacientes que evoluem para hepatite crônica, o HBsAg permanecerá detectável no soro
por mais de seis meses, como representado esquematicamente na Figura 4. Nesses casos, o
indivíduo poderá permanecer reagente para o HBeAg por vários anos ou apresentar soroconversão
para anti-HBe em um período de tempo variável. Portanto, essa soroconversão é acompanhada
pelo desaparecimento do HBeAg, além da negativação do HBV-DNA no soro, normalização dos
níveis de aminotransferases e remissão da lesão hepática. Uma pequena porcentagem de pacientes
anti-HBe positivos pode continuar a apresentar doença hepática ativa com positividade para o
HBV-DNA, decorrente de uma baixa replicação residual do vírus selvagem, apesar de já ter
ocorrido perda do HBeAg. Esse fato pode também ser observado nos casos de surgimento de
mutações na região pré-core ou promotor basal do core (Liang 2009).
Com o desenvolvimento de novos métodos de biologia molecular, os recentes avanços no
diagnóstico têm propiciado a identificação de novas modalidades de infecção pelo HBV, como a
infecção oculta (Cacciola et al. 1999, Grob et al. 2000, Brechot et al. 2001). O padrão laboratorial
25
dessa infecção é a ausência de positividade para o HBsAg no soro, associada à presença de anti-
HBc ou anti-HBs isolado, anti-HBc/anti-HBs, e mesmo à ausência de qualquer marcador
sorológico, além do baixo nível circulante de HBV-DNA (Cacciola et al. 1999, Shiota & Oyama
2000, Brechot et al. 2001). A infecção oculta pelo HBV tem sido observada em diferentes tipos de
populações; dentre elas, pacientes coinfectados com o vírus da hepatite C (HCV) (Cacciola et al.
1999, Brechot et al. 2001, Silva & Gonçales 2004), ou pelo vírus da imunodeficiência humana
(HIV) (Gonçales Jr & Pereira 2003).
Figura 3: evolução dos marcadores sorológicos na hepatite B aguda
Fonte: www.cdc. gov/ncidod/diseases/hepatitis/ slideset (modificado)
26
Figura 4: evolução dos marcadores sorológicos na hepatite B crônica
Fonte: www.cdc. gov/ncidod/diseases/hepatitis/ slideset (modificado)
1.4- HISTÓRIA NATURAL E APRESENTAÇÃO CLÍNICA DA HEPATITE B
Após a infecção pelo HBV, o período de incubação pode durar de 1-6 meses, com média de
70 dias. Os sintomas e sinais se iniciam de forma insidiosa, com icterícia presente em cerca de
metade dos casos, muitas vezes associada a manifestações extra-hepáticas, como artralgias,
mialgias, febre e exantema. A duração da fase ictérica é variável, em média 1-2 semanas. No
período de convalescença, a icterícia desaparece, permanecendo os sintomas constitucionais, como
astenia, fadiga e dispepsia por semanas ou até meses (Liang 2009). Em aproximadamente 1% dos
pacientes com hepatite B aguda com icterícia, ocorrem sinais de insuficiência hepática fulminante,
caracterizados principalmente pelo surgimento súbito de encefalopatia hepática (Hoofnagle et al.
1995). Entretanto, em cerca de 50% dos casos a forma aguda é subclínica (Foccacia 2005).
Vários fatores estão implicados no desenvolvimento e na evolução da infecção pelo HBV.
Dentre eles, estão a época de aquisição da infecção e os aspectos relativos à raça, ao sexo e ao
genótipo do HBV (Lok et al. 2001, Wright 2006, Liang 2009, Liaw 2009). Crianças raramente
27
desenvolvem infecção sintomática com icterícia. Por outro lado, quanto mais nova a criança, maior
a chance de se tornar portadora crônica, atingindo um índice de 90 a 95% em recém-nascidos
(Liang et al. 2009). Muitos dos portadores que adquirem a infecção durante a infância poderão
desenvolver cirrose e/ou carcinoma hepatocelular após um período de 30 a 60 anos. Cerca de 25%
das crianças infectadas até os 7 anos de idade por via não vertical se tornarão portadoras crônicas.
Após essa idade, as crianças e adolescentes passam a exibir padrão epidemiológico de adultos,
com cerca de 5 a 10% tornando-se portadores crônicos (Coursaget et al. 1987, Lee 1997, Ferreira
2000, Bortolotti et al. 2006, Chu & Liaw 2007).
A infecção persistente (HBsAg positivo por tempo superior a 6 meses) pode produzir
quadros de portador inativo do HBV, ou evoluir para quadros de hepatite crônica clássica, que é
atualmente subdividida em hepatite B crônica HBeAg positiva e negativa. Podem aparecer como
complicações tardias a cirrose hepática e o carcinoma hepatocelular. Os indivíduos cronicamente
infectados com o HBV e que são HBsAg e HBeAg reagentes, em dado momento da evolução da
doença, podem espontaneamente soroconverter para anti-HBe (Chang & Sung 1989, Realdi et al.
1990, Chu & Liaw 2007, Liang 2009). Essa soroconversão geralmente é precedida por uma
redução acentuada nos níveis séricos do HBV-DNA, e acompanhada pela diminuição dos níveis
séricos de ALT, com persistência do HBsAg. A soroconversão usualmente representa a transição
do estado de hepatite crônica para um estado de portador inativo do HBV, em que não há sinais de
atividade da doença e os níveis do HBV-DNA são indetectáveis no soro (Iloeje et al. 2006, Liaw
2009). Estima-se que 5% a 15% dos pacientes com hepatite B crônica soroconvertem
espontaneamente para o marcador anti-HBe a cada ano, persistindo, então, com a ALT normal e
com mínimas alterações na biópsia hepática. Essa doença hepática geralmente não progride e o
desenvolvimento de carcinoma hepatocelular é raro (De Franchis et al. 1993, Chen et al. 2006,
Fattovich et al. 2008).
Contudo, nem todos os pacientes que soroconvertem do HBeAg para o anti-HBe manterão
uma remissão sustentada da doença. Parte desses pacientes permanecerá HBeAg negativa,
podendo apresentar altos níveis séricos de HBV-DNA acompanhados de aumentos persistentes ou
intermitentes de ALT. Esses indivíduos geralmente abrigam variantes do HBV, que apresentam
mutações nas regiões pré-core ou promotor basal do core, e terão o quadro clínico de hepatite B
28
crônica HBeAg negativa, que é uma forma grave e progressiva da infecção (Lok et al. 2001,
Rezende et al. 2005, Lok & McMahon 2007, Fattovich et al. 2008, Liang 2009, Liaw 2009). É
importante considerar que nem todo paciente com hepatite B crônica HBeAg negativo e HBV-
DNA positivo alberga somente o vírus mutante, pois se sabe que alguns pacientes podem
continuar a apresentar baixos níveis do HBV selvagem (Chan et al. 2000).
Assim, nota-se que a hepatite crônica pelo HBV pode se apresentar de duas formas
distintas: HBsAg positiva/HBeAg positiva e HBsAg positiva/HBeAg negativa. Ambas podem
levar à cirrose e à falência hepática (Iloeje et al. 2006). Em alguns indivíduos, a hepatite crônica
progride para cirrose de maneira insidiosa e com a atividade da doença subsequentemente
diminuindo, mas mesmo assim pode-se desenvolver o carcinoma hepatocelular (Chen et al. 2006,
Lok & McMahon 2007, Liang 2009).
A infecção oculta pelo HBV é uma forma crônica da hepatite B relacionada à persistência
do cccDNA (covalently closed circular DNA) nos hepatócitos dos indivíduos infectados, com uma
forte supressão da replicação viral e da expressão gênica (Cacciola et al. 1999, Le Mire et al. 2005,
Allain 2006, Raimondo et al. 2007). Essa forma da doença tem impacto em vários contextos
clínicos, como a transmissão do HBV por transfusão sanguínea, ou transplante de órgãos, e sua
reativação aguda em casos de imunossupressão. As evidências em relação à progressão da fibrose
hepática e o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular na infecção oculta ainda são
controversas (Raimondo et al. 2007, Hollinger & Sood 2010, Said 2011).
1.5- IMUNOPATOGÊNESE DA INFECÇÃO PELO HBV
Apesar do HBV não ser um vírus citopático, a infecção com esse agente está associada a
largo espectro de dano hepático. Alterações histopatológicas no fígado vão desde hepatite crônica
com atividade inflamatória leve à intensa e cirrose, com potencial evolução para o carcinoma
hepatocelular (Lee 1997, Lai et al. 2003, Liu & Kao 2007). Estudos de patogênese do HBV em
humanos e em modelos animais estabeleceram que a diversidade de manifestações clínicas e a
evolução da infecção pelo HBV dependem primariamente da resposta imune do hospedeiro ao
vírus (Chisari 1995, Liang 2009). Durante a infecção aguda, é necessário um envolvimento
29
eficiente e coordenado das respostas imunes celular e humoral do hospedeiro para a resolução da
infecção pelo HBV e da doença hepática associada (Liang 2009).
A resposta imune envolve uma variedade de fatores solúveis e células, que são divididos de
modo geral em mediadores da imunidade inata (natural) ou adaptativa (adquirida). A resposta
imune inata não é específica para agentes infecciosos particulares e seu componente celular inclui
fagócitos e células natural killer (NK). Notadamente, o fígado é o órgão com a mais alta
proporção de células NK do corpo (22 a 40%), o que é relevante para a defesa do hospedeiro
contra vírus hepatotrópicos (O’ Farrely & Crispe 1999, Gonçales Jr 2002, Rapicetta et al. 2002,
Ferrari et al. 2003, Ganem & Prince 2004). A resposta imune adaptativa, que inclui anticorpos e
linfócitos T, é específica para o agente indutor, sendo intensificada após contatos repetidos com
esse agente, dessa forma apresentando memória imunológica. A etapa inicial da imunidade
adaptativa é o processamento e a apresentação de um antígeno por células apresentadoras de
antígenos especializadas, como células dendríticas aos linfócitos T helper CD4+. As células T
CD4+ antígeno-específicas, restritas ao HLA classe II, subsequentemente coordenam as reações
imunes efetoras e são subdivididas em dois subgrupos funcionais: células T helper 1 (Th1), que
produzem interferon gama e interleucina 2 (IL-2) e promovem atividade de linfócito T citotóxico
(CTL), enquanto as células T helper 2 (Th2) produzem IL-4, IL-5 e IL-10 e promovem resposta de
anticorpos específicos. Atribui-se ao reconhecimento de hepatócitos infectados pelo HBV por CTL
restritos ao HLA classe I antígeno-específicos papel principal dentre os mecanismos efetores,
responsável paradoxalmente tanto pela eliminação viral quanto pelo desenvolvimento de dano
hepático relacionado ao HBV (Chisari 1995, Ferrari et al. 2003, Vierling 2007).
Estudos de patogênese da hepatite B em humanos e em modelos animais mudaram o
tradicional conceito de interação vírus-hospedeiro. Primeiramente, foi estabelecido que a inibição
da expressão dos genes virais mediada por citocinas, mais do que a destruição direta de
hepatócitos infectados, representa o mecanismo dominante para o controle da replicação viral
(Chisari 1995, Guidotti & Chisari 1996). Em segundo lugar, demonstrou-se que a replicação do
HBV em níveis baixos, paralelamente à forte reatividade de células T HBV específicas, persiste
por muitos anos em pacientes com uma história passada de infecção pelo HBV (soropositivos para
o marcador anti-HBc) (Penna et al. 1996, Rehermann & Ferrari 1996). Isso sugere que a inibição
30
da replicação viral após a infecção pelo HBV não implica na eliminação do vírus. Ao contrário,
significa uma infecção persistente pelo HBV com um eficiente controle imunológico da replicação
viral por parte do hospedeiro (Rapicetta et al. 2002, Vierling 2007).
Após a infecção aguda pelo HBV, diversas manifestações clínicas e diferentes formas de
evolução podem ser observadas nos pacientes infectados. A recuperação da hepatite aguda é
dependente da resposta das células B que produzem anticorpos contra os antígenos das regiões
pré-S e S, bem como da resposta das células T (Lok 2000). Assim, pacientes com infecção aguda
autolimitada pelo HBV exibem uma vigorosa resposta policlonal HLA classe I restrita dos
linfócitos T citotóxicos contra múltiplos epítopos presentes nas regiões do envelope, do
nucleocapsídeo e da polimerase do HBV. Essa resposta é mantida por décadas após a recuperação
da infecção pelo HBV (Penna et al. 1996, Lok 2000). A resposta T citotóxica é mantida por
fragmentos residuais do HBV que podem ser detectados no fígado e nos linfócitos do sangue
periférico, indicando que a completa eliminação desse vírus é raramente observada, mesmo nos
indivíduos considerados curados (Lok 2000). Quando a resposta dos linfócitos T citotóxicos é
fraca e limitada a poucos epítopos, a infecção pode tornar-se crônica (Nayersina et al. 1993).
Na infecção crônica pelo HBV, a resposta imune celular ao vírus é fraca, permitindo a
continuidade da replicação viral em níveis elevados nos hepatócitos infectados. Embora a resposta
imune ao HBV nesses pacientes seja incapaz de controlar a replicação viral, a mesma desempenha
um importante papel para o dano da célula hepática durante o curso da infecção crônica. No
decorrer dos anos, alguns pacientes podem suprimir espontaneamente a replicação do HBV a um
nível que não desencadeie mais qualquer inflamação hepática.
