marina barguil macÊdo · universidade de sÃo paulo instituto de ciÊncias biomÉdicas candidata:...

MARINA BARGUIL MACÊDO

PAPEL PROTETOR DA QUINASE ATIVADA POR ADENOSINA

MONOFOSFATO (AMPK) NA PROGRESSÃO E SEVERIDADE

DA NEFRITE TUBULOINTERSTICIAL EXPERIMENTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Imunologia do Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em Ciências

SÃO PAULO

2017

MARINA BARGUIL MACÊDO

PAPEL PROTETOR DA QUINASE ATIVADA POR ADENOSINA

MONOFOSFATO (AMPK) NA PROGRESSÃO E SEVERIDADE

DA NEFRITE TUBULOINTERSTICIAL EXPERIMENTAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Imunologia do Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Área de concentração: Imunologia

Orientador: Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara

Versão original

SÃO PAULO

2017

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

Candidata: Marina Barguil Macêdo

Titulo da Dissertação: Papel protetor da quinase ativada por adenosina monofosfato

(AMPK) na progressão e severidade da nefrite tubulointersticial experimental

Orientador: Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão

pública realizada em ........./......../.........., considerou a candidata:

( ) Aprovada ( ) Reprovada

Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................

Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................


Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................


Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................

Presidente: Assinatura: ...............................................................................

Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais, Plínio e Mariane, por estarem sempre presentes, apesar da

distância. Distância, aliás, que não foi empecilho algum para vivenciarem cada momento

relevante da minha formação acadêmica. Que o diga o papai, que, mesmo morando nas

proximidades da Linha do Equador, cruzou o Trópico de Capricórnio muitas e muitas vezes

para me visitar, e chegou mesmo a atravessar duas vezes o Trópico de Câncer para me

acompanhar.

A very special thanks para o meu orientador, o Prof. Niels, que estava sempre em sua

salinha disposto a me dar food for thought & food for tummy. Sempre recebi de bom grado

seus conselhos valiosos. Já não posso dizer o mesmo sobre suas iguarias gourmets... Acho que

ele não vai me perdoar por todas as vezes que recusei as tortas e bolos. Mas sou capaz de

garantir que estavam todos muito bons, mesmo sem ter provado!

Um muitíssimo obrigada à Angela, que assumiu fielmente o posto de guardian angel

na minha pesquisa. Enquanto o Prof. Niels me ensinou como pensar ciência, a Angela me

ensinou como fazer ciência. Pacientemente ela me explicou todas as técnicas de bancada

sobre as quais eu apenas tinha uma vaga ideia de como funcionavam. E pacientemente ela me

fez perceber que era necessário ter paciência com os resultados. Já dizia Ambrose Bierce,

“paciência é uma forma menor de desespero, disfarçada de virtude”. No caso da Angela,

paciência é uma virtude nata. No meu caso, é tão somente desespero contido. Que bom ter

podido conhecê-la e aprender tanto com ela!

O Paulo também merece meus mais sinceros agradecimentos. Afinal não foram poucas

as vezes em que eu fui reclamar do material de western blotting que tinha acabado e precisava

preparar mais. Ou que seria necessário antecipar um sacrifício e a ajuda dele seria requisitada

antes do combinado. Ou que a reação de genotipagem parou de funcionar e teríamos que

testar uma combinação diferente de primers ou de mix para que a banda voltasse a aparecer no

local certo. Enfim, foram muitos os percalços que sofremos juntos, mas que ficaram mais

leves por estarmos trabalhando em equipe.

Para o Thiago, um obrigada do fundo do coração por todos os momentos que

passamos, mesmo aqueles em que ele inventava as mais absurdas histórias e brincadeiras só

para chamar a atenção. Entramos juntos no Mestrado, mas eu concluí antes. Acho que foi

melhor assim, porque se tivesse sido ele a terminar antes de mim, eu teria sofrido, pois metade

da alegria do lab iria embora com ele.

Merecem ainda uma menção especial: o Vinícius, que, apesar de ter convivido pouco

comigo, foi muito importante no começo do meu trabalho; a Cris Aguiar, pela companhia, em

especial nas quartas e quintas-feiras, os dias mais gostosos da semana; a Meire, que sempre

faz o seu melhor para o bom andamento do laboratório, e que tem meu sincero

reconhecimento por isso; a Fernanda, que compartilha comigo o amor por contos de fada e

que é, ela mesma, quase uma personagem saída deles, com um senso de dever e uma

sensibilidade próprios de uma princesa; e a Natália, que eu conheço há pouco tempo, mas que

é uma colega dedicada e esforçada.

A equipe do LIT é grande e está envolvida em diferentes áreas de pesquisa, então

houve muitas pessoas que não colaboraram diretamente no meu trabalho, mas que nem por

isso deixaram de dar sua contribuição, seja através de comentários oportunos, seja

simplesmente por se mostrarem ouvintes atentos nas discussões de resultado das sextas-feiras.

Foram elas: a Tati, o Rafael, o Tárcio, a Amanda, a Camila, a Cris Naffah, a Aline, o

Guilherme, e a Raquel. Um muito obrigada a todos que conviveram comigo nesses quase dois

anos!

ENTIDADES DE FOMENTO

O presente trabalho foi desenvolvido com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa

do Estado de São Paulo (FAPESP, Processos 2016/02299-1 e 2012/02270-2) e do Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Processo 130128/2016-3).

“But the scientist is intensely religious - he is so religious that he will not accept quarter-

truths, because they are an insult to his faith.” (Sinclair, 1925)

RESUMO

Macêdo MB. Papel protetor da quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK) na

progressão e severidade da nefrite tubulointersticial experimental. [Dissertação (Mestrado em

Imunologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2017.

A quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK) é um sensor e regulador metabólico,

cujo efeito sobre a polarização de macrófagos (MØ) vem sendo investigado como potencial

alvo terapêutico. Objetivou-se investigar o papel da ativação dessa molécula pela metformina

(Met) na doença renal crônica (DRC) experimental, tendo por hipótese que ela exerceria um

impacto positivo sobre a progressão da doença, ao levar os MØ para um fenótipo menos pró-

inflamatório. Para tal, inicialmente induziu-se nefrite tubulointersticial (NTI) crônica em

camundongos C57BL/6, através de ração suplementada com adenina 0,25% por 10 dias.

Concomitantemente, os animais foram tratados com Met 200 mg/kg/dia ou salina, por

gavagem. Intencionando comprovar que o efeito da Met sobre os MØ era dependente de

AMPK, experimento idêntico foi realizado em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

. Com o

intuito de identificar outras células relevantes para a fisiopatologia da lesão, e passíveis de

alteração metabólica pela AMPK, administrou-se clodronato lipossomal 50 mg/kg, uma droga

depletora de MØ, em camundongos C57BL/6 com NTI, e associou-se a gavagem com Met.

Trabalhou-se ainda com camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

. Realizou-se experimento in

vitro com células tubulares epiteliais renais murinas (CTERM, linhagem MM55.K), em que

se avaliou o efeito do estímulo com Met 20 mM sobre a transição epitélio-mesenquimal

(TEM). Os camundongos C57BL/6 tratados com Met apresentaram menor deterioração da

função renal, ao que se associou uma redução do número de granulomas no interstício renal;

uma maior frequência de MØ M1, em detrimento dos M2; e uma redução da expressão da

citocina pró-fibrótica TGF-β. Os camundongos LyzM-cre AMPK-/-

não diferiram dos LyzM-

cre AMPK+/+

quanto à intensidade da lesão, o que se justifica por a molécula já se encontrar

menos expressa no contexto da NTI. Por outro lado, ao se estimular a fosforilação da quinase

com Met, os LyzM-cre AMPK+/+

evoluíram melhor do que os não tratados, o mesmo não se

verificando nos LyzM-cre AMPK-/-

, o que sugere que a ação da Met nos MØ é de fato

dependente de AMPK. Apesar disso, a Met ainda foi capaz de limitar o grau de fibrose nos

rins dos LyzM-cre AMPK-/-

. O experimento com o Clo apontou para a existência de outros

alvos celulares da Met, uma vez que os animais tratados com ambas as drogas se mostraram

significativamente melhores do que os que receberam apenas uma delas. Os camundongos

CD4-cre AMPK-/-

e CD4-cre AMPK+/+

manifestaram a doença com igual gravidade. Não

houve diferenças no infiltrado linfocitário dos linfonodos renais entre os grupos controle e

com NTI, o que insinua que os linfócitos T CD4, nesse modelo de DRC, desempenham papel

pouco relevante para o estabelecimento da lesão. As CTERM apresentaram aumento da

fosforilação da AMPK e ativação da via glicolítica após o estímulo com Met, ao que se

correlacionou maior captação de glicose e expressão do transportador Glut-2. Houve menos

TEM nas CTERM que receberam Met. Assim, conclui-se que, na NTI experimental, a

ativação da AMPK reduz acentuadamente a gravidade da doença, ao modular os MØ para um

fenótipo menos pró-fibrótico, e ao tornar as CTERM resistentes à TEM.

Palavras chave: Quinase Ativada por Adenosina Monofosfato (AMPK). Imunometabolismo.

Macrófagos. Metformina. Doença renal crônica.

ABSTRACT

Macêdo MB. Protective role of adenosine monophosphate activated kinase (AMPK) on the

progression and severity of experimental tubulointerstitial nephritis. [Dissertação (Mestrado

em Imunologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo;

2017.

Adenosine monophosphate activated kinase (AMPK) is an energy sensor and a master

regulator of metabolism, whose role on macrophage (MØ) polarization has been proposed as

a potential therapeutic target. We aimed to investigate the role of AMPK activation by

metformin (Met) on chronic kidney disease, hypothesizing that it could have a positive impact

on disease progression, mainly by leading MØ to a less inflammatory phenotype. We induced

tubulointerstitial nephritis (TIN) on C57BL/6 mice by feeding of adenine-enriched (0.25%)

diet for 10 days. Mice were gavaged daily with either saline or Met 200 mg/kg. In order to

certify that Met was acting through an AMPK-dependent pathway on MØ, the same model

was tested in LyzM-cre AMPKflox/flox

mice. With the intent of identifying other cells

meaningful to TIN pathogenesis, and prone to the beneficial interference of AMPK on their

metabolism, we administered liposome-encapsulated clodronate 50 mg/kg to C57BL/6 mice

with TIN, and additionally treated them with Met. We also worked with CD4-cre

AMPKflox/flox

mice. We performed an in vitro experiment on a lineage of murine renal tubular

epithelial cells (RTEC, MM55.K) to assess the effect of Met 20 mM on epithelial to

mesenchymal transition (EMT). Met-treated C57BL/6 mice presented a less marked

deterioration of renal function, to which it was associated a reduction of the number of

granulomata on renal interstitium; a greater frequency of infiltrating M1 MØ; and a reduced

expression of pro-fibrotic cytokine TGF-β. Severity of renal injury did not differ between

LyzM-cre AMPK-/-

and AMPK+/+

mice, what can be explained by AMPK being

downregulated on TIN. On the other hand, upregulation promoted by Met resulted in

improvement of LyzM-cre AMPK+/+

, but not AMPK-/-

mice, thus suggesting that the effect of

Met on MØ is indeed dependent of AMPK. Nevertheless, Met was able to reduce renal

fibrosis on LyzM-cre AMPK-/-

mice. The experiment with Clo pointed to other cellular targets

of Met, since mice treated with both drugs faired even better than those treated with each one

in separate. CD4-cre AMPK+/+

and AMPK-/-

mice presented the same intensity of injury, and

there was no difference on the lymphocytic infiltrate of renal lymph nodes from control and

diseased mice, indicating that CD4 T cells, on this model, do not present a prominent role.

Met-stimulated RTEC expressed higher levels of phosphorylated AMPK, and exhibited

activation of glycolysis, to which correlated increase of glucose uptake and enhanced

expression of the transporter Glut-2. EMT was impaired on Met-treated RTEC. We therefore

conclude that, in experimental TIN, activation of AMPK sensibly reduces disease severity

both by modulating MØ to a less fibrotic phenotype, and turning RTEC resistant to EMT.

Keywords: Adenosine monophosphate activated kinase (AMPK). Immunometabolism.

Macrophages. Metformin. Chronic kidney disease.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Modelo da via de sinalização da AMPK. ................................................................ 22

Figura 2 - Representação esquemática dos mecanismos celulares envolvidos na progressão da

doença renal crônica. ................................................................................................................ 25

Figura 3 - Delineamento experimental de NTI induzida por adenina e tratada com

metformina. .............................................................................................................................. 32

Figura 4 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para LyzM. ............ 33

Figura 5 - Delineamento experimental de NTI induzida por adenina e tratada com clodronato

e/ou metformina. ....................................................................................................................... 34

Figura 6 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para Prkaa. ............ 36

Figura 7 - Esquema representativo do cultivo de células tubulares epiteliais renais murinas,

linhagem MM55.K. .................................................................................................................. 43

Figura 8 - Parâmetros clínico-laboratoriais dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por

adenina, e tratados com metformina. ........................................................................................ 46

Figura 9 - Peso renal e histologia dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina,

e tratados com metformina. ...................................................................................................... 47

Figura 10 - Marcação imunoistoquímica para iNOS nos rins dos camundongos C57BL/6 com

NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ........................................................... 49

Figura 11 - Estratégia de gating para caracterização do infiltrado leucocitário nos rins dos

camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ............ 50

Figura 12 - Frequência de células CD45+ nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI

induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................................................... 50

Figura 13 - Caracterização da população de monócitos nos rins dos camundongos C57BL/6

com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................................... 51

Figura 14 - Frequência da população CD45+ F4/80high

CD11bhigh

CD86+ nos rins dos



CD11bhigh

CD206+ nos rins dos


Figura 16 - Expressão gênica das citocinas IL-6, TNF-α e TGF-β nos rins dos camundongos

C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................... 52

Figura 17 - Frequência das populações CD45+ CD4+ e CD45+ CD8+ nos rins dos


Figura 18 - Frequência da população CD45+ CD11c MHCII nos rins dos camundongos

C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................... 54

Figura 19 - Avaliação da transição epitélio-mesenquimal, através da expressão de αSMA, nos

rins dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina. ........................................... 55

Figura 20 - Expressão de colágeno nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida

por adenina, e tratados com metformina. ................................................................................. 56

Figura 21 - Expressão de pAMPK em tecido renal de camundongos C57BL/6 com NTI

induzida por adenina, e tratados com metformina. ................................................................... 57

Figura 22 - Gravidade clínica da NTI em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox. ............. 57

Figura 23 - Caracterização dos M de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI. ....... 58

Figura 24 - Frequência da população CD45+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre

AMPKflox/flox

com NTI. ............................................................................................................. 59

Figura 25 - Distribuição das células CD45+ F4/80 CD11b no tecido renal de camundongos

LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI. ............................................................................................ 59

Figura 26 - Frequência da população CD45+ F4/80low

CD11bhigh

Ly6C+ no tecido renal de

camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI...................................................................... 60


CD11bhigh

CD86+ no tecido renal de


com NTI...................................................................... 60


CD11bhigh

CD206+ no tecido renal de


com NTI...................................................................... 61

Figura 29 - Fibrose renal em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI. ..................... 62

Figura 30 - Histologia dos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI. ............. 63

Figura 31 - Coloração imunoistoquímica para CD11b nos rins de camundongos LyzM-cre

AMPKflox/flox

com NTI. ............................................................................................................ 64

Figura 32 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK-/-

tratados com

metformina. .............................................................................................................................. 65

Figura 33 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK+/+

tratados com

metformina. .............................................................................................................................. 65


com NTI tratados

com metformina. ....................................................................................................................... 66

Figura 35 - Frequência das populações CD45+ F4/80high

CD11bhigh

CD86+ e CD45+ F4/80high

CD11bhigh

CD206+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI

tratados com metformina. ......................................................................................................... 67

Figura 36 - Expressão de αSMA nos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI

tratados com metformina. ......................................................................................................... 68

Figura 37 - Marcadores de função e lesão renal nos camundongos C57BL/6 tratados com

metformina e/ou clodronato...................................................................................................... 69

Figura 38 - Variação do peso dos camundongos C57BL/6 tratados com metformina e/ou

clodronato. ................................................................................................................................ 69

Figura 39 - Expressão gênica de IL-6 e TNF-α no tecido renal de camundongos C57BL/6

tratados com metformina e/ou clodronato. ............................................................................... 70

Figura 40 - Expressão proteica de αSMA em tecido renal de camundongos C57BL/6 tratados

com metformina ou clodronato................................................................................................. 70

Figura 41 - Parâmetros clínicos dos camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

com NTI. ............. 71

Figura 42 - Estratégia de gating nas células do parênquima renal de camundongos CD4-cre

AMPKflox/flox

. ............................................................................................................................ 71

Figura 43 - Caracterização dos LT CD4+ infiltrando o parênquima renal de camundongos

CD4-cre AMPKflox/flox

. ............................................................................................................. 72

Figura 44 - Estratégia de gating nas células do linfonodo renal de camundongos CD4-cre

AMPKflox/flox

. ............................................................................................................................ 72

Figura 45 - Frequência da população de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos CD4-

cre AMPKflox/flox

. ...................................................................................................................... 73

Figura 46 - Ativação de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

.

.................................................................................................................................................. 73

Figura 47 - Caracterização da expressão de IFN-γ por linfócitos T CD4 no linfonodo renal de

camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

. ...................................................................................... 74

Figura 48 - Ensaio de viabilidade das CTERM cultivadas na presença de metformina 20 mM

ou de composto C 10 μM por 24h. ........................................................................................... 74

Figura 49 - Expressão de AMPK fosforilado nas CTERM após estímulo com metformina 20

mM. .......................................................................................................................................... 75

Figura 50 - Expressão de αSMA por CTERM submetidas à TEM e tratadas com Met 20 mM

e/ou CompC 10 μM. ................................................................................................................. 75

Figura 51 - Concentração de glicose e lactato no sobrenadante das CTERM cultivadas com

Met 20 mM ou CompC 10 μM. ................................................................................................ 76

Figura 52 - Captação de 2-nbdg pelas CTERM cultivadas com Met 20 mM ou CompC 10 μM.

