metodologia para quantificação de atividade de enzimas

Metodologia para Quantificação de Atividade de Enzimas Relacionadas com a Resistência a Inseticidas em Aedes aegypti

Quantification Methodology for Enzyme Activity Related to Insecticide

Resistance in Aedes aegypti

MInIstéRIo dA sAúdE

Brasília/dF

MANUAL_LAFICAVE_CAPA.indd 1 4/12/2006 12:20:02

© 2006 Ministério da Saúde.Todos os direitos reservados. É permitida a reprodução parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que não seja para venda ou qualquer fim comercial.A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra é da área técnica.A coleção institucional do Ministério da Saúde pode ser acessada, na íntegra, na Biblioteca Virtual em Saúde do Ministério da Saúde: http://www.saude.gov.br/bvs

Série A. Normas e Manuais Técnicos

Tiragem: 1.ª edição – 2006 – 1000 exemplares

Elaboração, distribuição e informações:MINISTÉRIO DA SAÚDESecretaria de Vigilância em SaúdeDiretoria Técnica de GestãoEsplanada dos Ministérios, bloco GEdifício Sede, 1.º andar, sala 134CEP: 70058-900, Brasília – DFE-mail: [email protected] page: http://www.saude.gov.br/svs

FuNDAçãO OSwAlDO CRuzAv. Brasil, 4.365 – ManguinhosRio de Janeiro – RJ – CEP 21040-900Home page: http://www.fiocruz.br/

Coordenação Editorial:Denise Valle - IOC/FIOCRuzIsabela Reis Montella – IOC/FIOCRuz - Instituto de Biologia do Exército

Equipe Técnica da Elaboração do Manual:Denise Valle – IOC/FIOCRuzIsabela Reis Montella – IOC/FIOCRuz - Instituto de Biologia do ExércitoRosana Aparecida Ribeiro - IOC/FIOCRuzPriscila Fernandes Viana Medeiros - IOC/FIOCRuzAdemir de Jesus Martins-Júnior - IOC/FIOCRuzJosé Bento Pereira lima - IOC/FIOCRuz

Revisão Técnica- científica:Denise Valle – IOC/FIOCRuzIsabela Reis Montella – IOC/FIOCRuz - Instituto de Biologia do Exército

Consultor Técnico:william G Brogdon - Centers for Disease Control and Prevention – CDC/Atlanta

Revisão de Português:Astrogildo Esteves Filho

Revisão de Inglês:Mitchell Raymond lishonwalter Oelemann

Colaboradores:Ima Aparecida BragaInstituto de Biologia do Exército

Programação Visual: Pixels e Pontos/Rossana Henriques

Direção de Arte: Rossana Henriques

Manipulação e Tratamento de Imagens: Ricardo Gandra

Produção Fotográfica: Rossana Henriques e Ruy Barbosa Pinto

Fotografias: Rossana Henriques e Ruy Barbosa Pinto

Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Ficha Catalográfica

Brasil. Ministério da Saúde. Fundação Oswaldo Cruz. Metodologia para qualificação de atividades de enzimas relacionados com a resistência a inseticidas em aedes aegypti/Ministério da Saúde, Fundação Oswaldo Cruz = Quantification methodology for enzyme activity related to insecticide resistance in aedes aegypti/Ministry of Health of Brazil, Fundação Oswaldo Cruz. – Brasília : Ministério da Saúde, 2006. 128 p. : il. – (Série A. Normas e Manuais Técnicos)

ISBN 85-334-1291-6

1. Resistência a inseticidas. 2. Aedes aegypti. 3. Vigilância em saúde. 4. Saúde pública. I. Título. II. Série.

NlM QX 600

Catalogação na fonte – Coordenação-Geral de Documentação e Informação – Editora MS – OS 2006/1338

Títulos para indexação:Em inglês: Quantification Methodology for Enzyme Activity Related to Insecticide Resistance in Aedes AegyptiEm espanhol: Metodología para Calificación de Actividades de Enzimas Relacionadas con la Resistencia a Pesticidas en Aedes aegypti




MInIstéRIo dA sAúdE

FUndAÇÃo osWALdo CRUZ

Série A. Normas e Manuais Técnicos

Brasília/dF2006

MANUAL_LAFICAVE_DENGUE FINAL.ind3 3 3/4/2007 11:19:26

ÍNDICE

PREFÁCIO 8

AGRADECIMENTOS 12

1. INTRODUÇÃO 14

2. ABREVIATURAS 18

3. EQUIPAMENTOS E REAGENTES 203.1. Equipamentos 203.2. Vidrariaeplásticos 203.3. Miscelânea 223.4. Reagentes 223.4.1. reagentesdeusogeralparaostestes 223.4.2. reagentesespecíficos 24

4. PREPARAÇÃO DOS MOSQUITOS PARA TESTE 264.1. Congelamento 264.2. Homogeneização 264.3. Distribuiçãodehomogenatosnasplacas 304.3.1. preparoda“placademosquitos” 304.3.2. distribuiçãodeamostrasnasplacas-teste 32

5. TESTES ENZIMÁTICOS 345.1. Acetilcolinesterase(ACE) 365.2. OxidasesdeFunçãoMista(MFO) 385.2.1. curva-padrãodecitocromoC 405.3. Esterasealfa(a-EST) 405.3.1. curva-padrãodealfa-naftol 445.4. Esterasebeta(b-EST) 445.4.1. curva-padrãodebeta-naftol 465.5. Esterase“PNPA”(PNPA-EST) 485.6. Glutationa-S-transferase(GST) 485.7. Proteínastotais(PTN) 505.7.1. curva-padrãodeproteína–alternativa1 525.7.2. curva-padrãodeproteína–alternativa2 545.7.3. posiçãodasamostrasdeBSAparaacurva-padrão 54

6. PREPARAÇÃO DE REAGENTES ESPECÍFICOS 566.1. Acetilcolinesterase(ACE) 566.2. OxidasesdeFunçãoMista(MFO) 586.3. Esterasealfa(a-EST) 606.4. Esterasebeta(b-EST) 62

INDEX

PREFACE 9

ACkNOwlEDGEMENTS 13

1. INTRODUCTION 15

2. ABREVIATIONS 19

3. EQUIPMENT AND REAGENTS 213.1. Equipment 213.2. Glasswareandplasticware 213.3. Miscellaneous 233.4 Reagents 233.4.1. reagentsofgeneraluse 233.4.2. specificreagents 25

4. PREPARING MOSQUITOES 274.1. Freezing 274.2. Homogenization 274.3. Distributionofthehomogenatesinthemicroplates 314.3.1. preparingthe“mosquitoplate” 314.3.2. distributingsamplesinthetestmicroplates 33

5. ENZYMATIC TESTS 355.1. Acethylcholinesterase(ACE) 375.2. MixedFunctionOxidases(MFO) 395.2.1. cytochromeCstandardcurve 415.3. alpha-Esterase(a-EST) 415.3.1. alpha-naphtholstandardcurve 455.4. beta-Esterase(b-EST) 455.4.1. beta-naphtholstandardcurve 475.5. “PNPA”Esterase(PNPA-EST) 495.6. Glutathione-S-transferase(GST) 495.7. Totalproteins(PTN) 515.7.1. proteinstandardcurve–alternative1 535.7.2. proteinstandardcurve–alternative2 535.7.3. distributionofBSAsamplesforthestandardcurve 55

6. PREPARING SPECIFIC REAGENTS 576.1. Acethylcholinesterase(ACE) 576.2. MixedFunctionOxidases(MFO) 596.3. alfa-Esterase(a-EST) 616.4. beta-Esterase(b-EST) 63

6.5. Esterase“PNPA”(PNPA-EST) 646.6. Glutationa-S-transferase(GST) 666.7. Proteínastotais(PTN) 68

7. TAMPÕES GERAIS E SOlUÇÕES-ESTOQUE 707.1. Tampõesfosfatodesódio 707.1.1. estoquesfosfatodesódio(monoebibásico)a1M 707.1.2. tampões-estoquefosfatodesódioa1M 727.1.3. tampõesfosfatodesódioa100e50mM 727.1.4. tampãofosfatodesódioa20mM 727.2. Tampõesfosfatodepotássio 747.2.1. estoquesfosfatodepotássio(monoebibásico)a1M 747.2.2. tampões-estoquefosfatodepotássioa1M 767.2.3. tampãofosfatodepotássioa90mMpH7,2 767.2.4. tampãofosfatodepotássioa100mMpH6,5 767.3. Tampãoacetatodesódio 787.3.1. tampãoestoqueacetatodesódio250mMpH5,0 787.4. Propoxur(ensaioAcetilcolinesterase) 787.5. SDS(ensaioEsterasesalfaebeta) 78

8. COMPARAÇÃO PROTOCOlOS OMS – CDC – lAFICAVE 80

9. ANÁlISE DOS RESUlTADOS 849.1. Acetilcolinesterase(ACE) 849.2. Proteínastotais(PTN) 849.3. OxidasesdeFunçãoMista(MFO) 869.4. Esterasesalfaebeta(aeb-EST) 889.5. Esterase“PNPA”(PNPA-EST) 889.6. Glutationa-S-transferase(GST) 90

10. METODOlOGIA lAFICAVE PARA PROCESSAMENTO E ANÁlISE DOS RESUlTADOS 9210.1. Arquivo1–transferênciadosdadosdoSoftMaxparaExcel 9410.2. Arquivo2–conversãodosvaloresdeabsorbância (exceçãodePNPA-EST) 9810.3. Arquivo3–conversãodosvaloresdeabsorbânciadePNPA-EST 10810.4. Arquivo4–totaldosdadosdecadapopulação 114

11. INTERPRETAÇÃO DOS RESUlTADOS 11811.1. Critériosparainclusãodeavaliaçõesdemosquitosindividuais 11811.2. Critériosparaclassificaçãodaspopulações 120

12. REFERÊNCIAS BIBlIOGRÁFICAS 126

6.5. “PNPA”Esterase(PNPA-EST) 656.6. Glutathione-S-transferase(GST) 676.7. Totalproteins(PTN) 69

7. GENERAl BUFFERS AND STOCk SOlUTIONS 717.1. Sodiumphosphatebuffers 717.1.1. sodiumphosphatestocks(monoandbibasic)at1M 717.1.2. sodiumphosphatestockbuffersat1M 737.1.3. sodiumphosphatebuffersat100and50mM 737.1.4. sodiumphosphatebufferat20mM 737.2. Potassiumphosphatebuffers 757.2.1. potassiumphosphatestocks(monoandbibasic)at1M 757.2.2. potassiumphosphatestockbuffersat1M 777.2.3. potassiumphosphatebufferat90mMpH7.2 777.2.4. potassiumphosphatebufferat100mMpH6.5 777.3. Sodiumacetatebuffer 797.3.1. sodiumacetatebuffer,stockat250mMpH5.0 797.4. Propoxur(Acethylcholinesteraseassay) 797.5. SDS(alphaandbeta-Esterasestest) 79

8. COMPARING wHO – CDC – lAFICAVE PROTOCOlS 81

9. ANAlYSIS OF RESUlTS 859.1. Acethylcholinesterase(ACE) 859.2. Totalproteins(PTN) 859.3. MixedFunctionOxidases(MFO) 879.4. alphaandbeta-Esterases(aandb-EST) 899.5. “PNPA”Esterase(PNPA-EST) 899.6. Glutathione-S-transferase(GST) 91

10. lAFICAVE METHODOlOGY FOR THE PROCESSING AND ANAlYSIS OF RESUlTS 9310.1. File1–datatransferfromSoftMaxtoExcel 9510.2. File2–conversionofabsorbancevalues(exceptPNPA-EST) 9910.3. File3–conversionofPNPA-ESTabsorbancevalues 10910.4. File4–totaldataofagivenpopulation 115

11. INTERPRETATION OF RESUlTS 11911.1. Criteriaforinclusionofevaluationsfromindividualmosquitoes 11911.2. Criteriaforpopulationclassification 121

12. REFERENCES 127

PREFÁCIO

Umadasferramentasutilizadasnocontroledadengueéaplicaçãodeinseticidasparacontroledovetor.Nessecontexto,omonitoramentodostatusderesistênciadepo-pulaçõesdeAedes aegypti,assimcomoadetecçãodosmecanismosbioquímicosen-volvidosnaresistênciasãomuitoimportantesparadefinirasestratégiasdecontroledessevetor.Aediçãodestemanual,queforneceinstruçõesdetalhadasparaaquantificação,emAedes aegypti,daatividadedeenzimasassociadasàresistênciaainseticidas,utilizan-dometodologiasadequadasàsnossascondições,vempreencherumalacunaimpor-tanteequedarásubsídiosaoslaboratóriosdaRededeMonitoramentodaResistênciadeAedes aegyptiaosInseticidasparaexecutaremmelhoredemaneiracoordenadaessesensaiosbioquímicos.Por outro lado, as atividades do monitoramento proporcionarão à Secretaria deVigilância em Saúde/Coordenação Geral do Programa Nacional de Controle daDengue, informações relevantes que auxiliarão no controle racional do vetor dedenguenopaís.Comestapublicação,aSecretariadeVigilânciaemSaúde,emconjuntocomoLabo-ratóriodeFisiologiaeControledeArtrópodesVetores/Fiocruz-RJ,atualmenteLabo-ratóriodeReferênciaNacionaldaRededeMonitoramentodaResistênciadeAedes aegyptiaosInseticidas,cumpreoseupapelnoâmbitodoSistemaNacionaldeVigi-lânciaemSaúde,contribuindoparaumamelhorefetividadedasaçõesdecontroledeumaimportantedoençanocontextodoperfilepidemiológicodopaís.

Fabiano Geraldo Pimenta JúniorSecretário de Vigilância em Saúde

8 | Quantificação de mecanismos de resistência a inseticidas

Insecticide resistance mechanisms quantification | 9

PREFACE

Oneofthetoolsemployedinthedenguecontrolistheapplicationofinsecticidestocontrolitsvector.Inthiscontext,monitoringtheresistancestatusofAedes aegyptipopulations,aswellasdetectingbiochemicalmechanismsimplicatedwithresistanceareveryimportantparameterstodefinecontrolstrategiesofthisvector.Thepublicationofthishandbookthatgivesdetailedinstructionstothequantification,inAedes aegypti,oftheactivityofenzymesrelatedtoinsecticideresistance,throughmethodologiesadaptedtoourconditions,fulfillsanimportantgapandwillenabletheLaboratoriesoftheBrazilianAedes aegyptiResistanceMonitoringNetworktoac-complishthesebiochemicalassayscoordinatelyandinabetterway.Ontheotherhand,monitoringactivitieswillprovidetheHealthSurveillanceSecre-tary/BrazilianDengueControlProgramGeneralCoordinationrelevantinformationtohelptherationalcontrolofthedenguevectorinthecountry.Withthispublication,theHealthSurveillanceSecretary,togetherwiththeLabora-toryofPhysiologyandControlofArthropodVectors/OswaldoCruzFoundation/Riode Janeiro,presentlyNationalReferenceLaboratoryof theBrazilianAedes aegyptiInsecticideResistanceMonitoringNetwork,accomplishesitsroleinthescopeoftheNational Health Surveillance System, contributing to a higher effectiveness in thecontrolactionsofanimportantdiseaseinthecontextoftheepidemiologicalprofileofthecountry.

Fabiano Geraldo Pimenta JúniorHealth Surveillance Secretay

PREFÁCIO

Adetecçãoeacaracterizaçãoiniciaisdeumcasoderesistênciaainseticidassãogeral-menteobtidaspormeiodarealizaçãodealgumtipodebioensaio.Bioensaiossãocon-duzidospararesponderàpergunta:Esteinseticidavaicontrolarestevetornestelocal,nestemomento?Estaéaquestãopráticafundamentalqueoagentedecontroleopera-cionalprecisaresponder,preferencialmenteantesqueoinseticidasejaadquirido.Semprequeresistênciaédetectada,surgeaquestão:Oqueeufaçoagora?Éparares-ponderaestaquestãoquemétodosbioquímicosemolecularesforamdesenvolvidos,paradetectareavaliar,eminsetosindividuais,osmecanismosderesistênciaeopoten-cialderesistênciacruzadaesuaespecificidadeparatiposparticularesdeinseticidas.Ensaiosbioquímicosderesistênciabaseadosemmicroplacasforaminicialmentede-senvolvidosnoCentrodeControledeDoenças,emAtlanta,nofinaldosanos1970.Na medida em que sua utilização foi expandida, várias modificações do protoco-loforamfeitas.Estasmodificaçõesforamprincipalmenteconseqüênciadavariaçãodosconjuntosdefiltrosdisponíveisemespectrofotômetroscomerciaispara leiturademicroplacasedaconveniênciadelaboratóriosparticularesnousodediferentesproporçõesdereagentes,tampõesmaisconvenientesefatoresdediluiçãodoshomo-genatosdeinsetos.Emgeral,acredita-sequedoisprotocolossejammaisamplamenteutilizados:osprotocolosdoCDCedaOrganizaçãoMundialdeSaúde.Contudo,aforçadequalquerprotocoloresideemsuacapacidadedepreencherasnecessi-dadesdeprogramasdecontroleespecíficos.Porestarazão,protocolosmodificadosepro-tocolosoriginaisdevemserencorajadossemprequepreencheremasnecessidadesopera-cionaisdeumpaísouprograma.Oúnicorequisitoéqueoprotocolodoensaiorepresenteacuradaeprecisamenteabioquímicadaresistênciaainseticidaseminsetosindividuais.OprotocolodoLAFICAVEaquidescritopreencheestesrequisitos,comoeuverifiqueipes-soalmente,ecorrespondeaumavaliosaadiçãoànossagamademétodosparaabordaraques-tãocrucialdadetecçãoedescrição,emtermospráticos,daresistênciaemvetoresdedoenças.Osautoresprocuraramfornecerummanualprático,orientadoparao laboratório,incluindoumCD-ROMextremamenteútil,quedeixaráousuáriocomasensaçãodesegurançadesaberexatamenteoqueestásendofeitoquandodaexecuçãodestestestes.Grandecuidadofoiempregadonaavaliaçãoempíricadetodososaspectosdametodologia.NoCDC,estamosplanejandoligaresteprotocoloaonossowebsitedetreinamentoemresistência,enfatizandoqueumametodologiaconsistentedevesermoldadaparapreencherasnecessidadesdeprogramas.

William G. Brogdon, Ph.D.Pesquisador Entomologista SeniorSeção de EntomologiaDivisão de Doenças ParasitáriasCentro Nacional de Doenças InfecciosasCentros de Controle e Prevenção de DoençasAtlanta, Geórgia, EUA 30341


PREFACE

Theinitialdetectionandcharacterizationofaninstanceofinsecticideresistanceisgenerally accomplished using some form of bioassay. Bioassays are conducted toanswerthequestion:Willthisinsecticidecontrolthisvectoratthisplaceatthistime?Thisisthefundamentalpracticalquestionthatoperationalcontrolpersonnelmusthaveanswered,preferablybeforetheinsecticideispurchased.Whereresistanceisfound,thequestionthenbecomes:WhatdoIdonow?Itistoan-swerthisquestionthatbiochemicalandmolecularmethodsweredevelopedforde-tectingandassessinginindividualinsectsinsecticideresistancemechanismsandthepotentialforcrossresistanceanditsspecificityforparticulartypesofinsecticides.Microplate based biochemical resistance assays were initially developed at the Cen-tersforDiseaseControlinAtlantainthelate70s.Astheyweremorewidelyused,anumberofmodificationsinprotocoloccurred.Theseweremainlyduetothevaryingfiltersetsavailableincommercialmicropolate-readingspectrophotometersandtotheconvenienceinparticularlabsofusingdifferentproportionsofreagents,moreconve-nientbuffersanddilutionfactorsofinsecthomogenates.Ingeneral,twoprotocolshaveperhapsbeenmostwidelyused:theCDCandWorldHealthOrganizationprotocols.However,thestrengthofanyprotocolliesinitsadaptabilitytofulfilltheneedsofspe-cificcontrolprograms.Forthatreason,modifiedprotocolsandoriginalprotocolsaretobeencouragedwheretheyfillanoperationalneedinacountryorprogram.Theonlycaveatisthattheassayprotocolrepresentaccuratelyandpreciselythebiochem-istryofinsecticideresistanceinindividualinsects.TheLAFICAVEprotocoldescribedhereinfulfillstheserequirements,asIhaveper-sonallyverified,andshouldprovetobeavaluableadditiontoourtoolkitofmethodsforaddressingthecrucialissueofdetectinganddescribinginpracticaltermsresis-tanceinvectorsofdisease.Theauthorsareseekingtoprovideapracticallab-orientedmanual,includingwhatwillbeamostusefulCDrom,thatwillleavetheuserwiththesecurefeelingthattheyknowexactlywhattheyaredoingwhenperformingthesetests.Greatcarehasbeenexercisedinanempiricalassessmentofeveryaspectofthemethodology.AtCDC,weareplanningtolinkthisprotocoltoourresistancetrainingwebsite,furtherem-phasizingthatarobustmethodologycanbetailoredtofittheneedsofprograms.

William G. Brogdon, Ph.D.Senior Fellow and Research EntomologistEntomology BranchDivision of Parasitic DiseasesNational Center for Infectious DiseasesCenters for Disease Control and PreventionAtlanta, Georgia, U.S.A. 30341


AGRADECIMENTOS

Muitosprofissionaiseamigoscolaboraramparatornarpossívelapublicaçãodestemanualeno-meartodosseriaumatarefadifícil;certamente,esqueceríamosdealgunsnomesimportantes.Noentanto,destacamosalgumaspessoasquedesempenharampapelfundamentalnarealizaçãodesteprojeto.ADrªImaAparecidaBraga,assessoratécnicadoProgramaNacionaldeControledaDengue/SecretariadeVigilânciaemSaúde(PNCD/SVS),acompanhoueincentivoutodosospassosdotrabalhodepadronizaçãodosprocedimentose,posteriormente,deviabilizaçãodecadaetapanecessáriaparasuapublicação.Seuempenhoprofissionalepessoalesuaamizadeforamcruciaisparaaconcretizaçãodesteprojeto.Nãomenos importante foioapoiodoDr.GiovaniniCoelho,coordenadordoPNCD,que,assimcomoaDrªIma,éumprofissionalextre-mamentecomprometidocomaqualidadedaprestaçãodeserviçosemsaúdepúblicanopaís,valorizandosempreosavançostécnicoseoconhecimentocientífico.NãopoderíamosdeixardemencionaroDr.FabianoPimenta,SecretáriodeVigilânciaemSaúde,eoDr.JarbasBarbosa,SecretárioExecutivodoMinistériodaSaúde,portodooesforçodevalorizaçãodascompetênciasnacionais.Devemosaestesquatroprofissionais,entremuitosesforçosnosentidodeimpulsio-naraqualidadedocontrolededenguenoBrasil,ainiciativadetrazeroDr.WilliamG.Brog-don,doCentersforDiseaseControl,EstadosUnidos,que,nacondiçãodeconsultoreavaliador,acompanhoutodasasetapasdoprotocoloaquiapresentadoeaprovouosprocedimentospornóspadronizados.AoDr.Brogdontambémgostaríamosdeagradecer,portodaapaciênciaepelasvaliosassugestões.FundamentalfoitambémaFiocruz,emespecialaVice-PresidênciadeServiçosdeReferênciaeAmbiente,representadapeloVice-PresidenteAryCarvalhodeMirandaeporsuaassessora,AnaBeatrizMoraesdaSilva,ondesempreencontramosentusiásticoapoio,semmencionarograndeempenhonavalorizaçãodosLaboratóriosdeReferênciadaInstituição,eoInstitutoOswaldoCruz,unidadedaFiocruzàqualpertencemos,quemuitotemtrabalhadonaintegra-çãoentreapesquisabásicaeaplicadaeaprestaçãodeserviçosdequalidadequecontribuamparaamelhoriadasaúdedapopulação.IgualmenteimportantetemsidoaparceriaencontradanoInstitutodeBiologiadoExército,comandadapeloCoronelBeneditoDomicioFerrari,ean-teriormentepeloGeneraldeBrigadaIvandaCostaGarcezSobrinho,ondetemosencontradoirrestritoapoioàrealizaçãodenossasatividades.AlémdaFiocruzedaSecretariadeVigilânciaemSaúde/CoordenaçãoGeraldeLaboratórios(SVS/CGLAB),recebemossuportefinanceirodeváriosprogramaseinstituiçõesdefomentoàpesquisa,comooConselhoNacionaldeDesenvolvimentoCientíficoeTecnológico(CNPq),aFundaçãoCarlosChagasFilhodeAmparoàPesquisadoEstadodoRiodeJaneiro(Faperj)eoProgramadeDesenvolvimentoTecnológicoemSaúdePúblicadaFiocruz(PDTSP).GostaríamosdecitaraindaMitchellRaymondLishoneoDr.WalterOelemann,pelarevisãodoinglês,respectivamentedotextoedasplanilhaseletrônicas,oprimorosotrabalhodedia-gramaçãodeRossanaHenriqueseodesenhodenossomosquito-mascotefeitoporDanielPeixoto.Finalmente,devemosressaltarqueestetrabalhojamaisteriasidorealizadosemacolaboraçãodetodososmembrosdoLaboratóriodeFisiologiaeControledeArtrópodesVetores,queforamsolidárioseparticipativosemtodasasetapas,desdeadecisãoinicialdedefinirprotocoloadequadoàsnossasnecessidades,atéafinalizaçãodestemanual.Aestaspessoas,eatodososoutrosquedealgumaformacolaboraramconosco,nossossin-cerosagradecimentos.