Em geral, a história natural da infecção crônica pelo HBV compreende três fases
consecutivas (EASL 2009). Na fase inicial da infecção, os pacientes são soropositivos para o
HBeAg com alto nível de replicação viral, mas com mínimo dano hepático. Essa fase, chamada de
imunotolerância, é particularmente longa em casos de transmissão vertical do HBV. Com o tempo,
há uma perda gradual da tolerância imune ao vírus, levando a uma transição para a fase imune
ativa (ou de imunoeliminação). Nessa fase, as aminotransferases séricas estão aumentadas e o
exame histológico do fígado mostra infiltração de células mononucleares nos espaços portais, com
31
hepatite de interface e lobular. Os fatores virais e/ou do hospedeiro que levam a essa transição da
fase imunotolerante para fase imune ativa são ainda desconhecidos (Liang 2009).
A duração da fase imune ativa tem um impacto importante na transformação ou não da
arquitetura hepática normal em um fígado cirrótico. Alguns pacientes suprimem espontaneamente
a replicação do HBV, o que é manifestado pela soroconversão do HBeAg para anti-HBe. Isso está
associado a uma redução marcante no número de cópias virais no soro e resolução da inflamação
hepática. Embora a maioria dos pacientes crônicos permaneça como portadora inativa do HBsAg,
essa é uma evolução favorável que melhora o prognóstico do paciente. Em alguns pacientes, a
negativação do HBeAg é reflexo da resposta imune aumentada no hospedeiro, sem mudanças
significativas no genoma viral. Em outros, a soroconversão ocorre como resultado de
mutação(ões) no genoma viral (na região pré-core ou promotor basal do core), que interrompe(m)
a síntese do HBeAg (Ulrich et al. 1990, Naoumov & Thomas 1995).
Diferentemente dos indivíduos infectados pelo HBV no período perinatal, nos pacientes
com infecções crônicas adquiridas na infância ou na idade adulta, observam-se somente uma fase
inicial de imunoeliminação com intensa replicação viral e doença hepática ativa, seguida de outra
fase de infecção não-replicativa, com doença hepática inativa (Hoofnagle et al. 1981, Realdi et al.
1990, Lok 1993, Lok & McMahon 2007).
Em seguida à fase do portador inativo, pode haver a reativação viral, com retorno da
replicação. Esse fenômeno pode dar-se por imunossupressão no hospedeiro em decorrência de
quimioterapia, uso de imunossupressores etc, ou por mutações virais na região pré-core ou
promotora do core, permitindo o retorno da replicação pelo escape à resposta imunológica do
hospedeiro (Liaw 2009).
1.6- EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO HBV
A infecção pelo HBV continua sendo um problema de saúde pública mundial. Estima-se
que mais de 2 bilhões de pessoas já foram infectadas pelo HBV e aproximadamente 350 milhões
32
são portadores crônicos, em risco para o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular,
complicações responsáveis por cerca de 1 milhão de óbitos anualmente. Soma-se a isso, o fato de
que os portadores do HBV funcionam como reservatórios da infecção, com potencial de
perpetuação do vírus por várias gerações (Lavanchy 2008, Liang 2009, Te & Jensen 2010,
Wiersma et al. 2011).
1.6.1- VIAS DE TRANSMISSÃO
As maiores concentrações do HBV são verificadas no sangue, diminuindo
consideravelmente no sêmen, fluido vaginal e saliva. Esse vírus é transmitido principalmente pelas
vias perinatal, sexual e parenteral, pela exposição percutânea ou de mucosas aos fluidos corpóreos
ou sangue contaminado, transfusão de sangue ou derivados, uso de drogas injetáveis, transplante
de órgãos ou tecidos, lesões de pele ou acidentes com objetos perfurocortantes, principalmente em
profissionais da área da saúde. Embora o HBsAg já tenha sido encontrado em vários fluidos
corporais, há evidências de transmissão do HBV apenas pelo sangue, sêmen e saliva, sendo esta
última demonstrada apenas em modelos animais (Alter et al. 1977, Bancroft et al. 1977, Alter
2003). A transmissão por outros fluidos corporais ainda é discutida, porém em pacientes
virêmicos, se encontrou o HBV-DNA em amostras de saliva, secreção nasofaríngea e lágrimas,
dentre outros (Kidd-Ljunggren et al. 2006).
Pode-se encontar grande variação na freqüência dos modos de transmissão de acordo com
o padrão endêmico encontrado. Em regiões de alta prevalência, a transmissão perinatal adquire
grande importância, ao passo que, em regiões de baixa prevalência, as transmissões sexual e
parenteral assumem maior vulto. Locais com prevalência intermediária apresentam certa mistura
de padrões de transmissão, com comportamento epidemiológico variável (Hou et al. 2005, Paraná
& Almeida 2005, Tengan & Araujo 2006).
A transmissão perinatal (mãe-filho) é um dos modos mais eficientes e temíveis de
transmissão do HBV. Mais de 90% das transmissões ocorrem por meio de mães portadoras
crônicas do HBV, embora também seja possível que mulheres agudamente infectadas durante a
gravidez transmitam o vírus para o filho. Mulheres HBeAg positivas apresentam uma chance de 70
33
a 90% de infectar seus recém-nascidos, e quase 100% desses se tornarão cronicamente infectados
na ausência de profilaxia pós-exposição. Esses portadores constituem um grupo de indivíduos
infectados com potencial de perpetuação da infecção na comunidade (Coursaget et al. 1987,
Gonçales Jr 1996, Lee 1997, Ferreira 2000, Hou et al. 2005).
A transmissão para adultos é a forma primária de transmissão em áreas de baixa
endemicidade, onde há grande quantidade de indivíduos suscetíveis. Cerca de um terço dos adultos
recém-infectados desenvolve hepatite B aguda com icterícia. Desse total, cerca de 5 a 10% se
tornam portadores crônicos, com subseqüente risco de desenvolvimento de hepatite crônica ativa,
cirrose e carcinoma hepatocelular. A transmissão sexual, tanto hetero quanto homossexual, é
responsável pela maior parte da transmissão nesse grupo. Em algumas regiões, o
compartilhamento de agulhas por usuários de drogas injetáveis também é de grande importância na
transmissão do HBV entre adultos. Além disso, a hepatite B apresenta risco ocupacional para
trabalhadores da saúde. A transmissão por sangue e derivados ou por material médico-
odontológico não esterilizado também pode ocorrer, ganhando maior importância em locais de
baixa e média endemicidade (Alter 2003, Hou et al 2005).
O risco de infecção pelo HBV por transfusão foi reduzido dramaticamente após a inclusão
da triagem sorológica para hepatite B nos bancos de sangue. Contudo, em regiões que não
apresentam condições socioeconômicas favoráveis, esse risco ainda é observado (Schmunis et al.
1998, Alter 2003, Hou et al.2005, Bloch et al. 2011, Nagalo et al. 2011). Dados atuais apontam um
risco de transmissão do HBV nos Estados Unidos de uma a cada 300.000 transfusões sanguíneas
(Zou et al. 2011).
1.6.2- PREVALÊNCIA
A divisão do mundo em áreas de baixa, intermediária e alta endemicidade para o HBV
baseia-se na prevalência do marcador HBsAg. Áreas de alta endemicidade são aquelas onde
grande parte da população se infecta pelo HBV, com especial ênfase para a infecção adquirida no
período perinatal e durante a infância. Considera-se que o limite inferior de prevalência do HBsAg
nessas áreas seja de 8%, e que o superior atinja cerca de 20%. A maior parte dos países nessa
34
categoria apresenta uma prevalência de portadores entre 10 e 15%, com cerca de 50 a 95% da
população apresentando evidência sorológica de infecção prévia pelo HBV. Áreas de alta
endemicidade incluem África, Ásia a leste do subcontinente Indiano, regiões do Pacífico,
Amazônia, algumas regiões do Oriente Médio, da Ásia e do Caribe (Silveira et al. 1999, Tanaka
2000, Alter 2003, Merril & Hunter 2011).
As áreas de endemicidade intermediária geralmente apresentam prevalência do HBsAg
entre 2 e 7%, com cerca de 30 a 50% da população com evidência sorológica de infecção prévia.
Alguns países do leste da Europa, como Turquia e Romênia, regiões do Oriente Médio, da Ásia
ocidental e partes das Américas Central e do Sul são consideradas de endemicidade intermediária
(Tanaka 2000, Alter 2003, Paraná & Almeida 2005, Rantala & Laar 2008, Merril & Hunter 2011).
Nessas áreas, ocorre tanto a transmissão na infância, como entre adultos. Hepatite aguda com
icterícia ocorre com freqüência nessas regiões, uma vez que a doença sintomática é mais comum
em adolescentes e adultos (Alter 2003, Liang 2009).
América do Norte, Europa ocidental, Austrália e parte da América do Sul são consideradas
áreas de baixa endemicidade (Tassopoulos et al. 1987, Alter 2003, Rantala & Laar 2008, Pereira et
al. 2009, Merril & Hunter 2011). Nessas regiões, a transmissão perinatal e na infância é
relativamente incomum. A maioria das infecções ocorre em adultos por via sexual, uso de drogas
injetáveis ou exposição ocupacional a sangue e material perfuro-cortante contaminado (Elgouhari
et al. 2008).
Todavia, vale ressaltar que existe uma grande diversidade dentro da maioria dessas regiões.
A divisão das áreas de prevalência global deve ser interpretada como somatória aos achados
regionais. Os dados regionais são, contudo, muito importantes na definição de estratégias de saúde
pública e devem ser sempre levados em consideração (Ferreira 2000, Miranda et al. 2000). A
heterogeneidade pode ser caracterizada por áreas com diferentes níveis endêmicos dentro de uma
mesma região ou país, ou pelo comportamento epidemiológico diferente do esperado para
determinado nível endêmico. Deve-se reforçar que na América Latina a distribuição da infecção é
extremamente heterogênea, havendo regiões classificadas em todos os níveis endêmicos (Silveira
et al. 1999, Paraná & Almeida 2005).
35
No Brasil, foram encontradas variações nas taxas de prevalência nas diferentes regiões, e
até mesmo dentro de um mesmo estado. Na Região Sul, considerada como de baixa endemicidade,
foram descritas elevadas taxas de prevalência em algumas cidades do Paraná e Santa Catarina. Por
outro lado, na Região Norte, existem alguns locais de endemicidade baixa (Barcelos, Amazonas) e
intermediária, como o oeste do Estado do Acre. Nas Regiões Centro-Oeste, Nordeste e Sudeste,
consideradas como de endemicidade intermediária, encontrou-se em Vargem Alta, cidade do sul
do Estado do Espírito Santo, índice de positividade para o HBsAg de 9% (Fonseca 1989, Ferreira
et al. 1993, Arboleda et al. 1995, Souto et al. 1996, Souto 1999, Martelli et al. 1999, Tanaka 2000,
Carrilho 2001, Paraná & Almeida 2005, Viana et al. 2005). Clemens et al (2000), estudando
quatro diferentes regiões no Brasil (Manaus na Região Norte, Fortaleza na Região Nordeste, Porto
Alegre no Sul e Rio de Janeiro e Nova Friburgo no Sudeste), encontraram taxas de prevalência de
anti-HBc muito variáveis, sendo de maior prevalência a Região Norte. Em todas as regiões, houve
um aumento da prevalência do marcador anti-HBc em adolescentes, principalmente de baixo nível
socioeconômico.
Mais recentemente, um estudo de base populacional multicêntrico, realizado em todas as
capitais do Brasil, sugeriu a ocorrência de baixa endemicidade (menor que 1%) da infecção pelo
HBV no conjunto das capitais de cada macrorregião e do Distrito Federal. A prevalência global
para o marcador de exposição ao HBV (anti-HBc) foi de 7,4% (IC 95% 6,8%-8,0%) (Brasil 2011).
Dados publicados das Regiões Nordeste, Centro-Oeste e Distrito Federal mostram uma
prevalência de infecção prévia pelo HBV (anti-HBc) em aproximadamente 10% dos indivíduos
não vacinados, principalmente em homens e pessoas com idade maior ou igual a 20 anos. A
prevalência do HBsAg variou de 0,2 a 0,6% nas diferentes regiões. Avaliando-se as três capitais da
Região Centro-Oeste, excluindo-se o Distrito Federal, a prevalência do marcador de infecção anti-
HBc foi de 1,3% em crianças e adultos jovens até 20 anos, e de 12,7% acima dessa faixa etária. O
HBsAg foi encontrado entre 0,2 e 0,7% dependendo da faixa etária (Pereira et al 2009).
Em Goiânia, a prevalência da infecção pelo HBV foi estudada em diferentes populações
(Quadro 1), sendo que a taxa de positividade do HBsAg variou de 0,0 a 14,5% e a taxa de
prevalência global de 2,7 a 63,4%.
36
1.6.3- DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DOS GENÓTIPOS
Os genótipos do HBV possuem uma distribuição geográfica característica. O genótipo A é
prevalente nos Estados Unidos, parte da África, norte da Europa e Índia, sendo também encontrado
nas Filipinas e Hong-Kong. O genótipo B é mais freqüente em áreas de alta endemicidade, como a
Ásia. O genótipo C acompanha a distribuição geográfica do B, sendo também encontrado em
populações das Ilhas do Pacífico. O genótipo D está distribuído mundialmente, mas apresenta
maior prevalência no Mediterrâneo, Ásia Ocidental e Índia. O genótipo E é restrito à África
Ocidental, e o F circula nas Américas do Sul e Central. O genótipo G foi identificado em amostras
provenientes da França, América do Norte e Alemanha. O genótipo H circula nos Estados Unidos,
Nicarágua e México (Magnius & Norder 1995, Stuyver et al. 2000, Arauz-Ruiz et al. 2002, Allain
2006, Kay & Zoulin 2007, Kurbanov et al. 2010).
