mestrado 2012fcfrp.usp.br/media/wcms/files/mestrado_2012.pdf · programa de pós graduação em...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

Programa de Pós Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia

MESTRADO – 2012

Aluno: Andrea Casella Martins

Orientador: Luciana Simon Pereira Crott

Defesa: 03/02/2012

Título: Investigação de efeitos imunomoduladores de veneno bruto de Titys serrulatus sobre funções de linfócitos T humanos

Title: Título:

Investigation of the immunomodulatory effects of crude venom of Tityus serrulatus on human T lymphocytes functions Investigación de los efectos inmunomoduladores de veneno crudo de Tityus serrulatus en las funciones de los linfocitos T humanos

Resumo: Escorpiões da família Buthidae estão envolvidos na maioria dos envenenamentos em todo o mundo. Tityus é um dos gêneros dessa família, sendo Tityus serrulatus a espécie mais perigosa, por estar envolvida em envenenamentos graves, nos quais as vítimas são crianças, podendo levar a óbito. As manifestações da picada incluem dor local, hipersensibilidade, hipertensão, manifestações cardiovasculares e edema pulmonar. A peçonha do T. serrulatus contem, entre outros componentes, várias toxinas que atuam em canais de K+, Na+ e Ca2+ e que são responsáveis pelos efeitos tóxicos do veneno. Estudos recentes mostraram que a peçonha de T. serrulatus pode ativar macrófagos que são críticos na resposta imune e desempenham papel fundamental na resposta humoral e celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos diretos dessas peçonhas sobre linfócitos humanos. Considerando que a modulação de funções celulares como proliferação, ativação e produção de citocinas pode desempenhar papel importante em envenenamentos, o presente estudo propôs: a) avaliar o efeito citotóxico do veneno bruto de Tityus serrulatus (VTs) sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); b) analisar o efeito do VTs sobre a modulação da expressão de marcadores fenotípicos (CD3, CD4, CD8 e CD19) e de marcadores de ativação celular, incluindo CD69, CD25 e HLA-DR em células T e B; c) avaliar o efeito do VTs sobre a proliferação de linfócitos T; d) avaliar a capacidade do VTs em modular a produção de citocinas pelas PBMC. Ensaios de citotoxicidade foram realizados pela técnica do MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) e mostraram que as concentrações de 500, 1000 e 2000 μg/mL do VTs apresentaram citotoxicidade baixa a moderada para PBMC (12,7, 22,2 e 23,7% de redução na viabilidade celular, respectivamente). Concentrações de 25, 50 e 100 μg/mL não foram citotóxicas. Com base nesses ensaios, estas ultimas concentrações foram utilizadas nos ensaios subsequentes. A citometria de fluxo foi empregada para avaliação da proliferação celular, da expressão de marcadores fenotípicos e de ativação celular, bem como para a quantificação de citocinas nos sobrenadantes de culturas celulares. As concentrações utilizadas não induziram alterações significativas nas subpopulações de linfócitos e não modificaram a expressão de marcadores de ativação em linfócitos T CD4+, CD8+ e B, após 24h de cultivo. O ensaio de proliferação celular, utilizando marcação concomitante com diacetato carboxifluoresceína succinimidyl ester (CFSE) e anticorpos monoclonais contra marcadores fenotípicos e marcadores de ativação celular, permitiu que se avaliasse não só a proliferação, mas a discriminação das diferentes subpopulações celulares e o estado de ativação das mesmas após 96h de cultivo. Os resultados sugerem que o VTs inibe a proliferação de linfócitos estimulados com fitohemaglutinina (PHA), e em especial a porcentagem de linfócitos T CD8+CD25+ (linfócitos T citotóxicos ativados). O VTs não foi capaz de induzir proliferação celular. Em contraste, o VTs quando adicionado isoladamente à cultura de PBMC, nas concentrações de 50 e 100 μg/mL, induziu a produção de IL-6

Programa de Pós-Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia - Defesas 2012 - MESTRADO

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(p<0,05 e p<0,01, respectivamente), uma citocina pró-inflamatória que desempenha papeis importantes nas respostas imunes

Summary: Scorpions of the Buthidae family are involved in most envenomations worldwide. Tityus is one of the genera of this family, being Tityus serrulatus the most dangerous species, because it is involved in severe envenomation, in which the victims are children and it can lead to death. The manifestations of scorpion sting are classified from mild to severe and its clinical signs include local pain, hypersensitivity, hypertension, cardiovascular manifestations and pulmonary edema. T. serrulatus venom contains, among other components, various toxins that act on K+, Na+ and Ca2+ channels, and are responsible for the toxic effects of the venom Recent studies showed that the venom of T. serrulatus (VTs) can activate macrophages that are critical to immune response and play a key role in the humoral and cellular response. However, little is known about the direct effects of these venoms on human lymphocytes. Considering that the modulation of cellular functions such as proliferation and induction of citokines production may play an important role in envenomation, the study proposed: a) to evaluate the cytotoxic effects of crude venom on peripheral blood mononuclear cells, b) to examine the effect of VTs on the modulation of expression of phenotypic markers (CD3, CD4, CD8 and CD19) and markers of cellular activation, including CD69, CD25 and HLA-DR on T and B cells c) to evaluate the VTs effect on the proliferation of T lymphocytes d) to evaluate the ability of VTs to modulate cytokine production by PBMC. Cytotoxicity assays were performed by the technique of MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) and showed that VTs concentrations of 500, 1000 and 2000 μg/mL showed low to moderate cytotoxicity to PBMC (12.7, 22.2 and 23.7% reduction in cell viability, respectively). Concentrations of 25, 50 e 100 μg/mL were not cytotoxic. Based on these tests, these concentrations were used in subsequent trials. Flow cytometry was used to assess cell proliferation, expression of phenotypic markers and cell activation, as well as for the quantification of cytokines in supernatants of cell cultures. The concentrations used did not induce significant changes in subpopulations of lymphocytes and did not modify the expression of activation markers on CD4+, CD8+ and B cells, after 24 hours of culture. The cellular proliferation assay, using simultaneously diacetate carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and monoclonal antibodies against phenotypic markers and cell activation markers, allowed the evaluation not only of proliferation, but the discrimination of different cell subpopulations and activation state of the same after 96h of culture. The results suggest that VTs inhibits the proliferation of lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin (PHA), and in particular the percentage of T lymphocytes CD8+ CD25+ (activated cytotoxic T lymphocytes). The VTs were not able to induce cell proliferation. In contrast, the VTs when added alone to the culture of PBMC at concentrations of 50 and 100 μg/mL induced production of IL-6 (p <0.05 and p <0.01, respectively), a proinflammatory cytokine that plays important roles in innate and adaptive immune responses. The increased secretion of IL-6, therefore, is not linked to increased cell proliferation. The presence of VTs concurrently with PHA tended to inhibit cytokine production by cells stimulated with PHA, as IL-10, TNF and IFN-gamma.The results suggest that the VTs is a potential source of substances with immunomodulatory actions on human T lymphocytes and stimulate further research to elucidate the mechanisms of action involved, including studies to consider the participation of ion channels of T lymphocytes in the phenomena observed. These investigations, along with the identification of the components of the venom responsible for the observed activities may contribute to the discovery of tools to study the pathophysiological mechanisms involved in the envenomation as well as for the discovery of new treatment alternatives for diseases mediated by the immune system.

Resumen:

Escorpiones de la familia Buthidae están involucrados en la mayoría de las intoxicaciones en todo el mundo. Tityus es uno de los géneros de esta familia, Tityus serrulatus es la especie más peligrosa, al estar involucrados en casos de envenenamiento grave, en el que las víctimas son niños y puede conducir a la muerte. Las manifestaciones de la picadura de escorpiones se clasifican de leves a severas y los signos clínicos incluyen dolor local, hipersensibilidad, hipertensión, manifestaciones cardiovasculares y edema pulmonar. El veneno de T. serrulatus contiene, entre otros componentes, varias toxinas que actúan sobre los canales de K+, Na+ y Ca2+ y son responsables de los efectos tóxicos del veneno. Estudios recientes muestran que el veneno de T. serrulatus puede activar a los macrófagos que son críticos para la respuesta inmune y tienen un papel clave en la respuesta humoral y


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celular. Teniendo en cuenta que la modulación de las funciones celulares como la proliferación y la inducción de la producción de citocinas pueden desempeñar un papel importante en los envenenamientos, el estudio propone: a) evaluar los efectos citotóxicos del veneno crudo de Tityus serrulatus (VTs) en las células mononucleares de la sangre periférica; b) analizar el efecto del VTs en la modulación de la expresión de marcadores fenotípicos (CD3, CD4, CD8 y CD19) y los marcadores de activación celular, como CD69, CD25 y HLA-DR en las células T y B; c) evaluar el efecto del VTs sobre la proliferación de los linfocitos T d) evaluar la capacidad del VTs para modular la producción de citocina por PBMC. Ensayos de citotoxicidad se realizaron mediante la técnica de MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) y mostraron que las concentraciones de 500, 1000 y 2000 μg/mL del VTs mostró baja a moderada citotoxicidad para PBMC (12,7, 22,2 y 23,7% de reducción en la viabilidad celular, respectivamente). Concentraciones de 25, 50 y 100 μg/mL no fueron citotóxicas. En base a estas pruebas, estas últimas concentraciones se utilizaron en los ensayos posteriores. Citometría de flujo fue utilizada para evaluar la proliferación celular, la expresión de marcadores fenotípicos y de activación de las células, así como para la cuantificación de citocinas en los sobrenadantes de cultivos celulares. Las concentraciones utilizadas no inducieron cambios significativos en las subpoblaciones de linfocitos y no modificaran la expresión de marcadores de activación de linfocitos CD4+, CD8+ y B, después de 24 horas de cultivo. El ensayo de proliferación celular utilizando simultáneamente diacetato caboxifluoresceína succinimidyl ester (CFSE) y anticuerpos monoclonales contra marcadores fenotípicos y marcadores de activación celular, permitió evaluar no solamente la proliferación, pero la discriminación de las diferentes subpoblaciones celulares y estado de activación del mismo después de 96h de cultivo. Los resultados sugieren que lo VTs inhibe la proliferación de linfocitos estimulados con fitohemaglutinina (PHA), y en particular la porcentaje de los linfocitos T CD8+ CD25+ (activa los linfocitos T citotóxicos). El VTs no fue capace de inducir la proliferación celular. Por otro lado, el VTs cuando añadido sólo a la cultura de PBMC en concentraciones de 50 y 100 μg/mL, indució la producción de IL-6 (p <0,05 y p <0,01, respectivamente), una citocina proinflamatoria que tiene un papel importante en la respuesta inmune innata y adaptativa. El aumento de la secreción de IL-6, por lo tanto, no está vinculado a la proliferación celular aumentada. La presencia del VTs al mismo tiempo que la PHA tiene una tendencia a inhibir la producción de citocinas por las células estimuladas con PHA, como IL-10, TNF e IFN-gamma. Los resultados sugieren que lo VTs es una fuente potencial de sustancias con acciones inmunomoduladoras en los linfocitos T humanos y estimulan nuevas investigaciones para aclarar los mecanismos de acción involucrados, incluyendo estudios para considerar la participación de los canales iónicos de los linfocitos T en los fenómenos observados. Estas investigaciones, junto con la identificación de los componentes del veneno responsables de las actividades observadas, pueden contribuir al descubrimiento de herramientas para estudiar los mecanismos implicados en el envenenamiento, así como para el descubrimiento de alternativas de tratamiento para las enfermedades mediadas por el sistema inmune.

Comissão:

Luciana Simon Pereira Crott Wagner Ferreira dos Santos Alexandra Ivo de Medeiros


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Aluno: Cássia Mariana Bronzon da Costa

Orientador: Ana Amelia Carraro Abrahão

Defesa: 17/08/2012

Título: Efeitos da administração de Zinco e L-arginina na prenhez de ratas Wistar infectadas pela cepa Y de Trypanosoma cruzi.

Title: Título:

Effects of zinc and L-arginine administration during pregnancy of Wistar rats infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi. Efectos de la administración de Zinc y L-arginina en la preñez de ratas Wistar infectadas por la cepa Y del Trypanosoma cruzi.

Resumo: O zinco é um elemento de grande importância para o desenvolvimento intra-uterino e é usado durante a gravidez para auxiliar o crescimento fetal. A arginina, um aminoácido dibásico, além de ser necessário para o crescimento, apresenta importantes funções biológicas e fisiológicas. Alguns autores mostraram que a ingestão de arginina melhora a resposta imune. Assim, o objetivo desse trabalho foi investigar o papel da suplementação alimentar de L-arginina e zinco na infecção chagásica experimental de ratas prenhes. Para tal, foram utilizadas ratas Wistar infectadas pela cepa Y de Trypanosoma cruzi, no 3º dia da prenhez e tratadas com L-arginina ou sulfato de zinco. Alguns parâmetros foram avaliados como a dosagem de óxido nítrico, citocinas (IFN-?, TNF-?, IL-2, TGF-?, IL-4, IL-10), corticosterona, número de macrófagos, linfoproliferação de esplenócitos, parasitemia e análise histopatológica do coração, placentas e fetos. A administração de zinco e arginina causou redução do parasitismo sanguíneo e cardíaco, ocasionou um aumento significativo nas concentrações de NO e na proliferação de esplenócitos. Além disso, contribuiu para o melhor desenvolvimento fetal. Dessa forma, podemos sugerir que a suplementação com estes elementos pode ser utilizada como uma substância imunomoduladora alternativa e, juntamente com a terapia anti-parasitária específica, minimizar as agressões ao hospedeiro, evitando a administração por longos períodos da droga tripanocida que sabidamente produz sérios efeitos colaterais e teratogênicos.

Summary: Zinc is an important element for the intrauterine development and during pregnancy is used to assist fetal growth. Arginine, a dibasic amino acid, besides its importance in the growth process, has important biological and physiological functions. Some authors have reported that daily intake of arginine improves the immune response. The objective of this study was to investigate the role of dietary supplementation of L-arginine and zinc in experimental Chagas disease in pregnant rats. To this end, we used Wistar rats infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi, on the 3rd day of pregnancy and treated with L-arginine or zinc sulfate. Some parameters were evaluated such as nitric oxide, cytokines (IFN-?, TNF-?, IL-2, TGF-?, IL-4, IL-10), corticosterone, number of macrophages, lymphocyte proliferation of splenocytes, parasitemia and histopathology of the heart, placenta and fetus. The administration of arginine and zinc caused a reduction in blood and heart parasitism, with a significant increase in the concentrations of NO and proliferation of splenocytes. Moreover, it contributed to a better fetal development. Therefore, we suggest that supplementation with these elements may be used as an alternative immunomodulating substance and together with the specific anti-parasitic therapy minimize the aggressions against the host, avoiding the administration of trypanocidal drugs over long periods that is known to produce serious side effects and teratogenic effects.

Resumen:

El zinc es un elemento de gran importancia para el desarrollo intrauterino y es usado durante el embarazo para auxiliar al crecimiento fetal. La arginina, un aminoácido dibásico, además de ser necesario para el crecimiento, presenta importantes funciones biológicas y fisiológicas. Algunos autores mostraron que la ingestión de la arginina mejora la respuesta inmune. Así, el objetivo de este trabajo fue investigar el rollo de la suplementación alimentar de L-arginina y zinc en la infección chagásica experimental de ratas preñas. Para tanto, fueron utilizadas ratas Wistar infectadas por la cepa Y del Trypanosoma cruzi en el tercer día de la preñez, y tratadas con L-arginina o sulfato de zinc. Algunos parámetros fueron


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evaluados como el dosaje del óxido nítrico, citoquinas (IFN-γ, TNF-α, IL-2, TGF-β, IL-4, IL-10), corticosterona, número de macrófagos, linfoproliferación de esplenócitos, parasitemia y análisis histopatológico del corazón, placentas y fetos. La administración de zinc y arginina causó reducción del parasitismo sanguíneo y cardíaco, ocasionó un aumento significativo en las concentraciones de oxido nítrico y en la proliferación de esplenócitos. Además, contribuyó para el mejor desarrollo fetal. De esa forma, podemos sugerir que la suplementación con estos elementos puede ser utilizada como una substancia inmunomoduladora alternativa y juntamente con la terapia antiparasitaria específica, minimizar las agresiones al hospedero, evitando la administración por largos períodos de la droga tripanocida que sabidamente produce serios efectos colaterales y teratogénicos.

