Microbiologia

Técnicas de Coloração

1) Ziehl-Neelsen Cobrir a superfície da lâmina com fucsina fenicada e aquecer com lamparina ou bico de Bunsen

até a emissão de vapores (5 minutos) Lavar com água Descorar com solução álcool-ácido Lavar com água Cobrir a superfície da lâmina com azul de metileno (30 segundos) Lavar com água Deixar secar Observar ao microscópio com objetiva de 100X utilizando óleo de imerssão

Reagentes:

a) Fucsina Fenicada- Fucsina Básica – 15g- Fenol – 86mL (Dissolvido em banho-maria)- Álcool Absoluto – 150mL- Água Reagente – 1.500mLOBS: Dissolver a fucsina c/ fenol em um gral, acrescentando o álcool e por fim a água. Deixar em repouso por 24 horas e filtrar com papel de filtro. Estocar em frasco escuro.

b) Solução de Álcool-Ácido- HCl P.A. – 30mL- Álcool 95º GL – 970mLOBS: Acrescentar o HCl sobre o álcool pelas paredes do frasco. Armazenar em frasco escuro.

c) Solução de Azul de Metileno- Azul de Metileno – 15g- Fenol Liquido – 57mL (Dissolvido em banho-maria)- Álcool Absoluto – 100mL- Água Reagente – 1.000mLOBS: Dissolver o azul de metileno com fenol. Acrescentar o álcool e por fim a água. Deixar em repouso por 24 horas. Filtrar com papel de filtro. Guardar em frasco escuro.

2) Gram Cobrir a lâmina com cristal violeta (1 minuto) Lavar com água Cobrir a lâmina com lugol (1 minuto) Lavar com água Descorar com solução de álcool-acetona Lavar com água Cobrir a lâmina com fucsina (30 segundos) Lavar com água Deixar secar e observar ao microscópio com objetiva de 100X utilizando óleo de imerssão.

Reagentes:

a) Cristal Violeta- Cristal Violeta – 4g- Álcool Absoluto – 100mL- Fenol Fundido – 10mL- Água Reagente – 890mLOBS: Colocar o cristal violeta em um gral, misturar o álcool absoluto e em seguida o fenol. Por fim acrescentar a água. Deixar em repouso por 24 horas e filtrar com papel de filtro. Armazenar em frasco escuro.

b) Lugol- Iodo – 4g- Iodeto de Potássio – 6g- Água Reagente – 900mLOBS: Colocar o Iodo e o Iodeto de Potássio em gral, macerar e adicionar água.

c) Fucsina- Idem Fucsina de Ziehl diluída 10X em água reagente

d) Solução de Álcool-Acetona- Acetona – 250mL- Álcool Absoluto – 750mL

Provas Bioquímicas para Gram Negativos

1) EPM Fermentação da Glicose, Uréase, Tryptofano, Produção de Gás e H2S

Teste Positivo Negativo

Glicose Base Amarela Sem Alteração (Verde)Uréase Base Azul Sem Alteração (Verde)Tryptofano Superfície Verde Escura Sem Alteração (Verde) ou AzulGás Presença de Bolhas Ausência de BolhasH2S Meio Escurecido (Preto) Sem Alteração

2) MILI Motilidade, Indol e Lisina

Teste Positivo Negativo

Motilidade Crescimento em todo o meio (Turvo) Crescimento no local de inoculação

Indol Reagente de Kovaks (Alo Vermelho) Alo AmareloLisina Meio Lilás ou Sempre que o meio não estiver

amareloMeio Amarelo

3) Ágar Citrato de Simmons Fonte de Carbono

Quando o teste é positivo o meio muda a cor de verde para azul com crescimento na superfície do meio.

Algoritmo de Identificação de Bactérias:

Meio Crescimento Tipo de Identificação Testes

Agar Sangue

Gram Positivos

StaphylococusTSA

Staphy Teste (S. aureus)Novobiocina (S. saprophyticus)

Streptococcus

Bile Esculina (Enterococcus)Caldo NaCl (Enterococcus)

CAMP (S. agalactiae)Bacitracina (S. pyogenes)

Optoquina (S. pneumoniae)Soro Tipagem p/ Strepto

Gram Negativos EnterobactériasPainel (Automatizado)

Provas Bioquímicas

Mac Conkey Gram Negativos

Não Fermentadores Painel (Automatizado)

EnterobactériasPainel (Automatizado)

Provas Bioquímicas

TSB Gram Positivos Colônias com -Hemólise Meio para Crescimento ST

Muller-Hinton Gram + e - Kirby - Bauer Antibiograma

EnteroKit B (Probac) EPM / MILI / Citrato

Primeiro Algarismo Segundo Algarismo Terceiro Algarismo

Lactose (MC) = 4 URE (EMP) = 4 Indol (MILI) = 4Gás (EPM) = 2 LTD (EMP) = 2 LIS (MILI) = 2H2S (EMP) = 1 MOT (MILI) = 1 CIT (Citrato) = 1Total Total Total

OBS: Os valores representados correspondem ao resultado positivo dos testes. Para resultados negativos considerar o valor “0” (zero). Procurar o resultado na tabela.