ACkNOwlEDGEMENTS

Manyprofessionalsandfriendscollaboratedtomakethepublicationofthepresenthand-bookpossibleand itwouldbeverydifficultwithout forgetting someone.However, somepersons played an important role towards the concretization of this project and must benamed.DrImaAparecidaBraga,technicalassistantoftheBrazilianDengueControlPro-gram/HealthSurveillanceDepartment,(PNCD/SVS)encouragedall thestepsofboththeprotocolstandardizationworkand, later, thepublicationofthisvolume.Herprofessionalandpersonalpersistenceandher friendshipwereessential totheaccomplishmentof thisproject.EquallyimportanthasbeenthesupportofDrGiovaniniCoelho,coordinatoroftheBrazilianDengueControlProgram,who,aswellasDrBraga, isaprofessionalextremelyengagedwiththequalityofthepublichealthservicesinourcountry,andalwaystakesintoaccounttechnicalandscientificknowledgeadvances.ItisalsooughtmentioningDrFabianoPimenta,SecretaryoftheBrazilianHealthSurveillanceDepartment,andDrJarbasBarbosa,HealthMinistryExecutiveManager, for theireffort to supportnationalabilities.Weowetothesefourprofessionals,amongmanyeffortstostimulatethedenguecontrolqualityinBrazil,theinitiativetobringDrWilliamG.Brogdon,fromtheCentersforDiseaseControlandPrevention,Atlanta,US,which,asanexternalconsultant,personallyevaluatedallthestepsoftheprotocolandapprovedtheproceduresstandardizedbyourteam.WewouldliketothankDrBrogdonforallhispatienceandvaluablesuggestions.AlsorelevanttotheaccomplishmentofthisworkwastheOswaldoCruzFoundation(Fio-cruz), specially the Reference Services and Environment Department, represented by DrAry Carvalho de Miranda and his adviser, Ana Beatriz Moraes da Silva, from whom wealwaysreceivedenthusiasticsupportandanexpressiveeffortintheimprovementoftheFio-cruzReferenceLaboratoriesandtheOswaldoCruzInstitute,theunittowherewebelong,whichhasbeenworkinghardintheinteractionbetweenbasicandappliedresearchandthequalifiedpublicservices,aimingatabetterpublichealth.AlsoimportantisourpartnershipwiththeArmyBiologyInstitute,underthecommandofColonelBeneditoDomicioFerrari,andpreviouslyofGeneralIvandaCostaGarcezSobrinho,wherewefoundunrestrictedsup-porttotheaccomplishmentofouractivities.BesidesFiocruzandtheBrazilianHealthSurveillanceDepartment/GeneralLaboratoriesCo-ordination (SVS/CGLAB) we received financial support of several programs and researchfunding agencies, like the National Counsil for Technological and Scientific Development(CNPq),theRiodeJaneiroResearchFundingAgencyCarlosChagasFilho(Faperj),andthePublicHealthTechnologicalDevelopmentProgram/Fiocruz(PDTSP).WewouldliketomentiontheEnglishrevisionofthetextandtheelectronicfilesmadeby,re-spectively,MitchellRaymondLishonandDrWalterOelemann,theexcellentfinalartworkofRossanaHenriquesand thedrawingofourmascot-mosquitodonebyDanielPeixoto.Finally, itshouldbeemphasizedthat thisworkwouldneverbefinalizedwithoutthecol-laborationofallArthropodVectorsPhysiologyandControlLaboratorymembers,participa-tiveinallsteps,fromtheinitialdecisiontodefineaprotocoladaptedtoourneedsuntilthepublicationofthishandbook.Tothesepersons,andtoalltheothersthatcollaboratedwithustosomeextent,oursinceregratitude.

1. INTRODUÇÃO

Os inseticidas químicos desempenham até hoje um papel importante no controledevetorestransmissoresdedoenças.Osmaisamplamenteusadosatuamnosistemanervosocentral(SNC)dosinsetosesãoclassificadosemquatrograndesgrupos,deacordocomasuanaturezaquímica:organoclorados,organofosforados,carbamatosepiretróides.Oaparecimentodeinsetosresistentesaestescompostosdecorreprin-cipalmentedeumaalteraçãonosseussítiosdeaçãooudemaioreficiênciadedeto-xificação.Esteúltimomecanismoéconhecidocomoresistênciametabólicaeoau-mentodaatividadedeenzimasdetoxificantes(Glutationa-S-transferases,Esterases,OxidasesdeFunçãoMista)contribuiparaaeliminaçãoouinativaçãodosinseticidascirculantesnoorganismodovetor.OusodeinseticidasnoBrasil,desde1967,vemexpondoovetordodengueaumaintensapressãoseletiva.Portanto,édeextremarelevânciaparaocontroleanalisarostatusderesistênciadepopulaçõesdeAedes aegyptieomecanismoenvolvido.Méto-dosbioquímicospodemdetectarprecocementeoaparecimentodeindivíduosalte-rados,fornecendoinformaçõessobreomecanismoderesistênciadeumapopulação,assimcomoopadrãoderesistênciacruzadafrenteaosinseticidasempregados.Este manual foi elaborado com o objetivo de fornecer instruções detalhadas para aquantificação,emA. aegypti,daatividadedeenzimasassociadasàresistênciaainsetici-das.OtrabalhoépartedasatividadesdoMoReNAa(RedeNacionaldeMonitoramentodaResistênciadeAedes aegyptiaosInseticidas),grupoquecongregalaboratóriosqueatuamemsintoniacomoPNCD(ProgramaNacionaldeControledaDengue),naten-tativadefornecersubsídiosparaocontroleracionaldovetordedenguenopaís.Osprotocolosqueestemanualdescreveforamresultadodemodificaçõesnosmé-todosrecomendadospelaOrganizaçãoMundialdeSaúde(Hemingway 1998)epeloCentersforDiseaseControl(Insecticide Resistance Workshop 1998),deformaaade-quá-losàsnossascondiçõesenecessidades.Estesprotocolosestãosendoutilizadoscomsucessopornossaequipedesde2002.Osprincipaisparâmetrosavaliadosforam:volumedehomogeneizaçãodosmosqui-tos,naturezaeconcentraçãodostampõesedemaisreativos,volumesdeextratosusa-dos emcadaensaio e temposde reação.Foi adotadoousodeduplicatasde todososespécimeseavaliou-seaindaoefeitodacentrifugaçãosobreaquantificaçãodasOxidasesdeFunçãoMúltipla,enzimasassociadasamembranas(Montellano 2004).Adicionalmente, optou-se pela inclusão de mosquitos susceptíveis a inseticidas, deumacepareferência,comocontrolesinternos,emcadaensaio(nósusamosmosquitosdacepaRockefeller).


1. INTRODUCTION

Chemicalinsecticideshaveupnowplayedanimportantroleintheinsectdiseasevec-torscontrol.InPublicHealth,themorewidelyusedinsecticidesactontheinsectcen-tralnervoussystem(CNS)andareclassifiedinfourmajorgroups,accordingtotheirchemical nature: organochlorines, organophosphates, carbamates and pyrethroids.Insectsbecomeresistanttothesecompoundsasaresultofeitheranalterationintheirtargetsitesoranincreaseddetoxificationefficacy.Thelattermechanismisknownasmetabolicresistance,andtheincreaseintheactivityofdetoxifyingenzymes(Glutha-tione-S-Transferases,Esterases,MixedFunctionOxidases)contributestotheelimi-nationordeactivationoftheinsecticidescirculatingthevector’sorganism.InBrazil,asaconsequenceoftheuseofinsecticidessince1967,denguevectorpopu-lationsareexposedtoanintenseselectionpressure.Inthissensetheanalysisofboththeresistancestatusofwildpopulationsandthemechanismsinvolvedisofrelevanceto the control of Aedes aegypti. Biochemical methods can be responsible for theearlydetectionofalteredspecimens,yieldinginformationconcerningtheresistancemechanismsofagivenpopulationaswellasapatternofcrossresistancetodifferentinsecticides.Thishandbookwaspreparedinordertogivedetailedinstructionstothequantifica-tionoftheenzymeactivityrelatedtoinsecticideresistanceinA. aegypti.TheworkispartofMoReNAa(BrazilianAedes aegyptiInsecticideResistanceMonitoringNet-work)activities,agroupoflaboratoriesthatacttogetherwiththePNCD(BrazilianDengue Control Program) and give support to the rational control of the denguevectorinthecountry.Theprotocolsdescribedinthishandbookaretheresultofmodificationsinthepro-cedures recommended by the World Health Organization (Hemingway 1998) andbytheCentersforDiseaseControl (Insecticide Resistance Workshop 1998)inordertoadaptthemethodologytoourconditionsandneeds.Theseprotocolshavebeenutilizedwithsuccessbyourgroupsince2002.Themainparametersevaluatedwere:mosquitohomogenizationvolume,natureandconcentrationofbuffersandreactives,sizeofthealiquotsofmosquitohomogenateusedineachassayandreactiontime.Weoptedtouseduplicatesamplesforallen-zymes.WealsoevaluatedtheeffectofcentrifugationonthequantificationofMixedFunctionOxidases,sincetheseenzymesareknowntobeassociatedwithmembranes(Montellano 2004).Furthermore,internalcontrols,correspondingtomosquitoesoftheinsecticidesusceptiblereferencestrain(weuseRockefellermosquitoes),werein-cludedineachassay.


Nossa intenção é testar outros parâmetros, como a expressão diferencial nos doissexos,aolongododesenvolvimentoouemadultosdediferentesidades.Atualmente,trabalhamoscomfêmeasadultas,umdiaapósaemergência.Comrelaçãoaosadul-tos,ométodoCDCutilizaapenasfêmeas,enquantoométodoOMSadmitetambémousodemachos.Poroutrolado,enquantoaOMSutilizaapenasadultosjovens,deumdia,oCDCnãofaznenhumarestriçãonessesentido.Contudo,podehaverdi-ferençatemporalnaexpressãodasenzimasenvolvidascomaresistência.Expressãodiferencialentrelarvaseadultospodeserrelevanteparaomonitoramentodaresis-tência,quandoénecessárioconfrontarosbioensaioseosensaiosbioquímicos.ForamdefinidosprotocolosparaaquantificaçãodeAcetilcolinesterase,enzima-alvo,noSNC,deorganofosforadosecarbamatos,edasprincipaisenzimasenvolvidascomaresistênciametabólica.Estas,emconjunto,podemserimportantesparaaresistên-cia aos grupos de inseticidas mais amplamente empregados em saúde pública. AsEsterasesestãosendoquantificadascomtrêssubstratosdiferentes.Todososensaiosquantificam a atividade enzimática, com exceção do teste de Oxidases de FunçãoMista(MFO),queéumamedidaindiretadoconteúdodaenzima,umavezquequan-tificaogrupamentoheme,seugrupamentoprostético(verSeção 9.3).Otextofoiorganizadoemseçõesparafacilitaraconsulta,desdeocongelamentodosmosquitosatéainterpretaçãodosresultados.Detalhesdapreparaçãodosreagentese dos tampões também podem ser encontrados em seções separadas. Finalmente,emassociaçãocomestemanual,foramelaboradasplanilhas,noprogramaExcel,quepermitem,deformasemi-automática,acomparaçãodasréplicasdecadaamostra,atransformaçãodosvaloresdeabsorbânciaematividadeenzimática,acorreçãopelaquantidadedeproteínastotaisemcadamosquitoeaelaboraçãodegráficosquemos-tramoperfildeatividadedecadapopulaçãoanalisada.Esperamosqueestetrabalhopossacontribuircomomonitoramentoquevemsendoexecutado,namedidaemqueoutroslaboratóriosenvolvidoscomaavaliaçãodare-sistênciadeAedes aegyptinopaíspossamutilizá-lo.Poroutrolado,omaterialaquidetalhadopoderiaservircomoroteiro inicialparaaavaliaçãodosmecanismosderesistênciadeoutrasespécies.Emboratenhasidoinicialmenteplanejadoparautili-zaçãopeloMoReNAa,fomosposteriormenteencorajadosaapresentarestematerialparaumpúblicomaisamplo,oquejustificaaversãoeminglês.


We intend to evaluate other parameters, like the differential expression betweenmalesandfemales,throughoutdevelopmentorinadultmosquitoesofvaryingages.Currentlyweworkwithone-dayoldadultfemales.Asfarasbiochemicalassayswithadultsareconcerned,CDCmethodologyutililizesonlyfemaleswhileWHOproto-colalsorecommendstheuseofmales.Bycontrast,WHOprotocolworksonlywithyoungadults,one-dayold,whileCDChasnospecial recommendationon this is-sue.However,temporaldifferencesintheexpressionofenzymesrelatedtoresistancecan occur. Differential expression between larvae and adults is also an importantparametertoresistancemonitoringwhenit isnecessarytocomparebioassaysandbiochemicaltests.WedefinedprotocolstoquantifyAcethylcholinesterase,thetargetsiteintheCNSoforganophosphatesandcarbamates,andthemainenzymesrelatedtometabolicresis-tance.Inconjunction,theseenzymescandetermineresistancetothemajorinsecti-cideclassesemployedinPublicHealth.WedescribethequantificationofEsteraseswiththreedifferentsubstrates.Alltheprotocolsarebasedonthequantificationoftheenzymeactivity.TheexceptionistheMixedFunctionOxidases(MFO)assay,anindi-rectmeasureoftheenzymecontent,sinceitquantifiesthehemegroup,itsprostheticgroup(seeSection 9.3).Tofacilitatehandling,thetextisorganizedinseparatesections,fromfreezingofmos-quitoestointerpretationoftheresults.Detailsofpreparationofbuffersandreagentscanalsobefoundinseparatesections.Finally,fourExcelfilesaccompanythishand-book.Thesefilesenable,inasemi-automaticway,tocomparereplicasofeachsample,tocalculatetheenzymaticactivityofeachmosquito, tocorrectvaluesobtainedbythetotalproteinamountofeachmosquitoandtoelaborategraphswiththeactivityprofileofeachtestedpopulation.WehopethisworkcontributestotheAedes aegyptiinsecticideresistancemonitoringthat ispresentlybeingperformed in thecountry, stimulatingother laboratories toperformbiochemicalassays.Itcouldalsoserveasaninitialguidetotheevaluationofresistancemechanismsinotherinsectspecies.InitiallyplannedasahandbooktobeusedbytheMoReNAanetwork,wewerelaterencouragedtopresentthismaterialtoawiderpublic;thisisthereasonfortheEnglishversion.


2. ABREVIATURAS

ACE AcetilcolinesteraseAChE atividadetotaldeAcetilcolinesteraseAChI atividadedeAcetilcolinesterasenapresençadeinibidorACTH iodetodeacetiltiocolinaBSA albuminaséricabovinacit citocromoCDNB 1-cloro2,4dinitrobenzenoDIA ortodianisidina,tetrazotizadaDTNB ácido5,5ditiobis(2-nitro-benzóico)EST EsteraseGSH L-glutationareduzidaGST Glutationa-S-transferaseH2O2 peróxidodehidrogêniok fosf fosfatodepotássioMFO OxidasesdeFunçãoMistaNa acet acetatodesódioPNPA 4-nitrofenilacetatoPTN proteínasTMBZ 3,3,5,5dihidrocloretodetetrametilbenzidina


2. ABREVIATIONS

ACE AcethylcholinesteraseAChE totalactivityofAcethylcholinesteraseAChI AcethylcholinesteraseactivityinthepresenceofaninhibitorACTH acetylthiocholineiodideBSA bovineserumalbumincit cytochromeCDNB 1-chloro-2,4-dinitrobenzeneDIA o-dianisidine,tetrazotizedDTNB 5,5’-Dithiobis(2-nitrobenzoicacid)EST EsteraseGSH glutathioneGST Glutathione-S-transferaseH2O2 hydrogenperoxidek phosph potassiumphosphateMFO MixedFunctionOxidasesNa acet sodiumacetatePNPA p-nitrophenylacetatePTN proteinsTMBZ 3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidinedihydrochloride


3. EQUIPAMENTOS E REAGENTES

3.1. Equipamentos

n Máquinadeproduzirgelo(emflocos)n Sistemadepurificaçãodeágua(graureagente)n MicrocentrífugaparatubostipoEppendorfn Espectrofotômetro,leitordemicroplacas(Versa-Max,daMolecularDevices)n Pipetasmonocanal,P20,P200eP1000,volumesvariáveisn Pipetamulticanal(12canais),5a50µln Pipetamulticanal(12canais),30a300µlou50a300µln pHmetron Balançaanalítican Geladeiran Congeladora-20ºCn Congeladora-80ºCn Agitadormagnético

3.2. Vidraria e plásticos

n Becheresde20–25–150–600–1000mln Garrafas(depreferênciatransparentes)de500e1000mln Provetasde10–50–100–500–1000mln TubostipoFalconde15e50mln Reservatóriosdereagentesparapipetasmulticanal(Sigma–nºcat.:R1525).n microplacas de 96 poços, com fundo em U e capacidadede 300µl da NUNC (ThomasScientificnºcat.:6106U07)n Ponteirasparapipetasautomáticasmonoemulticanal


3. EQUIPMENT AND REAGENTS

3.1. Equipment

n Icemachine(flakedice)n Water purification system (reagent grade water)Waterpurificationsystem(reagentgradewater)n Microcentrifuge for Eppendorf tubesMicrocentrifugeforEppendorftubesn Microplates spectrophotometer (Versa-max, Molecular Devices)Microplatesspectrophotometer(Versa-max,MolecularDevices)n Single channel pipettes, P20, P200 and P1000, variable volumesSinglechannelpipettes,P20,P200andP1000,variablevolumesn Multichannelpipette(12channels),5to50µln Multichannelpipette(12channels),30to300µlor50to300µln pHMetern Analytical balanceAnalyticalbalancen RefrigeratorRefrigeratorn Freezer -20�CFreezer-20�Cn Freezer -80�CFreezer-80�Cn Magneticstirrer

3.2. Glassware and plasticware

n Beakers(volumes:20– 25 – 150 – 600 – 1000 ml)– 25 – 150 – 600 – 1000 ml)25– 150 – 600 – 1000 ml)– 150 – 600 – 1000 ml)150– 600 – 1000 ml)– 600 – 1000 ml)600– 1000 ml)– 1000 ml)1000ml)n Bottles (preferably transparent)(volumes: 500 and 1000 ml)Bottles(preferablytransparent)(volumes:500and1000ml)n Graduated cylinders (volume: 10 – 50 – 100 – 500 – 1000 ml)Graduatedcylinders(volume:10– 50 – 100 – 500 – 1000 ml)– 50 – 100 – 500 – 1000 ml)50– 100 – 500 – 1000 ml)– 100 – 500 – 1000 ml)100– 500 – 1000 ml)– 500 – 1000 ml)500–1000ml)n Falcon Tubes (volumes: 15 and 50 ml)FalconTubes(volumes:15and50ml)n Pipetting reservoir (Sigma – nº cat: R1525)Pipettingreservoir(Sigma–nºcat:R1525)n 96-well NUNC microplates, round-bottom, well volume: 300 µl96-wellNUNCmicroplates,round-bottom,wellvolume:300µl (ThomasScientificcatnº:6106U07)n Tips for single and multichannel automatic pipettesTipsforsingleandmultichannelautomaticpipettes

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3.3. Miscelânea

n Aparatoparafiltraçãodesoluçõesn Homogeneizador Usamoshomogeneizadorelétrico,compedal.Homogeneizadorapilhatambém podeserusadocomomesmobastão.

3.4 Reagentes1

3.4.1. reagentes de uso geral para os testes

Ostampõesfosfatopodemserfeitoscomfosfatosanidroouhidratados,desdequesejamconsideradosospesosmolecularesdosreagentesoriginais.Todososreagenteslistadosacimadevemserestocadosàtemperaturaambiente.

�UsodeumamarcaregistradanãoimplicaendossopeloMinistériodaSaúde,masobjetivaapenasauxiliarnaidentificaçãodeumdeterminadoproduto.Ousodereagentesdeoutrosfabricantesdeveserprecedidoportestesdeavaliação.

reagente origem n° catálogo quantidade

Acetato de sódio, anidro Sigma S-2889 1 Kg

Fosfato de potássio monobásico, anidro Sigma P-5379

500 gFosfato de potássio bibásico, anidro Sigma P-3786

Fosfato de potássio bibásico, trihidratado Sigma P-5504

Fosfato de sódio monobásico, anidroSigma S-5011 1 Kg

Sigma S-0751 500 g

Fosfato de sódio bibásico, anidro Sigma S-5136 1 Kg

Homogeneizador elétrico com pedal.

Página ao lado: homogeneizador a pilha


3.3. Miscellaneous

n Filtration systemFiltrationsystemn HomogenizerHomogenizer Weuseanelectrichomogenizer,withpedal.Abatteryhomogenizeralsocan beemployed.Thesamepestlecanbeusedinbothcases.

3.4 Reagents1

3.4.1. reagents of general use

reagent manufacturer cat n° quantity

Sodium acetate, anhydrous Sigma S-2889 1 Kg

Monobasic potassium phosphate, anhydrous Sigma P-5379

500 gBibasic potassium phosphate, anhydrous Sigma P-3786

Bibasic potassium phosphate, tri-hidrated Sigma P-5504

Monobasic sodium phosphate, anhydrousSigma S-5011 1 Kg

Sigma S-0751 500 g

Bibasic sodium phosphate, anhydrous Sigma S-5136 1 Kg

Phosphatebufferscanbepreparedwithanhydrousorhydratedphosphates,provid-ingthemolecularweightoftheoriginalreagentsisconsidered.Allthereagentslistedabovecanbestoredatroomtemperature.

� UseoftrademarknamesdoesnotimplyendorsementbytheHealthMinistrybutisintendedonlytoassistinidentificationofaspecificproduct.Useofreactivesfromothermanufacturersshouldbeprecededbyevaluationtests.

Battery homogenizer. Facing page: electric homogenizer, with pedal


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3.4.2. reagentes específicos


3.4.2. specific reagentsen

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7.3

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6.5

.


4. PREPARAÇÃO DOS MOSQUITOS PARA TESTE

4.1. Congelamento

a) Sãousadasfêmeasadultasdeumdiadeidade(0a24horasapósemergência),NÃOalimentadascomsangue2.

b) Asfêmeasdaspopulaçõesaseremtestadassãocolocadas,aindavivas,emtubostipoEppendorf,emgruposde40-50.Fêmeasdeumalinhagemdereferência,sus-ceptívela inseticidas,usadascomocontrole internodosensaios, sãocolocadasnostubostipoEppendorfemgruposdesete(7).

c) Ostubossãocongeladosimediatamente(fêmeas ainda vivas)a-70ºC3.d) Quandodautilização (Seção 4.2, c), retiraros tubosnecessáriosdocongelador

paraprocessamento, imediatamente antes do uso.Colocarnogelo.Nãoé reco-mendávelrecongelarmosquitosexcedentes.

4.2. Homogeneização

a) Distribuir45tubostipoEppendorf,numerados,sobreumabaciacomgelo.b)Adicionar30µldeáguaacadatubo.Usar,preferencialmente,águatipoMilli-Q4.c) Retirardocongeladorumtubocom45-50mosquitosfêmeadapopulaçãoaser

testadaeumtubocomsetesusceptívelainseticidas.d) Espalharosmosquitossobreumabaciaplástica(ouumaplacadePetri),colocada

diretamentesobreogelo.e) Distribuirosmosquitosnostubosnumerados(umportubo).Nostubos1a40

coloqueosmosquitosdapopulaçãoasertestadaenostubos41-45,mosquitoscontrole,deumacepareferência,susceptível.

�DeacordocomomanualdaOMS(Hemingway 1998),nãoserecomendausarmosquitosqueforamdiretamenteexpostosaospesticidasantesdemorrer.�DeacordocomomanualdaOMS(Hemingway 1998),insetosquemorreramhámaisquealgunsminutos(eforammanti-dosàtemperaturaambiente)têmníveisdeenzimasseriamentereduzidos.�NãoestoquenemautoclaveáguaMilli-Q.Águadeosmosereversa(Milli-RO)tambémpodeserusada.

26 |

4. PREPARING MOSQUITOES

4.1. Freezing

a)Useone-dayold(0-24hoursafteremergence)adultfemales,NONbloodfed2.b)FemalesfromthepopulationstobetestedareplacedstillaliveinsideEppendorf

tubes in pools of 40-50. Females of an insecticide susceptible reference strain,usedasinternalcontrolsoftheassays,arestoredingroupsofseven(7).

c)Tubes containing mosquitoes are immediately frozen (females still alive) at-70ºC3.

d)Whennecessary,removetubesfromthefreezerimmediately before use (Section

4.2, c).Maintainthetubesiced.Itisnotrecommendedtore-freezetheremain-ingmosquitoes.

4.2. Homogenization

a)Distribute45numberedEppendorftubesinabasincontainingice.b)Add 30 µl of water to each tube. Use preferably reagent grade water (ex:

Milli-Q)4.c)Removeonetubecontaining45-50mosquitoestobetestedandonetubewiththe

insecticidesusceptiblemosquitoesfromthefreezer.d)Spreadmosquitoesoveraplasticbasin(oraPetridish),directlyplacedoverice.e)Putonemosquito ineachnumberedtube,1-40correspondingtomosquitoes

fromthepopulationtobetestedand41-45,susceptiblemosquitoes,fromthereferencestrain.

