Métodos laboratoriais para pesquisa e

identificação de Legionella species em

amostras ambientais

05 de abril de 2018

Raquel Esaguy Rodriguesraquel.rodrigues@insa.min-saude.pt

Enquadramento Geral

• > 61 espécies e 70 serogrupos distintos;

• Pelo menos 26 espécies de Legionella estão associadas a doençasno ser humano, como por exemplo, Legionella micdadei, L.bozemanii, L. dumoffii, e L. longbeachae;

Fonte: Norma ISO 11731:2017

• Legionella pneumophila (16 serogrupos) é responsável por 70 a 90%

das infeções no Homem. 2

Características Gerais:• Bacilos gram-negativos;

• 0,3 a 0,9 m de largura;

• 2 a 20 m de comprimento;

• Móveis, exceto Legionella oakridgensis;

• Algumas espécies exibem fluorescência quando observadas sobre

luz U.V;

• L-cisteína e sais de ferro;

• Crescem em BCYE e GVPC.

• Aspeto “vidro-martelado”

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Habitat • Ambiente: rios, lagos, ribeiros, nascentes, solos húmidos e águas

subterrâneas

• Reservatórios artificiais: torres de arrefecimento de arcondicionado, sistemas de distribuição de água, condensadores,entre outros;

• Capazes de se multiplicarem em 14 espécies de amibas e em 2espécies de protozoários ciliados;

• Bactérias do género Legionella, tornam-se mais resistentes acondições adversas quando associadas a biofilmes. 4

Condições favoráveis ao

desenvolvimento da Legionella

• Temperatura da água entre 20ºC e 45ºC;

• Redução dos níveis de cloro;

• Estagnação da água, pontos “mortos” na rede de abastecimento;

• Matéria orgânica, sedimentos, biofilmes;

• Presença de algas, fungos, protozoários e outras bactérias;

• Reservatórios de água artificiais: corrosão, incrustações.

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Infeções e sintomas provocados nos

seres humanos

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LEGIONELOSE

Doença dos Legionários

(pneumonia)

Febre de Pontiac

(síndrome gripal)

• Sintomas idênticos a

uma constipação

Período de incubação

2 a 10 dias

Período de incubação

24 a 48 horas

• Má disposição

(dores de cabeça e tosse)

• Febres muito altas,

arrepios

• Diarreia e vómitos

Risco de infeção depende de fatores

como:

• Concentração de Legionella na água;

• Condições para a sua multiplicação;

• Patogenicidade da bactéria;

• Formação de aerossóis;

• Tempo de exposição;

• Suscetibilidade do indivíduo exposto.

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Caracterização da Doença dos

Legionários em Portugal• Alguns exemplos publicados de surtos epidémicos da Doença dos

Legionários em território nacional:

– 1994 – Hospital de Santa Cruz em Lisboa;

– 1997 – Unidade hoteleira no Algarve;

– 2000 – Concerto de Rock, Município de Vizela;

– 2006 – Hospital de Coimbra.

– 2011 – Hospital de Bragança.

– 2014 - Vila Franca de Xira (375 casos de doença e 12 óbitos).

– 2017 – Hospital São Francisco Xavier

– 2018 – Hospital CUF Descobertas8

Caracterização da Doença dos

Legionários em Portugal

• 2004 – 35 casos;

• 2005 – 39 casos; 2010 –125 casos;

• 2006 – 90 casos; 2011 – 88 casos;

• 2007 – 78 casos; 2012 – 132 casos;

• 2008 – 91 casos; 2013 – 91 casos;

• 2009– 93 casos; 2014 –588 casos;

2015 –145 casos;

Casos confirmados apenas

Fonte: Vigilância em saúde Pública:

Doença dos Legionários em Portugal 2004_2013 _DGS (2014)

SURVEILLANCE REPORT - Annual epidemiological report for 2015 _ECDC 9

Legislação Nacional

• Portaria 1220/2000, de 29 de Dezembro, aplicada apenas às

águas minerais naturais e as águas de nascente.

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Parâmetros Valores Máximos Recomendados

Por ingestão e em

contacto com as

mucosas

Por via externa

Legionella

pneumophila Não detetada/L Não detetada/L

Legionella spp. não

pneumophila Não detetada/L 100 ufc/L

Legislação Nacional (cont)

• Portaria n.º 353-A/2013, de 4 de dezembro.