.................................................................................................................................................. 76

Figura 53 - Expressão do transportador de glicose Glut2 nas células tubulares renais tratadas

com Met 20 mM ou CompC 10 μM. ........................................................................................ 77

Figura 54 - Esquema representativo do mecanismo de ação da metformina na nefrite

tubulointersticial induzida por adenina em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

................. 90

Figura 55 - Sumário gráfico...................................................................................................... 91

LISTA DE SIGLAS

Ad Adenina

AMPK Quinase ativada por adenosina monofosfato

AU Ácido úrico

CD Cluster de diferenciação

cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar

CEL Clodronato encapsulado por lipossoma

Clo Clodronato

CompC Composto C

Cr Creatinina

CTERM Células tubulares epiteliais renais murinas

Ctrl Controle

DNA Ácido desoxirribonucleico

DRC Doença renal crônica

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

Glut Transportador de glicose

IHQ Imunoistoquímica

IL Interleucina

IP Intraperitoneal

KIM-1 Kidney injury molecule 1

LB Lipossomas brancos

LT Linfócitos T

MØ Macrófago

MEC Matriz extracelular

Met Metformina

MHC Complexo principal de histocompatibilidade

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

NK-ƙB Fator nuclear kappa B

NTI Nefrite tubulointersticial

pAMPK Quinase ativada por adenosina monofosfato, molécula fosforilada

RC Ração convencional

REA Ração enriquecida com adenina

RNA Ácido ribonucleico

RT-PCR Reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa

αSMA Actina alfa do músculo liso

TEM Transição epitélio-mesenquimal

TGF-β Fator transformador do crescimento beta

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

Ur Ureia

WB Western blotting

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................19

1.1 A doença – considerações clínico-epidemiológicas .................................................20

1.2 A molécula – considerações químico-estruturais e funcionalidades no sistema imune

.........................................................................................................................................21

1.3 O agonista – considerações mecanísticas e terapêuticas ..........................................23

1.4 As células – considerações fisiopatológicas .............................................................24

1.5 O modelo – considerações fisio e histopatológicas ..................................................26

1.6 Justificativa................................................................................................................27

2 OBJETIVOS..........................................................................................................................28

2.1 Objetivo Geral...........................................................................................................29

2.2 Objetivos Específicos................................................................................................29

3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................30

3.1 Experimentos in vivo....................................................................................................31

3.1.1 Modelo de NTI em camundongos selvagens tratados com metformina................31

3.1.2 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em

macrófagos.......................................................................................................................32

3.1.3 Modelo de NTI em camundongos selvagens depletados de macrófagos...............34

3.1.4 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em linfócitos T

CD4..................................................................................................................................35

3.1.5 Avaliação da função renal através da quantificação de creatinina e ureia no soro.36

3.1.6 Avaliação histológica do tecido renal.....................................................................37

3.1.7 Avaliação de expressão proteica em tecido renal por RT-PCR.............................39

3.1.8 Avaliação de expressão proteica em tecido renal por western blotting..................40

3.1.9 Análise do infiltrado inflamatório e ativação celular no rim por citometria de fluxo

.........................................................................................................................................40

3.2 Experimento in vitro....................................................................................................41

3.2.1 Cultura de células tubulares renais.........................................................................41

3.2.2 Ensaio de viabilidade celular..................................................................................41

3.2.3 Avaliação da indução de AMPK por metformina..................................................42

3.2.4 Avaliação da influência da AMPK sobre a captação de glicose............................42

3.2.5 Avaliação da influência da AMPK sobre a transição epitélio-mesênquima..........43

3.2.6 Avaliação da via glicolítica pela dosagem de glicose e lactato .............................44

3.3 Processamento de dados e análise estatística...............................................................44

4 RESULTADOS......................................................................................................................45

4.1 A metformina protege camundongos selvagens da NTI induzida por adenina ..........46

4.1.1 Parâmetros clínico-laboratoriais ............................................................................46

4.1.2 Parâmetros histomorfológicos................................................................................48

4,1.3 Infiltrado inflamatório ...........................................................................................50

4,1.4 Análise de marcadores de fibrose...........................................................................54

4.2 O efeito da metformina sobre a polarização dos macrófagos é dependente de

AMPK................................................................................................................................58

4.3 A metformina atua, também via AMPK, nas células tubulares renais........................67

5 DISCUSSÃO.........................................................................................................................79

6 CONCLUSÃO.......................................................................................................................88

REFERÊNCIAS .......................................................................................................................93

1 INTRODUÇÃO

20

1.1 A doença – considerações clínico-epidemiológicas

Definida como uma anormalidade funcional ou estrutural do rim que persiste por mais

de três meses, com implicações para a saúde do indivíduo, a doença renal crônica (DRC) vem,

de forma crescente, angariando atenção das comunidades médica e acadêmica ao se

estabelecer como um problema de saúde pública [2].

Estima-se que entre 11 e 13% da população mundial apresente DRC. Esta cifra é

particularmente alarmante ao se constatar que pode representar uma subestimativa, sendo o

diagnóstico feito comumente de forma tardia, uma vez que os pacientes não costumam

apresentar queixas a não ser em estágios avançados, quando a terapia renal substitutiva já se

torna imperativa como pilar da proposta terapêutica [3].

Associada ao fato de ser uma condição indolente e assintomática em seus estágios

iniciais, outra razão para o subdiagnóstico da perda da capacidade de filtração dos rins é a

falta de uma sistematização visando a seu rastreamento. De fato, como ocorre com outras

doenças crônico-degenerativas com que ela compartilha fatores de risco, tais como

hipertensão arterial sistêmica e diabetes mellitus, a DRC entra no rol de doenças preveníveis.

Assim, na atualidade, a investigação ativa de seus fatores causais, aliada à intervenção

precoce, é a principal estratégia de que se dispõe para tentar reduzir sua prevalência [4].

Apesar de se ter conhecimento de uma abordagem custo-efetiva para conter seu

alastramento, opções terapêuticas para os mais de 200 milhões de pacientes que já convivem

com a doença são escassas, de modo que, anualmente, cerca de 850 mil indivíduos vão a óbito

pela DRC, que assim se configura como a 12ª causa de mortalidade no mundo [5-7].

Sabe-se que, a despeito de qual seja a causa subjacente à deterioração da função renal,

a fisiopatologia da DRC envolve um estado persistente de inflamação local e sistêmica que

resulta na perda do parênquima renal, que gradativamente vai sendo substituído por fibrose.

Logo, a identificação de alvos celulares e moleculares que permitam a interrupção de uma

cascata inflamatória que tende a se amplificar e se retro-alimentar, levando à inexorável perda

da função e à desestruturação anatômica dos rins, representa o cerne das pesquisas atuais que

buscam sobrepujar o problema [8-9].

Contudo, a elaboração de novos compostos que possam vir a se tornar drogas no

combate à progressão da DRC é um processo lento, longo e laborioso, sendo premente o

surgimento de alternativas que possam, ao menos a médio prazo, constar como opção

terapêutica viável e acessível [10].

21

Nesse contexto, o entendimento das mudanças metabólicas que ocorrem nas células do

sistema imune, as principais responsáveis pelos danos estruturais que se estabelecem durante

a progressão da doença, representou um avanço na busca de possíveis soluções terapêuticas

para a DRC. Diante da perspectiva de modulação de vias imunometabólicas, uma molécula

em especial tem despertado o interesse da comunidade científica por já ter um modulador

largamente utilizado na prática clínica – essa molécula é a quinase ativada por adenosina

monofosfato (AMPK), e seu modulador de emprego corrente é a metformina (Met) [11].

1.2 A molécula – considerações químico-estruturais e funcionalidades no sistema imune

A AMPK é um heterotrímero composto por três subunidades, α, β e γ, pertencente à

família das serina/treonina quinases. Expressa em todos os organismos eucarióticos, trata-se

de uma quinase conservada evolutivamente com função de sensor energético, capacitando a

célula a responder a desafios energéticos. A exposição a ambientes pobres em glicose ou o

aumento da concentração intracelular de AMP desencadeiam a fosforilação da treonina 172

da subunidade α, com função catalítica, estimulando, portanto, a ativação da quinase [12,13].

Várias são as vias metabólicas que convergem para ou interagem com a AMPK.

Enquanto algumas têm o propósito de transmitir estímulos tróficos vindos do extracelular,

mediando a comunicação entre a célula e o meio em que ela se insere (a exemplo dos

receptores hormonais de adiponectina e leptina), outras sinalizam para alterações no próprio

intracelular (como a disfunção mitocondrial causando a elevação da razão AMP/ADP, um

forte gatilho para deflagrar a ação da AMPK) [14].

Muito ainda se desconhece sobre quais sejam as moléculas intermediárias entre a

AMPK e os receptores localizados na membrana celular; sabe-se, porém, que as três

principais quinases envolvidas na fosforilação da treonina 172 são a quinase dependente de

cálcio-calmodulina (CAMKKβ), a quinase hepática B1 (LKB1), e a quinase ativada pelo fator

transformador do crescimento β (TAK1) [15].

Tem-se demonstrado que variadas situações fisiológicas e patológicas são capazes de

deflagrar a ativação da AMPK, por exemplo, a contração muscular, a hipóxia, a inflamação e

a sepse [13]. Todas essas situações convergem quanto ao fato de representarem um stress

metabólico, requisitando da célula um alto consumo energético.

A AMPK concorre para o estabelecimento de um balanço energético favorável agindo

em duas frentes: ao regular positivamente as vias catabólicas que produzem trifosfato de

adenosina (ATP), e negativamente as vias anabólicas que consomem ATP [16]. Desta forma,

22

em condições de escassez de glicose, a AMPK atua tanto na redução do gasto energético,

suprimindo a tradução de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm) de citocinas, quanto na

ativação de vias metabólicas alternativas, como o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, que utiliza

o aminoácido não essencial glutamina como substrato básico [17,18].

Figura 1 - Modelo da via de sinalização da AMPK.

A AMPK age em concerto com outras quinases no sentido de promover redução do consumo e aumento da

produção de energia pela célula. Para tal, ela reprime enzimas envolvidas em vias anabólicas, seja através da

inibição de sua transcrição, ao interagir com a proteína de ligação do elemento regulador de esterol (SREBP1c),

seja através da fosforilação de enzimas relacionadas à etapa limitante de reações, tais como a hidróxi-metil-

glutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase) e a acetil-CoA carboxilase (ACC), que controlam a síntese de

lipídios e ácidos graxos. Além de seus efeitos negativos sobre a lipidogênese, a AMPK também suprime a

síntese proteica ao inibir direta e indiretamente (via ativação do complexo da esclerose tuberosa - TSC) o

complexo do alvo molecular da rapamicina (mTOR). Paralelamente, a AMPK eleva a síntese de trifosfato de

adenosina (ATP) ao estimular a glicólise e o ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs). Fonte: Zadra et al.

(2010) [19].

O estudo in vivo realizado por Blagih et al. (2015) demonstrou que linfócitos T (LT)

nos quais se induziu deficiência da isoforma AMPKα1 apresentam maior apoptose quando

submetidos a ambientes adversos em termos de oferta nutricional [12]. Tais ambientes, apesar

de elaborados artificialmente no estudo em questão, são, em verdade, a realidade com a qual

os LT devem confrontar durante sua transição de naïve, quando habitam órgãos linfoides em

23

condições otimizadas de oferta nutricional, para efetores, quando passam a ocupar sítios em

que a competição por nutrientes, oxigênio e fatores de crescimento é a regra, conforme

sugeriu estudo de Pearce et al. (2013) [20].

Além de atuar como moduladora do metabolismo celular no processo de diferenciação

dos LT, a AMPK também exerce papel central na mudança do padrão de comportamento dos

macrófagos. Seu envolvimento na polarização dos macrófagos do fenótipo de M1 para M2, já

foi demonstrado em diversos estudos. Isso porque ela parece ser particularmente relevante

para as células cuja principal fonte energética advém da oxidação dos ácidos graxos, como é o

caso dos macrófagos M2 [21,22].

Ao promover a biogênese mitocondrial, através da estimulação do coativador do

receptor ativado pela proliferação de peroxissomos γ (PPARγ), e ao elevar captação de ácidos

graxos pela mitocôndria, através da estimulação da carnitina palmitoiltransferase 1α (Cpt1α),

a AMPK maximiza a síntese de citocinas antiinflamatórias pelos macrófagos M2, como a IL-

10 [23]. Não apenas isso: a AMPK também está inserida em várias vias de sinalização

implicadas na regulação negativa da inflamação, agindo, por exemplo, através da inibição do

fator nuclear kappa B (NF-ƙB) e da ativação da serina/treonina quinase AKT [24].

1.3 O agonista – considerações mecanísticas e terapêuticas

A modulação positiva da AMPK em uma série de modelos experimentais de lesão

renal tanto aguda quanto crônica abre uma perspectiva de interferir na sua via de sinalização

para reduzir a progressão e a severidade de diversas nefropatias. Essa perspectiva é

particularmente promissora uma vez que se dispõe de uma droga amplamente comercializada,

e de segurança comprovada em seres humanos, que tem como mecanismo de ação a

estimulação da fosforilação da AMPK – trata-se da Met, atualmente indicada para controle

glicêmico no diabetes tipo II [25,26].

Por extensão, dispõe-se de inúmeras publicações acerca dos benefícios da Met na

nefropatia diabética, os quais foram recentemente sumarizados em uma revisão de Ravindran

et al. (2016), mas o seu potencial de aplicabilidade terapêutico é muito mais amplo. Isso

porque todos os insultos renais, independentemente de sua natureza, tendem a evoluir para o

estabelecimento de fibrose tecidual [27].

Em um estudo de Lu et al. (2015), evidenciou-se que a Met é capaz de inibir a

produção de colágeno mediada pelo fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) em

24

fibroblastos renais, de modo que ela agiria, dessa forma, interrompendo a via final comum a

diversos mecanismos de injúria renal [28].

Corroborando as evidências in vitro, Cavaglieri et al. (2015) demonstraram em um

modelo de obstrução ureteral unilateral que camundongos tratados apresentam menor

infiltrado inflamatório no rim obstruído, além de menor expressão de citocinas inflamatórias e

marcadores de fibrose [29].

1.4 As células – considerações fisiopatológicas

Os macrófagos representam uma das populações celulares mais comumente

identificadas em espécimes oriundos de tecido renal que sofreu agressão, seja ela imuno-

mediada ou não. Tem-se atribuído a eles tanto efeitos patogênicos, ao propiciar, em seu

fenótipo M1, um ambiente pró-inflamatório nas fases iniciais da doença renal, e ao estimular,

em seu fenótipo M2, a fibrogênese em fases mais tardias, quanto efeitos benéficos, ao

promover o clareamento de imunocomplexos e estimular a reparação do tecido lesado [30].

Apesar dessa abrangência de ações que poderiam, a princípio, serem caracterizadas

como díspares, sabe-se que a interação dos macrófagos com as células glomerulares e

tubulares epiteliais renais é mediada por citocinas e fatores de crescimento responsáveis por

regular os efeitos dos macrófagos na DRC, podendo estes, na dependência daqueles, assumir

um papel positivo ou negativo sobre o processo lesão-reparação [31].

De modo que, irrespectivamente da natureza inicial do insulto, ao sistema imune é

atribuído o papel central em manter ou sustar a injúria tecidual, estando claro que a

predominância de uma subpopulação de macrófagos, M1 ou M2, tem implicações decisivas

sobre a evolução da lesão renal [30,31].

Isto abre possíveis janelas de oportunidades terapêuticas quanto à interferência nesta

transição entre os polos M1 e M2, impedindo que a subpopulação implicada no ciclo

repetitivo inflamação-fibrose perpetue o processo. Na DRC, ao mesmo tempo em que o

fenótipo M2 está envolvido na regeneração da membrana tubular basal e na secreção de

fatores antiinflamatórios, também a ele se imputa o recrutamento de miofibroblastos e o

estímulo à síntese de colágeno. Assim, o próprio controle fino dos papéis exercidos por um

mesmo fenótipo é campo a ser desbravado no interesse de se encontrar novos alvos

terapêuticos [32].

Em contrapartida, a presença de LT CD4+ no infiltrado celular de um rim

cronicamente lesado se relaciona com a diminuição da função renal e com a extensão da

25

fibrose. A fibrose intersticial e atrofia tubular são similarmente achados não específicos

compatíveis com uma multiplicidade de causas, incluindo lesão renal isquêmica, hipertensão e

toxicidade crônica por medicamentos [33].

A fibrose intersticial é caracterizada por um acúmulo de tecido conjuntivo, que inclui

colágenos tipo I e III, fibronectina e vários proteoglicanos, levando a uma desorganização na

arquitetura do rim [34]. O seu aparecimento é uma sequela de inflamação ou lesão, durante as

quais fatores humorais são liberados por células infiltrantes ou residentes, que estimulam o

parênquima renal a aumentar a produção de componentes da matriz extracelular, como o

colágeno, sendo a intensidade de fibrose intersticial o processo mais fortemente relacionado

com a deterioração da função do enxerto renal no pós-transplante [35]. Especificamente na

rejeição crônica do enxerto mediada por células, ocorre ativação de LT, fibrose intersticial e

atrofia tubular, sem evidência de alguma etiologia específica [36].

Figura 2 - Representação esquemática dos mecanismos celulares envolvidos na

progressão da doença renal crônica.

Independentemente do fator causal da lesão, o processo que leva à cronificação da doença renal envolve uma

interação viciosa entre as células do sistema imune e as células tubulares epiteliais: macrófagos e linfócitos T

secretam citocinas pró-inflamatórias que, por sua vez, mantêm o influxo constante de células infiltrantes no

tecido, amplificando o sinal; ao mesmo tempo, fatores de crescimento, a exemplo do fator transformador do

crescimento beta (TGF-β), são liberados e induzem transição epitélio-mesenquimal, convertendo pericitos e

miofibroblastos produtores de matriz extracelular (ECM), o que agrava ainda mais a destruição da arquitetura

tubular, que acaba por ser substituída por fibrose. Fonte: Lee et al (2017) [37].