Rotinas de Laboratoriais:

1. Avaliar o crescimento bacteriano nos meios de cultura (AS, MC, ACH) em 24 horas, e caso negativo, re-incubar por mais 24 horas. Relatar na folha de trabalho (Neg 24) em caso de urocultura.

2. Crescimento em AS / ACH para Gonococo (Orofaringe)

3. Gram (+) ST ou STA + ou - / Catalase (+) STA / (-) ST

o STA Staphy Testeo ST BE , CHC, CAMP (SV / SP)

(-) Oxidase (+) Não Fermentador Painel / (-) Enterobactérias PB ou Painel

4. Gardnerella 48h

5. Gonococo Incubar em Jarra CO2

6. Crescimento em MC / SS (Coprocultura) PB ou Painel

7. Painel G+ Se cultura automatizada com antibiograma

8. Antibiograma Manual Preparação do Inoculo em BHI, TSB ou Salina (Incubar em estufa) Semear com Swab a suspensão preparada Aplicar os discos de antibióticos Incubar o Meio (MH). p/ S. pneumoniae, Haemophilus ou N. gonorrhoeae (Jarra CO2) Sensível Alo de inibição grande / Resistente Crescimento

MicroScan / AutoScan (Dade Behringer)

Painel Gram Positivo1. Observar Crescimento no poço “G”2. Observar Reação Positiva para:

PGT Amarelo (+) / Transparente (-) Pelo menos 3 Carbonos Amarelo ou Laranja (+) / Vermelho (-)

3. Colocar os Reagentes VP 1 gota VP1 (KOH 40%) e 1 gota VP2 (Alfa Naftol 5%) NIT 1 gota NIT1 (Ac. Sulfanílico 0,8%) e 1 gota NIT 2 Dimetil-Alfa-Naftilamina) PYR 2 gotas do Reagente Peptidase (À Temperatura ambiente. Retirar da geladeira 30

minutos antes ser usado). 4. Esperar 20 minutos e Ler o painel

Painel Gram Negativo1. Observar Crescimento no Poço “G”2. Observar o poço “GLU” (Glicose) (+) Amarelo / Fermentador ; (-) Laranja / Não Fermentador3. Somente para Não Fermentadores (Observar)

ARG + (Púrpura) e OF/G + (Amarelo) ou ARG + (Púrpura) e CET + (Crescimento) ou LYS + (Púrpura) ou ORN + (Púrpura)

4. Colocar os Reagentes VP 1 gota VP1 e 1 gota VP2 TDA 1 gota de FeCl3 (Ccloreto Férrico 10%) IND 3 gotas de Reativo de Kovaks NIT (Somente para Não Fermentadores) 1 gota NIT 1 e 1 gota NIT 2

5. Esperar 20 minutos e Ler o Painel

OBS: Os painéis só devem ser lidos se houver crescimento no poço “G” e reações descritas pelo menos uma possibilidade positiva. Caso contrário re-incubar por mais 24 horas.

Pesquisa para H. pylori Uréase

Inocular a amostra (biópsia) em caldo contendo uréase (Probac) com alça de platina Incubar a 35º C Observar mudança da cor do meio de Laranja para Rosa após 4 horas Fazer um esfregaço do caldo, corar pelo Gram e observar bacilos Gram Negativos Curvos

OBS: A uréase produzida pelo H. pylori alcaliniza o estômago

Micoplasma e Ureaplasma

U. urealyticum Metaboliza UréiaM. hominis Metaboliza Arginina

Observar mudança de coloração do meio de amarelo-laranja para rosa, devido a produção de amônia que deixa o pH alcalino. Incucar a 37ºC por 24 horas.

1ª Etapa: Triagem Inoculação da amostra em uma tira com 10 poços (4 seções) Mycofast®Poços 1 a 3: Titulação de U.u. entre 103 e ≥ 105 ccu/mLPoços 4 a 6: Resistência a Antibióticos (U.u e M.h) contra:

o Doxiciclina (D) 8 g/mLo Roxitromicina (ROX) 4 g/mLo Ofloxacino (OFX) 4 g/mL

Poços 7 a 9: Identibiótico: Resistência contra:o Lincomicina (L)o Sulfametox. + Trimetroprim (SXT)o Eritromicina (E)

Poço 10: Titulação M.h. ≥ 104 ccu/mL

2ª Etapa: Titulação:U.u Lincomicina (3 primeiros poços) Inibição do crescimento de M.h.M.h. no poço 100, a Eritromicina inibe o crescimento do U.u.

BK (Micobacterium tuberculosis)

Coloração pela técnica de Z.N.

Micobactérias Bastonetes delgados, ligeiramente curvos, isolados, aos pares ou em grupos, corados de vermelho (BAAR) e outras bactérias coradas de azul.

