microbiota fÚngica e ocorrÊncia de aflatoxina b na dieta de … · 2018. 7. 11. · ficha...
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INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
MICROBIOTA FÚNGICA E OCORRÊNCIA DE AFLATOXINA B 1 NA DIETA DE BOVINOS LEITEIROS
Thiago Pereira Motta
Nova Odessa
Janeiro – 2012
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
MICROBIOTA FÚNGICA E OCORRÊNCIA DE AFLATOXINA B1 NA DIETA DE BOVINOS LEITEIROS
Thiago Pereira Motta Orientador: Drª. Claudia Rodrigues Pozzi
Nova Odessa Janeiro, 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável.
Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia
Bibliotecária responsável – Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166
Motta, Thiago Pereira
M921m Microbiota fúngica e ocorrência de aflatoxina B1 na dieta de bovinos leiteiros. / Thiago Pereira Motta. Nova Odessa - SP, 2012.
57p. : il.
Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA. Orientador: Drª. Claudia Rodrigues Pozzi.
1. Bovino - Nutrição. 2. Segurança alimentar. I. Pozzi, Claudia Rodrigues. II. Título.
CDD 636.2
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTEN TÁVEL
CERTIFICADO DE APROVAÇÃOCERTIFICADO DE APROVAÇÃOCERTIFICADO DE APROVAÇÃOCERTIFICADO DE APROVAÇÃO
MICROBIOTA FÚNGICA E OCORRÊNCIA DE AFLATOXINA B1 NA DIETA DE BOVINOS LEITEIROS
THIAGO PEREIRA MOTTATHIAGO PEREIRA MOTTATHIAGO PEREIRA MOTTATHIAGO PEREIRA MOTTA
Orientadora: Prof. Dra.Prof. Dra.Prof. Dra.Prof. Dra. Claudia Rodrigues Pozzi Claudia Rodrigues Pozzi Claudia Rodrigues Pozzi Claudia Rodrigues Pozzi Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em Produção Animal
Sustentável, pela Comissão Examinadora:
Dra. Claudia Rodrigues Pozzi IZ/APTA/SAA/SP
Dra. Raquel Braghini
USP
Dr. Jackson Barros do Amaral IZ/APTA/SAA/SP
Data da realização: 15/02/2012
Presidente da Comissão Examinadora Prof. Dra. Claudia Rodrigues Pozzi
v
DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado as nossas famílias amadas, que sempre nos apoiam em todos os momentos e em todos os sentidos possíveis, nos dando força e motivação nos momentos de dificuldade, tornado nossas vidas mais suaves e ditosas. Ao meu querido irmão Cléciton, “In memóriam”, e ao meu querido filho(a) que virá. O nosso muito obrigado por fazerem parte de nossas vidas.
vi
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus pela vida e saúde, pelas oportunidades concedidas, pelas experiências vividas e pelo aprendizado adquirido no decorrer dos últimos dois anos. Aos idealizadores do curso de pós-graduação em produção animal sustentável, por oferecerem um curso para as necessidades atuais do setor agropecuário. À Profª Drª Claudia Rodrigues Pozzi pela orientação sempre presente, generosidade, paciência e ensinamentos transmitidos ao longo de nossa convivência. À Profª Drª Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro pela contínua colaboração e apoio ao longo do desenvolvimento do trabalho.
À Mariana Santos de Miranda que tanto me ajudou nos deslocamentos e nas coletas pelas fazendas a fora, muito obrigado pela valorosa contribuição.
Às colegas e companheiras de laboratório, Thamires Martins e Adriana Frezzarin, pelos ensinamentos e auxílio vital para execução deste trabalho. Pela convivência e pelo exemplo de dedicação e amizade. Às Drª Adriana Palma de Almeida e Profª Drª Rosana Aparecida Possenti pela participação da banca de qualificação contribuido de forma preciosa com sugestões e observações extremamente úteis objetivas.
Aos Professores do curso de Pós-Graduação do Instituto de Zootecnia pelos ensinamentos transmitidos, pela contribuição sempre valiosa em nossa formação profissional. A todos os Pesquisadores que, de forma direta ou indireta, contribuíram para com esta pesquisa. Aos funcionários da fazenda experimental Palmeira (Centro experimental em pecuária leiteira) que tiveram paciência e boa vontade em colaborar a auxiliar com este trabalho. O meu muito obrigado a Ana Baião, Tereza, Donizete, Creusa, Valter, Gilberto e Ivo.
A todos que contribuíram nas análises laboratoriais de forma direta e indireta.
Aos colegas da pós-graduação pela convivência, momentos de estudo, colaboração e amizade.
Aos proprietários das fazendas por permitirem as nossas coletas de material e dados de suas propriedades.
Ao instituto de Zootecnia pelo apoio e pelas instalações e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelos recursos financeiros para execução deste trabalho.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................................................ ix
LISTA DE TABELAS................................................................................................................ x
RESUMO..................................................................................................................................... xi
ABSTRACT................................................................................................................................. xii
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................................ 3
2.1. Dieta de vacas leiteiras......................................................................................................... 3
2.2. Produção de leite................................................................................................................... 5
2.3. Reino Fungi (Fungos)........................................................................................................... 7
2.4. Fungos filamentosos e leveduras em silagem................................................................... 9
2.5. Micotoxinas: conceitos gerais............................................................................................. 10
2.6. Aflatoxinas.......................................................................................................................... 12
2.7. Fatores bióticos e abióticos............................................................................................... 17
3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................... 19
3.1. Material............................................................................................................................... 19
3.1.1. Localização das fazendas leiteiras............................................................................... 19
3.1.2. Características gerais de produção das fazendas leiteiras............................................ 20
3.1.3. Esquema de colheita das amostras das dietas.............................................................. 22
3.2. Métodos........................................................................................................................... 23
3.2.1. Determinação da Atividade de água (Aa) ................................................................... 23
3.2.2. Isolamento, contagem e identificação da microbiota fúngica das dietas......................... 23
3.2.3. Determinação de aflatoxina B1 nas dietas....................................................................... 24
viii
3.2.3.1. Material................................................................................................................. 24
3.2.3.1.1. Toxina........................................................................................................................ 24
3.2.3.1.2. Determinação da concentração do padrão................................................................. 24
3.2.3.1.3. Reagentes:.......................................................................................................... 25
3.2.3.1.4 Equipamento............................................................................................................ 25
3.2.3.2. Método................................................................................................................... 25
3.2.3.2.1 Extração e purificação de Aflatoxina..................................................................... 25
3.2.3.2.2. Quantificação de aflatoxina B1 por cromatografia líquida de alta eficiência........... 26
3.2.4. Dados meteorológicos das regiões das fazendas avaliadas........................................... 27
3.2.5. Análise estatística........................................................................................................ 27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................... 29
4.1. Microbiota fúngica............................................................................................................ 29
4.2. Análises Cromatográficas................................................................................................. 42
4.3. Aflatoxina B1 (AFB1) nas amostras das dietas................................................................. 42
5. CONCLUSÕES..................................................................................................................... 47
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 49
ix
LISTA DE FIGURAS Figura 01 – Localização das fazendas leiteiras no Estado de São Paulo.................................... 19 Figura 02 – Atividade de água, UFC.g-1 de leveduras e fungos filamentosos isolados das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.................................................................. 37
Figura 03 – UFC.g-1 e Frequência relativa de Aspergillus flavus nas amostras das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011. ................................................................................ 40
Figura 04 – UFC.g-1 e Frequência relativa de Fusarium verticillioides nas amostras das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011. ................................................................ 40 Figura 05 – Frequência absoluta (FA) e frequência relativa (FR) de amostras contaminadas por aflatoxina B1 nas amostras das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011............................................................................................................................................. 44
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Características gerais de produção das fazendas leiteiras, 2010-2011..................... 20
Tabela 02 – Características gerais das dietas ofertadas às vacas em lactação nas propriedades leiteiras, 2010-2011..................................................................................................................... 20 Tabela 03 Aspecto geral das instalações, tipo de armazém para concentrado e tipo de silo das propriedades leiteiras, 2010-2011................................................................................................ 21 Tabela 04 Unidades formadoras de colônias (UFC.g-1) e contaminação (%) de dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.................................................................................. 30 Tabela 05 – Atividade de água e Frequências absoluta e relativa (%) de isolamentos de fungos filamentosos nas dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011........................... 34 Tabela 06 – Atividade de água e unidades formadoras de colônias de fungos filamentosos e leveduras isoladas das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011............................... 37 Tabela 07 – Dados meteorológicos no período de 45 dias nas regiões das fazendas avaliadas, 2010-2011.................................................................................................................................... 39 Tabela 08 – Atividade de água (Aa), Unidades Formadoras de Colônias (UFC.g-1) e frequência relativa (%) de fungos dos gêneros Aspergillus spp e Fusarium spp isolados das amostras das dietas de bovinos leiteiros, 2010-2011................................................................... 41 Tabela 09 – Frequência de contaminação por aflatoxina B1 em amostras de dietas de bovinos nas fazendas leiteiras, 2010-2011................................................................................................ 43
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RESUMO
MICROBIOTA FÚNGICA E OCORRÊNCIA DE AFLATOXINA B 1 NA DIETA DE BOVINOS LEITEIROS
O leite é alimento nobre, fonte de nutrientes essenciais que atuam diretamente no desenvolvimento e manutenção da vida e saúde humana. Contudo, os aspectos relativos à qualidade sanitária é um dos maiores entraves à produção no Brasil. A possibilidade de presença de aflatoxina M1 no leite, decorrente do consumo de aflatoxina B1 presente na dieta de vacas em lactação, representa grande ameaça à saúde humana e motivou a presente pesquisa. O objetivo foi avaliar o perfil da microbiota fúngica, medir a atividade de água e avaliar a ocorrência de aflatoxina B1 em dietas ofertadas às vacas em lactação em propriedades do Estado de São Paulo. As amostras de dieta de vacas em lactação foram coletadas em nove fazendas, sendo seis localizadas na região metropolitana de Campinas e três nos municípios de Descalvado, Ribeirão Preto e Bragança Paulista. As amostragens foram realizadas nos cochos em dois dias com intervalos de 24h e a cada 15 dias, perfazendo um período de 45 dias por fazenda. O estudo da micoflora presente nas dietas revelou que as leveduras se mostraram predominantes em todas as propriedades. Em seguida, foram isolados 15 gêneros de fungos filamentosos, sendo eles: Aspergillus spp, Fusarium spp, Penicillium spp, Rhizopus spp, Fungos não esporulados (FNE), Absidia spp, Mucor spp, Emericella spp, Monascus spp, Alternaria spp, Moniliella spp, Scopulariopsis spp, Eurotium spp, Trichoderma spp, Geotrichum spp e Acremonium spp. As contagens de Unidades Formadoras de Colônias por grama de alimento (UFC.g-1 ) variaram de 102 a 1011. A frequência de isolamento de Aspergillus spp, Fusarium spp e Penicillium spp foi de 20,09%, 14,16% e 11,42%, respectivamente. O Aspergillus flavus foi a espécie predominante do gênero. A espécie Fusarium verticillioides foi isolada de amostras em três propriedades leiteiras. Foi encontrada a presença de Aflatoxina B1 em 31,44% das amostras de dietas. Os valores encontrados variaram de 1,68 a 194,51 ηg.g-1. A fazenda E apresentou os maiores níveis de contaminação das amostras das dietas (80%). A fazenda H não apresentou amostras com níveis detectáveis de aflatoxina B1. Medidas de boas práticas de produção, estocagem e utilização dos alimentos devem ser tomadas para diminuir a ocorrência de aflatoxina B1 nas dietas ofertadas às vacas em lactação.
Palavras-chave: Aflatoxinas, fungos, micotoxinas, segurança alimentar.
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ABSTRACT
MYCOFLORA AND OCCURRENCE OF AFLATOXIN B 1 IN THE DIET OF DAIRY CATTLE
Milk is noble food, source of essential nutrients that act directly on the development and maintenance of life and human health. However, the health aspect of quality is one of the biggest barriers to production in Brazil. The possible presence of aflatoxin M1 in milk resulting from the consumption of aflatoxin B1 in the diet of dairy cows represents a major threat to human health and motivated the present research. The objective was to evaluate the profile of mycoflora, measure the water activity and occurrence of aflatoxin B1 in diets offered to lactating cows properties in the State of São Paulo. Samples of the diet of lactating cows were collected from nine farms, six located in the metropolitan region of Campinas and three farms in the cities of Descalvado, Ribeirao Preto and Bragança Paulista. The samples were collected in the troughs in two days with intervals of 24 hours and every 15 days, making a period of 45 days per farm. Yeasts were isolated in larger numbers and in all samples, followed by filamentous fungi. A total of 15 genera were isolated from filamentous fungi, which were: Aspergillus spp, Fusarium spp, Penicillium spp, Rhizopus spp, Non Sporulated Fungi (FNE), Absidia spp, Mucor spp, Emericella spp, Monascus spp, Alternaria spp, Moniliella spp, Scopulariopsis spp, Eurotium spp, Trichoderma spp, Geotrichum spp and Acremonium spp, The counts of colony forming units per gram of food (CFU. g-1) ranged from 102 to 1011. The frequency of isolation of Aspergillus spp, Fusarium spp and Penicillium spp was 20.09%, 14.16% and 11.42% respectively. Aspergillus flavus was the predominant species of the genus. Fusarium verticillioides was isolated from samples from three dairy farms. The presence of aflatoxin B1 was detected in 31.44% of the samples of diets. The values found ranged from 1.68 to 194.51 ng.g-1. The farm E had the highest levels of contamination of samples of the diets (80%). The farm H samples showed no detectable levels of aflatoxin B1. Measures of good production, storage and use of food should be taken to reduce the occurrence of aflatoxin B1 in diets fed to lactating cows. Keywords: aflatoxins, Food safety, fungi, mycotoxins.