Comissão: Ana Amelia Carraro Abrahão Fernanda de Freitas Anibal Mara Cristina Pinto


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Aluno: Denise Sayuri Calheiros da Silveira

Orientador: Auro Nomizo

Defesa: 01/06/2012

Título: Papel funcional dos leucotrienos na resposta imunológica ao melanoma B16-F0 experimental em camundongos

Title: The role of Leukotrienes in the immune response of melanoma B16-F0 in experimental mice

Resumo: No presente trabalho investigamos a relevância dos mediadores lipídicos (Leucotrienos) gerados pela enzima 5-Lipoxigenase (5-LO) na susceptibilidade ou resistência de camundongos ao Melanoma experimental com células tumorais B16-F0, utilizando como modelo camundongos produtores de leucotrienos (129_WT) e camundongos geneticamente deficientes "knockout" de 5-LO (129_5-LO KO). Primeiramente, verificamos que leucócitos peritoneais provenientes de animais WT implantados com melanoma B16-F0, apresentam aumento da expressão do gene para 5-LO (Alox5). Nossos resultados mostram que animais 5-LO KO, deficientes de 5-LO são mais eficientes no controle da progressão do tumor e apresentam significativo aumento na sobrevivência, quando comparados a animais WT, produtores de 5-LO. A nossa análise do perfil imunológico em células esplênicas indicam que a maior eficiência dos camundongos 5-LO KO no controle do crescimento de células tumorais B16-F0 estariam associados à presença numérica aumentada de neutrófilos (Gr-1+), células apresentadoras de antígeno (I-Ab+) majoritariamente CD19+CD80+ e esplenócitos capacitados para produção de altos níveis de citocinas pró-inflamatórias/efetoras como a IL-6, TNF?, IFN-? e baixos níveis de citocinas regulatórias como IL-10, 15 dias pós-implantação do tumor; a rápida geração da resposta imune polarizada para produção elevada de citocinas Th1 (IFN-?), mas não, citocinas Th2 (IL-10) e presença de maiores números de linfócitos T CD4+ e CD8+ efetoras, expressando o fenótipo CD44high ou CD44highCD62Llow. Ainda, verificamos que a deficiência genética da 5-LO ou a inibição da 5-LO pelo MK886 em células LAK, aumenta significativamente sua atividade citotóxica em células do melanoma B16-F0. Nossos resultados em conjunto, indicam que leucotrienos gerados pela enzima 5-LO, modulam negativamente a geração de resposta imune protetora em camundongos para o Melanoma B16-F0.

Summary: In the present work we examine the contribution of 5-lipoxigenase-derived lipid mediators during experimental melanoma (B16-F0) in 5-LO gene knockout (KO) mice and wild-type (WT) mice. The 5-LO KO mice presented delayed tumor growth, lesser tumor volume and delayed mortality. The greater resistance of 5-LO KO mice correlated with the following: High splenic Gr-1+ leukocytes counts, High and dominant presence of splenic IAb+CD19+CD80+ antigen-presenting cells counts and capacity of spleen cell to produce high levels of IL-6, TNF-?, IFN-? and lower levels of IL-10 early after tumor cells implantation; rapid T-cell polarization to secret high quantities of Th1 type cytokine IFN-? and low quantities of Th2 type cytokine IL-10; rapid generation and greater numbers of CD4+ and CD8+ activated T cells expressing CD45RB or CD44 markers; and also CD4+ and CD8+ CD44high or CD44highCD62Llow effector T cells. Herein, IL-2 induced splenic LAK cells from 5-LO KO mice, compared with splenic LAK cells from WT mice, were more efficient at killing B16-F0 melanoma cells. The increased B16-F0 melanoma cells killing activity were also found by treatment of splenic LAK cells from WT mice with a 5-LO activity inhibitor, MK886. Our findings suggest that 5-LO deficiency altered antigen-presenting cells profile, IFN-? and IL-10 production during skin cancer disease favoring the generation of protective immune responses and also provide evidence that 5-LO-derived LTs negatively affect the host survival during experimental B16-F0 melanoma.

Resumen:

En este trabajo se investiga la relevancia de mediadores lipídicos (los leucotrienes) generado por La enzima 5-Lipoxigenasa (5-LO) em La susceptibilidad o La resistência de los ratones com melanoma experimental B16-F0, lãs células tumorales, utilizando ratones como modelo de producción de leucotrienos (129_WT) y ratones geneticamente deficientes “knockout”de La 5-LO (129_5-LO KO). Em primer lugar, encontramos que los leucócitos peritoneales de animales WT implantados com melanoma B16-FO, muestran uma mayor expresión del gen de La 5-LO (ALOX5). Nuestros resultados muestran que animales 5-LO KO, son más


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eficazes en El control de La progresión del tumor y aumenta significativamente La supervivência en comparación com los animales WT,. Nuestro análisis del perfil inmunológico em las células del bazo indica que La eficiência de ratones 5-LO KO para controlar el crecimiento de lãs células tumorales B16-F0 se associaron com uma mayor presencia numérica de los neutrófilos (Gr 1+), células presentadoras de antígenos (I-Ab+) em su mayoria CD80+y CD19+ esplenocitos capaces de producir altos niveles de citoquinas como La pro-inflamatorioas/efetoras IL-6, TNF , IFN- y los bajos niveles de citoquinas reguladoras, tales como IL-10, 15 días después de La implantación del tumor, La rápida generación de La respuesta inmune polarizada a La elevada producción de citoquinas Th1 (IFN- ),pero no, las citocinas Th2(IL-10) y la presencia de um mayor número de linfócitos efector T CD4+ e CD8+, fenótipo expresar CD44high ou CD44highCD62Llow. Sin embargo, hemos encontrado que la deficiência genética de la 5-Lo inibición o 5-LO em lãs células LAK por MK886, aumenta significativamente sua ctividad citotóxica em células de melanoma B16-F0. Nuestros resultados indicam que junco los leucotrienos generados por la enzima 5-LO, modulan negativamente la gereción de respuesta inmume protectora em ratones com melanoma B16-F0.

Comissão: Auro Nomizo Yara Maria Lucisano Valim Gabriela Silva Bisson


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Aluno: Eliane Pereira da Silva

Orientador: Elaine Cristina Pereira de Martinis

Defesa: 25/10/2012

Título: Influência da temperatura, de enzimas degradantes de DNA e do sobrenadante de cultura de estafilococos na formação de biofilme por Listeria monocytogenes em superfície abiótica

Title: Influence of temperature, DNA degrading enzymes and staphylococcal culture supernatant on biofilm formation by Listeria monocytogenes on abiotic surface.

Título:

Influencia de la temperatura, de las enzimas degradantes de DNA y de sobrenadante del cultivo de estafilococos en la formación de biopelícula por Listeria monocytogenes en superficie abiótica.

Resumo: A listeriose é uma infecção rara e grave, transmitida principalmente por alimentos. É causada pela bactéria Listeria monocytogenes e acomete principalmente mulheres grávidas e pessoas comprometidas imunologicamente. Este patógeno é reconhecido como um problema para as indústrias de alimentos devido à sua capacidade em formar biofilmes. Os biofilmes são comunidades microbianas aderidas a superfícies bióticas ou abióticas embebidas em uma matriz de polímeros extracelulares produzidos pelas próprias células. Estas estruturas são resistentes a procedimentos de higienização e desinfecção, contribuindo para a persistência de L.monocytogenes em ambientes processadores de alimentos. Desta forma, há grande interesse em estratégias para prevenir a formação de biofilmes por L.monocytogenes. No presente trabalho foi investigada a formação de biofilmes por L.monocytogenes em superfície abiótica, sob diferentes temperaturas, na presença de enzimas degradantes de DNA (DNAses) e na presença de sobrenadante de cultura de estafilococos com e sem atividade de DNAse termoestável (termonuclease). Foram utilizadas técnicas de cultivo e de microscopia e os resultados demonstraram que L. monocytogenes aderiu à superfície de aço inoxidável, em média 105-106 UFC/cm2. A temperatura de incubação influenciou na adesão de L. monocytogenes à superfície de aço inoxidável, mas outros fatores em conjunto, como a cepa bacteriana e o tipo de sistema de cultivo utilizado, também podem ter contribuído para os resultados observados. Por microscopia de fluorescência foi constatada a formação de biofilmes maduros por L. monocytogenes, contendo canais provavelmente envolvidos em fluxo de nutrientes e também, cavidades características de dispersão celular. A mesma técnica permitiu constatar um predomínio de células metabolicamente ativas envoltas por matriz extracelular polimérica contendo DNA extracelular (DNAe), coradas por laranja de acridina. Por microscopia confocal a laser, foram observadas microcôlonias contendo DNAe e foram visualizadas também camadas homogêneas pouco espessas de células viáveis, coradas por SYTO9 e DDAO. O DNAe foi observado ainda em locais sem células, característicos de dispersão celular. O sobrenadante de cultura de S. aureus com atividade de termonuclease inibiu L. monocytogenes livre no meio de cultura e interferiu na formação de biofilme por este patógeno por até 24h a 37ºC. As DNAses comerciais não interferiram na formação de biofilme por L. monocytogenes, indicando ser improvável a ação da termonuclease de S. aureus na inibição da forma planctônica ou séssil de L. monocytogenes. Foi constatada a produção de uma proteína termoestável por S. aureus, capaz de inibir L. monocytogenes em teste de antagonismo em ágar, mas estudos posteriores são necessários para a completa caracterização de tal substância inibitória.

Summary: Listeriosis is a rare and serious mainly food-borne infection. It is caused by the bacterium Listeria monocytogenes that primarily affects pregnant women and immunologically compromised individuals. This pathogen is recognized as a problem for the food industry due to its ability to form biofilms. Biofilms are microbial communities adhered to biotic or abiotic surfaces embebed by self produced extracellular polymers. These structures are resistant to cleaning and disinfection procedures, allowing the survival and persistence of L. monocytogenes in food processing environments. Thus, several strategies have been adopted to prevent and control the formation of biofilms on food contact surfaces. The present study investigated biofilm formation by L. monocytogenes on abiotic surface at different temperatures, in the presence of DNA degrading enzymes (DNAses) and in the presence of culture supernatant with and without staphylococcal thermonuclease activity. For


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this purpose, we used culture techniques and microscopy. The results showed that L. monocytogenes was able to adhere on stainless steel surface on average 105-106 CFU per cm2. The different incubation temperatures affected the adhesion of L. monocytogenes on stainless steel surface, although other factors in combination were also involved, such as the bacterial strain and the type of system used for assay. By fluorescence microscopy, we noticed the formation of mature biofilms by L. monocytogenes, with channels likely involved in flow of nutrients and holes typical of cell dispersion. Furthermore, we found a predominance of metabolically active cells surrounded by extracellular matrix polymer containing extracellular DNA (eDNA) stained with acridin orange. By laser confocal microscopy, we observed the formation of microcolonies containing eDNA and homogeneous thin layer of viable cells stained with SYTO 9 and DDAO. The eDNA was also observed in locations with absence of cells characteristics of cell dispersion. The culture supernatant of S. aureus with thermonuclease activity was able to inhibit L.monocytogenes free on culture medium and interfered with the formation of biofilm by the pathogen for up to 24h at 37°C. The commercial DNAses did not affect biofilm formation by L. monocytogenes, possibly excluding the action of thermonuclease of S. aureus on the inhibition of planktonic or sessile forms of L. monocytogenes. It has been found a production of a thermostable protein by S. aureus and it was able to inhibit L. monocytogenes in agar antagonism assays but further studies are needed to characterize such inhibitory substance.

Resumen:

La listeriosis es una infección poco frecuente, grave y transmitida principalmente por los alimentos. Es causada por la bacteria Listeria monocytogenes, afecta principalmente a las mujeres embarazadas y personas con problemas de inmunidad. Este patógeno es reconocido como un problema para la industria de los alimentos debido a su capacidad para formar biopelículas. Biopelículas son comunidades microbianas adheridas en superficie biótica o abiótica embebidas en una matriz polimérica extracelular. Estas estructuras son resistentes a los procedimientos de limpieza y desinfección, permitiendo la supervivencia y la persistencia de L.monocytogenes en los entornos de procesamiento de alimentos. Varias estrategias se han adoptado para prevenir y controlar la formación de biopelículas por L.monocytogenes en las superficies de contacto con los alimentos. En este estudio se investigó la formación de biopelículas por L. monocytogenes en superficie abiótica a diferentes temperaturas, en la presencia de enzimas degradantes de DNA (DNAses) y en presencia de sobrenadante del cultivo de estafilococos con y sin actividad de termonucleasa. Por lo tanto, hemos utilizado las técnicas de cultivo y microscopía. Los resultados demostraron que L. monocytogenes fue capaz de adherirse a la superficie de acero inoxidable, en promedio 105-106 UFC por cm2. Las temperaturas de incubación diferentes afectaron la adherencia de L. monocytogenes en la superficie de acero inoxidable, aunque otros factores juntos, como la cepa bacteriana y el tipo de sistema utilizado, también puede haber contribuido a los resultados observados. Para microscopía de fluorescencia, se observó la formación de biopelículas maduras de L. monocytogenes que contienen canales para el flujo de nutrientes y las cavidades características de la dispersión. La misma técnica reveló un predominio de las células metabólicamente activas rodeadas por polímero de matriz extracelular que contiene el DNA extracelular (DNAe), que se ha tiño con naranja de acridina. Para la microscopía láser confocal, se observó la formación de micro colonias que contienen el DNAe y capas poco espesor de células viables, que se ha tiño con SYTO9 y DDAO. El DNAe también se observó en sitios con ausencia celular, característica de dispersado celular. El sobrenadante del cultivo de S. aureus con actividad de termonucleasa fue capaz de inhibir L. monocytogenes libre en medio de cultivo y interferir con la formación de biopelícula por ese patógeno durante 24h a 37°C. Las DNAses comerciales no afectaron la formación de biopelícula por L.monocytogenes, que indicó una acción improbable de termonucleasa en la inhibición de la forma sésil o planctónico de L. monocytogenes. Se ha encontrado que S.aureus produce una proteína termoestable, capaz de inhibir L. monocytogenes en antagonismo de ensayo en ágar. Sin embargo, se necesitan más estudios para caracterizar tales sustancias inhibidoras.

Comissão: Elaine Cristina Pereira de Martinis Evandro Watanabe Carlos Augusto Fernandes de Oliveira


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Aluno: Fábio Alves Aguila

Orientador: Maria Jose Alves da Rocha

Defesa: 21/09/2012

Título: Análise da concentração de nitrato no líquido cefalorraquidiano e da atividade enzimática das óxido nítrico sintases no hipotálamo de ratos submetidos à sepse experimental

Title: Analysis of nitrate concentration in the cerebrospinal fluid and of the enzymatic activity of nitric oxide synthase in the hypothalamus of rats submitted to experimental sepsis.

Título:

El análisis de la concentración de nitrato en el líquido cefalorraquídeo y la actividad enzimática de la óxido nítrico sintasas en el hipotálamo de ratas con sepsis experimental.