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Parâmetro Condições de referência

Legionella spp

Concentração inferior a 100 ufc/L, exceto no

caso da pesquisa em tanques de torres de

arrefecimento em que deve verificar-se uma

concentração inferior a 1000 UFC/L.

Ausência de Legionella pneumophila.

Orientação Número 20/2017

12

Orientação Número 20/2017

13

“European Technical Guidelines for the

prevention, control and investigation of

infeccions caused by Legionella species

(2017)

14

O método de PCR em

Tempo real pode ser

útil na investigação de

potenciais fontes de

infeção e na

monitorização das

ações corretivas

aplicadas;

(…) Continua a não

haver consenso na

interpretação dos

resultados obtidos por

esta metodologia.

“European Technical Guidelines for the

prevention, control and investigation of

infeccions caused by Legionella species.

(2017)

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Um resultado negativo por PCR

é praticamente certo que será

igualmente um resultado

negativo pelo método cultural;

Este momento é recomendado

para uma realização de uma

análise rápida a diversos locais

de colheita associados a

casos/surtos de modo a

eliminar rapidamente os

negativos e identificar os

positivos. No entanto, os

resultados devem ser sempres

confirmados pelo método

cultural _ Gold Standard.

Norma ISO 12869: 2012

“Water quality — Detection and quantification of Legionella spp.

and/or Legionella pneumophila by concentration and genic

amplification by quantitative polymerase chain reaction (qPCR)”

Norma ISO 11731:2017

“Water Quality - Enumeration of Legionella ”

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Componente Ambiental

PCR em Tempo Real (RT-PCR)

• Técnica que possibilita a monitorização do estado de uma reaçãode PCR, através da adição de um sinal (fluorescência) emitido emcada ciclo da reação de PCR, como um indicador de amplificaçãoproduzida;

• Possibilita a medição do aparecimento dos produtos amplificados

durante o próprio processo de amplificação, para resultados

quantitativos e qualitativos:

– deteção qualitativa (resposta Sim/Não)

– quantificação absoluta (resultado: p.ex. UG/ L)

17

Protocolo de colheitas de amostras

18

• Colheita de 2 L de amostra de água.

• As amostras devem ser entregues no Laboratório o mais

rapidamente possível, de preferência no prazo de 24h e não

excedendo as 48 horas.

• Caso a amostra seja analisada no prazo de 24 horas, estas

devem ser guardadas à temperatura ambiente. Caso só sejam

processadas no prazo de 48 horas, estas devem ser armazenadas

entre 2ºC a 8ºC.

NOTA: Amostras de água que sofreram tratamento por biocida só

devem ser submetidas a este tipo de análise 48 horas após a

realização do mesmo.

• Concentração da amostra através de filtração - membranas de

policarbonato;

• Extração de DNA;

• PCR em Tempo Real Qualitativo;

• PCR em Tempo Real Quantitativo;

• Expressão de resultados.

19

Protocolo do PCR em Tempo Real

Amplificação do gene pretendido

20

Interpretação resultados

1º Análise:

Presença / Ausência Legionella spp e Legionella

pneumophila;

2ª Análise:

Quantificação de Legionella spp e Legionella

pneumophila (resultado expresso em Unidades

Genómicas (UG)).21

Apresentação Resultados

Curvas de amplificação

– amostras positivas

22

Apresentação de um caso real _

Inquérito Epidemiológico Leg. spp

23

Apresentação de um caso real _

Inquérito Epidemiológico Leg. spp

24

Apresentação de um caso real _ Inquérito

Epidemiológico Leg. pneumophila

25

Apresentação de um caso real _ Inquérito

Epidemiológico Leg. pneumophila

26

Vantagens do método de PCR em

Tempo Real

• Capacidade de resposta em poucas horas;

• Extremamente sensível;

• Necessita de quantidades de DNA muito inferiores àsnecessárias para uma reação de PCR.

27

Desvantagens PCR em tempo Real

• Elevado custo;

• Necessidade de pessoal técnico qualificado para a correta

interpretação dos resultados obtidos;

• Não existência de correlação entre UG (unidades genómicas)

e UFC (Unidades formadoras de colónias) – Grande entrave

em Termos Legislativos.

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• Sementeira direta em amostras suspeitas de elevada

contaminação por Legionella (>104 UFC/L).

•Filtração por membrana, seguida de sementeira direta em

meio de cultura.

• Filtração por membrana, seguida de um processo de eluição.