Os LT CD4+ sintetizam e secretam fator transformador do crescimento beta (TGF-β),

molécula com importante função fibrogênica. O TGF-β estimula a produção de moléculas

como colágeno e fibronectina pelos fibroblastos. Estudos mostraram que, durante a DRC em

26

camundongos, há uma massiva infiltração de LT CD4+ e secreção de citocinas tais como

IFN-γ e IL-1β [38].

Ainda, a transferência para camundongos saudáveis de LT CD4+ provenientes de

camundongos submetidos à isquemia e reperfusão renal em uma fase tardia, com significante

presença de fibrose e inflamação, rapidamente induziu aumento de albuminúria nos receptores

[39]. Esses dados indicam que uma alteração no metabolismo dessas células é capaz de

induzir alterações significativas nas funções renais.

1.5 O modelo – considerações fisio e histopatológicas

Em mamíferos, a adenina (Ad) é um produto endógeno da via da poliamina e é

captada pela adenina-fosforibosiltransferase (APRT). Quando a APRT funcional está ausente,

a Ad passa a ser um substrato significante para a xantina-desidrogenase (XDH), que a oxida

em 2,8-diidroxiadenina (DHA) [40].

Como a 2,8-DHA é extremamente insolúvel, sua excreção pelo rim pode levar à

formação de cálculos urinários. Os cristais de 2,8-DHA exercem efeitos tóxicos diretos nas

células tubulares e intersticiais renais, eventualmente levando à falência renal de estágio final

[41,42].

Os mecanismos envolvidos na toxicidade tubular não são bem compreendidos.

Estudos experimentais com camundongos deficientes de APRT apresentam nefrolitíase com

extensa dilatação tubular, inflamação, necrose e fibrose [43]. Além disso, a Ad é uma base

purínica, sendo, portanto, precursora do ácido úrico (AU) na via da xantina oxidase. O AU,

por seu turno, é reconhecidamente um importante deflagrador de estresse oxidativo, podendo,

por si só, resultar em DRC [44].

Do ponto de vista histopatológico, secções de tecido renal de ratos ou camundongos

com lesão renal mediada por Ad revelam predominantemente uma desestruturação da

arquitetura tubular, sendo o glomérulo relativamente poupado. Assim, o uso de ração

enriquecida com Ad para induzir DRC experimental constitui um interessante modelo de

nefrite tubulointersticial (NTI) crônica [45].

A NTI, em humanos, é definida microscopicamente por fibrose intersticial e atrofia

tubular com variado infiltrado inflamatório de linfócitos, macrófagos e outras células, desde

que a lesão intersticial esteja fora de proporção para qualquer doença glomerular. Fibrose

periglomerular é comum e algumas obsolescências glomerulares podem ser encontradas nas

áreas afetadas [46].

27

1.6 Justificativa

O acúmulo de evidências sobre a importância do papel da AMPK no metabolismo

celular, cuja função não é restrita ao equilíbrio energético, mas também se relaciona à

resposta inflamatória e à fibrose tecidual, vem estimulando o estudo desta molécula como

alvo terapêutico potencial em uma série de doenças [47,48].

Por sua vez, a Met, um agonista reconhecido da AMPK, é capaz de reduzir a

expressão de TGF-β em fibroblastos renais de camundongos, o que, por sua vez, resulta em

menor produção de colágeno por essas células [28,49].

A relevância de tal constatação é significante uma vez que se sabe que a fibrose e a

produção desregulada de colágeno constituem o ponto crucial no remodelamento tecidual

verificado na DRC. A possibilidade de se intervir sobre essa etapa do processo patológico,

para o qual no momento não se dispõe ainda de uma droga modificadora da história natural da

doença, abre um campo de oportunidades para o desenvolvimento de fármacos voltados para

a modulação do AMPK e de outros componentes que com ele interagem na cascata [50].

Isso nos motivou a elaborar o presente estudo, que visa avaliar os efeitos da AMPK

sobre o curso da DRC, presumindo-se que sua ativação module os dois principais tipos

celulares presumivelmente envolvidos na lesão, os macrófagos e linfócitos T CD4+, a

apresentar um fenótipo menos pró-inflamatório.

2 OBJETIVOS

29

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o papel exercido pela ativação da AMPK em macrófagos, LT CD4+ e células

tubulares renais, sobre os mecanismos de lesão renal crônica.

2.2 Objetivos Específicos

Inicialmente, valendo-se de um modelo de NTI em animais selvagens, intencionamos avaliar

o efeito da ativação de AMPK através da administração de Met sobre:

(i) os parâmetros funcionais e morfológicos da lesão;

(ii) o perfil inflamatório das células infiltrantes;

(iii) os marcadores de fibrose renal no tecido renal; e

(iv) as principais vias moleculares envolvidas.

Uma vez tendo demonstrado que a via da AMPK está envolvida no desenvolvimento da NTI

experimental, e que a ativação dessa quinase tem impacto positivo sobre a disfunção renal,

objetivamos estudar em qual população celular a ativação da AMPK é mais relevante para

impedir a progressão da doença. Tendo por base o mesmo modelo de NTI, intencionamos:

(v) Observar o efeito de sua deleção seletiva em macrófagos ou LT CD4+ sobre o

desenvolvimento de lesão renal crônica; e

(vi) Analisar o efeito da deleção seletiva no perfil inflamatório induzido pela NTI.

Ainda, buscando identificar se a ativação da AMPK é relevante para as células tubulares

renais se tornarem resistentes ao processo de fibrogênese de que são alvo, intencionamos:

(vii) Induzir transição epitélio-mesênquima em uma cultura de células tubulares

renais, e averiguar qual o efeito da adição de Met ao meio; e

(viii) Avaliar quais as alterações metabólicas proporcionadas pela Met nessas células.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

31

3.1 Experimentos in vivo

Os experimentos abaixo descritos receberam o aval da Comissão de Ética em Uso

Animal (CEUA) do ICB em 16 de março de 2016, sob o número de protocolo 10/2016, com

posterior adendo em 30 de novembro de 2016, sob a forma da Declaração 128/2016.

3.1.1 Modelo de NTI em camundongos selvagens tratados com metformina

O modelo adotado consistiu em provocar NTI em camundongos selvagens através do

acesso livre e irrestrito (ad libitum) a uma dieta consistindo de ração suplementada com

0,25% de adenina (Rhoster Indústria e Comércio Ltda, Araçoiaba da Serra, São Paulo, Brasil).

Os animais foram mantidos em microisoladores contendo até cinco camundongos por gaiola,

à temperatura ambiente constante de 22 oC, com ciclos artificiais de claro-escuro de 12 horas.

No primeiro experimento, ao todo 20 camundongos C57BL/6, machos, datando entre

seis e oito semanas, e pesando entre 20 e 25 g, foram alocados aleatoriamente em um entre

quatro grupos: (1) grupo controle (Ctrl), tendo por alimentação uma ração convencional (RC),

e sendo gavado com PBS; (2) grupo metformina (Met), tendo por alimentação RC, e sendo

gavado com metformina; (3) grupo adenina (Ad), tendo por alimentação a ração enriquecida

com adenina (REA), e sendo gavado com PBS; e (4) grupo adenina mais metformina

(Ad+Met), tendo por alimentação REA, e sendo gavado com metformina.

Os camundongos receberam Met (Medley, Campinas, São Paulo, Brasil), na dose de

200 mg/kg/dia. A preparação da Met se deu da seguinte forma: um comprimido de 850 mg foi

triturado e diluído em 21,25 mL de PBS, de modo que a solução contivesse a droga na dose

de 40 mg/mL. A solução foi então armazenada em geladeira, a 4 oC. O dia zero do

experimento foi considerado como aquele em que se iniciaram a alimentação com REA e o

procedimento da gavagem. Os camundongos, bem como a ração consumida, foram pesados

diariamente no começo da manhã. O dia do sacrifício foi estabelecido como aquele

subsequente à décima dose de Met.

Ao fim do experimento, os animais foram anestesiados com Quetamina-Xilazina e

eutanasiados por exsanguinação. O sangue foi coletado por punção cardíaca para subsequente

dosagem de ureia e creatinina séricas. Os rins foram removidos, descapsulados e pesados. O

peso do rim foi normalizado pelo peso corporal total dos camundongos no dia zero do

experimento para permitir a comparação entre os grupos.

32


metformina.

Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais

metformina, Ur – ureia, Cr – creatinina. Fonte: autoria própria.

Parte do tecido renal foi criopreservada em nitrogênio líquido para realização posterior

de western blotting (WB) e reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa (RT-PCR).

Outra parte foi mantida em solução de colagenase IV a 2% em PBS como parte do preparo

para execução da citometria de fluxo. A parte remanescente foi conservada em formaldeído

4% para preparação de cortes histológicos. O experimento foi repetido mais duas vezes para

confirmar a consistência e a reprodutibilidade dos resultados (Figura 3).

3.1.2 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em macrófagos

Para se obter camundongos em que a AMPK estivesse condicionalmente ausente em

macrófagos, procedeu-se ao cruzamento de animais contendo a sequência Cre, que codifica

para uma enzima DNA recombinase, sob o controle do promotor do gene lisosima M (LyzM),

expresso predominantemente em monócitos e macrófagos, com animais contendo o gene

Prkaa1, que codifica a AMPK, ladeado pela sequência flox, que é reconhecida por Cre como a

parte a ser excisada.

Ao se valer da técnica cre-lox, não se tem o inconveniente potencial apresentado por

agonistas ou antagonistas farmacológicos, cuja dose administrada pode não ser a adequada

33

para ativar ou inibir a molécula na célula alvo, ou que podem ainda estar exercendo efeito off-

target.

Os animais foram cruzados até atingirem homozigosidade em ambos os genes, a qual

foi comprovada através de genotipagem usando o protocolo recomendado pela The Jackson

Laboratory (JAX, Bar Harbor, ME, USA). Os genes mutados foram amplificados usando a

seguinte sequência de primers recomendada pela JAX: LyzM – mutante: 5’ CCC AGA AAT

GCC AGA TTA CG 3’, selvagem: 5’ TTA CAG TCG GCC AGG CTG AC 3’, comum: 5’

CTT GGG CTG CCA GAA TTT CTC 3’; Prkaa – forward: 5’ CCC ACC ATC ACT CCA

TCT CT 3’, reverse: 5’ AGC CTG CTT GGC ACA CTT AT 3’ (Figura 4).

Figura 4 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para LyzM.

Em (A), reação para o gene LyzM mutante (peso molecular: 700 kDa), isto é, acrescido da sequência que

codifica para a enzima cre. Em (B), reação para o gene LyzM selvagem (peso molecular: 350 kDa), isto é,

desprovido da sequência cre. B – branco, CP – controle positivo, CN – controle negativo. Fonte: autoria própria.

Em um primeiro experimento, visando comparar a gravidade da NTI induzida por Ad

entre os camundongos AMPK+/+

e AMPK-/-

, os animais, com idade entre 8 e 10 semanas,

foram distribuídos em quatro grupos: Ctrl AMPK+/+

(N=4, 4♀), Ad AMPK+/+

(N=11, 8♀,

3♂), Ctrl AMPK-/-

(N=8, 8♀), Ad AMPK-/-

(N=13, 10♀, 2♂).

Em um segundo experimento, visando comprovar que o efeito benéfico da Met é

exercido por ativação da AMPK, os animais, com idade entre 8 e 10 semanas, foram

distribuídos em seis grupos: Ctrl AMPK-/-

(N=11, 3♂ e 8♀), Ad AMPK-/-

(N=20, 15♂ e 5♀),

Ad+Met AMPK-/-

(N=18, 14♂ e 4♀), Ctrl AMPK+/+

(N=8, 8♀), Ad AMPK+/+

(N=6, 4♂ e

2♀), e Ad+Met AMPK+/+

(N=5, 4♂ e 1♀). O desenho experimental seguiu o mesmo molde

daquele dos camundongos C57BL/6, já detalhado no subitem 1.1.

A B

34

3.1.3 Modelo de NTI em camundongos selvagens depletados de macrófagos

A administração intraperitoneal (IP) de clodronato encapsulado por lipossoma (CEL) é

uma técnica reconhecidamente eficaz para depletar macrófagos: estes engolfam as vesículas,

as quais promovem a morte dos fagócitos por apoptose [51]. Visou-se observar se o efeito do

CEL sobre a progressão da NTI induzida por adenina era comparável à administração de Met.


clodronato e/ou metformina.

As seringas representam os dias em que foi administrado clodronato encapsulado por lipossoma (CEL) ou

lipossoma branco (LB), por via intraperitoneal (IP), nos camundongos. A metformina, ou seu veículo, o PBS, foi

administrada diariamente, na dose de 200 mg/kg, através de gavagem, até o 7o dia do experimento. No 8

o dia,

procedeu-se ao sacrifício, representado pela cruz. Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo

adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina,

metformina e clodronato. Fonte: autoria própria.

Com esse intuito, produziu-se, em colaboração com a Profa. Dra. Katia Regina Perez,

da Universidade Federal de São Paulo, e a Profa. Dra. Iolanda Midea Cuccovia, do Instituto

de Química da Universidade de São Paulo, vesículas lipossomais contendo clodronato,

seguindo o protocolo tradicionalmente descrito na literatura [52]. Para descartar qualquer

35

influência que os lipossomas pudessem ter sobre os macrófagos, produziram-se também

lipossomas brancos (LB), i.e., sem a droga, para serem administrados ao grupo controle.

Estabeleceu-se um esquema de administração em quatro doses de 50 mg/kg: a

primeira, aplicada dois dias antes de se introduzir a REA, e as outras três, em intervalos de

três dias (Figura 5).

De forma que se trabalhou, nesse segundo momento, com cinco grupos experimentais,

cada qual com cinco camundongos C57BL/6 machos, datando oito semanas, e pesando entre

20 e 25 g: (1) grupo controle (Ctrl), alimentado com RC, gavado diariamente com PBS, e

recebendo LB por via IP, (2) grupo adenina (Ad), alimentado com REA, gavado diariamente

com PBS, e recebendo LB por via IP, (3) grupo adenina mais metformina (Ad+Met),

alimentado com REA, gavado diariamente com metformina, e recebendo LB por via IP, (4)

grupo adenina mais clodronato (Ad+Clo), alimentado com REA, gavado diariamente com

PBS, e recebendo CEL por via IP, e (5) grupo adenina mais metformina e clodronato

(Ad+Met+Clo), alimentado com REA, gavado diariamente com metformina, e recebendo

CEL por via IP.

No dia do sacrifício, os animais foram anestesiados com Quetamina-Xilazina e

eutanasiados por exsanguinação. Foram coletados sangue para dosagem de ureia e creatinina

séricas, e tecido renal para realização posterior de WB e RT-PCR.

3.1.4 Modelo de NTI em camundongos com deleção seletiva de AMPK em linfócitos T CD4

Para se trabalhar com camundongos em que a AMPK estivesse deletada

especificamente nos linfócitos T CD4, procedeu-se ao cruzamento de animais contendo a

sequência Cre sob o controle do promotor do gene do cluster de diferenciação 4 (CD4), com

animais contendo o gene Prkaa1 ladeado pela sequência flox.

Os cruzamentos foram efetuados até se conseguir homozigosidade. Os animais foram

genotipados conforme protocolo recomendado pela The Jackson Laboratory (JAX, Bar

Harbor, ME, USA). Os genes mutados foram amplificados usando a seguinte sequência de

primers recomendada pela JAX: cre genérico – forward: 5’ GCG GTC TGG CAG TAA AAA

CTA TC 3’, reverse: 5’ GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT 3’; Prkaa – forward: 5’

CCC ACC ATC ACT CCA TCT CT 3’, reverse: 5’ AGC CTG CTT GGC ACA CTT AT 3’

(Figura 6).

Desenvolveu-se um experimento com vinte e três camundongos CD4-cre

AMPKflox/flox

, dez machos e treze fêmeas, datando de oito semanas, e pesando entre 20 e 25g.

36

Distribuíram-se os animais em dois grupos, um recebendo REA (grupo Ad, N=14, dos quais 6

AMPK-/-

e 8 AMPK+/+

), e outro, RC (grupo Ctrl, N=9, dos quais quais 6 AMPK-/-

e 3

AMPK+/+

).

Figura 6 - Gel de agarose representativo de uma reação de genotipagem para Prkaa.

O gene mutante tem peso molecular de 450 kDa, enquanto o selvagem, de 334kDa. B – branco, Mut – controle

para o gene mutado, WT – controle para o gene selvagem. Fonte: autoria própria.

O experimento teve duração de dez dias, sendo marcado como dia zero aquele em que

se iniciou a alimentação com REA. Os camundongos tiveram seu peso aferido em dias

alternados. No décimo dia, os animais foram anestesiados com quetamina-xilazina e

eutanasiados por exsanguinação. Foram coletados sangue para dosagem de ureia e creatinina

séricas, e linfonodos renais para citometria de fluxo.

3.1.5 Avaliação da função renal através da quantificação de creatinina e ureia no soro

As dosagens de ureia e creatinina séricas foram efetuadas por método colorimétrico

(Labtest, São Paulo, Brasil), seguindo protocolo fornecido pelo fabricante. O sangue dos

camundongos foi centrifugado por 10 min a 10 mil rpm para separar o soro da fase sólida. Na

sequência, o soro foi desproteinizado através de uma solução de 40 μL de ácido sulfúrico

1,84% + 40 μL de tungstato de sódio 10% + 80 μL de água destilada, totalizando 160 μL da

solução a ser acrescida para cada 40 μL de amostra. A mistura soro mais solução

desproteinizante foi centrifugada por 10 min a 12 mil rpm e, então, o conteúdo

desproteinizado foi separado em um eppendorf para cada amostra.