Resumo: Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica frente a um estímulo infeccioso. Na fase inicial da doença ocorre aumento da secreção de vasopressina (AVP) e na fase tardia observamos uma redução, apesar dos elevados níveis de mediadores inflamatórios e agravamento da hipotensão que são estímulos para a secreção do hormônio. O óxido nítrico (NO), produzido pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), parece modular a secreção de AVP dependendo do contexto fisiopatológico. Durante sepse experimental nosso grupo demonstrou que as concentrações plasmáticas de nitrato, que servem como índice da produção de NO, se elevam progressivamente durante a evolução da doença, mas não há evidências de que isto ocorra também a nível central. Nosso objetivo foi avaliar temporalmente a concentração de nitrato no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a atividade enzimática das NOS no hipotálamo de ratos submetidos à sepse por ligadura e perfuração cecal (CLP). Os procedimentos, aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto (CEUA-USP, protocolo nº 10.1.294.53.7), foram realizados com ratos Wistar pesando 250 ± 30 gramas, os quais foram divididos em dois grupos: CLP e operação fictícia (OF). Após 0, 2, 6 e 24 horas das cirurgias, foi feita a coleta do LCR para a determinação da concentração de nitrato pelo método de quimiluminescência NO/ozônio. Imediatamente após os animais foram decapitados para coleta de sangue utilizado para determinação de hematócrito, sódio sérico, proteína, interleucina (IL)-1?, nitrato e AVP plasmáticos. Também foram removidas as neurohipófises para análise do conteúdo de AVP e o hipotálamo para análise da atividade da NOS pelo método da Citrulina. Nos animais sépticos, as concentrações plasmáticas de AVP seguiram o padrão esperado, com aumento em 2h e 6h, retornando a níveis basais em 24h. Os estoques neurohipofisários de AVP reduziram em 2h e 6h retornando a níveis basais em 24h. O sódio sérico e as proteínas plasmáticas diminuíram 2h, 6h e 24h após CLP, e os hematócritos aumentaram nos mesmos períodos. As concentrações plasmáticas de IL-1? e nitrato aumentaram 6h e mantiveram-se elevadas 24h após CLP. Entretanto, no LCR o nitrato aumentou em 6h, mas retornou a níveis basais em 24h. A atividade hipotalâmica das NOS totais e constitutivas eram de 50 a 100 vezes maiores que as das NOS induzidas e aumentaram 6h e 24h após a CLP. Os resultados deste estudo mostram que as atividades das NOS observadas no hipotálamo ex vivo dos ratos sépticos indicam a presença de formas viáveis das enzimas, sendo a isoforma constitutiva a mais relevante para a produção de NO nesta região cerebral. Além disso, as alterações temporais das concentrações de nitrato no LCR diferem da de nitrato plasmático, revelando um perfil diferenciado da produção de NO central em relação à periférica, e que este pode estar relacionado à secreção bifásica de AVP na sepse

Summary: Sepsis is defined as a systemic inflammatory response to an infectious stimulus. In the initial phase of the disease the secretion of vasopressin (AVP) is increased and late is observed a reduction, although high levels of inflammatory mediators and worsening of the hypotension, which are stimuli for the hormone secretion. Nitric oxide (NO) produced by the enzyme nitric oxide synthase (NOS), appears to modulate the secretion of AVP depending on the pathophysiological context. During experimental sepsis our group demonstrated that the plasma nitrate concentrations, which serve as an index of NO production, increase gradually during the course of the disease. However, there is no evidence that this also occurs at the central level. Our aim was to evaluate the temporal nitrate concentration in the cerebrospinal fluid (CSF) and the enzymatic activity of NOS in the hypothalamus of rats submitted to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). The procedures, approved by the Ethics Committee on


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Animal Use of the Campus of Ribeirão Preto (CEUA - USP, Protocol nº10.1.294.53.7) were performed with Wistar rats weighing 250 ± 30 grams, which were divided into two groups: CLP and Sham operation. After 0, 2, 6 and 24 hours of surgery, CSF was collected for determining the nitrate concentration by the chemiluminescence NO/ozone method. Immediately after, the animals were decapitated, blood was collected and used for hematocrit, serum sodium, protein, interleukin (IL)-1?, nitrate and plasma AVP determination. The neurohypophysis was removed for AVP content determinations and hypothalamus for NOS activity analysis by the method of citrulline. In septic animals, plasma concentrations of AVP showed the expected pattern, an increase at 2h and 6h and returning to basal levels at 24h. The AVP neurohypophyseal stocks decreased at 2h and 6h returning to basal levels at 24h. The sodium serum and plasma proteins decreased 2h, 6h and 24h after CLP, and the hematocrit increased at the same periods. The plasma concentration of IL-1? and nitrate increased 6h and remained elevated 24h after CLP. However, in the cerebrospinal, nitrate increased at 6h but returned to basal level in 24h. The total and constitutive NOS activities were fifty to one hundred times higher than inducible NOS and were increased 6h and 24h after CLP. These results suggest that the activity of NOS observed in the hypothalamus ex vivo of rats septic indicates the presence of viable forms of enzymes, and that the constitutive isoform is the most relevant for the NO production in this brain region. Moreover the temporal alterations of the nitrate concentrations in the CSF differ from the plasma nitrate, showing a different profile of the central and peripheral NO production, which may be related to biphasic AVP secretion in the sepsis.

Resumen:

La sepsis se define como una respuesta inflamatoria sistêmica a un estímulo infeccioso. En la fase inicial de la enfermedad se aumenta la secreción de vasopresina (AVP) y en la fase tardía se observa reducción, a pesar de los altos niveles de mediadores inflamatorios y el agravamiento de la hipotensión que son estímulos para la secreción de la hormona. El óxido nítrico (NO) producido por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), parece modular la secreción de AVP en función del contexto fisiopatológico. Durante la sepsis experimental nuestro grupo demostró que las concentraciones plasmáticas de nitrato, que sirven como un índice de producción de NO, aumentó gradualmente durante el curso de la enfermedad, pero no hay evidencia de que esto se produce también en el nivel central. Nuestro objetivo fue evaluar temporalmente la concentración de nitrato en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y la actividad enzimática de la NOS en el hipotálamo de ratas sometidas a sepsis por ligadura y punción cecal (CLP). Los procedimientos, aprobados por el Comité de Ética en el Uso de Animales del Campus de Ribeirão Preto (CEUA-USP, protocolo nº10.1.294.53.7) se realizaron con ratas Wistar 250 ± 30 gramos, divididos en dos grupos: CLP y la operación ficticia (OF). Después de 0, 2, 6 y 24 horas de la cirugía, se recogió LCR para determinar la concentración de nitrato por el método de quimioluminiscencia NO/ozono. Inmediatamente después los animales fueron decapitados para la recolección de sangre que se utilizó para la determinación de hematocrito, niveles séricos de sodio, proteínas, interleucina (IL)-1β, el nitrato y el AVP plasma. También fueron removidos neurohipófisis para el análisis del contenido de AVP y el hipotálamo para el análisis de actividad de la NOS por el método de citrulina. En los animales sépticos, las concentraciones plasmáticas de AVP seguido el patrón de espera, con un aumento a las 2h y 6h y volviendo a los niveles basales a las 24h. Los inventarios de AVP neurohipofisários se redujo a las 2h y 6h regresando a los niveles basales a las 24h. Los niveles de sodio en el suero y proteínas en el plasma disminuyó 2h, 6h y 24h después de CLP, y el hematocrito aumentó en el mismo periodo. La concentración plasmática de IL-1β e de nitrato aumentó 6h y 24 h después de CLP. Si embargo, en el líquido cefalorraquídeo el nitrato aumento a las 6h peró volvió a los niveles basales a las 24 h. La actividad de la NOS constitutiva y totales eran de cincuenta a cien veces maiores que los des NOS inducible y estaban aumentadas 6 y 24 h después del CLP. Estos resultados muestran que la actividad observada de NOS en el hipotálamo ex vivo de ratas séptico indica la presencia de formas viables de enzimas, y la isoforma constitutiva es el más relevante para la producción de NO en esta región del cerebro. Además, los cambios temporales de las concentraciones del nitrato en el LCR, difieren del nitrato de plasma, revelando un perfil diferente para la producción del NO central y de plasma, y que puede estar relacionado con la secreción bifásica de la vasopresina en la sepse.


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Comissão: Maria Jose Alves da Rocha, José Carlos Farias Alves Filho Gloria Emilia Petto de Souza


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Aluno: Fábio Pio Dornas

Orientador: Victor Hugo Aquino Quintana

Defesa: 09/03/2012

Título: Investigação sorológica de anticorpos IgM e IgG anti-dengue em crianças atendidas no Centro de Saúde Escola Dr. Edgard Aché do município de Ribeirão Preto, São Paulo.

Title: Serological Investigation of IgM and IgG antibodies anti-dengue in children attended by Health Center Dr. Edgard Aché in Ribeirão Preto city, São Paulo, Brazil.

Título:

La vigilancia serologica de anticuerpos IgM y IgG anti-dengue en niños atendidos en el Centro de Saúde Dr. Edgard Aché de la ciudad de Ribeirão Preto, São Paulo.

Resumo: A dengue é uma doença infecciosa viral transmitida pela picada de mosquitos do gênero Aedes e é um importante problema de saúde pública mundial. A infecção por qualquer um dos quatro sorotipos (DENV 1-4) pode apresentar diferentes quadros clínicos: pode ser assintomática, causar uma síndrome febril indiferenciada, ou a febre da dengue (DF), a evolução do quadro clínico pode levar a dengue hemorrágica com ou sem choque (DHF/DSS). Um número crescente de casos de infecção por dengue em crianças têm sido observados nos últimos anos. Estudos de prevalência da dengue em regiões endêmicas são importantes para avaliar a incidência da infecção por dengue em crianças. Assim, o objetivo deste estudo é investigar a prevalência de anticorpos anti-dengue IgM e IgG em crianças atendidas no Centro de Saúde Escola Dr. Edgard Aché, localizado na região oeste de Ribeirão Preto-SP. Crianças (n = 271) de 1-15 anos de idade foram recrutadas de março de 2010 até maio de 2011. Depois de um termo de consentimento ter sido assinado pelo responsável, uma amostra de sangue das crianças, participantes deste estudo, foi coletada. As crianças foram classificadas em assintomáticas (n= 174) ou sintomáticas (n = 97), quando estas apresentavam um ou mais de um sintoma sugestivo de dengue, de acordo com critérios da Organização Mundial de Saúde. As amostras foram testadas por ELISA de captura para detecção de anticorpos IgM e IgG anti-dengue. O ELISA de captura para IgG mostrou uma positividade de 9,23% (25/271) e o ELISA de captura para IgM de 8,49% (23/271). O ELISA de captura para IgG foi positivo em 10,31% (10/97) das crianças sintomáticas e 8,62% (15/174) das crianças assintomáticas, enquanto que o ELISA de captura para IgM foi positivo em 15,46% (15/97) das crianças sintomáticas e 4,6% (8/174) em crianças assintomáticas. Este estudo mostrou a alta prevalência de anticorpos anti-dengue em crianças da região oeste do município de Ribeirão Preto; mostrou também que a infecção pode ser causada de forma assintomática, e que a infecção por este vírus pode ser um grave problema de saúde nesta população, servindo como um alerta às autoridades de saúde.

Summary: Dengue is an infectious viral disease transmitted by the biting of mosquitoes of Aedes genus and it is an important public health problem worldwide. Infection with any of the four serotypes (DENV 1-4) may be asymptomatic or causes illness ranging from mild viral syndrome, dengue fever (DF) to dengue hemorrhagic fever (DHF). An increasing number of dengue infection cases in children have been noted in the last years. A dengue surveillance study might be an important tool in endemic region to evaluate the incidence of dengue infection in children. Thus, the aim of this study was to investigate the prevalence of anti-dengue IgM and IgG antibodies in children in the Primary Health Care Center, Dr. Edgard Aché, located in the west region of Ribeirão Preto-SP. Children (n=271) from 1 to 15 years old were recruited during March 2010 until May 2011. After a signed consent by the person responsible for the children to participate in this study, a blood sample was collected. The children were classified in asymptomatic (n=174) or symptomatic (n=97) when they had more than one symptom suggestive of dengue according to the World Health Organization criterions. Anti-dengue IgM and IgG were detected in serum samples by capture ELISA. IgG capture ELISA was positive in 9,23% (25/271) and IgM capture ELISA in 8,49% (23/271) of the children. IgG capture ELISA was positive in 10,31% (10/97) of the symptomatic children and 8,62% (15/174) in asymptomatic children; while IgM capture ELISA was positive in 15,46% (15/97) of symptomatic children and 4,6% (8/174) in asymptomatic children. This study showed the high prevalence of anti-dengue antibodies in children in the west region of Ribeirão Preto. In addition, a high prevalence of dengue-infected children without symptoms


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was observed. The present survey demonstrated that dengue virus infection might be a problem in children’s from Ribeirão Preto city and serve as an alert to the health authorities.

Resumen:

El dengue es una enfermedad infecciosa viral transmitida por la picadura de los mosquitos del género Aedes y es un importante problema de salud pública en todo el mundo. La infección con cualquiera de los cuatro serotipos (DENV 1-4) pueden presentar diferentes cuadros clínicos: puede ser asintomática, causar un síndrome febril indiferenciada o fiebre del dengue (FD), la progresión de la enfermedad puede conducir a la fiebre hemorrágica del dengue con o sin shock (DH / SCD). Un número creciente de casos de dengue en los niños se han observado en los últimos años. Los estudios sobre la prevalencia del dengue en áreas endémicas pueden ser herramientas importantes para evaluar la incidencia de infección por dengue en los niños. El objetivo de este estudio es investigar la prevalencia de anticuerpos anti-dengue IgM e IgG en los niños en el Centro de Atención Primaria de Salud, Dr. Edgard Aché, ubicado en la región oeste de Ribeirão Preto-SP. Los niños (n = 271) 1-15 años de edad fueron reclutados a partir de marzo de 2010 hasta mayo de 2011. Después de un formulario de consentimiento firmado por los responsables, una muestra de sangre de los niños participantes en este estudio fueron recogidos. Los niños fueron clasificados como asintomáticos (n = 174) o sintomáticos (n = 97), cuando tenían uno o más de los síntomas sugestivos de dengue, de acuerdo con los criterios de la Organización Mundial de la Salud IgM e IgG anti-dengue furon detectados en muestras de suero por ELISA de captura. El ELISA de captura para IgG fue positivo en 9,23% (25/271) y para IgM 8,49% (23/271). El ELISA de captura IgG fue positiva en 10,31% (10/97) de los niños sintomáticos y 8,62% (15/174) de los niños asintomáticos, mientras que el ELISA de captura IgM fue positiva en 15,46% (15/97) de niños sintomáticos y 4,6% (8/174) en niños asintomáticos. Este estudio mostró una alta prevalencia de anticuerpos anti-dengue en los niños en la región oeste de la ciudad de Ribeirão Preto, y que la infección con este virus puede ser un grave problema de salud en esta población, que sirve como alerta a las autoridades sanitarias.

Comissão:

Victor Hugo Aquino Quintana

Juliana Helena Chavez

Alessandra Abel Borges


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Aluno: Henrique Dantas de Menezes

Orientador: Gilberto Úbida Leite Braga

Defesa: 29/08/2012

Título: Inativação fotodinâmica de conídios dos fungos Aspergillus nidulans, Colletotrichum acutatum e Colletotrichum gloeosporioides com fotossensibilizadores fenotiazínicos e cumarínicos.

Title: Photodynamic inactivation of conidia of the fungi Aspergillus nidulans, Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides with phenothiazinium and coumarinium photosensitizers.

Título:

Inactivación fotodinámica de conidios de los hongo Aspergillus nidulans,Colletotrichum acutatum y Colletotrichum gloeosporioides con fotosensibilizadores fenotiazínicos y cumarínicos.