No Brasil, os genótipos A, B, C, D, F e G foram encontrados, sendo A, D e F os mais
prevalentes (Moraes et al. 1996, De Castro et al. 2000, Teles et al. 2002, Araújo et al. 2004, Sitnik
et al. 2004, Rezende et al. 2005, Viana et al. 2005, Ribeiro et al. 2006, Mello et al. 2007,
Bottecchia et al. 2008, Matos et al. 2009, Pereira et al. 2009).
37
Quadro 1: Estudos sobre a prevalência da infecção pelo vírus da hepatite B em Goiânia-GO
Referência População HBsAg (%) Global (%)
Cardoso et al. (1990) Feminina - 6,1
Martelli et al. (1990) Prisioneiros - 26,4
Martelli et al. (1990) Primodoadores - 12,8
Rosa et al. (1992) Hanseníase (ambulatoriais) 4,8 16,9
Rosa et al. (1992) Hanseníase institucionalizados 8,8 50,5
Azevedo et al. (1994) Profissionais da saúde 2,3 23,4
Porto et al. (1994) Meninos de /na rua 2,0 13,5
Cardoso et al. (1996)
Borges et al. (1997)
Teles et al. (1998)
Bastos (2000)
Lopes et al. (2001)
Silva et al. (2002)
Teles et al. (2002)
Carneiro & Daher (2003)
Costa (2004)
Souza et al. (2004)
Tavares et al. (2004)
Silva et al. (2005)
Ferreira et al. (2006)
Oliveira et al. (2006)
Ferreira et al. (2009)
Lemes (2011)
Gestantes
Pacientes em diálise
Pacientes em hemodiálise
Doenças falciformes
Profissionais de hemodiálise
Suspeita de hepatite
Pacientes em hemodiálise
Anestesiologistas
Idosos em asilos
Portadores de doença mental
Hemofílicos
Profissionais de laboratório
Pacientes em hemodiálise
Adolescentes
Usuários de drogas ilícitas
HIV soropositivos
0,5
13,7
12,0
0,0
0,7
14,5
5,8
0,0
0,5
1,6
1,1
0,7
2,4
0,6
1,0
5,8
7,5
63,4
56,7
2,7
24,3
50,7
-
8,9
32,3
22,4
43,7
24,1
-
5,9
15,0
25,4
38
1.7- PREVENÇÃO E CONTROLE DA HEPATITE B
O objetivo dos programas de prevenção da hepatite B é a redução dos índices de infecção
aguda e crônica e, conseqüente, hepatopatia crônica relacionada a esse vírus. A infecção pelo HBV
pode ser prevenida por controle rigoroso das doações de sangue, órgãos e tecidos e sêmen, e
apesar de tais medidas serem capazes de reduzir ou até mesmo eliminar um potencial risco de
transmissão, a medida preventiva mais eficaz consiste na vacinação contra hepatite B (Alter 2003).
Em 1991, a Organização Mundial de Saúde recomendou que todos os países incluíssem a
vacina contra hepatite B nos programas de imunização infantil. Mais tarde, ficou evidenciado que
essa intervenção protege os indivíduos em mais de 95% do risco de desenvolvimento de infecção
crônica e, consequentemente, de cirrose e carcinoma hepatocelular relacionados a esse vírus
(Lavanchy 2005). A imunização efetiva de crianças contra a hepatite B tem demonstrado alta
eficácia na redução das taxas de prevalência e incidência dessa infecção em diversos locais, como
Estados Unidos, Itália, Holanda e África do Sul (Tsebe et al. 2001, Lin et al. 2003, CDC 2004, Da
Villa et al. 2007, Van Houdt et al. 2007). No Brasil, a vacina foi incorporada ao calendário
nacional de imunizações no início da década de 1990 para crianças menores de 1 ano. Em 2001,
passou a ser disponibilizada para pessoas até 20 anos de idade (Brasil 2003, 2005), e mais
recentemente para indivíduos até 24 anos de idade (Brasil 2010), além de grupos em risco.
As vacinas disponíveis contra hepatite B são constituídas de HBsAg altamente purificado
obtido por tecnologia do DNA recombinante. Ensaios clínicos realizados com essas vacinas
mostram que a eficácia protetora está associada ao aparecimento de anticorpos anti-HBs, em
concentrações acima de 10 mUI/ml, o que pode ser percebido em mais de 90% dos adultos e
jovens sadios, assim como em mais de 95% dos lactentes, crianças e adolescentes (Kao & Chen
2002, Shouval 2003). A eficácia diminui com a idade, sendo menor em maiores de 40 anos, e aos
60 anos situa-se em torno de 40 a 60% (Mast et al. 2004). Este fato deve-se, aparentemente, à
senescência do sistema imune, embora outros fatores, como doenças crônicas, infecção pelo HIV,
tabagismo e local de aplicação também tenham sido associados a menores taxas de soroconversão
(Shaw & Gues 1989, Alves & Nascimento 2001, Shouval 2003).
39
O esquema vacinal recomendado é de três doses, sendo zero, um e seis meses. Sabe-se que
5-10% dos indivíduos saudáveis e 40-50% dos pacientes em hemodiálise não respondem a esse
esquema (Roukens & Visser 2011). Além disso, cerca de 30 a 60% dos indivíduos vacinados que
soroconverteram podem apresentar redução dos títulos de anti-HBs abaixo de 10 mUI/ml em cinco
anos após a vacinação, embora a memória imunológica persista nesses indivíduos, não havendo
necessidade de dose(s) de reforço (Zanetti et al. 2010). Entretanto, quando uma dose de reforço é
administrada, nota-se excelente resposta anamnéstica, com rápida e intensa elevação dos títulos de
anticorpos (European Consensus Group on Hepatitis B Immunity 2000, Banatvala & Van Damme
2003).
Outra medida utilizada na prevenção da infecção causada pelo HBV é a imunoprofilaxia
passiva, pelo uso da imunoglobulina humana hiperimune anti-hepatite B (HBIG). Essa
imunoglobulina contém altos níveis de anti-HBs preparados a partir do plasma de doadores, e tem
se mostrando eficaz na prevenção da transmissão pós-exposição viral, conferindo uma imunidade
passiva temporária (Joshi & Kumar 2001, Bruguera 2006). Comumente associada à vacinação, a
HBIG é indicada para uso em recém-nascido cuja mãe é HBsAg positiva, imediatamente após o
parto, ou até 12 horas após o nascimento. Outros casos indicados para profilaxia passiva são: após
exposição acidental com sangue HBsAg positivo, quando há exposição sexual com indivíduos
HBsAg positivos e nos pacientes submetidos ao transplante hepático (Holinger 1996, Joshi &
Kumar 2001, Brasil 2002, Hou et al. 2005, Lopes 2006, Bruguera 2006).
Além das medidas citadas, para se prevenir a transmissão do HBV, algumas mudanças
comportamentais devem ser consideradas, como a prática sexual segura e a não reutilização, ou
compartilhamento de seringas/agulhas e de objetos cortantes de higiene pessoal. A triagem dos
doadores de sangue e gestantes, a inativação viral dos hemoderivados e práticas adequadas de
biossegurança nos estabelecimentos de saúde são também medidas que reduzem o risco da
transmissão do HBV (Brasil 2006, 2008, 2009, Hou et al. 2005).
40
1.8- TUBERCULOSE
A tuberculose (TB) acompanha a humanidade desde a antiguidade. Acredita-se que a TB
tenha ocasionado mais óbitos do que qualquer outra doença infecciosa. Estima-se, nos últimos cem
anos, cem milhões de óbitos devido à TB. Podemos ter uma noção da extensão da TB
relembrando que, no início do século XX, 12% de todos os óbitos eram devidos à essa doença, e
que a maioria dos adultos nas grandes cidades européias estava infectada pelo Mycobacterium
tuberculosis (Kaufmann 2005). Em 1921, a primeira vacina contra TB foi desenvolvida por Albert
Calmette e Camille Guérin. Trata-se de uma vacina constituída por Mycobacterium bovis
atenuado, conhecida como BCG (Bacilo Calmette-Guérin) (Calmette & Guérin 1921 apud
Kaufmann 2005). O primeiro fármaco bactericida ativo contra o M. tuberculosis, a estreptomicina,
foi descoberto em 1944, com o surgimento de vários outros posteriormente, embora atualmente
seja muito preocupante a situação de resistência às drogas (Khoharo & Shaik 2011; Sharma et al.
2011; Spies et al. 2011). Outro grande marco no estudo e combate dessa doença foi o
sequenciamento do genoma do M. tuberculosis em 1998 (Gingeras et al. 1998).
Nos dias atuais, a TB permanece como um grande problema mundial de saúde pública e
uma das doenças infecciosas mais letais no mundo, afetando principalmente a faixa
economicamente ativa da população, e sendo responsável por grande número de óbitos,
especialmente em indivíduos HIV positivos. De acordo com dados da Organização Mundial de
Saúde (OMS), o número absoluto de novos casos de TB vem diminuindo a cada ano desde 2006,
assim como a taxa de incidência, com redução de cerca de 1,3% ao ano desde 2002 (WHO 2009,
2011). Em 2010, ocorreram aproximadamente 8,8 milhões de novos casos, com 1,1 milhões de
óbitos em pacientes HIV negativos, e cerca de 350.000 óbitos em HIV positivos. A África
subsaariana exibe a maior taxa de incidência mundial (290 casos/100.000 habitantes). Os países
mais populosos da Ásia, como Índia, China, Indonésia, Bangladesh e Paquistão, são responsáveis
por mais da metade dos casos mundiais. Dos casos diagnosticados em 2010, 40% são provenientes
da Índia e China, e 24% da África (WHO 2011). Apenas 22 países são responsáveis pela imensa
maioria dos casos de TB no mundo com 82% das notificações, dentre eles o Brasil (WHO 2007,
2009, 2011). Porém, dados recentes mostram uma queda progressiva na incidência e mortalidade
por TB em nosso país (WHO 2009, 2011). Em 2007, foram notificados mais de 87 mil casos no
41
Brasil, 756 casos novos em Goiás e 195 em Goiânia (Ministério da Saúde, DATASUS 2009). Em
2010, foram notificados no Brasil 81.946 casos, incluindo novos diagnósticos e recidivas (WHO
2011).
Cerca de 500.000 casos de TB multiresistente são detectados por ano, sendo 50% destes em
pacientes da China e Índia (Wright et al. 2009). Segundo dados da OMS, vem ocorrendo nos
últimos anos um aumento do número de casos multiresistentes diagnosticados, e o tratamento é
disponibilizado apenas para uma pequena parcela desses pacientes. Em 2010, apenas 16% do
número total estimado de pacientes com TB multiresistente iniciaram tratamento (WHO 2011).
Esses dados vêm nos lembrar da significativa morbidade e mortalidade causada pela TB em uma
escala global, além da crescente necessidade de um melhor entendimento da sua patogênese,
desenvolvimento de testes diagnósticos mais rápidos, além de fármacos e vacinas mais eficazes
(Kaufmann 2005).
A infecção se inicia pela inalação de diminutas partículas contendo o M. tuberculosis,
expectoradas por pacientes com TB pulmonar ou laríngea ativa, tipicamente após a tosse. A
transmissão ativa ocorre mais frequentemente entre contactantes próximos, e o risco de infecção
depende de vários fatores, como infectividade do caso índice, proximidade do contato, carga
bacilífera inalada e estado imunológico do hospedeiro (Frieden et al. 2003; Bellamy 2005).
Estudos epidemiológicos evidenciam importantes diferenças na apresentação da doença e fatores
demográficos em regiões de alta e baixa incidência. Em vários países africanos e asiáticos, a
incidência é maior em adultos jovens, e a maioria dos casos resulta de infecção recente ou
reinfecção (Dye 2006; Mathema et al. 2008; Mokaddas & Ahmad 2008). Inversamente, em países
de baixa incidência na Europa e América do Norte, a maior proporção de casos ocorre em idosos
ou imigrantes de regiões de alta incidência (Dye 2006). A doença pulmonar é responsável por mais
de 85% dos casos de TB ativa nos países de alta incidência, e as formas extrapulmonares são mais
comuns naqueles de baixa incidência, particularmente em pacientes HIV positivos ou imigrantes
de países endêmicos (Golden & Vikran 2005; Mokaddas et al. 2008).
As partículas inaladas escapam das defesas brônquicas devido ao seu pequeno tamanho e
penetram nos alvéolos terminais, sendo envolvidas por células apresentadoras de antígenos, como
macrófagos e células dendríticas. Na fase inicial da infecção, o M. tuberculosis se reproduz nessas
42
células, podendo atravessar a barreira alveolar para causar disseminação sistêmica (Bermudez et
al. 2002). A reprodução intracelular com simultânea disseminação do patógeno para os linfonodos
pulmonares e vários outros sítios extrapulmonares ocorrem previamente ao desenvolvimento das
respostas imunes adaptativas (Davis & Ramakrishnan 2009).
Imediatamente após a entrada do M. tuberculosis, macrófagos alveolares produzem
citocinas inflamatórias que servem como sinalizadores da infecção. Monócitos, neutrófilos e
linfócitos migram para o foco da infecção, porém são incapazes de destruir a bactéria. Durante
esse período, o bacilo resiste aos mecanismos bactericidas dos macrófagos evitando a fusão
fagossoma-lisossoma, se multiplica no interior do fagossoma, podendo levar à necrose do
macrófago (Pieters 2008).