37

Para a dosagem de creatinina, acrescentou-se uma solução de 40 μL de ácido pícrico

mais 10 μL de hidróxido de sódio (NaOH) para cada 100 μL de soro desproteinizado.

Utilizou-se como controle positivo uma amostra padrão cuja concentração de creatinina era

previamente conhecida (5,0 mg/mL). O padrão sofreu diluições seriadas, originando uma

curva de concentração nos valores de 5,0 mg/mL; 2,5 mg/mL; 1,25 mg/mL; 0,675 mg/mL;

0,33 mg/mL; e 0,16 mg/mL. Utilizou-se como controle negativo água destilada. Da mesma

forma que nas amostras, aos controles foi acrescentada a solução de ácido pícrico mais

NaOH.

A seguir, o conteúdo foi transferido a uma placa de Elisa de fundo chato. A

absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 520 nm, foi registrada através do

aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA) acoplado ao software Gen5™

(BioTek, VT, USA). As concentrações de creatinina sérica (Cr) foram estabelecidas através

da equação obtida ao se calcular o coeficiente de determinação R2 da curva de diluição do

padrão.

Para a dosagem de ureia, acrescentou-se, para cada 25 μL de soro desproteinizado,

uma solução composta de 500 μL de urease tamponada. Aqueceu-se a mistura em banho-

maria, a 37OC, por 5 min. Na sequência, adicionaram-se 500 μL de oxidante de uso a cada

amostra, e foram novamente aquecidas em banho-maria, a 37OC, por 5 min.

Transferiram-se 200 μL do conteúdo por poço de placa de Elisa de fundo chato.

Utilizou-se como controle positivo uma amostra padrão de ureia cuja concentração era

previamente conhecida (70 mg/mL), e como controle negativo água destilada. A absorbância

das amostras, medida no comprimento de onda 620 nm, foi registrada através do aparelho

Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA) acoplado ao software Gen5™

(BioTek, VT, USA). O cálculo das concentrações de ureia sérica (Ur) foi realizado em

comparação ao padrão, seguindo a fórmula Ur = absorbância da amostra x 70/absorbância do

padrão.

3.1.6 Avaliação histológica do parênquima renal

Fragmentos de parênquima renal foram fixados em formaldeído 4% logo a seguir da

sua extração. O material foi enviado ao Laboratório de Histotecnologia do Instituto de

Ciências Biomédicas IV, o qual processou as amostras, dando origem a cortes histológicos

para os seguintes propósitos: (I) coloração com hematoxilina-eosina (H&E), (II) coloração

38

com Picrosirius Red, e (III) coloração imunoistoquímica (IHQ) tendo como anticorpo

primário a anti-actina alfa do músculo liso (αSMA, 1:600 abcam, MA, USA).

A avaliação do escore de severidade da lesão tubular, efetuada pela Profa. Dra. Denise

Malheiros se embasou nas lâminas coradas com H&E. Aquelas coradas com Picrosirius, por

sua vez, se prestaram para avaliar o grau de fibrose.

No que concerne à IHQ, seguiu-se o seguinte protocolo: inicialmente, procedeu-se à

desparafinização e reidratação dos tecidos. Na sequência, pré-trataram-se os tecidos para a

recuperação antigênica. Para tal, aqueceram-se as amostras em banho-maria por 30 min, a

96oC. Elas foram então colocadas em câmara escura com o tampão de recuperação

Tris/EDTA pH 9,0 (Dako, Glostrup, Dinamarca), deixando-se resfriar em temperatura

ambiente por 20 min. Lavou-se, em seguida, com água destilada.

Realizou-se então o bloqueio da peroxidase endógena. Preparou-se peróxido de

hidrogênio (H2O2) 10 volumes (3%), acrescentando-se 10 mL de H2O2 a 90 mL de água

destilada. Incubaram-se as amostras com H2O2 3% por 15 min, em temperatura ambiente.

Lavou-se, em seguida, com água destilada. Depois, as amostras ficaram mergulhadas no

tampão de lavagem Tris-Buffered Saline (TBS) pH 7,6 (Dako, Glostrup, Dinamarca), por

5min, ao fim dos quais removeu-se o excesso do tampão.

Procedeu-se então ao bloqueio de ligações inespecíficas. Gotejou-se o reagente Protein

Block (Dako, Glostrup, Dinamarca) sobre os cortes histológicos, e deixou-se em câmara

escura em temperatura ambiente, por 20 min, ao término dos quais removeu-se o excesso.

Acrescentou-se então o anticorpo primário, deixando-se as amostras incubadas em

temperatura ambiente, em câmara escura, por 1h, após o que se lavaram as lâminas com TBS

pH 7,6 (Dako, Glostrup, Dinamarca). A seguir, removeu-se o excesso de tampão e aplicou-se

o reagente polímero sobre as amostras, incubando-se em temperatura ambiente, em câmara

escura, por 30 min, ao término dos quais se lavaram as lâminas com TBS pH 7,6 (Dako,

Glostrup, Dinamarca).

Para revelar a reação, incubaram-se as amostras com Liquid DAB+ (Dako, Glostrup,

Dinamarca) por 5 min, em temperatura ambiente, lavando-se em seguida com água corrente.

As lâminas foram contracoradas com hematoxilina e lavadas em água corrente. Acrescentou-

se água amoniacal e lavaram-se novamente as lâminas em água corrente. Por fim, estas foram

desidratadas através de passagem por bateria de alcoóis e xilois.

39

3.1.7 Avaliação de expressão gênica em tecido renal por RT-PCR

Obteve-se RNA de fragmentos de parênquima renal, adotando-se o seguinte protocolo

de extração: triturou-se, com o auxílio de beads de óxido de zircônio (Bertin Corp, Rockville,

MD, USA), o tecido renal acrescido de 500 μL de TRIzol™ (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Waltham, MA, USA), no homogeneizador Precellys™ (Bertin Corp, Rockville, MD, USA).

À solução resultante adicionaram-se 400 μL de clorofórmio, centrifugando-se a seguir

a 13 mil rpm por 15min. O sobrenadante, de aspecto cristalino, foi coletado, e a ele se

adicionou 500 μL de isopropanol. Procedeu-se à centrifugação a 13 mil rpm por 10 min.

Descartou-se o sobrenadante, e realizaram-se três lavagens do pellet resultante com álcool

75%. Aguardou-se o pellet secar em temperatura ambiente, e diluiu-se o produto resultante

em 80 μL de água ultrapura tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) 0,1%.

Na sequência, sintetizou-se cDNA a partir do RNA, obedecendo os passos descritos:

calculou-se o volume por amostra para se alcançar uma concentração alvo de 1500 ng/μL de

RNA. A este, adicionou-se água ultrapura DEPC até se atingir o volume final de 21,5 μL.

Acrescentaram-se então 2,5 μL de RNase-free DNase buffer 10x (Promega, Madison,

WI, USA) e 1,0 μL de RNase-free DNase (Promega, Madison, WI, USA). Selecionou-se, no

termociclador (Eppendorf, Hamburg, Alemanha), o programa padronizado para favorecer a

lise de DNA. A seguir, adicionou-se 1,0 μL de oligo(dT), um primer específico para mRNA,

e selecionou-se no termociclador o programa padronizado para o anelamento.

Por fim, acrescentou-se a cada amostra uma mistura composta de 1μL de BSA (Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2μL de M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison,

WI, USA), 10 μL de M-MLV 5x buffer (Promega, Madison, WI, USA), e 10 μL de dNTP mix

(Promega, Madison, WI, USA), a qual foi deixada incubando a 42 oC por 60 min, seguidos de

70 oC por 10 min.

Uma vez de posse do cDNA, efetuaram-se as reações em cadeia da polimerase em

tempo real no aparelho QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher

Scientific Inc., Waltham, MA, USA), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.

Os primers para os genes testados foram: beta-actina (5’ AA AAC GCA GCT CAG TAA

CAG TC), Havcr/KIM-1 (Mm00506686_M1), TNF-α (5’ TGG GAG TAG ACA AGG TAC

AAC CC 3’), IL-6 (5’ AG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CCT 3’), TGF-β (5’AA CTA

TTG CTT CAG CTC CAC AGA GA 3’), e colágeno I (5’ TGG CCA AGA AGA CAT CCC

TGA AGT 3’). A quantificação relativa dos genes foi determinada através do método de

40

comparação do limiar cíclico (deltaCT ou 2-ΔΔCT

), e expressa graficamente em escala

logarítmica para permitir que fossem agrupados valores dos diferentes experimentos

efetuados em repetição.

3.1.8 Avaliação de expressão proteica em tecido renal por western blotting

A avaliação da expressão de proteínas no parênquima renal, por método de western

blotting, seguiu o protocolo detalhado adiante: aproximadamente 50 μg de proteína total

foram diluídas em tampão de amostra (BioRad Laboratories, CA, USA), contendo 20 mg/mL

de 2-β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, MO, USA). As proteínas foram desnaturadas por

aquecimento de 5 minutos a 95 °C, sendo a seguir separadas por eletroforese em gel de

poliacrilamida 10%. Posteriormente, as proteínas foram transferidas para uma membrana de

nitrocelulose, sendo esta bloqueada durante 1 hora com leite 5% dissolvido em TBS-T e, a

seguir, incubada com o anticorpo primário diluído em TBS-T.

Os anticorpos primários utilizados foram contra pAMPK e αSMA (1:1.000 Cell

Signaling Technology, MA, USA) e β-actina (1:10.000 Sigma-Aldrich, MO, USA). Na

sequência, a membrana foi lavada com TBS-T e incubada por 1 hora com o anticorpo

secundário biotinilado: anti-rabbit (Cell Signaling Technology, MA, USA) para pAMPK, e

anti-mouse (Cell Signaling Technology, MA, USA) para beta-actina e αSMA. A massa

molecular das proteínas foi determinada por comparação com a migração das proteínas

padrão Rainbow (BioRad Laboratories, CA, USA).

3.1.9 Análise do infiltrado inflamatório e ativação celular no rim por citometria de fluxo

Fragmentos de tecido renal foram imersos em solução de colagenase IV (Sigma-

Aldrich, MO, USA), 2 mg/ml em PBS, e aquecidos a 37 oC por 30 min. O homogenato

resultante foi filtrado em cell strainers (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)

com poros de 100 μm, e a solução foi submetida a gradiente de Percoll® (Sigma-Aldrich,

MO, USA) para purificação dos leucócitos.

As células foram marcadas com anticorpos monoclonais para análise da marcação das

moléculas de superfície de linfócitos (CD45, CD3, CD4, CD8, CD69), de macrófagos (CD45,

CD11b, CD11c, F4/80, CD86, CD206), de células dendríticas (MHC classe II), e de

viabilidade celular (Live&Dead) (1:200, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). As

41

amostras foram processadas no aparelho FACSCanto, utilizando-se o software FACSDIVA

(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), e analisadas com o software FlowJo (Tree Star,

San Carlo, CA).

3.2 Experimento in vitro

3.2.1 Cultura de células tubulares renais

Cultivou-se uma linhagem epitelial de túbulo proximal renal murino, MM55.K

(American Type Culture Collection - ATCC, Manassas, VA, USA), em meio DMEM high

glucose (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), acrescido de PBS 10% e

penicilina-estreptomicina 1%. As células foram deixadas em estufa, com oferta contínua de

gás carbônico a 5%, e temperatura estável em 37 C.

Após constatados o crescimento e adesão das colônias de células em garrafas de

cultura de 75 cm2, procedeu-se à sua tripsinização, contagem em câmara de Neubauer, e

transferência de cerca de 500 mil células por poço para placas de 6, 12 e 24 wells.

3.2.2 Ensaio de viabilidade celular

Em placas de seis wells, as células, após atingirem plena confluência, foram

estimuladas por Met 20 mM (Merck Millipore Corporation, Darmstadt, Alemanha), ou pela

molécula inibitória de AMPK composto C 10 μM (Merck Millipore Corporation, Darmstadt,

Alemanha), por 2 horas, durante as quais a placa foi mantida em estufa a 37 C.

Em seguida, realizou-se um ensaio de viabilidade para verificar se as drogas, na

concentração administrada, induziam significativamente morte celular. Utilizaram-se células

não estimuladas como controle.

O ensaio realizado foi o MTT assay (Sigma-Aldrich, MO, USA), no qual o marcador

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, na concentração de 5mg/mL,

foi adicionado aos poços e, duas horas após incubação, verificou-se a mudança de coloração

de amarelo para roxo.

A absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 570 nm, foi registrada

através do aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA) e calculada através

do software Gen5™ (BioTek, VT, USA).

42

3.2.3 Avaliação da indução de AMPK por metformina

Visando identificar o intervalo de tempo após o qual a expressão da molécula de

AMPK ativada (fosforilada) era máxima após a adição de Met ao meio, as células foram

incubadas com Met 20 mM por 2, 4, 6 e 24 horas.

Ao fim do período de incubação, as células foram lisadas com o tampão de extração de

proteínas RIPA (Sigma-Aldrich, MO, USA), e realizou-se o WB. Aproximadamente 30 μg de

proteína total foram diluídas em tampão de amostra (BioRad Laboratories, CA, USA),

contendo 20 mg/mL de 2-β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, MO, USA).

As proteínas foram desnaturadas por aquecimento de 5 minutos a 95 °C, sendo a

seguir separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 10%. Posteriormente, as proteínas

foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, sendo esta bloqueada durante 1 hora

com leite 5% dissolvido em TBS-T e, a seguir, incubada com o anticorpo primário diluído em

TBS-T.

Utilizaram-se como anticorpos primários p-AMPK (1:1.000 Cell Signaling

Technology, MA, USA) e β-actina (1:10.000 Sigma-Aldrich, MO, USA), e como anticorpos

secundários anti-rabbit (Cell Signaling Technology, MA, USA) para pAMPK, e anti-mouse

(Cell Signaling Technology, MA, USA) para beta-actina. A massa molecular das proteínas foi

determinada por comparação com a migração das proteínas padrão Rainbow (BioRad

Laboratories, CA, USA).

3.2.4 Avaliação da influência da AMPK sobre a captação de glicose

Em placas de 24 wells, as células, após atingirem plena confluência, foram

estimuladas por Met 20 mM, ou por composto C 10 μM, por 2 horas. A seguir, adicionou-se

TGF-beta 10 ng/mL, deixando-o agir por 24h. Ao fim desse período, substituiu-se o meio

DMEM high glucose por um meio composto por PBS, vitaminas 1%, aminoácidos não

essenciais 1%, piruvato 1%, e L-glutamina 1%, deixando, pois, as células em jejum.

Após meia hora, acrescentou-se 2-nitro-benzoxa-diazol-deóxiglicose (2-nbdg) 50μM

conjugada ao fluoróforo FITC (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

Aguardou-se que as células, ávidas por glicose após o período de deprivação, internalizassem

a glicose marcada por 30 min. Logo a seguir, fez-se a leitura no citômetro FACSCanto,

utilizando-se o software FACSDIVA (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Os

resultados foram analisados com o software FlowJo (Tree Star, San Carlo, CA).

43

3.2.5 Avaliação da influência da AMPK sobre a transição epitélio-mesênquima

Em placas de 12 wells, as células, após atingirem plena confluência, foram

estimuladas pela molécula ativadora de AMPK Met 20 mM, ou pela molécula inibitória de

AMPK composto C 2 mM/mL, por 2 horas. A seguir, adicionou-se TGF-β 10 ng/mL,

deixando-o agir por 24 horas. Durante todo o tempo as placas permaneceram em estufa a 37

C com CO2 5% (Figura 7).

Figura 7 - Esquema representativo do cultivo de células tubulares epiteliais renais

murinas, linhagem MM55.K.

As células foram plaqueadas em poços de 12 wells e estimuladas com metformina 20 mM (Met), composto C 10

μM (CompC), e/ou TGF-beta 10 ng/mL (TGFβ) por 24h. Células não estimuladas (NS) foram utilizadas como

controle. Fonte: autoria própria.

Ao fim do período de incubação, as células foram lisadas com o tampão de extração de

proteínas RIPA (Sigma-Aldrich, M , USA) e conservadas a -80 C para posterior realização

de WB. Neste, utilizou-se como anticorpo primário a actina do músculo liso α (αSMA, 1:2000

abcam, MA, USA), e o transportador de glicose 2 (Glut2, 1:2000 abcam, MA, USA), e como

anticorpo secundário anti-mouse (Cell Signaling Technology, MA, USA). A massa molecular

das proteínas de interesse foi determinada por comparação com a migração das proteínas

padrão Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (ThermoFisher Scientific, MA,

USA).

44

3.2.6 Avaliação da via glicolítica pela dosagem de glicose e lactato

O sobrenadante dos poços contendo as células do experimento do subitem 3.2.5 foi

armazenado em eppendorf e congelado a -80 C, para subsequente mensuração dos níveis de

glicose e lactato.

Para a dosagem de glicose, acrescentaram-se 500 μL do reagente Glicose Liquiform

(Labtest, São Paulo, Brasil) a 5 μL de cada amostra, bem como a 5 μL de amostra padrão

(controle positivo), e a 5 μL de água destilada (controle negativo), deixando-se em banho-

maria a 37 C por 10 min.

A seguir, 100 μL de cada solução foram transferidos para poços de placa de Elisa de

fundo chato. A absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 505 nm, foi

registrada através do aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA)

acoplado ao software Gen5™ (BioTek, VT, USA). cálculo das concentrações de glicose

(G) seguiu a fórmula G = absorbância da amostra x 100 / absorbância do padrão.

Para a dosagem de lactato, acrescentaram-se 400 μL do reagente Lactato Liquiform

(Labtest, São Paulo, Brasil) a 5 μL de cada amostra, bem como a 5 μL de amostra padrão

(controle positivo), e a 5 μL de água destilada (controle negativo), deixando-se em banho-

maria a 37 C por 5 min.

A seguir, 100 μL de cada solução foram transferidos para poços de placa de Elisa de

fundo chato. A absorbância das amostras, medida no comprimento de onda 550 nm, foi

registrada através do aparelho Synergy™ Mx Microplate Reader (BioTek, VT, USA)

acoplado ao software Gen5™ (BioTek, VT, USA). cálculo das concentrações de lactato (L)

seguiu a fórmula L = absorbância da amostra x 40 / absorbância do padrão.