Resumo: O tratamento fotodinâmico antifúngico (APDT) é um método promissor que combina um fotossensibilizador não tóxico (FS), oxigênio e luz visível para provocar a morte seletiva das células microbianas. O desenvolvimento do APDT depende da identificação de FS que sejam eficazes para as diferentes espécies de patógenos. No presente estudo, as suscetibilidades, in vitro, de conídios de Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides (ambas são espécies fitopatogênicas) e Aspergillus nidulans ao APDT com quatro FS fenotiazínicos [azul demetileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e o novo fenotiazínico pentacíclico S137 (S137)] em combinação com a luz vermelha, foram investigadas. Nós também avaliamos a suscetibilidade dos conídios de C. acutatum e A.nidulans ao APDT com o psoraleno 8-metóxipsoraleno (8-MOP), com duas cumarinas (7-metoxicumarina e 5,7-dimetóxicumarina) e com uma furanocumarina (isopimpinelina) em combinação com a radiação solar. Ambas as cumarinas e a furanocumarinas foram extraídas, no presente trabalho, do limão Tahiti (Citrus latifolia). Os efeitos dos tratamentos com os diferentes FS nas folhas de laranja-pera (Citrus sinensis) também foram avaliados. O NMBN e o S137 foram os fenotiazínicos mais eficazes. Os APDT com o NMBN (50 μM) e S137 (10μM) e dose de luz de 25 J cm-2 resultaram na redução de aproximadamente 5 logs na sobrevivência dos conídios das três espécies. O APDT com o 8-MOP e com as cumarinas resultaram em uma redução de aproximadamente 4 logs na sobrevivência dos conídios de C.acutatum e A. nidulans. O APDT com a furanocumarina foi menos efetivo e resultou em umaredução na sobrevivência dos conídios de aproximadamente dois logs para C. acutatum e de três logs para A. nidulans. Nenhum dano nas folhas foi observado quando os FS foram colocados na superfície adaxial das folhas. Os estudos histológicos mostraram que nenhum dos FS fenotiazínicos atravessou a cutícula das folhas.

Summary: Antifungal photodynamic treatment (APDT) is a promising method that combines a nontoxic photosensitizer (PS), oxygen and visible light to cause selective killing of microbial cells. The development of APDT depends on identifying effective PS for the different pathogenic species. In the present study, the in vitro susceptibilities of Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides (both are phytophatogenic species) and Aspergillus nidulans conidia to APDT with four phenothiazinium PS [methylene blue (MB), new methylene blue N (NMBN), toluidine blue O (TBO) and the novel pentacicyclic phenothiazinium S137 (S137)] in combination with red light were investigated. We also evaluated the susceptibilities of C. acutatum and A. nidulans conidia to APDT with the psoralen 8-methoxypsoralen (8-MOP), with two coumarins (7-methoxicoumarin and 5,7-dimethoxycoumarin) and one furanocoumarin (isopimpinelin) in combination with solar radiation. Both the coumarins and the furanocoumarin were extracted, in the present work, from Tahiti lemon (Citrus latifolia). The effects of the treatments with all the PS on Citrus sinensis leaves were also evaluated. NMBN and S137 were the more effective phenothiazinium PS. APDT with NMBN (50 μM) and S137 (10 μM) and light dose of 25 J cm-2 resulted in a reduction of approximately 5 logs in the survival of the conidia of the three species. APDT with 8-MOP and with the coumarins resulted in a reduction of approximately 4 logs in the survival of C. acutatum and A. nidulans conidia. APDT with the furanocumarin was less effective and resulted in the reduction of approximately 2 logs for C. acutatum and 3 logs for A. nidulans. No damages to the leaves were observed when the PS were spotted on the adaxial surface of the leaves and the plants


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were exposed to solar radiation. Histological studies showed that the phenothiazinium PS did not cross the leave cuticle.

Resumen:

El tratamiento fotodinámico antifúngico (APDT) es un método prometedor que combina un fotosensibilizador no tóxico (FS), el oxígeno y la luz visible para causar la muerte selectiva de las células microbianas. El desarrollo de APDT depende de la identificación de FS que sean efectivos para las diferentes especies de patógenos. En este estudio, la susceptibilidad, in vitro, de conidios de Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides (ambos especies fitopatógenas) y Aspergillus nidulans al APDT con cuatro FS fenotiazina [azul de metileno (MB), nuevo azul de metileno N (NMBN) azul de toluidina O (TBO) fenotiazina y el nuevo pentacíclico S137 (S137)] en combinación con luz roja, se investigaron. También se evaluó la susceptibilidad de los conidios de C. acutatum y A. nidulans al APDT con psoraleno 8-metoxipsoraleno (8-MOP), con dos cumarinas (7-metoxicumarina y 5,7-dimethoxycoumarin) y una furanocumarina (isopimpinelina) en combinación con la radiación. Ambas cumarinas y furocumarinas fueron extraídas en este presente trabajo, lima Tahití (Citrus latifolia).Los efectos de los tratamientos con los diferentes FS en las hojas de la naranja pera (Citrus sinensis) también fueron evaluados. El NMBN y S137 fueron los fenotiazínicos más eficaces. Los APDT como el NMBN (50 μM) y S137 (10 μM) y dosis de luz de 25 J cm-2 resultaron en la reducción de aproximadamente el 5 logs en la sobrevivencia de los conidios de las tres especies. El APDT con el 8-MOP y con las cumarinas resultaron en una reducción de aproximadamente 4 logs en la sobrevivencia de los conidios de C. acutatum y A. nidulans. La APDT con la furanocumarina fue menos eficaz y resultó en una reducción en la sobrevivencia de aproximadamente dos y tres logs para C. acutatum y A. nidulans, respectivamente. Ningún daño en las hojas se observó cuando los FS se adicionaron sobre la superficie adaxial de las hojas. Los estudios histológicos mostraron que ninguno de los fenotiazínicos FS traspaso la cutícula de las hojas.

Comissão: Gilberto Ubida Leite Braga Marcia Regina von Zeska Kress Antonio Claudio Tedesco


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Aluno: Isabel Cristina Costa Vigato Ferreira

Orientador: Cleni Mara Marzocchi Machado

Defesa: 02/08/2012

Título: FcyR e CR3 no lúpus eritematoso sistêmico: variantes polimórficas e sua influência na fagocitose e desgranulação dos neutrófilos

Title: FcyR and CR in systemic lupus erythematosus: polimorphisms and their influence in the phagocytosis and degranulation of neutrophils

Resumo: O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune e a suscetibilidade às infecções está associada as suas anormalidades imunológicas e a sua terapia imunossupressora e citotóxica. Dentre as alterações que predispõem às infecções no LES estão anormalidades moleculares e funcionais dos neutrófilos: clearance e fagocitose ineficientes de imunocomplexos (IC) e bactérias, neutropenia, defeitos na quimiotaxia, redução do burst oxidativo e redução da expressão de receptores para IgG (FcyR) e para complemento (CR). Além disso, os polimorfismos genéticos dos FcyR têm sido associados

efetoras do neutrófilo e atuam em sinergismo com os CR (CR1 e CR3). O polimorfismo dos genes FcyRIIA e FcyRIIIB determina a expressão de variantes alélicas com diferenças funcionais, as quais podem influenciar as respostas biológicas e a suscetibilidade e o prognóstico das doenças infecciosas. Em particular, o alótipo FcyRIIa-R131, tem menor afinidade para a IgG2, o que resulta em prejuízo na fagocitose mediada por esta imunoglobulina. A IgG2 é essencial contra bactérias encapsuladas e os pneumococos são responsáveis por 6-18% das infecções bacterianas no LES. O objetivo deste estudo foi investigar a influência dos polimorfismos genéticos dos FcyR na fagocitose e desgranulação dos neutrófilos, associados ao polimorfismo do CR3, e à ocorrência de infecções bacterianas no LES. Os genótipos foram determinados por reações da polimerase em cadeia para os polimorfismos das variantes alélicas; a fagocitose e desgranulação foram estimuladas por IC contendo IgG (IC-IgG) e por IC-IgG e complemento (IC-IgG/SHN); a fagocitose de IC por neutrófilos e a expressão dos FcyR e CR3 foram avaliadas por citometria de fluxo; e a desgranulação dos neutrófilos estimulada por IC foi medida pela liberação de elastase e lisozima. Os resultados mostraram: maior frequência para o genótipo R-131 no LES; associação do genótipo HNA-4a negativo para o CR3 com a suscetibilidade para o LES e associação do HNA-4a positivo com proteção; fagocitose menor em neutrófilos de pacientes com LES com genótipo HR-131 comparados aos neutrófilos do grupo controle com genótipo R-131 (IC-IgG e IC-IgG/SHN); no polimorfismo do FcyRIIIb, a fagocitose e a lisozima foram menores em neutrófilos de pacientes com LES com genótipo HNA-1b e maior para HNA-1a/1b comparados aos controles com os respectivos genótipos (IC-IgG/SHN); a ocorrência de infecções foi mais frequentemente associada à presença do alelo R-131 e HNA-1b; nenhuma diferença foi observada para o polimorfismo HNA-4a do CR3, bem como para e elastase. Este estudo contribui para o entendimento das anormalidades nas funções dos neutrófilos no LES e para a identificação de indivíduos, cujo polimorfismo dos FcyR e CR3 possa conferir suscetibilidade ou proteção às infecções.

Summary: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease in which disease-related and genetic factors and immunosuppressive and cytotoxic therapies all contribute to an increased susceptibility to infections. Factors predisposing to infection include defects in chemotaxis, abnormalities in neutrophil phagocytic activity, decreased immune complex (IC) and bacteria clearance, neutropenia, reduced oxidative burst, abnormalities in the expression of Fc?R (Fc?R) and complement (CR) receptors. Recent data have provided evidence that genetic polymorphism of FcyR is associated with immune abnormalities and risk to development of SLE. FcyR can mediate neutrophil effector functions and play a synergistic action with CR. Fc?RIIa and FcyRIIIb display functionally relevant genetic polymorphisms, which allelic variants can influence the biological responses and the susceptibility to and course of infectious diseases. In particular, the presence of the FcyRIIa-R131 allotype results in lower affinity binding to IgG2, a subclass of IgG specific for encapsulated bacteria. Since pneumococci accounts for 6-18% of all bacterial infections in SLE, the R131 allele can be relevant as a risk factor for infections. The aim of this study was to investigate the influence of


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the FcyR polymorphisms on the phagocytosis and degranulation of neutrophils, associated with CR3 polymorphism, and bacterial infections in SLE. Genotypes were determined by polymerase chain reactions for the polymorphisms of the allelic variants; the phagocytosis and the degranulation were stimulated with IC-containing IgG (IC-IgG) and IC-IgG and complement (IC-IgG/NHS); the phagocytosis of IC by neutrophils and expression of FcyR and CR3 were evaluated by flow cytometry, and degranulation of neutrophils stimulated with IC was measured by the release of lysozyme and elastase. The results showed a higher frequency for the genotype R-131 in SLE and association of genotype HNA-4a negative for the CR3 with susceptibility to SLE and association of HNA-4a with protection; the phagocytosis was lower in neutrophils from patients with SLE with HR-131 genotype than those in neutrophils from control group with genotype R-131 (IC-IgG and IC-IgG/NHS); in the Fc?RIIIb polymorphism, the phagocytosis and lysozyme were lower in neutrophils from patients with SLE with genotype HNA-1b and higher for HNA-1a/1b than those controls with the respective genotypes (IC-IgG/NHS); the occurrence of infections was more frequently associated with the presence of the allele R-131 and HNA-1b; no difference was observed for polymorphism HNA-4a of the CR3, neither for elastase. This study can contribute for the understanding of neutrophil abnormalities in SLE and identifying genetic markers that would predict patients Who are at high risk for infections.

Comissão: Cleni Mara Marzocchi Machado Thiago Mattar Cunha Carlos Alberto de Oliveira


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Aluno: Juliana Abigail Leite

Orientador: Elaine Cristina Pereira de Martinis

Defesa: 27/09/2012

Título: Bacillus cereus produtor de substâncias semelhantes a bacteriocinas (BLIS): isolamento, caracterização preliminar e aplicação de extrato semi-purificado contendo BLIS para inibição de Listeria monocytogenes em polpa de fruta.

Title: Bacillus cereus producing bacteriocin-like substances (BLIS): isolation, preliminary characterization and application of semi-purified extract containing BLIS for inhibiting Listeria monocytogenes in fruit pulp.

Resumo: Mudanças nos hábitos alimentares dos consumidores têm aumentado a demanda por frutas frescas e polpas de frutas. Com isso, a busca por novos compostos com atividade antimicrobiana é de grande interesse, já que a aplicação de aditivos químicos convencionais em alimentos tem sido reavaliada devido à potencial toxicidade de alguns desses compostos. As bacteriocinas ou BLIS, produzidas por diferentes gêneros bacterianos, têm despertado grande interesse industrial para aplicação em alimentos em processos de bioconservação. No presente trabalho, foram obtidos 3 isolados bacterianos (A, B e C) a partir de polpa de abacaxi, produtores de substância antagonista frente a diferentes linhagens de Listeria monocytogenes e Bacillus sp. A natureza proteica das substâncias antagônicas produzidas pelos isolados foi confirmada pela sensibilidade à enzima ? - quimotripsina. As linhagens foram identificadas através de provas bioquímicas e moleculares como Bacillus cereus, com a colaboração da Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brasil). Para estudos mais detalhados da BLIS foi selecionado o isolado C denominado Bacillus cereus LFB-FIOCRUZ 1640. A melhor condição de incubação para produção da BLIS foi a 30ºC/24 horas, em caldo MRS. A BLIS apresentou estabilidade térmica por até 30 minutos a 80ºC e em ampla faixa de pH frente a L. monocytogenes. A purificação da BLIS foi realizada com resina Amberlite XAD-16 e de troca catiônica SP-Sepharose "Fast Flow", tendo o extrato apresentado um fator de purificação de 4,1 vezes e rendimento de 30%. O extrato obtido foi liofilizado e uma alíquota foi analisada por SDS-PAGE, o que permitiu a estimativa da massa molecular da BLIS de 25 kDa. A Concentração Bactericida Mínima (CBM) de 2 mg/mL foi determinada frente ao indicador L. monocytogenes e esta concentração de extrato foi aplicada em sistema modelo contendo polpa de abacaxi. A BLIS teve ação bactericida inibindo completamente L. monocytogenes por 24h/ 37ºC. Neste sentido, a aplicação da BLIS na área de alimentos e outras áreas farmacêuticas poderá ser explorada em outros trabalhos.

Summary: Changes in habits of consumers, with preference for healthy foods, have increased the demand for fruits and fruit pulps. Thus, there is great interest in searching new compounds with antimicrobial activity, since the application of conventional additives in foods is of concern due to the toxicity of some of these compounds. The bacteriocins or BLIS, produced by different bacteria genera, have increased the interest for its industrial application in food technology in processes of biopreservation. In this study, three isolates were obtained (A, B and C) from pineapple pulp, which produce antagonistic substances with activity against Listeria monocytogenes and Bacillus sp. The proteinaceous nature of the antagonistic substance produced by the isolates was confirmed by susceptibility to the enzyme ? - chymotrypsin. The strains were identified by biochemical and molecular tests as Bacillus cereus, in collaboration with Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brazil). Isolate C of Bacillus cereus was named LFB-FIOCRUZ 1640. The best condition of incubation for the BLIS production was 30°C for 24 hours in MRS broth. The BLIS was thermostable (up to 30 minutes at 80°C) and it was partially stable in the range of pH 2 to 9. The purification of the BLIS was performed with Amberllite XAD-16 and cation-exchange SP-Sepharose "Fast Flow" resins. The extract presented a purification factor of 4.1 times and 30% of yield. The extract was lyophilized and analyzed by SDS-PAGE. The molecular mass of the BLIS was estimated as 25 kDa. The Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of 2 mg/mL was determined with the indicator L. monocytogenes, and this concentration of extract was applied in a model system containing pineapple pulp. The BLIS had bactericidal action which completely inhibited L. monocytogenes for 24h/37°C. The BLIS of B. cereus 1640 presents potential for


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application as an antimicrobial in food and other pharmaceutical areas.