�AccordingtotheWHOhandbook(Hemingway 1998),itisnotrecomendedtousemosquitoesthatweredirectlyexposedtopesticides.�AccordingtotheWHOhandbook(Hemingway 1998),deadinsectskeptatroomtemperatureformorethansomeminuteshaveenzymelevelsseriouslyreduced.�DonotstoreneitherautoclaveMilli-Qwater.Reverseosmosispurifiedwatercanalsobeused.


f) Homogeneizarcadamosquito5,6.Seguiraordemdanumeraçãodostubos.Manter os tubos no gelo durante todo o procedimento7.

g)Adicionar270µldeáguaacadatubo.NÃOaplicarnaparede,esimpelomeio,de forma a favorecer a mistura. Seguir a ordem de numeração dos tubos (1 a45).Comisso,quandosechegaaoúltimotubo,osrestoscelularesdasamostrasiniciaisjáestarãodecantados.Apartirdaípode-seiniciaradistribuiçãodasalí-quotasparaostestesdeAcetilcolinesterase(ACE)edasOxidasesdeFunçãoMista(MFO)(Seções 5.1 e 5.2).

h)Antes de centrifugar os homogenatos, separar quatro alíquotas, de 25 µl cada,paradosagemdeACE;cadapardealíquotasemumaplacade96poçosdiferente(verSeção 4.3.2)8.

i) Aindaantesdecentrifugar,transferirmaisduasalíquotas,de20µlcada,paraumaplacade96poços,paraquantificaçãodeMFO8.

j) Centrifugarorestante(~160µl)a12.000gpor60segundos9,10.k) Voltarcomostubosdacentrífugaparaabaciacomgelo.Manterostubosnogelo

durantetodaadistribuiçãodoshomogenatos,deformaareduzirproteólise11.l) Transferir,paraumaplacanovade96poços(a“placadosmosquitos”,Seção

4.3.1),aproximadamente130-150µldosobrenadantedecadahomogenato12.Apartirdesseponto,adistribuiçãodasalíquotaséfeitacomauxíliodepipetasmulticanal.

�Homogeneizadoresautomáticossãobastanteeficientes.Usamosumequipamentodebancada,adaptado,compedal.Homo-geneizadoresportáteis,movidosapilha,tambémsãoindicados(Seção 3.3).�Cadamosquitoéhomogeneizadoporaproximadamente5-10segundos.Depoisdecadahomogeneização,obastãoélavadoemumBecherde100mldecapacidade,contendo50mldeágua,aproximadamente.Amesmaamostradeáguaéusadaparatodooprocedimento.Depoisdecadalavagem,obastãoésecocomguardanapodepapel(tipoKleenex).�A partir da homogeneização, é importante que os procedimentos sejam executados rapidamente.�Cuidadoparanãoressuspenderodecantado.Eviteretirarmaterialdofundodotubo.�DeacordocomomanualdaOMS(Hemingway 1998),acentrifugaçãoéimportanteprincipalmenteparaaGST(partículasinterferemcomaabsorçãoa340nm,verSeção 5.6).�0Oidealéusarcentrífugarefrigerada.Nasnãorefrigeradas,nãousartemposmaioresque2minutos.Usamosmini-centrífu-gatipoEppendorfnavelocidademáxima.��DeacordocomomanualdaOMS(Hemingway 1998),congelamentoa-20ºCimediatamenteapósahomogeneizaçãomantématividadedaenzimarelativamenteconstanteporváriashoras.Contudo,emnossaexperiênciaéimportanterealizarotesteomaisrapidamentepossível.��Serãousados,nototal,110µldecadahomogenatoparaasdosagensadicionais(alémdaAcetilcolinesteraseeMFO,cujosvolumesestãoespecificadosnasletrashei).

Detalhe de homogeneização de

mosquito individual com homogeneizador elétrico


f) Homogenizeeachmosquito5,6,followingthenumbersdefinedforthetubes.Keep tubes iced during the whole homogenization procedure7.

g)Add270µlofwatertoeachtube.DONOTpipetteonthetubewall:ifyoupipetteinthemiddleofthetube,mixingwillbefavored.Respectthenumbersdefinedforthetubes(1-45).Inthisway,whenthelasttubeisattained,thecelldebrisfromthefirstsampleswillalreadyhavesunktothebottomofthetube.YoucannowstartthedistributionofaliquotstotheAcethylcholinesterase(ACE)andMixedFunc-tionOxidases(MFO)assays(Sections 5.1 and 5.2).

h)Beforecentrifugation,removefouraliquots,25µleach,toquantifyACE;eachpairofaliquotsinoneseparate96-wellmicroplate(seeSection 4.3.2)8.

i) Beforecentrifugation,transfertwoadditionalaliquots,20µleach,toone96-wellmicroplate,inordertoquantifyMFO8.

j) Centrifugetheremaininghomogenate(~160µl)at12.000gfor60seconds9,10.k)Removetubesfromthecentrifugeandtransfertothebasincontainingice.Keep

tubesonicewhileyoudistributethehomogenates,inordertoreduceproteolysis11.l) Transfertoanew96-wellmicroplate(the“mosquitoplate”,Section 4.3.1),about

130-150 µl of the supernatant from each homogenate12. From this point on, amulti-channelpipettecanbeusedtodistributethealiquots.

�Automatichomogenizersareveryefficient.Weuseanadaptedbenchequipment,withpedal.Portablehomogenizers,bat-tery-operated,arealsoindicated(Section 3.3).�Eachmosquitoishomogenizedduring5-10seconds,approximately.Afterhomogenizingeachmosquito,thepestleiswa-shedina100mlcapacityBeaker,containing50mlwater.WaterintheBeakerisnotchangedduringalltheprocedure.Aftereachwashing,thepestleisdriedwithaKleenex.� Once you started the homogenization, it is important to proceed quickly.�Avoidtoressuspendandtoremovethedecantedmaterialatthebottomofthetube.�AccordingtotheWHOhandbook(Hemingway 1998),thecentrifugationstepisimportantmainlytotheGSTdosage(particlescaninterferewithabsorptionat340nm,seeSection 5.6).�0Ideallyusearefrigeratedcentrifuge.Ifonlynon-refrigeratedcentrifugesareavailable,donotcentrifugeformorethan2minutes.WeuseamicrocentrifugeforEppendorftubes,atmaximumspeed.��AccordingtotheWHOhandbook(Hemingway 1998),freezingat-20ºCimmediatelyafterthehomogenizationprocedurekeepsenzymeactivityrelativelyconstantforseveralhours.However,inourexperience,itisimportanttoperformthetestasquicklyaspossible.��Atotalof110µlofeachhomogenatewillbeneededintheremainingquantifications(besidesAcethylcholynesteraseandMFO,alreadydiscriminated,itemshandi).

Facing page: homogenization detail of an individual mosquito, with an electric homogenizer


4.3. Distribuição de homogenatos nas placas

4.3.1. preparo da “placa de mosquitos”

Parafacilitarostestes,130-150µldossobrenadantesdoshomogenatosdemosquitosindividuaissãotransferidosdostubostipoEppendorfparaumaplacade96poços(semprenogelo),naseguinteordem13:

m = mosquito da população a ser testadaR = mosquito da cepa referência, susceptível a inseticidas

��Estadistribuiçãopermitequeamesmaplacasejautilizadaparadoistestesdiferentes:noprimeirotestesãousadasaslinhasA-Denosegundo,aslinhasE-H.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12

B m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24

C m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36

D m37 m38 m39 m4 0 R41 R42 R43 R44 R45

E

F

G

H

Transferência dos sobrenadantes de homogenatos de mosquitos para a “placa de mosquitos”


4.3. Distribution of the homogenates in the microplates

4.3.1. preparing the “mosquito plate”

Tospeedupthetests,130-150µlofthesupernatantfromthehomogenatesofindi-vidualmosquitoesaretransferedfromtheEppendorftubestoa96-wellmicroplate(alwaysontheice),inthefollowingorder13:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12

B m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24

C m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36

D m37 m38 m39 m40 R41 R42 R43 R44 R45

E

F

G

H

m = mosquito from the population to be testedR = mosquito from the insecticide susceptible reference strain

��Thisdistributionenablestheuseofthesamemicroplateintwotests:linesA-DadlinesE-H.

Facing page: transfer of mosquito homogenate supernatants to the “mosquito plate”


4.3.2. distribuição de amostras nas placas-teste

Separar,parateste,emcinco(5)placasdiferentes,alíquotasdehomogenato,emdu-plicata,comosegue:

enzima alíquotas

GST 2 X 15 µl

Esterase alfa 2 X 10 µl

Esterase beta 2 X 10 µl

Esterase “PNPA” 2 X 10 µl

Proteínas totais 2 X 10 µl

Distribuirasalíquotasdehomogenatosdeacordocomomodeloabaixo:

m = mosquito da população a ser testadaR = mosquito da cepa referência, susceptível a inseticidasb = branco (controle negativo)c = controle positivo14

��Noscasosemquenãohácontrolepositivo,osseispoços(G10aG12eH10aH12)sãopreenchidoscomobrancos(verSeção 5).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12

B m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12

C m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24

D m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24

E m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36

F m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36

G m37 m38 m39 m40 R41 R42 R43 R44 R45 b b b

H m37 m38 m39 m40 R41 R42 R43 R44 R45 c c c

Antes da centrifugação, alíquotas de homogenatos de mosquitos são transferidas para as placas de 96 poços, para quantificação de ACE e MFO


4.3.2. distributing samples in the test microplates

Preparefive(5)differentmicroplates,containingthefollowingamountsofmosquitohomogenate,induplicatesamples:

enzyme aliquots

GST 2 X 15 µl

alpha-Esterase 2 X 10 µl

beta-Esterase 2 X 10 µl

“PNPA” Esterase 2 X 10 µl

Total proteins 2 X 10 µl

Distributethehomogenatealiquotsaccordingtothemodelbelow:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12

B m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12

C m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24

D m13 m14 m15 m16 m17 m18 m19 m20 m21 m22 m23 m24

E m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36

F m25 m26 m27 m28 m29 m30 m31 m32 m33 m34 m35 m36

G m37 m38 m39 m40 R41 R42 R43 R44 R45 b b b

H m37 m38 m39 m40 R41 R42 R43 R44 R45 c c c

m = mosquito from the population to be testedR = mosquito from the insecticide susceptible reference strainb = blank (negative control)c = positive control14

��Whennopositivecontrolisavailable,the6wells(G10toG12andH10toH12)areusedasblanks(seeSection 5).

Facing page: before centrifugation, mosquito homogenate aliquots are transferred to 96-well microplates in order to quantify ACE and MFO


5. TESTES ENZIMÁTICOS

Cadatesteésempreexecutadoporduaspessoasaomesmotempo,paraotimizaroprocesso.NÃOrecomendamosqueotestecompleto(detodasasenzimassimultane-amente,45mosquitos)sejaexecutadoporumasópessoa.Otesteparacadaenzimatemumprotocoloeumtempodereaçãodiferente.Nolabo-ratório,definimosumaordemdeexecuçãoquefacilitaotesterápidoesematropelosdetodasasenzimas:1)OxidasesdeFunçãoMista15

2)Acetilcolinesterase3)Esterase-alfa15

4)Esterase-beta15

5)dosagemdeproteínas6)curva-padrãodeproteína16

7)Esterase“PNPA”8)Glutationa-S-transferaseComexceçãodaquantificaçãodeatividadedeMFOeACE,quedevemseraspri-meiras enzimasa serem testadas, aordemacimanãoéobrigatória,devendocadalaboratóriodeterminarofluxodetrabalhomaisadequadoàsuarotina.

��Alémdostestescomasenzimas,sãorealizadascurvas-padrãocomsubstratosdasMFOedasEsterasesalfaebeta.Estascurvassãoutilizadasparaconversãodosvaloresdeabsorbânciaematividadeespecíficadasenzimas.Emnossarotinalaboratorial,optamosporrefazerascurvas-padrãocomossubstratosdestasenzimastodavezqueiniciamosumanovabateriadetestescomaspopulaçõesdecampo(10a20populações).Usamos como base para cálculo a média de pelo menos três curvas-padrão.��Umanovacurva-padrãodeproteínaéfeitaacadateste.Emborapossaserfeitaaqualquertempoduranteoteste,recomen-da-sequesejarealizadajuntocomadosagemdeproteínas.


5. ENZYMATIC TESTS

Inordertooptimizetheprocedure,eachtestisalwaysperformedsimultaneouslybytwopersons.WeDONOTrecommendthatacompletetest(45mosquitoes,allen-zymessimultaneously)bedonebyjustoneperson.Thetestforeachenzymehasadifferentprotocolandadifferentreactiontime.Inthelaboratorywedefinedanoptimizedsequenceforallthereactions:1)MixedFunctionOxidases15

2)Acethylcholinesterase3)alpha-Esterase15

4)beta-Esterase15

5)totalproteins6)proteinstandardcurve16

7)“PNPA”Esterase8)Gluthatione-S-transferaseThissequenceofreactionsisnotobligatory,excludingMFOandACEthatarethefirstenzymestobequantified.Eachlaboratoryshoulddefinethesequenceofreac-tionsmostconvenientforitsroutine.

��Inadditiontothequantificationofthisenzyme,itisnecessarytodostandardcurveswiththesubstratesofMFOandalpha-andbeta-Esterases.Thesecurvesarenecessarytotheconversionofabsorbancevaluesinthespecificactivityofeachenzyme.Inourroutine,weoptedtoconstructnewstandardcurveseachtimeanewbatchoftestswithfieldpopulationsstarts(10-20populations).We take into account the mean of at least three standard curves.��Anewproteinstandardcurveisdoneateachtest.Itcanbedoneatanymomentduringthetest.However,itisrecomendedthatitisperformedtogetherwiththeproteindosageofthemosquitohomogenates.

| 35

5.1. Acetilcolinesterase (ACE)

Atabelaabaixodiscriminaassoluçõesnecessáriasparaesteteste.Paraconsultasobreosdetalhesdapreparação,consulteaSeção 6.1.

a)Distribuir25µldehomogenato,antes da centrifugação,emduplicata,emduasplacas. Uma placa receberá o nome de “AChE” e a outra, de “AChI”. Na placaAChEmede-seaatividadetotaldeAcetilcolinesterase.NaplacaAChImede-seaatividadedestaenzimaquandonapresençadeuminibidor.Oinibidorutilizadoépropoxur,carbamatoindicadoparaestafinalidadepelomanualdaOMS(Hemin-

gway 1998).b)Nospoçoscorrespondentesaos “brancos” (6poços:G10aG12eH10aH12),

adicionar25µldeágua.c)Adicionar,emcadapoço,145µldeTriton/Nafosfato.d)Adicionar,emcadapoço,10µlDTNB/Nafosfato.e)Adicionar,naplacaAchE,emcadapoço,25µldasoluçãoAchE.f) Adicionar,naplacaAchI,emcadapoço,25µldasoluçãoAchI. (o volume final em cada poço é de 205 µl)g) Fazeraleitura(end point),apósumahora,dasduasplacas(AchEeAchI),a405nm.

n° soluçãoquantidade por teste

observaçõesqto se gasta qto se prepara

1 Triton/Na fosfato 29 ml 500 ml em estoque

2 DTNB/Na fosfato 2 ml 3 ml

preparar antes do teste3 AChE 2,5 ml 3 ml

4 AChI 2,5 ml 3 ml

Distribuição de homogenatos de mosquitos nas placas para teste de ACE. Página ao lado: detalhe da coloração resultante do teste ACE, nas placas AChE (painel da esquerda) e AChI (painel da direita), respectivamente com e sem propoxur. B: branco


5.1. Acethylcholinesterase (ACE)

� eTable below discriminates the solutions necessary for this test. More details re-lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.1.

n° solutionquantity per test

observationsquantity used quantity prepared

1 Triton/Na phosphate 29 ml 500 ml in stock

2 DTNB/Na phosphate 2 ml 3 ml

freshly prepared3 AChE 2.5 ml 3 ml

4 AChI 2.5 ml 3 ml

a) Distribute 25 µl of the homogenates, before centrifugation, in duplicate, in twomicroplates. One plate is named “AChE” ad the other “AChI”. In the AChE platethe total activity of Acethylcholinesterase is quanti�ed. In plate AChI the re-maining activity of this enzyme, in the presence of an inhibitor, is measured.Propoxur is the inhibitor utilized, carbamate indicated by the WHO handbook(Hemingway 1998).

b) In the “blank” wells (6 wells: G10 to G12 and H10 to H12), add 25 µl of water.c) Add to each well 145 µl o Triton / Na phosphate.d) Add to each well 10 µl DTNB / Na phosphate.e) Add to each well of the plate AchE 25 µl of the solution AchE.f) Add to each well of the plate AchI 25 µl of the solution AchI. (the �nal volume in each well is 205 µl)g) Read the absorbance of both plates (AchE and AchI), at 405 nm a�er 1 hour (“end

point”).

Resulting color of ACE assay, in the AChE (left panel) and AChI (right panel) plates, respectivelywith and withoutpropoxur. B: blank. Facingpage: mosquitohomogenatedistribution in the microplates for ACE testROCKROCK


5.2. Oxidases de Função Mista (MFO)

Estanãoéumamedidadeatividadeenzimática,esimumaquantificaçãodogru-pamentoheme,que,eminsetosnãoalimentadoscomsangueestá,emsuamaioria,associadoaocitocromoP450(verSeção 9.3).Atabelaabaixodiscriminaassoluçõesnecessáriasparaesteteste.Paraconsultasobreosdetalhesdapreparação,consulteaSeção 6.2.

a)Distribuir20µldehomogenato,antesdacentrifugação,emduplicata,emumaplaca.

b)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaos“brancos”(trêspoços:G10aG12)adicionar20µldetampãoKfosf.

c)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaoscontrolespositivos(trêspoços:H10aH12),adicionar20µldesoluçãodecitocromoC(totalgastoporteste:0,2ugdecitocromoC)17.

d)Adicionar,emcadapoço,60µldetampãoKfosf.e)Adicionar,emcadapoço,200µldesoluçãodetrabalho:TMBZ/Naacet.f) Adicionar,emcadapoço,25µlH2O2a3%(*). (o volume final em cada poço é de 305 µl)g) Incubarpor90minutosàtemperaturaambienteeaoabrigodaluz.h)Fazeraleitura(end point)a650nm.

��AconcentraçãodecitocromoCusadanocontrolepositivofoicalibradaemfunçãodacurva-padrão,estandonafaixadelinearidade.Érecomendávelobservarsempreovalordeabsorbânciadocontrolepositivo,queébastanteestávelemtestessucessivos.Recomenda-serepetiracurva-padrãoseosvaloresobservadosparaocitocromoCestiveremmuitoalteradosemrelaçãoaoqueseobservageralmente.

Distribuição de homogenatos de mosquitos na placa para quantificar MFO (painel da esquerda) e distribuição de reagente com o uso de pipeta multicanal (painel da direita). Página ao lado: detalhe da coloração resultante do teste MFO. B: branco; C: controle positivo



1 K fosf 90 mM, pH 7,2 6 ml 500 mlem estoque

2 citocromo C 0,01 mg/ml 60 µl 5 ml

3 TMBz/Na acet 20 ml 24 mlpreparar antes do teste

4 H2O2 a 3% 2,5 ml 3 ml


Resulting color of MFO assay. B: blank; C: positive control. Facing page: mosquito homogenate distribution for MFO test (left panel) and distribution of reagents using a multichannel pipette (right panel)

5.2. Mixed Function Oxidases (MFO)

� istest does not measure the enzymatic activity. It quanti�es the heme group that,in non blood-fed insects, is mainly associated with cytochrome P450 (see Section 9.3

for details).� eTable below discriminates the solutions necessary for this test. More details re-lated to the preparation of solutions are shown in Section 6.2.



1 90 mM K phosph, pH 7.2 6 ml 500 mlin stock

2 0.01 mg/ml cytochrome C 60 µl 5 ml

3 TMBZ/Na acet 20 ml 24 mlfreshly prepared

4 3% H2O2 2.5 ml 3 ml

a) Distribute 20 µl of the homogenates, before centrifugation, in duplicate, in onemicroplate.

b) In the “blank” wells (3 wells: G10 to G12), add 20 µl of K phosph.c) In the “positive control” wells (3 wells: H10 to H12), add 20 µl of the solution

cytochrome C (total per test: 0.2 ug cytochrome C)17.d) Add to each well 60 µl K phosph bu�er.e) Add to each well 200 µl of the working solution: TMBZ/Na acet.f) Add to each well 25 µl of 3% H2O2 (*).(the �nal volume in each well is 305 µl)g) Incubate at room temperature and protected from light during 90 minutes.h) Read the absorbance at 650 nm (“end point”).

17 � econcentration of cytochrome C used in the positive control was calibrated according to the standard curve and it isincluded in its linearity range. It is recommended to frequently observe the absorbance value of the positive control, generallyvery stable among successive tests. It is recommended to repeat the standard curve if the values observed for the cytochromeC are very di�erent from the usual ones.

ROCK


5.2.1. curva-padrão de citocromo C

Emnossarotinalaboratorial,optamosporrefazeracurvatodavezqueexaminamosumanovabateriadetestescomaspopulaçõesdecampo.Consideramos,comobaseparacálculodecoeficienteangular,aserutilizadonaconversãodeabsorbânciaparaugdesubstrato(Seção 9.3),ovalordamédiadepelomenostrêscurvas-padrão.Adicionar,emduplicata,namesmalinhadeumaplaca,asseguintesquantidadesdecitocromoC,naconcentraçãode0,01mg/ml:

µg cit C µl cit C (0,01 mg/ml) µl k fosf

0,0 – 80

0,01 1 79

0,02 2 78

0,05 5 75

0,1 10 70

0,2 20 60

Procedercomoparaadosagemnasamostras–Seção 5.1, e – h.

5.3. Esterase alfa (a-EST)


a)Distribuir10µldehomogenato,depois da centrifugação,emduplicata,emumaplaca.

b)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaos“brancos”(trêspoços:G10aG12)adicionar10µldeágua.



1 alfa-naftol (controle positivo) 30 µl 5 ml em estoque

2 alfa-naftil acetato/Na fosfato 20 ml 25 mlpreparar antes do teste

3 Fast Blue 10 ml 15 ml


5.2.1. cytochrome C standard curve

Inourlaboratoryroutine,weoptedtodeviseanewstandardcurveforeverynewbat-teryoftestswithfieldpopulations.Weconsiderthemeanofatleastthreestandardcurvesasabasistocalculatetheangularcoefficientthatisutilizedintheconversionofabsorbancetoµgsubstrate (Section 9.3).Add,induplicate,inthesamelineofamicroplate,thefollowingquantitiesof0.01mg/mlcytochromeC:

µg cit C µl cit C (0.01 mg/ml) µl k phosph

0.0 – 80

0.01 1 79

0.02 2 78

0.05 5 75

0.1 10 70

0.2 20 60

Proceedexactlyastothequantificationofmosquitosamples–Section 5.1, e – h.

5.3. alpha-Esterase (a-EST)

TheTablebelowdiscriminatesthesolutionsnecessaryforthistest.Moredetailsre-latedtothepreparationofsolutionsareshowninSection 6.3.



1 alpha-naphthol (positive control) 30 µl 5 ml in stock

2 alpha-naphthyl acetate/Na phosphate 20 ml 25 mlfreshly prepared


a)Distribute10µlofthehomogenates,after centrifugation,induplicate,inonemi-croplate.

b)Inthe“blank”wells(3wells:G10toG12)add10µlofwater.


c)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaoscontrolespositivos(trêspoços:H10aH12),adicionar10µldesoluçãodealfa-naftola0,5µg/µl(~3,5nmoles/µl)emcadapoço(total:5µgou~35nmoles)18,19.

d)Adicionar,emcadapoço,200µldealfa-naftilacetato/Nafosfato.e) Deixar15minutosàtemperaturaambiente.f) Adicionar,emcadapoço,50µldeFastBlue.Estasoluçãoépreparadaemquan-

tidadesuficienteparaaquantificaçãodealfaebeta-Esterases(gasta-se5mlparacadateste).Estasoluçãocontémdetergenteeproduzmuitasbolhas,poristo,pre-para-seumvolumesuperioràqueleefetivamentegasto.Porestemesmomotivo,asagitaçõessãofeitasporinversão(enãonovortex).

Cuidadoaopipetar.(o volume final em cada poço é de 260 µl)g)Esperar5minutosàtemperaturaambiente.h)Fazeraleitura(end point),a570nm.

��Oscontrolespositivos(alfaebeta-naftol)sãobastanteestáveis.Contudo,éconvenientequealíquotasde50µlsejamconge-ladas(-20ºC),edescongeladasumaúnicavez.��Aconcentraçãodealfaedebeta-naftolusadanocontrolepositivo(0,5µg/µl)foicalibradaemfunçãodacurva-padrão,estandonafaixadelinearidade.Érecomendávelobservarsempreovalordeabsorbânciadocontrolepositivo,queébastanteestávelemtestessucessivos.Recomenda-serepetiracurva-padrãoseosvaloresobservadosparaoscontrolespositivosestive-remmuitoalteradosemrelaçãoaoqueseobservageralmente.

Distribuição de homogenatos de mosquitos nas placas para teste de a-EST e b-EST. Página ao lado: detalhe da coloração resultante do teste a-EST. B: branco; C: controle positivo


c) In the “positive control” wells (3 wells: H10 to H12), add 10 µl of the solutionalpha-naphthol at 0.5 µg/µl (~ 3.5 nmoles/µl) in each well (total: 5 µg or ~35nmoles)18,19.

d) Add to each well 200 µl of alpha-naphthyl acetate/Na phosphate.e) Incubate at room temperature during 15 minutes.f) Add to each well 50 µl of Fast Blue. Prepare this solution in quantity enough to

the dosage of alpha and beta Esterases (5 ml are used in each test). � issolutioncontains a detergent, and foam is produced during its preparation. For this reasonit is recommended to prepare a volume higher than the volume used. Agitate byinversion (do not use the vortex). Pipette with care.(the �nal volume in each well is 260 µl)

g) Incubate at room temperature during 5 minutes.h) Read the absorbance at 570 nm (end point).