3.3 Processamento de dados e análise estatística

Todas as variáveis numéricas foram tabuladas no software Microsoft Excel 2007. As

imagens de histologia e WB foram processadas para análise quantitativa através do software

ImageJ (Bethesda, MD, USA). Os dados foram apresentados em gráficos, mostrando média e

desvio padrão (DP), produzidos através do software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software,

CA, USA). Os testes t e ANOVA foram usados para comparar os dados. A análise estatística

foi realizada estabelecendo-se um intervalo de confiança de 95%, com p<0,05.

4 RESULTADOS

46

4.1 A metformina protege camundongos selvagens da NTI induzida por adenina

4.1.1 Parâmetros clínico-laboratoriais

Figura 8 - Parâmetros clínico-laboratoriais dos camundongos C57BL/6 com NTI

induzida por adenina, e tratados com metformina.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1060

70

80

90

100

110

Ctrl

Met

Ad

Ad+Met

*

Peso

l (%

D0)

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

0

10

20

30

40

***

Perd

a d

e p

eso

D0-D

10 (

%)

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et0

1

2

3

4

5 ***

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Co

nsu

mo

de r

ação

(g/c

am

un

do

ng

o/d

ia)

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

0

200

400

600**

Ure

ia (

mg

/dL

)

Met A

d

Ad+M

et0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

***

Ure

ia (

vers

us C

trl)

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et0

1

2

3***

Cre

ati

nin

a (

mg

/dL

)

Met A

d

Ad+M

et0

1

2

3

4

***

Cre

ati

nin

a (

vers

us C

trl)

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

-1

0

1

2

3

4*

log

(2-

CTK

IM-1

)

Em (A variação percentual de peso em relação ao dia inicial do experimento (D0). Em (B), consumo diário de

ração. Em (C), ureia sérica, em valores absolutos e relativos ao controle. Em (D), creatinina sérica, em valores

absolutose relativos ao controle. Em (E), expressão gênica da kidney injury molecule 1 (KIM-1) em tecido renal.

A B

D

C

E

47

Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais

metformina, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.

Para avaliarmos a gravidade da lesão renal induzida por Ad em camundongos

C57BL/6, adotamos como parâmetros a perda de peso diário e os níveis séricos de ureia (Ur)

e creatinina (Cr) ao fim do experimento.

Os camundongos tratados com Met apresentaram menor perda ponderal do que os

não tratados (Figura 8A). A diferença da variação de peso entre os grupos Ad e Ad+Met

tornou-se pronunciada a partir do sexto dia do experimento (D6). Ao se calcular a variação de

peso entre o primeiro e o último dia do experimento (D0 e D10, respectivamente),

evidenciou-se que, enquanto o grupo Ad perdeu em média 31,4% do peso inicial, o grupo

Ad+Met perdeu somente cerca de 24,6% do peso inicial (p<0,0001).

Figura 9 - Peso renal e histologia dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por

adenina, e tratados com metformina.

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et0

2

4

6

8

10***

Peso

do

rim

(m

g)

/

Peso

co

rpo

ral (g

)

Em (A), peso do rim normalizado pelo peso corporal total. Em (B), número de cristais (gráfico à esquerda) e de

granulomas (gráfico àdireita) por campo de grande aumento (high power field - HPF). Em (C), fotomicrografias

de tecido renal (aumento de 100x). A imagem é uma sobreposição das fotos tiradas sob luz clara e sob luz

polarizada, para evidenciar os cristais de adenina (estruturas arredondadas refringentes). Ctrl – grupo controle,

Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05,

***p<0,0001. Fonte: autoria própria.

C

B A

Ctrl Met Ad Ad+Met0

2

4

6

8 *

Cri

sta

is/H

PF

Ctrl Met Ad Ad+Met0

1

2*

Gra

nu

lom

as/H

PF

Ad Ad+Met

48

A menor perda de peso observada no grupo Ad+Met não foi resultado de diferença

na quantidade de ração ingerida em relação ao grupo Ad (Figura 8B), o que vem a reforçar a

suposição de que a droga esteja agindo de modo a atenuar o processo inflamatório e a

liberação de citocinas com efeito catabólico, responsáveis pela caquexia.

A função renal do grupo tratado, ao término do experimento, encontrava-se também

marcadamente menos deteriorada do que aquela do grupo não tratado, como pode ser

constatado pelo nível sérico de escórias nitrogenadas (Figuras 8C-D). A KIM-1 se mostrou

expressivamente aumentada nos rins dos grupos Ad e Ad+Met em relação ao Ctrl; esse

aumento, contudo, foi menor no Ad+Met comparativamente ao Ad (p<0,05, Figura 8E).

4.1.2 Parâmetros histomorfológicos

Verificou-se, de forma consistente nos três experimentos efetuados, que os rins do

grupo Ad+Met eram maiores que os de todos os demais grupos. A pesagem confirmou a

avaliação visual, e a normalização do peso dos rins pelo peso corporal total permitiu

estabelecer o fato categoricamente (Figura 9A). Esse aumento foi atribuído ao maior número

de cristais no grupo tratado (Figura 9B). Ainda, os rins do grupo Ad+Met se mostraram com

menor distorção arquitetural e dilatação tubular do que os do grupo Ad (Figura 9C).

Empregamos o marcador imunoistoquímico da enzima óxido nítrico sintase induzida

(iNOS), associada a MØ de perfil M1 [53], para caracterizar os MØ envolvidos na formação

dos granulomas (Figura 10). Nos cortes de tecido renal do grupo Ad+Met, houve apenas

coloração difusa nas células tubulares, que também expressam a enzima em resposta ao stress

inflamatório [54,55].

Já nos cortes do grupo Ad, foi perceptível uma intensa coloração marcando os MØ

em proximidade com os cristais no interstício, representando granulomas incipientes, ainda

em organização (setas brancas, Figura 10A). Por outro lado, os granulomas bem formados, já

maduros, apresentavam marcação mais pontual, restrita tão somente às células posicionadas

no entorno dos cristais (seta preta, Figura 10A).

Esta avaliação preliminar conferida pela histologia apresenta, no entanto, importantes

limitações: a coloração imunoistoquímica de que dispomos só permite visualizar um único

marcador de polarização por corte de tecido, inviabilizando a avaliação simultânea de

marcadores para M1 e M2 no mesmo corte; e a intensidade do marcador só oferece uma

informação semi-quantitativa da frequência do antígeno a que ele se liga [56-58]. Por estas

49

razões, recorreu-se à citometria de fluxo para uma apreciação mais pormenorizada dos tipos

celulares infiltrando os rins doentes.

Figura 10 - Marcação imunoistoquímica para iNOS nos rins dos camundongos C57BL/6

com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.

Em (A), fotomicrografia (aumento de 400x) de tecido renal do grupo Ad. A coloração intensa em marrom-escuro

corresponde às células marcadas para a enzima óxido nítrico sintetase induzida (iNOS). As pontas de seta ( )

apontam para os cristais de adenina dispersos no interstício. As setas brancas ( ) apontam para granulomas

em formação. A seta preta ( ) aponta para um granuloma maduro. Em (B), fotomicrografia (aumento de

400x) de tecido renal do grupo Ad+Met. Repare a existência apenas de coloração difusa nas células tubulares,

ressaltando a escassez de células fagocitando ativamente os cristais, sinalizados pelas pontas de seta seta ( ).

Em (C), controle negativo. Fonte: autoria própria.

C

A

B

50

4.1.3 Caracterização do infiltrado inflamatório

Uma vez estabelecido que a administração de Met confere benefício clínico na NTI,

buscou-se descrever os tipos celulares predominantemente envolvidos na lesão. Procuramos

detectar se a Met gerava diferenças no padrão de expressão de moléculas de superfície nos

MØ que apontassem para diferentes fenótipos, bem como se outras células da resposta

inflamatória local, a exemplo das células dendríticas ou dos LT, poderiam sofrer influência

dela (Figura 11).

Figura 11 - Estratégia de gating para caracterização do infiltrado leucocitário nos rins

dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.

Para se caracterizar as populações constituintes do infiltrado inflamatório no rim, a princípio se delimitaram os

singlets. Abriu-se então uma nova janela, e nesta se demarcou uma população que, pelo tamanho e

granulosidade, era composta preponderantemente de células, excluindo-se os debris. Para melhor se assegurar da

ausência de células mortas nas populações estudadas, utilizou-se o marcador Live&Dead conjugado com o

fluoróforo AmCyan, e só as células não coradas, e portanto, vivas, foram incluídas na análise. Fonte: autoria

própria.

Figura 12 - Frequência de células CD45+ nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI


As figuras e o gráfico são representativos de três experimentos. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,

Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

0

20

40

60

80

****

CD

45 (

%)

Ctrl Met

Ad Ad+Met

Não marcado

51

Figura 13 - Caracterização da população de monócitos nos rins dos camundongos

C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.

Ctrl Met Ad Ad+Met0

10

20

30

40 **

ns

F4/8

0h

igh C

D11b

hig

h (

%)

Ctrl Met Ad Ad+Met0

5

10

15 *** ***

F4/8

0lo

w C

D11b

hig

h (

%)

As figuras e gráficos são representativos de três experimentos. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,

Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, **p<0,001, *** p<0,0001, ns – não

significativo. Fonte: autoria própria.

Figura 14 - Frequência da população CD45+ F4/80

high CD11b

high CD86+ nos rins dos

camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

0

20

40

60

80

***

CD

45 F

4/8

0h

igh C

D11b

hig

h C

D86 (

%)


Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.

Percebeu-se um incremento na frequência de células positivas para CD45 no grupo

Ad, apontando para um maior aporte de leucócitos nos rins lesionados, frequência esta

significativamente menor no grupo Ad+Met (Figura 12).

Ctrl Met

Ad Ad+Met

Não marcado

Ctrl Met

Ad Ad+Met

Não marcado

52

Em relação aos monócitos, identificaram-se duas populações distintas: uma CD45+

F4/80high

CD11b high

, e outra CD45+ F4/80

low CD11b

high (Figura 13). A população CD45

+

F4/80high

CD11b high

estava proporcionalmente reduzida nos grupos Ad e Ad+Met em relação

ao Ctrl, enquanto que a população CD45+ F4/80

low CD11b

high apresentou significativo

aumento em Ad, em comparação tanto a Ad+Met quanto ao Ctrl.


CD11bhigh

CD206+ nos rins dos


Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

0

20

40

60

80***

CD

45 F

4/8

0h

igh C

D11b

hig

h C

D206 (

%)


Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.

Figura 16 - Expressão gênica das citocinas IL-6, TNF-α e TGF-β nos rins dos


Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

-2

-1

0

1

2

3 ***

ns

log

(2-

CTIL

-6)

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

-2

-1

0

1

2

3

*

log

(2-

CTT

NF

- )

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

*

ns

log

(2-

CTT

GF

- )

Em (A), expressão de IL-6. Em (B), expressão de TNF-α. Em (C), expressão de TGF-β. Ctrl – grupo controle,

Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, ns – não

significativo, *p<0,05, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.

A frequência da população F4/80

high CD11b

high marcada com CD86 (também

conhecido por B7.2) foi significativamente mais elevada no grupo Ad+Met (Figura 14). Já a

frequência da população positiva para CD206 foi maior no grupo Ad (Figura 15).

Ctrl Met

Ad Ad+Met

Não marcado

A B C

53

Corroborando o achado da citometria de mais MØ M2 nos rins do grupo Ad,

observou-se que a expressão da citocina pró-fibrótica TGF-β estava mais elevada no grupo

Ad em relação ao Ctrl, aumento este não expressivo, contudo, no grupo Ad+Met (Figura

16C). As citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α, por sua vez, se encontraram elevadas no

grupo Ad em relação ao Ctrl, mas não no grupo Ad+Met em relação ao Ctrl (Figuras 16A-B)

Figura 17 - Frequência das populações CD45+ CD4+ e CD45+ CD8+ nos rins dos


Ctrl

Met A

d

Ad+M

et0

10

20

30

CD

45 C

D4 (

%)

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et0

5

10

15

CD

45 C

D8 (

%)

Em (A), LT CD4. Em (B), LT CD8. As figuras e gráficos são representativos de três experimentos Ctrl – grupo

controle, Met – grupo metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Fonte:

autoria própria.

Investigamos se os efeitos da Met se estendiam a outras populações celulares, como

os LT e as células dendríticas. No que se refere ao infiltrado linfocitário, não se observou

aumento de células CD45+ CD4+ ou CD45+ CD8+ nos rins de camundongos que receberam

Ad em relação ao Ctrl (Figura 17). Constatou-se, por outro lado, uma frequência aumentada

Ctrl Met

Ad Ad+Met

Não marcado

Ctrl Met

Ad Ad+Met

Não marcado

A

B

54

de células CD45+ CD11c+ MHC classe II+ no grupo Ad em comparação ao Ad+Met (Figura

18).

Figura 18 - Frequência da população CD45+ CD11c MHCII nos rins dos camundongos

C57BL/6 com NTI induzida por adenina, e tratados com metformina.

Ctrl

Ad

Ad+M

et0

10

20

30

40 *** *

CD

45 C

D11c M

HC

II (

%)

As figuras e o gráfico são representativos de três experimentos Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina,

Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05, *** p<0,0001. Fonte: autoria própria.

4.1.4 Análise de marcadores de fibrose

Finalizada a caracterização da inflamação ocorrida no parênquima renal em nosso

modelo de DRC, partimos para a análise do estágio que a sucede, a fibrose. Para tal, utilizou-

se da coloração IHQ para αSMA, valendo-se do princípio de que esta isoforma de actina é

expressa principalmente (embora não exclusivamente) por miofibroblastos.

Apesar de também poder ser identificada em células musculares lisas endoteliais, das

quais deriva seu nome, e em pericitos (ambos tipos celulares de origem mesenquimal), a

marcação positiva para αSMA permanece ainda como o método mais amplamente empregado

e mais bem validado para detectar miofibroblastos em cortes histológicos [59,60].

O percentual de área corada no grupo Ad foi de aproximadamente 8%,

significativamente maior do que os 0,65% no grupo Ad+Met (p<0,0001), que apresentou

frequência equivalente ao grupo Ctrl, com 0,69%. O western blot corroborou esses dados

(Figura 19).

Ctrl

Ad Ad+Met

Não marcado

55

Figura 19 - Avaliação da transição epitélio-mesenquimal, através da expressão de

αSMA, nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI induzida por adenina.

Ctrl Met Ad Ad+Met

0

2

4

6

8

10

***

S

MA

(%

áre

a c

ora

da)

Ctrl Met Ad Ad+Met0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

***

S

MA

/ acti

na

Em (A), fotomicrografias de tecido renal (aumento de 200x). Para fins de cálculo, foram tiradas três fotos cada

de três lâminas por grupo. Em (B), western blotting para αSMA. Ctrl – grupo controle, Met – grupo

metformina, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, ***p<0,0001. Fonte: autoria

própria.

A

B

β-actina

α-SMA

()

Controle negativo

Ctrl Met Ad Ad+Met

(42kDa)

() (42kDa)

()

56

Figura 20 - Expressão de colágeno nos rins dos camundongos C57BL/6 com NTI


Ctrl Met Ad Ad+Met0

20

40

60

***

% Á

rea c

ora

da

Ctrl

Met A

d

Ad+M

et

-1

0

1

2

3

*

log

(2-

CTco

lág

en

o I

) ***

Em (A), fotomicrografias de tecido renal (aumento de 200x); foi feita uma sobreposição das imagens adquiridas

sob luz branca e sob luz polarizada. Em (B), representação gráfica do percentual de área corada por Picrosirius

red. Para fins de cálculo, foram tiradas três fotos cada de três lâminas por grupo. Em (C), gráfico da expressão de

colágeno I no tecido renal, avaliada por técnica de RT-PCR. Ctrl – grupo controle, Met – grupo metformina,

Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, *p<0,05, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.

Com o objetivo de comparar quantitativamente o grau de fibrose entre os grupos,

lançou-se mão da coloração por Picrosirius red, que marca as fibras de colágeno presentes no

tecido. Sob luz branca, o colágeno aparece com coloração avermelhada, enquanto que, sob luz

polarizada, ele é visualizado nas cores vermelho, amarelo e verde [61,62].

Observamos que, enquanto os grupos Ctrl e Met apresentaram uma área corada de

apenas cerca de 13%, o grupo Ad apresentou aproximadamente 50% da área de cada corte

corada, significativamente maior que aquela do grupo Ad+Met, com 28% (p<0,0001, Figura

20A-B). A expressão de colágeno I nas células renais, avaliada por método de RT-PCR,

também demonstrou aumento inequívoco no grupo Ad, tendo sido, de outra parte,

notavelmente menor no grupo Ad+Met (Figura 20C).

A

B C

Ad Ad+Met

Ctrl Met

57

Visando-se comprovar que a Met exercia seus efeitos benéficos na NTI através da

ativação da via da AMPK, compararam-se as densidades da banda da molécula fosforilada

(pAMPK) entre os grupos (Figura 21). Observa-se claramente que a Met induz a fosforilação

da quinase no tecido renal, ao se comparar os grupos Ctrl e Met. A lesão causada por Ad leva

à sua redução, e o tratamento com Met restabelece para níveis similares ao grupo controle.

Figura 21 - Expressão de pAMPK em tecido renal de camundongos C57BL/6 com NTI


Ctrl Met Ad Ad+Met0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

***

**

pA

MP

K/

acti

na


Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria

própria.

Figura 22 - Gravidade clínica da NTI em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1060

70

80

90

100

110

Ctrl AMPK+/+

Ad AMPK+/+

Ctrl AMPK-/-

Ad AMPK-/-

Dia

Peso

(%

D1)

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

Cre

ati

nin

a (

mg

/dL

)

ns

******

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0

100

200

300

Ure

ia (

mg

/dL

)

******

ns

Em (A), curva da variação percentual de peso diária. Em (B), creatinina sérica. Em (C), ureia sérica. Ctrl - grupo

controle, Ad - grupo adenina, AMPK+/+

- camundongos com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-

-

camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, ***p<0,0001, ns – não significativo. Fonte:

autoria própria.