Comissão: Elaine Cristina Pereira de Martinis Eliana Guedes Stehling Adriano Brandellii


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Aluno: Juliana Borges Pereira

Orientador: Maria José Alves da Rocha

Defesa: 10/02/2012

Título: Efeito do MK-886 sobre a produção de leucotrienos e citocinas em animais sépticos.

Title: Effect of MK-886 in leukotrienes and cytokines production in septic animals.

Título:

Efecto del MK-886 la central de producción de los leucotrienos y lãs citocinas en animales sépticos.

Resumo: Os leucotrienos (LTs) e as citocinas são mediadores inflamatórios produzidos durante a sepse e que podem apresentar uma tarefa moduladora na secreção de arginina-vasopressina (AVP). Na fase aguda da sepse as concentrações plasmáticas de AVP encontram-se aumentadas e na fase tardia em níveis basais, apesar da hipotensão progressiva. Nosso objetivo foi analisar o efeito da injeção intraperitoneal de MK-886, (inibidor da síntese de leucotrienos), sobre a produção de LTs e de citocinas no sítio infeccioso e plasma de animais sépticos. Foram usados ratos Wistar que receberam injeções intraperitoneais de MK-886 (4mg/kg) ou veículo (DMSO 5%) 1h antes da indução de sepse experimental por ligadura e perfuração cecal (CLP) ou da operação fictícia (OF). Os animais foram decapitados 0, 4 e 24h após CLP ou OF. O sangue foi coletado para a determinação do sódio sérico, hematócrito, citocinas, LTB4. O lavado peritoneal foi coletado para dosagem de citocinas. O hipotálamo foi removido e incubado para a análise de cis-LTs. O sódio sérico diminuiu, o hematócrito aumentou e os cis-leucotrienos hipotalâmicos não apresentaram alterações significantes após 4 horas de CLP. A sepse provocou um aumento as concentrações de TNF-a, no sítio infeccioso, mas não foi detectada no plasma. As citocinas IL-1b e a IL-6 aumentaram em 4 horas tanto no sítio infeccioso como no plasma. A análise dos resultados de LTB4 plasmático mostrou uma diminuição das concentrações 24 horas após o CLP. A administração do MK-886 não modificou o sódio, o hematócrito e aparentemente nem os cis-leucotrienos hipotalâmicos. No sítio infeccioso a droga causou um aumento nas concentrações de TNF-a 4 e 24 horas enquanto as de IL-1b não se modificaram e as de IL-6 aumentaram apenas 4 horas após o CLP. Entretanto, no plasma, a droga diminuiu acentuadamente as concentrações tanto de IL-1b como de IL-6. A análise do LTB4 plasmático mostrou efeito da droga em 4 horas, mas não em 24 horas da sepse. Os resultados deste estudo sugerem que os LTS regulam de maneira diferente a produção de citocinas no plasma e no foco infeccioso e podem explicar os efeitos destes mediadores sobre a secreção de AVP durante a sepse.

Summary: Leukotrienes (LTs) and cytokines are inflammatory mediators produced during sepsis and may have a task in modulating the secretion of vasopressin (VP). In the acute phase of sepsis, the plasma AVP concentrations are increased and in the late stage at basal levels, despite the progressive hypotension. Our goal was to analyze the effect of intraperitoneal injection of MK-886 (leukotriene synthesis inhibitor) on the production of LTs and cytokines in the infectious site and plasma of septic animals. We used Wistar rats that received intraperitoneal injection of MK-886 (4.0mg/kg) or vehicle (DMSO 5%) 1 h before induction of experimental sepsis by cecal ligation and puncture (CLP) or sham operation (OF).The animals were decapitated at 0, 4 and 24 h after surgeries and blood was collected for determination of serum sodium, hematocrit, cytokines and LTB4. The peritoneal fluid was collected for cytokine assay. The hypothalamus was removed and incubated for the analysis of cis-LTs. Serum sodium decreased, hematocrit increased and hypothalamic cis-leukotrienes did not show significant changes after 4 hours of CLP. Sepsis caused increase in the TNF-a concentrations in the site of infection, but was not detected in plasma. The cytokines IL-1b and IL-6 increased by 4 hours both in the plasma as in the site of infection. The results of LTB4 showed a decrease in plasma concentrations 24 hours after CLP. The administration of MK-886 did not alter sodium, hematocrit, and apparently neither the cis-hypothalamic leukotrienes. At the site of infection the drug caused an increase in the concentrations of TNF-a 4 and 24 hours while IL-1b remained unchanged and L-6 increased only 4 hours after CLP. However, in the plasma the drug markedly diminished the concentrations of IL-1b and IL-6. The analysis of LTB4 in plasma showed effects of the drug in 4 hours but not 24 hours of sepsis. The results of this study suggest that LTs differentially


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regulate the cytokine production in the plasma and in the site of infection, and may explain the effects of these mediators in AVP secretion during sepsis..

Resumen:

Los leucotrienos (LTs) y las citoquinas son mediadores inflamatorios producidos durante la sepsis y puede haber una tarea en la secreción de la modulación de la arginina vasopresina (AVP). En la fase aguda de la sepsis AVP concentraciones plasmáticas se incrementan en la fase tardía se encuentram en niveles basales, pesar de la hipotensión progresiva. Nuestro objetivo fue analizar el efecto de la inyección intraperitoneal de MK-886, (inhibidor de la síntesis del leucotrieno) en la producción de LTs y citoquinas en el sitio de la infección y el plasma de animales sépticos. Hemos utilizado ratas Wistar que recibieron inyecciones intraperitoneales de MK-886 (4.0mg/kg) o vehículo (DMSO al 5%) 1 h antes de la inducción de la sepsis experimental por ligadura cecal y punción (CLP) o cirugía simulada (OF). Los animales fueron decapitados a 0, 4 o 24h após CLP. La sangre fue recolectada para la determinación de niveles séricos de sodio, hematocrito, citoquinas, LTB4. El líquido peritoneal se recogieron para el ensayo de citoquinas. El hipotálamo se retiró y se incubó durante el análisis de los cis-LTs. La disminución del sodio sérico, aumento de hematocrito y cis-leucotrienos hipotalâmicos não mostró cambios significativos después de 4 horas de CLP. Sepsis causó un aumento de las concentraciones de TNF-α en el sitio de la infección, pero no se detectó en el plasma. Las citocinas IL-1β e IL-6 aumentó un 4 horas, tanto en plasma como el sitio de la infección. Los resultados de LTB4 plasmático reveló una disminución en las concentraciones de 24 horas después de CLP. La administración de MK-886 no alteró de sodio, hematocrito, y al parecer ni el cisleucotrienos hipotálamo. En el sitio de la infección de la droga causó un aumento en las concentraciones de TNF-α 4 y 24 horas mientras la IL-1β no cambio e la IL-6 aumentó sólo 4 horas después de CLP y. Sin embargo, in el plasma el fármaco, marcadamente disminuyó las concentrationes de IL-1β e IL-6. El análisis de LTB4 en el plasma mostró efectos de la droga en 4 horas, pero no las 24 horas de la sepsis. Los resultados de este estúdio sugerem que los LTs regulan diferencialmente la producción de citoquinas en el plasma y en el sitio de la infectión, y puedem explicar los efectos de estos mediators em la secretion de AVP durante la sepsis.

Comissão: Maria Jose Alves da Rocha Fabiani Gai Frantz Thiago Mattar Cunha


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Aluno: Juliana Campos Pereira

Orientador: Luciana Simon Pereira Crott

Defesa: 19/10/2012

Título: Avaliação do potencial imunomodulador sobre o sistema complemento humano de frações da alga marinha Bostrychia tenella e de extratos de micro-organismos endofíticos associados.

Title: Evaluation of the immunomodulatory potential of marine algae Bostrychia tenella fractions and extracts from associated endophytic micro-organisms on the human complement system.

Título:

Evaluación del potencial inmunomodulador de fracciones de la alga marina Bostrychia tenella y extractos de microorganismos endófitos asociados en el sistema del complemento humano.

Resumo: A natureza sempre constituiu uma fonte extremamente rica de compostos e substâncias utilizados pelo homem para diferentes fins, principalmente na área médica, pois os produtos naturais abrangem uma variedade de agentes terapêuticos para diversas doenças, como moléstias infecciosas, câncer, desordens lipídicas e imunológicas. Com a necessidade de se encontrar novos fármacos, tanto para doenças bem definidas, quanto para novas doenças, a pesquisa de substâncias com atividades biológicas torna-se fundamental. Fontes exóticas como o ambiente marinho e, recentemente o universo dos micro-organismos, ganharam grande interesse no meio científico devido ao fato de terem sido pouco conhecidas e exploradas. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi avaliar se diferentes frações da macroalga marinha Bostrychia tenella e extratos de micro-organismos endofíticos isolados dessa mesma espécie possuíam atividade imunomoduladora sobre o sistema complemento (SC) humano, que é reconhecido como um dos maiores efetores do processo inflamatório. Iniciado por três vias distintas (clássica, alternativa e das lectinas), ele leva à formação de produtos de clivagem e complexos de ativação que exercem diferentes funções biológicas importantes, como quimiotaxia, ativação de fagócitos, desgranulação de mastócitos, citólise, ativação celular e apoptose. Sendo assim, este sistema desempenha papel importante em várias reações inflamatórias, bem como em diferentes mecanismos patogênicos de dano tecidual. Através do ensaio de atividade hemolítica, 10 das 20 amostras iniciais foram selecionadas por modularem esta atividade do SC no pool de soro humano normal (SHN). As 10 amostras (dentre frações, subfrações e extratos de B. tenella e seus micro-organismos endofíticos) foram capazes de induzir a geração de fragmentos de C3, componente central do SC, observados tanto em técnicas imunoeletroforéticas, quanto em Western blotting. Também, observou-se a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) em ensaio imunoenzimático, indicando que houve ativação total do SC. Através dos resultados obtidos no Western blotting para fragmentos de C4 e Fator B foi possível identificar quais vias do SC são ativadas, quando correlacionados com os resultados dos ensaios hemolíticos para via clássica/das lectinas (VC/VL) e via alternativa (VA). Desse modo, foi possível concluir que as 10 amostras selecionadas possuem efeito imunomodulador sobre o SC humano por serem capazes de ativá-lo, seja pela VC/VL ou pela VA. Conclui-se, também, que o ensaio hemolítico cinético constitui uma importante ferramenta de triagem, assim como o Western blotting do SHN para detecção de fragmentos do SC.

Summary: Nature has always provided an extremely rich source of compounds and substances used by man for various purposes, mainly in the medical field because natural products include a variety of therapeutic agents for various diseases such as infectious diseases, cancer, lipid and immune disorders. With the need to find new drugs for either well defined diseases as for new ones, the search for substances with biological activities becomes essential. Exotic sources such as marine environment, and recently the world of micro-organisms have gained great interest in the scientific community due to the fact that they were little known and explored. In this context, the objective of this study was to assess whether different fractions of marine macroalgae Bostrychia tenella and extracts of endophytic micro-organisms isolated from this species possess immunomodulatory activity on the human complement system (CS), which is recognized as one of the major effectors of the inflammatory process. Started by three distinct pathways (classical, alternative and lectin), it leads to the formation of


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cleavage products and activation complexes which have various important biological functions such as chemotaxis, activation of phagocytes, mast cell degranulation, cytolysis, cellular activation and apoptosis. Thereby, this system plays an important role in various inflammatory reactions, as well as various pathogenic mechanisms of tissue damage. Through the hemolytic activity assays, 10 of the initial 20 samples were selected because they were able to modulate this activity of the CS in the pool of normal human serum (NHS). The 10 samples (among fractions, subfractions and extracts of B. tenella and its endophytic micro-organisms) were able to induce the generation of fragments from C3, a central component of the CS, which was observed both in immuno electrophoresis technique and Western blotting. Also, we observed the formation of the membrane attack complex (MAC) in enzyme immunoassay, indicating that there was total activation of the CS. By the results obtained in Western blotting for fragments of C4 and Factor B was possible to identify which pathways are activated in CS, when correlated with the results of hemolytic assays for the classical/lectin (VC/VL) and alternative pathway (VA). Thus, we conclude that the 10 selected samples have immunomodulatory effects in human CS because they were able to activate it either by VC/VL or VA. It follows also that the hemolytic assay by the kinetic method is an important tool for screening, as well as Western blotting of NHS to detect fragments of the CS

Resumen:

La naturaleza siempre ha sido una fuente muy rica de compuestos y sustancias utilizadas por el hombre para diversos fines, principalmente en el campo de la medicina ya que los productos naturales comprenden una variedad de agentes terapéuticos para diversas enfermedades como las enfermedades infecciosas, cáncer, trastornos de los lípidos y inmunológicas. Con la necesidad de buscar nuevos medicamentos, tanto para enfermedades bien definidas, como para nuevas enfermedades, la investigación de sustancias con actividad biológica se convierte en esencial. Fuentes exóticas como el ambiente marino, y recientemente el universo de los microorganismos han adquirido gran interés en la comunidad científica debido al hecho de que eran poco conocidos y explorados. En este contexto, el objetivo del presente estudio fue evaluar si las diferentes fracciones de macroalga marina Bostrychia tenella y extractos endófitos de microorganismos aislados de esta misma especie posee actividad inmunomoduladora del sistema del complemento (SC) humano, que es reconocido como uno de los mayores efectores del proceso inflamatorio. Empezando por tres vías distintas (clásica, alternativa y lectina), el SC conduce a la formación de productos de escisión y complejos de activación ejerciendo diferentes funciones biológicas importantes, tales como quimiotaxis, activación de fagocitos, desgranulación de mastocitos, citolisis, activación celular y apoptosis. Por lo tanto, este sistema desempeña un papel importante en varias reacciones inflamatorias, así como en diferentes mecanismos patogénicos de daño tisular. A través de la actividad hemolítica, 10 de las 20 muestras iniciales fueron seleccionadas por modular la actividad del SC en el pool de suero humano normal (SHN). Las 10 muestras (entre fracciones y subfracciones y extractos de B. tenella y sus microorganismos endofíticos) fueron capaces de inducir la generación de fragmentos de C3, un componente central del SC, observados tanto en técnicas imunoeletroforéticas cuanto en Western blotting. Además, se observó la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC) en imunoensayo enzimático, indicando que ocurrió activación total de SC. A través de los resultados de Western blotting para fragmentos de C4 y Factor B fue posible identificar que vías activan el SC, cuando se correlaciona con los resultados de los ensayos hemolíticos de las vías clásica / de las lectinas (VC / VL) y alternativa (VA). Por lo tanto, es posible concluir que las 10 muestras seleccionadas tienen potencial inmunomodulador sobre el SC humano, por tener la capacidad de activarlo, sea por VC/VL o VA. Así, se concluye también que el ensayo hemolítico cinético es una herramienta importante para la selección de muestras, tanto como el Western blotting do SHN para detectar fragmentos del SC.

Comissão: Luciana Simon Pereira Crott Iracilda Zeppone Carlos Niege Araçari Jacometti Cardoso Furtado


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Aluno: Leila Priscilla Pinheiro da Silva

Orientador: Ana Lúcia da Costa Darini

Defesa: 12/03/2012

Título: Epidemiologia molecular e genética da resistência à vancomicina em enterococos isolados de pacientes de dois hospitais de Ribeirão Preto

Title: Molecular epidemiology and genetics of vancomycin resistance in enterococci isolated from patients in two hospitals in Ribeirão Preto, Sao Paulo, Brazil..