18 � epositive controls, alpha- and beta-naphthol, are stable. However, it is convenient to freeze 50 µl aliquots (-20ºC) andthaw it just once.19 � econcentration of alpha- and beta-naphthol used in the positive control (0.5 µg/µl) was calibrated according to thestandard curve and it is included in its linearity range. It is recommended to frequently observe the absorbance value of thepositive control, generally very stable among successive tests. It is recommended to repeat the standard curve if the valuesobserved for the positive controls are very di�erent from the usual ones.

Resulting color of -ESTassay. B: blank; C: positive control. Facing page: mosquito homogenate distribution for -EST and -EST tests


5.3.1. curva-padrão de alfa-naftol

Adicionar,emduplicata,namesmalinhadeumaplaca,asseguintesquantidadesdealfa-naftola0,5mg/ml:

µg alfa-naftol µl alfa-naftol (0,5 mg/ml) µl H2O

0 – 10

1 2 8

2 4 6

3 6 4

4 8 2

5 10 –

Procedercomoparaadosagemnasamostras–Seção 5.3, d – h.

5.4. Esterase beta (b-EST)



b)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaos“brancos”(trêspoços:G10aG12)adicionar10µldeágua.

c)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaoscontrolepositivos(trêspoços:H10aH12),adicionar10µldesoluçãodebeta-naftola0,5µg/µl(~3,5nmoles/µl)emcadapoço(total:5µgou~35nmoles).

d)Adicionar,emcadapoço,200µldebeta-naftilacetato/Nafosfato.e) Deixar15minutosàtemperaturaambiente.f) Adicionar,emcadapoço,50µldeFastBlue.Comomencionadonaseçãoanterior,

estasoluçãoépreparadaemquantidadesuficienteparaaquantificaçãodealfaebeta-Esterases.Cuidadoaopipetar.

(o volume final em cada poço é de 260 µl)



1 beta-naftol (controle positivo) 30 µl 5 ml em estoque

2 beta-naftil acetato/Na fosfato 20 ml 25 mlpreparar antes do teste


Página ao lado: Coloração resultante do teste para b-EST. B: branco; C: controle positivo


5.3.1. alpha-naphthol standard curve

Add, in duplicate, in the same line of a microplate, the following quantities of 0.5mg/ml alpha-naphthol:

µg alpha-naphthol µl alpha-naphthol (0.5 mg/ml) µl H2O

0 – 10

1 2 8

2 4 6

3 6 4

4 8 2

5 10 –

Proceed exactly as to the quanti�cation of mosquito samples – Section 5.3, d – h.

5.4. beta-Esterase (-EST)




1 beta-naphthol (positive control) 30 µl 5 ml in stock

2 beta-naphthyl acetate/Na phosphate 20 ml 25 mlfreshly prepared


a) Distribute 10 µl of the homogenates, a�er centrifugation, in duplicate, in one mi-croplate.

b) In the “blank” wells (3 wells: G10 to G12) add 10 µl of water.

Resulting color of -ESTassay. B: blank; C: positive control

ROCK


g) Esperar 5 minutos à temperatura ambiente.h)Fazeraleitura(end point),a570nm.

5.4.1. curva-padrão de beta-naftol

Adicionar,emduplicata,namesmalinhadeumaplaca,asseguintesquantidadesdebeta-naftola0,5mg/ml:

µg beta-naftol µl beta-naftol (0,5 mg/ml) µl H2O

0 – 10

1 2 8

2 4 6

3 6 4

4 8 2

5 10 –

Procedercomoparaadosagemnasamostras–Seção 5.4, d – h.

Adição dos reagentes nas placas para quantificação de a-EST e b-EST


c) Inthe“positivecontrol”wells(3wells:H10toH12),add10µlofthesolutionbeta-naphtholat0.5µg/µl(~3.5nmoles/µl)ineachwell(total:5µgor~35nmoles).

d)Addtoeachwell200µlofbetanaphthylacetate/Naphosphate.e) Incubateatroomtemperatureduring15minutes.f) Addtoeachwell50µlofFastBlue.Asmentionedintheprevioussection,this

solutionispreparedinquantityenoughtothedosageofalphaandbeta-Esterases.Pipettewithcare.

(the final volume in each well is 260 µl)g)Incubateatroomtemperatureduring5minutes.h)Readtheabsorbanceat570nm(endpoint).

5.4.1. beta-naphthol standard curve

Add, induplicate, in the same lineofamicroplate, the followingquantitiesof0.5mg/mlbeta-naphthol:

µg beta-naphthol µl beta-naphthol (0,5 mg/ml) µl H2O

0 – 10

1 2 8

2 4 6

3 6 4

4 8 2

5 10 –

Proceedexactlyastothequantificationofmosquitosamples–Section 5.4, d – h.

Facing page: Addition of specific Esterase reagents in 96-well test microplates


5.5. Esterase “PNPA” (PNPA-EST)

A tabela abaixo discrimina a solução necessária para este teste. Para consulta sobre osdetalhes da preparação, consulte a Seção 6.5.

a) Distribuir 10 l de homogenato, depois da centrifugação, em duplicata, em umaplaca.

b) Em cada um dos poços correspondentes aos “brancos” (seis poços: G10 a G12 eH10 a H12) adicionar 10 µl de água.

c) Adicionar, em cada poço, 200 µl de solução de trabalho: PNPA/Na fosfato. (o volume �nal em cada poço é de 210 µl)d) Fazer leitura, por 2 minutos, a intervalos de 15 segundos, a 405 nm. De acordo

com o manual da OMS (Hemingway 1998), este ensaio NÃO pode ser lido como end point.

5.6. Glutationa-S-transferase (GST)

A tabela abaixo discrimina a solução necessária para este teste. Para consulta sobre osdetalhes da preparação, consultar a Seção 6.6.



1 PNPA/Na fosfato 20 ml 25 ml preparar antes do teste



1 GSH/CDNB 20 ml 21 ml preparar antes do teste

Coloração resultante do teste para PNPA-EST. Página ao lado: O teste para GST que não resulta em coloração visível e deve ser lido com filtro UV (340nm). B: branco

ROCK


5.5. “PNPA” Esterase (PNPA-EST)




1 PNPA/Na phosphate 20 ml 25 ml freshly prepared


b) In the “blank” wells (6 wells: G10 to G12 and H10 to H12), add 10 µl of water.c) Add to each well 200 µl of the working solution: PNPA/Na phosphate.

(the �nal volume in each well is 210 µl)d) Read the absorbance at 405 nm, at 15-seconds intervals, during 2 minutes. According to the WHO handbook (Hemingway 1998), this assay must not be read

as “end point”.

5.6. Glutathione-S-transferase (GST)




1 GSH/CDNB 20 ml 21 ml freshly prepared

The GST assay is read with na UV filter (340nm) since its reaction product is not colored. Facing page: Resulting color of PNPA-EST assay. B: blank

ROCK


a)Distribuir 15 µl de homogenato, depois da centrifugação, em duplicata, emumaplaca.

b)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaos“brancos”(seispoços:G10aG12eH10aH12)adicionar15µldeágua.

c)Adicionar,emcadapoço,195µldesoluçãodetrabalho:GSH/CDNB. (o volume final em cada poço é de 210 µl)d)Fazerleitura,por20minutos,aintervalosde1minuto,a340nm.

5.7. Proteínas totais (PTN)


(**)destetotal,parteéusadaparaaconfecçãodacurva-padrãodeBSA:3,6ml(Se-

ção 5.7.1,alternativa1)ou7,2ml(Seção 5.7.2,alternativa2).


b)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaos“brancos”(trêspoços:G10aG12),adicionar10µldeágua.

c)Emcadaumdospoçoscorrespondentesaoscontrolespositivos(trêspoços:H10aH12),adicionar10µldesoluçãodeBSAa1µg/µl(10ugtotais).

d)Adicionar,emcadapoço,300µldoreativo(Bio-Rad)a1:5. (o volume final em cada poço é de 310 µl)e)Fazerleitura,3a5minutosapósaadiçãodereativo,a620nm.



1 BSA 1 µg/µl 30 µl 1 ml em estoque

2 reativo Bio-Rad 30 ml 40 ml (**) preparar antes do teste

Adição do reativo para dosagem de proteína total nos homogenatos de mosquitos. Página ao lado: Coloração resultante do teste para PTN. B: branco; C: controle positivo



b) In the “blank” wells (6 wells: G10 to G12 and H10 to H12) add 15 µl of water.c) Add to each well 195 µl of the working solution: GSH/CDNB.

(the �nal volume in each well is 210 µl)d) Read the absorbance at 340 nm, at one-minute intervals, during 20 minutes.

5.7. Total proteins (PTN)




1 1 µg/µl BSA 30 µl 1 ml in stock

2 Bio-Rad reactive 30 ml 40 ml (**) freshly prepared

(**) part of this quantity is used in the BSA standard curve: 3.6 ml (Section 5.7.1,alternative 1) or 7.2 ml (Section 5.7.2, alternative 2).


b) In the “blank” wells (3 wells: G10 to G12) add 10 µl of water.c) In the “positive control” wells (3 wells: H10 to H12), add 10 µl of 1 µg/µl BSA

(total:10 ug).d) Add to each well 300 µl of the Bio-Rad reactive at 1:5.(the �nal volume in each well is 310 µl)e) Read the absorbance 3 -5 minutes later, at 620 nm.

Resulting color of PTN assay. B: blank; C: positive control. Facing page:Addition of protein reactive to quantify total proteins in mosquito homogenates

ROCK


5.7.1. curva-padrão de proteína – alternativa 1

Estaéacurva-padrãoutilizadarotineiramente.Adicionar,emduplicata,namesmalinhadeumaplaca,comoindicadonaSeção 5.7.3,asseguintesquantidadesdeBSA:

µg BSA µl BSA (*) µl H2O

0 0 10

2,5 2,5 7,5

5 5,0 5

7,5 7,5 2,5

10 10,0 0

15 7,5 2,5

(*) Em todos os casos, utiliza-se solução-estoque de BSA a 1 µg/µl, com exceção do ponto de 15 µg, quando solução a 2 µg/µl é usada.

Procedercomoparaadosagemnasamostras–Seção 5.7, d, e.

Exemplo de leitura de absorbância no espectrofotômetro


5.7.1. protein standard curve – alternative 1

Thisstandardcurveisroutinelyused.Add,induplicate,inthesamerowofamicro-plate,asindicatedinSection 5.7.3,thefollowingquantitiesofBSA:


0 0 10

2.5 2.5 7.5

5 5.0 5

7.5 7.5 2.5

10 10.0 0

15 7.5 2.5

(*) A 1 µg/µl BSA stock solution is used in all cases, except in the point “15 µg”, when a 2 µg/µl BSA solution is used.

Proceedastothequantificationofmosquitosamples–Section 5.7, d, e.

5.7.2. protein standard curve – alternative 2

Thisstandardcurvecanbeusedwhenahigherlevelofdetailisneeded.Add,induplicate,intworowsofamicroplate,asindicatedinSection 5.7.3,thefollowingquantitiesofBSA:


0 0.0 10

1 1.0 9

2 2.0 8

3 3.0 7

4 4.0 6

5 5.0 5

6 6.0 4

7 7.0 3

8 8.0 2

9 9.0 1

10 10.0 0

15 7.5 2.5

(*) A 1 µg/µl BSA stock solution is used in all cases, except in the point “15 µg”, when a 2 µg/µl BSA solution is used.

Proceedastothequantificationofmosquitosamples-Section 5.7, d, e.

Facing page: Example of absorbance reading in the spectrophotometer


5.7.2. curva-padrão de proteína – alternativa 2

Estaéacurva-padrãoquepodeserutilizadanoscasosemquehouvernecessidadedemaiordetalhamentodosvalores.Adicionar,emduplicata,emduaslinhasdeumaplaca,comoindicadonaSeção 5.7.3,asseguintesquantidadesdeBSA:


0 0,0 10

1 1,0 9

2 2,0 8

3 3,0 7

4 4,0 6

5 5,0 5

6 6,0 4

7 7,0 3

8 8,0 2

9 9,0 1

10 10,0 0

15 7,5 2,5

(*) Em todos os casos, utiliza-se solução-estoque de BSA a 1 µg/µl, com exceção do ponto de 15 µg, quando solução a 2 µg/µl é usada.

Procedercomoparaadosagemnasamostras–Seção 5.7, d, e.

5.7.3. posição das amostras de BSA para a curva-padrão

Página ao lado: Coloração resultante das duas alternativas de curva-padrão de proteína

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0 0 2,5 2,5 5 5 7,5 7,5 10 10 15 15

B

C 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

D 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

E

F

G

H


5.7.3. distribution of BSA samples for the standard curve

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0 0 2.5 2.5 5 5 7.5 7.5 10 10 15 15

B

C 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

D 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

E

F

G

H

Resulting color of both protein standard curve alternatives


6. PREPARAÇÃO DE REAGENTES ESPECÍFICOS

6.1. Acetilcolinesterase (ACE)

1) Triton/Na fosf –1%TritonX-100em100mMtampãofosfatodesódiopH7,8Estasoluçãopodeserestocadapormeses,fechada,a4ºC.

Estoque, 500 ml

-5mlTritonX-100a100%-50mltampãofosfatodesódioa1MpH7,8(parapreparaçãoconsultarSeção 7.1.2)-águaqsp500ml

2)DTNB/Na fosf –10mMDTNBem100mMtampãofosfatodesódiopH7,0Estasoluçãodeveserpreparadano máximo 4 horas antes do uso.

Solução de trabalho, 3 ml

-0,012g(0,01189g)deDTNB(PM396,3)20

-3mltampãofosfatodesódio100mMpH7,0(parapreparaçãoconsultarSeção 7.1.3)

3,4)AchE/AchI –Iodetodeacetiltiocolina,a10mM,emágua,naausência(AchE)ounapresença(AchI)depropoxurEstassoluçõesdevemserpreparadasno máximo 4 horas antes do uso.

Parater3mldecadasolução:

Solução de trabalho, 6 ml

-0,0174gdeiodetodeacetiltiocolina(PM289,2)21

-6mlágua-separar3ml:AchE-aos3mlrestantes,adicionar6µldepropoxur0,1Memacetona:AchI(parapreparaçãodepropoxur,consultarSeção 7.4)

�0Emgeral,mantemosváriasalíquotasde0,012gdeDTNBemtubosEppendorf,a4ºC.��Emgeral,mantemosváriasalíquotasde0,0174gdeacetiltiocolinaemtubosEppendorf,a-20ºC.



1 Triton/Na fosf 29 ml 500 ml em estoque

2 DTNB/Na fosf 2 ml 3 ml

preparar na hora3 AChE 2,5 ml 3 ml

4 AChI 2,5 ml 3 ml


6 PREPARING SPECIFIC REAGENTS




1 Triton/Na phosph 29 ml 500 ml in stock

2 DTNB/Na phosph 2 ml 3 ml

freshly prepared3 AChE 2.5 ml 3 ml

4 AChI 2.5 ml 3 ml

1)Triton/Na phosph– 1% Triton X-100 in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.8– 1% Triton X-100 in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.81%TritonX-100in100mMsodiumphosphatebufferpH7.8Thissolutioncanbestoredforseveralmonths,closed,at4ºC.

Stock, 500 ml

-5ml100%TritonX-100-50ml1MsodiumphosphatebufferpH7.8(detailsofpreparationinSection 7.1.2)-waterto500ml

�) DTNB/Na phosph– 10 mM DTNB in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.0– 10 mM DTNB in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.010mMDTNBin100mMsodiumphosphatebufferpH7.0Thissolutionmustbepreparedjust before use (4 hours maximum).

working solution, 3 ml

-0.012g(0.01189g)DTNB(MW396.3)20

-3ml100mMsodiumphosphatebufferpH7.0(detailsofpreparationinSection 7.1.3)

3,4)AchE/AchI –10mMacethylthiocholineiodide,inwater,intheabsence(AchE)orinthepresence(AchI)ofpropoxur.Bothsolutionsmustbefreshlyprepared(maximum 4 hours before use).

Inordertohave3mlofeachsolution:

working solution, 6 ml

-0.0174gacethylthiocholineiodide(MW289.2)21

-6mlwater-reserve3ml:AchE-totheremaining3ml,add6µl0.1Mpropoxurinacetone:AchI(detailsofpropoxurpreparationinSection 7.4)

�0Wekeepseveral0.012gDTNBaliquotsinEppendorftubes,at4ºC.�� Wekeepseveral0.0174gacethylthiocholinealiquotsinEppendorftubes,at-20ºC.


6.2. Oxidases de Função Mista (MFO)

1)tampão fosfato de potássio (k fosf) –90mMtampãofosfatodepotássiopH7,2Estasoluçãopodeserestocadapormeses,fechada,a4ºC.

Estoque, 500 ml

-parapreparaçãoconsultarSeção 7.2.3

2)citocromo C –0,01mg/mlemacetatodesódio250mMpH5,0Estasoluçãoéestocadaa-20ºC,emalíquotasde80-100µl.Cada alíquota é usada apenas uma vez e o restante é descartado.

Estoque, 5 ml

-pesar0,5mgdecitocromoC-adicionar5mltampãoacetatodesódio250mMpH5,0(Seção 7.3).Concentraçãofinaldasolução:0,1mg/ml-diluirasoluçãoacimadezvezes:0,5mldoestoque+4,5mldeacetatodesódio250mMpH5,0-estaquantidadeésuficientepara50alíquotasde100µl

3)TMBZ/acetato de sódio (TMBZ/Na acet)

Estasoluçãodeveserpreparadanomomentodouso.

Solução de trabalho

-6mlTMBZa0,2%emmetanol(a)-18mltampãoacetatodesódioa250mMpH5,0(b)

Estasoluçãoéfeitaemduasetapas:a)0,2%TMBZemmetanol(6mlporensaio)



1 K fosf 6 ml 500 mlem estoque

2 citocromo C 60 µl 5 ml

3 TMBz / Na acet 20 ml 24 mlpreparar na hora

4 H2O2 a 3% 2,5 ml 3 ml





1 K phosph 6 ml 500 mlin stock

2 cytochrome C 60 µl 5 ml

3 TMBz/Na acet 20 ml 24 mlfreshly prepared

4 3% H2O2 2.5 ml 3 ml

1)potassium phosphate buffer (k phosph)-90mM potassium phosphate buffermMpotassium phosphate bufferpotassiumphosphatebufferpH7.2Thissolutioncanbestoredforseveralmonths,closedat4ºC.

Stock, 500 ml

-detailsofpreparationin Section 7.2.3

2)cytochrome C –0.01mg/mlin250mMsodiumacetatepH5.0Thissolutionisstoredat-20ºC,in80-100µlaliquots.Each aliquot is used only once, and the remainder is discarded.

Stock, 5 ml

-weight0.5mgcytochromeC-add5ml250mMsodiumacetatebufferpH5.0(Section 7.3).Finalconcentration:0.1mg/ml-dilutethissolutiontoatenth:0.5mlstock+4.5ml250mMsodiumacetatepH5.0-thisamountisenoughfor50aliquotsof100µleach

3)TMBZ/sodium acetate (TMBZ/Na acet)

Thissolutionmustbefreshlyprepared.

working solution

-6ml0.2%TMBZinmethanol(a)-18ml250mMsodiumacetatebufferpH5.0(b)

Thissolutionispreparedintwosteps:a) 0.2%TMBZinmethanol(6mlforeachassay)



-0,012gdeTMBZ22

-6mlmetanolEstasoluçãodeveserpreparadanomomentodouso.

b) tampãoacetatodesódioa250mMpH5,0

Estoque

-paradetalhesdepreparação,consultarSeção 7.3.1

4) peróxido de hidrogênio –H2O2a3%Estasoluçãodeveserpreparadanomomentodouso.


-300µlH2O2a30%-2,7mlágua

6.3. Esterase alfa (a-EST)

1)alfa-naftol–alfa-naftola0,5mg/ml(~3,5mmoles/ml)(PM:144,2)Estasoluçãoéestocadaa-20ºC,emalíquotasde100µl.Asalíquotaspodemserusa-dasmaisdeumavez.

Estoque, 5 ml

-pesar2,5mgdealfa-naftol-adicionar5mldeacetona-estaquantidadeésuficientepara50alíquotasde100µl

2)alfa-naftil acetato/fosfato de sódio (alfa-naftil acet / Na fosf)–0,3mMalfa-naftilacetatoemtampãofosfatodesódio20mMpH7,2Estasoluçãodeveserpreparadano máximo 1-2 horas antes do uso.

��Emgeral,mantemosváriasalíquotasde0,012gdeTMBZemtubostipoEppendorf,a4ºC.



1 alfa-naftol (controle positivo) 30 µl 5 ml em estoque

2 alfa-naftil acet/Na fosf 20 ml 25 mlpreparar na hora



working solution

-0.012gTMBZ22

-6mlmethanolThissolutionmustbefreshlyprepared.

b) 250mMsodiumacetatebufferpH5.0

Stock

-detailsofpreparationinSection 7.3.1

4)hydrogen peroxide–3%H2O2

Thissolutionmustbefreshlyprepared.

working solution

-300µl30%H2O2

-2.7mlwater

6.3. alfa-Esterase (a-EST)



1 alpha-naphthol (positive control) 30 µl 5 ml in stock

2 alpha-naphthyl acet/Na phosph 20 ml 25 mlfreshly prepared


1)alpha-naphthol–0.5mg/mlalpha-naphthol(~3.5mmoles/ml)(MW:144.2)Thissolutionisstoredat-20ºC, in100µlaliquots.Aliquotsmaybeusedmorethanonce.

Stock, 5 ml

-weigh2.5mgdealpha-naphthol-add5mlacetone-thisamountisenoughfor50aliquotsof100µleach

2) alpha-naphthyl acetate/sodium phosphate (alpha-naphthyl acet/Na

phosph)–0.3mMalpha-naphthylacetatein20mMsodiumphosphatebufferpH7.2Thissolutionmustbeprepared not more than 1-2 hours before use.

�� Wekeepseveral0.012gTMBZaliquotsinEppendorftubes,at4ºC.



-250µl30mMalfa-naftilacetato(a)-24,75mltampãofosfatodesódio20mMpH7,2(b)

Estasoluçãoéfeitaemduasetapas:a)30mMalfa-naftilacetatoemacetona

Estoque

-0,028gdealfa-naftilacetato(PM186,2)-5mlacetonaEstasoluçãopodeserestocadapormeses,fechada,a4ºC.

b)tampãofosfatodesódio20mMpH7,2-parapreparaçãoconsultarSeção 7.1.4

3) Fast Blue –0,3%FastBlueBem3,5%SDSEstasoluçãodeveserpreparadanomáximo1-2horasantesdouso.


-pesar45mgdeFastBlueB(0,045g)23

-adicionar4,5mldeágua-Depois de dissolvido,adicionar10,5mldeSDSa5%(Seção 7.5)

6.4. Esterase beta (b-EST)

1)beta-naftol–beta-naftola0,5mg/ml(~3,5mmoles/ml)Estasoluçãoéestocadaa-20ºC,emalíquotasde100µl.Asalíquotaspodemserusa-dasmaisdeumavez.

Estoque, 5 ml

-pesar2,5mgdebeta-naftol-adicionar5mldeacetona-estaquantidadeésuficientepara50alíquotasde100µl

��Emgeral,mantemosváriasalíquotasde45mg(0,045g)deFastBlueemtubostipoEppendorf,a4ºC.



1 beta-naftol (controle positivo) 30 µl 5 ml em estoque

2 beta-naftil acet/Na fosf 20 ml 25 mlpreparar na hora



working solution

-250µl30mMalpha-naphthyl-acetate(a)-24.75ml20mMsodiumphosphatebufferpH7.2 (b)

Thissolutionispreparedintwosteps:a) 30mMapha-naphthylacetateinacetone

Stock

-0.028galpha-naphthylacetate(MW186.2)-5mlacetoneThissolutioncanbestoredforseveralmonths,closed,at4ºC.

b) 20mMsodiumphosphatebufferpH7.2-detailsofpreparationinSection 7.1.4

3)Fast Blue–0.3%FastBlueBin3.5%SDSThissolutionmustbepreparednotmorethan1-2hoursbeforeuse.

working solution

-weigh45mgFastBlueB(0.045g)23

-add4.5mlwater-After solubilization,add10.5ml5%SDS(Section 7.5)

6.4. beta-Esterase (b-EST)



1 beta- naphthol (positive control) 30 µl 5 ml in stock

2 beta- naphthyl acet/Na phosph 20 ml 25 mlfreshly prepared


1)beta-naphthol -0.5mg/mlbeta-naphthol(~3.5mmoles/ml)Thissolutionisstoredat-20ºC,in100µlaliquots.Aliquotscanbeusedmorethanonce.

Stock, 5 ml

-weigh2.5mgdebeta-naphthol-add5mlacetone-thisamountisenoughfor50aliquotsof100µleach

��Wekeepseveral45mg(0.045g)FastBluealiquotsinEppendorftubes,at4ºC.


2)beta-naftil acetato/fosfato de sódio (beta-naftil acet/Na fosf)–0,3mMbeta-naftilacetatoemtampãofosfato20mMpH7,2Esta solução deve ser preparada no máximo 1-2 horas antes do uso.


-250µl30mMbeta-naftilacetato(a)-24,75mltampãofosfatodesódio20mMpH7,2(b)

Estasoluçãoéfeitaemduasetapas:a)30mMbeta-naftilacetatoemacetona

Estoque

-0,028gdebeta-naftilacetato(PM186,2)-5mlacetonaEstasoluçãopodeserestocadapormeses,fechada,a4ºC.

b)tampãofosfatodesódio20mMpH7,2-parapreparaçãoconsultarSeção 7.1.4

3)Fast Blue–Apreparaçãodestasolução,emquantidadesuficienteparaosensaiosdealfaebeta-Esterases,estáindicadanaseçãoanterior.