β-actina

pAMPK

Ctrl Met Ad Ad+Met

(42kDa)

()

(62kDa)

()

A B C

58

4.2 O efeito da metformina sobre a polarização dos MØ é dependente de AMPK

O western blot tem o inconveniente de demonstrar o panorama geral do que ocorre

com a AMPK no tecido renal como um todo, não especificando as alterações ocorridas na

expressão da quinase em cada uma das populações celulares relacionadas com a

fisiopatogenia da NTI. Assim, com vistas a esmiuçar o seu papel nos macrófagos, que se

destacaram, no experimento anterior, como o principal alvo da ação nefroprotetora da Met,

aplicamos o mesmo desenho experimental em camundongos com deleção seletiva de AMPK

em macrófagos, isto é, LyzM-cre AMPKflox/flox

.

Figura 23 - Caracterização dos M de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI.

Em (A), western blot para AMPK1 em macrófagos intraperitoneais de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

.

Em (B), estratégia de gating no tecido renal de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI. Inicialmente,

restringiu-se o gate com vistas a excluir possíveis debris. A seguir, selecionou-se apenas a população positiva

para CD45. Dentro desta, abriu-se um gate com os marcadores F4/80 e CD11b. Dentro da população CD45+

F4/80low

CD11bhigh

, marcou-se a subpopulação positiva para Ly6c, enquanto a população CD45+

F4/80high

CD11b high

foi caracterizada com os marcadores CD86 e CD206. Fonte: autoria própria.

Em um primeiro momento, comparamos a intensidade da lesão renal entre os

camundongos AMPK+/+

e AMPK-/-

. Como pode ser verificado na Figura 22, não houve

qualquer diferença aparente nos parâmetros clínicos analisados. No intento de detectar

diferenças sutis no padrão de resposta dos macrófagos à lesão renal, realizamos ainda

citometria de fluxo (Figura 23).

A

B

AMPK-/-AMPK+/+

AMPKα1(62kDa)

β-actina(42kDa)

59

Figura 24 - Frequência da população CD45+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre

AMPKflox/flox

com NTI.

Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK

+/+ - camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,

AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, ***p<0,0001, ns – não


Houve um aumento na frequência de células positivas para CD45, indicando maior

aporte de leucócitos nos grupos adenina em relação aos controles, sem distinção, contudo,

entre os grupos AMPK+/+

e AMPK-/-

(Figura 24). Mimetizando o já verificado nos

camundongos C57BL/6, duas populações foram identificadas com os marcadores F4/80 e

CD11b: uma CD45+

F4/80high

CD11b high

, e outra CD45+ F4/80

low CD11b

high (Figura 25).

Figura 25 - Distribuição das células CD45+ F4/80 CD11b no tecido renal de


com NTI.



AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, **p<0,001,

***p<0,0001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.

60

Figura 26 - Frequência da população CD45+ F4/80low

CD11bhigh

Ly6C+ no tecido renal

de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI.

. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK


AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, **p<0,001, ns – não



CD11bhigh

CD86+ no tecido renal


com NTI.



AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, ns – não significativo.

Fonte: autoria própria.

A população duplo-positiva se encontrava reduzida uniformemente em ambos os

grupos Ad, independentemente da presença ou ausência de AMPK, enquanto a CD11bhigh

se

mostrou enriquecida. Para corroborar nossa suposição, previamente discutida, de que essa

61

segunda população possivelmente representasse os monócitos infiltrantes, aplicamos o

marcador Ly6c dentro do gate (Figura 26). Houve um incremento, nos grupos Ad, da

população CD45+ F4/80

low CD11b

high Ly6C

high em relação ao controle, sem diferença entre os

grupos AMPK+/+

e AMPK-/-

.

O marcador de M1 CD86 e o marcador de M2 CD206 foram utilizados para

caracterizar a população duplo-positiva (Figuras 27 e 28). A frequência de ambos se mostrou

aumentada nos grupos Ad em comparação aos Ctrl, mas, mais uma vez, sem distinção entre

os camundongos AMPK+/+

e AMPK-/-

.


CD11bhigh

CD206+ no tecido renal


com NTI.



AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos, ***p<0,0001, ns – não


À semelhança do verificado nos camundongos C57BL/6, notamos um aumento do

marcador de miofibroblasto αSMA no tecido renal em relação aos controles (Figura 29A), o

que veio acompanhado, conforme previsto, de maior deposição de matriz colágena, avaliada

por meio da coloração histológica com Picrosirius red (Figura 29B).

Correlacionamos a acentuação da fibrose com a maior expansão intersticial e dilatação

tubular observadas nos camundongos AMPK-/-

(Figura 30). De forma notável, o número e o

tamanho dos granulomas desse grupo se mostraram superiores aos dos camundongos

AMPK+/+

. A marcação imunoistoquímica para CD11b ratificou que o tipo celular

predominando em sua composição foram os macrófagos (Figura 31).

62

Ctrl

Ad A

MPK

+/+

Ad A

MPK-/-

0

5

10

15

20

25

30

Sir

ius

re

d (%

áre

a c

ora

da

) **

Figura 29 - Fibrose renal em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI.

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2 ****

***

S

MA

/ acti

na

Em (A), expressão de αSMA em rim, quantificada por western blotting e imunoistoquímica (fotomicrografias

com aumento de 100x). Em (B), marcação de colágeno com Picrosirius red. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo

adenina, AMPK+/+

- camundongos com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-

- camundongos com AMPK

seletivamente deletada nos macrófagos, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.

A

B Ad AMPK+/+

Ad AMPK-/-

Ctrl

Ad AMPK+/+

Ad AMPK-/-

Ctrl

63


com NTI.

Fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal, corado com hematoxilina-eosina, dos grupos (A) controle -

Ctrl, (B) adenina nos camundongos com AMPK mantida nos macrófagos - Ad AMPK+/+

e (C) adenina nos

camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos - Ad AMPK-/-

. As pontas de seta brancas ( )

apontam para cristais de adenina no interstício. As setas brancas ( ) apontam para granulomas gigantes no

córtex renal. As pontas de seta pretas ( ) apontam cristais de adenina dentro do granuloma. Em (D),

quantificação de cristais e granulomas por campo de grande aumento (HPF – 400x). Fonte: autoria própria.

A B

C

Ad AMPK+/+

Ad AMPK-/-

Ctrl

Ctrl A

MPK

+/+ +/

+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0

20

40

60

Cri

sta

is/H

PF

D

64

Figura 31 - Coloração imunoistoquímica para CD11b nos rins de camundongos LyzM-

cre AMPKflox/flox

com NTI.

A ausência de AMPK, embora tenha resultado em piora histológica, não se traduziu

em piora clínica. Empregamos, então, mais uma vez a Met para ativar a via da quinase. Não

se percebeu melhora nos camundongos AMPK-/-

(Figura 32), enquanto que os AMPK+/+

se

comportaram como os C57BL/6, apresentando menor deterioração da função renal e perda de

peso menos pronunciada (Figura 33).

A histologia correspondeu aos achados clínicos: os rins dos camundongos AMPK-/-

tratados com Met se mostraram com estrutura bem mais deteriorada do que aqueles dos

camundongos AMPK+/+

que também receberam a droga (Figura 34). Para averiguar quais

mudanças nos Mϕ que proporcionaram esses resultados, realizamos citometria de fluxo com o

mesmo delineamento já especificado na figura 23.

O marcador de M1 CD86 se encontrava elevado em ambos os grupos Ad tratados com

Met relativamente aos não tratados. Esse aumento foi, contudo, notavelmente superior nos

AMPK+/+

AMPK-/-

Con

trole

A

den

ina

Fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal marcado com o anticorpo contra monócitos anti-CD11b.

Repare que, nos grupos adenina, os monócitos ficam agregados ao redor dos cristais de adenina, formando

granulomas. Fonte: autoria própria.

65

camundongos AMPK-/-

. Por outro lado, o marcador de M2 CD206 se elevou

significativamente nos camundongos AMPK+/+

tratados, o mesmo não se verificando nos

AMPK-/-

(Figura 35).

Figura 32 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK-/-

tratados com

metformina.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1065

75

85

95

105

Ctrl AMPK-/-

Ad AMPK-/-

Ad+Met AMPK-/-

Dia

Peso

(%

D1)

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

-/-

Ad+M

et A

MPK

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5***

ns

Cre

ati

nin

a (

mg

/dL

)

Em (A), evolução da perda diária de peso, em termos percentuais do primeiro dia do experimento. Em (B),

creatinina sérica. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente

deletada nos macrófagos, **p<0,001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.

Figura 33 - Parâmetros clínicos dos camundongos LyzM-cre AMPK+/+

tratados com

metformina.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1060

70

80

90

100

110

Ctrl AMPK+/+

Ad AMPK+/+

Ad+Met AMPK+/+

*

Dia

Peso

(%

D1)

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK+/+

Ad+M

et A

MPK+/

+

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

*****

ns

Cre

ati

nin

e (

mg

/dL

)

Em (A), evolução da perda diária de peso, em termos percentuais do primeiro dia do experimento. Em (B),

creatinina sérica. Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, AMPK+/+

- camundongos com AMPK mantida nos

macrófagos,***p<0,0001, **p<0,001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.

A B

A B

66


com NTI

tratados com metformina.

Fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal, corado com hematoxilina-eosina. AMPK+/+

- camundongos

com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-

camundongos com AMPK seletivamente deletada nos

macrófagos. As pontas de seta brancas ( ) apontam para cristais de adenina no interstício. As setas brancas

( ) apontam para granulomas gigantes no córtex renal. Fonte: autoria própria.

A Met foi capaz de reduzir a expressão de αSMA em ambos o grupos tratados

(Figura 36). Isso nos motivou a investigar outros alvos celulares da droga. Utilizamos o CEL

para minimizar a influência da participação dos MØ no estabelecimento da lesão.

AMPK+/+

AMPK-/-

Con

trole

A

den

ina

Ad

enin

a+

Met

form

ina

67

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

+/+

Ad+M

et A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

-/-

Ad+M

et A

MPK

0

5

10

15

20

25

30

***

*****

ns

F4/8

0h

ighC

D11b

hig

hC

D86 (

%)

Figura 35 - Frequência das populações CD45+ F4/80high

CD11bhigh

CD86+ e CD45+

F4/80high

CD11bhigh

CD206+ no tecido renal de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com NTI tratados com metformina.

Ctrl - grupo controle, Ad - grupo adenina, Ad+Met - grupo adenina tratado com metformina, AMPK+/+

-

camundongos com AMPK mantida nos macrófagos, AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente

deletada nos macrófagos, *p<0,05, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.

4.3 A metformina atua, também via AMPK, nas células tubulares renais

Conjecturamos que o CEL, ao reduzir substancialmente o número de monócitos

fagocitando os cristais de Ad depositados no parênquima renal e produzindo citocinas pró-

inflamatórias e pró-fibróticas, iria resultar em um benefício clínico semelhante ao da Met, e

que, ao se associar as drogas, a melhoria na função renal seria ainda mais pronunciada.

AMPK-/- AMPK+/+C

TRL

AD

AD

+MET

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

+/+

Ad+M

et A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

-/-

Ad+M

et A

MPK

0

5

10

15

20

25

30*** ns

F4/8

0h

igh C

D11b

hig

h C

D206 (

%)

68

Figura 36 - Expressão de αSMA nos rins de camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

com

NTI tratados com metformina.

Em (A), fotomicrografias (aumento de 200x) de tecido renal, corado imunoistoquimicamente com anticorpo anti-

αSMA. Em (B), western blot para αSMA. AMPK+/+

- camundongos com AMPK mantida nos macrófagos,

AMPK-/-

camundongos com AMPK seletivamente deletada nos macrófagos. Fonte: autoria própria.

AMPK+/+

AMPK-/-

Con

trole

A

den

ina

Ad

enin

a+

Met

form

ina

69

Figura 37 - Marcadores de função e lesão renal nos camundongos C57BL/6 tratados

com metformina e/ou clodronato.

Em (A), ureia sérica. Em (B), creatinina sérica. Em (C), expressão gênica de KIM-1 no tecido renal. Ctrl –

grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo adenina mais

clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato.*p<0,05, ***p<0,0001, ns – não


Figura 38 - Variação do peso dos camundongos C57BL/6 tratados com metformina e/ou

clodronato.

0 1 2 3 4 5 6 7 865

75

85

95

105Ctrl

Ad

Ad+Met

Ad+Clo

Ad+Met+Clo

*

Dia

% P

eso

in

icia

l

Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, Ad+Met – grupo adenina mais metformina. Ad+Clo – grupo

adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato, *p<0,05 versus todos os

demais grupos adenina. Fonte: autoria própria.

A função renal do grupo Ad+Clo se equiparou àquela do grupo Ad+Met (Figura 37A-

B). Apesar de os níveis de ureia e creatinina não apresentarem diferença estatisticamente

apreciável entre os três grupos tratados, observou-se que a expressão de KIM-1 encontrava-se

particularmente reduzida no grupo Ad+Met+Clo (Figura 37C), e que este grupo também foi o

que apresentou menor variação de peso (Figura 38).

Ctrl

Ad

Ad+M

et

Ad+C

lo

Ad+M

et+C

lo

0

100

200

300

400

500

ns

***

Ure

ia (

mg

/dL

)

Ctrl

Ad

Ad+M

et

Ad+C

lo

Ad+M

et+C

lo

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

ns

***

Cre

ati

nin

a (

mg

/dL

)

A B

Ctrl

Ad

Ad+M

et

Ad+C

lo

Ad+M

et+C

lo

0

500

1000

1500**

*2-

CT K

IM-1

C

70

Figura 39 - Expressão gênica de IL-6 e TNF-α no tecido renal de camundongos C57BL/6

tratados com metformina e/ou clodronato.

Ctrl

Ad

Ad+M

et

Ad+C

lo

Ad+M

et+C

lo

0

5

10

15

***

2-

CT I

L-6

Ctrl

Ad

Ad+M

et

Ad+C

lo

Ad+M

et+C

lo

0

10

20

30

40

***

2-

CTT

NF

-


adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato, ***p<0,0001 versus todos os

demais grupos. Fonte: autoria própria.

Figura 40 - Expressão proteica de αSMA em tecido renal de camundongos C57BL/6

tratados com metformina ou clodronato.

Ctrl

Ad

Ad+M

et

Ad+C

lo

Ad+M

et+C

lo

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

**

S

MA

/ acti

na


adenina mais clodronato. Ad+Met+Clo – grupo adenina, metformina e clodronato, **p<0,001 versus todos os

demais grupos. Fonte: autoria própria.

A menor deterioração renal propiciada pelo CEL, em monoterapia ou em associação,

foi reflexo da atenuação do processo inflamatório, como se infere da menor expressão das

citocinas IL-6 e TNF-α (Figura 39), o que, por sua vez, se traduziu em menor substituição do

parênquima normal por miofibroblastos produtores de MEC, representados pela expressão de

αSMA (Figura 40).

(42kDa)

()

(42kDa)

()

71

Figura 41 - Parâmetros clínicos dos camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

com NTI.

0 3 4 5 6 7 1060

70

80

90

100

110

Ctrl AMPK-/-

Ctrl AMPK+/+ Ad AMPK

+/+

Ad AMPK-/-

Dia

P

eso

(%

D0)

-/-

Ctrl A

MPK -/-

Ad AMPK

+/+

Ctrl A

MPK+/+

Ad AMPK

0

100

200

300

400

Ure

ia (

mg

/dL

)

*** **

ns

-/-

Ctrl A

MPK -/-

Ad AMPK

+/+

Ctrl A

MPK+/+

Ad AMPK

0.0

0.5

1.0

1.5

*

***

ns

Cre

ati

nin

a (

mg

/dL

)

Em (A), curva evolutiva da variação de peso, em termos percentuais do dia zero (D0), ao longo do experimento.

(B), ureia sérica. Em (C), creatinina sérica. Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, AMPK+/+

- camundongos

com AMPK mantida nos linfócitos T CD4, AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos

linfócitos T CD4, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001, ns – não significativo. Fonte: autoria própria.

Figura 42 - Estratégia de gating nas células do parênquima renal de camundongos CD4-

cre AMPKflox/flox

.

Para se caracterizar as populações constituintes do infiltrado inflamatório no rim, a princípio se delimitou os

singlets. Abriu-se então uma nova janela contendo apenas o singlets, e nesta se demarcou uma população que,

pelo tamanho e granulosidade, era compatível com linfócitos. Desta população, foram selecionadas apenas as

células com marcação positiva para CD45. Para se assegurar de que não havia porventura monócitos

contaminando, selecionou-se, dentro da população CD45 positiva, apenas as células F4/80 negativas. Na

sequência, abriu-se uma janela em que se selecionaram apenas as células que expressavam fortemente a

molécula de superfície CD3. Dentro deste gate, designaram-se as células CD45+ F4/80- CD3+ CD4+ como

linfócitos T CD4, e as células CD45+ F4/80- CD3+ CD8+ como linfócitos T CD8. Fonte: autoria própria.

A B C

72

Figura 43 - Caracterização dos LT CD4+ infiltrando o parênquima renal de

camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

.

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0

10

20

30

40

50

CD

45

CD

3 C

D4

(%

)

Em (A), imagens representativas da citometria. Em (B), gráfico com as frequências computadas em cada grupo.

Ctrl – grupo controle, Ad – grupo adenina, AMPK+/+

- camundongos com AMPK mantida nos linfócitos T CD4,

AMPK-/-

- camundongos com AMPK seletivamente deletada nos linfócitos T CD4. Fonte: autoria própria.

Figura 44 - Estratégia de gating nas células do linfonodo renal de camundongos CD4-cre

AMPKflox/flox

.

