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Universidade de São Paulo
Instituto de Química
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Bioquímica)
Mariana Canale Manzini
Efeito da Carga dos Lipídios na
Interação do BP100 em Modelos de
Membrana
Versão corrigida da Dissertação defendida
São Paulo
Data do Depósito na SPG:
31/10/2011
Mariana Canale Manzini
Efeito da Carga dos Lipídios na
Interação do BP100 em Modelos de
Membrana
Dissertação apresentada ao Instituto de
Química da Universidade de São Paulo para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências (Bioquímica)
Orientadora: Profa
. Dra. Iolanda Midea Cuccovia
São Paulo
2011
Aos que mais amo, minha mãe Maria, meu pai Pedro,
minha avó Rosa, meu namorado Bruno e minha ex-cachorrinha Mili.
AGRADECIMENTOS
À Profª Dra. Iolanda Midea Cuccovia, pela orientação, confiança e amizade.
Obrigada por sempre me incentivar a continuar. E também por me permitir conhecer
e trabalhar com pessoas incríveis. Obrigada pela paciência.
À Profª Dra. Katia Regina Perez Daghastanli, por me orientar, por sempre
estar disposta a esclarecer minhas dúvidas e por me ensinar tudo muito direitinho!
Por me ajudar na UNIFESP, pelas caronas e cafezinhos!
Ao Profo
À Profª Dra Karin do Amaral Riske, por ter permitido a utilização do
Laboratório de Membranas na UNIFESP, pela colaboração, disponibilidade e
atenção. Pelas discussões, propostas e grande ajuda.
Dr Hernan Chaimovich, pelo laboratório, leitura de relatórios e
conselhos.
Ao Profo
Marcelo Bemquerer e Magali Rodrigues pela síntese do BP100.
Dr. Antonio de Miranda, pela grande ajuda, idéias e por ter
permitido o uso do aparelho de dicroísmo circular.
Aos meus amigos de laboratório Bianca, Catarina, Deborah, Gustavo, Filipe,
Louise, Marcos, Vanessa e a técnica Márcia, que me acompanharam e me
divertiram durante meus dias de mestrado.
Às minhas amigas, com as quais cursei as disciplinas da pós-graduação,
Cecília, Gabriela e Mariana que se tornaram grandes companheiras.
À Tatiana da UNIFESP por ter me acompanhado e me ensinado a técnica do
dicroísmo circular.
Aos meus pais, minha avó e meu namorado, que sempre me apoiaram e
estiveram comigo em todos os momentos. Pela alegria, conforto, confiança, carinho
e por se dedicarem tanto a mim.
Ao CNPQ, pela bolsa concedida para meu mestrado.
À FAPESP e ao INCT-Cx (Instituto Nacional de Ciência e tecnologia de
Fluidos Complexos), pelo financiamento do laboratório.
Ao Laboratório de Sistemas Biomiméticos, por oferecer as condições
necessárias para execução deste trabalho.
“A felicidade não é a ausência de conflitos, é a habilidade para lidar com eles.
”
RESUMO
Manzini, M. C. Efeito da Carga dos Lipídios na Interação do BP100 em Modelos
de Membrana, 2011, 135 p. Dissertação – Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são uma alternativa promissora aos
antibiróticos. Os AMPs, compostos de menos de 80 aminoácidos, apresentam
caráter anfipático o que lhes dá a capacidade de agir em membranas lipídicas.
Podem formar poros na membrana causando morte da célula. Seu espectro de ação
é variado, sendo seus alvos bactérias até células de mamíferos.
Os AMPs são encontrados em todos os seres vivos, desde bactérias, plantas,
insetos e mamíferos, apresentam diferentes estruturas, composição de aminoácidos
e agem por diversos mecanismos. Dois peptídeos antimicrobianos têm sido
estudados por sua grande eficiência: a Cecropina A, peptídeo não hemolítico e que
sofre degradação por proteases, e a Melitina, de grande potencial antimicrobiano,
mas que apresenta atividade hemolítica hemólise.
Para se obter uma melhor ação terapêutica, foram sintetizados híbridos de
Cecropina e Melitina, dentre eles, o BP100, cuja sequência é KKLFKKILKYL-NH2. O
BP100, além de atuar sobre a membrana de bactérias causando a sua morte, é
pouco hemolítico e possui alta seletividade por membranas carregadas
negativamente, o que é característica das membranas bacterianas.
Estudamos a interação do BP100 com vesículas unilamelares grandes, LUVs
obtidas por extrusão, preparadas com misturas de fosfatidilcolina de ovo (PC) e
fosfatidilglicerol (PG) utilizando técnicas de fluorescência, dicroísmo circular,
mobilidade eletroforética, espalhamento de luz dinâmico e microscopia óptica (neste
caso utilizando-se vesículas gigantes, GUVs), a fim de obter informações sobre o
mecanismo de ação do BP100.
Nossos resultados mostraram que o BP100 permeabiliza LUVs preparadas
com diferentes misturas de PC:PG, mesmo em alta força iônica. A presença de
carga negativa nas LUVs aumenta significativamente a atividade do peptídeo
enquanto o colesterol diminui a sua atividade.
Quanto a sua estrutura secundária, em meio aquoso o BP100 apresentou
uma estrutura ao acaso. Na presença de vesículas de PC sua estrutura não
apresentou alteração e em vesículas de PC:PG, observou-se estrutura típica de alfa-
hélice.
Mostrou-se também que as LUVs de PC não se agregam na presença de
BP100, mas o peptidio altera a sua mobilidade eletroforética. Nas LUVs contendo
PG, entretanto, observou-se agregação e alteração da mobilidade eletroforética,
confirmando a forte ligação do BP100 a essas vesículas.
A observação direta da ação do BP100 sobre as GUVs preparadas com PC e
PC:PG, mostrou que o peptídeo forma agregados na superfície da membrana e
diminui o diâmetro das GUVs. Observou-se agregação de vesículas, formação de
brotos na superfície das vesículas e, posteriormente, rompimento das mesmas com
o vazamento de todo conteúdo interno.
O conjunto dos dados obtidos é sugestivo de que o BP100 atua formando
estruturas similares a poros na membrana das vesículas, através dos quais o
conteúdo interno extravasa. A formação de estrutura em α -hélice do BP100 em
LUVs contendo PG que deve favorecer estruturação do poro.
Palavra-chave: BP100, pepídio antimicrobiano, membranas, LUVs, GUVs.
ABSTRACT
Manzini, M. C. Charge Effect of Lipids in Interaction of BP100 and Model
Membranes, 2011, 135 p. Master Thesis – Graduate Program in Biochemistry.
Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Antimicrobial peptides (AMPs) have been a promising alternative therapy to
antibiotics. These molecules, consisting of less than 80 amino acids, with different
structures and amino acids composition, have amphipathic character which gives
them the ability to act on lipid bilayers. They act, by different mechanisms, over
bacteria to mammal cells.
The AMPs are found in all kinds of living creatures, bacteria, plants, insects
and mammals. Two important antimicrobial peptides have been studied because of
their high efficiency: the Cecropin A, a non-hemolytic peptide which undergoes
degradation by proteases, and Melittin, which has high antimicrobial potential but
with hemolytic activity.
In order to obtain peptides with better therapeutic action, hybrids peptides of
Cecropin and Mellitin were synthesized. One of them, BP100, which has the
sequence KKLFKKILKYL-NH2, is a target of several studies because it acts on
bacteria´s membrane causing it´s death, but do not cause hemolysis and has a high
selectivity for negatively charged membranes, characteristic of bacterial membranes.
Here we study the properties of BP100 and its interaction with large
unilamellar vesicles, LUVs, prepared with egg phosphatidylcholine (PC) and
phosphatidylglycerol (PG) by extrusion. Fluorescence techniques, circular dichroism,
CD, electrophoretic mobility, dynamic light scattering and optical microscopy with
giant vesicles (GUVs) were used in order to obtain informations about its action
mechanisms.
Our results showed that BP100 is able to cause leakage of vesicles prepared
with different mixtures of PC:PG, even at high ionic strength. The increase in
negative charge of the vesicles significantly raises the activity of the peptide whereas
the presence of cholesterol decreases its activity.
The secondary structure of BP100 was studied by CD technique in water and
a random coil structure was observed. In the presence of PC vesicles, BP100 did not
change its structure. However, it aquires a typical alpha-helix structure in the
presence of negative vesicles of PC:PG.
Analysis of hydrodynamic diameter of LUVs in the presence of BP100 showed
that BP100 didn’t cause significant change in PC vesicles diameter but,with anionic
vesicles at low ionic strength, large aggregates are formed. BP100 also changed the
electrophoretic mobility of both LUVs containing only PC and mixtures of PC:PG,
confirming the binding of BP100 at all membranes.
The data set obtained is suggestive that BP100 acts binding to the vesicle
membrane forming pores through which the internal contents overflows. The
negative surface of the vesicle induces BP100 to acquire an α-helix conformation
which favors the formation of a pore structure.
BP100 also forms aggregates at the membrane surface of giant lipid vesicles
(GUVs) and reduce its diameter. Aggregation of vesicles, formation of buds on the
vesicle´s surface and finally the rupture and leakage of internal contents was also
observed in GUVs of PC and PC:PG.
Keywords: BP100, membranes, LUVs, GUVs.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 141.3 Peptídeos antimicrobianos, contexto histórico. ................................................. 141.4 Propriedade química dos AMPs ........................................................................ 171.5 Modo de ação dos peptídeos antimicrobianos .................................................. 191.6 Composição das membranas ........................................................................... 221.7 Aplicação dos AMP ........................................................................................... 241.8 A Melitina .......................................................................................................... 241.9 Cecropina A ...................................................................................................... 281.10 O peptídeo BP100 ............................................................................................ 301.11 Descrição de algumas moléculas utilizadas ..................................................... 322. OBJETIVOS .................................................................................................... 352.1 Objetivo Geral: .................................................................................................. 352.2 Objetivos Específicos: ....................................................................................... 353. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 363.1 Material ............................................................................................................. 363.1.4 Aparelhos ..................................................................................................... 373.2 Métodos ............................................................................................................ 383.2.4 Dosagem de Fosfato inorgânico ................................................................... 383.2.5 Dosagem do Colesterol ................................................................................ 383.2.6 Purificação da Carboxifluoresceína .............................................................. 393.2.7 Determinação da concentração da solução de BP100 ................................. 393.2.8 Síntese do Peptídeo BP100 ......................................................................... 393.2.9 Preparação das Vesículas Unilamelares Grandes (LUVs) ........................... 413.2.10 Fluorescência ............................................................................................... 433.2.11 Supressão de Fluorescência ........................................................................ 443.2.12 Preparação de LUVs contendo 5(6)-carboxifluoresceína ............................. 453.2.13 Cinética de Vazamento das LUVs com Carboxifluoresceína ........................ 463.2.14 Estudo da supressão de fluorescência de Pireno Tetrasulfonato de Sódio (PTS) por Metilviologênio (MV) .................................................................. 473.2.15 Preparação de LUVs com Pireno Tetrasulfonato de Sódio (PTS) ................ 513.2.16 Cinética de vazamento de LUV contendo PTS em presença de Metilviologênio. .......................................................................................................... 513.2.17 Determinaçao da Mobilidade Eletroforética e Potencial Zeta ....................... 523.2.18 Determinação do Diâmetro Hidrodinâmico ................................................... 543.2.19 Preparação das LUVs para os experimentos de diâmetro hidrodinâmico e mobilidade eletroforética ........................................................................................... 553.2.20 Dicroísmo Circular ........................................................................................ 563.2.21 Preparação das amostras para o Dicroísmo Circular, CD: ........................... 603.2.22 Preparação de Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs) ............................ 613.2.23 Microscopia Óptica ....................................................................................... 634. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 644.1 Estudo da cinética de vazamento de LUVs contendo 5(6)-carboxifluoresceína (CF) 644.1.4 Estudo do efeito de BP100 em LUVs de PC 100%. ..................................... 654.1.5 Cinéticas de vazamento de CF de LUVs de PC:PG 9:1 com BP100. .......... 684.1.6 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 8:2 com BP100. ......................... 69
4.1.7 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 7:3 com BP100. ......................... 714.1.8 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 6:4 com BP100. ......................... 724.1.9 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 1:1 com BP100. ......................... 744.1.10 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 4:6 com BP100. ......................... 754.1.11 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 3:7 com BP100. ......................... 764.1.12 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 1:9 com BP100. ......................... 784.1.13 Cinéticas de vazamento de CF de PG 100% com BP100. ........................... 794.2 Efeito de BP100 na Cinética de Vazamento de CF de LUVs contendo Colesterol .................................................................................................................. 814.2.4 LUVs de PC:Colesterol 63:37 ....................................................................... 814.2.5 Cinética de LUVs de PG:colesterol 64:36 com BP100 ................................. 834.3 Estudo do Vazamento de Vesículas Contendo Pireno-tetrasulfonato de sódio (PTS) com a Adição de BP100 a Baixa Força Iônica. ............................................... 874.3.4 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC 100% com BP100. .......... 884.3.5 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 7:3 com BP100. ........ 904.3.6 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 1:1 com BP100. ........ 914.3.7 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 7:3 com BP100. ........ 934.3.8 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PG 100% com BP100. .......... 944.4 Resultados dos Estudos de Dicroísmo Circular ................................................ 984.4.4 Dicroísmo Circular do BP100 em água ......................................................... 984.4.5 Estudo de Dicroismo Circular do BP100 em água com LUVs de PC 100% . 994.4.6 Estudo de Dicroismo Circular do BP100 em água com LUVs LUVs de PC:PG 9:1 ............................................................................................................... 1004.4.7 Estudo de Dicroismo Circular do BP100 em água com LUVs de PC:PG 7:3
1014.4.8 Estudo de CD de BP100 em água com LUVs de PC:PG 1:1 ..................... 1044.5 Estudos de Mobilidade Eletroforética das LUVs com BP100 .......................... 1064.6 Estudo do efeito de BP100 no Diâmetro Hidrodinâmico das Vesículas .......... 1114.7 Microscopia Óptica de GUVs em presença do BP100 .................................... 1135. CONCLUSÕES ............................................................................................. 1256. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................. 127SÚMULA CURRICULAR ......................................................................................... 135
ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES
-ACN - Acetonitrila
-AMPs – Peptídeos antimicrobianos
-CHE – Colesterol esterase
-CF - Carboxifluoresceína
-Col – Colesterol
-DIC - N,N’-diisopropilcarbodiimida
-DMF - N,N-dimetilformamida
-GUVs – Vesículas Unilamelares Gigantes
-HOBt - 1-hidroxibenzotriazola
-ITO - Óxido de índio-titânio
-LPS - Lipopolissacarídeos
-LUVs – Grandes Vesículas Unilamelares
-MIC – Mínima Concentração Inibitória
-MS - espectrometria de massas -MV – Metil Viologênio
-POPC - Palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina
-POPG - Palmitoil-oleoil-fosfatidilglicerol
-PTS – Pireno Tetra Sulfonato de Sódio
-TFA - Ácido trifluoracético
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1. INTRODUÇÃO
1.3 Peptídeos antimicrobianos, contexto histórico.
O primeiro relato do controle de crescimento de bactérias isoladas em
culturas foi em torno de 1870 por Pasteur, Joubert e Koch (Korolkovas e
Burckhalter,1982). Esse foi um marco na história, possibilitando desenvolvimento e
descoberta de técnicas para o controle de infecções.
Em 1928 a descoberta da Penicilina (Figura 1B) por Alexander Fleming
causou uma revolução na medicina. A molécula promissora foi isolada do Penicillium
notatum e foi amplamente utilizada na 2a
Na década de 30 foi descoberto o potencial antibiótico da sulfonamida. Já na
década de 40, foram isoladas a actinomicina (1940), estreptotricina (1942),
estreptomicina (1943) e a neomicina (1949). Com o desenvolvimento de novas
técnicas de síntese, e pesquisas ampliando-se em diversos países, nesta mesma
época surgiram a bacitracina, o cloranfenicol (Figura 1A), a clortetraciclina,
oxitetraciclina, eritromicina, anfomicina, oleandomicina, espiramicina, vancomicina,
canamicina, paronamicina e as rifampicinas.
Guerra Mundial, época em que também foi
desenvolvida a benzilpenicilina. A partir deste momento, muitas moléculas foram
isoladas e desenvolvidas com grande potencial para matar bactérias (Korolkovas e
Burckhalter, 1982).
Devido ao “boom” de descobertas, as décadas de 40 a 60 foram chamadas
de “época de ouro da descoberta dos antibióticos”. Logo após, as descobertas
continuaram, porém em menor intensidade (Korolkovas, Burckhalter, 1982).
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O uso incorreto de antibióticos, tratamento incompleto de infecções e o
consumo inapropriado e excessivo, muitas vezes sem orientação médica e sem
identificação prévia dos agentes patogênicos através de exames laboratoriais,
colaboraram para o surgimento de bactérias resistentes a essas moléculas
antimicrobianas apesar do grande número de antibióticos de última geração
existentes (Daffre et al., 2001).
Figura 1. A-Estrutura da molécula de Cloranfenicol. B- Estrutura da Penicilina.
Entre os mecanismos de defesa desenvolvidos pelos microorganismos estão:
a presença de enzimas que degradam os antibióticos tais como a β -lactamase,
existente principalmente em estafilococus, que clivam o anel β-lactâmico da
penicilina e cefalosporinas; a enzima cloranfenicol-acetiltransferase, encontrada em
bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, que inativa o cloranfenicol. Outros
mecanismos, já bastante estudados, são a fosforilação, adenilação ou acetilação de
antibióticos aminoglicosídeos. Variações na proteína da subunidade 30S do
ribossomo de bactérias, que diminuem a ligação dos antibióticos aminoglicosídeos,
mutações na subunidade 50S do ribossomo, responsável pela resistência a
eritromicina e diminuição de ligação por fluorquinolonas e alterações da RNA-
polimerase, que causam diminuição na ação da rifampicina, são exemplos de
16
mutações em microorganismos que os tornam resistentes aos fármacos conhecidos
(Rang et al., 2004, Tenover, 2006).
Outros mecanismos envolvem as porinas, proteínas que funcionam como
bombas de efluxo do antibiótico para fora da célula bacteriana, e alterações da
membrana externa de bactérias envolvendo componentes polissacarídeos, alterando
a permeabilidade à ampicilina, dentre outros agentes antimicrobianos (Rang et al.,
2004).
Por estas razões, a pesquisas por novas classes de moléculas que atuem
como agentes antimicrobianos tornaram-se incessante nos últimos anos, além de
emergencial. Em contrapartida ao aparecimento de resistência às moléculas
antimicrobianas já existentes, em 1969 ocorreu o primeiro relato de um peptídeo
com atividade hemolítica e antimicrobiana. Este foi o peptídeo Bombinina, uma
molécula de 24 aminoácidos proveniente da secreção subcutânea do anuro
Bombina variegata.