1
1. INTRODUÇÃO
O leite é considerado o mais nobre dos alimentos por sua composição em proteínas
(essenciais para o crescimento e manutenção dos tecidos), gorduras, carboidratos, vitaminas A,
B1 e B2 e cálcio. Sendo este alimento a melhor fonte do mineral para o organismo humano.
Entretanto, sob o ponto de vista de saúde pública, o comprometimento da sua qualidade é um dos
principais entraves para o fortalecimento da cadeia produtiva. A Instrução Normativa 51, editada
pelo MAPA (Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento) (2002) e a Portaria 73, “Plano
Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes no Leite” (2010) pretendem monitorar a
qualidade do produto, colocando o país como exportador de lácteos. Além dos aspectos físico-
químicos e organolépticos, para que o produto chegue às mãos do consumidor nutritivo e
saudável, são necessárias ausência de agentes patogênicos, reduzida carga microbiana, baixa
contagem de células somáticas (CCS) e a manutenção de resíduos de drogas ou outros
contaminantes dentro dos limites máximos, legalmente permitidos ou reconhecidos como
aceitáveis neste alimento.
Nos últimos anos, garantir a segurança dos alimentos tem sido um grande foco de ação
internacional e nacional nos últimos anos. Os perigos microbiológicos e químicos são motivos de
preocupação e, entre os contaminantes naturais, a contaminação de alimentos e rações por
2
micotoxinas pode ter efeitos graves na saúde humana e animal. Os primeiros limites máximos de
resíduos estabelecidos no comércio de alimentos foram definidos no final da década de 60 para a
aflatoxina B1 e adotados desde então por centenas de países. Esses metabólitos secundários,
produzidos por espécies do gênero Aspergillus spp, podem contaminar os alimentos durante
diferentes fases de produção, processamento e distribuição. Quando alimentos contaminados com
aflatoxinas B1 são ingeridos o metabolismo animal converte a aflatoxina em diversos metabolitos,
entre eles a aflatoxina M1 que pode ser detectada no leite, representando perigo para parcelas da
população que tem no leite a principal fonte de alimento.
Diversos trabalhos têm destacado a importância da origem e qualidade dos produtos
alimentares, com o intuito de aumentar a produtividade e melhorar a qualidade de vida da
população mundial. Dessa forma, a presente pesquisa teve por objetivos: avaliar o perfil da
microbiota fúngica, medir a atividade de água e avaliar a ocorrência de aflatoxina B1 em dietas
ofertadas às vacas em lactação em propriedades do Estado de São Paulo.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Dieta de vacas leiteiras
Os bovinos evoluíram, como todos os ruminantes, tendo como base alimentar de suas
dietas gramíneas e outros vegetais. A digestão e aproveitamento da fibra vegetal como fonte
energética se dá graças à presença de micro-organismos no trato gastrointestinal desses animais
(KOZLOSKI, 2009). Os grãos (milho, sorgo, trigo, algodão, cevada, soja, etc.) participam da
dieta dos ruminantes como suplemento alimentar com objetivo de incrementar o desempenho
produtivo. Os volumosos (gramíneas e leguminosas) conservados na forma de silagem
(fermentação anaeróbica) e feno (desidratação) aparecem como as alternativas de armazenamento
de alimento volumoso para o período de escassez durante o período seco do ano.
As gramíneas de grande porte, como sorgo e milho, são consideradas ideais para produção
de silagem. Isto se deve aos teores de carboidratos solúveis encontrados nessas plantas,
indispensáveis para uma fermentação desejável e sua produção de massa verde por área.
Atualmente grande parte dos produtores de leite, principalmente os especializados, se utilizam da
técnica de ensilagem para armazenar milho e ou sorgo picado como fonte de volumoso para seus
rebanhos. (EMBRAPA, 2004).
4
A silagem é definida como a forragem fragmentada, suculenta, conservada por meio de
um processo de fermentação anaeróbica. As silagens são armazenadas em silos após processo de
corte, compactação e vedação para que haja a fermentação, sendo fornecida aos animais em
época de escassez de pastagem (Mc DONALD, 1981). A prática de conservação de forragens sob
a forma de ensilagem é muito difundida entre os produtores de leite e de corte, que procuram
melhorar seus índices zootécnicos e rendimento econômico e a adoção desta técnica está
associada entre diferentes fatores ao bom valor nutricional do alimento conservado, ao uso
intensivo da terra e ao relativo domínio da técnica pelos produtores (NUSSIO, 1990).
O processo de ensilagem baseia-se na redução do pH da massa ensilada principalmente
através da produção de ácido lático por bactérias homoláticas por meio da fermentação de
carboidratos solúveis da planta. Essa produção de ácido é exigida em quantidades suficientes para
inibir o desenvolvimento de micro-organismo deteriorante, de modo a preservar esse material até
que o mesmo seja fornecido ao animal (McDONALD et al., 1991). O processo de ensilagem
inicia-se após o corte da forrageira, a qual ainda permanece viva e respirando ativamente.
Quando este material é ensilado, as células vivas continuam respirando até esgotar o oxigênio
retido no meio do material ensilado. Junto a este material existe uma variedade de micro-
organismos como leveduras, fungos filamentosos e bactérias aeróbias. A atuação desses micro-
organismos, somada a respiração das células do material ensilado, consome, num período de 4 a
6 horas, todo o oxigênio disponível, produzindo em contrapartida, dióxido de carbono, água e
calor. Nesta fase a temperatura ideal deve estar entre 27 e 38º C, a qual será um meio propício ao
desenvolvimento dos microorganismos produtores de ácido lático. Caso a compactação e vedação
do material não forem bem feitas haverá excesso de oxigênio, que induzirá maior respiração
celular, que causará temperaturas acima de 44º C, reduzindo as chances de uma fermentação
desejável. (VITTORI, 2009).
A cultura a ser ensilada, em geral, é preservada no silo pelo ambiente anaeróbio e o baixo
pH. O ambiente anaeróbio previne o crescimento de micro-organismos indesejáveis que
necessitam de oxigênio e o pH inibe micro-organismos anaeróbios que são prejudiciais à
atividade enzimática da planta. Falhas no processo de ensilagem (corte, compactação e vedação)
ocasionam o aparecimento de leveduras e bolores em altas contagens. Uma silagem mal feita é
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caracterizada pela presença de bolsas de ar que possibilitam o crescimento desses micro-
organismos nessas áreas, promovendo deterioração, perda de valor nutricional e contaminação do
material por micotoxinas (MUCK, 1996).
As vacas em lactação são capazes de transformar alimentos não essenciais (forragens) aos
não ruminantes em produto de alto valor nutricional. À medida que se aumenta a produtividade
por animal, os volumosos (pasto, silagem e feno) são insuficientes para manter altos níveis de
produção de leite, assim, além dos volumosos, a alimentação dos animais necessita de
suplementação com concentrados, minerais e vitaminas. O concentrado para vacas em lactação
deve conter de 18 a 22% de proteína bruta (PB) e cerca de 70% de nutrientes digestíveis totais
(NDT), fornecido na base de 01 kg de concentrado para cada 2,5 kg de leite produzido. Como
matéria prima na formulação dos concentrados são utilizados os grãos de milho, farelos de soja
ou algodão e, dependendo da disponibilidade, grãos de soja moídos ou caroço de algodão, além
de calcário e sal mineral. A relação concentrado e volumoso é maior para vacas de maior
produção de leite. De maneira geral, animais com produções entre 30-40 kg de leite/dia, a relação
concentrado:volumoso pode ser de 45%:55% a 55%:45% (EMBRAPA, 2002).
2.1. Produção de leite
A produção de leite no país está distribuída em todo território nacional e os sistemas
produtivos são heterogêneos. Os produtores especializados investem em tecnologia, economia de
escala e diferenciam o seu produto, recebendo mais pelo volume produzido e qualidade
alcançada. Os produtores com esse perfil se concentram em bacias leiteiras tradicionais nos
estados de Minas Gerais, Goiás, Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo. Em
meio aos especializados, inúmeros pequenos produtores que estão distribuídos em todo território
nacional, vivem da renda gerada na atividade, que é vital para a agricultura familiar. Entre 1990 a
2004, verificou-se uma modificação da distribuição do rebanho bovino, deslocando-se para
regiões norte do país, onde se identifica microrregiões produtoras de leite, como o município de
Ji-Paraná, no estado de Rondônia, que produziu 370 milhões de litros de leite no ano de 2004,
sendo superado apenas pelo município de Meia Ponte, em Goiás, com 371,9 milhões de litros de
6
leite. Do total de leite produzido em Rondônia, 90% destina-se a mercados do estado de São
Paulo (EMBRAPA, 2006).
Em 2006, a produção total de leite no Brasil foi estimada em 25,7 bilhões de litros. Esta
condição gerou um valor bruto da produção aproximado em R$ 12,1 bilhões. No setor primário
envolveu cerca de cinco milhões de pessoas, considerando os 1,3 milhão de produtores de leite.
Duas características são marcantes na atividade leiteira, primeira é que a produção ocorre em
todo o território nacional. A segunda característica marcante é que não existe um padrão de
produção, a heterogeneidade dos sistemas de produção é muito grande e ocorre em todas as
Unidades da Federação. Há propriedades de subsistência, utilizando técnicas rudimentares e
produção diária menor que dez litros, até produtores comparáveis aos mais competitivos do
mundo, usando tecnologias avançadas e com produção diária superior a 60 mil litros. Apesar da
grande dispersão da produção e da heterogeneidade dos sistemas de produção, existem áreas de
concentração da produção de leite (EMBRAPA, 2006).
O estado de São Paulo é o grande consumidor de leite no país, importa 5,87 bilhões de leite,
principalmente dos estados de Minas Gerais e Goiás, para suprir o mercado interno, já que produz
apenas 7,4% do total de leite produzido no país e consome 32,4%. Do total produzido em São
Paulo, 84,4% são entregues às empresas e cooperativas para beneficiamento e processamento sob
inspeção federal (91,5%) e estadual (8,5%), o restante é dirigido ao consumo na própria fazenda e
comercializado diretamente ao consumidor, como leite clandestino. A mesorregião do estado de
São Paulo, com melhor colocação no ranking brasileiro de produção leiteira é a de São José do
Rio Preto, 15% com a produção de 356.054 milhões de litros de leite. Outras bacias leiteiras no
estado estão localizadas na região administrativa de Campinas (313.354 milhões) e São José dos
Campos (215.677 milhões) (AMARAL et al., 2007).
O conhecimento destas áreas é importante para a definição de políticas públicas de
infraestrutura, logística e análise de viabilidade de projetos de desenvolvimento regional e
setorial. São relevantes também, para o estabelecimento da dinâmica do setor agropecuário, de
estratégias de vigilância sanitária, rastreabilidade e avaliação de risco geográfico da ocorrência de
doenças, resíduos químicos e biológicos (EMBRAPA, 2006).
7
2.2. Reino Fungi (Fungos)
Os fungos são micro-organismos eucariontes heterotróficos, nutrindo-se a partir da
matéria orgânica inanimada ou como parasita de hospedeiros vivos. Como saprófitos,
decompõem resíduos complexos de plantas e animais, transformando-os em formas químicas
mais simples que retornam ao solo. Essas substâncias químicas são reabsorvidas pelas gerações
vegetais subsequentes, assim a atividade fúngica contribui amplamente para a manutenção da
fertilidade do solo. Reproduzem-se, naturalmente, por meio de esporos, com poucas exceções.
São aclorofilados, possuem parede celular constituída de quitina, celulose ou hemicelulose. Sua
reserva de energia é o glicogênio (PELCZAR, 1980; SILVA JR., 2005). Os membros desse grupo
foram enquadrados por Whitaker em 1969 em um Reino à parte, o Reino Fungi. Estima-se que o
Reino Fungi apresente aproximadamente 1,5 milhões de espécies com representantes habitando
em todos os ecossistemas existentes. Por ser um grupo de organismos heterotróficos, os fungos
necessitam de compostos orgânicos pré-formados como fonte de energia para seu crescimento.
Essa característica levou os fungos a evoluírem como saprófitos, alimentando-se de matéria
orgânica morta, ou simbionte, interagindo com outros organismos vivos (MACCHERONI;
ARAUJO; LIMA, 2004).