6.5. Esterase “PNPA” (PNPA-EST)

1)acetato de para-nitrofenil/fosfato de sódio (PNPA/Na fosf)–1mMPNPAemtampãofosfatodesódioa50mMpH7,4Estasoluçãodeveserpreparadaimediatamenteantesdouso(normalmenteprepara-mosno máximo 5 minutos antes de usar).Seasoluçãoestiverfortementeamarelada,descartar.

Solução de trabalho:

-250µl100mMPNPAemacetonitrila(a)-24,75mltampãofosfatodesódio50mMpH7,4(b)



1 PNPA/Na fosf 20 ml 25 ml preparar na hora


2)beta-naphthyl acetate/sodium phosphate (beta- naphthyl acet/Na phos-

ph)–0.3mMbeta-naphthylacetatein20mMsodiumphosphatebufferpH7.2This solution must be prepared not more than 1-2 hours before use.

working solution

-250µl30mMbeta-naphthylacetate (a)-24.75ml20mMsodiumphosphatebufferpH7.2(b)

Thissolutionispreparedintwosteps:a)30mMbeta-naphthylacetateinacetone

Stock

-0.028gbeta-naphthylacetate(MW186.2)-5mlacetoneThissolutioncanbestoredforseveralmonths,closed,at4ºC.

b)20mMsodiumphosphatebufferpH7.2-detailsofpreparationinSection 7.1.4

3)Fast Blue –Preparationofthissolution,inquantityenoughtothealphaandbeta-Esterasesassays,inindicatedintheprevioussection.




1 PNPA/Na phosph 20 ml 25 ml freshly prepared

1) p-nitrophenyl acetate/sodium phosphate (PNPA/Na phosph) – 1 mMPNPAin50mMsodiumphosphatebufferpH7.4Thissolutionmustbepreparedimmediatelybeforeuse(ingeneralourpreparationdoes not exceeded 5’ prior to usage).Ifthesolutionpresentsanintenseyellowcolor,discard.

working solution

-250µl100mMPNPAinacetonitrile(a)-24.75ml50mMsodiumphosphatebufferpH7.4 (b)


Estasoluçãoéfeitaemduasetapas:a)100mMPNPAemacetonitrila


-0,01815gPNPA(PM181,15)24

-1mldeacetonitrila25

DeacordocomomanualdaOMS(Hemingway 1998),estasoluçãopodeserestocadapor1-2meses,fechada,a4ºC.No laboratório, descartamos depois de uma semana.Acetonitrilaéaltamentetóxica.Cuidado!

b)tampãofosfatodesódio50mMpH7,4


-parapreparaçãoconsultarSeção 7.1.3


1) glutationa reduzida/cloro-dinitrobenzeno (GSH/CDNB) – 9,5 mM GSHem1mMCDNBOmanualdaOMS(Hemingway 1998) preconizaqueestasoluçãosejapreparada1a2horasantesdouso.Nós preparamos, no máximo, 10-15 minutos antes.


-20mldeGSHa10mM(a)-1mldeCDNBa21mM(b)

Estasoluçãoéfeitaemduasetapas:a)10mMGSH(PM307,3)emtampãofosfatodepotássio

��Estasoluçãoésuficienteparaquatrotestes.Asoluçãodescritanoitem(a)émantidaa4ºC.Adicionalmente,podem-semanterváriasalíquotasde0,01815gdePNPAemtubostipoEppendorf,a-20ºC.��Jáexperimentamosproblemasemvirtudedaqualidadedaacetonitrila;atualmenteusamosoprodutodaSigma,quetemfuncionadoadequadamente.



1 GSH/CDNB 20 ml 21 ml preparar na hora


Thissolutionispreparedintwosteps:a) 100mMPNPAinacetonitrile

working solution

-0.01815gPNPA(MW181.15)24

-1mlacetonitrile25

According to theWHOhandbook (Hemingway 1998), this solutioncanbestoredduring1-2months,closed,at4ºC.In the laboratory we discard after one week.Acetonitrileishighlytoxic.Attention!!

b)50mMsodiumphosphatebufferpH7.4

working solution

-detailsofpreparationinSection 7.1.3




1 GSH/CDNB 20 ml 21 ml freshly prepared

1)Reduced glutathione/chloro-dinitrobenzene (GSH/CDNB)–9.5mMGSHin1mMCDNBTheWHOhandbook (Hemingway 1998) recommendspreparing this solution1-2hoursbeforeuse.We prepare at most 10-15 minutes before.

working solution

-20ml10mMGSH(a)-1ml21mMCDNB(b)

Thissolutionispreparedintwosteps:a) 10mMGSH(MW307.3)inpotassiumphosphatebuffer

��Thissolutionisenoughtofour(4)tests.Thesolutiondescribedin(a)iskeptat4ºC.Inaddition,several0.01815gPNPAaliquotscanbestoredinEppendorftubesat-20ºC.��Wealreadyhadproblemsderivedfromthequalityofacetonitrile.WepresentlyweuseSigma’sproductthatworkswell.



-0,0615gdeGSH26

-20mltampãofosfatodepotássio100mMpH6,5(verSeção 7.2.4)

b)21mMCDNB(PM202,6)emmetanol


-0,0042gdeCDNB24

-1mlmetanol

6.7. Proteínas totais (PTN)

1)Albumina Sérica Bovina (BSA) –1mg/mlemáguaAmpolascontendo1mldesolução-padrãodeBSA,a2mg/ml(verSeção 3.4.2)sãomantidasa4ºC.Depoisqueumaampolaéaberta, seuconteúdoédistribuídoemalíquotasde60ou100µl,emtubostipoEppendorfde0,5mldecapacidade.Asalí-quotassãomantidasa-20ºC.Nomomentodouso,adiciona-seigualvolumedeáguaàalíquota(parapreparaçãodeBSAa1mg/ml).Cadaalíquotaésuficienteparaoscontrolespositivos(naplacacomasamostrasdemosquitos)eparaacurva-padrão,deacordocomaalternativa1(alíquotade60µl)oualternativa2(alíquotade100µl).A solução de 1 mg/ml que sobra é descartada.Opontode15µgdeBSAdacurva-padrão(verSeções 5.7.1 e 5.7.2) éfeitodireta-mentecomasoluçãoa2mg/ml.Nolaboratório,usamosumaalíquotaseparada,querecongelamos2-3vezes.

2)reativo para proteínas (reativo Bio-Rad) –Bio-Radnºcatálogo500-0006Asoluçãodeveserpreparadanomomentodouso.


-8mlreativo-32mlágua

��Emgeral,mantemosváriasalíquotasde0,0615gdeGSHede0,0042gdeCDNBemtubostipoEppendorf,a4ºC.



1 BSA (controle) 30 µl 1 ml em estoque

2 reativo Bio-Rad 30 ml 40 ml (**) preparar na hora


working solution

-0.0615gGSH26

-20ml100mMpotassiumphosphatebufferpH6.5(seeSection 7.2.4)

b) 21mMCDNB(MW202.6)inmethanol

working solution

-0.0042gCDNB24

-1mlmethanol




1 BSA (control) 30 µl 1 ml in stock

2 Bio-Rad reactive 30 ml 40 ml (**) freshly prepared

1)Bovine Serum Albumin (BSA) –1mg/mlinwaterVialswith1mlofthestandardBSAsolution,at2mg/ml(seeSection 3.4.2)arekeptat4ºC.Oncethevialisoppened,itscontentisdistributedin60-100ulaliquotsin0.5mlEppendorftubes,storedat-20ºC.Uponapplication,anequalvolumeofwaterisaddedtoonealiquot(inordertopre-pare1mg/mlBSA).Eachaliquotisenoughforthepositivecontrols(inthemicroplatescontainingthemos-quitosamples)andforthestandardcurve,accordingtoalternative1(60µlaliquot)oralternative2(100µlaliquot).The remaining 1 mg/ml BSA solution is discarded.Inthestandardcurve,thepointcorrespondingto15µgBSA(seeSections 5.7.1 and

5.7.2)isobtaineddirectlywiththesolutionat2mg/ml.Forthispurpose,weuseaseparatealiquotthatisre-frozen2-3times.

2)protein reactive (Bio-Rad reactive) –Bio-Radcat500-0006Thissolutionmustbepreparedimmediatelypriortousage.

working solution

-8mlreactive-32mlwater

��Wekeepseveral0.0615gGSHand0.0042gCDNBaliquotsinEppendorftubes,at4ºC.


7. TAMPÕES GERAIS E SOlUÇÕES-ESTOQUE

TodasassoluçõesdescritasnasSeções 7.1a7.4 sãoestocadasa4ºC.

Observações importantes:1) Fazerasolução-estoquedetampãonomáximo20vezesmaisconcentradaquea

soluçãodetrabalho.2) ParaobteropHadequado,devem-semisturarduassoluçõesdemesmamolari-

dade(monobásicoebibásico),nasquantidades indicadas.Asoluçãoresultante(o tampão)estará,automaticamente,namesmamolaridadequeas soluçõesdefosfatooriginais.

3) Fazer a mistura no pHmetro. As quantidades indicadas abaixo são, na prática,apenasumaaproximação.

-AdicionarmaisfosfatobibásicosetiverqueelevaropH. -AdicionarmaisfosfatomonobásicosetiverquebaixaropH.4) Atenção com contaminações.Guardarassoluçõesemfrascostransparentes.Exa-

minarsempreaousar!

7.1. Tampões fosfato de sódio

Tampõesfosfatodesódionecessários:

Preparaçãodeestoquesdetampãofosfatodesódio:

7.1.1. estoques fosfato de sódio (mono e bibásico) a 1 M

-fosfatodesódiomonobásico1M–1litro (PM=120)(usamosfosfatoanidro:NaH2PO4)120gdefosfatodesódiomonobásicoáguaqsp1litroEsterilizecomfiltro0,22µm

-fosfatodesódiobibásico1M–1litro (PM=142)(usamosfosfatoanidro:Na2HPO4)142gdefosfatodesódiobibásico

molaridade pH enzima, teste solução

100 mM 7,0 ACE DTNB/Na fosf

50 mM 7,4 PNPA-EST PNPA

100 mM 7,8 ACE Triton/Na fosf

20 mM 7,2 EST (alfa, beta) naftil acet/Na fosf


7. GENERAl BUFFERS AND STOCk SOlUTIONS

AllthesolutionsdescribedinSections 7.1to7.4arestoredat4ºC.

Important notes:1) Thebufferstocksolutionshouldbeatmost20timesmoreconcentratedthanthe

workingsolution.2) ToobtaintherequiredpH,twosolutionsofidenticalmolarity(monoandbibasic)

havetobemixed,intheindicatedquantities.Theresultingsolution(buffer)willhave,automatically,thesamemolaritythantheoriginalphosphatesolution.

3) MixbothsolutionsinthepHmeter.Theamountsindicatedbelowarejustanindi-cation.

-AddmorebibasicphosphateifyouhavetoincreasepH. -AddmoremonobasicphosphateifyouhavetodecreasepH.4) Take care with contaminations.Storeyoursolutionsintransparentflasks.Examine

alwaysbeforeusing!!

7.1. Sodium phosphate buffers

Sodiumphosphatebuffersneeded:

molarity pH enzyme, test solution

100 mM 7.0 ACE DTNB/Na phosph

50 mM 7.4 PNPA-EST PNPA

100 mM 7.8 ACE Triton/Na phosph

20 mM 7.2 EST (alpha, beta) naphthyl acet/Na phosph

Preparingstocksofsodiumphosphatebuffers:

7.1.1. sodium phosphate stocks (mono and bibasic) at 1 M

-sodiumphosphatemonobasic1M–1liter (MW=120)(weuseanhidrousphosphate:NaH2PO4)120gsodiumphosphatemonobasicwaterto1literSterilizebyfiltrationthrougha0.22µmfilter

-sodiumphosphatebibasic1M–1liter (MW=142)(weuseanhidrousphosphate:Na2HPO4)142gsodiumphosphatebibasic


águaqsp1litroEsterilizecomfiltro0,22µm

7.1.2. tampões-estoque fosfato de sódio a 1 M

a) Natabelaabaixoestãoasquantidadesrecomendadasparaapreparaçãode1litrodostampõesfosfatodesódionospHsnecessários.Éimportantequeaconcentra-çãosejaamesmanasduassoluçõesdefosfato:

b) Abaixoseguemasquantidadesdefosfatodesódioa1Mqueusamosderotinanolaboratório:

c) Usar as soluções-tampão a 1 M para preparar tampões cuja concentração sejaigualousuperiora50mM

7.1.3. tampões fosfato de sódio a 100 e 50 mM

7.1.4. tampão fosfato de sódio a 20 mM

EstetampãoéusadoparaostestesdeEsterasealfaebeta.Parapreparaçãodotampãofosfatodesódioa20mMpH7,2,usarestoquesdefosfatodesódio(monoebibásico)a0,2M:a) Diluir5vezesosestoquesdefosfatodesódioa1M: -fosfatomonobásico:20mlfosfato+80mlágua(100mlfinal)

pH monobásico (NaH2PO4) bibásico (Na2HPO4)

7,0 19,5 ml 30,5 ml

7,2 70 ml 180 ml

7,4 9,5 ml 40,5 ml

7,8 42,5 ml 457,5 ml

teste mM pH ml tampão 1 M (*) ml água ml total

ACE 100 7,0 50 450 500

PNPA-EST 50 7,4 50 950 1000

(*) solução-tampão (Seção 7.1.2) a 1 M no pH indicado

pH monobásico (NaH2PO4) bibásico (Na2HPO4)

7,0 390 ml 610 ml

7,2 280 ml 720 ml

7,4 190 ml 810 ml

7,8 85 ml 915 ml


waterto1literSterilizebyfiltrationthrougha0.22µmfilter

7.1.2. sodium phosphate stock buffers at 1 M

a) The table below discriminates the amounts recommended to prepare 1 liter ofsodiumphosphatebuffersatdefinedpHs.Itisimportanttoassurethattheconcentra-tionofbothphosphatesolutionsisthesame:

pH Monobasic (NaH2PO4) bibasic (Na2HPO4)

7.0 390 ml 610 ml

7.2 280 ml 720 ml

7.4 190 ml 810 ml

7.8 85 ml 915 ml

b) Thequantitiesof1Msodiumphosphateweuseinlaboratoryroutineareasfollows:

pH monobasic (NaH2PO4) bibasic (Na2HPO4)

7.0 19.5 ml 30.5 ml

7.2 70 ml 180 ml

7.4 9.5 ml 40.5 ml

7.8 42.5 ml 457.5 ml

c) Use1Mbuffersolutionstopreparebuffersthatareatleast50mM.

7.1.3. sodium phosphate buffers at 100 and 50 mM

test mM pH ml buffer 1 M (*) ml water ml total

ACE 100 7.0 50 450 500

PNPA-EST 50 7.4 50 950 1000

(*) 1 M buffer solution (Section 7.1.2) in the indicated pH

7.1.4. sodium phosphate buffer at 20 mM

Thisbufferisusedforthealphaandbeta-Esterasestests.To prepare 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.2, use stocks of 0.2 M sodiumphosphate(monoandbibasic):a) Dilutethe1Msodiumphosphatestocks5times: -monobasicphosphate:20mlphosphate+80mlwater(100mlfinal)


-fosfatobibásico:40mlfosfato+160mlágua(200mlfinal) (estasserãosoluçõesdefosfatoa0,2M)b) Preparar250mldetampãoa0,2M,usandoasmesmasproporçõesindicadasna

tabeladaSeção 7.1.2, b: -70mlfosfatomonobásico -180mlfosfatobibásicoc) CorrigiropH,conformenecessário,usandoassoluçõesdefosfatodesódiomono

oubibásicoa0,2M(veritem a).d) Descartaroexcedentedassoluçõesdefosfatomonoebibásicoa0,2M(descritas

noitem a).e) Diluirotampãoa0,2M10vezesparaprepararasoluçãoa20mM: -10mltampãofosfato0,2MpH7,2(veritem c)

-90mlágua -Estetampãopodeserdiluídoemquantidadesuficienteparausopor2-3dias. -Dependendodovolumedetrabalho,pode-sepreparar200ml,adicionando-se

20mldetampãofosfato0,2Me180mldeágua.

7.2. Tampões fosfato de potássio

Tampõesfosfatodepotássionecessários:


90 mM 7,2 MFO K fosf

100 mM 6,5 GST GSH

Preparaçãodeestoquesdetampãofosfatodesódio:

7.2.1. estoques fosfato de potássio (mono e bibásico) a 1M

-fosfatodepotássiomonobásico1M–1litro (PM=136,1)(usamosfosfatoanidro:KH2PO4)136,1gdefosfatodepotássiomonobásicoáguaqsp1litroEsterilizecomfiltro0,22µm

-fosfatodepotássiobibásico1M–1litro (PM=228,2)(usamosfosfatotrihidratado:K2HPO4.3H2O)228,2gdefosfatodepotássiobibásicoáguaqsp1litroEsterilizecomfiltro0,22µm


-bibasicphosphate:40mlphosphate+160mlwater(200mlfinal) (thesewillbe0.2Mphosphatesolutions)b) Prepare250mlof0.2Mbuffer,usingthesameproportionsindicatedinthetable

ofSection 7.1.2, b: -70mlmonobasicphosphate -180mlbibasicphosphatec) CorrectthepH,ifnecessary,usingthe0.2Mmonoorbibasicsodiumphosphate

solutions(see item a).d) Discardtheremaining0.2Mmonoandbibasicphosphatesolutions(describedin

item a).e) Dilutethe0.2Mbuffer10timestopreparethe20mMsolution: -10ml0.2MphosphatebufferpH7.2 (seeitem c) -90mlwater -Thisbuffercanbedilutedinamountssufficientforusageduring2-3days. -Dependingontheworkvolume,200mlcanbeprepared,mixing20ml0.2M

phosphatebufferand180mlwater.

7.2. Potassium phosphate buffers

Potassiumphosphatebuffersneeded:


90 mM 7.2 MFO K phosph

100 mM 6.5 GST GSH

Preparingstocksofpotassiumphosphatebuffers:

7.2.1. potassium phosphate stocks (mono and bibasic) at 1M

-potassiumphosphatemonobasic1M–1liter (MW=136.1)(weuseanhidrousphosphate:KH2PO4)136.1gpotassiumphosphatemonobasicwaterto1literSterilizebyfiltrationthrougha0.22µmfilter

-potassiumphosphatebibasic1M–1liter (MW=228.2)(weusetrihydratedphosphate:K2HPO4.3H2O)228.2gdepotassiumphosphatebibasicwaterto1literSterilizebyfiltrationthrougha0.22µmfilter


7.2.2. tampões-estoque fosfato de potássio a 1 M

a) Natabelaabaixoestãoasquantidadesrecomendadasparaapreparaçãode1litrodostampõesfosfatodepotássionospHsnecessários.Éimportantequeaconcen-traçãosejaamesmanasduassoluçõesdefosfato:

pH monobásico (kH2PO4) bibásico (k2HPO4)

6,5 640 ml 360 ml

7,2 283 ml 717 ml

7.2.3. tampão fosfato de potássio a 90 mM pH 7,2

a) preparaçãodetampãoa1M -71,7mldefosfatobibásicoa1M -28,3mldefosfatomonobásicoa1M -misturarnoagitadormagnético,comacompanhamentonopHmetro -corrigiropH,senecessário,acrescentandofosfatobibásicoparaelevaropHou

ofosfatomonobásicoparadiminuiropH -comisto,tem-se100mldeumasoluçãotampãofosfatodepotássioa1MpH7,2

b) preparaçãodetampãoa90mM -45mltampãofosfatodepotássioa1M,pH7,2(veritem a) -455mldeágua -conferirpH.Acertarcomfosfatobibásicooumonobásicoa 90 mM paramanter

amolaridadedesejada27

7.2.4. tampão fosfato de potássio a 100 mM pH 6,5

a) preparaçãodetampãoa1M -18mldefosfatobibásicoa1M -32mldefosfatomonobásicoa1M -misturarnoagitadormagnético,comacompanhamentonopHmetro -corrigir,senecessário,acrescentandofosfatobibásicoparaelevaropHouofos-

fatomonobásicoparadiminuiropH -comisto,tem-se50mldeumasoluçãotampãofosfatodepotássioa1MpH6,5

b) preparaçãodetampãoa100mM -50mltampãofosfatodepotássioa1M,pH6,5 -450mldeágua -conferirpH.Acertarcomfosfatobibásicooumonobásicoa 100 mM paraman-

teramolaridadedesejada28.

��Paraprepararfosfatodepotássiomonooubibásicoa90mMbastaadicionar9mldosestoquesa1M(Seção 7.2.1)a91mldeágua.��Paraprepararfosfatodepotássiomonooubibásicoa100mMbastaadicionar10mldosestoquesa1M(Seção 7.2.1)a90mldeágua.


7.2.2. potassium phosphate stock buffers at 1 M

a) Thetablebelowdiscriminates thequantitiesrecommendedtoprepare1 literofpotassiumphosphatebuffersatdefinedpHs.Itisimportanttoassurethattheconcen-trationofbothphosphatesolutionsisthesame:

pH monobasic (kH2PO4) bibasic (k2HPO4)

6.5 640 ml 360 ml

7.2 283 ml 717 ml

7.2.3. potassium phosphate buffer at 90 mM pH 7.2

a) preparationofbufferat1M -71.7ml1Mbibasicphosphate -28.3ml1Mmonobasicphosphate -mixonthemagneticstirrer,accompanyingwiththepHmeter - correct the pH, if necessary, adding bibasic phosphate to increase the pH or

monobasicphosphate,todecreasethepH -thiscorrespondsto100mlofa1MpotassiumphosphatebufferpH7.2solution

b) preparationofbufferat90mM -45ml1MpotassiumphosphatebufferpH7.2(seeitem a) -455mlwater -checkpH.Correct ifnecessary,using the90 mM monoorbibasicphosphate

solutions,tokeepthedesiredmolarity27

7.2.4. potassium phosphate buffer at 100 mM pH 6.5

a) preparationofbufferat1M -18ml1Mbibasicphosphate -32ml1Mmonobasicphosphate -mixonthemagneticstirrer,accompanyingwiththepHmeter - correct the pH, if necessary, adding bibasic phosphate to increase the pH or

monobasicphosphate,todecreasethepH -youwillhave50mlofa1MpotassiumphosphatebufferpH6.5

b) preparationofbufferat100mM -50ml1MpotassiumphosphatebufferpH6.5 -450mlwater -checkpH.Correctifnecessary,usingthe100 mM monoorbibasicphosphate

solutions,tokeepthedesiredmolarity28

��Preparemonoorbibasicpotassiumphosphateat90mMmixing9mlof1Mstocks(Section 7.2.1)and91mlwater.��Toprepare100mMpotassiumphosphatemonoorbibasicmix10mlofthe1Mstocks(Section 7.2.1)to90mlwater.