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Método Cultural

Filtração

Sementeira da amostra em BCYE e GVPC

Incubação 7 a 10 dias, a 36±2ºC

Leitura e Confirmação das colónias suspeitas;

Identificação Legionella pneumophila ou Legionella spp. não

pneumophila (Teste de aglutinação)

30

Método Cultural – Norma ISO 11731

Filtração

Sementeira da amostra

Sem tratamento Tratamento da amostra

Calor Ácido Calor +Ácido

0,1 ml GVPC; BCYE e/ ou BCYE +AB

Incubação 7 a 10 dias, a 36±2ºC

Leitura e Confirmação das colónias

suspeitas;

Identificação Legionella pneumophila ou Legionella spp. não

pneumophila (Teste de aglutinação)31

Método Cultural – ISO 11731

32

Método Cultural: ISO 11731 – Matriz de

decisão 1º passo: determinar a

origem a as características da

água;

2º passo: determinar o nível

de deteção desejado

(LD_limite de deteção);

3º passo: selecionar os

tratamentos a serem

efetuados;

4º passo: Selecionar o(s)

meio(s) de cultura a ser(em)

utilizado(s).

33

Método Cultural: ISO 11731: Matriz de

decisão

Inoculação direta : Limite de

deteção 10 000 ufc/L.

(1,0x104 ufc/L)

Filtração por membrana _

inoculação direta: filtração

de 10 ml de amostra, o limite

de deteção é de 100 ufc/L.

Filtração por membrana

seguida de eluição: filtração

de 1 Litro de amostra, o limite

de deteção é de 50 ufc/L.

Leitura das placas

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• Colónias características :

“Colónias que crescem em meio específico (GVPC), nunca

antes das 48 horas de incubação, podendo apresentar uma

coloração branca, esverdeada ou outras cores, com aspeto

vidro moído”.

Sem tratamento Calor Ácido

Leitura das placas

• Leitura das placas após incubação, com o auxilio de

uma lupa binocular com luz incidente num

ângulo de 45º;

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• Reisolamento de colónias suspeitas em BCYE e BCYE sem cisteína (ou

gelose de sangue)

• Seroaglutinação com Kit comercial: o kit utilizado no laboratório inclui

partículas azuis de látex, sensibilizadas com anticorpos que aglutinam na

presença de antigénios específicos da parede celular da Legionella,

formando agregados visíveis a olho nu;

• Permite distinguir entre: L. pneumophila (serogrupos 1, 2-14 ou 2-15) e

Legionella spp. não L. pneumophila:

Identificação das colónias suspeitas

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Placa de GVPC - concentrado sem tratamento

Placa de GVPC - concentrado com tratamento por

calor

Placa de GVPC - concentrado com tratamento por

ácido

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Amostra proveniente de uma Torre de

Refrigeração _ Caso Real

Placa de GVPC - direto sem tratamento

Placa de GVPC - direto com tratamento por calor

Placa de GVPC - direto com tratamento por ácido

38

Amostra proveniente de uma Torre de

Refrigeração _ Caso Real

Expressão dos resultados

• Não detetada (LD=50 ufc/L)

• Positiva – Nº ufc / L

(ufc – unidades formadoras de colónias)

Legionella pneumophila serogrupo 1

Legionella pneumophila serogrupo 2-14 ou 2-15

Legionella spp. não pneumophila

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• Vantagens:

• Capacidade de isolar as diferentes estirpes de

Legionella;

• Possibilidade de descobrir o agente etiológico nos IE;

• Possibilidade de comparação de estirpes clínicas com

estirpes ambientais;

• Apenas são recuperadas as bactérias viáveis.

Método complexo e exigente em tempo, meios de

cultura, reagentes e experiência técnica.

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Método Cultural

• Apesar de ainda haver alguma discussão acerca da comparação dosresultados obtidos pelos dois métodos referidos (cultural versus PCRem Tempo Real), estes podem ser usados de uma forma expedita ecomplementar na análise de amostras ambientais.

• O PCR em Tempo Real deve ser a primeira escolha sempre que senecessita de um resultado rápido. Este método é capaz de produzirresultados definitivos em menos de 12 horas, o que se traduz numamais valia em situações de risco.

• De ressalvar que as amostras positivas por PCR em Tempo Realdevem ser confirmadas pelo método cultural, o que permitirá tambémcomplementar a identificação da espécie e serogrupo da Legionellaem causa.

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Muito obrigada!

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