Os fungos podem contaminar os alimentos durante as diferentes fases de produção, desde
o cultivo da planta no campo até a colheita dos grãos (pré e pós-colheita), durante o transporte,
armazenamento, processamento e distribuição ao consumo, desde que as condições de
temperatura e umidade sejam favoráveis (FRISVAD; NIELSEN; SAMSON, 2006). Esses micro-
organismos crescem em grãos de cereais e oleaginosas, como o milho, amendoim, trigo, cevada,
sorgo, algodão, que são ingredientes básicos da dieta de vacas leiteiras, administrados na forma
de concentrados ou volumosos conservados ou não sob a forma de silagem. Segundo Christensen
e Kaufmann (1965) os fungos que invadem os grãos, de maneira geral, podem ser divididos em
dois grupos ecológicos: campo e armazenamento. Os fungos de campo invadem os tecidos da
planta em crescimento e exigem para o desenvolvimento elevadas umidade relativa do ar (80%) e
teores de água nos grãos (20-21%). Estão distribuídos nos gêneros Alternaria spp, Cladosporium
spp, Fusarium spp e Helmintosporium spp.
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Quando os teores de água são inferiores a 21%, no qual nenhuma água livre está
disponível no interior do grão, os fungos de campo aparentemente desaparecem proliferando
então, os fungos de armazenamento. Tais espécies necessitam de teores de água próximos entre
13 a 18% e são representados pelos gêneros Aspergillus e Penicillium (CHRISTENSEN e
SAUER, 1982). Entretanto, nos trópicos úmidos, esta classificação não é apropriada, pois
determinadas espécies dos gêneros Aspergillus e Penicillium, considerados como fungos de
armazenamento, podem ocorrer antes da colheita e produzir micotoxinas (HILL et al., 1983).
Os fungos podem se desenvolver em vários tipos de ambientes, sendo que em condições
de campo no Brasil o gênero Fusarium tem predominância de crescimento. A exigência mínima
para o desenvolvimento de fungos do gênero Fusarium é elevada umidade (>70%) e temperaturas
amenas. Esse gênero é responsável por uma gama de doenças em cereais e gramíneas. Em
lavouras de milho, causam podridão em partes distintas da planta. Em lavoura de trigo causam
uma doença chamada ferrugem do trigo (AMARAL, 2011). A contaminação de grãos de milho
recém-colhido por Fusarium verticillioides em diferentes regiões do país chega a 100%,
apresentando-se como forte competidor em relação ao Aspergillus flavus isolados entre 9,8 a 14%
nos grãos de milho (ROCHA et al., 2009). Maiores isolamentos de fungos do gênero Aspergillus
spp em grãos de milho recém-colhido foram obtidos por Almeida et al. (2000) no Estado de São
Paulo, nas regiões de Assis (23,3%) e Capão Bonito (22,2%). Zorzete et al., (2008) analisando a
distribuição de aflatoxinas e fumonisinas em milho inoculado com Fusarium verticillioides e
Aspergillus flavus durante o período entre o florescimento da planta até a colheita dos grãos,
observaram que o fungo Aspergillus flavus eram melhores adaptados às altas temperaturas e
baixa umidade.
Em cultivos de sorgo mais de 40 gêneros fúngicos contaminam os tecidos da planta e os
grãos quando em crescimento no campo, entre eles: Fusarium spp, Alternaria spp, Cladosporium
spp, Rhizopus spp, Penicillium spp, Aspergillus spp e Helmintosporium spp. No Brasil grãos de
sorgo colhidos em diferentes etapas de desenvolvimento da planta apresentaram contaminações
por Fusarium spp (25,1%) e Aspergillus spp (7%). A competição entre os mais de 40 gêneros
fúngicos isolados da microbiota pode também explicar a mais baixa frequência de Fusarium
quando comparado aos isolamentos desse gênero no cultivo de milho (RATNAVATHI;
9
SASHIDHAR, 2003; REIS et al., 2010).
O isolamento de fungos toxigênicos a partir de alimentos não significa obrigatoriamente
risco imediato para o consumo. Assim como a ausência de fungos em alimentos suspeitos não
significa ausência de micotoxina, o fungo pode estar ausente, mas a toxina pode estar presente e
ativa (PITT; HOCKING, 1997).
2.5. Fungos filamentosos e leveduras em silagem
Os micro-organismos presentes na silagem têm um importante papel no sucesso do
processo de conservação. A flora basicamente pode ser dividida em micro-organismos desejáveis
e indesejáveis. Aqueles que devem estar presentes são as bactérias ácido lácticas (Lactobacillus
spp, Pediococcus spp, Leuconostoc spp e Enterococcus spp) e os micro-organismos indesejáveis
são aqueles envolvidos na deterioração anaeróbia (Clostridium spp e as Enterobactérias) e
deterioração aeróbia (leveduras e fungos filamentosos) (DRIEHUIS; OUDE ELFERINK, 2000).
Os fungos em geral são apontados como os principais responsáveis pela deterioração
aeróbia de silagens, com destaque para as leveduras e fungos filamentosos. As populações de
leveduras variaram de < 102 UFC.g-1 de forragem até 1012 UFC.g-1 em menos de 03 dias após
abertura do silo. A vulnerabilidade da silagem para a deterioração aeróbia é função da população
de leveduras sendo que se a silagem apresenta populações acima de 105 UFC.g-1 o problema já
está se instalando no sistema. Entre as leveduras destacam-se os seguintes gêneros: Cândida spp,
Hansenula spp, Endomycopsis spp, Pichia spp, Torulopsis spp e Saccharomyces spp (AMARAL,
2011).
O aumento do número de micro-organismos aeróbios deve-se às práticas incorretas durante
o processo de ensilagem, permitindo a entrada de oxigênio na massa ensilada. Dentre vários
fatores destacam-se: enchimento lento do silo, baixo teor de umidade da massa, tamanho elevado
de partículas, compactação e vedação deficientes, forma de ensilagem (fatia ou degrau), tempo
elevado entre a retirada e fornecimento aos animais, dimensionamento incorreto entre tamanho
do silo e necessidades do rebanho (NUSSIO; MANZANO, 1999).
10
Os fungos na deterioração da silagem são representados por muitos gêneros, incluindo os
tipos termofílicos. Em algumas silagens, o desenvolvimento dos fungos filamentosos segue os
das leveduras e isso frequentemente é refletido no aparecimento de dois picos de elevação da
temperatura durante a deterioração. Um grande número de espécies tem sido isolado de silagens
deterioradas incluindo membros do gênero Monascus, Geotrichum, Bissochlamys, Mucor,
Moniliella, Aspergillus, Penicillum e Fusarium (McDONALD et al., 1991).
O crescimento dos bolores em silagem geralmente está restrito as superfícies e laterais do
silo e o desenvolvimento dos fungos ocorre em estágio avançado de deterioração, tendo um papel
coadjuvante ao das leveduras. As espécies mais frequentemente isoladas pertencem aos gêneros
Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Mucor, Byssochlamys, Absidia, Arthrinium, Geotrichum,
Monascus, Scopularipos e Trichoderma (PELHATE, 1977; NOUT et al., 1993).
2.4. Micotoxinas: conceitos gerais
Micotoxinas são substâncias tóxicas resultantes do metabolismo secundário de fungos
filamentosos. São compostos orgânicos de baixo peso molecular, ocorrendo em diferentes partes
do mundo e representam um risco potencial para a saúde dos homens e animais quando presentes
nos alimentos e rações. As principais micotoxinas podem ser divididas em três grupos: as
aflatoxinas produzidas por fungos do gênero Aspergillus; ocratoxinas produzidas pelos
Aspergillus alutaceus (A. ochraceus) e diversas espécies do gênero Penicillium e as
fusariotoxinas, que possuem como principais representantes os tricotecenos, zearalenona e as
fumonisinas, produzidas por diversas espécies do gênero Fusarium (CLEVSTROM, 1986;
FREIRE, et al., 2007; MURPHY et al., 2006).
O termo micotoxina foi criado em 1962, após um incidente em uma granja nos arredores
de Londres, na Inglaterra, que ocasionou a morte de aproximadamente 100 mil perus. Descobriu-
se, mais tarde, que essa misteriosa “doença X do peru” estava ligada a torta de amendoim,
contaminada com metabólitos secundários de Aspergillus flavus (aflatoxina). A partir daí
iniciaram-se os estudos da comunidade científica sobre os metabolitos secundários de fungos que
ocorrem em alimentos. Logo, o conceito de micotoxinas foi ampliado para incluir outras toxinas
11
fúngicas já conhecidas (alcalóides da cravagem do centeio), alguns compostos que foram a
princípio isolados como antibióticos (patulina) e uma série de outros metabólitos secundários a
partir de estudos focados na descoberta de micotoxinas (Ocratoxina A) (BENNETT; KLICK,
2003).
Entre 1960 e 1975 houve o que se chamou de “corrida do ouro das micotoxinas”, pois
muitos cientistas buscavam descobrir esses agentes tóxicos (BENNETT; KLICK, 2003). Estima-
se que existam entre 100 mil a 250 mil espécies fúngicas, destes 250 são capazes de produzir
micotoxinas, mas somente em torno de 30, são efetivamente responsáveis por casos de
micotoxicoses (GOMPERTZ et al, 2008). Diferentes espécies de fungos podem produzir um
mesmo tipo de micotoxina, assim como uma mesma espécie pode produzir mais de um tipo de
toxina (BACK, 2004), atualmente já foram identificadas pelo menos 500 micotoxinas (JOUANY,
2007).
Apesar de todas as micotoxinas serem de origem fúngica, nem todas as substâncias
produzidas por fungos são chamadas de micotoxinas. Produtos micogênicos, que são tóxicos para
bactérias (tais como penicilina), são normalmente chamados antibióticos. Produtos de fungos que
são tóxicos para as plantas, são chamados de fitotoxinas por fitopatologistas. Micotoxinas são
produzidas por fungos e são tóxicas para os vertebrados e outros grupos de animais em baixas
concentrações. Outros metabólitos fúngicos de baixo peso molecular, como o etanol, que são
tóxicos somente em altas concentrações, não são considerados micotoxinas. Os metabólitos de
cogumelos venenosos, apesar de serem tóxicos e poderem causar doenças e morte em humanos e
outros animais, são arbitrariamente excluídos das discussões da Micotoxicologia (BENNETT;
KLICK, 2003).
Muitas são as dúvidas e divergências sobre os estímulos que levam a formação dos
metabólitos secundários pelos fungos filamentosos. O metabolismo secundário dos micro-
organismos é comumente associado com o processo de esporulação, incluindo os fungos
filamentosos. Alguns produtos químicos que inibem a esporulação do Aspergillus parasiticus
também influenciam na inibição da produção da micotoxina (CALVO et al., 2002).
12
A principal via de exposição dos animais e do homem às micotoxinas é através da ingestão
de alimentos contaminados, apesar de existirem casos esporádicos de inalação e adsorção por
contato na derme (PITT; HOCKING, 1997). Os níveis de micotoxinas nos alimentos variaram
muito de ano para ano nos alimentos e, quando presentes em níveis elevados na dieta, podem
acarretar efeitos agudos e ocasionar até a morte. A exposição prolongada a níveis baixos de
micotoxinas pode levar as manifestações insidiosas (imunidade debilitada, atraso no crescimento,
aumento da susceptibilidade a doenças) o que tem despertado a atenção de autoridades
responsáveis pelo controle desses metabólitos nos alimentos. Várias micotoxinas são
classificadas como carcinogênicas ou potencialmente carcinogênicas, constituindo-se em sério
problema de saúde pública (IARC, 1998).
2.6. Aflatoxinas
As aflatoxinas compreendem um grupo de substâncias cristalizáveis de baixo peso
molecular, com estrutura química bifuranocumarínica e possuem uma ação extremamente tóxica
para o homem e para os animais (WHO, 1979). O principal gênero fúngico relacionado à
produção de aflatoxinas é o Aspergillus, sendo A. flavus, A. parasiticus e A. nomius as espécies
mais importantes. Já foram descritos 18 compostos diferentes, mas apenas 04 aflatoxinas são
bem conhecidas e estão, até o momento, intimamente relacionadas a surtos de intoxicação. Cada
molécula é designada por uma letra referente ao tipo de fluorescência que emite sob luz
ultravioleta: B1, B2, G1 e G2. A letra “B” representando a fluorescência azul, do inglês “blue”, e a
letra “G”, representando a fluorescência verde, do inglês “green” (HARTLEY; O'KELLY, 1963).
Dessas quatro substâncias a aflatoxina B1 é considerada a mais tóxica, apresentando propriedades
hepatotóxicas, teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas (ZERINGUE et al., 1993), sendo
classificada no Grupo 1 pela “International Agency for Research on Cancer” (IARC, 1993).
O fígado é o principal órgão alvo, além de induzirem o câncer, as aflatoxinas podem
ocasionar outros efeitos como cirrose hepática, diminuição da resistência imunológica
propiciando surtos de hepatites virais tipo B, estando também associadas à Síndrome de Reye,
caracterizada por distúrbios hepáticos e cerebrais em crianças entre 3 a 10 anos de idade, de
evolução rápida e altamente fatal. As aflatoxinas quando em estado puro são extremamente
13
estáveis em temperaturas de até 200 ºC (graus celcius) e não são afetadas pelo frio. Entretanto, as
micotoxinas são relativamente instáveis quando expostas à luz, à radiação ultravioleta (UV), ao ar
sobre placa de cromatografia de camada delgada (CCD) e ainda quando dissolvidas em solventes
altamente polares. São solúveis em solventes como clorofórmio, benzeno, metanol e etanol, mas
insolúveis em gorduras e óleos. Além disso, são incolores e inodoras (SMITH; ROSS, 1991).