7.3. Tampão acetato de sódio

Tampãoacetatodesódionecessário:


250 mM 5,0 MFO TMBz/Na acet

7.3.1. tampão estoque acetato de sódio 250 mM pH 5,0

a) preparaçãodetampãoa3M: -pesar246,09gdeacetatodesódioanidro(PM82,03) -dissolverem800mldeágua -ajustaropHpara5,0comácidoacéticoglacial -completarovolumepara1litrocomágua -Esterilizecomfiltro0,22µm

b) preparaçãodetampãoa250mM -41,6mltampãoacetatodesódioa3M -adicionaráguaaté450ml -conferirpHnovamente.Acertarcomácidoacéticoglacial -completarovolumepara500mlcomágua

7.4. Propoxur (ensaio Acetilcolinesterase)

0,1Mpropoxuremacetona

Estoque, 1 ml:

-0,02092gdepropoxur(PM:209,24)-1mlacetona-fazeralíquotasde100µl,estocá-lasa4ºC(Gasta-se6µlporensaio)

7.5. SDS (ensaio Esterases alfa e beta)

SDSa5%Emnossolaboratóriopreparamosestasoluçãopordiluiçãoapartirdeestoquea10%(50mldeSDSa10%e50mldeágua)

Estoque a 10%, 500 ml:

-50gdeSDS(usarmáscaraaopesar!)-águaqsp500ml-dissolverusandoagitadormagnético,lentamente(paraevitarbolhas)-Esterilizecomfiltro0,22µm(também lentamente)-estocaratemperaturaambiente(SDSprecipitaseestocadoa4ºC)


7.3. Sodium acetate buffer

Sodiumacetatebufferneeded:


250 mM 5.0 MFO TMBz/Na acet

7.3.1. sodium acetate buffer, stock at 250 mM pH 5.0

a) preparationofbufferat3M: -weigh246.09gsodiumacetate,anhydrous(MW82.03) -dissolvein800mlwater -adjustpHto5.0withglacialaceticacid -addwaterupto1liter -Sterilizebyfiltrationthrougha0.22µmfilter

b) preparationofbufferat250mM -41.6ml3Msodiumacetatebuffer -addwaterupto450ml -checkpHagain.Correctwithglacialaceticacid -completevolumeto500mlwithwater

7.4. Propoxur (Acethylcholinesterase assay)

0.1Mpropoxurinacetone

Stock, 1 ml:

-0.02092 g propoxur (MW: 209.24)0.02092 g propoxur (MW: 209.24)gpropoxur(MW:209.24)-1mlacetone-prepare100µlaliquotsandstoreat4ºC(6µlareusedineachtest)

7.5. SDS (alpha and beta-Esterases test)

5%SDSInthelaboratorythissolutionisobtainedbydilutionofthe15%stock(50ml10%SDSand50mlwater)

Stock at 10%, 500 ml:

-50gSDS(usemaskwhenweighing!)-waterupto500ml-dissolvewiththeaidofamagneticstirrer,slowly(toavoidbubbles)-Sterilizebyfiltrationthrougha0.22µmfilter (also slowly)-storeatroomtemperature(SDSprecipitatesifstoredat4ºC)


8. COMPARAÇÃO PROTOCOlOS OMS – CDC – lAFICAVE

MÉTODO OMS (homogenato 200ul)

ENZIMA vol amost(µl) nº réplicas λ (Abs) t leitura

(minutos) k X EP (*) ordem (**)

EST alfa 20 1 570 15 EP

não indicado

EST beta 20 1 570 15 EP

PNPA-EST 10 2 405 2 K

GST 10 2 340 5 K/20 EP EP/K

MFO 2 2 650 120 EP

ACE 25 (x 2) 1 405 5 K/60 EP K/EP

PTN 10 2 620 5 EP

MÉTODO CDC (homogenato 2000ul)



EST alfa 100 3 540 20 EP 1

EST beta 100 3 540 20 EP 1

PNPA-EST este teste não é realizado

GST 100 3 340 0 – 5 EP 4

MFO 100 3 620 10 EP 3

ACE 100 3 x 2 414 20 EP 2

PTN 20 3 620 0 EP 5

MÉTODO lAFICAVE (homogenato 300ul)



EST alfa 10 2 570 15 EP 4

EST beta 10 2 570 15 EP 3

PNPA-EST 10 2 405 2 K 5

GST 15 2 340 20 K 7

MFO 20 2 650 90 EP 1

ACE 25 (x 2) 2 405 60 EP 2

PTN 10 2 620 5 EP 6

(*) K: leitura cinética; EP: leitura end point(**) ordem de reação


8. COMPARING wHO – CDC – lAFICAVE PROTOCOlS

wHO METHOD (200Ul HOMOGENATE)

ENZYME sample vol (µl) nº replicate λ (Abs) t lecture

(minutes) k X EP (*) order(**)

EST alpha 20 1 570 15 EP

not indicated

EST beta 20 1 570 15 EP

PNPA-EST 10 2 405 2 K

GST 10 2 340 5 K/20 EP EP/K

MFO 2 2 650 120 EP

ACE 25 (x 2) 1 405 5 K/60 EP K/EP

PTN 10 2 620 5 EP

CDC METHOD (2000ul homogenate)



EST alpha 100 3 540 20 EP 1

EST beta 100 3 540 20 EP 1

PNPA-EST test not done

GST 100 3 340 0 – 5 EP 4

MFO 100 3 620 10 EP 3

ACE 100 3 x 2 414 20 EP 2

PTN 20 3 620 0 EP 5

lAFICAVE METHOD (homogenate 300ul)



EST alpha 10 2 570 15 EP 4

EST beta 10 2 570 15 EP 3

PNPA-EST 10 2 405 2 K 5

GST 15 2 340 20 K 7

MFO 20 2 650 90 EP 1

ACE 25 (x 2) 2 405 60 EP 2

PTN 10 2 620 5 EP 6

(*) K: reading of absorbance as a rate, kinectic lecture; EP: “end point” reading of absorbance(**) reaction order


Coloração resultante de cada teste como indicado sobre as placas. As reações de PNPA-EST e GST estão representadas pela mesma placa, uma vez que não produzem cor (GST) ou apenas uma ligeira coloração amarela. No painel “Standard Protein Curve” as duas alternativas de curva-padrão de proteína indicadas no texto são apresentadas. B: branco; C: controle positivo; ROCK: cepa suscetível (Rockefeller)

ACE (AChE) ACE (AChI)

MFO GST/PNPA-EST

ROCK

ROCK

ROCK

ROCK


Resulting coloration of each assay as indicated above the microplates. PNPA-EST and GST reactions are presented by the same microplate since no color (GST) or a weak yellow color (PNPA-EST) is developed. In the panel “Standard Protein Curve”, both alternatives indicated in the text are presented. B: blank; C: positive control; ROCK: susceptible strain (Rockefeller)

-EST -EST

PTN PTN STANDARD CURVE

ROCK

ROCK ROCK


9. ANÁlISE DOS RESUlTADOS

Aofinaldecadaensaio,obtém-se,comoresultado,ovalordeabsorbânciadasrépli-casdecadamosquito.Paraseremexpressosemvaloresdeatividadeenzimática,estesdadosprecisamserprocessadosecorrigidos:1) pelovolumedehomogeneizaçãodomosquito2) pelaquantidadedeproteínastotaisemcadamosquito3) pelaunidadedeatividadedecadaenzimaconsiderada

Nospróximositens,estãoindicadasasunidadesusadaspararepresentarosresulta-dosobtidoscomcadaenzima.Asetapasnecessáriasparaasconversõesdosvaloresdeabsorbânciaematividadeenzimáticadecadamosquitotambémestãobrevementediscriminadas.

9.1. Acetilcolinesterase

OsresultadosdeAcetilcolinesterasesãoexpressoscomoopercentualdeatividadeenzimáticaremanescenteapósaadiçãodoinibidor.Paraissocalcula-se,paracadamosquito, a diferença entre os resultados de atividade obtidos na presença (placaAChI,Seção 5.1)enaausência(placaAChE,Seção 5.1)doinibidor,propoxur:

%atividaderemanescente=AChIX100 AChE

Alternativamente,pode-seexpressaroresultadocomoopercentualdeinibiçãodaAcetilcolinesterase:

%inibição=(AChE-AChI)X100 AChE

Estaéaúnicaenzimaparaaqualnãoénecessáriocorrigirosvaloresobtidospelototaldeproteínasnempelovolumedehomogeneizaçãodosmosquitos.

9.2. Proteínas totais

Adosagemdototaldeproteínasdecadamosquitoénecessáriaparaacorreçãodeto-dososvaloresdeatividadedasenzimasrelacionadascomaresistênciametabólica.Paracalcularototaldeproteínasdecadamosquito,osvaloresdeabsorbânciaobtidosnasalíquotas(10µl)devem:1)sercorrigidosparaovolumetotaldehomogenato(300µl)-multiplicaraabsor-

bânciapor30;


9. ANAlYSIS OF RESUlTS

Attheendofeachassaytheabsorbancevalueofthereplicatesofeachmosquitoisobtained.Inordertoexpressthesevaluesasenzymaticactivitythedatamustbepro-cessedandcorrectedaccordingto:1)thevolumeofmosquitohomogenization2)theamountoftotalproteinsineachmosquito3)theactivityunitconsideredforeachenzyme

Inthefollowingitemstheunitsusedtorepresentresultswitheachenzymeareindi-cated.Thestepsneededtoconvertabsorbancevaluesinenzymaticactivityforeachmosquitoarealsobrieflydiscriminated.


Acethylcholinesteraseresultsareexpressedas thepercentageofremainingactivityafteradditionoftheinhibitor.Thedifferencebetweenactivityinthepresence(plateAChI, Section 5.1)andabsence(plateAChE,Section 5.1)oftheinhibitor,propoxur,iscalculated:

%remainingactivity=AChIX100 AChE

AlternativelytheresultcanbeexpressedastheAcethylcholinesteraseinhibitionrate:

%inhibition=(AChE-AChI)X100 AChE

InthecaseofACEitisunnecessarytocorrectvaluesaccordingtothetotalquantityofproteinsortothehomogenizationvolumeofeachmosquito.


Dosageoftotalproteinsofeachmosquitoisanecessarysteptocorrectactivityvaluesobtainedforallenzymesrelatedtometabolicresistance.Tocalculatetotalproteinquantityineachmosquito,theabsorbancevaluesobtainedinthe10µlaliquotsshould:1) becorrectedbythetotalhomogenatevolume(300µl)–absorbancemultipliedby

afactorof30;2) betransformedinµgprotein.In order to do this, it is necessary to divide by the

conversion factor. Thisfactorisobtainedwiththestandardcurve(Sections 5.7.1


2)ser transformadosemµgdeproteína.Para isto é necessário dividir pelo fator de conversão.Estefatoréobtidocomacurva-padrão(Seções 5.7.1 e 5.7.2),apartirdaqualsecalculaaequaçãodareta(y=ax+b)29.Ofatordeconversão(a)éocoeficienteangulardestareta,queéobtidoaplicando-seafórmula:

a=∆y-b ∆xOnde: ∆y=diferençaentreosvaloresdeabsorbânciadedoispontosdareta ∆x=diferençaentreosvaloresdeproteína(BSA)dospontosacima b=valordeabsorbâncianaausênciadeBSA(branco)

9.3. Oxidases de Função Mista

Nesteensaio,mede-seoconteúdodehemenoinseto.Emmosquitosnãoalimentadoscomsangue,ohemeestáprincipalmenteassociadoaocitocromoP450(Hemingway

1998),doqualéogrupamentoprostético.OcitocromoP450eseugrupamentopros-téticoestãoenvolvidosemreaçõesdemonooxigenação,quecatalisamainserçãodeumátomodeoxigênioaosubstrato,apartirdeO2;ooutroátomodeoxigênioéredu-zidoàágua.Aequaçãogeralparaestareaçãoé:

RH+O2+2H++2e→ROH+H2O

AsenzimascitocromoP450podemreceberoutrasdenominações,comoMonooxi-genasescitocromoP450,OxidasesdeFunçãoMista(MFOs),Monooxigenasespoli-substrato(PSMOs),heme thiolate proteinsousimplesmenteP450(Feyereisen 1999).ComotestedescritonaSeção 5.2 nãoépossívelmedirdiretamenteaatividadedemonooxigenaçãodaP450sobreumsubstrato.Emvezdisso,quantifica-seoconteúdodehemepresentenomosquito,oquepermiteinferirsobreaatividadedaenzima.Assim,quantomaiselevadoforoconteúdodeheme,maiordeveseraatividadedaP450,evice-versa.Valeressaltaranecessidadedeusarmosquitosnãoalimentadoscomsangue,parareduzironúmerodemoléculasdeheme(comoaquelaspresentesnaproteínahemoglobina)quepossaminterferircomosresultados.Nesteensaio tambémse fazumacurva-padrão (Seção 5.2.1), comcitocromo(quecontémheme).Estacurva-padrãopermiteconverteremconteúdodecitocromoosvalores de absorbância obtidos com os homogenatos de mosquitos. Os resultadosdesteensaiosãoentãorepresentadosemµgounmolesdecitocromopormiligramadeproteínatotaldosmosquitos(µgcit/mgptnounmolescit/mgptn).Paracalcularaconcentraçãodecitocromo/mgdeproteína,osvaloresdeabsorbânciaobtidosnasalíquotas(20µl)devem:1) sercorrigidosparaovolumetotaldehomogenato(300µl)-multiplicaraabsor-

bânciapor15;

��Nestaequaçãoy=absorbância,x=concentraçãodeBSAdacurva-padrão,emmicrogramas,b=absorbâncianaausênciadeproteína(branco).


and5.7.2),thatisusedtocalculatealinearequation(y=ax+b)29.Theconversionfactor(a)istheslopeofthisline,anditisobtainedbytheformula:

a=∆y-b∆x

Where: ∆y=differencebetweentheabsorbancevaluesoftwopoints ∆x=differencebetweentheproteinvalues(BSA)ofthethesepoints b=absorbancevalueintheabsenceofBSA(blank)


Thisassaymeasuresthehemecontentoftheinsect.Innonblood-fedmosquitoes,hemeismainlyassociatedwithcytochromeP450(Hemingway 1998).CytochromeP450 and its prosthetic heme group are involved in monooxygenation reactions,whichcatalyzetheinsertionofanoxygenatomofO2inthesubstrate;theotheroxy-genatomisreducedtowater.Thegeneralequationofthisreactionis:

RH+O2+2H++2e→ROH+H2O

The cytochrome P450 enzymes are also known as Monooxygenases cytochromeP450,MixedFunctionOxidases(MFOs),poly-substrateMonooxygenases(PSMOs)and“hemethiolateproteins”orsimplyP450(Feyereisen 1999).TheassaydescribedinSection 5.2doesnotmeasurethemonooxygenationactivityofP450overasub-strate,directly.Instead, itquantifiesthetotalhemecontentof themosquito,andthisenablesanindirectestimateoftheenzymeactivity.Hence,thehigherthehemecontent,highershouldbetheP450activity.Itisimportanttonotethatnonblood-fedmosquitoesmustbeused inorder to reduce thenumberofhememolecules(likethosepresentinthehemoglobinprotein)thatcaninterferewithresults.Astandardcurveisconstructed(Section 5.2.1)withcytochrome,containingheme.This standard curve enables conversion of the absorbance values of mosquito ho-mogenatestocytochromecontent.Resultsofthisassayarerepresentedascytochromeµgornmolespresentpertotalproteinofeachmosquito,inmiligrams(µgcit/mgptnornmolescit/mgptn).Tocalculatethecytochromeconcentration/proteinmgineachmosquito,theabsorb-ancevaluesobtainedinthe20µlaliquotsshould:1) becorrectedbythetotalhomogenatevolume(300µl)–absorbancemultipliedby

afactorof15;2) betransformedincytochromeµg(ornmoles).Inordertodothisitisnecessaryto

dividebytheconversionfactor.Thisfactorisobtainedwiththestandardcurve(Sec-

tion 5.2.1),andcalculationsaredoneexactlyasdescribedintheprevioussection;

��Inthisequation,y=absorbance,x=BSAconcentrationinthestandardcurve,inmicrograms,b=absorbanceintheabsenceofprotein(“blank”).


2) sertransformadosemµg(ounmoles)decitocromo.Paraissoénecessáriodividirpelofatordeconversão.Estefatoréobtidocomacurva-padrão(Seção 5.2.1),eoscálculossãofeitosexatamentecomoindicadonaseçãoanterior;

3) sercorrigidosparaoconteúdototaldeproteínadecadamosquito.Paraisso,di-vide-seovalorobtidoacimapelototaldeproteínadomosquitocorrespondente,cujaobtençãoestádescritanoitemanterior(Seção 9.2).

9.4. Esterases alfa e beta ((a and b-EST)

Osresultadosparaestasenzimassãorepresentadosemnmol/mgptn/min.Osvaloresdeabsorbânciaobtidosnasalíquotas(10µl)devem:1) sercorrigidosparaovolumetotaldehomogenato(300µl)multiplicaraabsor-

bânciapor30;2) sertransformadosemnmolesdesubstrato.Paraissoénecessáriodividirpelosfatores

deconversão.Estesfatoressãoobtidoscomascurvas-padrãodealfaoubeta-naftol(Seções 5.3.1 e 5.4.1).OcálculoéfeitoexatamentecomodescritonaSeção 9.2;

3) sercorrigidospelototaldeproteínasdecadamosquito.Paraisso,divide-secadava-lorgeradoacimapelototaldeproteínadomosquitocorrespondente,cujaobtençãoestádescritanaSeção 9.2.Oresultadoéototaldesubstrato(emnmol)consumidopormgdeproteínadecadamosquitonotempototaldereação(15minutos);

4) paracalcularaatividadedaenzimaporminuto,bastadividirovalorobtidonoitemacimapor15.

9.5. Esterase “PNPA”

AocontráriodasEsterasesalfaebeta,paraesteensaio (Seção 5.6)nãoseusaumsubstrato-padrãoe,portanto,nãoépossívelconstruirumacurva-padrãonem,con-seqüentemente,converterosvaloresdeabsorbânciaemquantidadedesubstratocon-sumido. Neste ensaio, o resultado final é expresso em ∆Abs/mg ptn/min, ou seja,calcula-seavariaçãodeabsorbânciaemumminutoedepoisfaz-seacorreçãoparaoconteúdodeproteínadecadamosquito.Naprática,aunidadeconsideradaéavelo-cidadedareação(expressaem∆Abs/min).Emnossolaboratório,esteéoprocedimentoadotadocomosvaloresdeabsorbânciaobtidosnasalíquotas(10µl):1) paracadamosquitoconstrói-seumgráfico"absorbânciaXminuto".Comestesgrá-

ficos,calcula-seaequaçãodaretaeobtém-seoíndicedecorrelação(R2),quevariaentre0e1.Esteíndiceavaliaarelaçãoentreosvaloresobservadoseesperados;

2) descartam-setodososmosquitoscujosvaloresdeR2foreminferioresa0,9;3) calcula-seavariaçãodeabsorbânciaentreospontosde90e30segundos.Esta

seráavariação,naamostra,paraumminutodereação(60”);4) paraseobtero∆Abs/minpormosquito,multiplica-seovalorobtidoacimapor

30,queéofatordediluição;


3) becorrectedbythetotalproteincontentofeachmosquito.Itisthennecessarytodividethevalueobtainedabovebythetotalproteincontentofthecorrespondingmosquito(thatisdescribedabove, Section 9.2).

9.4. alpha and beta-Esterases (a and b-EST)

Resultsobtainedwiththeseenzymesarerepresentedasnmol/mgptn/min.Theab-sorbancevaluesobtainedwith10µlmosquitoaliquotsshould:1) becorrectedbythetotalhomogenatevolume(300µl)absorbancemultipliedbya

factorof30;2) betransformedinsubstratenmols.Inordertodothisitisnecessarytodivideby

theconversionfactors.Thesefactorsareobtainedwiththealphaorbeta-naphtholstandardcurves (Sections 5.3.1 and 5.4.1).Calculationsaredoneexactlyasde-scribedinSection 9.2;

3) becorrectedbytotalproteins.Eachvalueobtainedaboveisdividedbythetotalproteincontentofthecorrespondingmosquito,detailedinSection 9.2. Theresultistheamountofsubstrate(innmol)consumedbyproteinmgofeachmosquitointhetotalreactiontime(15minutes);

4) tocalculatetheenzymeactivityperminute,itissufficienttodividethevalueob-tainedaboveby15.


Inoppositiontoalpha-andbeta-Esterases,forthisassay (Section 5.6) astandardsubstrateisnotavailable.Forthisreasonitisneitherpossibletoconstructastand-ardcurvenortoconvertabsorbancevaluesinconsumedsubstrateamount.Inthisassaythefinalresultisexpressedas∆Abs/mgptn/min,meaningthattheabsorb-ancevariationinoneminuteiscalculated,beingcorrectedbythetotalproteincon-tentineachmosquito.Inpracticetheunitthatisconsideredistherateofreaction(expressedas∆Abs/min).Theprocedureweadoptwiththeabsorbancevaluesobtainedinthe10µlaliquotsisasfollows:1) for each mosquito a graph "absorbance X minute" is constructed. With these

graphs,thelinearequationiscalculated,andacorrelationindex(R2)isobtained.Thisindex,whichvariesfrom0to1,evaluatesthecorrelationbetweentheob-servedandexpectedvalues;

2) allmosquitoesthathaveR2valueslowerthan0.9arediscarded;3) theabsorbancedifferencefrom90to30secondsiscalculated.Thiscorrespondsto

theoneminutesamplevariationofreaction(60”);4)toobtainthe∆Abs/minforeachmosquito,thevalueobtainedaboveismultiplied

by30(thedilutionfactor);


5) faz-seacorreçãopelasproteínastotais.Paraisso,divide-secadavalorobtidoaci-mapelototaldeproteínasdomosquitocorrespondente,emmiligramas.


AssimcomoparaaEsterase“PNPA”,paraesteensaio(Seção 5.6)nãoseusaumsubs-tratopadrãoe,portanto,nãoépossívelconstruirumacurva-padrão.Poroutrolado,nestecasopode-secalcularaquantidadedesubstratoutilizadonareação.Paraisso,osparâmetrosutilizadospor Hemingway (1998) foramconsideradoseincorporadosaoscálculos.Estesparâmetrosincluem:- osvaloresdocoeficientedeextinçãodoprodutodestareação,a(3-(2-cloro-4-ni-

trofenil)-glutationa;- ocaminhoópticodoespectrofotômetro,ouseja,aalturadasoluçãonospoçosdas

microplacas(emnossocaso,0,6cm).Estes parâmetros são usados para transformar valores de absorbância (Abs) emmmoles/mosquito/minuto,deacordocomafórmula:

mmol/mosq/min=(Abs20-Abs10)X20 4,39X0,6X10Onde:Abs20=ovalordeAbsobtidonotempodeleiturade20minutosAbs10=ovalordeAbsobtidonotempodeleiturade10minutos30

20nonumerador=fatordediluição(15µldeamostra,deumtotalde300µl)10nodenominador=minutosdereação(diferençaentre20e10minutos)4,39=coeficientedeextinçãodoprodutodareação0,6=caminhoóptico(=alturadasoluçãonopoço,emcm)

Ouseja,simplificando: mmol/mosq/min=(Abs20-Abs10)X2 4,39X0,6

Paracorrigirpelasproteínastotais,divide-seovalorgeradoacimapelototaldepro-teínadomosquitocorrespondente,cujaobtençãoestádescritanaSeção 9.2.Comacorreçãodaatividadepormgdeproteína,oresultadofinaldesteensaioéexpressoemmmoles/mgptn/min,quecorrespondeàquantidade,emmmoles,doprodutodereaçãogeradoporminuto,pormgdeproteína.

�0Emnossaexperiência,hámuitaoscilaçãonosvaloresmedidosaté10minutosdereação.Porisso,sóestamosconsideran-doointervaloentre10e20minutos.


5) thecorrectionby totalproteins is thenperformed.Eachvalueobtainedabove isdividedbythetotalproteincontentofthecorrespondingmosquito,inmilligrams.


Similarlyto“PNPA”Esterase,forthisassay (Section 5.6)astandardsubstrateisnotavailable.Forthisreasonitisnotpossibletoconstructastandardcurve.However,inthiscaseitispossibletocalculatetheamountofsubstrateusedinthereaction.TheparametersutilizedbyHemingway (1998) havebeenconsideredandwereincorpo-ratedinthecalculations.Theseparametersinclude:– theextinctioncoefficientvalueofthereactionproduct,(3-(2-chloro-4-nitrophe-

nyl)-glutathione;– thespectrophotometerpathlength,thatcorrespondstotheheightofthesolution

inthemicroplatewell(inourcase,0.6cm).Theseparametersareused to transformabsorbancevalues (Abs) inmmoles/mos-quito/minute,accordingtotheformula:

mmol/mosq/min=(Abs20-Abs10)X20 4.39X0.6X10Where:Abs20=Absvalueobtainedafter20minutesofreactionAbs10=Absvalueobtainedafter10minutesofreaction30

20inthedividend=dilutionfactor(15µlsample,from300µlhomogenate)10inthedivisor=minutesofreaction4.39=extinctioncoefficientofthereactionproduct0.6=pathlength(=heightofthesolutioninthemicroplatewell,incm)

Simplifying:mmol/mosq/min=(Abs20-Abs10)X2

4.39X0.6

Inordertocorrectbytotalproteins,thevalueaboveisdividedbythetotalproteincontentofthecorrespondingmosquito,obtainedasdescribedinSection 9.2.Aftercorrectionbyproteinmg,thefinalresultofthisassayisexpressedasmmols/mgptn/min,correspondingtotheamount,inmmols,ofthereactionproductgeneratedperminute,perproteinmg.

�0Inourexperience,ahighoscillationisobservedinthevaluesmeasuredupto10minutesofreaction.Forthisreasonweconsideronlytheintervalbetween10and20minutes.


10. METODOlOGIA lAFICAVE PARA PROCESSAMENTO

E ANÁlISE DOS RESUlTADOS

Osensaiosaquidescritosgeramumvolumemuitograndededados,tendoemvistaque:a) aatividadedeseisenzimaséavaliadasimultaneamenteemcadamosquito;b) emcadaensaiosãoprocessados40mosquitosdapopulaçãosobteste;c) paracadapopulaçãodeAedesaegyptisãoavaliados80a120mosquitos.

Paraagilizaroprocessamentodosdadosbrutosfornecidospeloespectrofotômetro,fo-ramelaborados,emExcel,quatroarquivoscomplementares.Essesarquivos,emcon-junto,permitema transformaçãodosdadosoriginais (obtidosemvaloresdeabsor-bância)ematividadeenzimáticaeacorreçãopelototaldeproteínasdecadamosquito.Adicionalmente,facilitamoscálculosdiscriminadosnasseçõesanteriores.Oresultadofinaldousodessesarquivoséaconstruçãoautomáticadehistogramas-umparacadaenzima,decadapopulaçãoavaliada.Nesseshistogramas,oeixodasabscissasrefere-seàatividadedaenzima(apresentadaemclasses),eoeixodasordenadasrefere-seaonúmerodeindivíduosqueseenquadramemumadeterminadafaixa.Dessaforma,aofinaldecadaanálise,épossívelobservaroperfilenzimáticodeumadeterminadapopu-laçãoecompará-locomoperfildacepareferênciadesuscetibilidade(Figura1).Aseguirestãodescritososprocedimentosgeraisdeusodecadaarquivomenciona-do31.Instruçõesdetalhadasparaopreenchimentopassoapassodos Arquivos 1 a 4

estãoincluídasnaprimeiraplanilha“instruções”decadaarquivo.

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25

0nú

mer o

de i

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nmol/mg ptn/min

100908070605040302010

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mer o

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nd

ivíd

uo

s

nmol/mg ptn/min

1101009080706050403020

30

10

Figura 1: histograma típico gerado com o Arquivo 2. Perfil de atividade de alfa-Esterase da cepa susceptível (alto) e de uma população de campo (acima), alterada.

��EssesarquivosestãodisponibilizadosemCDjuntamentecomomanual.


10. lAFICAVE METHODOlOGY FOR THE PROCESSING

AND ANAlYSIS OF RESUlTS

Theassayshereindescribedgenerateagreatvolumeofdata,since:a)theactivityofsixenzymesissimultaneouslyevaluatedineachmosquito;b)40mosquitoesfromthepopulationundertestareprocessedineachassay;c)80-120Aedes aegyptimosquitoesofeachpopulationareevaluated.