Título:

Epidemiología molecular y genética de la resistencia a la vancomicina en enterococos aislados de pacientes de dos hospitales de la ciudad de Ribeirao Preto.

Resumo: A emergência de resistência à vancomicina no mundo iniciou-se no final dos anos 80, sendo primeiro documentada na parte ocidental da Europa e posteriormente nos EUA. Depois disso, o isolamento de enterococos resistentes à vancomicina (VRE - do inglês, vancomycin-resistant enterococci) tem sido continuamente reportado em diversas localizações geográficas, inclusive no Brasil. As infecções nosocomiais causadas por enterococos são grandes desafios para os médicos devido à ocorrência de isolados resistentes a múltiplos antibióticos. Diversos métodos de tipagem molecular têm sido utilizados para estudar a epidemiologia de VRE. Neste trabalho, foi realizada a caracterização genética da resistência à vancomicina e epidemiologia molecular de VREs isolados de pacientes de dois hospitais de Ribeirão Preto, o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP) e a Santa Casa de Misericórdia de Ribeirão Preto (SCMRP), no período de setembro de 2008 a setembro de 2010. Foram estudados também os primeiros VREs isolados no HCFMRP-USP, em meados de 2005/2006. Foram determinadas as espécies e os genótipos de 53 VREs, pela reação da polimerase em cadeia (PCR), e todos eram E. faecium e apresentavam o gene vanA. Todos E.faecium isolados dos 2 hospitais em estudo apresentaram CIM para vancomicina >256μg/mL pelo Etest®, já daptomicina mostrou valores de CIM dentro do limite de sensibilidade para todos os enterococos analisados. Com relação aos fatores de virulência, foi evidente a predominância dos genes acm e esp nos E. faecium estudados. Os primeiros VREfm (do inglês, vancomycin-resistant E. faecium) isolados em meados de 2005/2006 de pacientes do HCFMRP-USP apresentaram o transposon Tn1546 intacto, já todos os E. faecium isolados do HCFMRP-USP e da SCMRP, no período de setembro de 2008 a setembro de 2010, apresentaram produto de amplificação maior do que os 4,4kb esperados para grupamento gênico vanRSHAX. Resultados de overlapping PCR e sequenciamento da região do transposon que amplificou fragmento de DNA com tamanho maior que o esperado utilizando primers P11-P12, mostraram que 81% (43 VREfm) isolados nos dois hospitais em estudo, no período de setembro de 2008 a setembro de 2010, apresentaram deleção da extremidade esquerda do Tn1546 e insersão (IS1251), entre genes vanS e vanH. A análise da PFGE dos VREfm em estudo mostrou que havia ocorrido disseminações clonais com determinados perfis de PFGE em períodos específicos. O fato dos primeiros VREfm terem apresentado perfil de PFGE diferente da maioria dos isolados, não permitiu que se determinasse o ancestral comum por PFGE, mas resultados de MLST mostraram que VREfm isolados, no período de 2008-2010, podem ser descendentes diretos destes cinco primeiros VREfm ou podem ter evoluído de um mesmo ancestral comum. A análise da tipagem por MLST de 31 linhagens de VREfm selecionadas a partir dos resultados de PFGE, mostrou que havia 9 STs diferentes, dentre estes, sendo 5 STs novos (656, 657, 658, 659 e 660). Os STs predominantes foram STs 412 e 478. Todos STs identificados pertenciam ao complexo clonal 17 (CC17), com exceção do ST658 que era um singleton. O ST78 que vem se disseminando mundialmente, foi identificado pela primeira vez no Brasil em linhagens do presente estudo. E, por fim, a tipagem por MLST comprovou o que já havia sido determinado pelos resultados de PFGE, que existe relação clonal entre linhagens isoladas nos dois hospitais estudados de Ribeirão Preto.

Summary: World reports on vancomycin resistance emerged in the late 1980s and first documented in Western Europe and later in the United States. Since then, isolation of vancomycin-resistant enterococci (VRE) has been continuously reported in several geographic locations, including Brazil. The widespread occurrence of strains resistant to multiple antibiotics present a


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challenge to clinicians when treating enterococci caused nosocomial infections. Several molecular typing methods have been used to study the epidemiology of VRE. In this study, genetic characterization of vancomycin resistance and molecular epidemiology were performed in VREs isolated from patients in two hospitals in Ribeirão Preto, Sao Paulo/Brazil, the University Hospital of the Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo (HCFMRP-USP) and the Santa Casa de Misericórdia de Ribeirão Preto (SCMRP), from September 2008 to September 2010. The first five VREs isolated in the HCFMRP-USP, in mid 2005/2006 were also included in this study. Species and genotypes of 53 VREs determined by the polymerase chain reaction (PCR) were all E. faecium and had the vanA gene. MICs for vancomycin determined by Etest® were >256μg/mL for all E. faecium isolated in the two hospitals, whereas daptomycin showed MIC values within the limit of susceptibility for all the enterococci analyzed. acm and esp genes predominated as virulence factors. The first five vancomycin resistant E. faecium (VREfm) isolated in mid 2005/2006 showed an intact Tn1546 transposon, whereas all E. faecium isolated later, September 2008 to September 2010, gave a larger amplified DNA fragment than the expected 4,4kb gene cluster vanRSHAX. Results of overlapping PCR and sequencing (primers P11-P12) of the transposon region that amplified the larger than expected DNA fragment showed that 81% (n=43) of the these VREfm had a deletion of the left end of Tn1546 and also a IS1251, between the vanS and vanH genes. The analysis of VREfm PFGEs indicated the occurrence of clonal disseminations with some PFGE profiles at specific times. The different PFGE profiles of the first VREfm (2005-2006) in relation to the latter isolates showed that the common ancestor could not be determined by PFGE. However, MLST results indicated that VREfm isolated, in the period from 2008 to 2010, could be direct descendants of the first five VREfm or could have evolved from a common ancestor. MLST analysis of 31 VREfm isolates selected according to the PFGE results, showed that there were nine different STs, among these five new STs (656, 657, 658, 659, 660). The predominant STs were ST412 and 478. All STs identified belonged to clonal complex 17 (CC17), except for ST658, a singleton. The ST78 that has spread worldwide is being identified in Brazil for first time in this study. MLST confirmed PFGE results showing that there is a clonal link between strains isolated in the two hospitals of Ribeirao Preto, Sao Paulo, Brazil.

Resumen:

La aparición de resistencia a la vancomicina en el mundo comenzó a finales de los 80, y fue documentado por primera vez en Europa Occidental y más tarde en Estados Unidos. Después de esto, el aislamiento de enterococos resistentes a vancomicina (VRE - del inglés, vancomycinresistant enterococci) ha sido continuamente informado en distintas localizaciones, entre ellas Brasil. Las infecciones nosocomiales causadas por enterococos son grandes retos para los médicos debido a la aparición de aislados resistentes a múltiples antibióticos. Varios métodos de tipificación molecular han sido utilizados para estudiar la epidemiología de VRE. En este trabajo, hemos realizado la caracterización genética de la resistencia a la vancomicina y la epidemiología molecular de VREs aislados de pacientes de dos hospitales de Ribeirao Preto, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRPUSP) e a Santa Casa de Misericórdia de Ribeirão Preto (SCMRP), desde septiembre de 2008 a septiembre de 2010. Se estudiaron también los primeros aislados VREs en el HCFMRP-USP, en 2005/2006. Se determinaron las especies y el genotipo de 53 VREs, por la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) y todos fueron E. faecium y presentaron el gen vanA. Los aislados E.faecium de los dos hospitales del estudio presentaron CIM para vancomicina > 256μg/mL por el Etest®, mientras que daptomicina mostró valores de CIM dentro del límite de sensibilidad para todos los enterococos analizados. Respecto a los factores de virulencia, fue evidente la mayoría de los genes acm y esp en los E. faecium estudiados. Los primeros aislados VREfm (del Inglés, vancomycin-resistant E. faecium) en 2005/2006 de pacientes del HCFMRP-USP presentaron el transposón Tn1546 intacto, mientras que todos los E. faecium aislados del HCFMRP-USP y de la SCMRP en el periodo de septiembre de 2008 hasta septiembre de 2010 presentaron producto de amplificación más grande que los 4,4kb esperados para el grupo de genes vanRSHAX. Los resultados de la PCR solapante y secuenciación de la región del transposón que amplificó fragmento de ADN con un tamaño más grande que el esperado utilizando cebadores P11-P12, mostraron que 81% (43 VREfm) aislados en los dos hospitales en estudio, en el periodo de septiembre de 2008 hasta septiembre de 2010, presentaron pierda del trozo izquierdo del Tn1546 y inserción (IS1251), entre los genes vanS y vanH. El análisis por PFGE de los VREfm demostró que había ocurrido diseminaciones


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clonales con determinados perfiles de PFGE en periodos específicos. El hecho de los primeros VREfm presentaren un perfil de PFGE diferente de la mayoría de los aislamientos, no permitió que se determinase el ancestro común por PFGE, pero los resultados de MLST mostraron que VREfm aislados, en el período 2008-2010, pueden ser descendientes directos de estos cinco primeros VREfm o pueden haber evolucionado de un ancestro común. El análisis de tipificación por MLST de 31 aislados de VREfm seleccionados de los resultados de PFGE, mostró que había 9 STs diferentes, entre estos, cinco son nuevos STs (656, 657, 658, 659 y 660). Los STs predominantes fueron 412 y 478. Todos los STs identificados pertenecían al complejo clonal 17 (CC17), con excepción del ST658 que fue un singleton. El ST78, diseminado por todo el mundo, fue identificado por primera vez en Brasil en lineages de este estudio. Y, por último, la tipificación por MLST comprobó lo que ya había sido determinado por los resultados de PFGE, que existe una relación clonal entre lineages aisladas en los dos hospitales estudiados de Ribeirao Preto.

Comissão: Ana Lucia da Costa Darini Evandro Watanabe Eliana Guedes Stehling


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Aluno: Lívia Gonzaga Moura

Orientador: Fabíola Attié de Castro

Defesa: 12/03/2012

Título: Expressão de Galectinas-1 e 3 em Neoplasias Mieloproliferativas

Title: Galectin-1 and 3 expression in Myeloproliferative Neoplasms

Título:

La expresión de las galectinas-1 y 3 en Neoplasias Mieloproliferativas.

Resumo: Doenças Mieloproliferativas Crônicas são desordens hematológicas malignas caracterizadas pela alteração na célula-tronco hematopoética e independência ou hipersensibilidade dos progenitores hematopoéticos a citocinas. Em 2008 a OMS renomeou esse grupo como Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs), no qual estão inclusas as entidades nosológicas Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), doenças alvo desse estudo. Embora, nos últimos anos, tenha havido avanços no diagnóstico das NMPs e nos mecanismos envolvidos com a fisiopatologia dessas doenças, sua patogênese permanece desconhecida. Alterações na maquinaria apoptótica parecem estar envolvidas em na fisiopatologia das NMP e por isso a compreensão dos mecanismos de regulação da apoptose e a interferência das galectinas-1 e 3 nesse processo, em pacientes com NMPs, é relevante para a busca de novos alvos terapêuticos. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram avaliar em leucócitos de sangue periférico e células CD34+ de medula óssea dos pacientes com PV, TE e MFP os níveis de expressão das LGALS1 e LGALS3 e a concentração de galectina-3 plasmática. Além disso, foram determinadas as correlações dos níveis de expressão de LGALS1 e LGALS3 e da quantificação da galectina-3 plasmática com os níveis de expressão do RNAm das moléculas reguladoras da apoptose e com os dados clínico-laboratoriais dos pacientes como a concentração de hemoglobina, percentagem de hematócrito, porcentagem de alelos mutados JAK2V617F, contagem de leucócitos e esplenomegalia. A expressão de LGALS1 estava diminuída em células CD34+ em PV e MFP e em leucócitos de sangue periférico de pacientes com MFP. Os pacientes de TE apresentaram aumento na expressão de LGALS3 em leucócitos de sangue periférico e alta concentração de galectina-3 no plasma. Houve correlação entre os níveis de expressão de LGALS1 e a porcentagem de alelos mutados e a contagem de leucócitos, em pacientes com PV. Foi detectada a correlação entre os níveis de expressão de LGALS3 a porcentagem de alelos mutados e o tamanho do baço, em pacientes com MFP. Com relação aos genes reguladores da apoptose, foram observadas correlações entre os níveis de expressão de LGALS1 e BCL-2 em células CD34+ de pacientes PV e entre LGALS3 e A1, MCL-1, BAX e C-FLIP em leucócitos de de pacientes com TE. Os resultados obtidos indicam que as NPM apresentam expressão diferencial de LGALS1 e LGALS3 e sugerem a associação entre a expressão de galectinas e o status da mutação JAK2V617F, principalmente em pacientes com MFP.

Summary: Chronic myeloproliferative diseases are haematological malignant disorders characterized by the presence of an altered haematopoietic stem cell and independence or hypersensibility of their hematopoietic progenitors to cytokines. In 2008, WHO renamed this group of diseases as Myeloproliferative Neoplasms (MPN) in which is included Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF). There have been advances concerning the knowledge about the mechanisms involved in MPN pathophysiology, however their pathogenesis remains unknow. Deregulation in apoptotic machinery seems to be involved in MPN pathophysiology. Fully understanding of apoptotic machinery and the influence of galectin-1 and 3 in this process in NMP patients might unveil novel targets for manipulation. The aims of the present study were to evaluate in leukocytes and CD34+ hematopoietic stem cells from PV, ET and PMF patients the LGALS1 and LGALS3 expression levels, the Galectin-3 plasma levels and to correlate LGALS1 and LGALS3 expression levels with galectin-3 plasma levels, apoptosis-related genes expression, JAK2 mutation status and clinic-laboratorial parameters. PV and PMF patients showed decreased expression levels of LGALS1 in CD34+ cells and also decreased LGALS1 expression levels in PMF leukocytes. ET patients presented an increased expression level of galectin-3 in leukocytes and plasma. We detected the correlations between LGALS3 gene expression with JAK2 allele burden and with leukocytes number in PV patients. We also


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observed in PMF patients the correlation between LGALS3 expression levels with JAK2 allele burden and spleen size. We also detected the correlation between LGALS1 expression levels BCL-2 gene expression in PV CD34+ HSC cells and between LGALS3 expression and A1, MCL-1, BAX and C-FLIP gene expression in TE leukocytes. Taken together, the results suggest the LGALS1and LGALS3 differential expression in NMP and the relation between JAK2V617F status with galectins expression, especially in PMF patients.