Os bacilos livres passam a se multiplicar extracelularmente e são fagocitados por outros
macrófagos que também não conseguem controlar sua multiplicação (Pieters 2008). Essa
progressão de eventos se mantém contínua em pessoas com resposta imune debilitada, levando à
TB ativa em cerca de 10% dos indivíduos (TB primária). Entretanto, na grande maioria dos
indivíduos infectados, uma eficaz resposta imune celular se desenvolve entre 2 e 8 semanas após a
infecção, promovendo a formação de um granuloma no sítio da infecção (Russel 2007). Os
linfócitos T CD4+ reconhecem macrófagos infectados pelo M. tuberculosis e os destroem (Wolf et
al. 2008). Com a formação do granuloma e uma resposta imune eficaz, grande parte dos bacilos é
destruída e a progressão da doença é interrompida (Russel 2007; Cooper 2009). Porém, uma
ativação insuficiente de células T efetoras promove uma vigilância imunológica também
insuficiente e a criação de nichos onde o M. tuberculosis sobrevive em estado de latência, com
mínima ou nenhuma atividade metabólica e replicativa (Voskuil et al. 2003). O bacilo latente pode
permanecer no granuloma por toda a vida do hospedeiro, mas é capaz de voltar a se multiplicar
quando a resposta imune se torna comprometida (reativação da TB).
A OMS estima que um terço da população mundial está infectada de forma latente pelo M.
tuberculosis, e que 5 a 10% dos infectados irão desenvolver doença ativa durante a vida (Dye et al.
1999). Entretanto, em pacientes HIV positivos, esse risco é de 5 a 15% ao ano (WHO 2009).
Embora a reativação de uma infecção latente possa ocorrer décadas após a infecção inicial, o
maior risco ocorre durante os dois primeiros anos de infecção (Frieden et al. 2003; Fitzgerald &
43
Haas 2004; Hussain 2007; Kritski & Melo 2007). Vários fatores podem promover o
desenvolvimento de reativação, mas tipicamente envolvem um comprometimento do sistema
imunológico. A infecção pelo HIV é considerada o fator de risco mais importante para reativação
da doença em adultos por causar anormalidades funcionais das células T CD4+ e CD8+, que são
fundamentais na proteção contra TB ativa (Gardan et al. 2003; Ulrichs & Kaufmann 2006; Wells
et al. 2007).
O diagnóstico da TB pulmonar continua sendo um desafio, dada à baixa sensibilidade do
exame de microscopia do escarro, o método mais difundido mundialmente. Particularmente em
pacientes HIV positivos, novas orientações da OMS propõem a realização de culturas no escarro
naqueles pacientes com microscopia negativa (WHO 2009), medida que teve sua eficácia
comprovada por um grande estudo com 1060 pacientes na Tailândia e Vietnã (Monkongdee et al.
2009). Embora a cultura para micobactérias comprovadamente aumente o número de casos
diagnosticados, são necessários testes mais rápidos para diagnosticar TB pulmonar com
microscopia do escarro negativa. Investigadores europeus utilizaram um teste enzimático
(ELISpot) no lavado broncoalveolar, com sensibilidade de 91% e especificidade de 79%,
concluindo ser o mesmo capaz de diferenciar entre doença pulmonar ativa e TB latente (Jafari et
al. 2009). Entretanto, outro grupo mostrou resultados conflitantes com o mesmo teste (Dheda et al.
2009), exigindo a realização de novos estudos.
Em países desenvolvidos, a recente redução da incidência de TB foi responsável por uma
menor experiência dos profissionais de saúde em relação ao diagnóstico dessa doença, resultando
em diagnósticos mais tardios. Investigadores do Center for Diseases Control (CDC), nos EUA,
relataram uma maior proporção de casos com doença pulmonar avançada, definida como presença
de cavitação ao exame radiológico e bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) positivo no escarro. Os
autores concluíram que a TB pulmonar avançada acomete desproporcionalmente pacientes
considerados de baixo risco, e em áreas de baixa incidência (Wallace et al. 2009).
Em relação ao tratamento, os fármacos disponíveis atualmente podem apresentar três
diferentes mecanismos de ação: 1) ação bactericida, definida como capacidade de eliminar
rapidamente os bacilos em replicação ativa, dentre eles a isoniazida, e com menor potência, a
rifampicina e estreptomicina; 2) ação esterilizante, capacidade de eliminar bacilos em situação de
44
semi-latência, como a rifampicina e pirazinamida; 3) ação preventiva ao desenvolvimento de
resistência, como a isoniazida e rifampicina (Mitchison 2005). O esquema terapêutico clássico
recomendado pelo OMS engloba o uso de rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol
(WHO 2009).
Um melhor entendimento dos fatores de risco associados à progressão da TB latente para
doença é essencial para o desenvolvimento e implementação de medidas de controle. Vários
fatores de risco são identificados e utilizados no screening de populações de alto risco, como
fatores imunológicos e sociodemográficos, além do tabagismo (Bates et al. 2007; Slama et al.
2007; Lin et al. 2009).
Várias diretrizes vêm sendo divulgadas por órgãos internacionais com o objetivo de deter a
epidemia de TB. Dentre elas, destaca-se o “Segundo plano global para acabar com a TB no mundo
(2006-2015)”, que se baseia principalmente nos seguintes componentes: ampliação e
aperfeiçoamento da estratégia de tratamento supervisionado (DOTS); manuseio da associação
TB/HIV e TB multi-resistente; fortalecimento dos sistemas de saúde; engajamento dos provedores
de assistência global; apoio dos portadores de TB e das comunidades; e promoção de pesquisas
(WHO 2009). A cobertura do tratamento supervisionado (DOTS) no Brasil passou de 7% em 2000
para 81,2% em 2006 (Santos 2007). As taxas de cura entre os casos em tratamento supervisionado
e com tratamento autoadministrado pouco diferiram nas Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, mas
foram superiores entre os casos supervisionados nas Regiões Norte e Nordeste (Bierrenbach et al.
2007). A associação da TB com o HIV foi de 8,1% e 7,8% nos anos de 2000 e 2001,
respectivamente, sendo mais elevada nos estados onde a incidência ou o número de AIDS é maior
(Jamal & Moherdaui 2007).
1.9- INFECÇÃO PELO HBV E TUBERCULOSE
Ainda são poucas as investigações sobre a infecção pelo HBV em pacientes com
tuberculose. Nos Estados Unidos, índices elevados foram encontrados para o marcador HBsAg
(13,8%) e para tuberculose latente (48%) em imigrantes vietnamitas. Dentre os quais, alguns
pacientes HBeAg positivos apresentaram hepatotoxicidade grave durante o tratamento para TB,
45
requerendo sua descontinuidade (Patel & Voight 2002). Além disso, o fato de apresentar
transaminases previamente elevadas, ou ser portador de cirrose hepática, parece aumentar o risco
de desenvolvimento de hepatite medicamentosa em pacientes que recebem tratamento para TB
(Sun et al. 2009). Kuniholm et al. (2008), assim como Huang et al. (2009), também evidenciaram
aumento significativo da hepatotoxicidade pelo tratamento da TB em pacientes portadores de
hepatite B. Apesar de várias evidências comprovarem tal toxicidade, um estudo realizado em
Atlanta, EUA, com 50 pacientes com lesão hepática após uso de rifampicina e pirazinamida,
analisou os fatores preditivos para tal lesão, sendo a idade e associação com outros medicamentos
considerados fatores importantes, mas não a presença do HBV ou HCV (Ijaz et al. 2006).
Um estudo realizado na República da Geórgia (região de fronteira da Europa e Ásia)
mostrou uma prevalência alta para o marcador HBsAg (4,3%) em pacientes com TB. Fatores como
história de transfusão sanguínea, uso de droga injetável, início da atividade sexual precocemente e
múltiplos parceiros sexuais foram associados à infecção pelo HBV (Kuniholm et al. 2008). Na
Tailândia, Sirinak et al. (2008) encontraram 9% de positividade para o HBsAg em pacientes HIV-
positivos com TB, sendo o homossexualismo masculino fator independentemente associado a tal
coinfecção. Outro estudo, realizado na Índia, estimou uma prevalência de 6,4% para o HBsAg em
pacientes HIV positivos com TB, e mostrou baixo índice de hepatotoxicidade com o tratamento
antituberculose nos pacientes que cursavam com enzimas hepáticas normais (Padmapriyadarsini et
al. 2006). Já Wang et al. (2011) demonstraram que pacientes com hepatite B e altos níveis de carga
viral apresentam maior risco de hepatotoxicidade quando submetidos ao tratamento
antituberculose.
Na Argentina, Pando et al (2008) estudaram 205 pacientes com TB, encontrando uma
prevalência de infecção pelo HBV de 19,8% , sendo considerados fatores de risco idade acima de
30 anos, história de prisão, uso de drogas injetáveis ou parceiro usuário de drogas injetáveis e
história de doença sexualmente transmissível.
No Brasil, apenas um estudo foi realizado sobre a infecção pelo HBV em pacientes com
TB (n=209) no Rio de Janeiro, dos quais 26,8% apresentaram marcadores sorológicos de infecção
pelo HBV, e 2,8% foram HBsAg positivos (Blal et al. 2005).
46
1.10- JUSTIFICATIVA
A hepatite B é uma das doenças infecciosas mais comuns no mundo. Dos dois bilhões de
indivíduos infectados pelo HBV, mais de 350 milhões estão cronicamente infectados. Estima-se
que, desse grande número de portadores, cerca de 30 a 40% desenvolverão, em algum momento,
quadro de cirrose, e 1 a 5% dos cirróticos poderão desenvolver, ao ano, carcinoma hepatocelular
(Lavanchy 2008, Liang 2009, Liaw & Chu 2009, Wiersma 2011).
Há evidências que o HBV persista nos hepatócitos, impedindo, assim, que haja uma
completa eliminação do vírus do hospedeiro (Lok 2000). Vários fatores podem alterar a história
natural dessa infecção, chamando a atenção o fato de que o desenvolvimento de imunossupressão
pode levar à reativação da replicação viral em indivíduos considerados portadores inativos. Como
um dos principais fatores relacionados ao surgimento de imunossupressão, devemos citar a
infecção pelo HIV, que pode ocorrer pelas mesmas vias de transmissão do HBV (Spradling et al.
2010; Chen et al. 2011).
A tuberculose, doença descrita desde o princípio da humanidade, vem apresentando um
crescimento no número de casos em todo o mundo, particularmente em regiões menos
desenvolvidas, fato que está relacionado ao surgimento da epidemia de HIV/AIDS (Frieden et al.
2003; WHO 2007, 2009). Como grande parte dos casos de HIV/AIDS no mundo está associada a
comportamento sexual de risco, pode-se estimar que esses pacientes estejam sob risco de infecção
pelo HBV (Spradling et al. 2010; Chen et al. 2011).
A prevalência da infecção pelo HBV vem sendo estudada em Goiás em diferentes
populações, como profissionais de saúde (Azevedo et al. 1994), pacientes em hemodiálise (Teles
et al. 2002; Ferreira et al. 2006), hemofílicos (Tavares et al. 2004), escolares com baixo nível
socioeconômico (Oliveira et al. 2006), comunidades isoladas afro-descendentes (Matos et al.
2009), usuários de drogas ilícitas (Ferreira et al. 2009), dentre outras. Em relação à prevalência da
infecção pelo HBV em pacientes com TB, um único estudo realizado no Brasil foi conduzido no
Rio de Janeiro e demonstrou que o HBV é prevalente nessa população, particularmente naqueles
pacientes infectados pelo HIV (Blal et al. 2005).
47
Como os estudos sobre a infecção pelo HBV em pacientes com TB ainda são poucos no
mundo (Kuniholm et al. 2008; Pando et al. 2008; Sirinak et al. 2008; Wang et al. 2011), inclusive
no Brasil (Blal et al. 2005), e inexistentes na Região Centro-Oeste, o presente estudo foi realizado
visando investigar os aspectos soroepidemiológicos e moleculares da infecção pelo HBV em
pacientes com tuberculose em Goiânia-GO, sendo o primeiro estudo em Goiás com essa
finalidade.
Nesta tese, a prevalência e os fatores de risco foram pesquisados, considerando que são
dados importantes para subsidiar medidas de prevenção e controle. Realizou-se a pesquisa dos
marcadores sorológicos e do DNA viral, possibilitando o diagnóstico de hepatite B e de sua forma
oculta, que vem sendo estudada nos últimos anos e existem ainda controvérsias sobre sua evolução
para formas graves de doença hepática, porém apresenta importância no risco de transmissão do
HBV por transfusões sanguíneas e possível reativação aguda em casos de imunossupressão
(Hollinger & Sood 2010; Said 2011). Além disso, procedeu-se a determinação dos genótipos
virais, permitindo o melhor conhecimento dos genótipos circulantes em nossa região. Sabe-se hoje
que determinados genótipos apresentam maior risco de evolução para hepatopatias crônicas e
carcinoma hepatocelular e, para cada genótipo específico, pode-se planejar uma melhor estratégia
terapêutica (Livingston et al. 2007; Kao 2007; EASL 2009; Liang 2009; Liaw 2009).
48
2- OBJETIVOS
Este estudo tem como objetivo geral investigar os aspectos sorológicos, epidemiológicos e
moleculares da infecção pelo HBV em pacientes com tuberculose atendidos em hospital de
referência em Goiânia-GO, visando proporcionar informações para o diagnóstico, tratamento e
controle desta virose em pacientes com TB.
Objetivos específicos:
• Estimar a prevalência da infecção pelo HBV, considerando os marcadores sorológicos, em
pacientes com TB em hospital de referência em Goiânia-GO;
• Analisar os fatores de risco para hepatite B nos pacientes estudados;
• Identificar os genótipos do HBV circulantes na população-alvo;
• Determinar o índice de infecção oculta pelo HBV em pacientes anti-HBc positivos;
• Verificar o índice de imunização contra hepatite B nestes pacientes, considerando a
detecção isolada do marcador anti-HBs.