Os fungos Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus têm grande importância econômica
em regiões de clima tropical e subtropical por contaminarem diversos tipos de alimentos,
apresentando alta afinidade por cereais e sementes oleaginosas como milho, amendoim, castanha
do Pará e algodão (CAST, 2003). Segundo Pitt (1993) cepas de A. flavus têm potencial para
produzir aflatoxinas B1 e B2, ambas ou nenhuma. Geralmente as aflatoxinas G1 e G2 não são
produzidas por essas espécies, embora alguns relatos mencionassem a produção de G1 e G2 em
isolados identificados como A. flavus (MPHANDE et al., 2004; TAKAHASHI et al., 2004). As
espécies de A. nomius são muito semelhantes ao A. flavus e podem produzir aflatoxinas B e G,
assim como as cepas de A. parasiticus.
No Brasil, vários trabalhos têm demonstrado a ocorrência de aflatoxinas em alimentos
destinados ao consumo animal. No período de 1971 a 1975 foram detectados níveis médios de
aflatoxinas B1 de 1, 131 µg.Kg-1 em produtos agrícolas e rações (SABINO, 1980). Purchio et al.,
(1988) estudando a ocorrência de micotoxinas em 170 amostras de rações destinadas ao gado
leiteiro, colhidas em Pelotas-RS e Vale do Paraíba-SP, obtiveram 17 (10%) de positividade para a
AFB1 e AFG1. Os níveis variaram entre 10 a 75 µg.Kg-1 (AFB1).
O milho é um dos principais produtos agrícolas contaminados pelas aflatoxinas. Vários
subprodutos do milho apresentaram contaminações de até 2.000 µg.kg-1 em amostras colhidas no
varejo no estado de São Paulo durante período de dois anos (FONSECA et al., 1983). Gloria,
Fonseca e Souza (1997) analisaram 292 amostras de grãos de milho recém colhido e encontram
33,6% contaminadas por aflatoxinas. A análise de 1.263 amostras de grãos de milho e 1.006
amostras de rações à base de milho em vários estados no Brasil, num período de dez anos,
revelou a presença das aflatoxinas em quase 50% dos alimentos analisados, com níveis máximos
de 14,4 µg.kg-1 (SANTURIO et al., 1996).
14
A contaminação do milho por aflatoxinas antes da colheita é um problema sério em vários
países. A infecção interna dos grãos pelo A. flavus parece ocorrer no último estádio de
desenvolvimento do grão. Estudos mostram que em conteúdos de umidade em torno de 23%
ocorre um nível de infecção de 27% (FONSECA, 1997).
Dilkin et al., (2000) isolaram A. flavus em 23,6% das amostras de milho híbrido cultivado
no Rio Grande do Sul, sendo que as cepas isoladas foram capazes de produzir aflatoxina B1 em
níveis entre 3.152 a 6.370 µg/kg-1, quando cultivadas durante 05 dias em grãos de milho
esterilizados e com 18% de umidade. Almeida et al., (2005) avaliaram o potencial toxigênico de
cepas de A. flavus isoladas de híbridos de milho cultivados nas regiões de Capão Bonito e
Ribeirão Preto em São Paulo e verificaram que 92,9% dos isolamentos foram capazes de produzir
aflatoxina B1 em níveis que variaram entre 10,5 a 482,6 µ/kg. Hassegawa et al., (2008) isolaram
A. flavus de grãos de milho cultivado em diferentes esquemas de fertilização e detectou aflatoxina
B1 em sete amostras com níveis de contaminação de até 1.858,3 µg/kg.
Rocha et al., (2009) analisando a co-ocorrência de aflatoxinas e fumonisinas em 200
amostras de grãos de milho recém colhido em quatro regiões do Brasil (Mato Grosso, Rio Grande
do Sul, Bahia e São Paulo) verificaram que 2 a 18% das amostras estavam contaminadas com
aflatoxinas, com índices entre 5.6 a 1.393,0 µg/kg-1. Das 21 amostras positivas, 16 (76,2%)
estavam acima do limite estabelecido pela legislação do Brasil (20 µg/kg-1).
O cuidado com a alimentação animal deve-se estender não só ao valor nutricional, mas
também a qualidade do alimento, porque além do milho, que participa com mais de 50% como
ingrediente de ração, outros insumos como algodão e o trigo, que entram na formulação de
concentrados para vacas em lactação, são passíveis de contaminação por aflatoxinas
(APPLEBAUM; MARTH, 1980). A contaminação do farelo de algodão ocorre durante o
processamento do caroço para extração do óleo e obtenção do farelo, concentrando a micotoxina
nesse subproduto, muito utilizado como suplemento protéico na alimentação de vacas leiteiras
(DIENER et al., 1987).
15
Gonçalves e Fonseca (1991) analisando 169 amostras de farelo de algodão fornecido por
indústrias de óleo localizadas em várias regiões do Estado de São Paulo e Paraná encontraram
67,45% das amostras contaminadas por aflatoxinas, com níveis variando de 10 a 40 µg.kg-1,
sendo que as amostras que representavam 40 µg.kg-1 representavam 12,3% do total contaminado.
Gonçalez et al., (2004) verificaram a presença das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em farelo de
algodão fornecido para vacas leiteiras, sendo que a concentração total de aflatoxinas encontrada
foi de 76,4 ηg.g-1 A análise micotoxicológica de 120 amostras de caroço de algodão armazenado
revelou a presença de três (03) amostras contaminadas com aflatoxinas (aflatoxina B1+ aflatoxina
B2) ou 2,5% das amostras em concentrações que variaram entre 15,2 a 38,5 µg.kg-1 entre os
meses de outubro a dezembro de 2004 (POZZI et al., 2005). Entre as várias pesquisas realizadas
no Brasil para a detecção de aflatoxina B1 nos alimentos destinados ao consumo animal, observa-
se uma grande variedade de resultados, desde a não detecção até valores de 7.400 ppb, o que
demonstra a necessidade de uma fiscalização constante por parte das autoridades sanitárias do
país (SALAY; MERCADANTE, 2002).
O Ministério da Saúde, resolução 274, de 15 de outubro de 2002, estabeleceu limites
máximos tolerados de aflatoxinas (B1+B2+G1+G2) admissíveis no milho e derivados (20,0 µg.kg-
1), amendoim e derivados (20,0 µg.kg-1) e leite fluido (aflatoxina. M1, 0,5 µg.kg-1). Para rações e
ingredientes destinados à alimentação animal o Ministério da Agricultura, através da Portaria
sete, de 09 de novembro de 1988, estabelece o limite máximo de aflatoxinas em 50 µg.kg-1. Em
18/02/2011 através da RDC N° 7, o Ministério da Saúde estendeu a fiscalização a outras
micotoxinas (fumonisinas B1 e B2, ocratoxina A, zearalenona, patulina e desoxinivalenol)
estabelecendo limites máximos tolerados para cada micotoxina em outros tipos de alimentos,
bebidas e matérias primas destinados ao consumo humano. Os limites máximos tolerados para as
aflatoxinas em milho e derivados, e o leite fluido continuam os mesmos estabelecidos na RDC
274 e para outros cereais e produtos o LMT foi estabelecido em 5 µg.kg-1 (BRASIL, 2002;
BRASIL, 1988; BRASIL, 2011).
Após a ingestão de alimentos contaminados, a aflatoxina B1 é absorvida pelo trato
gastrointestinal e, via sistema porta, chega ao fígado onde é biotransformada por meio de reações
catalisadas por enzimas microssomais associadas ao citocromo P 450. As aflatoxinas M1 e M2 ou
16
toxinas do leite são metabólitos resultantes da hidroxilação das aflatoxina B1 e aflatoxina B2,
respectivamente e secretadas no leite de mamíferos que consomem alimentos contaminados. A
ocorrência de aflatoxina M1 no leite é uma questão de saúde pública, pois o produto é consumido
por crianças e adultos em todo o mundo. A micotoxina é classificada pelo IARC (1998) no grupo
2B como uma substância potencialmente carcinogênica. A excreção da toxina no leite dos
animais depende de vários fatores, relacionados ao tipo da dieta ingerida, nível de contaminação
com aflatoxina B1, quantidade ingerida, raça, nível de produção do animal, fase da lactação,
estado de saúde dos animais. Estudos recentes indicam que entre 0,3 a 6,2% da AFB1 ingerida na
dieta, aparece no leite de vacas lactantes (WHO, 2001).
A dieta de bovinos leiteiros de alta produção consiste principalmente de volumosos
conservados sob a forma de silagem de gramíneas e concentrados. As pesquisas sobre a
ocorrência de micotoxinas em concentrados ou ingredientes de rações fornecidos aos animais são
consideráveis (SANTURIO et al., 1996; SCUDAMORE; PATEL, 2000). Entretanto, as pesquisas
sobre ocorrência de micotoxinas em silagens de gramíneas são mais escassas e tem sido objetivo
de estudo em diferentes países.
Driehuis et al. (2008) avaliaram a ocorrência de micotoxinas em 290 amostras de silagem
de milho e trigo em propriedades leiteiras da Holanda entre os anos de 2002 a 2004. Os autores
detectaram desoxinivalenol em 72% das amostras de milho e 10% nas amostras de trigo com
níveis entre 854 e 621 µg/kg-1. Zearalenona também foi detectada em 49% das amostras de milho
com concentrações de até 943 µg/kg-1. Foi detectada a presença de Fumonisina em apenas 1,7%
das amostras de silagem de milho e aflatoxina não foi encontrada, provavelmente em razão de
condições climáticas, já que a ocorrência da micotoxina é relevante em regiões tropicais e
subtropicais. Amaral (2011) avaliando 36 amostras de silagem de milho no momento da abertura
do silo verificou a presença de aflatoxinas B1 em três amostras, representando 6,6% das silagens
provenientes do tratamento com vedação com plástico de polipropileno, 25% das silagens que
receberam aditivos e 16,6% das silagens provenientes do silo que não receberam terra sobre a
lona plástica. Os níveis médios detectados foram de 13,02 µg/kg-1 e estavam abaixo dos LMT
permitidos para o consumo animal (BRASIL, 1988).
17
Os fungos e seus produtos de metabolismo representam sérios riscos a saúde humana com
a possibilidade da contaminação direta, através da ingestão de alimentos contaminados e
contaminação indireta por meio da presença de resíduos em produtos de origem animal, além da
grande contaminação de grãos por fungos capazes de sobreviver em condições adversas. Diante
desta problemática há necessidade de se estudar os fatores que levam ao desenvolvimento de
fungos e a presença de micotoxinas em alimentos destinados a animais de produção, para assim,
manter os níveis de contaminação dentro de limites tolerados pela legislação nacional e
internacional.
2.3. Fatores bióticos e abióticos
O crescimento dos fungos toxigênicos e a produção de micotoxinas são dependentes de
vários fatores: a) susceptibilidade do substrato à colonização do fungo produtor; b) fatores
físicos: temperatura, umidade do substrato e umidade relativa do ar; danos mecânicos provocados
às sementes, tempo de armazenamento; c) fatores biológicos: capacidade genética do fungo de
produzir micotoxinas, presença de esporos viáveis, interação de diferentes espécies fúngicas e de
micotoxinas no mesmo substrato. (CIEGLER, 1978). Entre esses fatores os mais importantes são
tipo de substrato, temperatura e umidade (CORREA, 2000).
A temperatura é o fator ambiental que mais afeta o crescimento do bolor (fungos
filamentosos). Em temperaturas abaixo de 10 °C a maioria dos fungos não se desenvolve e os que
conseguem o fazem lentamente. A temperatura ótima de crescimento está entre 25 e 30 °C,
embora as espécies de Aspergillus desenvolvam-se mais rapidamente em temperaturas acima de
30°C (LACEY et al., 1991).
A atividade de água (Aa) ou água livre é outro fator importante no crescimento do fungo e
produção de micotoxinas. A atividade de água é um conceito físico-químico que foi introduzido
para os microbiologistas em meados da década de 50 por Scott (1957). Nesse trabalho o autor
demonstrou que a atividade de água efetivamente quantificava a relação entre umidade dos
alimentos e a habilidade de crescimento dos micro-organismos. O termo Aa é definida pela
relação entre a pressão de vapor de determinado alimento e a pressão de vapor da água pura à
18
máxima temperatura, com valores entre 0 e 1. Essa variável tem forte relação com a umidade
relativa do ar, isso porque a umidade pode migrar para o alimento devido a gradientes de
temperatura dentro de depósitos (LACEY, 1989). Umidade relativa do ar entre 81 a 85%
estimularia a germinação de esporos de Aspergillus flavus, enquanto que taxas acima de 85%
estimulariam produção de micotoxinas por esses fungos.
De acordo com Leitão (1988) e Lacey et. al (1991) a faixa ideal de Aa para o crescimento
de A. flavus está entre 0,78 a 0,80 e 0,78 a 0,82, respectivamente. Para a produção de aflatoxinas
os níveis necessários de Aa estão entre 0,83 a 0,87 para o A. flavus e 0,87 para o A. parasiticus.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material
3.1.1. Localização das fazendas leiteiras
Foram avaliadas 09 fazendas produtoras de leite tipos B e C, entre outubro de 2010 e
agosto de 2011, localizadas nos municípios de Nova Odessa (02), Monte Mor (01), Paulínia (01),
Campinas (02), Bragança Paulista (01), Descalvado (01) e Ribeirão Preto (01). (Figura 1).