Na década de 80 foram isoladas as magaininas de Xenopus laevis e a partir
deste ponto na história, deu-se início a pesquisas mais aprofundadas dessas
promissoras moléculas (Prates & Júnior, 2000).
Em 2003 Bomam mostrou, em experimentos in vivo, que cerca de 2 x 107
células bacterianas eram eliminadas por dia na boca de sapos. Estes achados
corroboravam as suspeitas de que deveria existir algum mecanismo alternativo que
controlasse a replicação desses microorganismos nesse ambiente. Além disso, esse
controle também deveria ser o responsável pelos seres humanos não serem
infectados pela sua flora bacteriana intestinal, pois cerca de 2 kg de
microorganismos vivem no seu trato digestivo e 200 g nas superfícies (Boman,
2003). Essas observações levaram cientistas de todo o mundo a isolar moléculas
17
que apresentassem atividade antimicrobiana. Grande parte dessas moléculas eram
de natureza peptídica, os chamados peptídeos antimicrobianos (AMP), provenientes
de plantas (Garcia-Olmedo et al., 1998, Padovan et al., 2010), animais vertebrados e
invertebrados (Bulet et al., 1999; Daffre et al., 2001; Janssen et al., 2006) além de
bactérias (Fontoura, R. & Brandelli, A., 2008).
Diferentes AMP têm apresentado um amplo espectro de ação, sendo efetivos
contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Brogden, 2005), fungos,
protozoários, envelopes virais (Daffre et al., 2001, Bulet et al., 2004) e,
recentemente, têm sido estudados como possíveis moléculas de combate às células
tumorais (Mader & Hoskin, 2006). Isto faz o estudo dos AMPs uma futura alternativa
ao uso de antibióticos convencionais, especialmente no tratamento de infecções
geradas por microorganismos resistentes a antibióticos já usados (Ferre et al.,
2009).
1.4 Propriedade química dos AMPs
Quanto às propriedades químicas, os AMP são, em grande maioria,
moléculas anfipáticas e catiônicas (Dempsey et al., 2010, Brogden, 2005). Possuem
de 10 a 80 resíduos de aminoácidos sendo, freqüentemente, 50% resíduos
hidrofóbicos e 50% resíduos hidrofílicos carregados positivamente em pH fisiológico.
A região catiônica da molécula é responsável pela sua atração por membranas
aniônicas de bactérias e, por fim, a conformação e composição dos AMPs permitem
a formação de estruturas que causam a morte do microorganismo (Ferre et al., 2009;
Brodgen, 2005).
A composição de aminoácidos e a estrutura secundária de um AMP são
importantes para definir as suas características hidrofílicas e hidrofóbicas, capazes
de causar maiores ou menores interações com os diferentes tipos de membranas. A
18
sua composição é capaz de definir estruturas em α-hélice, dobrada (em grampo),
randômica e outras, dependendo do meio em que a molécula se encontra, e ainda
determinam domínios que irão interagir com superfícies ou se inserir no interior
hidrofóbico da membrana dos microorganismos (Zhang et al., 2001; Jenssen et al.,
2006, Giangaspero et al., 2001, Epand et al. 2010, Nguyen et al. 2010).
Os peptídeos antimicrobianos são agrupados em quatro principais classes de
acordo com sua composição de aminoácidos e conformação (Brogden, 2005, Figura
2):
(1) Peptídeos lineares com hélices anfipáticas como a magainina (Zasloff,
1987).
(2) Folhas-β estabilizadas por ligações dissulfeto como a defensina A, isolada
da larva do mosquito Phormia terranovae (Dimarcq et al., 1990; Schmidt et al.,
2011).
(3) Peptídeos com predominância de certo aminoácido em sua sequência,
como a histatina presente na saliva de humanos, que tem alto teor de histidina
(Hertog et al., 2004).
(4) Peptídeos com estruturas em clipe (loop) devido à presença de ligação de
dissulfeto, como a gomesina isolada de hemolinfa da aranha brasileira
Acanthoscurria gomesiana (Silva et al., 2000).
(5) Peptídeos estendidos como a indolizidina, isolada de neutrófilo bovino
(Falla et al., 1996).
Existe ainda na literatura trabalhos que reportam o potencial antimicrobiano
de peptídeos aniônicos, ricos em aspartato e glutamato, como o peptídeo maximina
H5, isolado do anfíbio Bombina máxima, que parece ser específico contra
Staphylococcus aureus (Lai et al., 2002, Harris et al., 2011). Também o peptídeo
19
aniônico dermicidina (DCD), isolado de glândulas sudoríferas de humanos, tem um
espectro de ação antimicrobiano mais amplo (Schittek et al., 2001). No entanto, o
mecanismo de ação destes peptídeos aniônicos ainda não está esclarecido.
Outra classe de peptídeos são os isolados de fragmentos de proteínas como
a lactoferricina oriunda da clivagem da lactoferrina (Neto, 2006), a casocidina 1 da
caseína (Somkuti et al., 2009) ou o Hb 33-61 da hemoglobina (Ivanov et al., 1997;
Sforça et al., 2005).
Alguns tipos de estrutura como a mista (várias estruturas em uma mesma
molécula), em loop, em dobra β, em α hélice e linear estão representadas na Figura
2 com alguns exemplos de peptídeos (Janssen et al., 2006).
Figura 2. Classes estruturais de peptídeos antimicrobianos. (A) Estrutura mista da β-defensina-2 humana; (B) Estrutura em loop; (C) Estrutura em dobra β; (D) Estrutura em alfa-hélice da magainin-2; (E) Indolicidina estendida. As pontes de dissulfeto estão representadas como uma linha amarela. Figura retirada de Janssen, et al. 2006.
1.5 Modo de ação dos peptídeos antimicrobianos
Uma das hipóteses sobre o mecanismo de ação dessas moléculas envolve a
habilidade dos AMPs causarem um colapso na membrana devido a formação de
poros, através da interação com os lipídios da superfície celular dos
microorganismos. Esse poros tornam a célula mais permeável, levando-a a morte.
Os peptídeos também podem penetrar na membrana celular, sem formar poros,
alcançam o ambiente citosólico e interferem na síntese de biomoléculas importantes
para a sobrevivência do microorganismo, resultando em vazamento de íons e
20
metabólitos, despolarização da membrana e interrupção do processo de respiração,
síntese de biopolímeros e morte celular (Figura 3 A) (Jansen et al. 2006; Daffre et al.
2001).
De acordo com a teoria de formação dos poros, os peptídeos catiônicos são
atraídos para a superfície das membranas por atração eletrostática devido a carga
negativa de moléculas como os fosfolipídeos, lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias
Gram-negativas, e ácido teicóico de bactérias Gram-positivas, que se localizam
assimetricamente na arquitetura da membrana celular desses microorganismos.
Além disso, a carga positiva dos resíduos de aminoácidos que constituem os AMPs
também interage com os lipídeos de membrana através de receptores específicos
pode ativar vários mecanismos que podem levar a morte celular e a interação do
AMP com os lipídeos de membrana pode formar estruturas semelhantes a poros os
quais também levam a morte da célula (Pelegrini et al., 2011).
Parâmetros intrínsecos e extrínsecos têm sito reportados como determinantes
para um limiar de concentração de peptídeo antimicrobiano na superfície da
membrana do microorganismo causar a morte celular, a concentração mínima para a
inibição do crescimento das bactérias em cultura, chamada MIC.
Os parâmetros intrínsecos (que dependem das características do próprio
peptídeo) seriam fatores que incluem a capacidade dos peptídeos se acomodarem e
se oligomerizarem na membrana, enquanto os extrínsecos são determinados pela
composição lipídica e fluidez da membrana e estrutura da cabeça polar do lipídeo.
Esses fatores influenciam o potencial de membrana, que é um fator crítico para
definir a concentração de peptídeo necessária para causar a lise/morte celular
(Yearnam & Yount, 2003). Há três mecanismos de ação propostos para a atuação
dos AMPs sobre as membranas:
21
1- Poros em forma de barril (Figura 3 C):
Após atingir uma determinada concentração no meio, os peptídeos inserem-
se na membrana de forma que vários monômeros interajam entre si lateralmente,
formando um canal que atravessa a membrana de um lado para outro. Os peptídeos
formam um anel em forma de barril, abrindo um poro na membrana (Janssen et al.,
2006).
2- Poros toroidais (Figura 3 B):
O poro toroidal é uma estrutura transmembrana formada por peptídeos que se
inserem na bicamada formando um complexo alternado de peptídios e lipídios entre
suas cadeias. Nesse caso, o poro é composto por lipídios intercalados com os
peptídeos (Janssen et al. 2006, Pelegrini et al. 2011).
3- Mecanismo de carpete (Figura 3 D):
Esse mecanismo é caracterizado, inicialmente, pela ligação dos peptídeos em
sua forma monomérica ou oligomérica na superfície da membrana celular por uma
atração eletrostática, recobrindo a membrana. Esse modo de ação é semelhante a
formação de um carpete de peptídeos na membrana bacteriana e,
consequentemente, esse carpete causa deslocamento de lipídeos alterando a
fluidez da membrana e reduzindo a sua propriedade de barreira celular. Assim, a
bicamada lipídica tem sua curvatura modificada pela formação desses complexos de
lipídeos e peptídio ocorrendo a ruptura e lise celular. Nesse processo, o dano celular
ocorre resultando numa dispersão de moléculas sem a formação de um poro
(Yearnam & Yount, 2003, Pelegrini et al. 2011).
22
Figura 3. Modelos de ação do peptídeo antimicrobiano. Em amarelo, a membrana plasmática. O cilindro representando o peptídeo, seu lado vermelho é o de característica hidrofílica e o lado azul é o de caráter hidrofóbico. A) Inserção do peptídeo na membrana, translocação e interferência na síntese de biomoléculas. B) Mecanismo de formação do poro toroidal (inserção do peptídeo formando um canal alternado com o lipídio). C) Modelo de poro em barril (o peptídeo se insere formando um canal). D) Mecanismo carpete (o peptídeo solubiliza a membrana formando micelas) (Jensen et at. 2006).
1.6 Composição das membranas
Independentemente do tipo de perturbação que o peptídeo exerce sobre a
membrana, a atração inicial do AMP é eletrostática, uma vez que estas moléculas
são policatiônicas e as membranas de bactérias são carregadas negativamente
(Huang, 2000).
Apesar de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas serem muito mais
complexas que modelos de membranas, estes microorganismos apresentam uma
carga superficial negativa oriunda da presença de fosfolipídeos ácidos, grupos
23
fosfato dos lipopolissacarídeos (bactérias Gram-negativas) e do ácido teicóico
(bactérias Gram-positivas) (Brogden, 2005).
A Tabela 1 mostra a composição lipídica da E. coli e da membrana da
hemácia. A membrana da E. coli apresenta 42% de carga negativa, somando-se o
fosfatidilglicerol que possui uma carga negativas por molécula e a cardiolipina que
possui duas cargas negativas por molécula. A membrana da hemácia possui
composições diferentes na sua parte interna, com lipídios negativos e neutros, e na
parte externa, com lipídios neutros somente. Essa composição de lipídios e a razão
de carga foram utilizadas para a construção de vesículas utlizadas em nossos
experimentos.
Tabela 1. Composição lipídica, em porcentagem, da membrana da E. coli e da membrana do eritrócito (Rouser et al. 1968).
Composição lipídica
(% molar)
Carga líquida
do lipídio
Lipídios da membrana da
E. coli
Lipídios totais da membrana do
eritrócito
Ácido fosfatídico -1 0 1,5
Fosfatidilcolina 0 0 19
Fosfatidiletanolamina 0 65 18
Fosfatidilglicerol -1 18 0
Fosfatidilinositol -1 0 1
Fosfatidilserina -1 0 8,5
Cardiolipina -2 12 0
Esfingomielina 0 0 17,5
Glicolipídios 0 0 10
Colesterol 0 0 25
24
1.7 Aplicação dos AMP
Os AMPs, além de serem candidatos ao tratamento de infecções, são de
grande interesse da indústria alimentícia cujo objetivo é utilizar esses AMP para
aumentar o tempo útil de alimentos processados (Vuyst, 2007).
A utilização de peptídeos requer mais que o próprio estudo e desenvolvimento
de novas moléculas com grande potencial e especificidade terapêutica. Para o uso
dos AMP por via oral, por exemplo, como a maioria deles tem grande
susceptibilidade de degradação por proteases, haveria necessidade de modificações
em sua estrutura, como conjugações químicas e encapsulamento dessas moléculas
antibióticas por lipossomas, por exemplo, para que elas pudessem ser utilizadas
(Bergeon et al., 2008).
Um dos maiores obstáculos para o uso em grande escala dos AMPs ainda é o
custo da produção de peptídeos para uso comercial. A síntese deverá ser
aprimorada de modo a ser menos custosa para uma produção em larga escala, já
que o preço de um grama de um antibiótico convencional, como os da classe dos
aminoglicosídeos, é US$ 0,80, enquanto um peptídeo antimicrobiano pode custar de
US$ 50,00 a US$ 400,00 (Marr et al., 2006).
1.8 A Melitina
A melitina é um peptídeo antimicrobiano isolado do veneno da abelha Apis
melífera que tem a característica de romper membranas lipídicas, formar poros,
causar fusão de membranas e hemólise. Esse peptídeo compõe 50% do peso seco
do veneno e é caracterizado por possuir 26 aminoácidos e carga +5 ou +6 quando o
resíduo de Gly é protonado em pH 7 (Raghuraman & Chattopadhyay, 2006). Sua
sequência é:
25
(+)NH2-GIGAVLK(+)VLTTGLPALISWIK(+)R(+)K(+)R(+)QQ-CONH2
sendo os
20 resíduos da ponta N terminal mais hidrofóbicos, possuindo a característica de
inserir-se na membrana lipídica, e os últimos 6 aminoácidos, da ponta C terminal,
mais hidrofílicos devido as cargas positivas em pH 7, que ancoram na membrana
através de pontes salinas nos grupos fosfato das cabeças dos lipídeos que a
constituem (Figura 4) (Stömstedt et al. 2007).
Figura 4. Software de AMPs http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.htm, sequência de aminoácidos da melitina com representação das regiões hidrofóbicas em azul e hidrofílicas em vermelho.
Vários mecanismos foram propostos para explicar a ação lítica deste peptídio
em vesículas lipídicas, entre eles a fusão de vesículas e micelização. Porém, a
proposta mais aceita é a de formação de poros.
A estrutura do peptídio em meio aquoso é predominantemente randômica em
concentrações abaixo da necessária para ocorrer a dimerização da molécula. Esse
peptídeo adota, predominantemente, uma estrutura em alfa-hélice quando ligado às
membranas lipídicas (Stömstedt et al. 2007, Glättli et al. 2006, Terra et al. 2007).
Assim, a melitina pode fazer poros toroidais e em forma de barril, em
tetrâmeros (Figura 5) (Lin & Beumgaertner, 2000) e também já foi reportado que, em
membranas aniônicas, esse peptídeo age como detergente. Porém Mihajlovic &
Lazaridis sugerem que a melitina interage mais fortemente com os lipídeos no
modelo de poro toroidal do que no poro cilíndrico, devido a sua maior solvatação
(Mihajlovic & Lazaridis, 2009).
26
Figura 5. A-Tetrâmero de melitina interagindo com as cabeças polares dos lipídios e os íons Cl-
, num poro cilíndrico. B-Transição e C- Poro toroidal. A figura foi feita por simulação por dinâmica molecular. As moléculas de água foram retiradas para melhor visualização. Os resíduos polares estão em amarelo, os resíduos carregados positivamente em azul, W19 em preto, fosfocolinas representadas como esferas verdes, íons em esferas vermelhas, caudas lipídicas em linhas cinza e o peptídeo em azul, laranja, amarelo e púrpura. Figura retirada de Mihajlovic & Lazaridis, 2009.
A maneira como o peptídeo interage com a membrana também parece estar
relacionada com a composição lipídica da membrana. Experimentos de vazamento
do conteúdo interno de vesículas compostas por lipídeo zwiteriônico (palmitoil-oleoil-
fosfatidilcolina, POPC) ou ácido (palmitoil-oleoil-fosfatidilglicerol, POPG), mostraram
que a atividade do melitina na membrana se dá por dois mecanismos de
permeabilização diferentes, dependendo da sua composição (Ladokhin et al., 2001).
Em vesículas de POPC há a formação estruturas de aproximadamente 25-30
Å de diâmetro pela melitina. Esses agregados trans-membrana de peptídeos em α-
hélice sugerem a formação de poro em forma de barril, pela característica do
vazamento do conteúdo interno das vesículas (Figura 6 A).
Para membranas constituídas de POPG, os estudos mostraram um
vazamento típico de um detergente, podendo sugerir um mecanismo de carpete
(Figura 6 B).
27
Além disso, experimentos de dicroísmo circular mostraram que, em presença
de POPC apenas, a melitina assumia conformação em α-hélice, capaz de adotar
uma orientação trans-membrana (Terra, 2006).
A atividade da melitina é aumentada em células sem colesterol e tem
atividade tóxica em diversos tipos de célula (eritrócito, leucócitos e mastócitos). Além
disso, ainda pode causar agregação, fusão de membranas e “budding” (Ferre et al,
2009, Strömsteadt et al, 2007).
Devido as suas propriedades anfifílicas, a melitina é um bom modelo para o
estudo das interações com membranas. Porém ela não poderia ser utilizada como
molécula antibiótica em mamíferos, pois é altamente danosa a células.
Figura 6. Representação esquemática do modo de ação da melitina sobre vesículas compostas de: A – POPC levando a formação de poro; B - POPG levando a um vazamento do tipo detergente “carpete” (Ladokhin et al, 2001). O experimento de Ladokhin mostra vesículas incorporadas com marcadores de tamanhos diferentes. Na de POPC os menores marcadores apresentam vazamento e nas de POPC o vazamento não é seletivo quanto ao tamanho do marcador (modificado de Ladokhin et al., 2001).
28
1.9 Cecropina A
Além da melitina, outros peptídeos encontrados na natureza com atividade
antimicrobiana são do grupo das Cecropinas A, B ou D, de 35-37 resíduos de
aminoácidos (Gudmundsson et al. 1991), os quais estão presentes na resposta
imune inata de mamíferos e insetos (Marassi, 1999). Essa família de AMPs possui
atividade contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, não apresentam
toxicidade contra eritrócitos e outras células eucarióticas, mas são susceptíveis a
degradação por protease (Ferre et al. 2009).
A Cecropina A foi isolado da hemolinfa da Hyalophora cecropia ou bicho da
seda gigante e sua composição de aminoácidos é
KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK-NH2 (Figura 7).
Figura 7. Software de AMPs http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.htm, sequência de aminoácidos da cecropina A, com representação das regiões hidrofóbicas em azul e hidrofílicas em vermelho.