Resumen:

Las enfermedades crónicas mieloproliferativos son enfermedades malignas hematológicas caracterizadas por alteraciones en las células madre hematopoyéticas multipotentes o la independencia y la hipersensibilidad de progenitores hematopoyéticos a citoquinas. En 2008, la OMS rebautizado este grupo de Neoplasia Mieloproliferativa como (NMP) que están presentes en la Policitemia Vera (PV), la Trombocitemia Esencial (TE) y la Mielofibrosis Primaria (MFP), este estudio se centró en las enfermedades. Aunque en los últimos años se han producido avances en el diagnóstico de la NMPs y los mecanismos implicados en la fisiopatología de estas enfermedades, su patogénesis es aún desconocido. Las alteraciones en la maquinaria apoptótica parecen estar implicados en su fisiopatología lo que la comprensión de los mecanismos de regulación de la apoptosis y la interferencia de las galectinas-1 y 3 en este proceso, en pacientes con NMPs, es relevante para la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas. En este contexto, los objetivos de este estudio fueron evaluar, en los leucocitos de sangre periférica y médula ósea CD34+ de los pacientes con PV, TE y MFP: (1) los niveles de expresión de LGALS1 y LGALS3 (2) La concentración de la galectina-3 en plasma; (3) Correlación entre los niveles de expresión de LGALS3 y LGALS1 y la cuantificación de la galectina-3 en los niveles plasmáticos de la expresión del ARNm de las moléculas pro-y anti-apoptóticos de la familia de receptores de muerte Bcl-2, (4) Correlación de niveles de expresión de LGALS3 y LGALS1 y la concentración plasmática de la galectina-3 con los datos clínicos y de laboratorio de pacientes: hemoglobina, hematocrito, el porcentaje de mutación JAK2V617F, recuento de leucocitos y un agrandamiento del bazo. Los pacientes MFP y PV han disminución de la expresión de LGALS1 en células CD34+ y también a disminuir en los leucocitos de sangre periférica de pacientes con MFP. TE pacientes mostraron incremento en la expresión de LGALS3 en leucocitos de sangre periférica y también altas concentraciones de galectina-3 en plasma. Observamos la correlación entre los niveles de expresión de LGALS1 y el porcentaje de alelos mutados y recuento de leucocitos en pacientes con PV. También se observó una correlación entre los niveles de expresión de LGALS3 el porcentaje de alelos mutados y el bazo agrandado en pacientes con MFP. Con respecto a los genes que regulan la apoptosis obtenido correlaciones entre los niveles de expresión de LGALS1 y BCL 2 en las células CD34+ de pacientes con PV y entre LGALS3 y A1, MCL-1, BAX y C-FLIP en los leucocitos de sangre periférica de pacientes con TE. Los resultados indican que la expresión diferencial de NPM tiene LGALS1 y LGALS3 y sugieren una asociación entre la expresión de las galectinas y el estado JAK2V617F mutación, especialmente en pacientes con MFP.

Comissão: Fabíola Attié de Castro Emerson Soares Bernardes Rodrigo do Tocantins Calado de Saloma Rodrigues


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Aluno: Luciana Baroni


Defesa: 12/03/2012

Título: Caracterização molecular da actina do Apicomplexa Neospora caninum

Title: Molecular characterization of the actin from the Apicomplexan Neospora caninum.

Título:

Caracterización molecular de la actina del Apicomplexa Neospora caninum.

Resumo: Neospora caninum é um protozoário pertencente ao filo Apicomplexa que atinge, dentre diversos hospedeiros intermediários, principalmente bovinos e tem emergido como um importante causador de problemas reprodutivos e abortos em rebanhos de corte e leiteiro. Organismos do filo Apicomplexa são parasitas intracelulares obrigatórios que, para locomoverem-se e realizarem a invasão das células hospedeiras, utilizam um mecanismo próprio de locomoção ativa impulsionada pelo motor actina/miosina denominado motilidade por deslizamento (gliding motility), cujo complexo motor localiza-se entre a membrana plasmática e o complexo de membrana interno do parasita. A investigação a respeito do funcionamento desse mecanismo de locomoção e invasão vem sendo realizada principalmente em Toxoplasma gondii e Plasmodium spp., entretanto não há nenhuma publicação envolvendo actina em N. caninum. Esse trabalho envolveu a clonagem e expressão da sequência NcAct201-310 e deu início a caracterização da actina de N. caninum (NcAct). A sequência NcAct foi obtida em banco de dados ToxoDB, e uma comparação por alinhamento entre as actinas de Apicomplexas relacionados revelou que NcAct é idêntica à TgACT1 (100% identidade). Com outras espécies, a NcAct tem maior identidade/similaridade com a actina de Eimeria tenella (97%/99%), seguida da actina de Plasmodium falciparum PfACT1 (93%/97%), da actina de Babesia bovis (86%/94%) e PfACT2 (80%/92%). Quando localizada com anticorpo anti-β-actina C4, NcAct apresenta-se em duas bandas de 43 e 45 kDa em gel de acrilamida 1D e em nove isoformas em gel de acrilamida 2D. Todas as identidades das bandas e spots foram confirmados por espectrometria de massas (MS/MS). Além disso, NcAct localiza-se, em sua maioria, na região periférica do taquizoíta de N. caninum e sua distribuição é alterada após incubação dos taquizoítas com 5 μM de jasplakinolida (JAS) ou 2 μM de citocalasina D (CytD). Por fim, por meio de ensaio de fracionamento de actina monomérica (actina-G) e filamentosa (actina-F), demonstramos que a JAS é capaz de aumentar a quantidade de actina-F em taquizoítas de N. caninum..

Summary: Neospora caninum is an Apicomplexan protozoan that infects, among a whole range of intermediate hosts, bovine where it is emerging as a relevant cause of reproductive problems and abortion in dairy and beef cattle. As obligatory intracellular organisms, parasites from Apicomplexa Phylum use their own active locomotion system to move and invade host cells. This mechanism is driven by the actin/myosin motor known as gliding motility, localized between the plasma and the inner membrane complex. Studies involving this locomotion and invasion system have been conducted mainly in Toxoplasma gondii and Plasmodium spp. To our knowledge there is no publication involving actin in N. caninum, so this work was outlined and involved the cloning and expression of the sequence NcAct201-310, initiating the characterization of actin of N. caninum (NcAct). The sequence NcAct was obtained from the Database ToxoDB, and a comparison of actins from Apicomplexa-related revealed total identity of NcAct with TgACT1 (100% identity). With other species, NcAct has higher identity/similarity with Eimeria tenella actin (97%/99%), followed by Plasmodium falciparum actin PfACT1 (93%/97%), Babesia bovis actin (86%/94%) and PfACT2 (80%/92%). When localized with the antibody anti-β-actin C4, NcAct is presented as two bands of 43 and 45 kDa in 1D acrylamide gel and as nine isoforms in 2D acrylamide gel. All these findings were confirmed by mass spectrometry (MS/MS). Moreover, NcAct localizes predominantly in the peripheric region of N. caninum tachyzoites. This distribution is altered after incubation of the tachyzoites with 5 μM of jasplakinolide (JAS) or 2 μM of cytochalasin D (CytD). Finally through fractionating assay of monomeric (actin-G) and filamentous (actin-F), we demonstrated that JAS is capable of increasing the quantity of actin-F in N. caninum


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tachyzoites.

Resumen:

Neospora caninum es un parásito protozoo perteneciente al phylum Apicomplexa que afecta, entre los hospedadores intermedios, principalmente bovinos y se ha convertido en una causa importante de problemas de aborto y reproductivos en ganado vacuno lechero y de corte. Como organismos intracelulares obligados, los parásitos del phylum Apicomplexa utilizan su propio sistema de locomoción activa para moverse e invadir las células huésped. Este mecanismo, accionado por el motor de actina / miosina, es conocido como motilidad de deslizamiento (gliding motility), y está situado entre la membrana plasmática y el complejo de membrana interna de los organismos. La investigación sobre el funcionamiento de este mecanismo de locomoción y la invasión se ha realizado principalmente en Toxoplasma gondii y especies de Plasmodium, aunque no existe una publicación que implica la actina en N. caninum. Este trabajo implicó la clonación y expresión de la NcAct201-310 y se inició la caracterización de actina de N. caninum (NcAct). La secuencia NcAct se obtuvo de la base de datos ToxoDB, y la comparación por alineación de las actinas de Apicomplexas relacionados reveló que NcAct es idéntica a TgACT1 (100% de identidad). Con otras especies, es mayor identidad / similitud de NcAct con la actina Eimeria tenella (97% / 99%), seguido de actina PfACT1 Plasmodium falciparum (93% / 97%), actina de Babesia bovis (86% / 94 %) y PfACT2 (80% / 92%). Cuando se localiza con anticuerpo anti-β-actina C4, NcAct se presenta en dos bandas de 43 y 45 kDa en gel de acrilamida 1D y en nueve isoformas en gel de acrilamida 2D. Todas las identidades de las bandas y spots fueron confirmados por espectrometría de masas (MS / MS). Además, NcAct se encuentra principalmente en la región periférica de taquizoitos de N. caninum y su distribución se altera después de la incubación de taquizoitos con 5 mM de jasplakinolida (JAS) o 2 mM de citocalasina D (CytD). Finalmente, por ensayo de fraccionamiento de actina monomérica (G-actina) y filamentosa (F-actina), hemos demonstrado que JAS es capaz de aumentar la cantidad de F-actina en taquizoítos de N. caninum.

Comissão: Ana Patricia Yatsuda Natsui Tecia Maria Ulisses de Carvalho Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira


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Aluno: Luiza Cunha Junqueira Reis

Orientador: Elisa Maria de Sousa Russo

Defesa: 28/11/2012

Título: Geração de células de pluripotência induzida (iPS) humanas utilizando vetores lentivirais e determinação do perfil de integração lentiviral

Title: Generation of human induced pluripotent stem (iPS) cell using lentiviral vector and determination of the lentiviral integration profile.

Título:

Generación de células tronco de pluripotencia inducida (iPS) humanas utilizando vectores lentivirales y determinación de lo perfil de integración lentiviral.

Resumo: As células iPS surgiram com a promessa de contornar as limitações das células-tronco embrionárias, como questões éticas, segurança, compatibilidade e disponibilidade. Essas células podem ser obtidas a partir de células somáticas de indivíduos normais ou de pacientes com doenças genéticas, fazendo destas uma importante ferramenta para o screening de drogas, modelos de doenças e testes toxicológicos. Grandes avanços ocorreram nareprogramação de células diferenciadas pela expressão forçada de fatores de transcrição (FT), principalmente, através de vetores lentivirais (VL), que proporcionam uma reprogramação eficiente. Entretanto, a inserção lentiviral no genoma humano e sua influência na reprogramação é pouco conhecida. Neste trabalho, avaliamos o perfil de inserção dos VL utilizados na geração de iPS. As iPS foram geradas e caracterizadas por nosso grupo a partir de fibroblastos humanos transduzidos com VL contendo 3 FT [SOX2, TCL-1A e C-MYC (célula TSM)], e de células mesenquimais derivadas de tecido adiposo com um vetor lentiviral policistrônico contendo 4 FT [OCT4, SOX2, KLF4 e C-MYC (iPS 4FT)]. Cinco colônias isoladas de cada iPS foram mapeadas e analisadas quanto aos sítios de inserção pela técnica de LM-PCR. O DNA genômico digerido foi amplificado com um primer específico para o LTR viral e outro para um linker sintético. Os produtos foram clonados, sequenciados, e analisados em bancos de dados para identificar similaridades com o genoma humano, entre outras análises. Na célula TSM, 176 sequências, obtidas com a técnica de LM-PCR, apresentaram identidade com o genoma humano, sendo que cerca de 50% ocorreram em regiões gênicas com 94% destas em introns. Já nas iPS 4FT, 251 sequências apresentaram identidade, com cerca de 45% atingindo genes, 92% destas em introns. As inserções distribuíram-se por todos os cromossomos, com preferência pelos cromossomos 16, 17 e 20 para a TSM e pelos cromossomos 11, 15 e 17 para a iPS 4FT. Analisamos a distância da inserção ao sítio de início de transcrição (TSS), e inserções próximas a ilhas CpG, que em geral correspondem a regiões regulatórias. A maior proporção de inserção ocorreu a partir de ±30Kb de distância desses sítios. Os sítios frágeis e as regiões repetitivas do genoma foram atingidas, mas com uma frequência baixa. Os resultados mostraram uma preferência de inserção lentiviral por regiões gênicas nas iPS, indicando a possível participação de proteínas como LEDGF/p75 na integração nas células estudadas. Este trabalho mostrou que o local da integração pode contribuir para a reprogramação e, apesar de possíveis efeitos negativos das integrações, estas as células iPS ainda são uma ferramenta importante para estudos in vitro. E identificar fatores que influenciem a seleção do sítio de inserção é importante para determinar regiões cromossômicas “seguras” para a integração, aumentando a segurança no uso clínico.

Summary: The induced pluripotent stem (iPS) cells came with the promise of circumvent some of the limitations in the use of embryonic stem cells, like ethical issues, biological safety, immune compatibility and availability. This cells can be generated from somatic cells of normal individuals or from patients with some genetic disease, making then an important tool for drug screening, construction of disease models and toxicological trials. Great advances have happened in reprogramming differentiated cells through the forced exogenous expression of transcription factors (TF), mostly by lentiviral vectors (LV), which provide an efficient reprogramming. However, the lentiviral insertion in the human genome and its influence in reprogramming is not well known. In this work, we evaluate the insertion profile of LV used to generate human iPS cells. The iPS cells were generated, by our group, from human fibroblasts transduced by LV containing 3 TF [SOX2, TCL-1A and C-MYC (TSM reprogrammed cell)], and from mesenchymal cells derived from human adipose tissue


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transduced by a polycistronic LV containing 4 TF [OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC (iPS 4TF)]. Five isolated colonies of each iPS cell were mapped and analyzed for the insertion sites through LM-PCR technique. The digested genomic DNA was amplified with a primer for the viral LTR e another for a synthetic linker. The products were cloned, sequenced and analyzed in database to identify similarities with the human genome, among other analyzes. In TSM cell, 176 sequences, derived from the LM-PCR technique, presented identity with the human genome, and about 50% of those occurred in genic regions with 94% in introns. In iPS 4TF, 251 sequences showed identity, with about 45% reaching genes, 92% of these in introns. The insertions were distributed on all chromosomes, with preference for the 16, 17 and 20 for the TSM cell, and for the 11, 15 and 17 for the iPS 4TF. We analyzed the distance of the insertion from de transcription start site, and insertions near CpG islands, which, overall, correspond to regulatory regions. The highest proportion of insertion occurred starting ±30Kb distance from these sites. The fragile sites and the repetitive regions of the genome were also reached, but with low frequency. The results showed a preference of lentiviral insertion for genic regions in iPS, indicating the potential participation of proteins like LEDGF/p75 in integration in the cells of this work. This work shows that the integration site may contribute to the reprogramming, and, despite possible negative effects of integration, these iPS cells are still an important tool for in vitro studies. Identify factors that influence the selection of insertion site is important for determination of “safe” chromosomal regions for the integration, increasing the safe in clinical use.

Resumen:

Las células iPS surgieron con la promesa de superar las limitaciones de las células tronco embrionarias, como cuestiones éticas, seguridad, compatibilidad y disponibilidad. Estas células pueden ser obtenidas a partir de células somáticas de individuos normales o de pacientes con enfermedades genéticas, haciendo de éstas una importante herramienta para el screening de drogas, modelos de enfermedades y ensayos toxicológicos. Grandes avances ocurrieron en la reprogramación de células diferenciadas por la expresión forzada de factores de transcripción (FT), principalmente, a través de vectores lentivirales (VL), que proporcionan una reprogramación eficiente. A pesar de esto, la inserción lentiviral en el genoma humano y su influencia en la reprogramación es poco conocida. En este trabajo, evaluamos el perfil de inserción de los VL utilizados en la generación de iPS. Las iPS fueron generadas y caracterizadas por nuestro grupo a partir de fibroblastos humanos transducidos con VL conteniendo 3 FT [SOX2, TCL-1A y C-MYC (célula TSM)], y de células mesenquimales derivadas de tejido adiposo con un vector lentiviral policistrónico conteniendo 4 FT [OCT4, SOX2, KLF4 y C-MYC (iPS 4FT)]. Cinco colonias aisladas de cada iPS fueron mapeadas y analizadas en cuanto a los sitios de inserción por la técnica de LM-PCR. El DNA genómico digerido fue amplificado con un primer específico para el LTR viral y otro para un linker sintético. Los productos fueron clonados, secuenciados, y analizados en bancos de datos para identificar similitudes con el genoma humano, entre otros análisis. En el caso de célula TSM, 176 secuencias, obtenidas con la técnica de LM-PCR, presentaron identidad con el genoma humano, siendo que cerca del 50% de las integraciones ocurrieron en regiones génicas con 94% de éstas en intrones. En el caso de iPS 4FT, 251 secuencias presentaron identidad, con cerca de 45% alcanzando genes y 92% de éstas en intrones. Las inserciones se distribuyeron por todos los cromosomas, con preferencia por el 16, 17 y 20 para TSM y por el 11, 15 y 17 para la iPS 4FT. Analizamos la distancia de la inserción al sitio de inicio de transcripción (TSS), e inserciones próximas a islas CpG, que en general corresponden a regiones regulatorias. La mayor proporción de inserción ocurrió a partir de ±30Kb de distancia de esos sitios. Los sitios frágiles y las regiones repetitivas del genoma fueron alcanzadas, pero con una frecuencia baja. Los resultados muestran una preferencia de inserción lentiviral por regiones génicas en las iPS, indicando la posible participación de proteínas como LEDGF/p75 en la integración en las células estudiadas. Este trabajo mostró que el sitio de integración pueden contribuir a la reprogramación y, a pesar de los possibles efectos negativos de la integración, estas células iPS son todavía una importante herramienta para los estudios in vitro. Identificar factores que influencien la selección del sitio de inserción es importante para determinar regiones cromosómicas “seguras” para la integración, aumentando la seguridad en el uso clínico.

