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Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012

Métodos Físicos de Análise - RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Prof. Dr. Leonardo Lucchetti

Mestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ

Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – FiocruzDocente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – FiocruzDocente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica – Farmanguinhos – Fiocruz

O que é e para que serve?- dá informação sobre o número de núcleos quimicamente não equivalentes (hidrogênios e carbonos, principalmente)- dá informação sobre o ambiente dos núcleos (estado de hibridização, átomos ligados etc)

Fundamentos- o sinal para a RMN de 13C é 10-4 vezes menor que o sinal para o 1H- o sinal para o núcleo de 13C apresenta apenas cerca de 1% da intensidade do sinal do núcleo de 1H devido às propriedades magnéticas e à sua abundância natural de 1,1%- sinais de 13C ocorrem em uma faixa muito maior que os de 1H, facilitando a identificação e contagem dos núcleos individuais

Métodos Físicos de Análise


Spins nucleares são orientados randomicamente na ausência (a) de um campo magnético externo; na presença de um campo externo B0, apresentam orientação específica (b)

• Alguns spins nucleares são alinhados paralelamente ao campo externo– Orientação de mais baixa energia– Maior probabilidade

• Alguns spins nucleares são alinhados de forma antiparalela ao campo externo– Orientação de energia mais alta– Menor probabilidade



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Quando os núcleos são alinhados paralelamente a um campo magnético externo são irradiados com uma determinada frequência de radiação eletromagnética, a energia é absorvida e os núcleos têm seus spins deslocados a um alinhamento antiparalelo de mais alta energia

Núcleos que são submetidos a este deslocamento em resposta à radiação aplicada são considerados como ressonantes

A frequência necessária para a ressonância depende da força do campo externo e da identidade dos núcleos. A diferença de energia ∆E entre os estados de spin nucleares depende da força do campo magnético aplicado



Muitos núcleos exibem o fenômeno da ressonância:

• Todos os núcleos com número ímpar de protons

• Todos os núcleos com número ímpar de neutrons

• Núcleos com número par de tanto protons como neutrons não apresentam ressonância





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A frequência de absorção não é a mesma para todos os núcleos de 1H e 13C– Núcleos nas moléculas são cercados por eletrons– Eletrons geram pequenos campos magnéticos locais que atuam em

oposição ao campo aplicado, blindando os núcleos do efeito do campo externo

– O campo efetivo realmente sentido pelo núcleo é o campo aplicado reduzido pelos efeitos de blindagem locais

– Cada núcleo quimicamente distinto em uma molécula está em um ambiente eletrônico diferente e, consequentemente, em um campo efetivo diferente

– Cada núcleo quimicamente distinto de 13C ou 1H em uma molécula experimente diferentes campos efetivos e exibirão sinais diferentes para a RMN de 13C ou 1H

ΒΒΒΒefetivo = ΒΒΒΒaplicado – ΒΒΒΒlocal



1H, 25oC, 60MHz...

1.000.009 no estado mais baixo

1.000.000 no estado mais alto

9 núcleos = população em excesso

→ RMN!

200MHz = 32

300MHz = 48

600MHz = 96



Preocupação com a água!• Concentração da água em solução aquosa: ~100 M

• Concentração de amostra: tipicamente 1 mM!

• Vários problemas de faixa dinâmica (fator de 100.000)!!!• Originalmente achava-se que a RMN de biomoléculas em solução

aquosa não era possível…

Não é possível exibir esta imagem no momento.



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• Amostra: mg, nm, fg; sólida ou líquida• Solventes deuterados:

• D2O• Py-d6

• DMSO-d6

• CD3OD• MeCO-d6

• CDCl3• Uso de referência: TMS

Adquirindo o espectro...



Operação esquemática de um espectrômetro de RMN



300 MHz NMR 900 MHz NMR



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Informações do espectro de RMN 1H:

1. Número de sinais: quantos tipos diferentes de hidrogênios há na molécula.

2. Posição dos sinais (deslocamento químico): que tipos de hidrogênios há na molécula.

3. Áreas relativas sob os sinais (integração): quantos hidrogênios de cada tipo há na molécula.