O mecanismo de ação da Cecropina A é dependente da sua concentração e
atua causando morte de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Nas Gram-
negativas o peptídeo atua ligando-se aos lipopolissacarídeos da membrana do
microorganismo, predominantemente por atração eletrostática (Arcidiacono et al.
2008).
O principal alvo da Cecropina é a membrana plasmática, levando à
permeabilização da membrana por formação de poro e canais iônicos que levam à
perda do potencial de membrana, permitindo vazamento e morte celular (Lu et al.
2010). Seu efeito citotóxico é observado em numerosas células de linhagens
29
tumorais, além de apresentar um grande efeito em protozoários, fungos e bactérias,
incluindo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium ou
Micrococus lutes (Cerón et al. 2010).
A Cecropina A apresenta estrutura randômica em meio aquoso e em contato
com membranas lipídicas adquire conformação em α-hélice. Seus resíduos de
aminoácidos de 5-21 formam uma α-hélice com carga +6 quando em interação com
interfaces lipídicas e, devido a essas cargas, essa parte da molécula se situa na
superfície da membrana e não penetra no core hidrofóbico. Já os resíduos de 24-37
apresentam característica hidrofóbica e são capazes de se inserir na membrana
lipídica. Na ponta carboxi terminal ainda há uma carga +1 do último resíduo de lisina
(Figura 8 B) (Ferre et al., 2009, Silvestro et al. 1997).
Em baixa concentração de Cecropina A há a formação de canais iônicos e em
maiores concentrações ocorre primeiramente a formação de dímeros do peptídeo
que formam, por fim, um poro toroidal representado pela Figura 8 (Silvestro et al.
2000; 1997; Durell et al. 1992).
Figura 8. Representação da Cecropina A. A) Esquema mostrando a hélice vertical a partir do NH2 terminal da seqüência de aminoácidos da cecropina A. Os resíduos em preto são os conservados em todas as cecropinas, os cinzas são os variáveis e os em branco são os resíduos hidrofóbicos (Durell, et al., 1992). B) Um dímero de cecropina A representado inserido na membrana, a parte hidrofílica nas superfícies interna e externa representadas em azul na membrana, e região hidrofóbica, inserida no core hidrofóbico da membrana em amarelo. C) Modelo de poro toroidal da cecropina A formado pelos dímeros das hélices representadas em B (Silvestro et al. 1997).
30
1.10 O peptídeo BP100
Como cada peptídeo exibe uma seletividade celular e diferentes mecanismos
de ação, uma estratégia para tentar obter o máximo de eficácia de um peptídeo
antimicrobiano é a combinação entre as seqüências dessas moléculas para se obter
peptídeos sintéticos híbridos. Este tipo de estratégia pode minimizar ou eliminar a
hemólise, por exemplo, que limitaria o uso sistêmico de uma terapia com AMP.
O BP100 cuja composição é KKLFKKILKYL-NH2 (Figura 9), de ponto
isoelétrtico 10.7 e massa molecular de 1421.88 g/mol, é um híbrido de Cecropina A
com Melitina obtido por química combinatória que apresentou grande eficiência,
tanto in vitro quanto in vivo, inibindo o crescimento de bactérias Gram-negativas
(Ferre et al., 2009).
Figura 9. Software de AMPs http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.htm, seqüência de aminoácidos do BP100 com representação das regiões hidrofóbicas em azul e hidrofílicas em vermelho.
Membranas miméticas de diferentes composições lipídicas foram utilizadas
em estudos de vazamento de conteúdo interno de vesículas, com diferentes
concentrações de BP100. Verificou-se uma enorme seletividade do BP100 para
membranas aniônicas, provocando vazamento do conteúdo interno das vesículas, e
baixa atividade do peptídeo sobre vesículas neutras. Nos sistemas compostos por
fosfolipídios aniônicos, mesmo em baixas razões de peptídeo/lipídio, foi grande a
permeabilização de vesículas por BP100, além de ocorrer neutralização da carga da
membrana e agregação de vesículas. Foi evidente também a relação entre a
31
concentração do BP100 com o vazamento das vesículas, ocorrendo um vazamento
mais rápido quanto maior a concentração de peptídeo (Ferre et al., 2009).
As cinéticas de vazamento de vesículas com o BP100 também apresentaram
comportamento sigmoidal, incomum para peptídeos antimicrobianos conhecidos até
então. Esse fenômeno pode indicar que vários eventos estão ocorrendo na
membrana ao longo do tempo de interação do BP100 com a vesícula.
Peptídeos catiônicos também podem alterar a densidade de carga da
superfície de vesículas induzindo agregação. Nos estudos de Ferre et al., 2009,
concentrações de BP100 menores que 15 μM e de lipídeo da ordem de125 μM, ou
seja uma razão de 0,12 peptídeo/lipídeo, não se observou mudanças significativas
na turbidez (em vesículas em 100 nm). Porém, acima dessa razão, a densidade
óptica da solução aumentava indicando formação de agregados.
As medidas de potencial zeta confirmaram essa saturação de peptídeos na
membrana lipídica, resultando na neutralização das cargas dos fosfolipídios
negativos. Esse efeito é altamente favorável a agregação de vesículas, pois cancela
a repulsão eletrostática entre as vesículas analisadas (Ferre et al., 2009, Alves et al,
2010).
A concentração mínima inibitória, MIC, do BP100 foi determinada para
diferentes microorganismos, como E. amylovora, X. vesicatoria, and P. syringae, e
foram obtidos valores entre 2,5 a 7,5 µM de BP100. Esses valores de MIC são de
baixa toxicidade para os eritrócitos humanos, como mostrado nos resultados de
Ferre et al., o que faz deste híbrido de peptídeo um candidato para antibiótico contra
infecções causadas por bactérias Gram-negativas.
Em experimentos de viabilidade celular, o BP100 mostrou efeitos citotóxicos
em cultura de fibroblastos de mamíferos em concentrações entre 50 - 60 μM e em
32
eritrócitos acima de 150 μM, o que é bastante promissor já que ele atua em
concentrações muito mais reduzidas em bactérias (2,5 a 7,5 µM).
Portanto, devido a seletividade do peptídeo por membranas aniônicas, é de
interesse estudar o mecanismo de ação desse peptídeo verificando o efeito da carga
superficial da membrana e da presença de colesterol na sua atividade, já que este
último está presente em eritrócitos de mamíferos.
1.11 Descrição dos lipídeos utilizados
Neste trabalho, a composição das vesículas estudadas LUVs e GUVs foi
definida utilizando-se como modelo a composição de lipídios de membrana de
bactéria e de eritrócito. Como pode ser visto na Tabela 1, a membrana de bactérias
possui uma porcentagem considerável de lipídios negativos (42%) enquanto a
membrana do eritrócito possui apenas 12,5 % de lipídios negativos. Porém, os
lipídios aniônicos no eritrócito ocorrem do lado interno da membrana. A membrana
externa do eritrócito possui exclusivamente lipídios de carga líquida zero, e é essa a
interface que seria encontrada pelo peptídeo caso ele fosse utilizado como
antibiótico. Outra diferença entre as membranas de bactérias e eritrócitos é a
presença do colesterol que existe somente nas membranas de mamíferos.
Assim, para mimetizar a membrana das bactérias, foram utilizados nesta
dissertação, lipídios neutros e negativos. Para mimetizar eritrócitos foram utilizados
lipídios de carga líquida zero e colesterol.
Os lipídios escolhidos para tal estudo foram a fosfatidilcolina de ovo, PC,
(Maximiano et al., 2008), o colesterol (Rouser, et al. 1968, Tabela 1), e o Egg-1-
Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicerol)] (PG). A PC e o PG obtidos de
33
ovo são misturas de 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina com ácidos graxos contendo
diferentes comprimentos e insaturações. Na Figura 10 estão representadas as
estruturas dos lipídeos POPC, POPG e colesterol.
Figura 10 – Estruturas dos lipídeos: A)1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-Fosfatidilcolina
(POPC), B) (1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicerol)] (POPG) e C) C
olesterol. Figura extraída de Ahyayauch et al., 2006.
Os lipídeos POPC e o POPG, mostrados na Figura 10, possuem cabeça polar
constituída pelo glicerol, grupo fosfato, uma colina, e dois ácidos graxos com cadeia
longa, sendo uma delas o acido palmítico (16 carbonos com nenhuma insaturação) e
outro um acido oléico (18 carbonos e uma instauração entre os carbonos 9 e 10),
formando duas ligações éster com o grupo glicerol da molécula.
O tamanho da cauda hidrofóbica e suas insaturações determinam a
temperatura de transição de fase do lipídio em questão. Nesta temperatura o lipídio
passa da fase gel, que apresenta menor grau de liberdade, para a fase líquida, no
34
qual apresenta maior grau de liberdade. As temperaturas de transição da POPC e
do POPG são da ordem de -2 0C (Ahyayauch et al., 2006; Archilha, 2008).
O colesterol é um constituinte presente em grandes quantidades
(20-40 % em mol) na membrana plasmática de eucarióticos, e é
ausente nas membranas dos procariotos. Essa molécula possui temperatura muito
alta de transição de fase gel para fase fluida e assim tem a propriedade de alterar as
propriedades físico-químicas da membrana lipídica, causando uma organização de
fase líquido-ordenada e promovendo a desorganização da fase gel (Mouritsen &
Zuckermann, 2004). O colesterol tem a capacidade de aumentar a ordem das
membranas lipídicas, chamada de fase-líquido-ordenada (Figura 11), na qual os
lipídios estão em fase fluida, porém há uma difusão rápida no plano da bicamada,
uma desordem translacional de lipídeos, e ao mesmo tempo essa fase tem uma alta
troca conformacional de cadeias lipídicas (Mouritsen & Zuckermann, 2004).
Figura 11. Esquema ilustrativo de diferentes fases da membrana lipídica em meio aquoso (Eeman, M. & Deleu, M, 2010).
35
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Estudar o mecanismo do peptídeo BP100 em modelos de membrana com
diferentes cargas de superfície e em presença de colesterol.
2.2 Objetivos Específicos:
1- Estudar diferentes modelos de membranas lipídicas, para testar o efeito de
carga negativa na superfície da membrana na atividade do BP100, e mimetizar as
membranas celulares de mamíferos e bactérias;
2- Utilizar a técnica de dicroísmo circular para avaliar a possível interação do peptídeo
híbrido com membranas lipídicas, através das mudanças da estrutura secundária do
BP100;
3- Quantificar a relação peptídeo/lipídio mínima para a formação de poros em
diferentes membranas lipídicas através do acompanhamento da cinética de
vazamento de sondas fluorescentes encapsuladas no compartimento aquoso interno
das LUVs;
4- Investigar a ação do BP100 em membranas lipídicas através da visualização de
GUVs por um microscópio óptico;
5- Estudar a mudança do diâmetro hidrodinâmico e a mobilidade eletroforética das
LUVs de diferentes proporções de carga negativa, com e sem colesterol, pelo
BP100.
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
A fosfatidilcolina de ovo, PC, foi extraída de gema de ovo segundo técnica
descrita (Maximiano, et al., 2008). O Egg-1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-
rac-(1-glicerol), PG, a 1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-Fosfatidilcolina, POPC, e o
(1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicerol)], POPG, eram da Avanti
Polar Lipids. O colesterol, a
5(6)-Carboxifluoresceína foi purificada segundo o método de Weinstein et al,
1977.
5(6)-carboxifluoresceína, Sephadex – G25 medium, a
sacarose, o Tris base, o ácido Perclórico 70% eram da Sigma Aldrich. O ácido
ascórbico era da Merck e o Molibdato de amônio da Baker. O metil-viologênio (MV),
e pireno tetrasulfonato de sódio, PTS, eram da Molecular Probes. As membranas de
policarbonato, com diâmetro de poro de 100 nm, utilizadas para a preparação das
vesículas extrusadas, eram da Whatman (Nucleopore Track-Etch Membrane).
Para a síntese do BP100, os derivados de aminoácidos (Fmoc-aminoácidos)
e a resina utilizada para a síntese eram produtos da Peptides International
(Louisville, Estados Unidos). A N,N-dimetilformamida (DMF) era da SYNTH (São
Paulo, Brasil) e foi seca sob hidróxido de potássio e destilada à pressão atmosférica
(146 ºC) antes da utilização. Os solventes, 2-propanol, metanol e ácido
trifluoroacético, eram reagentes de grau analítico (VETEC, Rio de Janeiro, Brasil).
Os compostos 4-metilpiperidina, triisopropilsilano, N,N’-diisopropilcarbodiimida, 1-
hidroxibenzotriazola e o α-ciano-4-hidroxicinâmico foram adquiridos da Sigma-
Aldrich (St Louis, EUA). O 2-ciano-2-(hydroxiimino) acetato de etila, conhecido
comumente como Oxyma, e o triisopropilsilano eram produtos Merck (Darmstadt,
37
Alemanha). Acetonitrila de grau cromatográfico era produto da Mallinckrodt
Chemical- J.T.Baker (Phillipsburg, Estados Unidos).
3.1.4 Aparelhos
A preparação de vesículas foi feita com um Extrusor LiposoFast (Avestin Inc.).
Para as medidas de Dicroísmo Circular utilizou-se um aparelho Jasco J-815
CD Spectrometer, equipamento do Grupo de Biofísica da UNIFESP, INFAR,
laboratório do Prof. Dr. Antônio Miranda, sob a responsabilidade da aluna Tatiana de
Oliveira. Nos experimentos de dicroísmo circular utilizou-se cela cilíndrica de quartzo
com caminho óptico de 0,5 mm.
As medidas de fluorescência foram realizadas em um espectrofluorímetro
Hitachi F-2000 e cela de quartzo com caminho óptico de 10 mm.
O diâmetro hidrodinâmico e da mobilidade eletroforética das vesículas foram
medidos em um aparelho Zetasizer Nano 317.
Para as medidas de Microscopia óptica utilizou-se um microscópio invertido
Zeiss Axiovert 200 e câmera Zeiss AxioCam HS (High Speed) do Laboratório de
Cristalografia do IFUSP. O aparelho possui placas condutoras de ITO (óxido de
índio-titânio) da FlexiTec Eletronica Orgânica, multímetro digital e um gerador de
funções digital, MFG 4202, Minipá. O porta-amostra com entrada lateral e os
espaçadores de teflon foram fabricados pela oficina do Departamento de Física
Aplicada do IFUSP. Os experimentos foram realizados pela Prof. Dra Karin do
Amaral Riske da UNIFESP, SP
38
3.2 Métodos
3.2.4 Dosagem de Fosfato inorgânico
A concentração dos fosfolipídios foi determinada dosando-se o fosfato
presente nas moléculas. Alíquotas das amostras de lipídio foram adicionadas aos
tubos de ensaio (previamente lavados em HCl concentrado) e foram secas numa
estufa de 120°C. Após secagem adicionou-se 0,4 mL de ácido perclórico a cada
amostra. Os tubos foram tampados com bolas de vidro e mantidos por uma hora em
um digestor a 180 °C, tempo necessário para mineralizar totalmente os lipídios.
Após resfriamento à temperatura ambiente, adicionaram-se 1 mL de água e 0,4 mL
de molibdato de amônio a 1,25 % (p/v) às amostras. Os tubos foram agitados num
vórtex. Em seguida, adicionou-se às amostras 0,4 mL de uma solução de ácido
ascórbico a 3 % (p/v), agitaram-se os tubos no vórtex novamente, e as amostras
foram mantidas em banho-maria por cerca de 10 minutos. Após esse período os
tubos foram esfriados em água corrente e a absorbância lida em 797 nm. A curva
padrão foi feita junto com as amostras utilizando-se uma solução padrão de KH2PO4
3.2.5 Dosagem do Colesterol
0,001 M em água (Chen et al, 1956).
O colesterol foi recristalizado de etanol a quente. A dosagem de colesterol foi
feita utilizando-se o kit da BioTécnica-biotecnologia avançada. Este kit continha uma
solução padrão de colesterol de 200 mg/dL em Butanol 10% v/v; Triton x 100 0,1%
v/v, e um reagente (R1) que correspondia a uma solução de tampão Pipes 100
mmol/L, pH 7,0; colato de sódio 8 mmol/L; colesterol esterase (CHE) > 750 U/L;
colesterol oxidase > 200U/L; peroxidase > 2000 U/L; 4-aminoantipirina 0,6 mmol;
fenol 20 mmol/L e azida sódica 0,05 % p/v.
39
Frações crescentes de 0-14 µL da solução padrão de colesterol foram
colocadas em tubos de ensaio e adicionou-se o reagente R1 para um volume final
de 1 mL para todas as amostras.
Alíquotas das amostras lipídicas a serem dosadas foram colocadas em
volumes crescentes em tubos de ensaio aos quais se adicionou 1 mL do reagente
R1 atingindo-se concentrações próximas das usadas na curva padrão de colesterol.
Os tubos foram agitados e incubados durante 10 minutos em 37 0
A partir da curva de absorbância da solução padrão de colesterol, obteve-se a
tangente no gráfico de absorbância x [colesterol] que foi utilizada para o cálculo da
concentração de colesterol nas amostras.
C. A absorbância
foi medida num espectrofotômetro em 505 nm sendo a cor das soluções estável por
30 minutos.
3.2.6 Purificação da Carboxifluoresceína
Recristalização e remoção de contaminantes polares foram realizadas
segundo adaptação dos métodos de Weinstein J. N. et al., 1977.
3.2.7 Determinação da concentração da solução de BP100
A concentração do peptídeo foi determinada medindo-se a absorbância a 276
nm. Nesse comprimento de onda a tirosina presente no BP100 absorve e a
concentração do BP100 pode ser determinada pela lei de Beer-Lambert utilizando-
se coeficiente de extinção molar de 1290 M-1 cm-1
3.2.8 Síntese do Peptídeo BP100 (EMBRAPA – Bemquerer, M.)
.
O peptídeo H-KKLFKKILKYL-NH2 foi sintetizado pelo método de fase sólida
(Chan & White, 2000; Albericio, 2004), com a utilização da resina “Rink-Amide-
40
MBHA-Resin” (Peptides International, Louisville, Estados Unidos), com grau de
substituição de 0,52 mmol.g-1 por Bemquerer, M. - EMBRAPA. As reações de
desproteção do grupamento Fmoc foram conduzidas com uma solução de 4-
metilpiperidina em N,N-dimetilformamida (DMF) a 25% (em volume) durante 30
minutos (em duas etapas de 15 minutos). Os acoplamentos para formação das
ligações peptídicas foram conduzidos com N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC)/1-
hidroxibenzotriazola (HOBt), ou DIC/2-ciano-2-(hydroxiimino)acetato de etila
(Subirós-Funosas et al, 2009) em DMF durante 60 a 120 minutos. As etapas de
desproteção e acoplamento foram repetidas alternadamente até a adição do
derivado de aminoácido N-terminal e desproteção do grupamento Fmoc amino-
terminal. As reações de desproteção e de acoplamento eram monitoradas pela
reação de ninhidrina (Chan & White, 2000; Friedman, 2004). Após cada etapa de
desproteção e acoplamento, a resina era lavada três vezes com 2-propanol (ou
metanol) e DMF, de modo alternado. Completada a síntese, a reação de
desproteção final e de desligamento entre o peptídeo e a resina foi conduzida em
uma solução de ácido trifluoroacético: triisopropilsilano:água (90:05:05, v:v:v)
durante 90 minutos à temperatura ambiente. Após quatro lavagens com éter
diisopropílico gelado sob N2
O peptídeo foi purificado por cromatografia de fase reversa e foi caracterizado
por espectrometria de massas. Para a purificação do peptídeo foi utilizada uma
coluna semi-preparativa ODS 9,4 x 250 mm da Agilent (Santa Clara, Estados
Unidos). O cromatógrafo utilizado para purificação do peptídeo era composto de
uma bomba modelo LC-10, um detector UV-visível modelo SPD-10AV, uma unidade
misturadora de solventes, modelo FCV-10AL, um degaseificador modelo DGU-14A,
líquido, o sobrenadante foi descartado e o peptídeo foi
extraído com água e liofilizado.