Comissão: Elisa Maria de Sousa Russo Carlos Eduardo Ambrosio Simone Kashima Haddad


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Aluno: Natália de Souza Nunes


Defesa: 25/01/2012

Título: Expressão de microRNAs em leucócitos e células CD34+ em Policitemia Vera

Title: microRNA expression in leukocytes and CD34+ cells in Polycythemia Vera.

Título:

Expresion de microRNAs em los leucocitos y las celulas CD34+ em la Policitemia Vera.

Resumo: A Neoplasia Mieloproliferativa Crônica (NMPC)- Politemia Vera é uma desordem clonal caracterizada pelo acúmulo de eritrócitos, leucócitos, plaquetas e progenitores normais na ausência de um estímulo definido. Apesar dos avanços no diagnóstico de PV e da descrição de mecanismos envolvidos no estabelecimento da doença sua patogênese permanece desconhecida entretanto, alterações no mecanismo regulador da apoptose parecem estar envolvidos em sua fisiopatologia. A compreensão acerca do funcionamento da maquinaria apoptótica e sua possível regulação por microRNAs em pacientes com Policitemia Vera parece revelar novos alvos para estudo e consequentemente transformar-se em novas terapias para a doença. Neste contexto os objetivos deste trabalho foram avaliar em leucócitos de sangue periférico e células CD34+ de medula óssea dos pacientes de PV: (1) a quantificação da expressão de microRNAs cujos alvos são RNAs associados a regulação da apoptose; (2) Correlação dos níveis de expressão dos miRNAs com os de RNAm das moléculas pró e anti-apoptóticas da família Bcl-2 e dos receptores de morte; (3) Correlacão dos níveis de expressão dos miRNAs com os seguintes dados clínico-laboratoriais dos pacientes: concentração de hemoglobina, hematócrito e percentagem da mutação JAK2. Os pacientes com Policitemia Vera apresentam aumento de expressão dos microRNAs 29c, 16, 21, 26a, 130b e let-7d e diminuição de miR15a e 34c em leucócitos de sangue periférico; Aumento de expressão dos miRs 29c, 16 e 21; diminuição na expressão de miR 130b e let-7d em células CD34+ ; alteração na expressão de genes pró e anti-apoptóticos em leucócitos de sangue periférico com aumento de a1, mcl-1 e diminuição de bcl-2, ciap-2, bax e fas-L,alteração na expressão de genes pró e anti-apoptóticos em células CD34+ com aumento de expressão de fas, bid, mcl-1, bcl-xl e c-flip; diminuição na expressão de bik. Observamos diminuição na expressão protéica de BCL-2 em pacientes quando comparado aos indivíduos controle.Notamos também a correlação entre a alteração na expressão de microRNAs e seus respectivos genes alvo e destes com parâmetros hematológicos analisados. Os linfócitos dos pacientes de PV apresentam maior resistência a apoptose do que os indivíduos controles quando induzidos por: Actinomicina, etoposídeo, citarabina e cicloheximida. Concluindo, os dados obtidos sugerem a participação dos microRNAs na regulação da maquinaria apoptótica e a participação desta desregulação na fisiopatologia da PV. Estes resultados contribuem para o melhor entendimento da fisiopatologia da PV e serão úteis futuramente para o desenho de novos alvos terapêuticos e descrição de marcadores de prognóstico..

Summary: Polycythaemia vera (PV) is a clonal disorder characterized by an accumulation of normal red and white cells, platelets, and their progenitors in absence of a definable stimulus. Despite the advances in PV diagnosis and the description of the mechanisms involved in disease establishment its pathogenesis remains unclear. The apoptosis deregulation might have a role in PV physiopathology. Fully understanding the basic apoptotic pathway and its potential regulation by microRNA in PV patients cells might unveil targets for manipulation, which may be translated into novel therapies for disease.The aims of this study were to avaluate in leukocytes and CD34+ cells: (1) The microRNA expression whose RNA target are associated with apoptosis regulation (2) Correlation between microRNA expression and the mRNA levels of anti and pro-apoptotic family Bcl-2 expression and death receptors; (3) Correlation between microRNA expression and the clinical data of patients: hemoglobin concentration, hematocrit and JAK2 percentage. Patientes with Polycythemia Vera shows increased expression of microRNAs 29c, 16, 21, 26a, 130b and let-7d and 34c and 15a decrease in peripheral leukocytes; incresead expression of miRs 29c, 16 and 21, decrease in miR130b and let-7d expression in CD34+ cells; deregulation in pro and anti-apoptotic gene


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expression in peripheral leukocytes with increase in a1, mcl-1 and decrease in bcl-2, ciap-2, bax and fas-L, deregulation in pro and anti-apoptotic gene expression in CD34+ cells with increased expression of fas, bid, mcl-1, bcl-xl and c-flip and decreased expression of bik. Decreased in proteic expression of BCL-2 in peripheral leukocytes of patients when compared to controls. Correlation between de deregulated expression of microRNA and their genes target and those with hematological parameters. Lymphocytes from PV patients shows higher resistance to apoptosis than controls when induced by: Actinomicin, etoposide, cytarabine and cycloheximide. In conclusion the data suggest the involvement of microRNA in apoptosis regulation and the involvement of apoptosis machinery in the PV pathophysiology. These results will contribute for a better understanding of PV pathophysiology and will be useful for the discover of future therapies.

Resumen:

La Neoplasia Mieloproliferativa Crônica (NMPC)- Politemia Vera es un transtorno clonal caracterizado por la acumulación de eritrocitos, leucocitos, plaquetas y los progenitores normales en ausencia de un estímulo definido. A pesar de los avances en el diagnóstico de la PV y la descripción de los mecanismos implicados en la aparición de la enfermedad, su patogenia se desconoce, sin embargo, cambios en el mecanismo de regulación de la apoptosis parecen estar involucrados en su fisiopatología. La comprensión del funcionamiento de la maquinaria de regulación de la apoptosis y su posible microARN en pacientes con Policitemia Vera parece revelar nuevos objetivos para el estudio y, en consecuencia, nuevas terapias para la enfermedad. En este contexto, los objetivos en este estudio fueron evaluar leucocitos de sangre periférica y células CD34 + de la médula ósea de pacientes con PV: (1) cuantificar la expresión de microARN, cuyo objetivo son ARN asociados con la regulación de la apoptosis; (2) Correlación de los niveles de expresión de miRNAs con el ARNm de moléculas pro y anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 y los receptores de muerte, (3) Correlación de los niveles de expresión de miRNAs con las siguientes características clínicas de los pacientes: la concentración de hemoglobina, hematocrito y porcentaje de JAK2. Los pacientes con policitemia vera tienen aumento de expresión de microARN 29c, 16, 21, 26 bis, 130 B y let-7d y disminución de miR15a y 34c, en leucocitos de sangre periférica, aumento en la expresión de miRs 29c, 16 y 21; disminución en la expresión de miR 130 B y let-7d en las células CD34 +, cambios en la expresión de genes pro y anti-apoptóticos en leucocitos de sangre periférica con aumento de a1, mcl-1 y la disminución de bcl-2, ciap-2, bax y fas-L, cambios en la expresión de genes pro y anti-apoptóticos en células CD34 +, con una mayor expresión de fas, bid, mcl-1, bcl-xl y c-flip; disminución de la expresión de bik. Se observó una disminución en la expresión de la proteína BCL-2 en los pacientes en comparación con los sujetos controles. Notamos la correlación entre el cambio en la expresión de microARN y sus genes objetos y aquellos con los parámetros hematológicos analizados. Los linfocitos de pacientes con PV tienen una mayor resistencia a la apoptosis que de los sujetos de control cuando es inducido por: actinomicina, etopósido, citarabina y cicloheximida. Por último, los datos obtenidos sugieren la participación de los microARN en la regulación de la maquinaria apoptótica y la participación de esta desregulación en la fisiopatología de la PV. Estos resultados contribuyen para una mejor comprensión de la fisiopatología de la PV y serán de utilidad para el diseño futuro de nuevas dianas terapéuticas y descripción de marcadores de pronóstico.

Comissão: Fabíola Attié de Castro Elvira Maria Guerra Shinohara Arlete Aparecida Martins Coelho Castelo


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Aluno: Vania Fernandez

Orientador: Jose Clovis do Prado Junior

Defesa: 04/10/2012

Título: Efeitos da administração de melatonina sobre a resposta imune em ratos Wistar na amebíase hepática

Title: Effects of melatonin administration on the immune response of Wistar rats in amebic liver abscess.

Título:

Los efectos de la administración de la melatonina sobre la respuesta inmune en ratas Wistar en la amebiasis hepática.

Resumo: Os trofozoítos de Entamoeba histolytica após se evadirem de uma complexa resposta imune ao nível da mucosa intestinal, invadem o epitélio, podendo disseminar-se pela circulação portal, atingindo o fígado e outros órgãos. A amebíase hepática é a forma mais comum de amebíase extraintestinal e corresponde a menos de 1% dos casos clínicos de amebíase. A modulação das respostas imunológicas frente à administração de substâncias farmacologicamente ativas em modelos experimentais infectados por diferentes patógenos tem contribuído de maneira importante nas investigações de terapias alternativas para colaborar no tratamento das diferentes doenças parasitárias. A melatonina é uma indolamina cuja síntese ocorre na glândula pineal e em vários locais extrapineais como as células do sistema imune, retina, medula óssea, pele, leucócitos, e trato gastrointestinal. É uma molécula pleiotrópica que possui atividades imunoestimulatórias e efeitos pró e anti-inflamatórios. O estudo em modelos animais suscetíveis ou resistentes à amebíase é de suma importância para entendermos os efeitos fisiopatológicos desta doença e das ações da melatonina na resposta imune neste modelo experimental resistente à amebíase. O presente estudo teve como objetivo avaliar um possível efeito imunomodulatório subseqüente à administração de melatonina em ratos da linhagem Wistar machos infectados no fígado pela cepa HM1-IMSS de Entamoeba histolytica na fase aguda da amebíase hepática experimental. Foram utilizados vários parâmetros como: dosagens das citocinas IFN-γ, IL-4, análise por citometria de fluxo das populações celulares TCD3+, TCD4+, TCD8+, CD45+, CD161+ e produção de óxido nítrico. Através dos resultados obtidos, podemos afirmar que a melatonina exerceu seus efeitos pleiotrópicos mantendo a homeostase imunológica do hospedeiro, através de uma resposta imune efetiva para conter a invasão parasitária e ao mesmo tempo evitando uma exacerbação dessas respostas que certamente iriam influenciar o grau de patogenicidade desta parasitose.

Summary: The trophozoites of Entamoeba histolytica after evade a complex immune response at the intestinal mucosal level, invade the epithelial layer and may spread into the portal circulation reaching the liver and other organs. The amebic liver abscess (ALA) is the most common form of the extraintestinal amebiasis and is less than 1% of clinical cases of human amoebiasis. The modulation of immune responses by the administration of pharmacological active substances in experimental models infected by different pathogens has contributed in investigations of alternative therapies in order to aid the treatment of various parasitic diseases. Melatonin is an indolamine whose synthesis occurs in the pineal gland and in several extra-pineal locations such as the immune system cells, retina, bone marrow, skin, leukocytes, and gastrointestinal tract. This molecule has pleiotropic effects with immunoenhancing actions besides pro and anti inflammatory effects. The study in susceptible or resistant animal models to amoebiasis is extremely important to understand the pathophysiological effects of this disease and the actions of melatonin in the immune response of a resistant strain of rat. The present study aimed to evaluate a possible immunomodulatory effect following the administration of melatonin in male Wistar rats infected with the strain HM1-IMSS of E. histolytica during the acute phase of experimental amebic liver abscess. Several immune parameters were evaluated such as of cytokines IFN-γ, IL-4, flow cytometry analysis of cell populations TCD3+, TCD4+, TCD8+, CD45+ CD161+, and nitric oxide production. According to our results, we can affirm that melatonin exerted its pleiotropic effects maintaining the host’s immune homeostasis by exerting an effective immune response in order to stop parasite invasion while avoiding an exacerbation of these responses that would certainly influence the degree of pathogenicity of this parasitosis.


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Resumen:

Los trofozoitos de Entamoeba histolytica después de evadir de una compleja respuesta inmune al nivel de la mucosa intestinal, invaden el epitelio, pudiendo diseminarse por la circulación portal, atingiendo el hígado y otros órganos. La amebiasis hepática es la forma más común de amebiasis extra intestinal y corresponde a menos de 1% de los casos clínicos de amebiasis. La modulación de las respuestas inmunológicas frente a la administración de substancias farmacológicamente activas en modelos experimentales infectados por diferentes patógenos ha contribuido de manera importante en las investigaciones de terapias alternativas para colaborar en el tratamiento de las diferentes enfermedades parasitarias. La melatonina es una indolamina cuya síntesis ocurre en la glándula pineal y en varios locales extra pineales como las células del sistema inmune, retina, medula ósea, piel, leucocitos y trato gastrointestinal. Es una molécula pleiotrópica que posee actividades inmunoestimulatorias y efectos pro y anti-inflamatorios. El estudio en modelos de animales susceptibles o resistentes a la amebiasis es de suma importancia para la comprensión de los efectos fisiopatológicos de esta enfermedad y de las acciones de la melatonina en la respuesta inmune en este modelo experimental resistente a la amebiasis. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar un posible efecto inmunomodulatorio subsecuente a la administración de melatonina en ratas del linaje Wistar machos infectadas en el hígado por la cepa HM1-IMSS de Entamoeba histolytica en la fase aguda de la amebiasis hepática experimental. Fueron utilizados varios parámetros como: dosaje de las citoquinas IFN-γ, IL-4, análisis por citometría de flujo de las poblaciones celulares TCD3+, TCD4+, TCD8+, CD45+, CD161+ y producción de óxido nítrico. Por medio de los resultados obtenidos, se puede afirmar que la melatonina pudo ejercer sus efectos pleiotrópicos manteniendo la homeostasis inmunológica del hospedero, por medio de una respuesta inmune efectiva para contener la invasión parasitaria y al mismo tiempo evitando una exacerbación de esas respuestas que por supuesto influenciarían el grado de patogenicidad de esta parasitosis.

Comissão: Jose Clovis do Prado Junior Fernanda de Freitas Anibal Angelita Maria Stabile

mestrado 2012fcfrp.usp.br/media/wcms/files/mestrado_2012.pdf · programa de pós graduação em...

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