Toexpediteprocessingofthedatageneratedbythespectrophotometer,fourcomple-mentaryExcelfileswereelaborated.Togetherthesefilesenablethetransformationoftheoriginaldata(expressedinabsorbancevalues)inenzymaticactivityandalsothecorrectionaccordingtothetotalproteincontentofeachmosquito.Inaddition,thesefilesfacilitatethecalculationsdiscriminatedintheprevioussections.Theirfi-nalresultistheautomaticconstructionofhistograms–oneforeachenzymeofthepopulationsevaluated.Inthesehistogramsthex-coordinatereferstotheactivityoftheenzyme(showninclasses),andthey-coordinateexhibitsthenumberofspeci-mensineachclass.Inthisway,attheendofeachanalysisitispossibletoevaluatetheenzymaticprofileofagivenpopulation,whichmaythenbecomparedtotheprofileofthesusceptiblereferencestrain(Figure1).Inthefollowingsections,thegeneralproceduresforusageofeachExcelfilearede-scribed31.Detailedinstructionsforfillingout Files 1 to 4 areincludedinthefirstsheet(instructions)ofeachfile.

75

50

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0nu

mb

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nmol/mg ptn/min

100908070605040302010

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nmol/mg ptn/min

1101009080706050403020

30

10

Figure 1: typical histogram generated by File 2. alpha-Esterase activity profile of the susceptible strain (upper graph) and an altered field population (lower graph).

��ThesefilesareavailableintheCDthataccompaniesthepresenthandbook.


10.1. Arquivo 1 – transferência dos dados do Soft Max para Excel

OespectrofotômetroqueutilizamosnolaboratórioestáassociadoaoprogramaSoftMax,queforneceosvaloresdeabsorbânciadecadaposiçãodamicroplaca.Poroutrolado,comomencionado,osarquivosparaprocessamentodosdadosforamelabora-dosnoprogramaExcel.Quandosetentatransferirdiretamenteosdadosdeumprogramaparaoutro,osva-loresdeabsorbânciavêmacompanhadosdeoutrosparâmetros,comotemperaturaetempodeexecuçãodoteste,quenãosãonecessáriosparaoprocessamentodosda-dos.Essesdados“excedentes”devemserexcluídosparaquerestemapenasosvaloresdeabsorbância.OArquivo 1 temcomoobjetivoprincipalprepararosdadosoriginaisdetalformaqueapenasosvaloresdeabsorbânciasejammantidos.Comissoatransferênciadosdadosparaoutrosarquivosficafacilitada.DestaformatambémsepodetrabalharemoutroscomputadoresquenãotenhamoprogramaSoftMaxinstalado.OArquivo 1 écompostoporseisplanilhas:aprimeiracominstruçõesdeusoecadaumadasdemaisdestinadaaosdadosdetodasasenzimasdeumtestecompleto.Estasplanilhassãodenominadas“data1”a“data5”edevemserrenomeadascomadataderealizaçãodotestequeláseráinserido.Emcadaplanilhaexistemespaçosdestinadosaosdadosbrutosdeabsorbânciadetodasasenzimas,daquantificaçãodeproteínastotaisedacurva-padrãodeproteí-nas(BSA).Estesespaços,queestãocoloridosdeazul,simulamasmicroplacasde96poços,seguindoanumeraçãoeadistribuiçãodosmosquitospreviamentedefinidas:mosquitos1a40correspondemàpopulaçãosobtesteemosquitos41a45correspon-demàcepareferênciadesusceptibilidade,comodescritonaSeção 4.3.2.

Como usar o Arquivo 1:

1) deacordocomaplanilha“instruções”doArquivo 1,salvarcomooarquivo,comaexpressão“dados originais”seguidadonomeedalocalizaçãodapopulaçãoava-liadaedoanodecoletadomaterialanalisado;

2) renomearcadaplanilha“data”comadataderealizaçãodeumtestecompleto:mês,diaeano;

3) copiardoprogramaSoftMaxosdadosbrutos(fornecidospeloespectrofotôme-tro)ecolaremespaçosembrancodecadaplanilha.Selecionam-seentãoapenasascélulasquecontêmosvaloresdeabsorbância.Estesvalores são transferidosparaosespaçoscoloridosdeazul,destinadosaosdadosbrutosdeabsorbânciaparacadaenzima.

Apartirdeagora,osdadosinseridosnasplanilhasdoArquivo 1 serãousadospara


10.1. File 1 – data transfer from Soft Max to Excel

ThespectrophotometerweuseinthelaboratoryisassociatedwiththeSoftMaxprogramthatshowstheabsorbancevalueforeachmicroplateposition.However,as mentioned above, the files for data processing were elaborated in the Excelprogram.WhendataaretransferreddirectlyfromSoftMaxtoExcel,theabsorbancevaluesareaccompaniedbyotherparameters,suchastemperatureandreadingtime,whicharenotnecessaryfortheprocessingsteps.These“excess”datashouldbeeliminated,andonlyabsorbancedatashouldberetained.TheprincipalpurposeofFile 1 istoprepareoriginaldatainsuchawayonlytheab-sorbancevaluesaremaintained.Thisprocedurefacilitatestransferenceofdatatotheotherfiles.Bydoingthisitisalsopossibletoworkinothercomputers,whereSoftMaxisnotinstalled.File 1containssixsheets.Thefirstonepresentsfillingoutinstructions;eachoftheremainingsheetswasdesignedtoreceivedatafromall theenzymesofacompletetest.Thesesheetsarereferredtoas“date1”to“date5”andshouldberenamedwiththedateoftheassaythatwillbeinserted.Eachsheethascellsassignedtoreceivetheoriginalabsorbancevaluesfromalltheen-zymes,fromthequantificationoftotalproteinsandfromtheproteinstandardcurve(BSA).Thesecells,thatareblue-labeledandsimulatethe96-wellmicroplates,followthenumberinganddistributionofthemosquitoespreviouslydefined:mosquitoes1to40correspondtothepopulationundertest,andmosquitoes41to45belongtothesusceptiblereferencestrain,asdescribedinSection 4.3.2.

How to use File 1:

1) accordingtothesheet“instructions”ofFile 1,saveasthefile,withtheexpression“original data”,followedbythenameandlocalizationoftheanalyzedpopulationandtheyearofcollectionofspecimens;

2) renameeachsheet“date”withthedateofthetest:month,day,year;3) copytheoriginaldata(providedbythespectrophotometer) fromtheSoftMax

programandpasteinblankcellsonthesheet.Thenselectonlycellscontainingtheabsorbancevalues.Thesevaluesaretransferredtotheblue-labeledcells,des-ignatedtoreceivetheabsorbancevaluesforeachenzyme.Henceforth,datainsertedinFile 1sheetswillbeusedtofilloutthefollowingfiles(Files 2 to 4).Thesefilescontaincalculationstoconverttheabsorbanceval-uesinenzymaticactivity(Files 2 and 3)andtopoolallthetestsfromthesamepopulation(File 4).


preencherospróximosarquivos(Arquivos 2 a 4),quecontêmoscálculosparaaconversãodosvaloresdeabsorbânciaematividadeenzimática(Arquivos 2 e 3)eparaoagrupamentodetodosostestesdeumamesmapopulação(Arquivo 4).


10.2. Arquivo 2 – conversão dos valores de absorbância

(exceção de PNPA-EST)

Énestearquivoqueosdadosoriginaisserãoconvertidosematividadeenzimáticaecorrigidospeloconteúdototaldeproteínasdecadamosquito.Estearquivocontémtodos os cálculos que foram descritos na Seção 9 para cada enzima testada, comexceçãodaEsterase“PNPA”,cujoscálculossãoefetuadosemumarquivoseparado(Arquivo 3).O Arquivo 2 é composto por 14 planilhas. Na primeira, “instruções”, estão as ins-truçõesdepreenchimento.As10planilhasseguintesdestinam-seaoprocessamentodedadosdecadaensaioespecíficoerecebemosnomesdasenzimasavaliadas.Emalgunscasoshámaisdeumaplanilhaparaomesmoteste:a) curva-padrãodeproteína–duasplanilhas,paraseremusadasseascurvas-padrão,

comBSA,foremfeitasdeacordocomaalternativa1ou2(Seções 5.7.1 ou 5.7.2);b) GST–umaplanilha,“GST cinética”, temespaçoparatransferênciadetodosos

dadosdesteensaioenquantooutra,“GST T20-T10”,temespaçoapenasparaospontosusadosnoscálculos(10e20minutosdereação).Estasegundaplanilhaépreenchidaautomaticamente,quandoosdadossãotransferidosdoArquivo 1paraoArquivo 2,planilha “GST cinética”;

c) MFO–umaplanilhaparacálculodeatividadeexpressaemµg, "MFO ugC”, eoutraplanilhaparacálculodeatividadeexpressaemnmoles,“MFO nmolC”.


10.2. File 2 – conversion of absorbance values (except PNPA-EST)

Inthisfileoriginaldataareconvertedtoenzymaticactivityandcorrectedaccordingtothetotalproteincontentofeachmosquito.ThisfileincludesallthecalculationsdescribedinSection 9foreachtestedenzymewiththeexceptionofPNPA-EST,cal-culatedinaseparatefile(File 3).File 2has14sheets,thefirstofwhich, “instructions”,containsthefillingoutinstruc-tions.The10followingsheetsaredesignatedforthedataprocessingofeachspecificassay.Thesesheetscorrespondtotheenzymeevaluated,insomecasesmorethanonesheetforthesameassay:a) proteinstandardcurve–twosheets, if thestandardcurve,withBSA,hasbeen

establishedaccordingtoalternative1or2 (Sections 5.7.1 or 5.7.2);b) GST–twosheets:thefirst,“GST kinetics”, fortransferenceofall thedatafrom

thisassayandtheother,“GST T20-T10”,forthetimepointsthatareusedinthecalculations(10and20minutesofreaction).Thissecondsheetiscompletedauto-matically,whendataaretransferredfromFile 1toFile 2,sheet“GST kinetics”;

c)MFO–twosheets:thefirstforactivitycalculationwhenexpressedinµg(“MFO ugC”)andtheotherinnmols(“MFO nmolC”).


Seguem-seentãotrêsplanilhas:a) “consolidado”,quefornece,automaticamente(comexceçãodePNPA-EST,verSe-

ção 10.3),umatabelacomosresultadosfinais,paratodososmosquitosanalisa-dos,dosensaioscomcadaenzimaquantificada;

b) “gráficos”, que apresenta tabelas com a classificação dos mosquitos analisados,porfaixadeatividadedecadaenzima.Estaplanilhaforneceaindahistogramas,umparacadaenzima,comosperfisdosmosquitosavaliados.Esteshistogramasmostramoperfildapopulaçãotestada(nomáximo40mosquitosporteste)edosmosquitos-controle(nomáximo5mosquitos);

c) “convenções”,que informaosvolumesdehomogenatousadosparao testecomcadaenzimaedáinstruçõessobreaconstruçãodosgráficoscomosperfisdaspo-pulações.Estaplanilhanãoéusadarotineiramenteeserveapenasparaconsulta.

Similarmente ao Arquivo 1, aqui também encontram-se, em cada planilha, qua-drantesazuis,quesimulamasmicroplacasdetestesondeserãocoladososvaloresdoArquivo 1.Nestesquadrantesestãoaindadiscriminadasasposiçõesdestinadasaosvaloresdereferência(“brancos”,controlespositivosemosquitosdacepareferência,embranco,amareloe rosa, respectivamente).EmalgumasplanilhasdoArquivo 2existemcélulascoloridasdelilás.Estascorrespondemaoslocaisondedevemserin-seridososcoeficientesangularesdealgumascurvas-padrão,comodetalhadoabaixo(“Observações sobre o Arquivo 2”,itens1e3).


1) deacordocomaplanilha“instruções”doArquivo 2,salvarcomooarquivo,comonomeealocalizaçãodapopulaçãoavaliadaeadataderealizaçãodoteste;

2) transferirosdadosdoArquivo 1paraasplanilhasdecadaenzimadoArquivo 2.Istoéfeitoparatodasasenzimas,comexceçãodaPNPA-EST(verSeção 10.3);

3) descartarasamostrascujasréplicastiveremapresentadodesvio-padrãoacimadoaceitável.Seguirasindicaçõesdaplanilha“instruções”;

4) verificarosperfisobtidosparacadaenzimanaplanilha“gráficos”.Osdadosrela-tivosatodasasenzimasestãotambémdispostosemumatabelanaplanilha“con-solidado”,deondepodemser transferidosparaqualqueroutroprograma,paraanáliseposteriorouparaconfecçãodeoutrostiposdegráfico;

5) Oscritériosutilizadosnolaboratórioparainterpretaçãodosresultadosestãode-talhadosnaSeção 11.


Threeadditionalsheetsfollow:a)“consolidate”,asheetthatautomaticallyexhibits(withexceptionofPNPA-EST,seeSection 10.3)atablewiththefinalresultsforallmosquitoesanalyzedforeachen-zymethathasbeenquantified;b)“graphs”,a sheet thatpresents tables (one forenzyme)with theclassificationoftheevaluatedmosquitoeswithrespecttorangeofactivity.Thissheetalsopresentshistograms,oneforeachenzyme,withtheprofilesofthetestedmosquitoes.Thesehistogramsdisplaytheprofilesofthepopulationevaluated(40mosquitoespertest,maximum)andmosquitocontrols(5mosquitoes,maximum);c)“conventions”,thissheetcontainsinformationregardingthemosquitohomogenatevolumesusedintheassayswitheachenzymeandprovidesinstructionsforthecon-structionofthehistogramswiththepopulationprofilesoftheenzymaticactivities.Thissheetisnotroutinelyusedandwasincludedonlyforconsultation.

SimilartoFile 1,eachsheetofthisfilehasblue-labeledareas,simulatingthe96-wellmicroplate,whereFile 1valuesare“pasted”.Thepositionscorrespondingtoreferencevalues (“blanks”, positive controls and reference strain mosquitoes, respectively inwhite,yellowandpink)arealsodiscriminated.InsomeFile 2 sheetstherearelilaccells,correspondingtotheplaceswheretheslopesofsomestandardcurvesmustbeinserted,asdetailedbelow(“Observations regarding File 2”, items 1 and 3).

How to use File 2:

1)accordingtothe“instructions”sheetofFile 2,saveasthefile,withthenameandlocationoftheanalyzedpopulation,togetherwiththedateofthetest;

2)transferdatafromFile 1tothesheetscorrespondingtoeachenzymeofFile 2.ThisisdoneforalltheenzymeswiththeexceptionofPNPA-EST(seeSection 10.3);

3) discard samples if replicatespresent standarddeviationbeyond theacceptable.Followindicationsonthe“instructions“sheet;

4) verifytheprofilesobtainedonthesheet“graphs”.Dataforalltheenzymesarealsodisplayedinonetableonthesheet“consolidate”.Datainthistablecanbetrans-ferredtoseveralotherprogramsifonewantstofurtheranalyzeorconstructotherkindsofgraphs.

5) ThecriteriautilizedinourlaboratoryfortheinterpretationofresultsaredetailedinSection 11.


Observações sobre o Arquivo 2:

1) acurva-padrãodeBSAérealizadasemprequesefizerumensaiobioquímico,jus-tificandoapresençadeumaplanilha“curva ptn”noArquivo 2.Osdadosobtidoscomestacurvasãousadosnadosagemdeproteínastotaiseovalordocoeficienteangular(a)dacurva-padrãoseráutilizado,porsuavez,paracalcularaquantidadedeproteínastotaispormosquito,acadateste.Apartirdaí, todososvaloresdeatividade enzimática são corrigidos automaticamente para o conteúdo total deproteínasdecadamosquitoemtodasasplanilhasdasenzimasassociadascomàresistênciametabólica;

2) somenteparaaAcetilcolinesterase,enzimarelacionadacomaresistênciaporalte-raçãodosítio-alvo,nãoénecessáriaacorreçãoparaototaldeproteínas:aanálisedestesresultadosestábaseadanadiferençadesuaatividadecomousempropoxur(Seção 9.1);

3) osvaloresdoscoeficientesangularesobtidoscomascurvas-padrãoparaEstera-seseMFO(Seções 5.3.1, 5.4.1 e 5.2.1)tambémdevemserusadosparaconverterosvaloresdeabsorbânciaemvaloresdeatividade,noscálculosdasrespectivasplanilhasdoArquivo 2.Notequeestascurvas-padrãonãoestãoincluídasnestearquivo, sendo realizadas separadamente.Paracalcular-lhesos coeficientesan-gularesadota-seomesmoprocedimentoempregadoparaacurvadeproteínas(descritonaSeção 9.2).Afreqüênciaderealizaçãodessascurvasvaidependerdanecessidadedecadalaboratório(vernota 14,naSeção 5);

4) naparteinferiordasplanilhasrelativasàsenzimas,osresultadosfinaisparacadamosquito, jácorrigidos,serãomostrados.Estesvaloresserepetirãonaplanilhadenominada “consolidado”, que reúne os resultados de todas as planilhas quecompõemoArquivo 2;

5) naplanilha“gráficos”,paracadaenzimasãoapresentadososperfisdosmosquitosavaliadosedosmosquitos-controle,paracomparação(verSeção 11 paradetalhes);

6) éimportanteressaltarqueaorganizaçãodetodososresultadosreunidosemumaúnicatabelapermiteanalisarosdadosdediferentes formas,nãoservindoape-nasparaaconstruçãodehistogramascomoodaFigura 1.Aconsolidaçãodestesdadospermite,porexemplo,avaliar,paraummesmomosquito,aatividadedecadaenzimaeestabelecercorrelaçõespotencialmenteimportantesentreasdiver-sasenzimas.Adicionalmente,outrasrepresentaçõesgráficaspodemseradotadas(verSeção 11 paraexemplos).


Observations regarding File 2:

1) oneproteinstandardcurve,withBSA, isestablished foreachnewbiochemicalassay.Thisisthereasonfora“ptn curve”sheetinFile 2.Dataobtainedwiththiscurveareusedinthedosageoftotalproteins,andtheslope(a)valueofthestan-dardcurveisutilizedtocalculatetheamountoftotalproteinsofeachmosquitoofagiventest.Fromthispointonalltheenzymaticactivityvalueswillbeautomati-callycorrectedaccordingtothetotalproteincontentofeachmosquitoinalltheenzymesheetsrelatedtometabolicresistance;

2) onlyinthecaseofAcethylcholinesterase,theenzymerelatedtotarget-sitere-sistance,iscorrectionaccordingtototalproteincontentnotnecessary:analysisoftheseresultsisbasedonthedifferenceinactivitywithorwithoutpropoxur(Section 9.1);

3) theslopevaluesobtainedwiththeEsterasesandMFOstandardcurves(Sections

5.3.1, 5.4.1 and 5.2.1)arealsousedtoconvertabsorbanceinactivityvaluesinthecorrespondingsheetsofFile 2.Notethatthesestandardcurvesarenotincludedinthisfile,astheyareconstructedseparately.Tocalculatetheslopesofthesecurves,thesameprocedurefortheproteinstandardcurve(describedinSection 9.2)isadopted.Theconstructionfrequencyofthesecurvesdependsonindividuallabo-ratorynecessity(see footnote 14, atSection 5);

4) inthelowerpartoftheenzymesheets,thefinalresultrelatedtoeachmosquito,alreadycorrected,willbedisplayed.Thesevalueswillberepeatedinthe“consoli-date”sheet,thatpoolsresultsofallFile 2sheets;

5) thesheet“graphs”exhibitstheprofileofeachenzyme,forcontrolandtestedmos-quitoes,therebyenablingcomparison(seeSection 11fordetails);

6) itisimportanttostressthatorganizationofalltheresultsinonetableallowstheanalysis of data in different ways, as well as affording representations differentfromthehistogramdisplayedinFigure 1.Forinstance,theconsolidationofthesedataenablessamemosquitoevaluationofactivityrelatedtoeachenzymeandes-tablishmentofcorrelationsamongtheenzymesthatmayberelevant.Inaddition,othergraphicrepresentationscanbeadopted(seeSection 11forexamples);


10.3. Arquivo 3 - conversão dos valores de absorbância

de PNPA-EST

Consideramosimportante,nocasodaPNPA-EST,incluirapenasmosquitosquenãoapresentemoscilaçõesexcessivasnacinéticadeatividadedestaenzima.Paraissoénecessário verificar, para cada mosquito, a correlação entre os dados obtidos e osvaloresesperados.Estaverificaçãoéfeitacomaconstruçãodegráficosquemostramaatividadeenzimáticadecadamosquitoaolongodotempo–ecomocálculodosrespectivosíndicesdecorrelação(R2).Comoovolumededadosparaestaavaliaçãoémuitogrande,trabalha-se,paraPNPA-EST,comumarquivoseparado.OArquivo 3 calcula,para todososmosquitosdeum teste, a atividadedaenzimaPNPA-EST,expressaem∆Abs/mgptn/min.OArquivo 3 écompostoportrêsplanilhas,denominadas:a) “instruções”;b) “cálculo PNPA”,ondeestãoosgráficosdemosquitosindividuais.Aquiépossível

avaliarosmosquitosparaosquaisacinéticadaPNPA-ESTapresentoumuitaos-cilação.Estaplanilhatambémdiscriminaasamostrascujasréplicasapresentamdesviopadrãoacimadoaceitável;

c)“cálculo atividade”,ondeéfeitaacorreçãodaatividadepeloconteúdototaldeproteínasdecadamosquito.OsgráficosquemostramoperfildeatividadedePNPA-ESTdototaldemosquitosavaliadosemumtesteestão localizadosnoArquivo2,planilha “gráficos”.

Naplanilha“cálculo PNPA”existemespaços,coloridosdeazul,destinadosarece-berosdadosbrutosdeabsorbânciadacinéticadestaenzima.Naplanilha“cálculo atividade”devemserinseridososvaloresdeproteínatotaldecadamosquito,cal-culadosnoArquivo 2.


1) deacordocomaplanilha“instruções”doArquivo 3,salvarcomooarquivo,comotermo“PNPA”,seguidodonome,dalocalizaçãodapopulaçãoavaliadaedadataderealizaçãodoteste;

2) transferirosdadosdacinéticadePNPAdoArquivo 1paraaplanilha “cálculo PNPA”;

3) transferirosdadosdeproteínatotal/mosquitodoArquivo 2paraaplanilha“cál-culo atividade”;

4) descartarasamostrascujasréplicastiveremapresentadodesviopadrãoacimadoaceitávelequandooíndicedecorrelaçãoforbaixo.Seguirasindicaçõesdaplani-lha“instruções”;

5) copiarosresultadosobtidosnaplanilha“cálculo atividade”ecolarnoArquivo 2

dotestecorrespondente,planilha“consolidado”.


10.3. File 3 – conversion of PNPA-EST absorbance values

Weconsiderthat,inthecaseofPNPA-EST,itisimportanttoincludeonlymosquitoeswhoseactivitykineticsdoesnotoscillateexcessively.Toaccomplishthis,itisnecessarytoverify,foreverymosquito,thecorrelationbetweentheobtainedresultsandtheex-pectedvalues.Thisisachievedbytheconstructionofgraphicsexhibitingtheenzymaticactivityofeachmosquitothroughouttimetogetherwiththecalculationoftherespec-tivecorrelationindexes(R2).Sincethisevaluationgeneratesahugevolumeofdata,theconversionofPNPA-ESTabsorbancevaluesisreservedforaseparatefile.File 3 calculates,forallthemosquitoesofagiventest,theactivityofPNPA-EST,ex-pressedin∆Abs/mgprotein/min.File 3contains3sheets,entitled:a)“instructions”;b)“PNPA calculation”,containinggraphicsforindividualmosquitoes.InthissheetitispossibletoevaluatethemosquitoespresentingPNPA-ESTkineticswithahighoscillation.Itisalsopossibletodiscriminatesampleswithanunacceptablestandarddeviation;c)“activity calculation”wherecorrectionofactivityaccordingtothetotalproteinamountofeachmosquitoisperformed.GraphswiththePNPA-ESTactivitypro-fileofthepoolofmosquitoesevaluatedinonetestisdisplayedisshowninFile2,sheet“graphs”.Thesheet“PNPA calculation”presentsblue-labeledcellsassignedtoreceivetheorigi-nalabsorbancevaluesofthewholekineticsofthisenzyme.Totalproteinvaluesofeachmosquito,calculatedinFile 2,are“pasted”inthesheet“activity calculation”.

How to use File 3:

1) accordingtothesheet“instructions”ofFile 3,saveas thefilewiththeexpression“PNPA”,followedbythenameandlocationoftheanalyzedpopulationtogetherwiththedateofthetest;

2) transferPNPA-ESTkineticsresultsfromFile 1 tothesheet“PNPA calculation”;3) transfertotalprotein/mosquitodatafromFile 2 tothesheet“activity calculation”;4) discardsamplesifreplicatespresentstandarddeviationbeyondacceptableorif

thecorrelationindexislow.Followindicationsinthesheet“instructions”;5) copytheresultsobtainedfromthesheet“activity calculation”andpastetoFile 2

ofthecorrespondingtest,sheet“consolidate”.


10.4. Arquivo 4 - total dos dados de cada população

OArquivo 4temcomoobjetivoconsolidarosresultadosdetodososexperimentosdecadapopulaçãoanalisada.Emprincípio,deveexistirumArquivo 4paracadapo-pulaçãoavaliada.Alternativamente,podeserfeitoapenasumArquivo 4 comváriasplanilhas,umaparacadapopulaçãoavaliadaemumadeterminadaépoca.Estearquivoapresenta,alémdaplanilha“instruções”,maisduasplanilhas:“dados”e“gráficos”.Paraaplanilha“dados”sãotransferidososresultadosobtidoscomtodosostestescompletos(Arquivo 2,depoisdainclusãodosdadosdePNPA-EST)deumamesmapopulação.Aplanilha“gráficos”gera,automaticamente,histogramascomosperfisdaquelapopulaçãoparacadaenzimaavaliada.