41
e um injetor manual Rheodyne injector, acessórios esses acoplados a uma unidade
controladora SCL-10A System Controler (Shimadzu, Kyoto, Japan). O programa de
gradiente utilizado para a cromatografia foi o seguinte: H2O:ACN:TFA (95:5:0,1,
v:v:v) durante 5 minutos, seguido de gradiente linear até H2O:ACN:TFA (35:65:0,1,
v:v:v) durante 60 min. A detecção foi a 216 e 280 nm, o fluxo foi de 3,0 mL.min-1
3.2.9 Preparação das Vesículas Unilamelares Grandes (LUVs)
e as
corridas foram conduzidas à temperatura ambiente. A identidade do peptídeo
purificado e o grau de pureza foram verificados por espectrometria de massas (MS),
em modalidade MALDI-ToF, com o emprego de ácido α -ciano-4-hidroxicinâmico
como matriz. Os espectros foram adquiridos em espectrômetro de massa modelo
Ultraflex III ToF-ToF (Bruker Daltonics, Bilerica, Estados Unidos), em modo refletido.
A fragmentação do peptídeo por MS/MS foi conduzida por meio da metodologia
LIFT™ (Suckau et al., 2003).
Para preparação das vesículas pesa-se a quantidade necessária de lipídio em
um tubo de ensaio de fundo largo. Os lipídios são dissolvidos em diclorometano e a
eliminação do solvente é feita com um fluxo contínuo de N2
Os tubos contendo o filme lipídico são colocados em um sistema de vácuo por
1 h para evaporação de resíduos de solvente orgânico. A seguir adiciona-se 500 µL
do tampão ou da solução contendo CF ou PTS ao tubo, e a suspensão é agitada até
o descolamento completo do lipídio do tubo. Na suspensão formada temos as MLVs,
grandes vesículas multilamelares com diversos diâmetros.
, com rotação do tubo
para formação do filme lipídico fino (Figura 12).
Para formar vesículas unilamelares e uniformizar o seu diâmetro, a
suspensão foi extrusada, processo no qual a suspensão lipídica é forçada a
42
atravessar uma membrana de policarbonato com poro de diâmetro conhecido
(Patty, et al., 2003).
Figura 12 - Representação esquemática da preparação de LUVs e SUVs (vesículas unilamelares pequenas). Em A o filme lipídico aderido ao tubo de ensaio (Ahyayauch, et al., 2006).
Nos experimentos descritos aqui utilizamos duas membranas com poros de
100 nm de diâmetro, que são colocadas no centro do extrusor (LiposoFast, Avestin
Inc.), entre duas placas de teflon com um furo no centro (Figura 13). A suspensão
lipídica é colocada em uma das seringas e forçada a atravessar a membrana
passando de uma seringa para outra por um número impar de vezes (em nosso
trabalho fizemos onze passagens) (Figura 13). Esse processo deve ser realizado em
uma temperatura acima da de transição de fase do lipídio. Após o processo de
extrusão, o diâmetro das vesículas foi determinado por medidas de espalhamento de
luz dinâmico (DLS) obtendo-se LUVs com um diâmetro médio em torno de 100 nm.
43
Figura 13 – Extrusor utilizado para a obtenção de LUVs (Ahyayauch, et al., 2006).
3.2.10 Fluorescência
Quando uma molécula no seu estado fundamental de energia é excitada, ela
irá para qualquer nível vibracional de um estado excitado (Figura 11, estado
fundamental representado por S0, estado excitado representado por S1 e S2
Diversos eventos podem resultar da perda de energia por calor. A molécula
pode, por exemplo, perder energia o suficiente para voltar ao estado fundamental,
liberando um fóton, fenômeno esse que é chamado de fluorescência, representado
pela seta vermelha da Figura 14.
). Após
esse processo, há perda de energia na forma de calor, ocasionando a passagem
dos elétrons para níveis vibracionais menos energéticos e conversões internas entre
os estados vibracionais (setas amarelas).
As moléculas também podem perder energia passando do estado S1 para um
estado tripleto excitado (T1), através de um cruzamento inter-sistema (seta azul
escura, Figura 11). Ainda é possível perder energia partindo desse estado para o
estado fundamental (S0
Além disso, partindo de S
). Esse fenômeno é chamado de fosforescência (seta rosa).
1, as moléculas podem perder energia numa forma
não radioativa, voltando ao estado fundamental sem emissão de fóton (seta laranja).
44
O diagrama de Jablonski (Figura 14) representa todos esses fenômenos
descritos que competem entre si havendo preferência pelo que possui menor tempo
de vida (Lakowicz, 1999).
3.2.11 Supressão de Fluorescência
A supressão da fluorescência pode ocorrer por mecanismos colisional
dinâmico ou estático. A supressão colisional dinâmica ocorre quando o fluoróforo, no
estado excitado, é desativado após contacto com o supressor em solução, sem que
ocorra alteração química. Já a supressão estática ocorre quando o fluoróforo, no
estado excitado, retorna ao estado fundamental através da formação de uma ligação
eletrônica com seu supressor. A diminuição da intensidade de fluorescência
colisional é descrita pela equação de Stern-Volmer (Lakowitcz, 2006) (Equaçao 01).
F0/F= 1 + kqτ0[Q] = 1 + KD
Onde F
[Q] Equação 01
0 e F são as intensidades de fluorescência na ausência e na presença
do supressor, respectivamente, kq é a constante de supressão bimolecular, τ0 é o
tempo de vida do fluoróforo na ausência do supressor e [Q] é a concentração do
supressor. A constante de supressão de Stern-Volmer é dada por KD = kqτ
O gráfico de F
0.
0/F em função da [Q] intercepta o eixo y em 1 e a sua
inclinação corresponde, portanto, ao KD. A concentração de supressor necessária
para suprimir 50 % da intensidade de fluorescência do fluoróforo é dada por KD-1
onde F0/F é igual a 2 (Lakowitcz, 2006).
45
Figura 14– Diagrama de Jablonski. Representação dos processos de absorção (seta verde) e relaxação de uma molécula e seus tempos característicos. Figura extraída e modificada de (Lakowics, 1999).
No caso da 5(6)-carboxifluoresceína, CF, o mecanismo de auto-supressão
ocorre por transferência de energia entre os monômeros de CF no estado excitado
através de colisões com outros monômeros e com dímeros não fluorescentes em
altas concentrações do fluoróforo (> 50 mM). Em menores concentrações, o
encontro de moléculas ocorre com menor frequência e portanto o fenômeno de auto-
supressão não acontece.
3.2.12 Preparação de LUVs contendo 5(6)-carboxifluoresceína
Os filmes lipídicos, com as composições lipídicas a serem estudadas, foram
hidratados com tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8, contendo 50 mM de CF. Prepararam-
se suspensões de LUVs a partir de filmes de 6,5 mg de lipídeo total e 0,5 mL de
tampão, resultando numa concentração final de fosfolipídios de 17 mM em média
(concentração após dosagem de fosfato inorgânico). Os tubos foram agitados num
46
vórtex até descolamento total dos lipídios da parede formando a suspensão. As
vesículas formadas dessa maneira eram multilamelares (MLVs). As MLVs foram
extrusadas utilizando–se duas membranas de 100 nm de poro (ver detalhes na
metodologia).
Depois da extrusão, a suspensão das LUVs contendo CF (0,5 mL) foi
passada por uma coluna de Sephadex G-25 (ver abaixo), utilizando-se tampão de
Tris-HCl 10 mM, pH 8, NaCl 300 mM como eluente, para que a força iônica dentro e
fora das vesículas fosse igual. As LUVs contendo CF são eluídas no volume vazio
da coluna (Vo) enquanto a CF livre sai no volume interno da coluna (Vi). As
vesículas foram recolhidas num único tubo (aproximadamente 2 mL) e a
concentração final de fosfolipídio era, em geral, 2 mM. As LUVs foram mantidas em
banho de gelo até a sua utilização. A estabilidade destas vesículas a 8 0
A Sephadex-G25 foi hidratada previamente no tampão de eluição da coluna,
foi deaerada e, após montagem de coluna (0,8 cm de diâmetro x 20 cm de altura),
foi saturada com uma suspensão de vesículas de mesma composição das utilizadas
na preparação com CF porem preparadas no tampão de eluição da coluna por
sonicação por 20 min em banho de gelo.
C é de cerca
de 24 h.
3.2.13 Cinética de Vazamento das LUVs com Carboxifluoresceína
Todas as cinéticas foram realizadas a 30 0C. No tempo zero, uma alíquota
das LUVs contendo CF (em geral 5 µL de uma solução 2 mM em lipídio) foi
adicionada a uma cela de fluorescência contendo 500 µL de tampão e, no tempo de
100 s, foi feita a adição de BP100. As alíquotas de BP100 adicionadas eram da
ordem de 5 µL e adicionou-se no máximo 50 µL de BP100 de uma solução estoque
47
da ordem de 200 µM (concentração final de 20 µM na cela). A CF foi excitada em λ=
490 nm e monitorada em λ= 520 nm (Chen & Knutson, 2004).
A cinética de aparecimento de fluorescência foi seguida até 3.000 s. Após
esse tempo, adicionou-se 5 µL de Polidocanol 10 % v/v para se obter o rompimento
total das vesículas e obter a fluorescência máxima para o cálculo da porcentagem
de vazamento.
A porcentagem de vazamento em cada cinética foi calculada utilizando-se a
equação 2, onde I0 é a intensidade de fluorescência inicial antes da adição de
peptídeo, (após 100 s de cinética), I(t) é a fluorescência no tempo escolhido, após
adição do peptídeo, e Itot
é a fluorescência total após adição de detergente.
% Vazamento = 0
)(
IIII
tot
ot
−
−. 100 Equação 2
3.2.14 Estudo da supressão de fluorescência de Pireno Tetrasulfonato
de Sódio (PTS) por Metilviologênio (MV)
Utilizamos o par fluoróforo/supressor PTS (1,3,6,8 – Pireno tetrasulfonato de
sódio)/MV(Metil Viologênio) (Figura 15) uma vez que ele permite observar o
vazamento das LUV em baixa força iônica.
Para se determinar a concentração de MV adequada para suprimir a
fluorescência do PTS registramos os espectros de emissão do PTS na ausência e
presença de diferentes concentrações de seu supressor.
48
Figura 15. A) Estruturas do 1,3,6,8 – Pireno tetrasulfonato de sódio (PTS) e B) Cloreto de 1,1’-dimetil-4,4’-bipiridínio (Metil Viologênio - MV).
Uma amostra de 3 mL de PTS (1,7 x 10-7 mol. L-1) em tampão acetato 0,01
mol x L-1 pH 5,1 foi transferida para uma cubeta de quartzo fluorescência e excitada
em 350 nm. O espectro de emissão foi registrado em uma faixa de comprimento de
onda de 350 a 500 nm. A maior intensidade de fluorescência foi observada na
ausência de supressor com dois picos mais intensos, em 381 nm e em 400 nm. Com
a adição do MV observa-se uma gradual redução da intensidade de fluorescência
dependente da concentração do supressor, Figura 16.
49
350 400 450 500
0
2000
4000
6000
8000
Fluo
recê
ncia
rela
tiva,
U.a
.
Comprimento de onda (nm)
Figura 16 – Espectros de emissão do PTS (1,7 x 10-7 mol.L-1) em tampão acetato 0,010 mol.L-1, pH 5,1. λexc = 350 nm. MV (mol.L-1): () 0; () 1,7 x 10-5; () 5,0 x 10-5; () 8,3 x 10-5; () 1,1 x 10-4; () 1,5 x 10-4; () 1,8 x 10-4; () 2,4 x 10-4; () 3,1 x 10-4; () 3,7 x 10-4; () 4,3 x 10-4; () 5,1 x 10-4; () 5,8 x 10-4;() 7,3 x 10-4; () 1,0 x 10-3; () 3,0 x 10-3
.
Na Figura 17 está o gráfico da intensidade de fluorescência a 400 nm do PTS
vs [MV]. Pode-se observar o decaimento exponencial da intensidade de
fluorescência do PTS em função da concentração do MV. Observamos que, em 1 x
10-3 mol.L-1
de MV, aproximadamente 85% da fluorescência do PTS é suprimida.
Concentrações maiores do PTS contribuem pouco para o decréscimo da intensidade
de fluorescência mas aumentam muito a força iônica da meio. Como o objetivo
destes experimentos é usar força iônica baixa, estabelecemos a concentração de 1
mM de MV como adequada para verificar o vazamento de PTS.
50
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,00300
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Fluo
recê
ncia
rela
tiva
(400
nm
)
[Metil viologênio], mol.L-1
Figura 17 - Intensidade de fluorescência do PTS (400 nm) em função da concentração do MV.
O gráfico da intensidade de fluorescência do PTS em função da concentração
do supressor segundo a equação de Stern-Volmer é linear e intercepta o eixo Y em
1 (Figura 18).
0.0000 0.0005 0.00100
1
2
3
4
5
6
Fo/F
[metil viologênio], mol.L-1
Figura 18 - Gráfico de Stern-Volmer. Razão das intensidades de fluorescência do PTS em função da concentração de MV.
51
Portanto, a concentração de MV necessária para suprimir metade da
intensidade de fluorescência do PTS (1,7x 10-7 mol x L-1) em tampão acetato 0,01
mol x L-1 pH 5,1 é de 2,34 x 10-4 mol x L-1
3.2.15 Preparação de LUVs com Pireno Tetrasulfonato de Sódio (PTS)
. Estes experimentos foram realizados por
Thiago Benz Pisco e Katia Regina Perez em nosso laboratório.
Uma solução de PTS 0,001 M em água foi adicionada aos filmes lipídicos (em
geral 0,5 mL para 6,5 mg de lipídio). Os tubos foram agitados até descolamento total
dos filmes da parede e posteriormente foram colocados em banho de gelo seco e
álcool até congelamento, alternando com banho a 37° C até descongelamento, por 5
vezes. Depois desta etapa as vesículas foram extrusadas por duas membrana de
poro de 100 nm e a separação das LUVs contendo PTS da sonda externa foi feita
através de cromatografia por Sephadex G-25, eluindo-se as LUVS com tampão Tris
HCl 20 mM, pH 8 (ítem 3.3.1 da metodologia). O volume de LUVs recolhido era de
cerca de 1 ml e a concentração de lipídio era, em geral, de 2 mM.
3.2.16 Cinética de vazamento de LUV contendo PTS em presença de
Metilviologênio.
Os experimentos de vazamento das LUV contendo PTS foram realizados a 30
°C e a fluorescência foi monitorada continuamente em 382 nm (λex= 350 nm).
Alíquotas de 5µL das LUVs com PTS eluídas da coluna de Sephadex-G25 foram
adicionadas a uma cubeta contendo 500 µL de MV 1 mM (Figura 17 B) em tampão
TRIS HCl 20 mM pH 8.
52
Ao final de cada experimento, a supressão de fluorescência máxima do PTS
encapsulado foi determinada após a adição de 10 µL de Polidocanol 10% (p/p) e a
porcentagem de vazamento foi calculada pela equação 03.
% Vazamento = [( I0 - I(t)) / ( I0 – Itot
)] . 100 Equação 03
Onde I0 é a intensidade de fluorescência inicial antes da adição de peptídeo
(após 100 s de cinética), I(t) é a fluorescência no tempo escolhido, após adição do
peptídeo, e Itot
3.2.17 Determinaçao da Mobilidade Eletroforética e Potencial Zeta
é a fluorescência total após adição de detergente.
Algumas partículas dispersas em um sistema aquoso podem adquirir uma
carga de superfície, principalmente através da ionização de grupos superficiais ou
adsorção de espécies carregadas do meio. Essas cargas superficiais modificam a
distribuição dos íons circundantes, resultando em uma camada ao redor da
partícula, que é diferente da solução.
Como
as partículas se movem em movimento browniano, esta camada ao
redor da partícula se move como parte dela. O potencial zeta é o potencial no ponto
limite desta camada, interface entre os íons adsorvidos na camada e a solução,
também chamado de “sliping plane”. A carga nesta interface é muito sensível à
concentração e ao tipo de íons em
solução (Figura 19).
53
Figura 19. Esquema mostrando o plano da interface onde é medido o potencial zeta de uma partícula carregada negativamente. A primeira camada de íons adsorvidos, chamada de Stern Layer, é onde se encontram os íons positivos, que se movem com a partícula, representada em azul escuro. O “slipping plane” é o plano em que há o movimento de íons, representado em azul claro. Essas duas camadas são chamadas de “Electrical double layer” ou dupla camada elétrica.
O potencial zeta é uma das principais forças que permeiam as interações
interpartículas. Partículas com um elevado potencial de mesma carga, positiva ou
negativa, irão se repelir. Convencionalmente, um potencial zeta elevado em módulo
de 30 mV seria considerado como um potencial zeta elevado. Para que moléculas e
partículas, que são pequenas o suficiente e de densidade consideravelmente baixa,
se mantenham em suspensão, um alto potencial zeta confere estabilidade, ou seja,
a solução ou dispersão irá resistir a agregação das partículas.
A medida é feita através da aplicação de um campo elétrico através da
dispersão. As partículas dentro da dispersão com um potencial de superfície irão
migrar para o eletrodo de carga oposta, com uma velocidade proporcional à
magnitude do seu potencial zeta. A velocidade da partícula nesse campo elétrico é
medida através da técnica de anemometria laser Doppler. A mudança de freqüência
ou fase de um feixe de laser incidente nessas partículas em movimento é medido
54
como a mobilidade das partículas (mobilidade eletroforetica) e esta mobilidade é
convertida para o potencial zeta, introduzindo a viscosidade do dispersante e a
aplicação das teorias Smoluchowski ou Huckel
A relação entre a mobilidade eletroforetica e o potencial zeta é dada pela
equação 4 (aproximação de Smoluchovski):
. Neste projeto foram utilizados os
valores obtidos do aparelho Zetasizer Nano em mobilidade eletroforética (Zetasizer
manual - Equação 4).