49
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- DELINEAMENTO E POPULAÇÃO DO ESTUDO
Estudo observacional, analítico, de corte transversal.
Todos os pacientes com diagnóstico de tuberculose, seja da forma pulmonar ou extra-
pulmonar, em tratamento atual ou não, atendidos nos ambulatórios de pneumologia e de
infectologia ou internados no Hospital de Doenças Tropicais Dr. Anuar Auad (HDT-HAA) em
Goiânia-GO, foram recrutados para o estudo.
No período de abril de 2008 a março de 2010, dos 425 pacientes com diagnóstico
confirmado de tuberculose, 402 aceitaram fazer parte do estudo, os quais foram incluídos após
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HDT-HAA.
3.2- ENTREVISTA E COLETA DE SANGUE
Para a entrevista, foi utilizado um questionário padronizado sobre dados sócio-
demográficos (idade, sexo, raça/etnia, estado civil, renda familiar, escolaridade e naturalidade),
fatores relacionados ao consumo de álcool e drogas ilícitas injetáveis e não injetáveis. Investigou-
se, ainda, atividades sexuais de risco (número de parceiros, parceiros do mesmo sexo, uso de
preservativo e história de doenças sexualmente transmissíveis) e outros fatores possivelmente
associados à transmissão do HBV, como hepatite na família, compartilhamento de objetos
cortantes de uso pessoal, cirurgia, transfusão sanguínea, hemodiálise, tatuagem, piercing,
acupuntura e história de prisão, além de vacinação prévia contra hepatite B.
Em seguida, foi realizada coleta de 10 ml de sangue por punção venosa periférica. O
sangue foi transportado para o Laboratório de Virologia do IPTSP/UFG, onde foi centrifugado e
50
os soros separados em duas alíquotas, sendo em seguida, armazanados a – 20° C até a realização
dos testes sorológicos e moleculares.
3.3 – TESTES SOROLÓGICOS
Inicialmente, todas as amostras foram testadas para a detecção dos marcadores sorológicos
HBsAg, anti-HBc total e anti-HBs pelo ensaio imunoenzimático (ELISA) utilizando-se reagentes
comerciais. Nas amostras HBsAg reagentes, foi realizada a detecção dos marcadores HBeAg e
anti-HBe pela mesma metodologia.
3.3.1 – Detecção do HBsAg
A detecção do marcador HBsAg foi realizada empregando-se reagentes comerciais
(Hepanostika HBsAg Ultra, Biomérieux-Alemanha). Em uma microplaca sensibilizada com
anticorpos anti-HBs monoclonais, foram adicionados o diluente (tampão fosfato), as amostras e
controles negativo e positivo em suas respectivas câmaras. A placa foi incubada e, posteriormente,
lavada. Após a adição do conjugado (anti-HBs marcado com peroxidase), a placa foi incubada e
lavada novamente. Em seguida, o substrato (peróxido de uréia) foi adicionado juntamente com o
cromógeno (tetrametilbenzidina - TMB). Após nova incubação, a reação foi interrompida pela
adição de ácido sulfúrico a 1N. Conforme as instruções do fabricante, a leitura espectrofotométrica
da reação foi realizada em 450 nm. Foram consideradas positivas as amostras que apresentaram
valores de absorbâncias maiores ou iguais ao valor do cut-off, obtido pela média das absorbâncias
dos controles negativos acrescida de 0,040.
3.3.2 – Detecção do anti-HBc total
Para detectar o marcador anti-HBc total, utilizou-se reagentes comerciais (Hepanostika
anti-HBc Uni-Form, Biomérieux-Holanda). O princípio da reação baseou-se na inibição
competitiva onde cada câmara da placa foi revestida com HBcAg. As amostras em teste e os
51
controles negativo e positivo foram incubados juntamente com o conjugado (constituído de
anticorpo anti-HBc humano ligado à enzima peroxidase) durante 90 minutos a 37ºC e, em seguida,
a placa foi lavada com o tampão fosfato. Posteriormente, foi adicionada a solução
substrato/cromógeno (tetrametilbenzidina/peróxido de uréia) e a reação incubada por 30 minutos.
A mesma foi interrompida com ácido sulfúrico a 1N e a leitura espectrofotométrica realizada em
450 nm. O valor do cut-off foi obtido pela fórmula: 0,25 (CNx + 3CPx), onde “CNx” é igual ao
valor médio das absorbâncias dos controles negativos e “CPx” ao dos controles positivos. Assim,
foram consideradas amostras positivas, aquelas que apresentaram absorbância menor ou igual ao
valor do cut-off.
3.3.3 – Detecção do anti-HBs
A detecção de anticorpos anti-HBs foi realizada pelo método imunoenzimático direto, tipo
sandwich em microplacas sensibilizadas com HBsAg (ad e ay), desenvolvido pela Biokit (Bioelisa
anti-HBs). As amostras e controles negativo e positivo foram adicionados às suas respectivas
câmaras. A placa foi incubada e, em seguida, lavada com tampão fosfato. Após a adição do
conjugado (HBsAg marcado com peroxidase), a placa foi incubada novamente. Realizada a
lavagem, a mistura substrato/cromógeno foi adicionada, sendo a placa mais uma vez incubada.
Então, a reação foi bloqueada pela ação de ácido sulfúrico, e a leitura (filtros de 450 nm e 620 nm)
realizada. O cut-off foi definido pela fórmula (CNx + 0,040), onde “CNx” é igual a média de
absorbância dos controles negativos. Os resultados foram obtidos pela razão entre a absorbância da
amostra e o valor do cut-off. As amostras com relação absorbância/cut-off ≥ 1,0 foram
consideradas positivas; com relação absorbância/cut-off < 0,9 foram negativas e, quando esta razão
foi igual a 0,9 as mesmas foram indeterminadas.
3.3.4 – Detecção do HBeAg e anti-HBe
Os testes ELISA Diasorin HBeAg (direto não competitivo) e anti-HBe (competitivo) foram
realizados em placa de poliestireno revestida com anticorpos monoclonais de camundongos contra
o antígeno e do HBV.
52
No ensaio para a detecção do HBeAg, amostras, controles (negativo e positivo) e
calibradores foram incubados com o tampão de incubação contendo IgG murina não específica,
em microplaca sensibilizada com anticorpos anti-HBe. Em seguida, foi realizada a lavagem e
acrescentado o conjugado enzimático (anti-HBe de rato conjugado com a peroxidase). Após a
incubação e lavagem, a reação foi revelada pela adição do substrato/cromógeno (peróxido de uréia
e TMB). A reação foi interrompida, sendo considerada positiva a amostra cuja absorbância (filtro
450 nm) foi maior ou igual ao cut-off, definido de acordo com as instruções do fabricante,
determinado pela adição de 0,060 à absorbância média dos valores do calibrador depois de subtrair
o branco do substrato.
Para detecção do anti-HBe, em microplaca sensibilizada com anticorpos monoclonais de
rato contra o antígeno e do HBV, foram adicionadas as amostras, controles e calibradores,
juntamente com uma solução contendo HBeAg recombinante. Durante a incubação, os anticorpos
presentes na amostra competem com os anticorpos monoclonais pelo HBeAg. Após a lavagem, o
complexo antígeno-anticorpo formado em excesso é removido. O conjugado enzimático foi
adicionado e a placa incubada novamente. A atividade do conjugado indica, de maneira
inversamente proporcional, a presença de anticorpos anti-HBe na amostra. Após a lavagem, foi
adicionado substrato/cromógeno, procedendo-se nova incubação. A reação foi interrompida, sendo
consideradas positivas as amostras que apresentaram valores de absorbância menores que o cut-off,
determinado pela adição de 0,500 à média de absorbância dos calibradores depois de subtrair o
valor do branco (substrato).
3.3.5 - Detecção do anti-HIV ELISA - A pesquisa de anticorpos para o HIV foi realizada por ELISA, HIV test (Wiener,
Argentina). Amostras e controles (positivo e negativo) foram diluídos nas câmaras da placa,
revestidas com antígenos do HIV (peptídeos sintéticos correspondentes às regiões pol, gag e env).
Após incubação e lavagem, foi adicionado o conjugado (anti-imunoglobulina humana conjugada
com peroxidase), realizada nova incubação, seguida de lavagem. Foram adicionados os
reveladores A (peróxido de hidrogênio 60 mmol/l em tampão citrato 50 mmol/l) e B
53
(tetrametilbenzidina – TMB – 0,01mmol/l em ácido clorídrico 0,1N), e realizada nova incubação.
A reação foi interrompida, sendo considerada positiva a leitura espectrofotométrica (filtro 450 nm)
com absorbância maior que o cut-off, definido de acordo com as instruções do fabricante, pela
adição de 0,150 à absorbância média dos valores do controle negativo.
Western-Blot - Todas as amostras reagentes para o HIV pelo ELISA foram submetidas ao teste
confirmatório New Lav Blot I (Bio-Rad, França). Inicialmente, tiras de nitrocelulose contendo
todas as proteínas estruturais do HIV-1 e um controle interno anti-IgG foram re-hidratados com
solução de lavagem/diluente. As amostras e controles (positivo e negativo) foram adicionados e a
reação incubada. Em seguida, procedeu-se aspiração do diluente, lavagem de cada uma das tiras e
a adição do conjugado (anticorpos de cabra anti-IgG humana marcados com fosfatase alcalina).
Após nova incubação e lavagem, foi adicionada a solução de revelação (5 Bromo – 4 Cloro – 3
Indolil Fosfato/BCIP e NitroBlue Tetrazolium/NBT em solução tampão de revelação) e sob
agitação observou-se o aparecimento da coloração nas tiras reagentes. A reação foi interrompida
pela remoção da solução de revelação e enxágüe das tiras com água destilada. Na leitura e
interpretação dos resultados, observou-se inicialmente a reatividade do controle positivo e do
controle interno de cada tira, sendo considerado o aparecimento de bandas específicas (azul
violeta) na posição das proteínas virais, conforme as instruções do fabricante e da OMS. Assim, a
amostra foi considerada positiva quando houve reatividade para duas proteínas env, ou para uma
proteína env e uma proteína gag ou pol; negativa na ausência de qualquer banda, e indeterminada
quando apresentou perfil diferente dos anteriores.
3.3.6- Detecção do anti-HCV
ELISA - Os soros obtidos foram testados para detecção de anticorpos anti-HCV
empregando-se reagentes comerciais (Hepanostika anti-HCV Ultra, Biomedical-China). As
amostras de soro juntamente com os controles positivo e negativo foram incubados em placa
previamente sensibilizada com os antígenos recombinantes das regiões core, NS3, NS4 e NS5 do
HCV. Após 60 minutos de incubação a 37°C, a placa foi lavada com o tampão fosfato por seis
vezes. Em seguida, foi adicionado o conjugado (anti-imunoglobulina humana marcada com
54
peroxidase) e nova incubação realizada por mais 30 minutos. Após segunda lavagem, procedeu-se
a adição do substrato da enzima (peróxido de uréia) e da solução cromógena (tetrametilbenzina –
TMB), incubando-se por 30 minutos. A seguir, a reação foi interrompida pela adição de ácido
sulfúrico a 1N e a leitura espectrofotométrica realizada em leitora de microplaca com uso de filtro
simples (450 nm). O valor do cut-off foi obtido pela fórmula: 0,27 x CPx, onde “CPx” é igual ao
valor médio das absorbâncias dos controles positivos. Assim, foram consideradas amostras
positivas, aquelas que apresentaram absorbância maior ou igual ao valor do cut-off.
Immunoblot - As amostras reagentes no ELISA foram retestadas pelo teste confirmatório
(CHIRON ® RIBA HCV 3.0 SAI Ortho Clinical Diagnostic, USA), que é um immunoblot
qualitativo in vitro com antígenos recombinantes e peptídeos sintéticos do HCV imobilizados
como bandas individuais sobre tiras do teste. Os antígenos recombinantes (c33c e NS5) e os
peptídeos sintéticos (c100c e 5-1-1p) são derivados das regiões não estruturais do vírus, enquanto
que o terceiro peptídeo recombinante (c22p) corresponde à proteína do capsídeo viral.
O ensaio foi realizado em três fases. Na primeira, as tiras foram hidratadas com solução
diluente (1 ml). Em seguida, as amostras (20 µl) e controles (20 µl) foram adicionados, e a reação
incubada por quatro horas sob agitação em temperatura ambiente. Logo após, procedeu-se
aspiração do diluente e lavagem de cada uma das tiras. Na segunda fase, foi adicionado em cada
tira 1 ml de conjugado (anti-IgG humana produzida em cabra, marcada com peroxidase),
realizando-se incubação por 10 minutos sob agitação, seguida de lavagem. Na terceira fase, foi
acrescentado 1 ml do substrato (peróxido de hidrogênio e 4-cloro-1-naftol). Após a incubação, a
reação foi interrompida pela remoção do substrato, seguida da lavagem final.
A reatividade da banda a cada antígeno foi determinada comparando-se visualmente a
intensidade de cada banda individual com a banda de controle interno de IgG humano alto e baixo
presentes em cada tira. Foram consideradas positivas, as amostras que apresentaram duas ou mais
bandas específicas contra os antígenos virais, e negativas quando nenhuma banda foi encontrada.
