Método Estreptoavidina-biotina-peroxidase (LSAB)

    Essa é a metodologia mais usada, na qual ocorre uma boa amplificação do sinal e trata-se de um método relativamente barato, no qual é usado um cromógeno em vez de fluorescência. Inicialmente, há a reação antígeno-anticorpo primário; depois, um anticorpo secundário marcado com biotina reage com esse complexo; por fim, um complexo protéico de estreptoavidina e peroxidase se liga as biotinas do anticorpo secundário. Esse complexo reage com peróxido de hidrogênio, emitindo uma coloração amarronzada.

Existem outros métodos, nos quais são usados outras enzimas associadas a cromógenos, anticorpos terciários e marcadores fluorescentes. Por ser a mais usada, esmiuçaremos a metodologia acima descrita.

Etapas do Método LSAB

1-    Desparafinização e hidratação das amostras cortadas em laminas de microscopia previamente silanizadas2-    Recuperação antigênica3-    Bloqueio da peroxidase endógena4-    Aplicação do anticorpo primário5-    Aplicação do anticorpo secundário biotinilado6-    Aplicação da estreptoavidina-peroxidase7-    Aplicação do substrato DAB8-    Contra-coloração9-    Desidratação e clarificação das amostras, com montagem das laminas        As amostras normalmente encontram-se emblocadas em parafina, depois de terem sido fixadas por formol, desidratadas em álcool e clarificadas com xilol. Essas amostras são então cortadas e adicionadas as laminas silanizadas, isto é, embebidas numa espécie de cola para evitar o descolamento do tecido ao longo dos passos da técnica.       Primeiramente, essas laminas com as amostras são submetidas a uma bateria de xilol em concentrações decrescentes para retirada da parafina e depois a uma bateria de álcool em concentração decrescente para retirada do xilol e hidratação. Ao fim, as amostras são colocadas em água corrente para hidratação total.      Quando o material fresco é submetido à fixação em formol 10%, as proteínas celulares sofrem alterações na sua estrutura terciaria e há ainda a formação de ligações cruzadas, tornando o reconhecimento antigênico difícil ou impossível. Dessa forma,

depois de reidratadas, as amostras devem sofrer um processo de recuperação antigênica, no qual mudanças de pressão, temperatura e pH quebram a maioria dessas ligações cruzadas e melhor expõem os epitopos alterados pela fixação com formol.      Terminada a recuperação antigênica, faz-se o bloqueio da peroxidase endógena. Como será melhor explicado adiante, a emissão da coloração acontece quando se aplica o DAB (cromógeno associado a peróxido de hidrogênio), reagindo com a peroxidase associada a estreptoavidina e emitindo cor. As células possuem a enzima peroxidase; se essa enzima não for bloqueada, quando se aplicar o DAB, haverá reação cruzada e ele vai reagir com a peroxidase endógena, de modo que não se terá como descobrir se a reação ocorreu porque houve reação antígeno-anticorpo ou porque reagiu com peroxidase já existente, havendo, assim, muitos falsos positivos. Assim, depois da recuperação antigênica, aplica-se hidróxido de hidrogênio as amostras, de modo que a peroxidase endógena seja esgotada.      Bloqueada a peroxidase endógena, as amostras são lavadas para retirada do excesso de H2O2 e é aplicado o anticorpo primário. Caso haja o antígeno de interesse, esse anticorpo reage e se liga a ele. Depois, as amostras são re-lavadas para tirar o excesso de anticorpo primário e então se aplica o anticorpo secundário biotinilado. Tendo havido a reação, esse anticorpo secundário reage com o complexo antígeno-anticorpo primário, ligando-se a ele.      Após a encubação das amostras com os anticorpos, a elas é aplicada a solução de estreptoavidina peroxidase, um complexo protéico que se liga fortemente as moléculas de biotina associadas ao anticorpo secundário. Assim, o cromógeno (DAB) é aplicado, reagindo com a peroxidase associada a estreptoavidina, emitindo coloração. Como sobre um único antígeno foi acrescentado um grande complexo formado por anticorpo secundário e varias estreptoavidinas-peroxidases, haverá uma grande amplificação da marcação, facilitando a interpretação do patologista.      Os últimos passos consistem em contra-corar a amostra com hematoxilina, para que as estruturas não marcadas possam também ser vistas ao microscópio, e em montar a lamina para analise, ou seja, desidratá-la em bateria de álcool com concentração crescente e depois retirar o álcool em bateria de xilol de concentração crescente. Por fim, coloca-se a lamínula sobre o tecido para conservação da amostra.