UE
= 2εzf(ka)/3η Equação 04
Aonde o UE
3.2.18 Determinação do Diâmetro Hidrodinâmico
é a mobilidade eletroforetica, ε é a constante dieletrica, f (ka) é a
funçao de Henry e η é a viscosidade.
Partículas suspensas num meio líquido nunca estão em estado estacionário,
possuindo movimento constante. Esse movimento, chamado de movimento
Browniano, ocorre devido à colisão das moléculas do líquido que circundam a
partícula. Pequenas partículas se movem mais rapidamente que partículas maiores.
A relação entre o tamanho e a velocidade do movimento Browniano da partícula é
definida pela Equação de Stokes-Einstein.
Partículas pequenas, quando iluminadas, possuem a característica de
espalharem luz, caracterizando o movimento Browniano. Assim, o espectro de luz
que atravessa essa amostra será composto de áreas claras e escuras onde não há
luz detectada. As áreas claras ocorrem onde o espalhamento de luz causado pelas
partículas e possuem a mesma fase de onda, resultando numa interferência
55
construtiva. As áreas negras ocorrem onde as ondas de luz, causadas pelo
espalhamento, são destrutivas e cancelam umas as outras.
O pontilhado resultante das áreas claras e escuras causadas pelo
espalhamento de luz que atravessa uma suspensão se moverá devido ao
movimento das partículas variando com certa intensidade e irá caracterizar esse
movimento com uma flutuação da intensidade.
O aparelho Zetasizer faz medidas de espalhamento de luz dinâmico, o qual
mede o movimento Browniano e o relaciona com o tamanho das partículas pela
relação de Stokes-Einstein. Essa medida é feita com a iluminação das partículas
com um laser e analisa a intensidade de flutuação do espalhamento de luz. O
aparelho possui um correlador que mede o grau de similaridade entre dois sinais
num período de tempo. A função de correlação varia conforme o tamanho da
partícula, e assim que a função de correlação é medida, essa informação é utilizada
para calcular a distribuição de tamanhos.
As medidas de mobilidade eletroforética assim como de diâmetro
hidrodinâmico foram feitas a partir da mesma suspensão na mesma cubeta, logo
depois da adição do BP100.
3.2.19 Preparação das LUVs para os experimentos de diâmetro
hidrodinâmico e mobilidade eletroforética
Os filmes lipídicos de 6,5 mg foram suspendidos em 0,5 mL de tampão de
TRIS HCl 0,01 M pH 8, agitados até descolamento total do lipídio da parede do tubo
de ensaio para o tampão e após esse processo foi feita a extrusão com uma
membrana de poro de 100 nm.
56
Para as medidas de mobilidade eletroforética e de diâmetro cerca de 5-10
µL de suspensão lipídica (concentração inicial de 5 mM, em média) foi adicionada a
uma cubeta de acrílico e completou-se o volume com tampão para 1mL.
As primeiras medidas de cada preparação foram feitas sem adição de
BP100 e, em seguida, foram adicionadas alíquotas de peptídeo, com concentração
final de 1 µM de BP100 a cada adição, até se alcançar uma concentração final de 25
µM de peptídeo na cela.
As condições e parâmetros utilizados para os experimentos foram:
1- Água como dispersante, indice de refração 1,33; viscosidade 0,792 cP,
constante dielétrica 76,8 e temperatura de 30 0
Após os experimentos foi feita a dosagem de fosfato inorgânico como já
descrito anteriormente no item 4.2.2 para determinação da concentração real de
lipídios na suspensão e cálculo da relação de peptídeo/lipídio.
C. Foram feitas em geral 3 corridas
por amostra tanto para as medidas de mobilidade eletroforetica quanto para as de
diâmetro e o resultado é a media dos 3 valores.
3.2.20 Dicroísmo Circular
Moléculas que possuem diversos centros quirais, como proteínas e peptídeos,
podem interagir com a luz incidente e alterar sua polarização. Assim, a técnica de
dicroísmo circular (CD) utiliza esse efeito para determinar a estrutura secundária de
proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos (Kelly, et al., 2005).
A técnica do dicroísmo consiste na absorção por uma molécula de uma luz
circularmente polarizada. A luz circularmente polarizada é composta por uma
componente que gira em sentido anti-horário (L) e outra que gira no sentido horário
(R), as duas de mesma magnitude (Figura 19)
57
Quando essa luz passa pela amostra, as componentes R e L são absorvidas,
na mesma proporção, não é gerado nenhum sinal de CD. Porém, quando existe uma
diferença de absorção das duas componentes R e L, o sinal de CD é diferente de
zero (Kelly, et al., 2005) (Figura 20).
O equipamento JASCO J-810 mede a diferença de absorção entre as duas
componentes R e L (Equação 5). Alguns equipamentos apresentam os dados em
elipticidade dicróica ([ϴ]), que é definida pela relação: 1tan baθ− = , onde a razão
ba é a relação entre o menos e o maior eixo da elipse (Kelly, et al., 2005).
( ) ( ) ( )L RA A Aλ λ λ∆ = − Equação 05
Figura 20. Luz circulamente polarizada da técnica de CD. (a) As componentes L e R polarizadas circularmente a um plano de radiação, são duas componentes representadas com a mesma amplitude após atravessar uma amostra não quiral, gerando um plano polarizado de radiação (somatória dos vetores representado pela seta mais grossa, calculado pela somatória de vetores - linhas pontilhadas) (b) As componentes de diferentes magnitudes depois que atravessam uma amostra quiral, geram uma resultante elipticamente polarizada (linha pontilhada) (Kelly, et al., 2005).
Os dados de CD podem ser apresentados em diferença de absorbância (ΔA),
elipticidade dicróica e elipticidade molar. Neste dissertação, os resultados foram
transformados os valores de diferença de absorbância em elipticidade molar
(Equação 06), onde ϴλ é a diferença de absorbância dada pelo aparelho, m é a
58
concentração em molar e d é o caminho óptico da cubeta (utilizado 0,5 mm) (Kelly,
et al., 2005).
[ϴ]molar,λ = 100 x ϴλ / m x d
Equação 06
Os tipos de gráficos que podem ser obtidos pelo espectro de CD, devido às
diferentes estruturas existentes em moléculas quirais, como as proteínas, estão
representados na Figura 13. Há diferentes tipos de estrutura secundária em
proteínas. Na Figura 20 a linha preta, por exemplo, representa uma estrutura em α -
hélice, com duas bandas negativas em 208 e 222 nm e uma banda positiva em
198nm.
Uma estrutura em β antiparalela é representada pelo gráfico de linha
vermelha com um pico positivo em 195nm e um negativo em 217nm. Além dessas
estruturas mais conhecidas ainda existem as estruturas estendidas, de tripla hélice e
desnaturada representada pelo colágeno (Figura 21).
59
Figura 21 – Espectro de CD de α - hélice (α - helix), folha - β (β-sheet) e estrutura, β turns, Prolina e desordenada (Coil). Figura extraída de http://www.photophysics.com/secondarystructure.php.
60
3.2.21 Preparação das amostras para o Dicroísmo Circular, CD:
Os espectros de CD foram feitos com acúmulo de 4 varreduras (50 nm/s) de
190 a 250 nm em água a 25ºC, numa cubeta de quartzo de caminho óptico de 0,5
mm, com aproximadamente 300 µL de volume. Dos espectros com LUVs e peptídeo
foi subtraído o das LUVs em água.
As análises de dicroísmo circular foram feitas primeiramente com soluções
de BP100 em água. Várias concentrações de peptídeo foram utilizadas para análise
de qual concentração seria suficiente para resultar num bom sinal no aparelho entre
190 e 250 nm. A concentração de 50 µM de BP100 se pareceu mais adequada para
a posterior medida com as adições de lipídio. O espectro da água pura foi feito e
subtraído de todas as medidas nas várias concentrações do peptídeo.
As LUVs foram feitas com 3 mg de lipídeo em 1 mL de água, Para cada
solução LUVs na concentração adequada na cela de CD era feito um espectro. Em
seguida adicionava-se à cela cerca de 50 µL de BP100 280 µM para um volume final
de 300 µL. As medidas de CD de cada preparação de LUVs e em diferentes
concentrações foram feitas independentemente e o espectro obtido das vesículas foi
subtraído das medidas de BP100 com as respectivas LUVs. Várias composições
lipídicas foram analisadas e em diferentes razões peptídeo/lipídeo. Este trabalho foi
realizado com a colaboração do Prof. Dr. Antonio de Miranda, e da sua aluna
Tatiana M. Domingues do INFAR/UNIFESP.
As medidas foram feitas imediatamente após a adição do BP100 às
suspensões lipídicas.
61
3.2.22 Preparação de Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs)
As GUVs foram preparadas em colaboração com a Profa. Dra. Karin do A.
Riske da UNIFESP utilizando-se o processo de eletroformação (Angelova e Dimitrov,
1986). A metodologia se inicia com o espalhamento de 10 µL de uma suspensão
lipídica em clorofórmio (2 mg/ml) sob duas lâminas de microscópio recobertas com
um polímero de óxido de estanho dopado com flúor, que conduz corrente elétrica
(Figura 23 a). O clorofórmio foi evaporado com um fluxo de nitrogênio formando um
filme lipídico (Figura 23 b). As lâminas foram colocadas com as superfícies
condutoras voltadas uma para a outra, separadas por uma moldura de teflon de 2
mm de espessura (Figura 23 c). A câmara formada foi preenchida com uma solução
aquosa de sacarose 0,2 mol.L-1 (Figura 21 d) e conectada a um gerador de corrente
alternada onde foi aplicada uma diferença de potencial de 1 V com uma freqüência
de 10 Hz durante 1 hora (Figura 23 e). Após este período, a suspensão de GUVs foi
coletada e diluída ~10 vezes em uma solução aquosa de glicose 0,2 mol.L-1
A diluição em glicose confere um alto contraste óptico às vesículas quando
observadas por contraste de fase, devido à diferença de índice de refração das
soluções de sacarose e glicose. Além disso, pelo fato de a sacarose ser mais densa
que a glicose, as vesículas sedimentam-se, facilitando sua observação por
microscopia óptica. A Figura 22 mostra uma GUV com sacarose dentro e glicose
fora visualizada por contraste de fase, onde os tons de cinza de dentro e de fora das
GUVs são diferentes.
para
manter a mesma pressão osmótica (Riske e Dimova, 2005). As osmolaridades das
soluções de glicose e sacarose eram idênticas.
62
Figura 22 – Modelo de visualização das GUVs pelo contraste de fase.
Figura 23 – Esquema das etapas da fabricação de GUVs pelo método de eletroformação. a) Espalhamento de 10 µL de uma suspensão lipídica em clorofórmio (2 mg/ml) sob duas lâminas de microscópio recobertas com um polímero de óxido de flúor, que conduz corrente elétrica, b) O clorofórmio foi seco sob um fluxo de nitrogênio formando um filme lipídico, c) As lâminas foram colocadas com as superfícies condutoras voltadas uma para a outra, separadas por uma moldura de teflon de 2 mm de espessura, d) A câmara formada foi preenchida com uma solução aquosa de sacarose 0,2 mol.L-1, d) A câmara preenchida foi conectada a um gerador de corrente alternada onde foi aplicada uma diferença de potencial de 1 V com uma freqüência de 10 Hz durante 1 hora.
63
3.2.23 Microscopia Óptica
As observações de GUVs foram feitas em um microscópio invertido Zeiss
Axiovert 200 (Jena, Germany) equipado com objetivas de contraste de fase com
aumento de 20 x, 40 x e 63 x, uma câmera digital Zeiss AxioCam HSm e um sistema
de injeção e micromanipulação do Laboratório de Biomembranas da Unifesp, sob
responsabilidade da Profa. Dra. Karin A. Riske.
Dois protocolos experimentais diferentes foram utilizados. No primeiro, uma
vez determinado o campo de visualização contendo uma ou mais GUVs, uma
solução do peptídeo BP100 (0,5-1x10-4 mol.L-1
O microscópio Zeiss, que pertence ao Laboratório de Cristalografia do IFUSP,
possui um sistema de micropipeta acoplado (Sutter Instrument). Esse sistema
permite que, através de uma micropipeta de vidro, uma solução seja injetada nas
vizinhanças das GUVs, enquanto que estas são observadas pelo microscópio óptico.
Isso permite que qualquer alteração na bicamada lipídica, devido a essa injeção,
seja observada e gravada. O sistema de injeção está representado na Figura 24.
) foi injetada com o auxílio de uma
micropipeta de aproximadamente 15 μm de diâmetro, conforme representado na
Figura 23.
64
Figura 24 – Representação esquemática da injeção de solução ao redor das GUVs. A GUV é representada pelo circulo vermelho, a solução está em laranja, a lamínula em azul, a micropipeta em cinza e a objetiva em verde.
No segundo arranjo, a cela de observação foi preenchida com uma solução
de 10-50 µM de BP100 preparada em 0,2 M glicose. Em seguida, 5 µL da
suspensão de GUVs preparadas em sacarose foi adicionada à cela e a filmagem foi
rapidamente iniciada.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Estudo da cinética de vazamento de LUVs contendo 5(6)-carboxifluoresceína (CF)
O objetivo desta série de experimentos foi verificar a relação entre a carga
das vesículas e as propriedades de permeabilização da bicamada pelo BP100.
As LUVs contendo CF foram preparadas como descrito em Métodos. As
concentrações de lipídio finais na cela de fluorescência são fornecidas na legenda
das figuras bem como a razão molar de peptídeo/lipídeo em cada experimento. O
BP100 foi adicionado na cela após 100 s em todos os experimentos. O polidocanol
65
foi adicionado em tempos diferentes, dependendo da cinética, sendo em geral após
3.000 s. A adição pode ser observada pelo salto de fluorescência que aparece no
traçado de fluorescência vs tempo em cada figura. As concentrações de BP100
utilizadas nesta série de experimentos estão na Tabela 2.
4.1.4 Estudo do efeito de BP100 em LUVs de PC 100%.
O primeiro experimento foi verificar se as LUVs de PC 100 % contendo CF
eram estáveis durante tempo de estudo. A fluorescência de vesículas de PC 100%
contendo CF foi monitorada por 1.700 s (Figura 25 A). Observou-se um pequeno
aumento de fluorescência em função do tempo correspondendo, após 1.700 s, a 1,5
% do total de fluorescência obtida após a adição de polidocanol. Portanto as
vesículas eram estáveis o suficiente para estudarmos a atividade do BP100. É
importante salientar que o meio externo das LUVs continha Tris/HCl 0.01 M pH 8 e
NaCl 0,3 M, portanto com alta força iônica.
O efeito da concentração de BP100 sobre o vazamento de LUVs com 100 %
de PC foi estudado mantendo-se fixa a concentração de LUVs em cada experimento
e variando-se a concentração de peptídeo. Para cada concentração de peptídeo
utilizada monitorou-se o aumento de fluorescência da CF em função do tempo
(Figura 25 A).
Estudou-se o efeito de BP100 no vazamento de CF nas razões molares de
peptídio:lipídio (pep:lip) entre 0,046 e 0,46. Observou-se que o BP100 induziu um
aumento linear da intensidade de fluorescência em função do tempo, que foi tanto
maior quanto maior a concentração do peptídeo (Figura 25 A). A menor
concentração de peptídio utilizada foi de 1 µM, que está abaixo da menor MIC do
BP100 descrita por Ferre et al. 2009, que é de 2,5 µM. Essa concentração
corresponde a uma relação pep:lip de 0.046 no experimento da Figura 24 A (ver
66
dados na Tabela 2). A maior [BP100] utilizada foi de 10 µM (um pouco acima da
maior MIC de 7,5 µM) que corresponde uma razão pep:lip de 0,46 (linha azul clara,
Figura 25 A). A concentração de fosfolipídio utilizada nestes experimentos foi 21,3
µM. Como cerca de 50 % dos lipídios estão na face externa e 50 % na face interna
das LUVs, a razão pep:lip é próxima de 1 (0,92) quando usamos 10 µM de BP100,
ou seja, 1 peptídeo para cada fosfolipídio da face externa das LUVs.
A velocidade de vazamento de CF, para todas as razões pep:lip estudadas, é
ligeiramente maior do que na cinética controle sem o peptídeo (Figura 25 A, linha
negra). As porcentagens de vazamento das vesículas, calculadas após 2.500 s, em
função da relação peptídeo/lipídeo são mostradas na Figura 25 B. Observa-se nessa
figura que, mesmo utilizando concentrações de BP100 maiores que a maior MIC, o
vazamento não passou de 14 % em 2.500 s. Portanto, o BP100 altera pouco a
permeabilidade da bicamada de vesículas de PC, até a concentração de BP100
usada, provavelmente porque a constante de associação do BP100 com as LUVs
com é muito baixa e a força iônica é muito alta, o que não favorece a ligação do
BP100.
67
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u. a
.
Tempo (s)
Razao pep/lip0 0,0460,230,350,46
A
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao pep/lip
B
Figura 25. Vazamento de CF de LUVs de PC 100 mol%. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. Nas cinéticas de 0 e 0,046 peptídeo/lipídeo a adição de polidocanol foi em 1700 s e nas demais após 3.000 s. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função das razões pep/lip, mol/mol, determinada em 2.500 s, exceto para zero e 0,046 pep:lip aonde o tempo utilizado para o cálculo foi em 1.500 s. A concentração de lipídio na cela foi 21,3 µM.
68
4.1.5 Cinéticas de vazamento de CF de LUVs de PC:PG 9:1 com BP100.
Estudamos o efeito de BP100 no vazamento de CF em LUVs de PC:PG 9:1
mol/mol (Figura 26 A). Nas cinéticas com BP100, em razões pep:lip entre 0,05 e
0,13, a fluorescência aumentou linearmente em função do tempo. Notamos um
pequeno aumento de fluorescência imediatamente após a adição do BP100,
chegando a 15% de vazamento, o que é devido a uma alta concentração local do
peptídeo no momento da adição (Figura 26 A). Este efeito se repetiu nas demais
cinéticas.
Nas razões pep:lip acima de 0,22 observaram-se cinéticas bifásicas, da
variações de fluorescência vs tempo. Observou-se uma curva sigmoidal de
fluorescência vs tempo em razões pep:lip maiores (Figura 26 A). Calculamos a % de
vazamento após 2.500 s para todas as cinéticas e o gráfico de % vazamento vs
razão pep:lip é mostrado na Figura 25 B. Observa-se que a % de vazamento atinge
um valor máximo de 74% para a razão pep:lip de 0,44 diminuindo para razões mais
altas. Se considerarmos que a vesícula possui 50 % dos lipídios na face externa e
na interna, a razão 0,44 corresponde a uma razão pep:lip próxima de 1:1,
considerando-se apenas a concentração de lipídios fora das LUVs.