Para se caracterizar os linfócitos presentes no linfonodo renal, a princípio se delimitou os singlets. Abriu-se

então uma nova janela contendo apenas o singlets, e nesta se demarcou uma população que, pelo tamanho e

granulosidade, era compatível com linfócitos. Desta população, foram selecionadas apenas as células com

marcação positiva para CD45. Na sequência, abriu-se uma janela em que se selecionaram apenas as células que

expressavam fortemente a molécula de superfície CD3. Dentre estas, foram delimitadas, na janela subsequente,

as que expressavam CD4. Por fim, dentro da população de células CD45+ CD3+ CD4+, a partir de então

designadas como linfócitos T CD4, foram definidas aquelas que expressavam IFN-gamma. Fonte: autoria

própria.

Não marcado

AMPK-/-

Ad

AMPK+/+

Ctr

l

A B

73

Figura 45 - Frequência da população de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos

CD4-cre AMPKflox/flox

.

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0

20

40

60

80

CD

45 C

D3 C

D4 (

%)




AMPK-/-


Figura 46 - Ativação de LT CD4+ no linfonodo renal de camundongos CD4-cre

AMPKflox/flox

.

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0

10

20

30

CD

45 C

D3 C

D4 C

D69 (

%)




AMPK-/-


Procurou-se estabelecer se a Met estaria contribuindo para redução da fibrose ao

modular os LT. Procedeu-se ao knockout de AMPK apenas em células T CD4+ (AMPK-/-

),

com a hipótese de que os camundongos em que essa molécula estivesse ausente apresentariam

uma doença mais grave.

Ad

C

trl

A B

Não marcado

AMPK-/-

AMPK+/+

A B

Não marcado

Ad

C

trl

AMPK-/-

AMPK+/+

74

Figura 47 - Caracterização da expressão de IFN-γ por linfócitos T CD4 no linfonodo

renal de camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

.

+/+

Ctrl A

MPK

+/+

Ad A

MPK

-/-

Ctrl A

MPK

-/-

Ad A

MPK

0

2

4

6

8

CD

45 C

D3 C

D4 IF

N (

%)




AMPK-/-


Nossa hipótese, no entanto, não se confirmou: os camundongos perderam peso na

mesma proporção, e não foi detectada qualquer diferença nos níveis seja de ureia, seja de

creatinina, entre os grupos Ad AMPK-/-

e AMPK+/+

(Figura 41). Ao se analisar a proporção de

LT CD4+ infiltrando o rim, mais uma vez não se obteve qualquer diferença entre os grupos

(Figuras 42 e 43).

Figura 48 - Ensaio de viabilidade das CTERM cultivadas na presença de metformina 20

mM ou de composto C 10 μM por 24h.

NE Met 20mM CompC 10M 0

20

40

60

80

100

% c

élu

las v

iáveis

CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, NE – células cultivadas em meio

DMEM high, sem estímulo, Met – células cultivadas em meio DMEM high acrescido de metformina 20 mM,

CompC – células cultivadas em meio DMEM high acrescido composto C 10 μM. Fonte: autoria própria.

Em uma análise mais pormenorizada, buscou-se evidenciar se, a despeito de a

frequência de LT CD4+ infiltrantes no rim permanecer inalterada, haveria alguma diferença

A B

Não marcado Ad

C

trl

AMPK-/-

AMPK+/+

75

na ativação desses linfócitos no órgão linfoide secundário em maior proximidade com a lesão,

neste caso, o linfonodo renal (Figura 44).

Figura 49 - Expressão de AMPK fosforilado nas CTERM após estímulo com

metformina 20 mM.

Ctrl M2 M4 M6 M240

1

2

3*

pA

MP

K/

acti

na

CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, C – células cultivadas em meio

DMEM high, sem estímulo, M2 – células incubadas com metformina 20 mM por 2 horas, M4 – células

incubadas com metformina 20 mM por 4 horas, M6 – células incubadas com metformina 20 mM por 6 horas,

M24 – células incubadas com metformina 20 mM por 24 horas, *p<0,05. Fonte: autoria própria.

Figura 50 - Expressão de αSMA por CTERM submetidas à TEM e tratadas com Met 20

mM e/ou CompC 10 μM.

0.0

0.5

1.0

1.5

**

-S

MA

/ -t

ub

uli

na

TGF- 10ng/dLMet 20mM

CompC 10M

- - + + + +- + - - + +- - - + - +

CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, TEM – transição epitélio-

mesenquimal induzida com TGF- 10 ng/dL, Met – células incubadas com metformina 20 mM por 24 horas,

CompC – células incubadas com composto C 10 μM por 24 horas, **p<0,001. Fonte: autoria própria.

Contudo, de forma idêntica ao observado no parênquima renal, não se notou aumento

de LT CD4+ no linfonodo drenante (Figura 45). Além disso, os linfócitos dos grupos Ad não

- - + + + +- + - - + +

- - - + - +

TGF-β10ng/dL

Met 20mM

CompC 10µM

pAMPK

AMPK total

β-actina

C C M2 M2 M4 M4 M6 M6 M24 M24

(62kDa)

(62kDa)

(42kDa)

76

0

50

100

150

200

*** * ***

TGF- 10ng/mLMet 20mM

CompC 10M

- - - + + +- + - - + -- - + - - +

Lacta

to (

mg

/dL

)

se mostraram mais ativados do que aqueles dos grupos Ctrl, como apontado pela inexistência

de expressão diferencial da molécula de superfície CD69 (Figura 46) ou da citocina

interferon-gamma (IFN-γ, Figura 47).

Figura 51 - Concentração de glicose e lactato no sobrenadante das CTERM cultivadas

com Met 20 mM ou CompC 10 μM.

0

100

200

300

400

500**

**

TGF- 10ng/mLMet 20mM

CompC 10M

- - - + + +- + - - + -- - + - - +

Glico

se (

mg

/dL

)

Em (A), concentração de glicose no sobrenadante. Em (B), concentração de lactato no sobrenadante. CTERM –

células tubulares epiteliais murinas, estimuladas por 24 horas com metformina (Met) 20 mM ou composto C

(CompC) 10 μM, *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001. Fonte: autoria própria.

Figura 52 - Captação de 2-nbdg pelas CTERM cultivadas com Met 20 mM ou CompC

10 μM.

Em (A), captação de 2-nbdg nas células estimuladas com metformina (Met 20 mM) ou composto C (CompC 10

μM) por 24 horas. Em (B), captação de 2-dg nas células em que se induziu transição epitélio-mesenquimal com

TGF-β 10 ng/mL, incubadas com metformina (TEM+Met 20 mM) ou composto C (TEM+CompC 10 μM) por

24 horas. CTERM – células tubulares epiteliais renais murinas, linhagem MM55.K, **p<0,001, ***p<0,0001.


Em virtude desses dados, investigou-se, na sequência, se a Met estaria agindo nas

células lesionadas pelos macrófagos no contexto da DRC – as próprias células tubulares. Para

esse propósito, utilizou-se de um modelo in vitro que mimetiza uma condição de fibrose renal:

A B

A B

Met

20m

M M

Com

pC 1

0

0

20

40

60

80 ***

Cap

tação

de 2

-nb

dg

(%

)

TEM+M

et 2

0mM M

TEM+C

ompC

10

0

20

40

60

80

**

Cap

tação

de 2

-nb

dg

(%

)

77

induziu-se a transição epitélio-mesênquima (TEM) em células tubulares epiteliais renais

murinas (CTERM, linhagem MM55.K), e observou-se que efeito tinha a adição de Met sobre

a evolução desse processo. Ainda, buscou-se identificar se a ativação e a inibição da AMPK,

pela Met e pelo composto C (CompC), respectivamente, ocasionava alterações metabólicas

nessas células.

Antes, porém, foi necessário se certificar de que as doses aplicadas ao meio de

cultura não detinham efeito tóxico sobre as células. Fez-se então um ensaio de viabilidade

celular, que demonstrou que as drogas, na concentração escolhida, não implicavam na morte

das células cultivadas (Figura 48).

O próximo passo foi identificar em qual timepoint a Met exercia seu efeito máximo

ativando o AMPK nas células tubulares. Para isso, deixaram-se as células incubando com a

droga durante 2, 4, 6 e 24h. A análise revelou que a ativação da quinase ocorria com maior

intensidade 4 horas após a adição da droga ao meio (Figura 49).

Figura 53 - Expressão do transportador de glicose Glut2 nas células tubulares renais

tratadas com Met 20 mM ou CompC 10 μM.

0.0

0.5

1.0

1.5 *

TGF- 10ng/mL

CompC 10M

- - + +- + - +

Glu

t2/β

-acti

na

0.0

0.5

1.0

1.5

TGF- 10ng/mL

CompC 10M

- - + +- + - +

Glu

t2/

-acti

na

*

Em (A), expressão de Glut2 nas células tubulares renais estimuladas com metformina (Met) 20 mM TGF-β 10

ng/mL por 24 horas. Em (B), expressão de Glut2 nas células tubulares renais estimuladas com composto C

(CompC) 10 μM TGF-β 10 ng/mL por 24 horas. ***p<0,0001, **p<0,001. Fonte: autoria própria.

--

TGF-β 10ng/dL

Glut2(57kDa)

Met 20mM

-+

+-

++

β-actina(42kDa)

A B

--

TGF-β 10ng/dL

Glut2(57kDa)

CompC10μM

-+

+-

++

β-actina(42kDa)

78

Na sequência, verificou-se o efeito da Met sobre a TEM das CTERM estimuladas

com TGF-β 10 ng/L por 24h. As células que receberam apenas TGF-β superexpressaram

αSMA, enquanto aquelas pré-tratadas com Met 20 mM apresentaram quantidade irrisória

deste marcador de TEM.

Para comprovar que este era um efeito dependente de AMPK, induzimos a TEM na

presença do antagonista de AMPK CompC 10 μM. A coadministração de ambas as drogas no

meio de cultura resultou em expressão de αSMA similar àquela das células que sofreram

TEM na ausência de Met (Figura 50).

Constatou-se que células incubadas com Met tiveram a glicose do meio de cultura

consumida, e concomitantemente produziram mais lactato, sugerindo aumento da glicólise em

relação ao basal (Figura 51). A seguir, procurou-se elucidar se a isto se associava uma maior

captação da glicose presente no meio. Com esse intuito, utilizou-se de glicose marcada com

um fluoróforo e submeteram-se as células à citometria, que revelou mais glicose adentrar as

células tratadas com Met (Figura 52).

Por fim, para averiguar se a maior captação de glicose estava relacionada à maior

expressão do seu transportador, procedeu-se à avaliação da expressão deste por western

blotting. Nos túbulos renais são expressas duas isoformas desse transportador, Glut1 e Glut2,

sendo esta última a responsável pela reabsorção da maior parte da glicose filtrada pelos rins

[63]. A expressão de Glut2 se mostrou reduzida nas células que sofreram TEM (Figura 53).

5 DISCUSSÃO

80

Lançada há exatas seis décadas, a Met se consolidou como o hipoglicemiante de

escolha no manejo do diabetes mellitus tipo 2. A despeito disso, aconselha-se cautela ao

prescrever a droga para pacientes com clearance de creatinina (ClCr) entre 45 e 30 mL/min

(DRC estágio 3b), e ela é formalmente contraindicada para pacientes com ClCr abaixo de 30

mL/min (DRC estágios 4 e 5). Esta recomendação se baseia no risco diminuto, porém real, de

acidose lática com o declínio da função renal, estimado em cerca de 3 casos por 100.000

pacientes-ano [64,65].

As alterações metabólicas provocadas pela Met, embora tradicionalmente encaradas

como obstáculos em potencial ao seu uso no contexto da DRC, podem, contudo, consistir em

um mecanismo de ação importante a ser explorado para conter a progressão da doença.

Evidências, a partir de estudos in vitro, apontam a ativação da AMPK como uma via

importante a ser modulada com a intenção de modificar o curso da fibrose tecidual [28,66].

Nosso estudo tece novas conexões entre os campos da nefrologia e do

imunometabolismo, ao oferecer um modelo in vivo que corrobora e aprofunda a compreensão

sobre a influência da Met na TEM, e sugerir que ela tenha um papel importante enquanto

reguladora da função do sistema imune. Propomos, assim, que a Met possa impactar

positivamente na evolução da DRC, e esperamos que estudos subsequentes permitam ampliar

e diversificar as indicações da droga.

O primeiro parâmetro avaliado para acompanhar a evolução da NTI induzida por Ad,

o modelo que adotamos de DRC, foi a perda de peso. Sabe-se que o ambiente inflamatório

associado à DRC leva ao consumo progressivo da massa corpórea [67,68]. O abrandamento

da inflamação se manifestaria, pois, com atenuação da caquexia.

No que concerne à influência da técnica adotada sobre a variação do peso corporal,

duas considerações se impõem: (1) o procedimento de gavagem pode se associar à perda

ponderal quando o animal é manipulado inadequadamente, e (2) a REA, por ser pouco

palatável, se associa a uma menor ingestão alimentar que pode se refletir como perda de peso

não atribuível à lesão renal em si.

A variação de peso resultante do estresse promovido pelas gavagens repetidas é

provavelmente insignificante, já que o método foi otimizado para causar o mínimo

desconforto aos animais, obedecendo-se ao limite de administração diária de 5mL/kg, o qual

está associado a menor distensão gástrica e melhor aceitabilidade do conteúdo gavado pelos

roedores, conforme Turner et al., 2011 [69].

81

De fato, observa-se que, mesmo no grupo controle, há uma discreta perda de 4% do

peso inicial nos dois primeiros dias, sendo que, já no terceiro dia, com a habituação dos

camundongos à manipulação, o peso retorna aos valores iniciais e estabiliza.

Quanto à diminuição do consumo de ração atribuída à sua impalatabilidade, sabe-se

que, no primeiro dia do experimento, tanto o grupo Ad quanto o Ad+Met apresentaram uma

redução de aproximadamente 28% do seu consumo basal e, a partir do segundo dia, essa

redução se acentuou para cerca de 70%, tendo assim permanecido até o fim do experimento.

Acredita-se que o declínio inicialmente verificado corresponda exclusivamente à

recusa alimentar devido à insipidez da dieta, já que, neste primeiro dia, ainda não houve

tempo hábil para o estabelecimento de lesão renal grave o suficiente para desencadear

manifestações sistêmicas. A partir do segundo dia, entretanto, a maior redução do consumo já

pode ser associada à síndrome de caquexia.

O segundo parâmetro clínico avaliado foi o nível séricos de escórias nitrogenadas. A

Ur aumenta à medida que declina a taxa de filtração glomerular (TFG), a taxa empregada para

definir e classificar a DRC [70]. Em camundongos saudáveis de oito semanas, o valor de

referência varia entre 38 e 47 mg/dL [71].

No grupo Ad, a Ur atingiu valores médios de 315 mg/dL (ou 7,5x o valor médio do

controle), já no grupo Ad+Met, apesar de elevada em comparação ao controle, ela apresentou-

se proporcionalmente menor, com valores médios de 223 mg/dL (ou 4,9x o valor médio do

controle; p<0,001).

Por apresentar interferências não relacionadas à TFG, a Ur, apesar de bastante

sensível, é pouco específica enquanto indicador de função renal. Assim, a Cr é o exame

bioquímico padrão para acompanhar a progressão da DRC [72]. Em camundongos saudáveis

de oito semanas, o valor da normalidade é entre 0,36 e 0,55 mg/dL [71].

Assim como ocorreu com a Ur, a Cr do grupo Ad+Met, ainda que alterada em

relação ao controle, mostrou-se significativamente reduzida se comparada ao grupo Ad (1,27

mg/dL versus 1,99mg/dL, respectivamente, ou 1,8x o controle versus 2,7x o controle;

p<0,0001).

Ressalta-se que, como confirmado por valores equivalentes de Ur e Cr ao do grupo

Ctrl, o grupo Met não apresentou alteração de função renal, o que implica que a dose de Met

administrada não detém qualquer efeito nefrotóxico mensurável durante o período de

execução do experimento.

Além dos parâmetros mais tradicionais de função renal, avaliou-se também a

expressão gênica de um marcador de lesão, a kidney injury molecule 1 (KIM-1), que vem

82

recebendo grande projeção na última década por se mostrar um indicador precoce e altamente

sensível de dano tecidual [73]. A KIM-1 é uma molécula sintetizada no túbulo renal proximal

quando este é submetido a situações de estresse, e sua mensuração em biópsias de tecido renal

e em urina, tanto de roedores como de humanos, revelou que ela se eleva muito antes que

alterações de ureia e creatinina sejam identificáveis [74].

Seu acompanhamento no curso de um insulto renal, qualquer que seja sua natureza,

ou aguda ou crônica, é de particular valia por ser dotado de valor prognóstico [75]. A

expressão de KIM-1 nos rins dos camundongos foi um espelho dos marcadores de função

renal, se elevando no grupo Ad consideravelmente em relação ao Ctrl, e se reduzindo no

Ad+Met em comparação ao Ad.

O último parâmetro clínico analisado foi o peso renal. É descrito que tanto

camundongos quanto ratos submetidos ao modelo de Ad apresentam peso do rim aumentado

em relação ao controle, o que se justifica pela deposição de cristais de Ad no interstício renal

[76,77]. Por outro lado, a substituição do parênquima por fibrose pode levar à atrofia renal

[78].

A importância da mensuração dos rins é tal que, na avaliação diagnóstica de DRC em

seres humanos, a redução do volume renal, avaliado por ultrassonografia, representa um fator

que favorece fortemente a suspeição de cronicidade da lesão [79].

Diante dos nossos resultados, postulamos que a Met age retardando o curso natural

da NTI: o grupo Ad não exibiu peso renal diferente do grupo Ctrl possivelmente em razão de

o órgão ter sofrido atrofia, o que compensou o aumento causado pela inclusão de cristais no

interstício. Já o grupo Ad+Met estaria num grau menos avançado da evolução da lesão, com

maior preservação do parênquima renal, daí resultando em rins aumentados de volume.