55
3.4 – DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO HBV DNA
3.4.1 - Extração do HBV DNA
As amostras HBsAg e/ou anti-HBc reagentes foram submetidas à extração do ácido
nucléico viral, realizada em duas etapas (Niel et al. 1994). A primeira consistiu na adição de 250
mL do soro em 80 mL de solução de lise, sendo esta composta por solução A (Tris 200 mM, SDS
1%, NaCl 700 mM, EDTA 20 mM e tRNA 0,1 mg/mL) e solução B (proteinase K 2 mg/mL)
dissolvida em solução de CaCl2 0,36 mM; o pH final foi ajustado para 9,0 utilizando o HCl. Os
soros, juntamente com a solução de lise, foram incubados em banho-maria por 4 horas a 37°C. O
DNA viral foi extraído pelo uso de fenol/clorofórmio, centrifugado, e a fase superior transferida
para tubos contendo etanol. Estes foram mantidos a –20ºC durante a noite. A segunda etapa da
reação consistiu na centrifugação do material e a formação de um precipitado, que em seguida foi
lavado com etanol a 70%, seco e ressuspenso em 30 mL de água milliQ auloclavada.
3.4.2 - Reação em cadeia pela polimerase
Após a extração do DNA, o mesmo foi submetido a uma semi-nested PCR, para
amplificação da região pré-S/S do genoma do HBV, que foi realizada em duas etapas (Motta-
Castro et al. 2005).
Para a primeira, denominada PCR-1, utilizou-se uma mistura contendo 1 pmol dos primers
PS1 e S2/S22 (Quadro 2) (Invitrogen), responsáveis pela amplificação do fragmento de DNA do
nucleotídeo 2826 a 841 do genoma; 0,2mM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 3mM de
Cloreto de magnésio (MgCl2) e 1 U de Taq DNA polimerase, num volume final de 50 µl. O HBV
DNA de cada amostra extraído na fase anterior (2 µL) foi misturado aos componentes descritos
acima, e esta mistura levada ao termociclador com o seguinte programa: 94ºC por 3 minutos
(desnaturação inicial), 30 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 52ºC por 40 segundos e 72ºC por 2
minutos (desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente) e 72ºC por 7 minutos
(alongamento final). O produto final desta reação era composto de 1236 pares de bases (pb).
56
A segunda etapa (PCR-2) foi realizada nas mesmas condições da PCR-1 empregando-se os
primers PS1 e SR (Quadro 2) (Invitrogen). O produto da PCR-1 (1 µl) foi adicionado à nova
mistura da reação e levado ao termociclador, com o seguinte programa: 94ºC por 3 minutos
(desnaturação inicial), 30 ciclos de 94ºC por 20 segundos, 55ºC por 20 segundos e 72ºC por 1
minuto (desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente) e 72ºC por 7 minutos
(alongamento final). O produto da PCR-2 era composto de 1099 pb.
3.4.3 - Eletroforese em gel de agarose
Ao gel de agarose preparado a 1% em tampão TBE (Tris-Borato EDTA), foi acrescentado
brometo de etídio em uma concentração final de 0,5 mg/mL. Os produtos obtidos após a PCR- 2 e
o marcador de peso molecular (100 pb - Invitrogen) foram misturados ao corante azul de
bromofenol, aplicados ao gel e submetidos à eletroforese. As bandas formadas durante a corrida
foram visualizadas através de luz ultravioleta com auxílio de um transluminador.
3.4.4 - Genotipagem pela análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de
restrição (restriction fragment length polymorphism - RFLP)
O fragmento de DNA amplificado foi analisado pelo método de RFLP, utilizando-se três
enzimas de restrição ou endonucleases (Araújo et al. 2004). Resumidamente, as enzimas EcoRI,
BamHI e StuI (New England BioLabs) foram diluídas (8 µl de água milliQ, 2 µl de tampão
específico e 10 U de cada enzima separadamente) e incubadas a 37°C durante a noite com igual
volume (10 µl) do produto obtido da PCR-2. As amostras foram misturadas a 5 µL de azul de
bromofenol, aplicadas em gel de agarose a 3% e submetidas à eletroforese. Utilizou-se, também,
um marcador (1 µL/mL do marcador 100 pb, 10 µL de TBE e 5 µL de azul de bromofenol). As
bandas formadas foram visualizadas através de luz ultravioleta com o auxílio de um
transluminador. A interpretação dos padrões eletroforéticos proporcionou a distinção entre os
genótipos do HBV encontrados (A e D).
57
3.4.5 – Genotipagem por sequenciamento nucleotídico e análise filogenética
Inicialmente, as amostras HBV-DNA positivas foram submetidas à amplificação da região
S, por semi-nested PCR. Na primeira amplificação, foram utilizados os primers : PS1, S2 e S22. A
segunda PCR foi realizada com os primers S1, S2 e S22 (Quadro 2). O DNA amplificado para a
região S foi purificado utilizando o kit QIAquick PCR purification (Qiagen). Resumidamente, em
tubo tipo eppendorf foram adicionados cinco volumes (500 µl) do tampão, que favorece a ligação
do DNA à membrana de sílica, ao volume total (100 µl) do produto obtido na PCR. Essa mistura
foi homogeneizada e, em seguida, aplicada na coluna fornecida pelo kit, que foi centrifugada por
um minuto a 13.000 rpm. Posteriormente, o líquido centrifugado foi descartado e, logo após, 750
µl do tampão de lavagem foram adicionados à coluna, sendo essa, igualmente submetida à
centrifugação. Depois dessa etapa, o líquido residual foi descartado e o tubo mais uma vez
centrifugado para retirar o excesso de tampão. Em seguida, a coluna QIAquick foi colocada em um
tubo tipo eppendorf, onde foram adicionados 50 µl do tampão de eluição no centro da membrana
da coluna e centrifugou-se como já descrito. Ao final do processo, a coluna foi desprezada, e o
DNA coletado no tubo tipo eppendorf foi armazenado a -20ºC.
Na etapa seguinte, foi realizada a quantificação do DNA purificado. Cada amostra (4 µL)
foi aplicada em gel de agarose a 2%, bem como 4µL do marcador de massa e peso molecular Low
DNA Mass Ladder (Invitrogen), afim de comparar a intensidade das bandas e calcular a
concentração de DNA a ser utilizada na técnica de sequenciamento.
As seqüências de nucleotídeos da região amplificada foram determinadas pelo
seqüenciamento direto utilizando BigDye Terminator v.3.01 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) com primers específicos (S1, S4, S7, S2 e S22) (Quadro 1). Para cada reação,
empregou-se 2 µL do DNA purificado, adicionados a 13 µL da mistura contendo: água MilliQ (6
µL), tampão (3 µL), primer (3 µL – 2 pmol) e 1µL do reagente fornecido pelo kit de
seqüenciamento (Big Dye) que contém ddNTPs (trifosfatos de didesoxinucleotídeos) marcados.
Em seguida, as amostras foram submetidas a 25 ciclos (95°C por 20 segundos, 50°C por 15
segundos e 60°C por 60 segundos) em um termociclador, para a síntese da fita complementar e
incorporação dos ddNTPs marcados.
58
Posteriormente, aos 15 µL de reação, foram adicionados 65 µL de isopropanol a 65% e a
placa foi centrifugada por 45 minutos (2000 rcf) a 20°C, para precipitação das amostras. Logo
após, o isopraponol foi desprezado e à placa foram adicionados 250 µL de etanol a 60%, seguido
de centrifugação por 10 minutos (2000 rcf). Essa etapa foi repetida por mais uma vez com 100 µL
de etanol a 60%. Após a centrifugação, o etanol foi retirado e a placa foi colocada em
termociclador para completa secagem da mesma durante 2 minutos a 95°C.
Às amostras, foram adicionados 10 µL de formamida Hi Di (Applied Biosystems) e a placa
foi colocada em termociclador por um período de 5 minutos a 95°C. Imediatamente após a
incubação, as amostras foram colocadas em gelo por dois minutos e a reação colocada no
sequenciador automático ABI 3130 (Applied Biosystems, Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA).
Para a análise das seqüências, um consenso das fitas sense e antisense foi montado
utilizando o programa SeqMan II versão 5.01(DNASTAR). Para a identificação do genótipo viral,
as seqüências consenso de cada amostra foram alinhadas, utilizando-se o programa Clustal X
(Thompson et al., 1997) juntamente com seqüências dos diferentes genótipos do HBV (A-H)
obtidas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). O programa BioEdit foi utilizado para edição
do alinhamento. A classificação dos genótipos foi realizada por análise filogenética utilizando-se o
programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versão 4 (Tamura et al., 2007). As
análises foram realizadas utilizando-se o método de Neighbor-Joining e o modelo de substituição
de nucleotídeos Kimura 2 parâmetros. Finalmente, a robustez dos grupos filogenéticos foi avaliada
utilizando bootstrap de 1025 repetições.
59
Quadro 2- Primers utilizados na amplificação da região Pré-S/S e sequenciamento
Primer Sentido Seqüência (5 ’ 3’)
PS1 sense CCATATTCTTGGGAACAAGA
S1 sense CTTCTCGAGGACTGGGGACC
S2 anti-sense GGGTTTAAATGTATACCCAAAGA
S4 sense TGCTGCTATGCCTCATCTTCT
S7 anti-sense TGAGCCAGGAGAAACGGGCT
S22 anti-sense GTATTTAAATGGATACCCAAAGA
SR anti-sense CGAACCACTGAACAAATGGC
3.5 – ANÁLISE DOS DADOS
Os dados das entrevistas, bem como os resultados dos testes sorológicos e moleculares,
foram analisados empregando-se o programa EpiInfo versão 6.04 (Centers for Disease Control
and Prevention, Atlanta, GA). Prevalência e estimativas de risco foram calculadas com intervalo
de confiança de 95%. Fatores de risco associados à exposição ao HBV (positividade ao HBsAg
e/ou anti-HBc) pela análise univariada (p ≤ 0,10) foram analisados posteriormente por regressão
logística por meio do programa SPSS versão 11.0 for Windows. Os testes Qui-quadrado, Qui-
quadrado para tendência e exato de Fisher foram utilizados quando apropriados. Valores de p <
0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
60
4- RESULTADOS
4.1- CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA
A Tabela 1 mostra as características sociodemográficas dos 402 pacientes portadores de
tuberculose estudados em Goiânia-GO. A média de idade foi de 44,1 anos (desvio padrão de 15,6).
Ao estratificar a população estudada por faixa etária, verificou-se que 75 pacientes (18,7%) tinham
idade menor ou igual a 30 anos, 98 (24,4%) entre 31 e 39 anos, 93 (23,1%) entre 40 e 49 anos e
136 pacientes (33,8%) tinham idade igual ou superior a 50 anos. A maioria era do sexo masculino
(71,9%) e com tempo de escolaridade de até 9 anos (79,8%).
Em relação ao estado civil, 42,3% eram solteiros, 39% casados ou com união consensual e
18,7% separados ou viúvos.
Quanto à renda familiar, 63,8% informaram renda menor ou igual a um salário mínimo,
31,3% de dois a três salários mínimos, e apenas 4,9% acima de três salários mínimos.
Evidenciou-se que quase a metade dos pacientes estudados era parda (46%) e natural de
Goiás (50,2%).
4.2- MARCADORES SOROLÓGICOS DO VÍRUS DA HEPATITE B
Os marcadores sorológicos para infecção pelo HBV (Tabela 2) foram encontrados em 103
pacientes, resultando em uma prevalência global de 25,6% (IC 95%: 21,5-30,2). O marcador anti-
HBc foi detectado isoladamente em 9 pacientes (2,2%). Esse marcador, quando associado ao anti-
HBs, foi reagente em 81 pacientes (20,1%), e ao HBsAg em 8 pacientes (2,0%). Ainda, 5 (1,2%)
pacientes apresentaram positividade para o HBsAg, na ausência do marcador anti-HBc.
Em 44 (10,9%) pacientes com tuberculose, verificou-se positividade isolada para o
marcador anti-HBs, indicando imunização contra hepatite B.
A suscetibilidade ao HBV, caracterizada pela ausência de qualquer marcador sorológico,
foi observada em 255 pacientes (63,5%).
61
Tabela 1 - Características sociodemográfícas dos 402 pacientes com tuberculose estudados em Goiânia, Goiás
Características N %
Idade (média ± dp: 44,1 ± 15,6)
≤ 30 anos 75 18,7
31 – 39 anos 98 24,4
40 – 49 anos 93 23,1
≥ 50 anos 136 33,8
Sexo
Masculino 289 71,9 Feminino 113 28,1
Estado Civil
Solteiro 170 42,3 União consensual/Casado 157 39,0 Separado/Viúvo
75 18,7
Escolaridade*
< 5 anos 127 31,8 5 – 9 anos 192 48,0 10 – 12 anos 65 16,2 > 12 anos 16 4,0
Renda Familiar
≤ 1 sm 247 63,8 2 - 3 sm 121 31,3 > 3 sm Sem informação 15
19 4,9
Raça/Etnia Branco 137 34,1 Pardo 185 46,0 Negro 59 14,7 Amarelo 17 4,2 Índio/Vermelho
4 1,0
Naturalidade Goiás 202 50,2 Outros estados 200 49,8 dp: desvio-padrão sm: salário mínimo *No cálculo, foram excluídas duas crianças com menos de seis anos de idade (n=400)
62
Tabela 2 – Prevalência dos marcadores sorológicos do vírus da hepatite B em 402 pacientes com tuberculose em Goiânia, Goiás
Categoria Marcadores Positivo
IC 95% n %
Infectados HBsAg 5 1,2 0,5-3,0
HBsAg/Anti-HBc 8 2,0 0,9-4,0
Anti-HBc 9 2,2 1,1-4,4
Anti-HBc/Anti-HBs 81 20,1 16,4-24,5
Global 103 25,6 21,5-30,2
Imunizados Anti-HBs 44 10,9 8,1-14,5
Suscetíveis Ausência de marcador 255 63,5 58,5-68,1
IC: Intervalo de confiança.