O efeito do BP100 no vazamento de CF com PC:PG 9:1 é significativamente
diferente do observado nas vesículas com 100 % PC. Aparentemente ocorre uma
organização do BP100 na membrana da vesícula, que é lenta, e que facilita o
extravasamento da CF para o meio.
Após a organização do BP100 na bicamada da membrana, ocorre uma
cinética rápida de vazamento de CF (“burst”). A fase lenta posterior pode ser
atribuída a cinética de passagem do BP100 de uma vesícula para outra.
69
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
100
200
300
400
500
600
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
u.a
.
Tempo (s)
Razao pep/lip 0 0,05 0,13 0,22 0,44 0,66 0,88
A
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipidio
B
Figura 26. Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 9:1 mol:mol. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas razões peptídio/lipídio indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função das razões peptídio/ lipídio após 2.500 s. A concentração de lipídios foi de 11,3 µM.
4.1.6 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 8:2 com BP100.
Nas cinéticas de BP100 com LUVs de PC:PG 8:2 na razão 0,06 de
peptídeo/lipídio, o vazamento da CF das vesículas de PC:PG 8:2 foi igual ao do
experimento controle e a cinéticas foi linear. Nas razões pep:lip iguais ou superiores
70
a 0,15 ocorreu um aumento não linear de fluorescência e nas razões de pep:lip de
0,3 e 0,4 observou-se uma cinética trifásica, apresentando uma etapa inicial de
vazamento de CF lenta seguida de etapas mais rápidas (Figura 27 A)
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
100
200
300
400
500
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,06 0,15 0,3 0,4
A
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razمo peptideo/lipidio
B
Figura 27. Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 8:2. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídeo/lipideo. A concentração de lipídios foi de 16,4 µM.
71
As porcentagens de vazamento também foram calculadas e, da mesma forma
que para as LUVs de PC:PG 9:1, observou-se um máximo de vazamento de CF com
a razão de 0,4 pep/lip (Figura 27 B). Aparentemente o excesso de BP100 quando a
vesícula tem carga negativa dificultou o vazamento de CF.
4.1.7 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 7:3 com BP100.
As cinéticas de vazamento de CF com as LUVs de PC:PG 7:3 foram muito
mais rápidas do que nas vesículas contendo menos PG. Na razão 0,04 de pep:lip, o
aumento da fluorescência vs tempo foi linear e parecido com a velocidade na
ausência de peptídeo. Porém, nas razões maiores, as cinéticas apresentaram
diversas fases e, na razão de apenas 0,21 pep/lip, o BP100 causou 80% de
vazamento de CF, diferentemente das LUVs de PC:PG 8:2 que, na mesma razão
pep/lip, chegou a uma porcentagem de vazamento de apenas 13,5 %. Este mesmo
fenômeno ocorre com razões maiores de pep/lip, chegando-se a obter praticamente
100 % de fluorescência após 2.500 s. Um vazamento de quase 100% foi observado
razão de 0,4 pep/lip, onde a concentração de BP100. Na Figura 28 B observa-se
que a % de vazamento aumenta com o aumento da relação pep/lip chegando a um
patamar.
72
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 40000
100
200
300
400
500
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,04 0,106 0,212 0,31 0,4 0,85
A
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipidio
B
Figura 28-Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 7:3 mol:mol. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídio/lipídio indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídio/lipídio em 2.500 s. A concentração de lipídios foi de 23,5 µM.
4.1.8 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 6:4 com BP100.
O efeito do BP100 no vazamento das LUVs contendo PC:PG 6:4 mol/mol foi muito
maior do que nas LUVs contendo menos PG. Na razão de 0,23 peptídeo/lipídeo
observou-se um comportamento sigmoidal na variação de fluorescência em função
73
do tempo. Após 2.500 s houve aproximadamente 73 % de vazamento de CF (Figura
29 A e B). Nas razões peptídio/lipídio maiores que 0,23 as cinéticas foram
semelhantes, o comportamento bifásico ficou menos evidente, e obteve-se um
vazamento muito rápido CF chegando-se quase 100% de vazamento de CF após
500 s.
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
50
100
150
200
250
300
Inte
nsid
ade
de F
luor
esce
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,09 0,23 0,47 0,71 0,95 1,9
A
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipidio
B
Figura 29. Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 6:4 mol/mol. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídio/lipídio indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídeo/lipidio. A concentração de lipídios foi de 10,5 µM.
O gráfico da Figura 29 B mostra que na razão pep/lip de 0,5 todas as
cinéticas chegam ao máximo de fluorescência após 2500 s. Claramente o aumento
74
de carga negativa das vesículas favorece a estruturação do BP100 na membrana
aumentando a eficiência do vazamento de CF.
4.1.9 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 1:1 com BP100.
Com LUVs de PC:PG 1:1 o vazamento de CF em função do tempo continuou
sigmoidal em algumas razoes peptídeo/lipídeo e a eficiência do BP100 é ainda maior
que nas LUVs com menos PG. Em 0,07 peptídeo/lipídeo, concentração de peptídeo
que corresponde ao ponto mínimo da MIC (de 2,5 µM de BP100), apresentou 42 %
de vazamento de 2500 s, e um comportamento nitidamente bifásico, com aumento
na taxa de vazamento a partir de 1200 s (Figura 30 A).
O vazamento de 100% de CF correspondeu a uma concentração de peptídeo
menor que o ponto máximo da MIC de 7,5 µM de BP100, pois a relação de 0,4
pep:lip equivale a 5 µM de BP100 na suspensão lipídica (Figura 30 B).
75
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
100
200
300
400
Inte
nsid
ade
de F
luor
esce
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,03 0,07 0,11 0,19 0,38
A
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipideo
B
Figura 30. Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 1:1 mol:mol (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídio/lipídio indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídio/lipidio. A concentração de lipídios foi de 11,3 µM.
4.1.10 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 4:6 com BP100.
Nas LUVs de PC:PG 4:6 mol/mol, na razão de 0,03 pep/lip observou-se uma
cinética linear com 11% de vazamento em 2500 s (Figura 31 A). Acima desta razão
as cinéticas apresentaram diversas fases e a % de vazamento aumentou. Nas
razões de 0,07 a 0,18 peptídeo/lipídeo o comportamento bifásico das cinéticas foi
76
menos evidente e o vazamento muito rápido após 600 s de adição do BP100 (Figura
31 A e B). O gráfico de % vazamento vs pep:lip é quase linear.
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
inte
nsid
ade
de F
luor
esce
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,03 0,07 0,15 0,18
A
-0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipideo
B
Figura 31. Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 4:6 mol:mol (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídeo/lipideo. A concentração de lipídios foi de 13,2 µM.
4.1.11 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 3:7 com BP100.
Nas LUVs de PC:PG 3:7 observou-se diversas fases, tal como observado nas
LUVs com proporções menores de PG. As cinéticas se caracterizaram por um
aumento rápido de fluorescência após adição do BP100, e depois disso
77
apresentaram uma diminuição na taxa de intensidade de fluorescência ou apenas
mantiveram uma fluorescência constante, como no caso da relação de 0,08
peptídeo/lipídeo. Nota-se também que a relação utilizada para obter 100% de
vazamento foi de 0,14, razão mais baixa do que foi necessária em LUVs de PC:PG
4:6 para obter a mesma porcentagem de vazamento (Figura 32 A e B). Nessas
vesículas, o menor valor da MIC, correspondente a 0,14 pep/lip ou 2,5 µM de
BP100, provocou 100% de vazamento de CF das vesículas (Figura 32 B).
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
100
200
300
400
500
Inte
nsid
ade
de F
luor
esce
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,02 0,05 0,08 0,14
A
0,00 0,05 0,10 0,15
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipideo
B
Figura 32. Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 3:7 mol:mol. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptideo:lipídeo. A concentração de lipídios foi de 18,0 µM.
78
4.1.12 Cinéticas de vazamento de CF de PC:PG 1:9 com BP100.
As LUVs de 90% de PG apresentaram cinéticas com uma velocidade baixa de
vazamento nas relações de 0,013 e 0,03 peptídeo/lipídeo e, depois em 1500 s, um
aumento de velocidade discreto, com uma porcentagem de vazamento de CF de 27
e 37% respectivamente (Figura 33 A e B). Com peptídeo/lipídeo de 0,04 a ação
imediata do BP100 causou 100% de vazamento para essa LUV o mesmo ocorrendo
em razões maiores de pep:lip (Figura 33 A e B).
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
100
200
300
400
500
600
700
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,013 0,03 0,04 0,05 0,08 0,13
A
-0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
Vaza
men
to
Razao peptideo/lipidio
B
Figura 33. Vazamento de CF de LUVs de PC:PG 1:9 mol:mol. (A) Cinética de vazamento de CF com a adição do BP100 nas razões peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídeo/lipideo. A concentração de lipídios foi de 18,0 µM.
79
4.1.13 Cinéticas de vazamento de CF de PG 100% com BP100.
Com LUVs de PG 100%, obteve-se 100 % de vazamento com uma razão 0,05
peptídeo/lipídeo (Figura 34 B), correspondendo a 1 µM de BP100, valor menor que a
menor MIC de 2,5 µM. Portanto, as outras razões de peptídeo/lipídeo estudadas
foram menores que 0,05. Essa foi a menor razão de peptídeo/lipídeo necessária
para obter 100 % de vazamento comparado a todas as outras LUVs já estudadas.
Em apenas 0,004 pep/lip o aumento da intensidade de fluorescência ocorreu
rapidamente logo após a adição do BP100 até 500 s, depois a velocidade de
vazamento foi mais lenta, entre 500 s a 2000 s e a partir desse tempo a cinética
atingiu 100% de vazamento (Figura 34 A). Nas demais razões pep:lip todas as
cinéticas foram não lineares, com aumento rápido de fluorescência e chegada a
100% de vazamento após 3.500 s (Figura 34 A e B).
80
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
100
200
300
400
500
600
700
In
tens
idad
e de
Flu
ores
cênc
ia, u
.a.
Tempo,s
Razao Pep/lip 0 0,004 0,0125 0,025 0,05
A
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipideo
B
Figura 34. Vazamento de CF de LUVs de PG 100 %. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs por adição de BP100 nas razões peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídeo:lipídeo. A concentração de lipídios foi de 20,0 µM.
Para verificar o efeito da carga na % de vazamento de CF fizemos o gráfico
de % vazamento vs razão [PG]/[Lipidio Total] na razão fixa de [BP100]:[lipídio] de
0,2, após 2.500 s (ou 0,4 considerando-se apenas a concentração de lipídios na face
81
externa da vesícula) (Figura 35). Verifica-se que o vazamento é acelerado a partir
de 20 % de PG. Quanto maior a razão peptidio/lipidio, menor a % de carga negativa
necessária para acelerar o vazamento.
[PG]/[Lipídio Total]
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
% V
azam
ento
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Figura 35. Vazamento de CF de LUVs após 2.500 s na razão BP100:lipídio de 0,2 em função da razão PG/lipídio total.
4.2 Efeito de BP100 na Cinética de Vazamento de CF de LUVs contendo Colesterol
4.2.4 LUVs de PC:Colesterol 63:37
Os experimentos feitos com LUVs contendo colesterol foram comparados aos
experimentos com LUVs de PC 100% e PC:PG 4:6.
Em LUVs de PC:colesterol 63:37, as cinéticas de vazamento de CF
apresentaram um comportamento linear em todas as relações de peptídeo/lipídeo
estudadas com vazamento pequeno, semelhante ao das LUVs de PC 100% (Figura
54 A). A porcentagem de vazamento de CF após 2.500 s foi de 5 a 15% no ponto
com maior [BP100] (10 µM de BP100), exceto na relação de 0,35 pep/lip aonde
houve cerca de 27% de vazamento (Figura 36 A e B). Não está claro porque houve
o aparecimento desse máximo de vazamento. A presença do colesterol não causou
interferência significativa na ação do BP100 e o efeito do peptídeo no vazamento de
CF foi semelhante ao observado com LUVs contendo apenas PC.
82
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 40000
50
100
150
200
250
300
350
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u. a
.
Tempo, s
Razao pep/lip 0 0,14 0,35 0,71 1,07 1,4
A
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Razao peptideo/lipidio
B
Figura 36. Vazamento de CF de LUVs de PC:colesterol 63:37. (A) Cinética de vazamento de CF das LUVs com adição do BP100 nas relações peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF em função da razão peptídeo/lipideo. A concentração de PC é 4,3 µM e a de colesterol 2,5 µM.
83
4.2.5 Cinética de LUVs de PG:colesterol 64:36 com BP100
Na cinética com LUVs de PG:Col 6:4, na razão de pep/lip de 0,125, a porcentagem
de vazamento foi praticamente 100 % até 250 s depois da adição do BP100. Nas
razões peptídeo/lipídeo menores, houve um vazamento rápido e depois um aumento
lento de fluorescência em função do tempo 250 s (Figura 37 A e B). Entretanto, o
máximo de fluorescência não foi atingido nas razões menores de pep:lip. O perfil das
cinéticas não é bifásico, como observado com as LUVs de PC:PG 4:6. A Figura 37 A
mostra a cinética de PG:Col 64:36, e na Figura 37 B a porcentagem de vazamento
em diferentes concentrações de BP100 após 2.500 s. Observa-se que a presença
de colesterol leva a uma diminuição na % de vazamento de vesículas contendo PG
e, alem disso, o vazamento total das vesículas não é alcançado no período de
estudo.
84
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0
200
400
600
800
1000
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao Pep/lip 0 0,0125 0,025 0,0375 0,0625 0,125
A
0,00 0,05 0,10 0,15
0
20
40
60
80
100
Porc
enta
gem
de
Vaza
men
to
Razao peptideo/lipidio
B
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
0
20
40
60
80
100
PG 60% + PC PG 60% +col
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to
Concentraçao de BP100 µM
C
Figura 37. Vazamento de CF de LUVs de PG:colesterol 64:36. (A) PG:col 6:4 com adição do BP100 nas relações peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) Porcentagem de vazamento de CF de LUVs de PG:colesterol em função da razão pep/lip, após 2400 s. (C) Curvas de % vazamento de CF vs [BP100] de LUVs de PC:PG 6:4 e PG:Col 6,4:3,6, em diferentes razões peptídeo/lipídio. As concentrações de lipídios foram de 2,0 µM de colesterol e 3,5 µM de PG.
85
Na Figura 37 C pode-se ver o efeito da razão pep:lip na % de vazamento das
LUVs de PG:Col 64:36 e LUVs de PG:PC 6:4 em função da concentração de BP100.
O vazamento nas LUVs de PG:colesterol é menor do que nas vesículas de PC:PG
nas razões de pep/lip mais altas (Figura 37 C). Outra característica que diferencia o
efeito de BP100 nas LUVs de PG:colesterol é que, aparentemente, uma vez formada
a estrutura contendo BP100 na bicamada da vesícula a saída do BP100 é lenta e
não se chega a 100 % de vazamento. É como se, uma vez ligado à membrana, o
BP100 não sai mais e não permeabiliza outras vesículas.
86
Tabela 2- Efeito da Concentração de BP100 e da relação BP100/Lipídio na % de vazamento da CF após 2.500 s. [Pi] é a concentração total de fosfolipídio em cada experimento.
PC 100% e [Pi] = 21,3 µM PC:PG 9:1 e [PI] = 11,3 µM PC:PG 8:2 e [Pi] = 16,4 µM
[BP100] µM Pep/Lip % Vaz [BP100] µM Pep/Lip % Vaz [BP100]
µM Pep/Lip % Vaz
0 0 1,56 0 0 0 0 0 0 1 0,0469 8,58 0,6 0,0531 4,4 1 0,061 0 5 0,235 13,06 1,5 0,133 6,3 2,5 0,152 10
7,5 0,352 8,54 2,5 0,221 13 5 0,305 43,5 10 0,469 14,12 5 0,442 74 7,5 0,457 22,6 7,5 0,664 43 10 0,885 39
PC:PG 7,5:2,5 e [Pi] = 12,5 µM PC:PG 7:3 e [Pi]= 23,5 µM PC:PG 6:4 e [Pi] = 10,5 µM
0 0 2,6 0 0 10 0 0 10 0,5 0,04 8 1 0,042 14 1 0,095 33 1,5 0,12 11 2,5 0,106 37 2,5 0,238 73 2,5 0,2 28,7 5 0,213 82 5 0,476 100 5 0,4 74,8 7,5 0,319 75 7,5 0,714 98
7,5 0,6 71 10 0,425 92 10 0,952 100 10 0,8 60 20 0,851 87 20 1,905 100 20 1,6 85,4 PC:PG 5:5 e [Pi] = 13 µM PC:PG 4:6 e [Pi] = 13,2 µM PC:PG 3:7 e [Pi] = 18 µM
0 0 2,9 0 0 9 0 0 10,2 0,5 0,0385 11,1 0,5 0,0379 11 0,25 0,0139 18 1 0,0769 42 1 0,0757 49 0,5 0,0279 32,73
1,5 0,115 100 2 0,151 77 1 0,0555 70,6 2,5 0,192 78,8 2,5 0,189 91 1,5 0,0833 86,1 5 0,385 97,7 2,5 0,1390 95,7 PC:PG 1:9 e [Pi] = 18 µM PG 100% e [Pi] = 20 µM 0 0 6,4 0 0 5
0,25 0,0139 27 0,08 0,004 99 0,5 0,0278 37 0,25 0,0125 89
0,75 0,0417 100 0,5 0,025 100 1 0,0556 88 0,75 0,0375 100
1,5 0,0833 90 1 0,05 100 2,5 0,1389 100
87
4.3 Estudo do Vazamento de Vesículas Contendo Pireno-tetrasulfonato de sódio (PTS) com a Adição de BP100 a Baixa Força Iônica.
Em vários experimentos desta dissertação medimos a interação do BP100
com LUVs e GUVs em condições de baixa força iônica. Os estudos de dicroísmo
circular, mobilidade eletroforética e diâmetro hidrodinâmico do BP100 e sua
interação com as LUVs foram todos realizados em baixa força iônica.
Existem relatos na literatura de peptídeos antimicrobianos que possuem
atividade diferenciada com maior ou menor concentração de sal no meio (Brugles et
al., 2008, Raghuraman & Chattopadhyay, 2006). Para podermos comparar os
resultados obtidos com os diversos métodos e a capacidade de permeabilização das
LUVs optamos por utilizar outro método com marcador fluorescente que pudesse ser
feito em baixa força iônica também. Para isso utilizamos o PTS como fluoróforo no
compartimento aquoso interno das LUVs e adicionamos, externamente, um
supressor, neste caso o Metilviologênio (MV). Com este sistema, a força iônica
externa é muito menor do que nos experimentos de LUVs com CF.