1) deacordocomaplanilha“instruções”doArquivo 4,salvarcomooarquivo,comotermo“total”seguidodonomeedalocalizaçãodapopulaçãoedoanodecoletadomaterialavaliado;

2) alternativamente,podesergeradoumarquivo“total”paracadagrupodepopu-laçõesavaliadasemumamesmaépoca.Nestecaso,oarquivodevesernomeadocomotermo“total”,seguidodoanodecoletadomaterial;

3) naplanilha“dados”existemespaços,organizadosemcolunas,parainserçãodosresultadosobtidoscomcadaenzima,paratodosostestescomumamesmapopu-lação.Paraistobastacolarnestesespaçosascélulas“copiadas” dasplanilhas“con-solidado”decadaArquivo 2deumadeterminadapopulação:dadosreferentesaos40mosquitosdapopulaçãodecampo(números1a40,umavezqueosmosquitos41a45sãodacepa-controle);

4) esteprocedimentoérepetido,seqüencialmente,comcadatesterealizado,atéqueessaplanilhacontenhaosresultadosdetodosostestesefetuadoscomumadeter-minadapopulação;

5) osresultadosdeatividadeenzimáticaeosnúmerosdemosquitostestadosserãousadosnaconstruçãodoshistogramas,queaparecerãosimultaneamenteàinser-çãodosdadosnaplanilhadenominada“gráficos”.Aofinal,pode-seobservaroperfilenzimáticodapopulação;

6) as classes definidas no Arquivo 4 contemplam as populações de mosquito quetêmsidoavaliadaspornós.Seoperfildeumadeterminadapopulaçãoformelhorrepresentadoporoutrointervalodeclasses,bastaredefini-los.Paraissodeve-seconsultaroArquivo 2,planilha“convenções”.


10.4. File 4 – total data of a given population

File 4 poolstheresultsofalltheassayswithonepopulation.Inprinciple,oneFile 4 shouldbecreatedforeachpopulation.Alternatively, theremaybeonlyone File 4 containing several sheets, one for each population evaluated in agivenperiodoftime.Thisfileconsistsof,besidesthesheet“instructions”,twomoresheets:“data”and“graphs”.Resultsobtainedfromallthecompletedtests(File 2,afterinsertionofPNPA-EST) are transferred to the sheet “data”. The sheet “graphs” generates,automatically,histogramswith theprofilesof thepopulation for eachenzymeevaluated.

How to use File 4:

1) accordingtothesheet“instructions”of File 4,“save as”thefilewiththeexpression“total”, followedby thenameand locationof theanalyzedpopulationwith theyearofcollectionofspecimens;

2) alternatively,a“total”filecanbegeneratedforagroupofpopulationsevaluatedinagivenperiod.Inthiscase,thefileshouldbeentitled“total”followedbytheyearofspecimencollection;

3) thesheet“data”hasspace,organizedincolumns,toinsertresultsobtainedwitheach enzyme of all the tests with the same population. In order to do this itis sufficient to paste in these cells data “copied” from the sheets “consolidate”ofeachFile 2 ofthatpopulation:dataconcerningthe40mosquitoesfromthepopulationundertest(numbers1to40,sincemosquitoes41to45belongtothecontrolstrain);

4) thisprocedureisrepeated,sequentially,witheverytestperformed,untilthissheetcontainstheresultsfromallthetestswithagivenpopulation;

5) theenzymaticactivityresultsandthenumberoftestedmosquitoesareusedintheconstructionofhistogramsthatappearsimultaneouslywiththeinsertionofdata,onthesheet“graphs”.Asafinalresult,theenzymaticprofileofthepopulationcanbeobserved;

6) enzymaticactivityclassesdefinedinFile 4 areadequateforthemosquitopopula-tionsthatarebeingevaluatedinourlaboratory.Iftheprofileofagivenpopulationisbetterrepresentedbyotheractivityintervalclasses, it issufficienttoredefinethem.Inordertodothis,gotoFile 2,sheet“conventions”.


11. INTERPRETAÇÃO DOS RESUlTADOS

11.1. Critérios para inclusão de avaliações

de mosquitos individuais

1) Todososensaiossãorealizadosemduplicata,paraquepossahavercontroledaqualidadedamanipulação.Deacordocomisso,definimos,comocritérioarbitrá-rio,rejeitartodasasamostrasparaasquaisodesviopadrãoentreasréplicasformaiorque30%damédia.NosArquivos 2e3,ocálculodasmédiasedodesviopadrãoentreasréplicaséfeitoautomaticamente,assimcomoocálculodopercen-tualqueodesviopadrãorepresentadamédia.Adicionalmente,asamostrasquedevemserrejeitadasaparecemnegritadaseemvermelho,bastandoeliminá-lasdoscamposindicadosnasSeções 10.2(“Como usar o Arquivo 2”,item3)e10.3(“Como usar o Arquivo 3”,item4),enasplanilhas“instruções”destesarquivos.

2) AdosagemdePNPA-ESTéfeitacomacompanhamentodacinéticadereação.Nestecaso,alémdedescartarasamostrasquenãoatendemaocritérioexpli-cadoacima,optamosporeliminar tambémmosquitosquandoaoscilaçãodacinéticadereaçãoémuitogrande.Definimos,igualmentecomocritérioarbi-trário,eliminarasamostrasparaasquaisacorrelaçãoentreosdadosobtidoseesperados(R2)éinferiora0,9.OpreenchimentodoArquivo 3comosdados


11. INTERPRETATION OF RESUlTS

11.1. Criteria for inclusion of evaluations from

individual mosquitoes

1) Inordertocontrolthequalityofmanipulation,alltheassaysarecarriedoutwithduplicatesamples.Accordingly,wedecidedasanarbitrarycriterion,torejectallsamplesforwhichthestandarddeviationbetweenthereplicaswashigherthan30%ofthemean.InFiles 2and3themeanandstandarddeviationbetweenrep-licatesarecalculatedautomatically.Thesefilesalsocalculatethestandarddevia-tionrepresentationwithrespecttothemean.Inaddition,samplesthataretoberejectedappearinboldandred.SufficeittoeliminatethesesamplesfromthecellsindicatedinSections 10.2(“Howto use File 2”,item3)and10.3 (“How to use File

3”,item4)aswellasonthe“instructions”sheetofthesefiles.2) QuantificationofPNPA-ESTevaluatesthereactionkineticsoftheenzyme.Inthis

case, inaddition to therejectionofsamplesaccording to thecriteriondetailedabove,weopted toeliminatemosquitoeswhentheoscillationof their reactionkineticsisveryhigh.Wedefined,alsoasanarbitrarycriterion,theeliminationofsampleswhenthecorrelationbetweentheobtainedandexpectedresults(R2)islowerthan0.9.FillingoutFile 3withabsorbancedatageneratesonegraphfor


deabsorbânciageraumgráficoparacadamosquitoavaliado.Nestesgráficos,ovalordeR2deveserinspecionadoeasamostrascujosR2foreminferioresa0,9devemserdescartadasdoscamposindicadosnaSeção 10.3(“Como usar Arqui-

vo 3”,item4)enaplanilha“instruções”.3) Antesdostestescomaspopulaçõesdecampo,deve-seobteroperfil,paratodas

asenzimasaquidiscriminadas,deumacepareferênciadesusceptibilidadeain-seticidas.Esteperfiléobtidofazendo-seoensaiocompletopelomenostrêsvezes,totalizando aproximadamente 100-120 mosquitos. Os perfis da cepa referênciaparacadaenzimaservemparacomparaçãocomaspopulaçõesdecampo(nossolaboratóriousaalinhagemRockefeller).

4) Osperfisdacepareferênciamencionadosnoitemanteriortambémauxiliamnocontroledaqualidadedostestescomcadapopulaçãodecampo.Paraissoéconve-nientecompararosperfisdacepareferência,mencionadosacima,comosresulta-dosobtidosparaoscincoespécimesusadoscomocontroleinternoemcadateste.Seosvaloresforemequivalentes,otestepodeserconsiderado.

11.2. Critérios para classificação das populações

1) Representações gráficas: uma opção à representação gráfica convencional,mostrada na Figura 2, é a inclusão, em um só gráfico, de todas as populações deumasériedeavaliações.Esteprocedimentofacilitaacomparaçãodiretadaativida-deenzimáticaentrepopulações.Nestegráfico,ainclusãodalinhagemdereferência,susceptívelainseticidas,permiteavisualizaçãodoníveldealteraçãodeatividadedecadapopulação.No entanto, consideramos que, para este tipo de representação, parâmetros comomédiaedesviopadrãonãosãoosmaisadequados:emmuitoscasos,osindivíduosdeumapopulaçãonãoseguemumadistribuiçãonormalparaascaracterísticasava-liadasnoescopodestemanual.Emparticular,aspopulaçõesnasquaisaresistênciaéincipiente,apresentandopoucosindivíduosalterados,sãoespecialmenterelevantesparaomonitoramento,poispossibilitamumaintervençãonocampoantesqueessaresistênciaatinjaumlimiarderiscoparaocontroledovetor.Umadasalternativasaosparâmetros“média”e“desviopadrão”éousodamediana.Graficamente,arepresentaçãodaspopulaçõespodeserfeitacomgráficostipobox-plot, emquea linhano interiordacaixa indicaamediana;os limitesdacaixa,osquartis;easlinhasverticaisforadascaixas,osindivíduoslimítrofesdapopulação(Fi-gura2a).Umaoutrarepresentaçãográficaquetambémpodeserusadaaparececomoumanuvemdepontos(gráficodepontos),quemostra,deformadireta,aatividadedecadaindivíduo,fornecendoumaidéiaprecisadoperfildapopulação(Figura2b).NenhumadestasduasrepresentaçõesestádisponívelnosArquivos 1 a4aquidescritos.Oprocedimentoatualnolaboratórioétransferirosdadosdo Arquivo 4paraoprogra-maGraphPadPrismversão4.00,paraconfecçãodosgráficosbox-plotoudepontos.


eachevaluatedmosquito.Inthesegraphics,theR2valuemustbeinspectedandsampleswithR2lowerthan0.9arediscardedfromthecellsindicatedinSection

10.3(“How to use File 3”,item4)andonthe“instructions”sheet.3) Prior to test initiationwithfieldpopulations it isnecessary toobtainprofiles

foralltheenzymeshereindiscriminatedofaninsecticide-susceptiblereferencestrain.Thisprofileisobtainedafteratleastthreecompleteassays(totalizingap-proximately100-120mosquitoes).Theprofilesofthereferencestrainforeachenzymeenablecomparisonswithfieldpopulations(ourlaboratoryusesRock-efellerstrain).

4)Thereferencestrainprofilesmentionedabovealsohelptocontrolthequalityofthetestsperformedwithfieldpopulations.Toaccomplishthis,itisconvenienttocomparethereferencestrainprofiles,mentionedabove,withtheresultsobtainedfromthe5mosquitoesusedasinternalcontrolsineachtest.Ifvaluesareequiva-lent,thetestcanbeconsideredvalid.

11.2. Criteria for population classification

1)Graph representation: oneoption to theconventionalgraphic representa-tion,showninFigure 2,istheinclusion,inonlyonegraph,ofallpopulationsfromaseriesofevaluations.Thisprocedurefacilitatesthedirectcomparisonofenzymaticactivityamongpopulations.Inthisgraph,theinclusionoftheinsecticide-suscep-tible reference strain enables visualization of the activity alteration level of eachpopulation.Howeverweconsiderthatforthiskindofrepresentationparameterssuchasmeanandstandarddeviationarenotadequate:inseveralcasesindividualsofonepopula-tion do not follow the normal distribution for the characteristics evaluated in thescopeofthishandbook.Inparticular,populationswithanincipientenzymaticaltera-tion,presentingonlyafewaffectedspecimens,areespeciallyrelevanttoresistancestatusmonitoring.Identificationofthesepopulationsallowsinterventioninthefieldbeforeresistanceattainsathresholdthatrepresentsarisktovectorcontrol.Oneofthealternativestotheparameters“mean“and“standarddeviation“istheuseofthemedian.Inthiscase,differentpopulationsarerepresentedinbox-plotgraphs,wherethelineinsidetheboxindicatesthemedian,theboxlimitsrepresentthequar-tilesandtheverticallinesoutsidetheboxexhibitthelimitsofthedistribution(Figure2a).Anothergraphrepresentationthatmayalsobeadoptedappearsasacloudofpoints(scatterplot).Thisrepresentationdisplaysdirectlytheactivityofeachindi-vidual,givingaprecisedescriptionofthepopulationprofile(Figure2b).NeitherofthesetworepresentationsisavailableinFiles 1 to4,hereindescribed.OurlaboratoryprocedureistotransferdatafromFile 4toprogramGraphPadPrismver-sion4.00,inordertoconstructtheboxorscatterplot.


12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0Ati

vid

ade/

min

mg

ptn

/A

tivi

dad

e/m

inm

g p

tn/

ROCK A B C

ROCK A B C

12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0

a)

b)

Figura 2: exemplos de representação gráfica de atividade enzimática nas populações de Aedes aegypti. Painel alto (a): gráfico tipo box-plot; painel acima (b): gráfico de pontos. Apresentam-se os perfis de atividade de Esterase, quando o substrato PNPA é usado, na cepa referência Rockefeller (ROCK) e em três populações de campo (A, B, C).

2)Quando classificar um perfil enzimático como normal ou alterado

Comparaçõesdoperfilenzimáticoentreaspopulações,pormeiodeanálisesesta-tísticas,paramétricasenãoparamétricas, revelaramdiferenças significativas,mes-moquandoestasdiferençasnãoeramrelevantesemtermosfuncionais.Estefoi,porexemplo,ocasocomaACEempopulaçõesbrasileirasdovetor:aanáliseestatísticamostrouqueaspopulaçõesdecamposãomuitodiferentesdacepareferência,sus-ceptível.Contudo,deacordocomocritériodaOMS(queéumcritériofuncional),estaenzimaéconsideradasusceptívelseainibiçãodesuaatividadenapresençadepropoxurforigualoumaiorque70%(Hemingway 1998).Quandoestecritériofoiaplicadonaspopulaçõesavaliadas,verificou-sequeaACEde todasaspopulaçõesdeveserconsideradasusceptível.Decidimosentãotrabalharnadefiniçãodeumaclassificaçãoquetraduzisseestasdi-ferençasfuncionais–eparaistoavaliamos,deinício,precisamenteasatividadesob-tidasparaAcetilcolinesterase,enzimaparaaqualocritériofuncionaldeclassificaçãoébastanteaceito(Hemingway 1998).Foidefinidaumaclassificaçãoquerepresentaadequadamenteasdiferençasfuncio-naisencontradas,nãosóparaACE,comotambémparaasoutrasenzimasavaliadas.Estaclassificaçãosebaseianousodopercentil99dacepareferênciacomopontodecorte.Avalia-se,então,emcadapopulação,opercentualdeindivíduosqueapresen-tamatividadesuperioraopercentil99daenzimacorrespondentenacepareferência.Algunsexemplossãomostradosabaixo:


12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0Act

ivit

y/m

inm

g p

tn/

Act

ivit

y m

g p

tn/

/m

in

ROCK A B C

ROCK A B C

12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0

a)

b)

Figure 2: examples of graph representation of enzymatic activity in Aedes aegypti populations. Panel on top (a): box-plot; panel above (b): scatter plot. “PNPA” Esterase activity profiles are shown in the reference strain, Rockefeller (ROCK) and in three field populations (A, B, C).

2)How to classify a profile as normal or altered

Enzymaticprofilecomparisonsamongpopulationsthroughparametricandnon-parametric statistical analysis revealed significant differences even when thesedifferences were not functionally relevant. This was, for instance, the case withACEactivityinBrazilianvectorpopulations:statisticalanalysisdemonstratedthatseveral field populations were significantly different from the susceptible refer-encestrain.However,according toWHOcriterion(a functionalcriterion), thisenzymeisconsideredsusceptibleiftheinhibitionofitsactivityinthepresenceofpropoxuris70%ormore(Hemingway, 1998).Whenthiscriterionwasemployedintheevaluatedpopulations,itwasverifiedthatACEactivityofallofthemshouldbeconsideredsusceptible.Wethendecidedtoworkinaccordancewiththedefinitionofaclassificationthatwasrepresentativeofthesefunctionaldifferences.Preciselyduetothis,wefirstevaluatedACEactivity,as thisenzyme isassociatedwitha functionalclassificationcriterionthatiswidelyaccepted(Hemingway, 1998).Aclassificationwasdefinedthatrepresentsadequatelythefunctionaldifferencesthatwere found, regardingnotonlyACEbutalsootherenzymes.Thisclassification isbasedontheuseofreferencestrain99percentileasthecutoffvalue.Ineachpopula-tion,thepercentageofspecimenswithactivityabovethe99percentileoftherefer-encestrainiscalculated.Someexamplesareexhibitedbelow:


ACE MFO GST a-Est b-Est PNPA-Est

(% atividade com inibidor)

nmoles cit/mg ptn

mmoles/ mg ptn/min

nmol/ mg ptn/min

nmol/ mg ptn/min

DAbs/ mg ptn/min

25,12 33,77 1,79 48,62 81,18 3,58

Etapa 1–calculeopercentil99dacepareferênciaparacadaenzima(istoéfacilmen-terealizadoemplanilhaseletrônicas,comooExcel):

Exemplosdepercentis99paraumacepareferência.

Etapa 2 –calcular,paracadapopulação,opercentualdeindivíduoscomatividademaiorqueopercentil99dacepareferência.

Estepontodecortepermiteidentificardeformabastanteadequadaasdiferençasdeatividademedidas.Alémdisso,épossívelquantificarestadiferença,umavezquesãoatribuídos valores numéricos para cada população (vale lembrar que estes valoresrepresentamsempreumacomparaçãocomacepareferência).Decidimos,então,deformaarbitrária,categorizarosnúmerosencontrados:valoresentre0e15indicariamatividade“não alterada”,ouseja,equivalenteàdacepareferência;valoresentre15e50,indicariam“alteração de atividade”evaloresacimade50representariamativida-de“muitoalterada”.Pode-seatribuircoresaestesnúmerosparafacilitaravisualiza-çãodosresultados:

População ACE MFO GST a-EST b-EST PNPA-EST

A 0 0 21 14 4 21

B 0 0 45 39 39 44

C 0 0 61 33 2 27

D 2 2 0 23 21 14

E 0 24 0 93 80 0

F 0 0 0 3 1 18

G 3 35 2 77 61 19

H 11 0 15 0 19 81

I 0 0 0 48 16 0


Step 1 –calculate,foreachenzyme,99percentileofthereferencestrain(thisiseas-ilyachievedwithseveralspreadsheetsoftwares,likeExcel).

Examplesof99percentileforareferencestrain.

ACE MFO GST a-Est b-Est PNPA-Est

(% inhibition activity)

nmoles cit/mg ptn

mmoles/ mg ptn/min

nmol/ mg ptn/min

nmol/ mg ptn/min

DAbs/ mg ptn/min

25,12 33,77 1,79 48,62 81,18 3,58

Step 2 –calculate,foreachpopulation,thepercentageofspecimenswithactivityhigherthanthe99percentileofthereferencestrain.The numbers indicate, for hypothetical populations, the percentage of specimensabovethe99percentileofthereferencestrain.

Population ACE MFO GST a-EST b-EST PNPA-EST

A 0 0 21 14 4 21

B 0 0 45 39 39 44

C 0 0 61 33 2 27

D 2 2 0 23 21 14

E 0 24 0 93 80 0

F 0 0 0 3 1 18

G 3 35 2 77 61 19

H 11 0 15 0 19 81

I 0 0 0 48 16 0

Thiscutoffvalueenablestheconsistentidentificationofmeasuredactivitydifferences.Inaddition,itispossibletoquantifythisdifference;sincenumericvaluesareassignedtoeachpopulation(itisrelevanttonotethatthesevaluesexpressacomparisonwiththereferencestrain).Wethendecided,arbitrarily,toclassifythesevalues:0-15corre-spondsto“unaltered”activity,equivalenttothereferencestrain;15-50suggest“altered activity”;valuesabove50represent“highly altered”activity.Itispossibletogivecolorstothesenumbersinordertofacilitatetheresultvisualization.


População ACE Monox GST a-EST b-EST PNPA-EST

A 0 0 21 14 4 21

B 0 0 45 39 39 44

C 0 0 61 33 2 27

D 2 2 0 23 21 14

E 0 24 0 93 80 0

F 0 0 0 3 1 18

G 3 35 2 77 61 19

H 11 0 15 0 19 81

I 0 0 0 48 16 0

% pop. legenda

0-15

15-50

50-100

12. REFERÊNCIAS BIBlIOGRÁFICAS

FeyereisenR1999.InsectP450Enzymes.Annu Rev Entomol.44:507-33.HemingwayJ1998.Techniquestodetectinsecticideresistancemechanisms(fieldandlabo-

ratorymanual).WHO/CDC/CPC/MAL/98.6,WorldHealthOrganization,Geneva.InsecticideResistanceWorkshop1998.CentersforDiseasesControl.“Microplateas-

says”,Atlanta,GAS.32

Lima-CastelaniAR,CeronCR,BicudoHE2004.Variationofgeneticexpressiondu-ringdevelopment,revealedbyesterasepatternsinAedes aegypti(Diptera,Culici-dae)Biochem Genet42:69-84.

MontellanoPRO2004CytochromeP450:structure,mechanismandbiochemistry.3rded.Springer.ISBN:0306483246.

MouryaDT,HemingwayJ,LeakeCJ1993.ChangesinenzymetiterswithageinfourgeographicalstrainsofAedes aegyptiandtheirassociationwithinsecticideresis-tance.Med Vet Entomol7:11-16.

Sousa-PolezziR,BicudoH2005.GeneticvariationalongtimeinaBrazilianpopu-lationofAedes aegypti(Diptera:Culicidae),detectedbychangesintheesterasepatterns.Genetica125:43-53.

��Nesteworkshopforamapresentadasligeirasmodificaçõesdasmetodologiasdequantificaçãodediferentesenzimas,relacionadasnosartigos:BrogdonWG,DickinsonCM1983.AmicroassaysystemformeasuringEsteraseactivityandproteinconcentrationinsmallsamplesandinhigh-pressureliquidchromatographyeluatefractions.Analyt Biochem131:499-503.BrogdonWG1988.MicroassayofAcetylcholinesteraseactivityinsmallportionsofsinglemosquitohomogenates.Comp Biochem Physiol90C:145-150.BrogdonWG,BarberAM1990.MicroplateassayofGlutathioneS-transferaseactivityforresistancedetectioninsingle-mos-quitotriturates.Comp Biochem Physiol96B:339-342.BrogdonWG,McAllisterJC,VululeJ1997.HemePeroxidaseactivitymeasuredinsinglemosquitoesidentifiesindividualsexpressinganelevatedOxidaseforinsecticideresistance.J Amer Mosq Cont Assoc13:233-237.


Population ACE MFO GST a-EST b-EST PNPA-EST

A 0 0 21 14 4 21

B 0 0 45 39 39 44

C 0 0 61 33 2 27

D 2 2 0 23 21 14

E 0 24 0 93 80 0

F 0 0 0 3 1 18

G 3 35 2 77 61 19

H 11 0 15 0 19 81

I 0 0 0 48 16 0

% pop. legend

0-15

15-50

50-100

12. REFERENCES

FeyereisenR1999.InsectP450Enzymes.Annu Rev Entomol44:507-33.HemingwayJ1998.Techniquestodetectinsecticideresistancemechanisms(fieldandlabo-

ratorymanual).WHO/CDC/CPC/MAL/98.6,WorldHealthOrganization,Geneva.InsecticideResistanceWorkshop1998.CentersforDiseasesControl.“Microplateas-

says”,Atlanta,GAS.32

Lima-CastelaniAR,CeronCR,BicudoHE2004.Variationofgeneticexpressiondur-ingdevelopment,revealedbyesterasepatternsinAedes aegypti(Diptera,Culici-dae)Biochem Genet42:69-84.

MontellanoPRO2004CytochromeP450:structure,mechanismandbiochemistry.3rded.Springer.ISBN:0306483246.

MouryaDT,HemingwayJ,LeakeCJ1993.ChangesinenzymetiterswithageinfourgeographicalstrainsofAedes aegyptiandtheirassociationwithinsecticideresist-ance.Med Vet Entomol7:11-16.

Sousa-PolezziR,BicudoH2005.GeneticvariationalongtimeinaBrazilianpopu-lationofAedes aegypti(Diptera:Culicidae),detectedbychangesintheesterasepatterns.Genetica 125:43-53.

�� InthisWorkshopslightmodificationsoftheenzymesquantificationmethodologies,describedinthereferencesbelow,werepresented.BrogdonWG,DickinsonCM1983.AmicroassaysystemformeasuringEsteraseactivityandproteinconcentrationinsmallsamplesandinhigh-pressureliquidchromatographyeluatefractions.Analyt Biochem131:499-503.BrogdonWG1988.MicroassayofAcetylcholinesteraseactivityinsmallportionsofsinglemosquitohomogenates.Comp Biochem Physiol90C:145-150.BrogdonWG,BarberAM1990.MicroplateassayofGlutathioneS-transferaseactivityforresistancedetectioninsingle-mos-quitotriturates.Comp Biochem Physiol96B:339-342.BrogdonWG,McAllisterJC,VululeJ1997.HemePeroxidaseactivitymeasuredinsinglemosquitoesidentifiesindividualsexpressinganelevatedOxidaseforinsecticideresistance. J Amer Mosq Cont Assoc13:233-237


disque saúde 0800.61.1997

www.saude.gov.br/svs

www.saude.gov.br/bvs

MANUAL_LAFICAVE_CAPA.indd 2 4/12/2006 12:20:03

metodologia para quantificação de atividade de enzimas

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