4.3- FATORES DE RISCO ASSOCIADOS À INFECÇÃO PELO HBV
A Tabela 3 apresenta as razões de chance de prevalência para os fatores de risco associados
à infecção pelo HBV, com seus respectivos intervalos de confiança a 95%, em pacientes com
tuberculose. Dentre os fatores analisados, os seguintes se mostraram estatisticamente significativos
na análise univariada: sexo masculino, uso de drogas injetáveis, consumo de álcool e relato de
parceiro sexual do mesmo sexo.
Após análise multivariada (Tabela 4), verificou-se que os pacientes com idade igual ou
superior a 50 anos apresentaram 2,9 (IC 95%: 1,2-7,0; p=0,02) vezes mais chances de exposição
ao HBV quando comparados aos que tinham idade menor ou igual a 30 anos. Em relação à história
de uso de drogas, os pacientes que usaram drogas não injetáveis apresentaram 2,5 (IC 95%: 1,2-
5,2; p=0,02) vezes mais chances de infecção pelo HBV do que aqueles que nunca usaram drogas, e
os pacientes que usaram drogas injetáveis mostraram risco 4,1 (IC 95%: 1,4-11,6; p<0,01) vezes
maior de adquirirem esse vírus.
63
Tabela 3 – Análise univariada dos fatores de risco associados à infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) em pacientes com tuberculose em Goiânia, Goiás (n=358)
Fator de risco HBV Positivo/Total*
% Estimativa de risco (IC 95%)
P
Idade
≤ 30 anos 14/58 24,1 1,0
31-39 anos 23/91 25,3 1,1 (0,5-2,4) 0,87
40-49 anos 25/86 29,1 1,3 (0,6-3,0) 0,51
≥ 50 anos 41/123 33,3 1,6 (0,7-3,4) 0,21
Sexo
Feminino 20/96 20,8 1,0
Masculino 83/262 31,7 1,8 (1,0-3,1) 0,04
Hepatite na família
Não 74/279 26,5 1,0
Sim 18/51 35,3 1,5 (0,8-2,8) 0,20
Sem informação 28
Transfusão de sangue
Não 63/243 25,9 1,0
Sim 40/114 35,1 1,5 (1,0-2,5) 0,07
Sem informação 1
Cirurgia
Não 47/172 27,3 1,0
Sim 56/184 30,4 0,9 (0,5-1,4) 0,51
Sem informação 2
Tatuagem/Piercing
Não 76/283 26,9 1,0
Sim 27/74 36,5 1,6 (0,9-2,7) 0,10
Sem informação 1
Acupuntura
Não 99/344 28,8 1,0
Sim 3/7 42,9 1,8 (0,4-8,4) 0,42
Sem informação 7
Compartilhamento de objetos de uso pessoal
Não 66/237 27,8 1,0
Sim 35/116 30,2 1,1 (0,7-1,8) 0,65
Sem informação 5
IC: Intervalo de confiança *Foram excluídos os pacientes vacinados contra hepatite B
64
Tabela 3 – Análise univariada dos fatores de risco associados à infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) em pacientes com tuberculose em Goiânia, Goiás (n=358) (continuação)
Fator de risco HBV Positivo/Total*
% Estimativa de risco (IC 95%)
P
Hemodiálise
Não 99/352 28,1 1,0
Sim 3/4 75,0 7,7 (0,8-74,6) 0,07
Sem informação 2
Uso de drogas ilícitas
Não 68/265 25,7 1,0
Não injetável 25/72 34,7 1,5 (0,9-2,8) 0,12
Injetável 10/21 47,6 2,6 (1,0-7,0) 0,03
Uso de álcool
Não 27/126 21,4 1,0
Sim 76/232 32,8 1,8 (1,1-3,0) 0,02
Antecedente de prisão
Não 72/267 27,0 1,0
Sim 31/91 34,1 1,4 (0,8-2,3) 0,20
Número de parceiros sexuais
≤ 2 13/57 22,8 1,0
3 – 5 12/65 18,5 0,8 (0,3-2,0) 0,55
> 5 77/225 34,2 1,8 (0,9-3,7) 0,10
Sem informação 11
Parceiro do mesmo sexo
Não 85/307 27,7 1,0
Sim 15/34 44,1 2,1 (1,0-4,2) 0,04
Sem informação 17
Uso de preservativo na última relação
Sim 63/228 27,6 1,0
Não 35/109 32,1 1,2 (0,7- 2,0) 0,40
Sem informação 21
Doença sexualmente transmissível
Não 54/206 26,2 1,0
Sim 41/132 31,1 1,3 (0,8-2,0) 0,33
Sem informação 20
IC: Intervalo de confiança *Foram excluídos os pacientes vacinados contra hepatite B
65
Tabela 4 – Análise multivariada dos fatores de risco associados à infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) em pacientes com tuberculose em Goiânia, Goiás
Estimativa de risco* (IC 95%)
Fatores de risco P
Não Ajustada Ajustada*
Sexo
Feminino 1,0 1,0
Masculino 1,8 (1,0-3,1) 1,1 (0,6-2,3) 0,71
Idade
≤ 30 anos 1,0 1,0
31 – 39 anos 1,1 (0,5 – 2,4) 0,9 (0,4-2,0) 0,80
40 – 49 anos 1,3 (0,6 – 3,0) 1,6 (0,7-4,0) 0,27
≥ 50 anos 1,6 (0,7 – 3,4) 2,9 (1,2-7,0) 0,02
Transfusão de sangue
Não 1,0 1,0
Sim 1,5 (1,0-2,5) 1,3 (0,8-2,3) 0,28
Uso de drogas ilícitas
Não 1,0 1,0
Não injetável 1,5 (0,9 – 2,8) 2,5 (1,2-5,2) 0,02
Injetável 2,6 (1,0 – 7,0) 4,1 (1,4-11,6) <0,01
Uso de álcool
Não 1,0 1,0 Sim
1,8 (1,1-3,0) 1,4 (0,8-2,5) 0,23
Hemodiálise Não 1,0 1,0 Sim 7,7 (0,8-74,6) 5,6 (0,5-59,6) 0,15
Tatuagem/piercing
Não 1,0 1,0
Sim 1,6 (0,9-2,7) 1,3 (0,6-2,9) 0,47
Número de parceiros sexuais
≤ 2 1,0 1,0
3 – 5 0,8 (0,3 – 2,0) 1,0 (0,4-2,5) 0,97
> 5 1,8 (0,9 – 3,7) 1,8 (0,9-3,9) 0,11
Parceiro do mesmo sexo
Não 1,0 1,0
Sim 2,1 (1,0-4,2) 1,9 (0,8-4,1) 0,13
IC: Intervalo de confiança *Estimativa de risco ajustada por sexo, idade, transfusão de sangue, uso de drogas ilícitas e de álcool, hemodiálise, tatuagem/piercing, número de parceiros sexuais e parceiro do mesmo sexo.
66
4.4- CARACTERÍSTICAS SOROLÓGICAS E MOLECULARES DOS PACIENTES
HBsAg REAGENTES
As caracterísicas sorológicas e moleculares dos pacientes HBsAg positivos encontram-se
listadas na Tabela 5. Das 13 amostras HBsAg reagentes, duas apresentaram positividade para o
HBeAg, e seis para o anti-HBe, enquanto cinco foram negativas para ambos. O HBV-DNA foi
detectado em 10 (76,9%) amostras HBsAg reagentes, sendo seis genotipadas por seqüenciamento
e oito por RFLP. Destas, em sete amostras foi detectado o genótipo A, sendo quatro do
subgenótipo A1 e uma do subgenótipo A2. A amostra restante foi do genótipo D, subgenótipo D2
(Figura 5).
Tabela 5 - Características sorológicas e moleculares das amostras HBsAg reagentes de pacientes com tuberculose em Goiânia-GO
Amostra HBeAg Anti-HBe Anti-HBc HBV-DNA Genótipo (Subgenótipo)
TB 04 TB 100 TB 104 TB 105 TB 120 TB 189 TB 218 TB 219 TB 230 TB 232 TB 280 TB 332 TB 363
+ - - - - - -
+ - - - - -
-
+
+
+
+ - - - - -
+
+ -
+
+
+ -
+ - -
+ - -
+
+
+
+
+/-
+ -
+
+
+
+ - -
+
+
+/-
A (A2)
-
D (D2) -
A (A1)
A
A
A (A1) - -
A (A1)
A (A1) -
+/- : positivo fraco
67
Figura 5 – Árvore filogenética da região S do vírus da hepatite B, incluindo seis sequências
obtidas de pacientes com tuberculose (TB) em Goiânia-GO e 20 sequências do Genbank dos
genótipos A-H (apresentadas pelo número de acesso, seguido do local de origem).
TB280
TB332
AY344107-A1 Brasil
TB219
TB120
U87742-A1 África do Sul
AY344098-A2 Brasil
TB04
AF143306-A2 Alemanha
AB194951-A3 Camarões
AF160501-G França
AF282918-B China
V00867-C Japão
AB048702-D4 Austrália
FN594770-D8 Nigéria
FJ904428-D7 Tunísia
FJ865548-D3 Brasil
AB493846-D6 Indonésia
AB033558-D1 Japão
DQ315779-D5 India
TB104
FJ865554-D2 Brasil
AB205126-D2 Japão
X75664-E África (oeste)
X69798-F Brasil
AY090457-H Nicarágua
99
82
88
81
73
99
78
87
0.000.010.020.03
68
4.5- INFECÇÃO OCULTA PELO HBV
Das nove amostras com perfil anti-HBc reagente isolado, uma foi HBV-DNA positiva.
Dentre 81 amostras anti-HBc e anti-HBs reagentes, 12 foram HBV-DNA positivas. Assim sendo,
o índice de infecção oculta pelo HBV foi de 14,4% (13/90) nos pacientes com tuberculose anti-
HBc reagentes. A Tabela 6 mostra as principais características dos pacientes com infecção oculta
pelo HBV. A idade variou de 32 a 76 anos, e houve predomínio de sexo masculino. Em relação
aos marcadores sorológicos de hepatite B, a maioria dos pacientes foi anti-HBc e anti-HBs
positiva, enquanto apenas um paciente apresentou o perfil anti-HBc isolado. Três indivíduos
tiveram sorologia positiva para anti-HCV e três para anti-HIV.
Tabela 6 - Características dos pacientes com infecção oculta pelo HBV
Amostra Idade Sexo Perfil sorológico
TB 01 TB 28 TB 30 TB 32 TB 46 TB 62 TB 63 TB 133 TB 149 TB 198 TB 324 TB 347 TB 386
48
70
32
38
37
34
51
70
62
58
52
54
76
M
F
F
M
F
M
M
M
M
M
F
M
M
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/Anti-HBs+/Anti-HCV+/Anti-HIV+
Anti-HBc+/Anti-HBs+/Anti-HCV+/Anti-HIV+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/anti-HBs+/Anti-HCV+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
Anti-HBc+/Anti-HIV+
Anti-HBc+/Anti-HBs+
M= masculino, F= feminino.
69
5- DISCUSSÃO
O presente trabalho consiste no primeiro estudo realizado na Região Centro-Oeste sobre a
infecção pelo vírus da hepatite B em pacientes com tuberculose, onde foram avaliados os aspectos
epidemiológicos, como prevalência dos marcadores sorológicos do HBV e fatores de risco, além
de aspectos moleculares, como detecção do DNA viral, diagnóstico de infecção oculta e
determinação dos genótipos virais.
Ao analisarmos as características sociodemográficas, observou-se que a maioria dos
indivíduos estudados era do sexo masculino, com baixa escolaridade e renda familiar. Dados que
estão de acordo com outros estudos em pacientes com TB realizados no Brasil, que também
encontraram maior freqüência de homens, principalmente em faixas etárias economicamente ativas
e com baixo nível socioeconômico (Coelho et al. 2009, Oliveira et al. 2009, Gonçalves et al. 2010,
Maciel et al. 2010, Miller et al. 2010).
A prevalência global de 25,6% (IC 95%: 21,5-30,2) para infecção pelo HBV encontrada
em pacientes com TB neste estudo pode ser considerada elevada quando comparada com a
observada em um estudo multicêntrico de base populacional na Região Centro-Oeste, que foi de
5,3% (Pereira et al. 2009). Entretanto, ao se comparar com o único estudo realizado no Brasil
sobre a infecção pelo HBV em pacientes com TB, notou-se uma taxa semelhante (26,8%; IC 95%:
19,7-31,9) (Blal et al. 2005). Considerando estudos realizados em outros países, também se
observou prevalência próxima à do presente estudo, como a reportada por Pando et al. (2008) na
Argentina em pacientes com TB (19,8%; IC 95%: 14,3-26,2). Por outro lado, a prevalência
estimada neste estudo foi superior às mostradas por Kuniholm et al. (2007) na República da
Geórgia (13%; IC 95%: 9,5-17,5) e por Wang et al. (2011) em Taiwan (11,7%; IC 95%: 6,8-15,5).
A prevalência do HBsAg, marcador de infecção ativa, foi de 3,2% (IC 95%: 1,4-7,0) nesta
população de pacientes com TB, mostrando-se mais elevada que na população em geral na Região
Centro-Oeste (0,47%) (Pereira et al. 2009). Quando comparada com pacientes com TB no Rio de
Janeiro, observou-se que naquele estudo, a prevalência do HBsAg em 209 pacientes com TB foi
semelhante (2,8%; IC 95%: 1,1-6,4) (Blal et al. 2005). Nos estudos realizados em outros países,
70
Kuniholm et al. (2007) encontraram prevalência próxima a do presente trabalho (4,3%; IC 95%:
2,4-7,4), enquanto Sirinak et al. (2008) relataram taxa mais elevada de positividade para o HBsAg
(9%; IC 95%: 7,3-11,6) em pacientes com TB na Tailândia.