O PTS é uma molécula fluorescente nas condições de incorporação nas LUVs
utilizadas e o MV é seu supressor. Assim, ao colocarmos as vesículas contendo PTS
num meio com MV, a amostra apresenta uma fluorescência inicial alta e, quando o
PTS passa para o espaço aquoso externo por ação do BP100, o MV suprime a
fluorescência do PTS. Portanto é possível verificar o efeito do peptídeo na
permeabilidade da membrana das LUVs medindo-se a velocidade de diminuição da
fluorescência do PTS na presença de concentração adequada de MV.
Foi feita inicialmente uma curva de calibração de supressão de PTS por MV,
como mostrado em Métodos, para determinar a menor quantidade a ser utilizada de
MV para suprimir a fluorescência do PTS. Posteriormente, preparamos as vesículas
88
contendo PTS, que foram passadas pela coluna de Sephadex-G25 para retirada do
PTS externo. A eluição das vesículas foi feita com tampão Tris/HCl 0.008 M, pH 8
para compensar a força iônica da solução 1 mM de PTS incorporada no interior das
LUVs.
Alíquotas de 5µL das LUVs com PTS incorporado foram adicionadas a uma
cubeta de fluorescência contendo 500 µL de tampão TRIS/HCl 8 mM pH 8 e 1 mM
de metil viologênio (Figura 18 B). A cinética foi realizada pelo tempo desejado e,
após adição de polidocanol, a fluorescência se tornou próxima de zero comprovando
o rompimento total das vesículas e supressão total da fluorescência do PTS pelo
MV.
4.3.4 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC 100% com BP100.
Estudou-se o efeito da adição de BP100 na supressão de fluorescência do
PTS pelo MV utilizando-se diferentes concentrações de peptídeo. Os resultados
estão na Figura 38. Observa-se, em todas as concentrações de peptídeo utilizadas,
que a fluorescência do PTS diminui em função do tempo com velocidade sempre
maior do que na ausência de peptídio.
Nas razões molares pep/lip menores que 0,23 o vazamento do fluoróforo foi
menor do que 5 % (Figura 38 A e B). Em todas as cinéticas feitas observou-se, após
a adição de BP100 em 50 s, ocorreu uma diminuição linear de fluorescência em
função do tempo. Em razões molares acima de 0,15 pep/lip, há um vazamento da
ordem de 20 % até cerca de 350 s e, após 900 s, a fluorescência ficou constante. Na
Figura 38 B pode-se observar que acima da razão pep/lip de 0,15 já ocorreu um
aumento de vazamento significativamente diferente do vazamento de PTS na
ausência de peptídeo.
89
Esses resultados são semelhantes ao vazamento de CF de LUVs de PC
100%, pois nestes experimentos também se observou uma cinética linear e um
vazamento reduzido, de menos de 20%, comparado com as vesículas sem BP100.
0 200 400 600 800 1000-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
In
tens
idad
e de
Flu
ores
cênc
ia, u
. a.
Tempo, s
Razao pep/lip00,070,150,230,31
A
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
0
5
10
15
20
25
30
% d
e va
zam
ento
Razão peptídio/liídp
B
Figura 38. Vazamento de PTS de LUVs de PC 100%. (A) Cinética de vazamento de PTS nas razões de peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico. (B) % de vazamento vs razão peptídio/lipídio. [lipídio] =11,6 µM e MV 1 mM em Tris/HCl 0.01 M pH 8
90
4.3.5 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 7:3 com BP100.
O efeito de BP100 na variação de fluorescência em função do tempo das
vesículas com PTS estão na Figura 39 A. Na ausência de peptídeo observa-se um
vazamento pequeno e linear em função do tempo. Com adição de BP100 observam-
se, em todas as razões pep/lip estudadas, duas velocidades distintas no gráfico de
fluorescência versus tempo e a % de vazamento foi muito maior do que a observada
com as LUVs de PC 100% (Figura 39 A e Figura 38 A e Tabela 3).
Observa-se na Figura 39 B que, mesmo sem a adição de BP100, ocorre
vazamento em torno de 10% após 900 s, resultado também observado nos
experimentos com CF. As porcentagens de vazamento calculadas para os
experimentos de CF e PTS incorporados nas LUVs são diferentes e as porcentagens
de vazamento de PTS, nas mesmas relações de pep/lip, apresentam valores muito
maiores comparados aos vazamentos de CF das LUVs em alta força iônica (Tabela
3).
A porcentagem de vazamento aumenta com razão pep/lip aparentemente
atingindo uma saturação em alta razão pep/lip. Pode-se observar também a
existência de um valor mínimo da razão pep/lip onde o fenômeno de vazamento é
acelerado (Figura 39 B).
91
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
120
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao pep/lip 0 0,04 0,1 0,21 0,32 0,43
A
0,0 0,1 0,2 0,3 0,410
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% d
e va
zam
ento
Razao pep/lip
B
Figura 39. Vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 7:3 em presença de MV. (A) Cinética intensidade de fluorescência do PTS em função do tempo nas razões peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico, [lipídio]= 23 µM. (B) Gráfico da porcentagem de vazamento após 900 s.
4.3.6 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 1:1 com BP100.
O efeito da concentração de BP100 no vazamento de PTS nas LUVs de
PC:PG 1:1 pode ser observado na Figura 40 A. Na razão de 0,014 peptídeo/lipídeo
92
observou-se uma diminuição discreta de intensidade de fluorescência até
aproximadamente 200s e depois um aumento de velocidade acima desse tempo.
Aparentemente vários fenômenos estão acontecendo com o sistema já que a
variação de fluorescência não segue uma função matemática simples em todas as
razões pep/lip (Figura 40 A). Na figura 40 B pode-se observar que o gráfico de
porcentagem vazamento vs a razão pep/lip é análogo a uma curva de saturação a
alta razão pep/lip.
0 200 400 600 800 1000-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Inte
nsid
ade
de F
lour
escê
ncia
, u.a
.
Tempo, s
Razao pep/lip 0,014 0,021 0,028 0,042 0,07 0,08 0,14
A
-0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,160
20
40
60
80
100
% d
e Va
zam
ento
Razao pep/lip
B
Figura 40. Vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 1:1 de, num meio com MV. (A) Cinética de intensidade de fluorescência do PTS em função do tempo nas razões de peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico, [lipídios] = 17,8 µM. (B) Gráfico da porcentagem de vazamento da respectiva cinética.
93
Em todas as razões de pep/lip utilizadas neste experimento, houve uma
grande diminuição de fluorescência logo após a adição do peptídeo (Figura 40 A e
B). Como a força iônica externa é baixa, a ligação do BP100 às LUVs é mais alta do
que nos experimentos com CF realizados em 300 mM de NaCl, o que explica o salto
inicial ser maior nas LUVs com PTS do que com as contendo CF.
4.3.7 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 7:3 com BP100.
Em LUVs de PG:PG 7:3, em todas as razões peptídeo/lipídeo, ocorre uma
diminuição não linear de fluorescência em função de tempo sendo possível observar
várias fases. Houve em todas as cinéticas uma grande diminuição da intensidade de
fluorescência antes de 200 s e após esse tempo foi observado um vazamento mais
lento (Figura 41 A).
As razões estudadas nos experimentos com CF apresentaram vazamento de
95,7% na razão de 0,14 pep/lip enquanto nos experimentos utilizando o PTS
também foi obtido 98% de vazamento para essa mesma LUV de 70% de carga
negativa em sua composição (Figura 41 A). Portanto, nas LUVs de PG:PC 7:3 com
BP100, observou-se uma maior porcentagem de vazamento nos experimentos
utilizando o PTS quando comparado aos experimentos de CF (Figura 41 A). Além
disso, as LUVs de 70% de carga negativa apresentaram porcentagens de
vazamento levemente inferiores às LUVs de 50% de PG.
94
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u. a
.
Tempo, s
Razao pep/lip 0 0,023 0,035 0,047 0,095 0,11 0,140 0,23
A
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,250
20
40
60
80
100
% V
azam
ento
Razao pep/lip
B
Figura 41. Vazamento de PTS de LUVs de PC:PG 3:7. (A) Cinética fluorescência do PTS em função do tempo nas razões peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico [lipídio]= 11,6 µM). (B) Gráfico da porcentagem de vazamento vs pep/lip.
4.3.8 Cinéticas de vazamento de PTS de LUVs de PG 100% com BP100.
A cinética das vesículas de PG 100% sem BP100 apresentou diminuição de
fluorescência, especialmente após 300 s, o que indica uma menor estabilidade da
95
vesícula controle, ocorrendo um vazamento de 38% (Figura 42 A e B). Na razão de
0,014 peptídeo/lipídeo observou-se vazamento rápido após a adição de BP100,
porém em torno de 110 s, essa velocidade diminuiu (Figura 42 A). Claramente, nas
demais razões de pep:lip ocorrem duas fases no processo de vazamento do PTS,
uma fase rápida seguida de outra mais lenta (Figura 42 A). A % de vazamento após
900 s é praticamente 100 % para razões pep:lip acima de 0,02 Figura 42 B).
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
, u. a
.
Tempo, s
Razao pep/lip0 0,014 0,021 0,028 0,04 0,07 0,0,7 0,14
A
-0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,1630
40
50
60
70
80
90
100
Porc
enta
gem
de
vaza
men
to %
Razao pep/lip
B
Figura 42. Vazamento de PTS de LUVs de PG 100% num meio com MV. (A) Cinética fluorescência do PTS em função do tempo nas razões peptídeo/lipídeo indicadas no gráfico [lipídio]= 24,5 µM. (B) Gráfico da porcentagem de vazamento da respectiva cinética.
96
Comparando-se este experimento com LUVs de PG 100% com PTS
encapsulado em baixa força iônica aos experimentos utilizando CF e alta força
iônica, é possível notar a grande diferença de porcentagem de vazamento. Na
Tabela 3 são mostradas as % de vazamento de PTS e CF em razões
peptídeo/lipídeo semelhantes.
Estes resultados mostram claramente que o BP100 se liga às LUVs por um
componente eletrostático muito forte e que essa interação é diminuída pela presença
de sal. Porem, mesmo na presença de 0,3 M NaCl o BP100 se liga
significativamente às LUVs e promove a permeabilização da bicamada das LUVs
liberando o conteúdo interno das mesmas.
97
Tabela 3. Porcentagem de Vazamento de CF e PTS de LUVs nas várias razões de BP100/lipídeo. A porcentagem de vazamento se refere ao tempo de 900 s para o vazamento de LUVs com CF e PTS.
LUVs (Lipídeo, µM) [BP100], µM [BP100]/[Lipídeo] %Vaz PTS %Vaz CF*
PC 100% (11,1) 0 0 0 -
2,5 0,078 0 -
5 0,156 0 -
7,5 0,234 21 6
10 0,312 26 9
PC:PG 7:3 (23,0) 0 0 16 -
1 0.044 24 8
2,5 0.109 48.7 13,8
5 0.217 69 37
7,5 0.326 81.4 22,78
10 0.435 89.7 42,17
PC:PG 1:1 (17,8) 0 0 11,3 -
0,5 0,014 29 -
0,75 0,021 49 -
1 0,028 52,5 7
1,5 0,042 76 -
2,5 0,07 92,5 11,5
3 0,084 100 --
5 0,140 com PTS e 0,11 com CF 100 33
PC:PG 3:7 (21,0) 0 0 13,7 -
0,5 0,024 46 15,4
0,75 0,036 59 -
1 0,048 63 43
2 0,095 87 -
2,5 0,119 96 -
3 0,143 98 100
5 0,238 100 -
PG 100% (24,5) 0 0 38 -
0,75 0,014 68 100
1 0,021 78 100
1,5 0,029 93 -
2,5 0,043 95 100
3 0,072 98 -
5 0,086 100 - *As concentrações de lipídio dos experimentos de CF estão na Tabela 2.
98
4.4 Resultados dos Estudos de Dicroísmo Circular
4.4.4 Dicroísmo Circular do BP100 em água
Foram obtidos os espectros de dicroísmo circular, CD, de soluções de BP100
em água variando-se a concentração do peptídio, Figura 43 A. Observou-se uma
banda negativa em 197 nm para todas as concentrações. Nas concentrações de 5 e
10 µM de BP100 observou-se também uma banda positiva em 216 nm (não
mostrado). O espectro de CD do BP100 em água é compatível com uma estrutura
ao acaso quando se compara esses resultados com os espectros de estruturas
padrões descritos na literatura (Greenfield and Fasmann, 1969) e Figura 21.
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
[φ] (
103 .d
eg.c
m2 .d
mol
-1)
λ, nm
[BP100], µM25 50 75 100
Figura 43. Espectro de Dicroísmo Circular do BP100 em diferentes concentrações.
Os espectros do BP100 em 50 µM apresentaram uma razão sinal/ruído
adequada e essa concentração foi utilizada para verificar o efeito da presença de
LUVs, de diferentes composições lipídicas, na estrutura secundária do BP100.
99
4.4.5 Estudo de Dicroismo Circular do BP100 em água com LUVs de PC
100%
Estudou-se o efeito da concentração de LUVs de PC 100% no espectro de
CD de BP100 50 µM (Figura 44). Os espectros do BP100 na presença de
concentrações diferentes de LUVs de PC 100% são muito semelhantes ao obtido
com o BP100 puro (Figura 44). Observou-se, porém, em razões de pep/lip entre 0,6
e 6,7 (mol/mol), que além da banda negativa em 197 nm, aparecem pequenos
ombros próximos a 200 nm. Acima de 210 nm também se observaram ombros não
muito bem definidos e cuja posição variou com concentração de LUVs (Figura 44).
190 200 210 220 230 240 250-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
[φ] (
103 .d
eg.c
m2 .d
mol
-1)
λ, nm
[BP100], µM em H2O 50
Razao de pep/lip 6,7 3,4 1,7 1,2 0,8 0,7 0,6
Figura 44. Espectro de Dicroísmo Circular do BP100 em 50 µM, com LUVs de PC 100%. As razões molares peptídio/lipídio estão na figura.
Comparando-se os experimentos de CD realizados com BP100 e LUVs de PC
100% com os resultados obtidos no estudo de vazamento de CF e PTS notamos as
seguintes semelhanças:
1-Houve uma pequena alteração no espectro de CD do BP100 na presença
de LUVs com 100 % PC.
100
2-Nos experimentos de fluorescência com LUVs com PC100% contendo PTS,
em baixa força iônica e razão pep/lip 0,31, a porcentagem de vazamento foi de 26%.
Com LUVs de PC100% contendo CF, em alta força iônica, a porcentagem de
vazamento foi de 14% numa razão pep/lip 0,46.
Estes resultados, em conjunto, indicam uma pequena interação do BP100
com LUVs de PC 100 %, em baixa e alta força iônica, com pequena mudança na
estrutura secundária do BP100.
4.4.6 Estudo de Dicroismo Circular do BP100 em água com LUVs LUVs
de PC:PG 9:1
O espectro de dicroísmo circular do BP100 mudou significativamente na
presença de LUVs de PC:PG 9:1 (Figura 45). Com a adição de concentrações
crescentes de LUVs houve um deslocamento da banda em 197 nm para
comprimentos de onda maiores e o aparecimento de nova banda negativa próxima
de 215 nm. Não foi possível, com as LUVs de PC:PG 9:1, fazer uma relação entre a
estrutura do BP100 e a concentração das LUVs mas, claramente, a interação dessas
LUVs contendo PG modificou a estrutura secundária do BP100.
O efeito da presença de 10% de PG nas LUVs também aumenta o vazamento
das vesículas contendo CF. Este efeito de vazamento está de acordo com a
mudança estrutura do BP100 observada por CD.
101
190 200 210 220 230 240 250
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
[φ] (
103 .d
eg.c
m2 .d
mol
-1)
λ, nm
[BP100], µM em H2O 50
[LUVs], µM + BP100 2,5 1,25 0,625 0,41 0,31 0,25 0,2 0,17
Figura 45. Espectro de Dicroismo Circular do BP100, 50 µM, na presença de LUVs de PC:PG 9:1. As razões molares peptídio/lipídio estão na figura.
4.4.7 Estudo de Dicroismo Circular do BP100 em água com LUVs de
PC:PG 7:3
Com LUVs de PC:PG 7:3 e 50 µM de BP100 (Figura 46), na razão de 2,5
pep/lip, o efeito das LUVS no espectro de CD do BP100 foi semelhante ao obtido em
água, observando-se uma banda negativa em 197 nm. À medida em que
concentração de LUVs aumenta (diminui a razão pep/lip) observa-se que a banda
em 197 nm diminui de intensidade, passa por zero e fica positiva. Na região de 205
a 240 nm aparecem vários ombros em diferentes comprimentos de onda. Na razão
de 0,2 pep/lip já é possível observar tres bandas negativas de maior intensidade que
nas razões pep/lip maiores, uma banda negativa em 208 nm, 217 nm e a última
também negativa em 224 nm (Figura 46 A). O efeito da razão pep/lip na elipticidade
molar em 197 e 222 nm é mostrado nas figuras 46 B.
102
Os resultados obtidos com adição de LUVs de PC:PG 7:3 na solução de
BP100 mostraram grande mudança estrutural no BP100 nas mais baixas razões de
pep/lip (de 0,4 a 0,16). Esses resultados são correspondentes aos efeitos do BP100
no vazamento de PTS, feito também nas mesmas condições de baixa força iônica.
Com 0,4 de pep/lip nos experimentos de fluorescência com PTS, o vazamento
correspondeu a 89%, já nos experimentos de CD, essa razão correspondeu a
inversão do espectro de dicroísmo da banda 197 nm de sinal negativo para positivo.
Nas razões de 0,3 e 0,2 pep/lip, a cinética de vazamento do PTS apresentou
comportamento não linear com até cerca de 80 % de vazamento total (69 e 81% de
vazamento respectivamente). Nos experimentos de CD, o espectro da razão de 0,2
peptídeo/lipídeo apresentou a nova conformação do BP100, apresentando bandas
negativas em 208 e 222 nm, e positiva em 197 nm.
Pode-se notar, portanto que quanto maior a carga negativa da superfície da
vesícula e menor a quantidade de BP100 adicionada à suspensão lipídica (baixas
razões pep/lip), maior a mudança estrutural do peptídeo BP100. E, em contrapartida,
quanto maior a razão de pep/lip, maior o vazamento PTS.
103
190 200 210 220 230 240 250
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
[φ
] (10
3 .deg
.cm
2 .dm
ol-1)
λ, nm
[BP100], µM em H20 50
[LUVs], µM +BP10 50 100 200 300 400 500 600 750
A
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5-60
-40
-20
0
20
40
60
[φ] (
103 .d
eg.c
m2 .d
mol
-1)
Razao pep/lip
λ, nm 197 nm 222 nm
B
Figura 46. A) Espectros de Dicroismo Circular do BP100 50 µM, com diferentes concentrações de LUVs de PC:PG 7:3. B) Valores de elipticidade molar vs razão de pep/lip em 197 nm e 222 nm.