A histologia veio a comprovar essa hipótese. Um dado curioso foi que o número de

cristais de Ad no grupo tratado foi consideravelmente maior do que no não tratado, em

contraponto com o estudo de Yang et al. (2016), que, em um modelo de litíase renal por

etilenoglicol, demonstrou ser a Met, administrada pelas mesmas rota e dose adotadas em

nosso trabalho, capaz de reduzir a deposição de cristais de oxalato nos rins [80].

Verificamos, contudo, que o número de granulomas no grupo Ad foi maior do que no

Ad+Met. Assim, conjuntamente, esses dados apontam que a Met resultou em menor

fagocitose dos cristais, em benefício da função renal do grupo tratado.

Há evidências na literatura reportando que o modelo da Ad tem dois mecanismos

fisiopatológicos básicos: o primeiro seria puramente mecânico, representando pela obstrução

83

proporcionada pelos cristais nos túbulos, e o segundo teria um componente essencialmente

inflamatório, representando pela resposta do sistema imune aos cristais [81,82].

Nossos dados indicam que o componente inflamatório da lesão seria o fator causal

preponderante na perda da função renal, já que a maior quantidade de cristais no grupo

Ad+Met não implicou em piora dos marcadores avaliados. Isto nos motivou a investigar as

alterações desencadeadas pela Met nos MØ, o principal tipo celular envolvido na formação

dos granulomas, e que já havia sido anteriormente culpabilizado como o grande responsável

em nosso modelo de NTI [83].

A partir da análise IHQ para iNOS, acredita-se que, em uma fase inicial, os MØ M1

constituam o maior componente dos granulomas em formação, enquanto que, em uma fase

mais tardia, os principais constituintes dos granulomas maduros sejam os MØ M2. Nestes, os

MØ M1 ocupariam a posição mais central, circundando os cristais, e os MØ M2, a periferia.

Isso está de acordo com o já descrito para outras doenças granulomatosas, como a tuberculose

[84].

Os resultados da citometria de fluxo sugerem que a população CD45+ F4/80

high

CD11bhigh

possa representar os MØ teciduais, enquanto que a CD45+ F4/80

low CD11b

high

possa se tratar de monócitos infiltrantes, o que explicaria um maior aporte dessas células nos

rins lesionados, e uma redução de sua frequência relativa no grupo Ad+Met.

A Met teve um efeito quantitativo sobre os monócitos infiltrantes, mas não sobre os

residentes, que representam a população mais abundante. Fomos então tentar detectar efeitos

qualitativos da droga nessa outra população, caracterizando-a com os marcadores de

superfície CD86, mais comumente expresso em MØ classicamente ativados, e CD206,

expresso principalmente em MØ alternativamente ativados [85].

O CD86 é comumente expresso em situações nas quais o MØ é desafiado por

patógenos intracelulares, a exemplo do Toxoplasma gondii [86]. Em um contexto não

infeccioso, ele foi demonstrado em MØ alveolares de pacientes com sarcoidose [87] ou com

asma [88].

Por sua vez, o CD206 é expresso em MØ com tendências pró-fibróticas, sendo

induzido em ambientes ricos em IL-4 e TGF-β [89]. Uma situação na qual ele se encontra

particularmente elevado é a doença pulmonar obstrutiva crônica, condição em que o

parênquima pulmonar é gradativamente substituído por traves fibrosas, perdendo sua função

de troca gasosa [90].

A maior frequência de um marcador para M1 parece, a princípio, paradoxal face à

melhora clínica verificada no grupo Ad+Met. O fato de não ter havido diferença entre os

84

grupos Ctrl e Ad+Met quanto à expressão gênica nos rins das citocinas inflamatórias IL-6 e

TNF-α reforça ainda mais a noção de que a Met é capaz de atenuar a inflamação. A elevação

dessas citocinas foi inclusive demonstrada em diversos outros modelos experimentais de

DRC, tendo-se inclusive proposto, mais recentemente, que elas poderiam ser biomarcadores

úteis para avaliar a gravidade da insuficiência renal em humanos [91,92].

No que diz respeito à relação entre AMPK e inflamação, em um experimento in vitro

com MØ derivados da medula óssea (MDMO), Li et al. (2015), observaram que, ao tratarem

essas células com o soro de ratos urêmicos, elas passaram a expressar fortemente TNF-α e IL-

6, o que era simultaneamente acompanhado de profunda redução dos níveis da forma ativa da

AMPK (pAMPK). Ao terem esses níveis restaurados a valores fisiológicos, através da

administração do agonista AICAR ao meio de cultura, notou-se, por outro lado, diminuição

significativa da produção dessas citocinas [93].

Logo, a observação de que a população F4/80high

CD11bhigh

do grupo Ad expressa

mais CD206, enquanto que a do grupo Ad+Met, mais CD86, implica que esses grupos estão

em diferentes estágios evolutivos da lesão – a Met agiria retardando a progressão da doença.

Daí que, no mesmo timepoint em que os rins do grupo Ad já perderam sua função e estão

tomados por MØ M2, favoráveis à fibrogênese, os rins do Ad+Met ainda estariam com sua

função relativamente preservada, com uma inflamação mais branda em curso, por isso a maior

frequência dos MØ M1.

O TGF-β é a principal citocina envolvida no processo de perda da polaridade celular e

reorganização do citoesqueleto que, em conjunto, levam as células tubulares epiteliais e

adquirir características mesenquimais [94]. Tendo sido demonstrado que, dentre as células do

sistema imune, aquela que mais sofreu alterações pelo tratamento com Met foi o MØ, e que a

principal modificação observada foi um aumento da frequência de MØ M1, em detrimento de

MØ M2, acompanhado de diminuição da expressão de TGF-β, nosso próximo passo foi

investigar se a redução de estímulo pró-fibrótico implicaria em diminuição proporcional da

TEM.

Para tal, utilizamos o marcador de miofibroblasto αSMA, que se revelou bastante

reduzido no grupo Ad+Met relativamente ao Ad. Nosso resultado está em concordância com

o trabalho de Dong et al. (2017), que observou menor expressão de αSMA em rins

senescentes de ratos tratados com Met, na dose de 300 mg/kg/dia, por oito semanas [95].

A fibrose intersticial é o marco histológico da DRC. Uma vez que o tratamento com

Met redundaram em menos TEM, era de se esperar que isso viesse acompanhado de menor

produção de matriz extracelular (MEC). Foi exatamente isso o que verificamos, tanto através

85

de cortes de tecido renal corados com Picrosirius red, quanto pela expressão gênica de

colágeno I.

Nossos dados encontram respaldo em outros modelos de DRC experimental. Em um

modelo de nefrectomia subtotal em ratos, Satriano et al. (2013) demonstraram que a gavagem

de Met, na dose de 250 mg/kg/dia, por trinta dias, resultou em menores glomeruloesclerose e

fibrose medular e cortical no rim remanescente, avaliados por meio da coloração tricromo de

Masson [96]. Tikoo et al. (2016) obtiveram resultado semelhante em um modelo de disfunção

renal associada à obesidade: ratos alimentados com dieta hiperlipídica por dezesseis semanas

e, a seguir, tratados com Met, 100 mg/kg/dia, por via oral, durante oito semanas, apresentaram

significativamente menos fibrose glomerular e intersticial [97].

Para nos assegurarmos que a AMPK, nos MØ, é uma via crucial no desenvolvimento

da NTI induzida por Ad, utilizamos camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

. Sumariamente,

nossos experimentos sugerem que, apesar de a citometria não ter revelado diferenças no perfil

de polarização dos MØ entre os grupos Ad, o que corresponde aos achados clínicos, os rins

dos camundongos AMPK-/-

apresentaram um grau mais acentuado de fibrose do que os dos

camundongos AMPK+/+

.

Histologicamente os rins desse último grupo se encontravam piores em razão de a

ausência da quinase se correlacionar com a formação mais pronunciada de granulomas,

levando à maior distorção arquitetural que, tem como consequência final, a substituição do

parênquima normal por tecido fibrótico.

Parece, todavia, contraditório a ausência de AMPK nos MØ também não vir

acompanhada de gravidade clínica mais acentuada da NTI. Como a ativação da via por um

método farmacológico resultou em menor intensidade da lesão renal, o naturalmente esperado

seria que, se a via fosse bloqueada por meio de deleção gênica na célula considerada como a

principal impulsionadora da progressão da doença, esta se manifestaria de forma mais

exacerbada. Não foi isso o que constatamos, entretanto.

Apesar de contraintuitivo, esses dados podem ser justificados ao se retomar a análise

do blot para a pAMPK. É bastante evidente que, no contexto da NTI, há redução da expressão

da forma ativa da AMPK. O WB sugere que, na doença, a molécula se encontra

constitutivamente menos expressa, o que torna compreensível a ausência de diferença entre os

grupos AMPK+/+

e AMPK-/-

. Assim, seria necessário que houvesse um estímulo à sua

ativação para se notarem diferenças apreciáveis no comportamento dos MØ.

Para testar essa hipótese, tratamos com Met os camundongos com a deleção

condicional. O resultado evidenciou o que supúnhamos, e a melhora clínica observada no

86

grupo Ad +Met AMPK+/+

se deveu à adoção de um fenótipo anti-inflamatório pelos Mϕ.

Desta forma, provamos que a Met realmente age no curso evolutivo da NTI através dos MØ,

por uma via dependente de AMPK.

Contudo, observamos que, nos camundongos AMPK-/-, a expressão proteica de αSMA

se encontrava reduzida no grupo tratado com Met, indicando que a droga ainda exercia um

efeito benéfico residual. No sentido de explorar os possíveis mecanismos de atuação

secundários, fomos identificar outros alvos celulares da droga.

Embora o experimento com camundongos selvagens tenha insinuado que o efeito

mais pronunciado da Met foi sobre a polarização dos MØ infiltrando os rins doentes, a droga

ainda foi capaz de reduzir o processo fibrótico em camundongos com deleção seletiva da

molécula de AMPK nestas células. Isto deu abertura a duas hipóteses: ou 1) a Met também

estaria agindo também por uma via independente de AMPK nos MØ, ou (2) a Met teria outros

alvos celulares que, uma vez sofrendo modulação em seu metabolismo, adotariam um

comportamento contrário à progressão da NTI.

Para fornecer respostas a esses questionamentos, propusemos um segundo

experimento em camundongos C57BL/6, em que comparamos a eficácia do agonista da

AMPK com uma droga utilizada para depletar MØ do organismo, o CEL. Queríamos testar a

hipótese de a Met agir, via AMPK, em outros atores do processo inflamatório que, apesar de

secundários, têm sua importância posta em evidência assim que o macrófago sai de cena.

Nossa suposição foi validada: os camundongos tratados com CEL apresentaram uma

melhora da função renal tão pronunciada quanto aqueles recebendo Met, o que sublinha a

função do MØ enquanto célula definidora do curso da NTI; e os animais que receberam

ambas as drogas se saíram ainda melhores, indicando que, de fato, a Met estaria agindo em

outras células envolvidas na doença.

No modelo com camundongos selvagens, as análises da citometria não revelaram

diferenças entre os grupos quanto à frequência de linfócitos T CD4+ infiltrando os rins. O

experimento com o CEL, porém, tornou imperativo que se considerasse a intervenção dessas

células no estabelecimento da lesão.

Há estudos demonstrando que o LT CD4+ pode exercer papel relevante sobre a

progressão da fibrose renal propriamente dita, irrespectivamente de ser ou não ele o principal

envolvido na injúria inicial que tenha causado a fibrose [98,99]. Assim, buscou-se, em um

segundo experimento, melhor averiguar se a AMPK teria influência no comportamento dos

LT CD4. Os experimentos com camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

revelaram, entretanto,

87

que a vantagem conferida pela ativação da AMPK não resultou do papel da quinase em LT

CD4+, já que a frequência desses sequer se elevou nos grupos Ad em relação aos Ctrl.

Uma vez que a base fisiopatológica da lesão se dá na interação do binômio sistema

imune – órgão-alvo, procurou-se evidenciar se os efeitos benéficos da Met nesse modelo de

DRC não poderiam ser atribuídos, ao menos parcialmente, à sua ação direta nas células

vítimas do processo inflamatório, isto é, nas células tubulares renais.

A Met foi capaz de inibir a TEM de modo dependente de AMPK em nosso modelo

in vitro. Isso está em conformidade com o observado por Thakur et al. (2015), que também

demonstraram diminuição deste marcador mesenquimal em células epiteliais renais humanas

e fibroblastos intersticiais de ratos pré-tratados com Met [100]. Banerjee et al. sugeriram que

o mecanismo de ação por trás disso seria a inibição da via da MAPK/ERK pela AMPK [66].

Em seguida, tentou-se estabelecer se a resistência, conferida pela Met, das CTERM à

TEM era acompanhada de mudanças no seu metabolismo. De fato, a Met ocasionou aumento

da captação de glicose e ativação da via glicolítica nessas células. Já foi descrito que o

tratamento de células neoplásicas com Met leva preferencialmente à ativação da via glicolítica

[99]. Em contraponto, Kang et al. (2015) demonstraram, em um trabalho a respeito de

defeitos no metabolismo de células tubulares durante a fibrose renal, que o TGF-β promove

redução de enzimas relacionadas ao metabolismo da glicose [101].

No nosso experimento, foi verificado que, ao se acrescentar ao meio de cultivo Met

previamente ao TGF-β, ocorreu um aumento expressivo do transportador de glicose Glut2,

cuja densidade de banda no WB foi restaurada a valores comparáveis ao grupo NS. Por outro

lado, a adição de CompC resultou em redução ainda mais acentuada da expressão do

transportador.

Esse resultado encontra eco no que já foi descrito acerca da ação da Met sobre a

expressão de transportadores de glicose em outros tecidos: no tecido adiposo, por exemplo,

tem-se estabelecido que ela é responsável por elevar os níveis de Glut4, a isoforma mais

abundante nos adipócitos [102,103].

6 CONCLUSÃO

89

O presente estudo permite concluir que:

(i) A Met apresenta papel protetor na NTI crônica induzida por Ad;

(ii) A preservação da função renal está associada ao aumento da fosforilação da

AMPK no tecido renal;

(iii) A principal célula modulada pela Met no contexto da lesão renal por Ad é o MØ;

(iv) O tratamento com Met resulta em redução do número de granulomas envolvendo

cristais de adenina nos rins, se associando a maior preservação arquitetural do tecido;

(v) marcador de miofibroblasto αSMA é fortemente expresso nos rins doentes, e a

Met leva à normalização para níveis verificados em rins saudáveis;

(vi) O colágeno I, principal componente da matriz extracelular na fibrose intersticial

que caracteriza a DRC, tem sua expressão diminuída pela Met;

(vii) Os camundongos com deleção seletiva de AMPK nos MØ não apresentam

diferenças na função renal quando comparados aos AMPK selvagem, o que pode ser

explicado por a fração ativa da quinase se encontrar menos expresa no contexto da doença;

(viii) A administração de Met aos camundongos LyzM-cre AMPK-/-

não exerce

influência sobre a gravidade da doença, enquanto que esta é amenizada de forma apreciável

naqueles LyzM-cre AMPK+/+

, comprovando que a modulação do MØ proporcionada pela

droga tem um mecanismo dependente de AMPK (Figura 54);

(ix) Ainda assim, os camundongos LyzM-cre AMPK-/-

expressam menos αSMA

nos rins, apontando que a ativação de AMPK em outras células também contribui para os

efeitos benéficos da Met;

(x) A associação de CEL, uma droga depletora de MØ, com a Met proporciona

melhora clínica ainda mais acentuada, ratificando a existência de outros alvos celulares do

agonista de AMPK;

(xi) O infiltrado linfocitário no rim e no linfonodo renal dos grupos Ad não apresenta

diferenças comparativamente aos grupos controles em camundongos CD4-cre AMPKflox/flox

,

excluindo os LT CD4 como células relevantes no estabelecimento da lesão;

(xii) O tratamento de CTERM com Metresulta em aumento da fosforilação da

AMPK e em resistência à TEM induzida por TGF-β; e

(xiii) A resistência verificada se associa a uma mudança do perfil metabólico dessas

células, que passam a captar mais glicose, expressar mais Glut2, e ativar a via glicolítica.

O mecanismo molecular e celular proposto para a ação da Met na NTI induzida por

Ad encontra-se sumarizado na Figura 55.

90

Figura 54 - Esquema representativo do mecanismo de ação da metformina na nefrite

tubulointersticial induzida por adenina em camundongos LyzM-cre AMPKflox/flox

.


91

Figura 55 - Sumário gráfico.

A adenina é convertida em cristais insolúveis de 2,8-diidroxiadenina pela xantina oxidase, os quais se depositam

no interstício renal. Nos camundongos selvagens não tratados (esquema à esquerda), ocorre ativação dos

macrófagos residentes e recrutamento de monócitos infiltrantes que, juntos produzem citocinas pró-

inflamatórias, como IL-6 e TNF-α. A lesão inflamatória, juntamente da obstrução mecânica promovida pelos

cristais, leva à destruição do epitélio tubular. Concomitantemente, células epiteliais, sob o estímulo de citocinas

92

pró-fibróticas, como o TGF-β, sofrem transição epitélio-mesenquimal, se transformando em miofibroblastos

produtores de matriz extracelular. Assim, progressivamente, o parênquima é substituído por tecido fibrótico. O

tratamento com metformina (esquema à direita) leva à fosforilação de AMPK em macrófagos e células tubulares

epiteliais. Nestas, ela induz aumento da expressão do transportador de glicose Glut2, ao que se associa maior

captação de glicose e ativação da via glicolítica, alterações metabólicas que tornam as células resistentes à TEM.

Naqueles, a ativação da AMPK inibe a inflamação, resultando em menor formação de granulomas e,

consequentemente, menor deterioração da arquitetura tubular. Os rins tratados com metformina, desta forma,

apresentam menos marcadores de fibrose (αSMA e colágeno) e têm sua função preservada. Fonte: autoria

própria.

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marina barguil macÊdo · universidade de sÃo paulo instituto de ciÊncias biomÉdicas candidata:...

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