Figura 1: Localização das fazendas leiteiras no Estado de São Paulo
20
3.1.2 Características gerais de produção das fazendas leiteiras
As propriedades foram caracterizadas por letras de “A a I” e suas principais características
de produção e de manejo da dieta estão expostos nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1 – Características gerais de produção das fazendas leiteiras, 2010-2011. Fazendas Leite Raça Vacas Lactantes
(Nº.) Produção Leite Diária
(L) A B HPB 56 650 B A HPB 1.450 42.000 C B HPB/Jersey 59 1.660 D C Mestiço/Jersey 27 370 E B Mestiço/HPB 110 1.500 F C Girolando 55 800 G B Mestiço/Jersey 29 667 H C Mestiço 17 220 I B Mestiço/HPB 249 4.000 HPB - Holandês Preto e Branco
Tabela 2 - Características gerais das dietas ofertadas às vacas em lactação nas fazendas leiteiras, 2010-2011.
Fazendas Volumoso Ingredientes Concentrado*
Fornecimento Concentrado Pasto
A SM GM+FS+CA MC NÃO B SM+CTP GM+PC+FS+CA MC NÃO C SM+FCT GM+PC+FS+CA MC NÃO D MP+SM GM+FT SV SIM E CP+SS+CVU GM+FT+CVS SV SIM F SCN+CVU GM+CA+PC SV SIM G SM+SS GM+FS+PC+CA SV SIM H SCN+CVU GM+FS+CA SV SIM I SM+AP GM+FS+FT+CVS MC NÃO SM - Silagem de Milho; SS – Silagem de sorgo; SCN – Silagem de Capim Napier; CTP – Capim Tifton Picado, FCT- Feno Capim Tifton; CP – Cana Picada; MP – Milho Picado; CVU – Cevada úmida; AP – Aveia picada; CVS –Cevada Seca; GM – Grãos de Milho; FS – Farelo de soja; PC – Polpa cítrica; CA – Caroço de algodão; FT – Farelo de trigo, MC – Mistura completa, SV – Sobre volumoso. *Preparo do concentrado realizado na própria fazenda, com exceção das fazendas D e E.
21
Na tabela 03 vemos a avaliação de aspecto geral das fazendas, tipo de armazém para
concentrado e tipo de silo. No aspecto geral, foram considerados a limpeza, ventilação, presença
de roedores e animais, manejo e organização das instalações.
Tabela 3 – Aspecto geral das instalações, tipo de armazém para concentrado e tipo de silo das fazendas leiteiras, 2010-2011. Fazendas Aspecto geral Tipo de Armazém Tipo de Silo
A Razoável Paiol de Madeira Trincheira
B Bom Galpão Aberto Trincheira
C Excelente Paiol de Alvenaria Aéreo Vertical
D Ruim Paiol de Alvenaria Trincheira
E Ruim Sem local próprio Superfície
F Bom Paiol Alvenaria Trincheira
G Bom Paiol Alvenaria Trincheira
H Bom Paiol Alvenaria Superfície
I Bom Silo Vertical Aéreo Trincheira
A fazenda A, considerada razoável, possui local de armazenagem inapropriado para ração,
pois se trata de construção antiga que permite entrada de roedores, outros pequenos animais e
insetos, além de permitir troca facilitada de umidade e temperatura entre ambiente externo e o
interno. O silo utilizado para conservação de forragem é do tipo trincheira, assim como nas
fazendas B, D, F, G, I. Observou-se também, falhas na vedação dos silos e na utilização da
silagem. Cuidados como, retirada de fatia exposta ao ambiente no primeiro trato do dia e vedação
do silo depois de retirada de material a ser utilizado não eram adotados. Todas as fazendas
produtoras de leite avaliadas, que forneciam silagem ao rebanho, estavam com os seus silos
abertos e em processo de utilização do material ensilado.
A fazenda B foi a única produtora de leite tipo A que participou do presente
levantamento. Por ser uma propriedade de grande porte possui um local para armazenagem de
ração aberto de forma a permitir a entrada de maquinário para abastecimento e retirada de ração.
Segundo administração da fazenda o fluxo de utilização da ração é rápido, mas não foi informado
quantos dias, em média, o material fica estocado nessas condições. Não foi possível acompanhar
22
de perto a retirada e utilização da silagem nesta propriedade, mas observou-se que os silos
permanecem abertos entre as retiradas de material ao longo do dia.
A fazenda C foi mais bem avaliada. O local de armazenamento da ração e ingredientes é
limpo e seco e protegido, com boa localização e conservação. O silo existente na propriedade é
do tipo vertical aéreo.
A fazenda D foi considerada ruim devido a proximidade de instalações de suinocultura
junto a sala de ordenha e paiol de ração e pelo fato de armazenar de forma inapropriada (em
carroça de trator) o volumoso utilizado no momento do estudo. O volumoso em questão é milho
picado “in natura”, colhido em plantações vizinhas e armazenado até uma semana nas condições
citadas acima.
A fazenda E foi a que se mostrou com mais pontos a melhorar. A higiene e conservação
das instalações não são boas, a presença e proximidade de aves domésticas, cães e gatos em todas
as instalações destinadas a bovinocultura leiteira prejudica a sanidade e conservação das
instalações e da ração estocada próxima à sala de ordenha. A falta de um local específico para
armazenar a ração e a cevada úmida ofertada aos animais expõe o material a ataque de animais,
insetos e umidade, comprometendo a qualidade do material armazenado.
Na fazenda H destaca-se a proximidade do deposito de ração da sala de ordenha e as
condições de estocagem da cevada úmida (caixa de alvenaria).
Nas demais fazendas (F, G e I) apresentavam depósitos de ração em bom estado de
conservação e higiene e ma3nejo de utilização dos alimentos estocados (volumoso e concentrado)
correto.
3.1.3 Esquema de colheita das amostras das dietas
As colheitas das amostras das dietas totais (volumoso + concentrado) dos rebanhos foram
realizadas a cada 15 dias, sendo duas colheitas de amostras em intervalos de 24 horas, no período
23
da manhã, logo após o trato realizado pelo funcionário da fazenda, durante período de 45 dias.
Na fazenda A o período avaliado foi de 60 dias. Em todas as fazendas, a amostragem foi
realizada diretamente do cocho correspondente ao lote de maior produção e de 15 vacas em
lactação. Foram retiradas amostras incrementais em 25 pontos diferentes do cocho para compor
uma amostra composta de 5 kg que foi homogeneizada e subdividida em quatro subamostras de
1,25 kg cada (BRASIL, 2010) e encaminhas ao laboratório de Qualidade do Leite do Instituto de
Zootecnia para determinação da atividade de água, perfil da microbiota fúngica e aflatoxina B1.
A obtenção dos valores de atividade de água foi realizada imediatamente após a chegada e
homogeneização das amostras. Após esse processo as amostras foram congeladas em freezer para
que os ensaios microbiológicos fossem realizados posteriormente. Depois de realizados os
isolamentos da microbiota fúngica, as amostras foram submetidas à secagem em estufa a 65 ºC e
submetidas à moagem para posterior análise de determinação de aflatoxina B1.
3.2. Métodos
3.2.1. Determinação da Atividade de água (Aa)
A atividade de água (Aa) das amostras das dietas foi medida por meio do aparelho Testo®
650 (Testo do Brasil Ltda). Alíquotas das amostras frescas fragmentadas foram acondicionadas
em recipiente próprio do aparelho e lacradas em pequena câmara de metal com sensor e a leitura
realizada após alguns minutos (4 a 6 min.)
4.2.2. Isolamento, contagem e identificação da microbiota fúngica das dietas (SWAMSON et
al., 1992)
De cada subamostra de dieta (296) foram retiradas 10 g e diluídas em 90 mL de solução
salina 0,85% esterilizada, obtendo-se diluição de 10-1. A partir desta foram preparadas diluições
decimais seriadas até 10-11. Foram depositados 1mL de cada diluição em duas placas de Petri
contendo 10 a 15 mL de meio de cultura Ágar Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol (DRBC-
OXOID) resfriado a 45 ºC; as placas foram homogeneizadas e incubadas a 25 ºC durante sete
24
dias. Após o período de incubação, foi realizada a contagem das colônias multiplicando-se o
número encontrado pelo fator de diluição, para se obter o número de unidades formadoras de
colônias por grama de dieta (UFC.g-1) (BUSTA et al., 1984).
Colônias de diferentes tipos morfológicos foram isoladas em Ágar Sabouraud Dextrose
(ASD-OXOID) e a identificação dos fungos filamentosos foi realizada através de padrões
morfológicos como características macroscópicas dos cultivos e microscópicas das colônias por
meio da técnica de microcultivo em lâmina em Ágar Sabouraud Dextrose conforme Ridell
(1950). Os fungos foram classificados até gênero, mas aqueles pertencentes aos gêneros
Aspergillus e Fusarium foram classificados até espécie, de acordo com os seguintes compêndios:
Nelson, Touson e Marasas (1983); Raper e Fennell (1965) e Samson e Reenem-Hoekstra (1988).
3.2.3. Determinação de aflatoxina B1 nas dietas
3.2.3.1. Material
3.2.3.1.1. Toxina
O padrão de aflatoxina B1 (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA), em embalagem de 5 mg,
utilizado nas análises, foi dissolvido em benzeno: acetonitrila (98:2) em balão volumétrico
calibrado de 5 mL. Retirou-se uma alíquota de 500 µl e transferiu-se para balão volumétrico
calibrado de 10 mL, evaporando até a secura e ressuspendido em metanol padrão CLAE
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). A partir dessa solução “stock” (50 µg.mL-1) foi
preparada uma solução de trabalho de 1 µg.mL-1 e diluições seriadas com 5, 10, 15, 20 e 25
ŋg.ml-1 para a construção da curva de calibração do Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência.
3.2.3.1.2. Determinação da concentração do padrão
A concentração do padrão de aflatoxina B1 (AFB1) foi avaliada de acordo com a
metodologia da Association Official Chemistry (AOAC), manual de Métodos Oficiais de 1995. A
25
análise foi efetuada em espectrofotômetro de UV (γ 350nm) e para o cálculo das concentrações
foi utilizada a seguinte fórmula:
ŋg aflatoxina B1.mL-1 = A x PM x 1000 x FC €
Onde:
A = Absorbância da amostra.
FC = Fator de correção do aparelho (1,05).
PM = Peso molecular da AFB1
€ = Absortividade molar.
3.2.3.1.3. Reagentes:
a) Metanol grau CLAE – Merk.
b) Acetonitrila grau CLAE – Merk.
c) Ácido Fosfórico – Merk.
d) Agua Milli-Q (Millipore)
e) Membranas filtrantes Milex (0,45µm) éster e de éster de celulose e teflom (0,45µm).
Milipore.
3.2.3.1.4. Equipamento
O cromatógrafo líquido de alta eficiência utilizado neste estudo foi da marca Shimadzu,
modelo LC-20 AT, acoplado ao detector de fluorescência RF-20 A e loop de 20 µl. Para as
análises o programa utilizado foi o LC-Solution Multi-PDA.
3.2.3.2. Método
3.2.3.2.1 Extração e purificação de Aflatoxina B1 (AOAC, 2000)
Vinte e cinco gramas de cada sub amostra (296), previamente trituradas com 5 g de NaCl,
26
foram transferidas para um frasco de boca larga e adicionados 125 mL de metanol:água (70:30
v/v). Após agitação por 30 minutos em agitador mecânico horizontal, o conteúdo do frasco foi
filtrado em papel de filtro e 15 mL da solução de extrato, obtida a partir da primeira diluição, foi
diluídos em 30 mL de água destilada. Em seguida, 15 mL do extrato filtrado (15 mL=1,0 g da
amostra) foram transferidos para uma coluna de imunoafinidade a um fluxo de cerca de 1-2
gotas/segundo. Concluída a operação, a coluna foi lavada com 10 mL de água destilada a um
fluxo de cerca de duas gotas/segundo e eluída com 1,0 mL de metanol grau CLAE a um fluxo de
cerca de uma a duas gotas por segundo. Após a eluição, o extrato foi recolhido e armazenado em
temperatura de congelamento até o momento da quantificação.
3.2.3.2.2. Quantificação de aflatoxina B1 por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE)
A aflatoxina B1 presente no extrato metanólico foi quantificada por CLAE, tendo como fase
móvel metanol: acetonitrila: ácido fosfórico 0,1% (24:24:52 v/v/v), fluxo de 1,0 mL/minuto,
detector de fluorescência (364 nm de excitação e 440 nm de emissão), coluna ODS C18 4,6x250
mm de 5 micron (Shimadzu) (CHAN et al., 2004).
O método de quantificação das amostras foi padrão externo utilizando curva de calibração
construída por meio do preparo de soluções com cinco diferentes concentrações do padrão de
AFB1 (05, 10, 15, 20 e 25 ηg.mL-1)
O controle de qualidade analítico foi realizado através da determinação dos limites de
detecção, quantificação e teste de recuperação. O limite de detecção (LD), de acordo com o
INMETRO (2010), é definido como a concentração mínima de uma substância medida e
declarada com 95% ou 99% de confiança de que a concentração do analito é maior que zero. O
LD teórico foi determinado analisando o ruído do intervalo entre os dois minutos anteriores e os
dois minutos posteriores ao tempo de retenção da AFB1 e foi considerado como o menor valor de
concentração que resultasse em pico de altura maior que três vezes a amplitude do intervalo de
ruído analisado.