4. Padrão de desdobramento de sinais: quantos hidrogênios vizinhos há na molécula.



O gráfico de RMN 1H

O campo baixo, desblindado, fica à esquerda e precisa de uma força de campo menor para a ressonânciaO campo alto, blindado, fica à direita e requer campo com mais força para a ressonância A absorção do tetrametilsilano (TMS) é usada como referência



Deslocamentos Químicos

Fatores que afetam o deslocamento químico (13C):1. Deslocamento afetado por átomos eletronegativos vizinhos

• Carbonos ligados a átomos eletronegativos absorvem em campo baixo (comparando aos respectivos alcanos)

2. Hibridização do carbono• carbonos sp3 geralmente absorvem de 0 a 90 δ• carbonos sp2 geralmente absorvem de 110 a 220 δ• C=O absorvem de 160 a 220 δ



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A maioria dos deslocamentos químicos em RMN 1H ocorrem dentro da faixa de 0 a 10 δ, exceto para hidroxilas de ácidos carboxílicos (geralmente ocorrem entre 11-12 δ)



Deslocamento químico


aumento do campo magnético em frequência fixa

aumento da frequência em campo magnético fixo




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Ambiente Químico e Deslocamento Químico



Alguns fatores que afetam o deslocamento químico

Efeitos estereoeletrônicos

1. Indutivos2. Hibridação3. Anisotropia magnética (mudança de propriedade física em função da direção)4. Ressonância5. Repulsão eletrônica6. Densidade eletrônica7. Efeito isotópico8. Efeito do solvente



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Efeito indutivo

Diferença de eletronegatividade

X

F OMe Cl N Br I C H

δ 1H 4,3 3,24 3,0 2,3 2,7 2,2 0,9 0,2

δ 13C 75,4 49,3 25,1 28,3 10,0 -20,7 5,7 -2,3

H3C-X



Quanto mais substituído, maior o efeito indutivo

Composto CHCl3 CH2Cl2 CH3Cl

δ 7.27 5.30 3.05


Efeito indutivo



Composto -CH2Br -CH2CH2Br -CH2CH2CH2Br

δ 3.30 1.69 1.25


Efeito indutivo


A influência do substituinte diminui com a distância


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sp3 sp2 sp

δ 1H 0,7 – 3,5 5 – 7 1,5 – 3

δ 13C 0 – 50 100 – 200 50 – 80


Tipo de hibridação

Diferença de eletronegatividade e anisotropia


a

b

c

d

δ Ha > δ Hc

δ 13Cb < δ 13Cd


Repulsão eletrônica (WW)

Compressão estérica e distorção de nuvens eletrônicas


δ H = - 1,40δ H = 0,92


Repulsão eletrônica (WW)

Compressão estérica e distorção de nuvens eletrônicas


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Hα ≅ 6.2 ppm

Hβ ≅ 6.8 ppm

(a)

(b)

Hα ≅ 6.2 ppm

Hβ ≅ 4.6 ppm


Ressonância


β

β

β

β

∆δ = - 1,82

∆δ = - 5,18

≠ = - 3,36E


Campo elétrico


H-1 H-2H-3H-4 H-5 H-7 H-6a,bc c’

ab

ab

CDCl3

C5D5N

EFEITO DE SOLVENTE


Efeito de solvente


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13C: Influências nos deslocamentos- estado de hibridização do carbono- eletronegatividade de grupos ligados ao carbono



carbono sp3 é mais blindado que sp2

um átomo eletronegativo desblinda o carbono ao qual está ligado



Tipode

carbono

Deslocamento químico(δ), ppm

RCH3 0-35

CR2R2C

65-90CRRC

R2CH2 15-40

R3CH 25-50

R4C 30-40

100-150

110-175

Tipode

carbono




Tipode

carbono


RCH2Br 20-40

RCH2Cl 25-50

RCH2NH2 35-50

RCH2OH 50-65

Tipode

carbono


RCH2OR 50-65

RCOR

O

RCR

O

160-185

190-220

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Espectros de (a) RMN 1H e (b) 13C do acetato de metila. TMS: calibração



Uma vez que os três hidrogênios em cada metila estão em um mesmo ambiente eletrônico, eles são blindados na mesma intensidade e são considerados equivalentes

Núcleos quimicamente equivalentes sempre mostram a mesma absorção

Os três hidrogênios em cada metila apresentam o mesmo sinal em RMN 1H



As duas metilas não são equivalentes: dois grupos de hidrogênios absorvem em posições diferentes

Quando a frequência de radiação é mantida constante e a força do campo aplicado é variada, cada núcleo em uma molécula entre em ressonância em campos com força levemente diferente, permitindo o mapeamento da estrutura carbono-hidrogênio de uma molécula orgânica



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O espectro de RMN 13C do acetato de metila mostra três sinais, um para cada um dos três carbonos quimicamente distintos na molécula



RMN requer mais tempo (cerca de 10-3s) comparativamente ao IV (cerca de 10-13s)

Se duas espécies que se interconvertem rapidamente estão presentes em uma amostra, o espectro no IV será único para ambas; porém, em RMN, será registrado um espectro da “média” – esta característica pode seu usada para medir cinética de reações e a energia de ativação de processos muito rápidos