Verificou-se, ainda, um perfil sorológico peculiar em cinco pacientes, que foi a
positividade para o HBsAg, na ausência do marcador anti-HBc. Este perfil poderia ser explicado
pelo fato do HBsAg ser o primeiro marcador sorológico que surge durante o curso da infecção
pelo HBV, podendo estar presente antes mesmo do início dos sintomas (Hatzakis et al. 2006).
Outra explicação para tal fato seria detecção do HBsAg pela presença de antigenemia vacinal
(Martín-Ancel et al. 2004). Entretanto, em muitos casos nos quais se detecta este perfil sorológico,
não se consegue ainda interpretá-lo de forma definitiva ou estabelecer seu significado (Pondé
2011).
A presença do marcador anti-HBc associado ao anti-HBs, indicando infecção passada pelo
HBV, foi verificada em 81 indivíduos (20,1%). Em nove indivíduos (2,2%), o anti-HBc foi
detectado isoladamente. Este perfil sorológico pode ser encontrado no período conhecido como
“janela imunológica”, no qual há o desaparecimento do HBsAg após infecção aguda e a não
detecção do anti-HBs, em função da baixa concentração desse anticorpo ou porque o mesmo não
foi sintetizado. Essa situação pode ocorrer, ainda, devido a mutações na região S do genoma viral,
particularmente na que codifica o determinante “a”, levando à redução dos títulos do HBsAg ou,
até mesmo, a não expressão desse antígeno (Badur & Akgun 2001, Weber et al. 2001, Alhababi et
al. 2003, Gonçales & Cavalheiro 2006). Em uma revisão recente, Pondé et al. (2010) relataram
taxas variáveis de detecção do anti-HBc isoladamente, dependendo da prevalência da infecção
pelo HBV na região estudada e da população avaliada.
Neste estudo, dentre as nove amostras com perfil anti-HBc reagente isolado, apenas uma
apresentou HBV-DNA positivo, enquanto 12 das 81 amostras anti-HBc e anti-HBs reagentes
apresentaram positividade para o DNA viral, indicando um índice de infecção oculta pelo HBV de
14,4%. Dentre os estudos que avaliaram a prevalência do HBV em pacientes com TB, tanto no
Brasil como em outros países, em nenhum foi determinada a taxa de pacientes com infecção oculta
(Blal et al. 2005, Kuniholm et al. 2007, Sirinak et al. 2008). Assim, ao compararmos os resultados
do presente estudo com outro realizado em doadores de sangue e pacientes HIV soropositivos,
71
observou-se que, nos doadores, o índice de infecção oculta foi de 4% e, nos pacientes com HIV, de
5% (Jardim et al. 2008), sendo inferiores em relação àquele encontrado nos pacientes com TB. Por
outro lado, Araujo et al (2008), avaliando também pacientes HIV positivos, observaram uma taxa
de infecção oculta de 14%, sendo semelhante à encontrada neste estudo. Já em nossa região, um
estudo realizado com usuários de drogas não injetáveis detectou índice inferior de infecção oculta
pelo HBV (3,6%) (Ferreira et al. 2009). Ainda não se dispõe de estudos convincentes a respeito de
que este tipo de infecção possa estar relacionada a condições clínicas de doença hepática crônica,
mas o mais provável é que a mesma não seja clinicamente relevante na maioria dos casos (Liang
2009). No entanto, há evidências de transmissão viral, mesmo com baixo nível de replicação do
HBV (Raimondo et al. 2007, Hollinger & Sood 2010, Said 2011). Por se tratar de um estudo
transversal, a presente investigação não se propôs a acompanhar a evolução clínica dos pacientes.
A positividade isolada para o marcador anti-HBs foi encontrada em 44 indivíduos (10,9%),
indicando que uma pequena parte dessa população apresentou evidência sorológica de vacinação
prévia contra a hepatite B. Da população de 402 pacientes estudados, apenas 62 (15,4%) relataram
vacinação prévia contra hepatite B e, destes, apenas 49 (12,2%) souberam informar sobre o
número de doses recebidas, sendo que 38 indivíduos informaram ter recebido as três doses (dados
não apresentados). No Rio de Janeiro, também se observou baixo índice de cobertura vacinal em
pacientes com TB (2,4%) (Blal et al. 2005), indicando que esta cobertura ainda é deficitária em
nosso país para populações em risco de infecção pelo HBV. De fato, a baixa cobertura vacinal
evidenciada nesta população foi também semelhante àquela observada em usuários de drogas na
mesma região (7,8%) (Ferreira et al. 2009), e pode estar associada em ambos a fatores econômicos
e sociais, como baixa escolaridade e renda, bem como a falta de infraestrutura adequada de saúde
pública, além da dificuldade de adesão ao atual esquema vacinal de três doses.
Dentre os fatores de risco associados à infecção pelo HBV na população estudada,
verificou-se, na análise multivariada, que pacientes com idade maior ou igual a 50 anos
apresentaram 2,9 vezes (IC 95%: 1,2-7,0; p=0,02) mais chances de exposição ao HBV. Pacientes
com TB no Rio de Janeiro também mostraram resultados compatíveis com o presente estudo,
apresentando maior prevalência do HBV de acordo com o aumento da faixa etária (Blal et al.
2005), sugerindo transmissão horizontal do vírus nessa população. Na Argentina, Pando et al.
72
(2008) também encontraram associação significativa entre idade avançada e prevalência do HBV.
Na República da Geórgia e Tailândia, estudos em pacientes com TB não definiram a faixa etária
como fator de risco significativo (Kuniholm et al. 2007, Sirinak et al. 2008), fato que pode ser
explicado em função de terem sido realizados em áreas de alta endemicidade para hepatite B, onde
um importante mecanismo de transmissão é a via vertical, acometendo indivíduos em fases
precoces da vida (Te & Jensen 2010).
Outro fator de risco que se mostrou estatisticamente significativo, na análise multivariada,
foi uso de drogas ilícitas injetáveis, cujo risco foi 4,1 vezes (IC 95%: 1,4-11,6; p< 0,01) maior do
que os pacientes que nunca usaram drogas. Nos pacientes com TB estudados no Rio de Janeiro,
este fator de risco se mostrou estatisticamente significativo apenas naqueles coinfectados com HIV
(Blal et al. 2005). Estudos conduzidos em outros países em pacientes com TB também mostraram
que o uso de drogas injetáveis realmente se constitui em importante fator de risco para infecção
pelo HBV nestes pacientes, como na Argentina, em que o risco de usuários de drogas injetáveis foi
6,6 vezes maior (Pando et al. 2008); na Geórgia, com risco 3,6 vezes maior (Kuniholm et al.
2007), e na Tailândia, 3,2 vezes maior (Sirinak et al. 2008).
Os pacientes usuários de drogas não injetáveis apresentaram 2,5 (IC 95%: 1,2-5,2; p= 0,02)
vezes mais chances de infecção pelo HBV do que aqueles que nunca usaram drogas. Em nossa
região, foi encontrada prevalência global do HBV de 14% em usuários de drogas não injetáveis,
cujo risco pode ocorrer pelo compartilhamento de equipamentos utilizados para o preparo e
consumo das drogas (Ferreira et al. 2009).
Ao se proceder a análise univariada, verificou-se que indivíduos do sexo masculino
apresentaram 1,8 (IC 95%: 1,0-3,1) vezes mais chances de adquirir hepatite B, assim como aqueles
que relataram uso de álcool (OR=1,8; IC 95%: 1,1-3,0), entretanto a associação entre estas
variáveis e infecção pelo HBV não se confirmou na análise multivariada. O maior risco de
infecção pelo HBV em homens foi reportado por outros autores (Lewis-Ximenez et al. 2002,
Ferreira et al. 2006). O uso crônico de álcool também já foi relatado como atividade mais
frequente no sexo masculino, podendo estar relacionada a outras práticas que favorecem a
transmissão do HBV, como comportamento sexual de risco e uso de drogas ilícitas (Reuben 2007,
73
Mincis 2008). Além disso, o uso crônico de álcool também se caracterizou em um recente estudo
como fator de risco para TB (Rehm et al. 2009).
Ainda na análise univariada, aqueles que relataram atividade sexual com parceiro do
mesmo sexo apresentaram 2,1 (IC 95%: 1,0-4,2) vezes mais chance de se infectarem pelo HBV, e
apesar de tal atividade não ter permanecido como fator de risco na análise multivariada, deve ser
valorizada, já que a atividade sexual de risco é uma das mais freqüentes formas de transmissão
desse vírus em adultos (Alter 2003). Homens que fazem sexo com homens se constituem como um
dos principais grupos em risco para infecção pelo HBV (Alter & Margolis 1990, Blal et al. 2005,
Sirinak et al. 2008). Na Europa, atividade sexual de risco foi descrita como responsável pela
maioria dos casos novos de hepatite B (Spada et al. 2001, Veldhuijzen et al. 2005).
Em alguns estudos, a presença de tatuagens e/ou piercings foi associada à infecção pelo
HBV (Mowat et al. 1973, Limentani et al. 1979). Em Goiânia, um trabalho com adolescentes
mostrou também tal associação (Oliveira et al. 2006). Porém, outras investigações conduzidas no
Brasil e na América do Norte na última década não relataram essa associação (Nishioka et al.
2002; 2003, Goldman et al. 2009), fato também observado no presente trabalho.
Com relação à história de transfusão sanguínea, também não foi observada significância
estatística. Sabe-se que o vírus da hepatite B é passível de transmissão por sangue contaminado,
sendo esse risco maior em pacientes politransfundidos (de Paula et al. 2005). Entretanto, vários
estudos realizados no Brasil que avaliaram tal risco, assim como o presente trabalho, não
relacionaram a transfusão sanguínea como fator de risco significativo para infecção pelo HBV
após a implantação da triagem sorológica para os marcadores HBsAg e anti-HBc total nos bancos
de sangue (Andrade et al. 2006, Kupski et al. 2008, Maresch et al. 2008, Cruz et al. 2009).
Dentre as amostras HBsAg reagentes, em 10 (76,9%) foi detectado o HBV-DNA,
considerado marcador de infecção e de replicação viral. Outro marcador de replicação viral, o
HBeAg, foi encontrado em apenas duas destas amostras, enquanto o anti-HBe foi reagente em seis
delas. A presença do HBV-DNA é um marcador definitivo de replicação viral, enquanto o HBeAg
pode estar ausente mesmo em pacientes com replicação devido à presença de mutações nas regiões
pré-core e/ou promotor basal do core, que levam à diminuição na expressão desse antígeno
74
(Hadziyannis & Vassilopoulos 2001, Hennig et al. 2002). Em três amostras HBsAg reagentes, não
foi detectado o DNA viral, fato que pode ter ocorrido em função de uma carga viral baixa ou pela
presença de antigenemia vacinal (Martín-Ancel et al. 2004).
Das 10 amostras em que se detectou o HBV-DNA, oito foram genotipadas. O genótipo A
foi encontrado em sete delas e o genótipo D em apenas uma. Semelhantemente, um amplo estudo
realizado em doadores de sangue provenientes das cinco regiões do Brasil mostrou maior
prevalência do genótipo A (48,5%), seguido pelos genótipos D (38,5%) e F (13%) (Mello et al.
2007). Um trabalho soroepidemiológico de base populacional também encontrou circulação dos
genótipos A, D e F na Região Centro-Oeste, sendo o genótipo A o mais prevalente (Pereira et al.
2009), bem como outros estudos realizados na Região Centro-Oeste, incluindo pacientes de
hemodiálise (Teles et al. 2002), comunidades afro-descendentes isoladas (Motta-Castro et al. 2005,
Matos et al. 2009) e usuários de drogas ilícitas (Ferreira et al. 2009).
Além disso, a análise filogenética mostrou que quatro das cinco amostras do genótipo A
eram do subgenótipo A1, também conhecido como subgenótipo Aa, onde “a” indica procedência
africana (Sugauchi et al. 2004). Tais achados sugerem a procedência africana para o genótipo A,
subgenótipo Aa, circulante no Brasil, assim como em outros estudos (Araujo et al. 2004, Motta-
Castro et al. 2005, Matos et al. 2009).
Diante dos resultados encontrados neste estudo, pode-se dizer que os pacientes com TB
têm maior prevalência de infecção pelo HBV, em relação à população em geral na nossa região,
sendo o uso de drogas ilícitas e idade avançada os principais fatores de risco. Além disso,
encontrou-se um índice baixo de imunização contra hepatite B, e consequentemente um grande
contingente de pacientes suscetíveis à infecção pelo HBV. Portanto, torna-se necessária a
implementação com maior efetividade de medidas educativas para a promoção da saúde, assim
como intensificar a vacinação contra hepatite B na população estudada.
75
6- CONCLUSÕES
• A prevalência global da infecção pelo HBV em pacientes com tuberculose em Goiânia-GO
de 25,6% foi semelhante à observada no único estudo brasileiro realizado nesta população
até o momento (26,8%), e mais elevada do que à estimada na população em geral na
mesma região (5,3%);
• Após análise multivariada, idade maior ou igual a 50 anos e história de uso de drogas
ilícitas, seja injetável ou não injetável, foram associadas à infecção pelo HBV, o que é
concordante com outros estudos conduzidos em pacientes com tuberculose;
• Das dez amostras HBsAg reagentes em que se detectou o DNA viral, oito foram
genotipadas como dos genótipos A (n=7) e D (n=1), dados que corroboram os de outros
estudos conduzidos em Goiás e no Brasil;
• O índice de infecção oculta pelo HBV foi de 14,4% nos pacientes com tuberculose anti-
HBc positivos;
• Encontrou-se um índice baixo de imunização contra hepatite B nesta população (10,9%).
76
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