27
O limite de quantificação (LQ), segundo o INMETRO (2010) é definido como a menor
concentração do analito que pode ser determinada com um nível aceitável de exatidão e precisão.
O limite de quantificação teórico foi calculado multiplicando-se o valor de LD por três.
Os testes de recuperação foram realizados através da fortificação de amostras de dietas
isentas da micotoxina com concentrações de 0,25 ηg.g-1, 0,4 ηg.g-1 e 1,25 ηg.g-1 em triplicata e
realizadas as extrações, purificações e quantificações de aflatoxina B1 como na metodologia
descrita no ítem 4.2.3. As amostras que apresentaram aflatoxina B1 detectáveis foram
confirmadas pela co-cromatografia e a derivatização com ácido tricloroacético segundo Tarin et
al. (2004).
3.2.4. Dados meteorológicos das regiões das fazendas avaliadas
As medidas de precipitação pluvial (mm), temperaturas máxima, mínima e média (ºC) e
umidade relativa do ar (%) foram obtidas do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), por meio
de estações meteorológicas mantidas em cada município das fazendas avaliadas.
3.2.5. Análise estatística
A análise estatística foi realizada teste de Kruskal-Wallis empregando-se o programa SAS
versão 9.1 (STATISTICAL ANALYSES SYSTEMS, 2003).
28
29
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Microbiota fúngica
Na tabela 4, estão expostos os dados de percentagem de contaminação e Unidades
Formadoras de Colônias (UFC.g-1) da população global de fungos (filamentosos e leveduras)
isolados das amostras de dietas das vacas em lactação nas nove (09) fazendas avaliadas. Nessa
tabela é possível observar que das 296 amostras analisadas houve predominância de leveduras em
relação à população geral de fungos, onde se verifica valores percentuais de frequência que
variaram de 83,97% a 99,98% para as leveduras e de 0,02% a 16,03% para isolamentos de fungos
filamentosos. As maiores proporções de fungos filamentosos foram observadas nas fazendas A
(16,03%), E (2,87%) e D (2,49%). O número UFC.g-1 variou de 5,28x104 a 6,80x1011 para as
leveduras e 3,0x102 a 1,73x1010 para os fungos filamentosos. A maior frequência de isolamentos
de leveduras nas dietas compostas principalmente por gramíneas conservadas sob a forma de
silagem (milho, sorgo e capim Napier) está de acordo com dados de pesquisadores que mostram
grandes populações de leveduras em silagens decorrente da exposição ao oxigênio no momento
do desabastecimento dos silos ou manejo inadequado durante a confecção. As leveduras são
consideradas as principais responsáveis pela deterioração aeróbia de silagens (Mc DONALD et
al., 1991; DRIEHUIS e OUDE ELFERINK, 2000). Os volumosos, parte da dieta total fornecida
30
aos animais, eram misturados à ração no momento do desabastecimento do silo em cada
propriedade e fornecidos no cocho, o que pode ter contribuído para os maiores isolamentos de
leveduras.
Tabela 4- Unidades formadoras de colônias (UFC.g-1) e contaminação (%) de dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.
FAZENDAS
LEVEDURAS
%
FUNGOS FILAMENTOSOS
%
TOTAL
A 7,65x108 83,97 1,46 x108 16,03 9,11x108
B 5,1 x1010 99,83 8,68x107 0,17 5,1 x1010
C 1,52x1011 99.67 5,03x108 0,33 1,52x1011
D 6,80x1011 97,51 1,73x1010 2,49 6,96x1011
E 2,49x108 97,13 7,38x106 2,87 2,57x108
F 5,28x104 99,14 3,0x102 0,56 5,31x104
G 7,25x109 99,86 1,01x107 0,14 7,25x109
H 3,95x109 99,69 1,2 x107 0,31 3,95x109
I 2,46x109 99,98 4,72x105 0,02 2,47x109
Teste de Kruskall-Wallis (P<0, 001) Houve diferença significante entre as fazendas D e A, B, C, E, F, G, H e I para UFC.g-1(Total de fungos, leveduras e fungos filamentosos) . Teste de Kruskall-Wallis (P<0,001) Houve diferença significante entre as fazendas F e A, B, C, D, E, G, H e I para UFC.g-1 (Total de fungos, leveduras e fungos filamentosos).
A analise estatística realizada (Tabela 4) revelou que houve diferença significante
(P<0,001) nas contagens de UFC.g-1 para fungos totais, leveduras e fungos filamentosos entre a
fazenda D e as demais fazendas, verificando-se os maiores isolamentos nessa propriedade. Ao
contrário, a Fazenda F foi diferente das demais (P<0,001) em relação às contagens de unidades
formadoras de colônias, sendo a propriedade que apresentou os menores isolamentos de fungos.
Miyazaki (2009) verificou após a abertura de silos experimentais de silagem de milho com
densidades de 650 kg/m3 o aumento da população de leveduras de 4,48 log UFC.g-1 de forragem
para 7,86 log UFC.g-1. A população inicial de fungos filamentosos de 3,39 log UFC.g-1 chegou a
6,36 log UFC.g-1 de silagem. Na ensilagem de cana de açúcar, que apresenta grande quantidade
de leveduras na flora epifítica, houve um aumento da população de leveduras até 21 dias de
abertura do silo e redução da população de filamentosos até 105 dias, provavelmente em
31
decorrência da produção de etanol pelas leveduras. As contagens médias no tempo de unidades
formadoras de colônias foram maiores para as leveduras do que para os fungos filamentosos, log
5,12 UFC.g-1 e log 2,57 UFC.g-1 respectivamente (VITTORI, 2009). Em silagem de milho
ofertada a vacas em lactação na região de Córdoba, Argentina, González-Pereyra et al. (2007)
isolaram leveduras em 65% das amostras avaliadas em dois silos trincheiras no momento da
abertura e após 150 dias de fermentação. Os fungos filamentosos Aspergillus spp e Fusarium spp
foram isolados em 75% e 62% das amostras, respectivamente.
Na tabela 5 estão expostos os dados de frequências absolutas e relativas de fungos
filamentosos isolados. Verifica-se que os principais gêneros encontrados nas amostras das dietas
no nosso trabalho foram: Aspergillus spp (20,09%), Fusarium spp (14,16%), Peniccilum spp
(11,42%), Rhizopus spp (7,31%), FNE (6,85%), Cladosporium spp (6,39%), Absidia spp
(5,48%), Mucor spp (5,48%), Emericella spp (4,57%), Monascus spp (4,57%), Alternaria spp
(3,65%), Moniliella spp (3,65%), Scopulariopsis spp (2,74%), Eurotium spp, (0,91%)
Trichoderma spp (0,46%), Geotrichum spp (0,46%) e Acremonium spp (0,46%). Esses resultados
estão de acordo com vários autores que citam os gêneros Aspergillus spp, Fusarium spp e
Penicillium spp como os mais importantes fungos toxigênicos isolados em grãos de cereais,
oleaginosas e rações (FRISVAD; NIELSEN; SAMSON, 2006; TANIWAKI; SILVA, 2001;
RODRIGUEZ-AMAYA; SABINO, 2002).
Batista et al. (2006), em estudo realizado em Recife – PE, verificaram ocorrência de oito
gêneros fúngicos (Penicillium, Paecilomyces, Aspergillus, Scopulariopsis, Monoascus,
Syncephalastrum, Micellya) em silagens de capim elefante associado a níveis de algaroba. Neste
mesmo estudo os autores observaram a prevalência da espécie A. flavus em todos os tratamentos.
Os valores de UFC.g-1 encontrados variaram de 58,13 a 261,88, bem abaixo dos encontrados no
presente estudo.
Bjelić et al. (2009), ao realizar a identificação e quantificação de fungos, em Belgrado -
Servia, encontraram Fusarium em 80% das amostras de silagem de leguminosas (alfafa, panasco
e festuca) analisadas, e em menor número os gêneros Aspergillus (10%), Rhizopus (2%),
Paecylomices (2%), Penicillium (2%), Acremonium (2%) e Alternaria (2%) na faze de formação
32
dos botões florais. Na fase de 50% das plantas florescendo foi isolado Fusarium spp em 91% das
amostras, Mucor spp (3.6%), Alternaria spp (3.6%) e Aspergillus spp (1.8%).
O gênero Aspergillus spp foi o primeiro em prevalência de isolamento no nosso trabalho
(20,09%). O fungo está distribuído amplamente no mundo, tem preferência de crescimento em
países de clima tropical e subtropical onde encontra condições de temperatura e umidade ótimas
para o desenvolvimento e produção de micotoxinas. Espécies do gênero têm afinidade por
sementes oleaginosas como o caroço de algodão fornecido nas dietas das vacas e cereais como o
milho. Em estudo do perfil da microbiota fúngica em grãos de milho recém-colhidos em
diferentes regiões do Brasil, Rocha et. al (2009) isolaram Aspergillus spp como o segundo gênero
em frequência em Mato Grosso (14,0%) e Bahia (12,6%). Outros trabalhos também têm
verificado a presença de Aspergillus spp como parte da microbiota fúngica de grãos de milho
recém-colhidos no Brasil, sendo superado em termos de frequência de isolamentos pelos fungos
Fusarium spp e Penicillium spp (POZZI et al., 1995; ALMEIDA et al., 2000).
Várias espécies de Aspergillus spp foram isoladas de culturas no campo, entretanto as
espécies do fungo Fusarium spp nessas condições são as mais encontradas no Brasil quando
analisados os isolamentos em grãos de cereais destinados à alimentação animal (ALMEIDA et
al., 2002). Considerados como fungos de campo, os fungos desse gênero invadem os tecidos da
planta durante o desenvolvimento, quando os teores de umidade no grão são mais elevados, ao
contrário do gênero Aspergillus spp, mais tolerantes a conteúdos de umidade mais baixos e
considerados fungos de armazenamento.
Segundo Berjak (1987) os fungos de armazenamento geralmente em número mais baixo
superam os de campo logo após o armazenamento, competindo pelos nutrientes presentes no
substrato e a mais baixa disponibilidade de água. A tendência de queda na frequência de
isolamentos de fungos do gênero Fusarium spp em grãos de milho e sorgo armazenados em
galpões durante período de 12 meses e aumento dos isolamentos de fungos do gênero Aspergillus
spp foi observado por Pozzi et al. (1995) e Silva et al. (2000), respectivamente.
Em amostras de caroço de algodão armazenado durante período de 12 meses Pozzi et al.
33
(2005) encontraram Aspergillus spp (36,6%), Peniccilum spp (20,0%) e Fusarium spp (9,16%)
como os gêneros fúngicos mais prevalentes, sendo que esse substrato, é muito utilizado como
componente de dieta de vacas em lactação.
Em nossa pesquisa os fungos do gênero Fusarium spp apresentaram frequência de
isolamento de 14,16%. Os mais baixos isolamentos de Fusarium spp quando comparados ao
gênero Aspergillus spp podem ter ocorrido devido aos maiores isolamentos de leveduras das
dietas dos animais, composta de silagem de gramíneas principalmente silagens de milho.
Segundo Pelhate (1977) para fungos filamentosos em silagens, as espécies de Fusarium são
estritamente aeróbias. Espécies de fungos como Aspergillus fumigatus, Monascus ruber,
Penicillium roqueforti são considerados microaerófilos ou indiferentes a presença ou não de
oxigênio. Auerback, Oldenburg e Weissback (1998) verificaram que populações de fungos
filamentosos decresceram em silagens de milho ao longo do período de fermentação até 100 dias
em condições estritas de anaerobiose. A partir desse dia apenas Penicillium roqueforti estava
presente, isso porque esporos dessa espécie fúngica mostram-se menos sensíveis aos ácidos
orgânicos do que espécies de outros fungos.
Mansfield e Kuldan (2007) observaram mudança no perfil da biota fúngica da planta de
milho antes do processo de ensilagem e após período de fermentação de 90 dias. Antes do
processo de ensilagem os pesquisadores isolaram 07 espécies de Fusarium spp, entre elas, F.
verticilliodes e 06 espécies de Penicillium spp. Após a ensilagem do material colhido os
pesquisadores isolaram apenas espécies de Penicillium, inclusive Penicillium expansum que não
aparecia na planta inteira antes da fermentação. Na presença de influxo de oxigênio, a degradação
aeróbia aumenta principalmente em decorrência da atividade principalmente de leveduras e em
segundo lugar fungos filamentosos de outras espécies menos sensíveis às condições de
fermentação presentes nos silos. Em Irish Midlands, O’Brien et al. (2005) analisaram amostras de
silagem de capim de 35 fazendas e constataram a presença de Penicilium, Geotrichum,
Mucolares, Fusarium, Trichoderma e Corprinus. A espécie Penicillium roquefort foi a que se
destacou constituindo 52% dos isolamentos e esteve presente em 86% dos fardos de silagem
analisados.
34
Tabela 5 – Atividade de água e Frequências absoluta e relativa (%) de isolamentos de fungos filamentosos nas dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.