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A área sob o sinal é proporcional ao número de protons que o geramIntegrar (medir eletronicamente) a área sob cada sinal torna possível

determinar o número relativo de cada proton na molécula



A absorção de um proton pode se dividir em múltiplos sinais - multiplete

O espectro de RMN 1H NMR do bromoetano mostra quatro sinais (um quarteto) em 3.42 δ para os proton de –CH2Br e três sinais (um triplete) em 1.68 δ para protons de –CH3



Absorções múltiplas, chamadas de desdobramento spin-spin, são causadas pela interação dos spins de núcleos vizinhos

• Pequenos campos magnéticos produzidos por um núcleo afetam os campos sentidos pelos núcleos vizinhos

– Se os protons se alinham com o campo aplicado, o campo efetivo sentido pelos vizinhos é levemente maior

– Se os protons se alinham contra o campo aplicado, o campo efetivo sentido pelos vizinhos é levemente menor



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Regra do “n + 1”• Protons que apresentam número de vizinhos

equivalente apresentam (n + 1) sinais em seus espectros de RMN 1H



Acoplamento spin-spin

Sinal de RMN desdobrado

S = 2nI + 1S = MULTIPLICIDADEn = No. DE ESPÉCIES VIZINHASI = No. DE SPIN

I = 1/2S = n + 1

1H, 13C, 19F, 31P

nJa,b





Multiplicidades

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Triângulo de PascalMétodos Físicos de Análise




S = 1 + 1 = 2

dupleto

S = 1 + 1 = 2

dupleto



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S = 2 + 1 = 3

tripleto

S = 1 + 1 = 2

dupleto



S = 3 + 1 = 4

quarteto

S = 2 + 1 = 3

tripleto



S = 1 + 1 = 2

S = 1 + 1 = 2

Duplo-dupleto

S = 1 + 1 = 2

S = 1 + 1 = 2

Duplo-dupleto

S = 1 + 1 = 2

S = 1 + 1 = 2

Duplo-dupleto


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!! dddd !!H-2

2JH-2, F

3JH-2, H-1

3JH-2, H-3b

3JH-2, H-3a

a

b

1

2

3

A origem do acoplamento spin-spin

Tipo - X Tipo - Y



Ângulo de ligação

Eletronegatividade

Tensão de torção

Comprimento de ligação

Distância entre os átomos


Fatores que afetam o acoplamento spin-spin


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Resumo do desdobramento spin-spin na RMN 1H1. Protons quimicamente equivalentes não apresentam desdobramento

2. O sinal de um proton com n protons equivalentes vizinhos é dividido em um multiplete de (n + 1) sinais com constante de acoplamento J


Os três protons C-H são quimicamente equivalentes –

não há desdobramento

Os quatro protons C-H são quimicamente equivalentes –

não há desdobramento

Ocorre o desdobramento Desdobramento geralmente não observado

Por que não há desdobramento em RMN 13C?

– Porque a abundância natural baixa torna improvável que dois núcleos de 13C sejam adjacentes na mesma molécula

– Não há acoplamento de spins carbono-hidrogênio • A molécula é irradiada com um pulso de radiofrequeência para cobrir as

frequências de ressonância dos carbonos e hidrogênios simultaneamente• A inversão dos spins dos hidrogênios é tão rápida que a média de seus

campos magnéticos locais é zero



Constante de Acoplamento• Distância entre os picos em um multipleto• Denominado como J e medida em hertz (Hz)

• Geralmente situa-se na faixa de 0 a 18 Hz• A mesma constante de acoplamento é compartilhada pelos grupos

de hidrogênios cujos spins estão acoplados• As constantes de acoplamento são independentes da força do

campo do espectrômetro



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EXEMPLOS



Cannabis sativa




Cannabis sativa


22


Cannabis sativa




Cannabis sativa

Fragmentação do ∆9-THC (EI-MS)


Cannabis sativa

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Anfetaminas



Anfetaminas



Anfetaminas


24


Anfetamina/metanfetamina


44

91




Anfetamina (fragmentação)


25

58

91




Metanfetamina (fragmentação)



Cetamina

(ou)


26


Cetamina



Cetamina



Cetamina


27


Cetamina



Cetamina


303 (M+)

[M-31]+ 272

182 [M-121]+82 (base peak)

121



Cocaína

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Cocaína (fragmentação)


Cocaína




Cocaína x crack

29


Heroína (diacetilmorfina)



Heroína



Heroína


30


Heroína



Heroína



Heroína


31


Heroína



Heroína



Heroína


32


Heroína



Heroína



Heroína


33


Heroína



Heroína



Heroína


34

Heroína



Heroína




Heroína


35


Heroína




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