Observar 100 campos com objetiva de 100X com óleo de imerssão

Como relatar o resultado:(-) Não Foram encontrados BAAR em 100 campos de 100X(+) Menos de 1 BAAR por campo em 100 campos de 100X(++) 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos de 100X(+++) Mais de 10 por campo em 20 campos de 100X

OBS-1:1 a 4 BAAR em 100 campos. Contar mais 100 campos. Se permanecer o valor, liberar o resultado como negativo e solicitar nova amostra. Se persistir, realizar a cultura em Meio LJ (Lowenstein Jensen).

OBS-2:Para espécimes clínicos provenientes de cavidades fechadas como líquidos orgânicos (Líquor, Sangue, Liquido Pleural, Medula Óssea) não é necessário a utilização do método de descontaminação (coleta asséptica e coletor estéril).

Realizar a concentração por centrifugação

Descontaminação com Fosfato Tribásico:Em tubo 15 x 100 mm estéril com tampa, adicionar 2mL do material (Parte purulenta do escarro) e juntar 7mL da mistura das soluções purificadora e precipitante na proporção 1 parte (Precipitante) + 5 partes (purificadora). Vedar o tubo e agitar por 2 minutos. Centrifugar a 3.000 RPM por 10 minutos (equilibrar os tubos na centrífuga). Incubar em estufa bacteriológica por 8 horas a 37ºC. Desprezar o sobrenadante em um béker com hipoclorito 1%. Adicionar 0,2mL (200L) de solução solvente e Homogeinizar.

Solução Precipitante- Cloreto de Cálcio P.A. (CaCl2) – 7,5g- Água Reagente – 1.500mLPesar 7,5g de CaCl2 e dissolver em 500mL de água reagente em um cálice graduado. Transferir o conteúdo do cálice para um erlemeyer de 3.000mL e completar o volume até 1.500mL. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Estocar em geladeira.

Solução Purificadora- Hidróxido de Sódio (NaOH) – 30g- Fosfato de Sódio Tribásico (Na3PO4 12H2O) – 30g- Água Reagente – 3.000mLDissolver aos poucos e transferir para um erlemeyer de 3.000mL e completar o volume. Não Autoclavar. Estocar à temperatura ambiente.

Solução Solvente- Ácido Cítrico (C6H8O7 H2O) – 15g- Citrato de Amônio Dibásico ((NH4)2C6H6O7)N- 12,5g- Água reagente – 500mLDissolver aos poucos e completar o volume para 500mL em cálice graduado. Distribuir 4mL em tubo 16 x 150 mm. Autoclavar a 121ºC por 35 minutos. Estocar em geladeira.

CulturaColocar 100L do espécime tratado ou não, com pipeta em tubos contendo o Meio LJ (Semear 2 tubos para cada paciente). Inclinar os tubos de modo que o inóculo cubra toda a superfície do meio. Coloca-los em caixas e incubar a 37ºC em estufa bacteriológica.

1ª Verificação após 48 horas: secagem do inoculo e presença de contaminação:Após esta etapa, fechar os tubos queimando a parte externa do capuchão e vedar com rolhas de cortiça. Incubar a 37ºC por 45 dias fazendo leituras semanais para observar crescimento.

Identificação:1. Tempo de crescimento (Primeiras colônias aparecem com 15 dias)2. Características da Colônia3. Produção de Pigmento4. Teste da Niacina (Fita)5. Teste do Nitrato (Fita)

Teste da Niacinao Adicionar 1 mL de água reagente no tubo LJ com 4 semanas de crescimento, fazendo alguns

cortes no meio com auxílio da alça a fim de liberar a niacinao Deixar o tubo na horizontal por 10 minutos e transferir 0,6mL (600L) desta solução para um

tubo com tampa de rosca de 90 x 120 mm. Colocar a fita da niacina na suspensão com a parte plástica para cima. Agitar suvemente o tubo na vertical por 20 minutos. O aparecimento de coloração amarela na suspensão indica teste positivo

Teste no Nitrato o Preparar uma suspensão com 2 colônias em 0,8mL (800L) de água reagente. Usar tubos com

tampa de rosca 90 x 120 mm.o Introduzir na suspensão a fita de nitrato mantendo a parte plástica para cima.o Tampar e incubar 37ºC / 2 horas na verticalo Retirar da estufa e agitar suavemente 6 vezes permitindo que a solução cubra toda a superfície

da fita. Uma coloração azul na extremidade da fita indicará resultado positivo.

Antibiograma para BK

Meio LJ + DrogasIsoniazida (INH) 0,2g/mL – 1%Rifampicina (RNP) 40g/mL – 1%Pirazinamida (PZA) 100g/mL – 10%Estreptomicina (SM) 4g/mL – 10%Etambutol (EMB) 2g/mL – 1%Etinamida( ETH) 20g/mL – 10%