Fazendas Gêneros A B C D E F G H I Total
FA FR FA FR FA FR FA FR FA FR FA FR FA FR FA FR FA FR n=219 (%) Aspergillus 12 5,48 1 0,46 1 0,46 10 4,57 2 0,91 1 0,46 10 4,57 5 2,28 2 0,91 44 (20,09) Fusarium - - - - - - 21 9,59 8 3,65 - - - - - - 2 0,91 31 (14,16) Penicillium 4,0 1,83 1 0,46 - - 1 0,46 6 2,74 - - 6 2,74 6 2,74 1 0,46 25 (11,42) Rhizopus spp 1 0,46 - - 1 0,46 9 4,11 1 0,46 - - - - 1 0,46 3 1,37 16 (7,31) FNE* - - 1 0,46 - - 9 4,11 4 1,83 - - - - - - 1 0,46 15 (6,85) Cladosporium 1 0,46 1 0,46 - - 6 2,74 3 1,37 - - 1 0,46 1 0,46 1 0,46 14 (6,39) Absidia 4 1,83 - - 3 1,37 2 0,91 - - - - - - 3 1,37 - - 12 (5,48) Mucor 5 2,28 - - - - 2 0,91 4 1,83 - - - - 1 0,46 - - 12 (5,48) Emericella - - 1 0,46 - - 1 0,46 1 0,46 - - 4 1,83 2 0,91 1 0,46 10 (4,57) Monascus 1 0,46 - - - - 6 2,74 2 0,91 - - - - - - 1 0,46 10 (4,57) Alternaria - - - - - - 4 1,83 3 1,37 - - - - 1 0,46 - - 8 (3,65) Moniliella 8,0 3,65 - - - - - - - - - - - - - - - - 8 (3,65) Scopulariopsis - - - - - - - - 6 2,74 - - - - - - - - 6 (2,74) Eurotium - - - - - - - - - - - - 2 0,91 - - - - 2 (0,91) Trichoderma - - - - - - - - - - - - - - 1 0,46 - - 1 (0,46) Geotrichum - - - - 1 0,46 - - - - - - - - - - - - 1 (0,46) Acremonium - - - - - - 1 0,46 - - - - - - - - - - 1 (0,46) Aa
0,96 0,98 0,93 0,93 0,93 0,90 0,92 0,91 0,91
FA = frequência absoluta, FR = frequência relativa. (%) Aa = Atividade de água
35
Bjelić et al. (2009), ao realizarem a identificação e quantificação de fungos, em Belgrado -
Servia, encontraram Fusarium em 80% das amostras de silagem de leguminosas (alfafa, panasco
e festuca) analizadas, e em menor número os gêneros Aspergillus (10%), Rhizopus (2%),
Paecylomices (2%), Penicillium (2%), Acremonium (2%) e Alternaria (2%) na faze de formação
dos botões florais. Na fase de 50% das plantas florescendo foi isolado Fusarium em 91% das
amostras, Mucor (3.6%), Alternaria (3.6%) e Aspergillus (1.8%).
Os resultados apresentados na tabela 5 mostram o isolamento de fungos dos gêneros
Rhizopus spp (5,07%), Absidia spp (3,72%) e Mucor spp (3,72%) nas dietas fornecidas às vacas
leiteiras. O isolamento desses fungos indica as péssimas condições sanitárias (acúmulo excessivo
de sujeira e resto de ração nas instalações, instalações mal projetadas que permitem facilmente a
entrada de roedores, pássaros, aves domésticas e insetos, proximidade excessiva da sala de
ordenha, ausência de um lugar específico para armazenamento) dos depósitos de insumos
utilizados no preparo dos concentrados fornecidos aos animais. Durante o período de quatro anos
(1996-1999) os gêneros Mucor e Absidia foram isolados respectivamente em 52% e 30% das
amostras analisadas de rações fareladas e peletizadas (n=189) estocadas em fazendas leiteiras em
Portugal, constituindo-se junto com Aspergillus spp (91%) e Penicillium spp (58%) como os
principais fungos contaminantes de rações fornecidas às vacas leiteiras (MARTINS e MARTINS,
2001). Santiago e Motta (2008) avaliaram em Recife amostras (n=86) de milho e derivados e
encontraram até 86% das amostras contaminadas por Mucorales indicando as péssimas condições
de higiene das indústrias processadoras dos grãos. Espécies desses fungos também são
produtoras de toxinas.
Os fungos do gênero Aspergillus spp foram isolados nas amostras das dietas de todas as
fazendas avaliadas, sendo mais frequentes nas fazendas A (5,48%), D (4,57%), G (4,57%) e H
(2,28%). Entretanto nas fazendas D (9,59%) e E (3,65%) foi observada a predominância de
fungos do gênero Fusarium spp. Importante salientar que nessas fazendas o volumoso ofertado às
vacas em lactação era composto por milho picado e cana picada, respectivamente, misturado à
silagem, o que corrobora os achados de outros autores sobre a mudança do perfil da biota fúngica
do milho e da cana antes e após processo de ensilagem (MANSFIELD; KULDAN, 2007;
VITTORI, 2009).
36
Schocken-Iturrino et al. (2005) registraram aumento na ocorrência dos fungos filamentosos
Penicillium, Fusarium e Pithomyces com o prolongamento da exposição ao ar, na avaliação de
silagens de capim-Tifton 85. Segundo os autores a presença de oxigênio permitiu o
desenvolvimento dos micro-organismos tolerantes a pH ácido, como os fungos filamentosos,
previamente inibidos pela anaerobiose.
Os dados de atividade de água das amostras das dietas colhidas das fazendas e a contagem
de unidades formadoras de colônias (UFC.g-1) estão expostos na tabela 6 e figura 2. Observa-se
que a atividade de água variou de 0,98 a 0,91, sendo que as fazendas A (0,95) e B (0,98)
apresentaram as maiores medidas de disponibilidade de água nas amostras e foram diferentes
estatisticamente das demais fazendas (P<0,001). As contagens de UFC.g-1 de leveduras nas
propriedades A e B foram de 1,91x107 e 1,59x109, respectivamente. As contagens de fungos
filamentosos nessas propriedades foram de 3,65x106 e 2,71x106, respectivamente. Os menores
valores de atividade de água (0,91) foram observados nas amostras das fazendas H e I. Nessas
propriedades as contagens de UFC.g-1 de leveduras foram de 1,23x108 e 6,15x107,
respectivamente. As contagens de fungos filamentosos foram de 3,90x105 e 6,96x107,
respectivamente.
As contagens obtidas no presente trabalho estão bem acima das contagens recomendadas
pela International Commission on Microbiological Specifications for Foods (1980), que
estabelece limites entre 102 a 104 como tolerados para unidades formadoras de colônias por
grama de alimentos. A fazenda F foi a única que apresentou contagens de UFC.g-1 dentro desse
limite, as demais apresentaram contagens de UFC.g-1 acima de 105. Segundo Amaral (2011)
contagens de leveduras acima de 105 em silagens indicam processos de deterioração instalados no
sistema.
Vittori (2009) avaliando amostras de silagem de cana de açúcar após 0, 21, 49, 77 e 105
dias de utilização dos silos, retiradas do centro e superfície do painel, constatou maior população
de micro-organismos na camada superficial, além de maiores valores de pH e nitrogênio
amoniacal. As silagens apresentaram os fungos filamentosos Aspergillus, Penicillium,
Trichoderma, Rhizopus e Neurospora após abertura, verificando-se redução na frequência dos
37
mesmos ao longo do período até 105 dias de avaliação. Segundo o autor as leveduras foram as
maiores responsáveis pela deterioração.
Tabela 6 - Atividade de água e unidades formadoras de colônias de fungos filamentosos e leveduras isoladas das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011. Fazenda Atividade de água UFC.g-1 leveduras UFC.g-1 fungos filamentosos A 0,95 1,91 x 107 3,65 x106
B 0,98 1,59 x 109 2,71 x106
C 0,93 1,47 x 109 1,57 x107
D 0,93 2,13 x 1010 5,40 x108 E 0,92 7,78 x 106 2,30 x105
F 0,92 1,65 x 103 9,37 x100 G 0,92 2,26 x 108 3,15 x105 H 0,91 1,23 x 108 3,90 x105 I 0,91 6,15 x 107 6,96 x107
UFC.g-1 - Unidade Formadora de Colônia por grama de dieta Teste de Kruskall-Wallis (P<0,001) Houve diferença significante entre as fazendas A e C, D, E, F, G, H, I para atividade de água. Teste de Kruskall-Wallis (P<0,001) Houve diferença significante entre as fazendas B e C, D, E, F, G, H, I para atividade de água.
Os valores de atividade de água observados no nosso trabalho (0,91-0,98) permitiram a
germinação e o crescimento dos fungos nas dietas. A maioria dos fungos que colonizam grãos e
Figura 2-Atividade de água, UFC.g-1 de leveduras e fungos filamentosos isolados das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.
38
as plantas antes da colheita necessita de um mínimo de atividade de água (Aa) para germinação
de 0,85, esporulação 0,90 e crescem em temperaturas de -5°C até 30 a 34 °C. Espécies de
fungos comuns no armazenamento germinam com atividade de água de 0,72 a 0,80 e crescem
dentro de limites mais amplos de temperatura de -4 a +15 °C a 30-55 °C. (LACEY et al., 1991).
As maiores frequências de isolamentos de fungos do gênero Aspergillus spp ocorreram nas
fazendas A (5,48%), D (4,57%), G (4,57%) e H (2,28%) em dietas que apresentaram medidas de
atividade de água de 0,96; 0,93; 0,92 e 0, 91, respectivamente. Nas fazendas D (9,59%) e E
(3,65%) ocorreram as maiores frequências de isolamentos de fungos do gênero Fusarium spp
com as dietas apresentando medidas de atividade de água de 0,93. Nota-se pelos dados da
frequência de isolamentos dos fungos que a atividade de água na dieta parece não ter sido fator
determinante no isolamento de um gênero fúngico em detrimento do outro, outros fatores como
tipo de volumoso (fresco ou conservado), contaminação inicial do substrato, tempo de aeração,
competição entre micro-organismos podem ter contribuído para esses resultados. Segundo Lacey
et al (1991) a atividade de água e temperatura afetam o crescimento do fungo e sua habilidade de
competir com outro fungo pelo substrato.
Na tabela 7 estão expostos os dados climáticos das regiões onde estavam localizadas as
fazendas avaliadas. O período de retirada das amostras das dietas nas propriedades A, B e C
coincidiu com período das águas, entre os meses de outubro a março, quando se observaram as
mais altas precipitações totais no período para as regiões das fazendas A (165,0 mm), B (438,7
mm) e C. (546,7 mm) quando comparadas às precipitações ocorridas nas regiões das fazendas F
(137, mm), G (13,4 mm), H (0,6 mm), I (0,2 mm), onde as amostras foram colhidas no período
seco do ano. A maior umidade no período das águas pode ter contribuído com as maiores
medidas de atividade de água observadas nas amostras das dietas colhidas nas fazendas A, B, C
de 0, 98, 0,96 e 0, 93, respectivamente.
39
Tabela 7 – Dados meteorológicos no período de 45 dias nas regiões das fazendas avaliadas, 2010-2011. FAZENDA PPD
Mm PPT mm
T °C
UR %
A 2,6±5,6 165,0 27,3±3,6 69,5±24,7 B 8,0±11,0 438,7 28,3±3,0 75,0±18,9 C 9,8±17,4 546,7 29,2±2,8 76,6±21,5 D ... ... ... ... E ... ... ... ... F 2,2±7,1 137,2 24,3±2,9 74,1±21,9 G 0,2±0,9 13,4 24,2±3,3 69,9±25,7 H 0,6±3,0 31,6 22,3±3,6 67,1±23,5 I 0,2±0,6 9,1 21,5±4,2 72,4±21,6 PPD = Precipitação pluvial diária média UR= Umidade relativa PPT = Precipitação Pluvial Total T=Temperatura média ... = não avaliado
Na tabela 8 e figuras 3 e 4 estão expostos os dados de UFC.g-1 e frequência relativa de
isolamentos dos fungos dos gêneros Aspergillus spp e Fusarium spp. Dentre o gênero
Aspergillus foram isoladas as espécies: A. flavus, A. parasiticus, A. fumigatus, A. alutaceus e A.
nidulans. O fungo A. flavus foi isolado nas amostras das dietas em todas as fazendas avaliadas
com contagens de UFC.g-1 de 3,0x102 a 1,6x109. Nas fazendas B, C, e F foi a única espécie
isolada (100%) dentre os isolamentos do gênero Aspergillus. A espécie A. parasiticus foi a
segunda em prevalência sendo isolada nas fazendas A, D, G, H e I, com contagens de UFC.g-1 de
1,0x103 a 1,5x109. A análise estatística realizada revelou que não houve diferença (P>0,05) entre
as fazendas quanto a UFC.g-1 de Aspergillus. Apesar de não ser encontradas diferenças entre as
fazendas, os resultados obtidos em nosso trabalho estão de acordo com vários trabalhos que
indicam Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus como as espécies mais isoladas e
importantes em países de clima tropical e subtropical por contaminarem diversos tipos de
alimentos (CAST, 2003). Vários estudos realizados com amostras de grãos de milho e sorgo
recém colhido e armazenado no Brasil identificam a espécie A. flavus como a mais isolada.
(POZZI et al., 1995; ALMEIDA et al., 2000; ROCHA et al., 2009; REIS et al., 2010). Em
ingredientes de ração destinados a bovinos leiteiros a espécie A. flavus foi identificada como a
espécie predominante em 58% (n=90) das amostras analisadas, cepas do fungo (20%) foram
capazes de produzir Aflatoxina B1 in vitro (CORREA, 1997).
40
0
20
40
60
80
100
120
A B C D E F G H I
log UFC/g %
Figura 3- UFC.g-1 e Frequência relativa de Aspergillus flavus nas amostras das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.
0
20
40
60
80
100
A B C D E F G H I
log UFC/g %
Figura 4- UFC.g-1 e Frequência relativa de Fusarium verticillioides nas amostras das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.
41
Tabela 08 - Atividade de água (Aa), Unidades Formadoras de Colônias (UFC.g-1) e frequência relativa (%) de fungos dos gêneros Aspergillus spp e Fusarium spp
isolados das amostras das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011.
A B C D E F G H I Fungos Filamentos
UFC/g % UFC/g % UFC/g % UFC/g % UFC/g % UFC/g % UFC/g % UFC/g % UFC/g %
Aspergillus spp 3,78x107 100 2,04x107 100 1,09x106 100 3,2x109 100 2,0x103 100 3,0x102 100 2,8x104 100 2,21x105 100 1,1x104 100
A. flavus 3,78x107 99,3 2,04x107 100 1,09x106 100 1,6x109 50,9 1,0x103 50 3,0x102 100 1,9x104 67,9 1,1x105 49,8 1,0x104 90
A. parasiticus 2,66x105 0,69 - - - - 1,5x109 49,0 - - - - 8,0x103 28,6 5,0x103 2,3 1,0x103 10
A. fumigatus 3,75x102 0,001 - - - - 0,3x109 0,1 - - - - - - - - - -
A. alutaceus - - - - - - - - 1,0x103 50 - - - - - - - -
A. terreus - - - - - - - - - - - - - - 6,0x103 5,5 - -
A. nidulans - - - - - - - - - - - - 1,0x103 3,6 1,0x103 0,5 - -
Fusarium spp - - - - - - 1,37x106 100 1,37x106 100 - - - - - - 1,4x105 100
F. verticillioides - - - - - - 1,37x106 100 3,51x105 99,7 - - - - - - 1,4x105 100
F. oxysporum - - - - - - - - 1,3x103 0,3 - - - - - - - -
Aa 0,96 0,98 0,93 0,93 0,93 0,90 0,92 0,91 0,91
Teste de Kruskall-Wallis – (P>0,05)
42
4.2 Análises Cromatográficas
Para a curva de calibração construída foi obtida uma equação da reta correlacionando-se os
valores da área obtida com as massas de AFB1 injetadas das respectivas soluções de padrão
utilizado. A linearidade da curva foi verificada através do coeficiente de determinação obtido
(R2) de 0,9999031.
O limite de detecção teórico calculado como três vezes o ruído, foi de 0,08ηg.mL-1. O
limite de quantificação teórico foi de 0, 125ηg.mL-1 a menor concentração da toxina possível de
ser confirmada. Os valores médios dos testes de recuperação das amostras fortificadas nas
concentrações de 0,2 ηg.g-1, 0,4ηg.g-1 e 1,25ηg.g-1 foram 60,23%, 73,22% e 84,60%,
respectivamente e estão de acordo com a metodologia descrita (AOAC, 2000).
4.3 Aflatoxina B1 (AFB1) nas amostras das dietas
A unidade adotada para a apresentação dos resultados encontrados de AFB1 nas dietas foi
de ηg.g-1, que caracteriza a relação de partes por bilhão (ppb).
Na tabela 09 e figura 5 verificamos as frequências de contaminação e médias das
concentrações de Aflatoxina B1 (AFB1) das dietas de bovinos leiteiros nas fazendas estudadas. No
total foram analisadas 299 amostras de alimento. As fazendas E, A, B, F e C com 80%, 40%,
37,50%, 37,14% e 34,38% de amostras contaminadas, respectivamente, obtiveram os maiores
percentuais de amostras positivas para AFB1, sendo encontrada a média de 15,69 ŋg.g-1 (15,69
ppb) por amostra, variação de 1,68 a 194,51 ŋg.g-1 e contaminação de 31,44% no geral. A
fazenda E apresentou a maior média de AFB1 por amostra (33,47 ŋg.g-1) e maior variação de
concentração com valores entre 2,15 a 194,51 ŋg.g-1. Os níveis de contaminação encontrados nas
dietas foram semelhantes aos encontrados por Almeida et al. (2009) que, analisando amostras de
milho utilizado na formulação de ração animal, encontraram 10% das amostras contaminadas
com teores entre 1 a 5µg.kg-1. Na Argentina, González Pereyra et al. (2007) detectaram AFB1 em
17% das amostras de silagem de milho analisadas com variação de 1,43 a 155,78 µg.kg-1. El-
Shanawany et al. (2005) encontraram aflatoxina, esterigmatocistina e toxina T2 em 35% das
43
amostras e aflatoxinas em 22,5% das amostras de silagem analisadas em províncias do Egito,
contudo os autores não mencionam os níveis de quantificação. Pereira et al. (2005) não
encontraram AFB1 em amostras de alimentos destinados a alimentação de bovinos leiteiros, na
cidade de Lavras, Minas Gerais.
Tabela 9 - Frequência absoluta e relativa (%) de contaminação por aflatoxina B1(AFB1) nas amostras de dietas de bovinos leiteiros nas fazendas, 2010-2011. Fazendas FA FR Média
ηg.g-1 Variação ηg.g-1
Amostras >50ηg.g-1
A 16 40,00 12,47 1,93-43,78 -
B 12 37,50 6,56 2,12-29,26 -
C 11 34,80 5,62 1,82-21,30 -
D 04 12,50 3,25 2,07-6,38 -
E 28 80,00 33,47 2,15-194,51 6 (21,42%)
F 13 37,14 8,02 1,72-74,98 1(7,69%)
G 05 14,29 2,86 1,68-3,85 -
H ND ND ND ND -
I 05 14,29 13,26 2,50-37,26 -
Total 94 31,44 15,69 1,68-194,51 7(7,44%)
FA=Frequência absoluta FR=Frequência relativa (%)
Em nosso trabalho a fazenda H foi a única que apresentou amostras com níveis não
detectáveis para AFB1. Considerando que as amostras analisadas neste trabalho eram
provenientes de dieta completa, ou seja, volumoso e concentrado, o fato dos nossos resultados
apresentarem um maior número de amostras contaminadas é justificável, pois todas as fazendas
utilizaram ingredientes altamente suscetíveis de contaminação por micotoxinas, como o milho e
caroço de algodão. É provável que a contaminação do volumoso (silagem) e ingredientes de
rações para contaminação da dieta completa fornecida aos animais tenha variado entre as
fazendas, levando em conta as condições de armazenamento do concentrado de algumas
propriedades e também da utilização e manejo dos silos em outras.
44
Diversos autores encontraram níveis de aflatoxinas B1 em ração e milho destinado a
alimentação animal que variaram de 1,131 a 1.393,0 µg.Kg-1, com frequências de contaminação
que foram de 2 a 50% (SABINO, 1980; PURCHIO et al., 1988; SANTURIO et al., 1996;
ROCHA et al. 2009). Rocha et al. (2009) encontraram 76,2% das amostras de ração
contaminadas com teores de aflatoxina B1 acima do permitido pela legislação do Brasil (20
µg/Kg) Trabalhos realizados com farelo de algodão verificaram níveis de contaminação por
aflatoxinas de 10 a 76,4 ppb e frequências de contaminação de 2.5 a 67.45%. (GONÇALVES;
FONSECA, 1991; GONÇALEZ et al., 2004; POZZI et al., 2005).
Mesmo tendo encontrado frequências elevadas de amostras contaminadas na maioria das
fazendas, apenas 02 das 09 propriedades apresentaram amostras com níveis médios acima de
50,00 ppb de AFB1, que é o limite máximo de aflatoxinas permitido pela legislação (MAPA,
1988). Nesse aspecto, encontramos irregularidade na fazenda E, com 06 amostras (21,42%) e
fazenda F, com 01 amostra (7,69%). Em relação ao total de amostras positivas a irregularidade é
verificada em 7,44% (Tabela 09).
Os níveis de contaminação por AFB1 nas propriedades leiteiras A, B, C, G e I estão
coerentes com a carga e variedade de fungos micotoxigênicos encontrados nas amostras de
alimentos fornecidos aos animais. Contudo os resultados das fazendas D e H nos chamam a
atenção. Na fazenda D, de acordo com a tabela 08, observamos prevalência populacional do
Figura 5- Frequência absoluta e relativa (%) de amostras contaminadas por aflatoxina B1 nas dietas
010
203040
506070
8090
A B C D E F G H I
FA
FR
45
gênero Aspergillus em relação ao Fusarium, no entanto o número de amostras contaminadas,
médias e variação de contaminação por AFB1 foram os mais baixos detectados e quantificados
neste estudo. Na fazenda E verifica-se um cenário inverso, pois o Fusarium mostra-se dominante
em relação ao Aspergillus, e apesar disso nesta fazenda se observa os mais elevados resultados de
contaminação para AFB1. A competição entre fungos do gênero Fusarium e Aspergillus pelos
nutrientes essenciais presentes no substrato, espaço e água parecem inibir a produção de algumas
micotoxinas em detrimento de outras. Alguns pesquisadores têm observado que Fusarium
verticillioides e Aspergillus flavus são fortes competidores. (LILLEHOJ et al., 1982; MARIN et
al., 1998; ZORZETE et al., 2008). Os fungos Fusarium verticillioides e Fusarium proliferatum
inoculados em cultura mista com Aspergillus flavus em grãos de milho com atividade de água
entre 0,93 a 0,98 e temperaturas de 15 e 25 °C mostraram uma complexa relação entre esses
fatores e a concentração de inoculo de cada fungo sobre a produção de fumonisinas e aflatoxinas.
Em geral, Aspergillus parasiticus reduziu a população de F. verticillioides e F. proliferatum (6 a
36%), mas não afetou a produção de fumonisinas. Ao contrário, enquanto as espécies de
Fusarium não reduziram a população de A. parasiticus, os fungos foram capazes de reduzir o
acúmulo de aflatoxinas entre 30 a 90% (MARIN et al., 2001).
Roigé et al., (2009) encontraram resultados semelhantes ao nosso em estudo realizado em
Buenos Aires, ao verificarem que nas amostras de alimento fermentado (silagem de milho e de
grãos úmidos de milho) Penicillium (74%) e Aspergillus (32%) foram mais isolados que
Fusarium (15%) e no entanto, não foram observadas amostras positivas para aflatoxinas e foi
relatada presença de micotoxinas de Fusarium em 68,4% das amostras. Os mesmos autores
também analisaram grãos de milho e trigo. No milho Penicilium (70%) e Fusarium (47%) foram
mais frequentes do que o Aspergillus (34%) e o mesmo ocorreu no trigo, Penicilium (42%),
Fusarium (27%) e Aspergillus (12%). Foi detectada presença de micotoxinas do gênero Fusarium
em 100% das amostras de milho e trigo, enquanto 4% das amostras de milho foram positivas para
aflatoxinas.
A fazenda F apresentou um dos mais baixos isolamentos de fungos Aspergillus flavus,
entretanto verificamos nesta propriedade uma amostra com concentração acima de 50,00 ηg.g-1
de aflatoxina B1. Uma possibilidade é a do desaparecimento do fungo e não da toxina, produzida
46
em momento anterior ao da amostragem (PITT; HOCKING, 1997). A fazenda H foi a única
fazenda a não apresentar níveis detectáveis de AFB1, apesar do perfil de contaminação por
Aspergillus ter sido semelhante ao das demais fazendas. Vale ressaltar que a presente pesquisa
avaliou a presença de aflatoxina B1 e que outros compostos produzidos por A. flavus (B2) e A.
parasiticus (B2, G1 e G2) podem estar presentes.
47
5. CONCLUSÕES
Os resultados encontrados atenderam os objetivos propostos e permitem concluir que:
A presença de elevada população de leveduras e fungos filamentosos indica condição
sanitária inadequada da dieta ofertada às vacas em lactação.
A maioria das fazendas apresentaram contagem média de UFC.g-1 acima de >105,
resultados que indicam falhas no manejo e utilização de volumosos e ingredientes de rações pelas
propriedades.
Aspergillus spp foram isolados das dietas em todas as fazendas indicando condições
inadequadas de armazenamento dos ingredientes de rações.
Aspergillus flavus foi a espécie mais isolada na maioria das fazendas. A presença de
Fusarium spp. foi observada em fazendas que forneciam volumoso in natura.
Algumas propriedades apresentaram níveis de contaminação por aflatoxina B1 na dieta
acima do permitido pela legislação brasileira.
48
A aflatoxina B1 ingerida pelas vacas em lactação pode acarretar sérios riscos à saúde
humana e animal.
Os resultados do nosso trabalho reforçam a necessidade de pesquisas sobre a interação
fúngica e co-ocorrência de micotoxinas nas dietas destinadas às vacas em lactação.
49
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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