104
4.4.8 Estudo de CD de BP100 em água com LUVs de PC:PG 1:1
O efeito de LUVs de PC:PG 1:1 no espectro de CD do BP100 é mostrado na
Figura 47. Observam-se as mesmas mudança que as obtidas com LUVs de PC:PG
7:3. A elipticidade molar diminui em 197 nm com o aumento da concentração das
LUVs (Figura 47 B). Com uma razão de pep/lip 0,27 a banda em 197 nm fica positiva
e há o aparecimento de outras bandas negativas em 206 nm e 225 nm (Figura 47
A). O efeito das LUVs na elipticidade molar em 197, 207 e 222 nm é mostrado nas
figuras 47 B, C, D.
Na razão de 0,1 de pep/lip e LUVs PC:PG 1:1 observou-se uma cinética de
vazamento de PTS não linear com vazamento de 100%. Na mesma razão pep/lip o
espectro de CD do BP100 foi semelhante a uma estrutura em alfa-hélice, com uma
banda positiva em 197 e bandas negativas em 208 e 222 nm.
Assim, pode-se concluir que o aumento na carga negativa das LUVs aproxima
a estrutura do BP100 a uma α-hélice.
105
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
[φ] (
103 .d
eg.c
m2 .d
mol
-1)
λ, nm
[BP100], µM em H2O 50
[LUVs], µM +BP100 50 100 200 300 400 500 600 750
A
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
[φ] (
103 .d
eg.c
m2 .d
mol
-1)
Razao pep/lip
λ, nm 197 nm 207 nm 222 nm
B
Figura 47. A) Espectro de Dicroismo Circular do BP100 50 µM com LUVs de PC:PG 1:1. B) Efeito da razão de pep/lip na elipticidade molar do BP100 em 197, 207 e em 222 nm.
106
4.5 Estudos de Mobilidade Eletroforética das LUVs com BP100
As medidas de mobilidade eletroforética e tamanho das LUVs foram
realizados com o fim de complementar as informações já obtidas com os
experimentos de fluorescência e dicroísmo circular (CD). Nos estudos com LUVS
contendo CF ou PTS observamos que, dependendo da relação pep/lip ocorre a
permeabilização das vesículas com liberação para o meio externo dos compostos
fluorescentes incorporados no compartimento aquoso. A diferença entre os
experimentos de vazamento de LUVs contendo CF dos feitos com LUVs contendo
PTS é a força iônica utilizada nos experimentos com CF (ver resultados). Nos
experimentos em baixa força iônica observou-se formação de agregados com a
adição de BP100 nas LUVs contendo misturas de PC:PG mas não nas LUVs com
100 % PC.
Nos experimentos a seguir mediu-se a mobilidade eletroforética de LUVs de
diferentes composições lipídicas após a adição de concentrações crescentes de
BP100 (Figura 48 A) em tampão Tris/HCl 0.01 M pH 8, portanto em baixa força
iônica.
Para LUVs com 100 % PC a mobilidade inicial foi de -1 µm.cm/V.s (Figura 33
A). Adicionando-se BP100 a essas LUVs observa-se que a mobilidade das vesículas
diminui, passa por zero e, com o aumento da [BP100], as vesículas passam a ter
carga positiva chegando a um valor de +1 µm.cm/V.s em 25 µM de BP100. Não foi
possível determinar uma constante de ligação do BP100 às LUVs, mas este
experimento foi utilizado para demonstrar que o BP100 se liga às LUVs de PC
107
mesmo na ausência de PG. Apesar das LUVs de PC 100 % serem neutras, como a
medida é feita em tampão Tris/HCl, os íons do tampão se ligam aos íons da cabeça
polar da PC (trimetilamônio e fosfato) conferindo carga às LUVs que, por isso,
migram no campo elétrico. Essa ligação, entretanto, não é suficiente para induzir um
vazamento apreciável de CF ou PTS das LUVs no tempo utilizado nesses
experimentos.
Em LUVs com 10 e 20% de PG a mobilidade eletroforética inicial é em torno
de -3,5 µm.cm/V.s, compatível com a presença de fosfolipídio negativo. Com adição
de pequenas quantidades de BP100 a mobilidade eletroforética é reduzida
linearmente chegando a 0 µm.cm/V.s quando a razão pep:lip era igual a 0,2 (Figura
48 B). A partir dessa razão a mobilidade passou a ter valores positivos, mas
inclinação da curva de mobilidade vs razão pep:lip diminui bastante. Em 25 µM de
BP100 o valor máximo de mobilidade alcançado foi + 0,5 µm.cm/V.s.
Em LUVs de 30, 40, 50 e 70% de PG nas vesículas, os valores iniciais de
mobilidade, sem adição de BP100 estavam entre -3,5 e -2 µm.cm/V.s. O potencial
de superfície dessas vesículas praticamente se manteve constante, aumentando
ligeiramente até a adição de 5 µM de BP100 (Figura 48 A). Após de adição de 7,5
µM do peptídeo, a mobilidade aumentou abruptamente, chegando próximo a 0
µm.cm/V.s e se manteve constante até 25 µM de BP100 (Figura 48 A).
108
0 5 10 15 20 25-4
-2
0
2
Mob
ilidad
e el
etro
foré
rica
[BP100] uM
PC:PG:Col 1:0:0 9:1:0 8:2:0 7:2:0 6:4:0 1:1:0 3:7:0 2:8:0 1:9:0 0:1:0 6:0:4 3:3:4 0:6:4
A
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Mob
ilidad
e el
etro
foré
tica,
µm
cm/v
s
Razao pep/lip
PC:PG 1:0 9:1 8:2 7:3 6:4 1:1 3:7 2:8 1:9 0:1
B
% POPG
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Mob
ilida
de E
letr
ofor
étic
a (µ
mcm
/vs)
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
Figura 48. Mobilidade eletroforética das LUV diversas razões PC:PG em Tampão Tris/HCl 0.01M pH 8,0, da ordem de 25 µM de lipídio. A) Adição de BP100 B) Mobilidade eletroforética x razão de peptídeo/lipídeo de LUVs. C) Mobilidade Eletroforética das LUVs em função da % PG sem adição de BP100.
C
109
Na figura 48 C a mobilidade eletroforética inicial das vesículas foi graficada
em função da razão pep:lip. Observa-se que a mobilidade eletroforética inicial varia
pouco com a % PG nas LUVs, mas acima de 20% de PG, a mobilidade se mantem
constante e da ordem de -3 µm.cm/V.s até 40 % de PG. Acima desta % de PG a
mobilidade diminui para -2 até 90 % de PG. Com 100 % de POPG observa-se novo
decréscimo. Isto se deve ao fato de que, quando há mais PG na vesícula ocorre
maior ligação de contra-íons, (Na+ e TRIS-H+
A adição de BP100 nas LUVs contendo PG não causa grande mudança à
mobilidade da vesícula, a não ser quando ocorre neutralização total da carga da
vesícula. Isto pode ser verificado pelo salto que se observa no valor de mobilidade
na Figura 48 A. A manutenção da carga da vesícula é explicada pela ligação do
peptídeo e conseqüente a troca dos contra-íons (Na
), mantendo-se, porém a carga das
vesículas constante.
+ e TRIS-H+
A pequena variação da mobilidade eletroforética das vesículas com adição de
baixas concentrações do peptídeo, foi semelhante nas LUVs de 30 a 70% de PG,
porém, a concentração de BP100 necessária para ocorrer a neutralização foi
diferente (Figura 48 A). Na Figura 48 B estão os valores de mobilidade eletroforética
vs pep/lip, de LUVs de composições diferentes, que tem o mesmo perfil que o
gráfico da Figura 48 A.
) da superfície pelo
BP100 que também é positivamente carregado. Portanto ocorre apenas uma
substituição dos íons da superfície pelo BP100 com manutenção da carga. A partir
da neutralização de todas as cargas da superfície das vesículas, a ligação de mais
BP100, impõe uma carga positiva nessas vesículas.
110
Foi feito também um pequeno estudo do efeito de colesterol na mobilidade
eletroforética de LUVs em presença de BP100 (Figura 49). Observa-se que com PC
100 % e PC:colesterol 60:40, em baixas concentrações de BP100, este liga menos
às LUVs, como pode ser verificado pela menor mobilidade eletroforética. Mas em
altas concentrações de peptídeo, o colesterol não faz mais diferença na ligação. Em
LUVs contendo PC:PG 6:4 e PC:PG:colesterol 3:3:4, a presença de colesterol
diminui a ligação do peptídeo. Isto pode ser explicado pela diminuição dos grupos
carregados na superfície da vesícula (que estão presentes quando existe PC na
vesícula) e aumento da rigidez da membrana devido a incorporação do colesterol.
Nos experimentos de mobilidade eletroforética observou-se o aparecimento
de turbidez na cubeta em certas LUVs e em algumas relações específicas de pep/lip.
Assim, foi feita a determinação do diâmetro hidrodinâmico nas mesmas condições
das medidas de mobilidade eletroforética para verificar o efeito do BP100 no
tamanho das LUVs.
0 5 10 15 20 25-5,0
-4,5
-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Mbi
lidad
e el
etro
foré
tica,
µm
cm/v
s
[BP100], µΜ
PC 100% PC:Col 6:4 PC:PG 7:3 PC:PG:Col 3:3:4 PG 100 % PG:Col 6:4
Figura 49. Efeito da razão peptídeo/lipídeo na mobilidade eletroforética de LUVs com e sem colesterol , com ~25 µM de lipídio na cubeta.
111
4.6 Estudo do efeito de BP100 no Diâmetro Hidrodinâmico das Vesículas
As LUVs resultantes do processo de extrusão apresentam um diâmetro inicial
da ordem de 100 nm, independente da composição lipídica. As LUVs de PC 100% e
de PC:Col 6:4 não apresentaram variação de diâmetro após adição de BP100
mesmo nas maiores concentrações utilizadas (25 µM) (Figura 50).
As LUVs contendo PG, entretanto, a partir de uma determinada razão pep:lip,
apresentaram um certo grau de turvação que correspondia à formação de
agregados. Com 10 % de PG nas LUVs, a partir de 4 µM (relação 0,2 pep/lip) de
BP100, o diâmetro das vesículas aumentou de 100 nm chegando a um máximo de
aproximadamente 1.400 nm e, a partir de 10 µM de peptídio ( 0,5 pep/lip), o tamanho
diminuiu chegando próximo de 300 nm em 22 µM de BP100 (Figura 50 A B).
Para LUVs com diferentes % de PG, adições de BP100 promoveram o
mesmo fenômeno, ou seja, o diâmetro aparente aumentou chegando a um máximo e
depois houve diminuição, o mesmo ocorrendo com a polidispersidade (Figura 50 C).
Pode-se notar que quanto mais aniônica a membrana, maior a concentração
de BP100 necessária para causar a agregação das LUVs. As LUVs de 10% de PG
apresentaram mudança de diâmetro hidrodinâmico com 4 µM de BP100 enquanto as
de PG 100% foi preciso de 11 µM do peptídeo por exemplo.
A razão de 0,44 pep/lip, aonde se observa a agregação de LUVs de PG
100%, é muito maior que a razão mínima para o efeito de vazamento de
aproximadamente 100% de PTS em baixa força iônica, que ocorre em 0,029 pep/lip.
Em LUVs de 30% de POPG foi preciso uma razão de 0,37 pep/lip para causar
a agregação de LUVs. Essa razão de BP100/lipídeo corresponde a cinética de
vazamento de PTS não linear e que apresenta quase 100% de vazamento (razão de
112
0,4 pep/lip nas cinéticas). Além disso, no experimento de dicroísmo circular, essa
razão apresentou uma transição do comportamento randômico para a estrutura
semelhante a uma alfa-hélice.
0 5 10 15 20 25
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Diâm
etro
hid
rodi
nâm
ico, d
.nm
[BP100], µM
PC:PG:col 1:0:0 9:1:0 8:2:0 7:2:0 6:4:0 1:1:0 4:6:0 3:7:0 2:8:0 1:9:0 0:1:0 6:0:4 3:3:4 0:6:4
A
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Diâm
etro
hid
rodi
nâm
ico, d
. nm
Razao pep/lip
PC:PG 1:0 9:1 8:2 7:3 6:4 1:1 4:6 3:7 2:8 1:9 0:1
B
0 5 10 15 20 250,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Polid
isper
sivid
ade
PC:PG:Col 1:0:0 9:1:0 8:2:0 7:3:0 6:4:0 1:1:0 4:6:0 3:7:0 2:8:0 1:9:0 0:1:0 6:0:4 3:3:4 0:6:4
[BP100], µM
Figura 50. Efeito de BP100 no diâmetro hidrodinâmico das diversas LUVs. A) Efeito da [BP100]em 20 µM de lipídio em Tampão Tris/HCl 0.01 M pH8 . B) Efeito da razão peptídeo/lpídeo no diametro das LUVs.C) Polidispersidade das medidas de diâmetro hidrodinâmico das diversas LUVs com adição de BP100, 20 µM de lipídio em Tampão Tris/HCl 0.01 M pH8.
113
4.7 Microscopia Óptica de GUVs em presença do BP100
Para uma análise visual da ação que o BP100 tem nas membranas, foi feito
um estudo por microscopia óptica de Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs) em
colaboração com a Prof. Dra. Karin do A. Riske do Departamento de Biofísica da
Unifesp. A visualização das GUVs em presença de peptídeos antimicrobianos
permite uma melhor compreensão do mecanismo de ação destes peptídeos (Lee et
al., 2008 Tamba et al., 2007 e 2005, Ambroggio et al., 2005). As GUVs contêm
inicialmente uma assimetria na distribuição de açúcares (sacarose no volume interno
e glicose no meio externo), o que lhes confere um alto contraste óptico quando
observadas por microscopia por contraste de fase. Isto permite que a
permeabilidade da membrana à glicose e à sacarose seja diretamente visualizada: a
manutenção do contraste óptico das GUVs em presença do BP100 mostra que a
membrana continua impermeável aos açúcares, enquanto que a perda deste
contraste indica que a membrana permite a passagem de sacarose e glicose.
Dois arranjos experimentais foram utilizados. Em um deles, uma solução de
peptídeo (50-100 µM BP100) foi injetada por uma micropipeta de aproximadamente
15 µm de diâmetro nas vizinhanças de GUVs (Domingues et al., 2010). Desta forma,
foi possível observar a resposta de vesículas à injeção local de peptídeos.
Entretanto, a concentração efetiva de peptídeo próxima à membrana variava com o
diâmetro da micropipeta, com a distância entre micropipeta e GUVs e com a pressão
de injeção. Alternativamente, uma solução de BP100 (2-50 µM) foi preparada na
cela de observação e uma pequena alíquota de GUVs foi adicionada. Neste caso, o
comportamento de diversas GUVs foi monitorado em presença de uma
concentração definida de BP100, mas não tínhamos acesso à situação inicial das
GUVs, na ausência de peptídeos. Em ambos os casos a concentração lipídica era
114
da ordem de 1 µM. Duas composições de membrana foram testadas, POPC puro e
POPC:POPG 70:30.
Os experimentos com microscopia óptica de GUVs mostram que o primeiro
efeito causado pelo BP100 nas duas composições de membrana é um aumento de
curvatura espontânea da membrana assim que o peptídeo é adicionado. Esse
fenômeno só é visualizado em vesículas que possuem inicialmente excesso de área,
em que ocorre flutuação da membrana. Assim, o acúmulo de peptídeos na
monocamada externa gera uma diferença de área entre as monocamadas externa e
interna, fazendo com que a membrana se curve.
Figura 51. GUVs de POPC:POPG 7:3 num aumento de 63 vezes com adição de BP100 pela micropipeta com observação de 0 a 52 s. Depois de 23,4 s após do início da adição do BP100 é nítida a observação de agregados de peptídeo e lipídeo na superfície da GUV e em 52 s ocorre a ruptura da membrana.
Consequentemente ocorrem mudanças morfológicas, como a formação de
buds. Um exemplo deste comportamento está mostrado nas primeiras fotos da
Figura 51 obtidas durante injeção de BP100 em uma GUV de POPC:POPG 7:3 (veja
formação de um bud do lado direito da vesícula entre 4,1 e 4,7 s).
Posteriormente, pôde-se observar a formação de regiões densas na
superfície das GUVs, o que indica um acúmulo local de lipídios (fotos posteriores na
115
Figura 51, obtidas em 23,4 s e 47,5 s). Esse efeito parece indicar que a ligação das
moléculas de peptídeo com a superfície da vesícula promove uma dobra da
membrana sobre si mesma. Esse acúmulo parece ser mais marcante em GUVs de
POPC:POPG 7:3 que de POPC puro. A Figura 52 mostra um exemplo semelhante
obtido com injeção de BP100 em GUVs de POPC puro. Inicialmente mudanças
morfolfológicas mostram um aumento da curvatura espontânea (10 s) com posterior
formação de domínios na superfície das GUVs (23 s).
Figura 52. GUVs de POPC num aumento de 63 vezes com adição de 50 µM de BP100 pela micropipeta com observação de 0 a 55 s. Depois de 23 s após do início da adição do BP100 é nítida a observação de agregados de peptídeo e lipídeo na superfície das GUVs e em 55 s ocorre a ruptura da membrana.
Os experimentos com microscopia óptica de GUVs mostram, portanto, que o
primeiro efeito causado pelo BP100 em vesículas de POPC e POPC:POPG 7:3 é um
aumento da curvatura espontânea devido à ligação do peptídeo à monocamada
externa, seguido pela formação de agregados de peptídeo e lipídeo na superfície
das GUVs que causam dobras da membrana. Em seguida, as GUVs explodem (52 s
116
na Figura 51 e 37-55 s na Figura 52), provalmente devido a uma desestabilização da
membrana pelo BP100. Efeito semelhante foi causado pela gomesina em GUVs
(Domingues et al., 2010).
Em algumas situações foi observada a agregação entre GUVs devido à
preseça do BP100. Esse efeito foi mais evidente em GUVs contendo POPG, como
mostra o exemplo da Figura 53 a partir de 14 s depois do início da adição de BP100
pela micropipeta. No final, ambas as GUVs agregadas acabaram explodindo (após
33,8 e 34 s). De forma semelhante, experimentos de DLS mostraram a agregação
de LUVs contendo PG.
Figura 53. GUVs de POPC:POPG 7:3 num aumento de 63 vezes com adição de BP100 pela micropipeta com observação de 0 a 34 s, a escala representa 20 μm. Em 0 s observa-se duas GUVs próximas e depois de 14,0 s ocorre a agregação das duas vesículas. Em 33,8 s ocorre o rompimento da GUV superior e em 43 s o rompimento da GUV inferior.
Entretanto, a extensão de agregação é certamente menor entre GUVs, o que
provavelmente advém da menor concentração lipídica nos experimentos por
microscopia e do menor coeficiente de difusão de GUVs em comparação ao de
LUVs.
117
É importante ressaltar que a injeção de BP100 com uma micropipeta em
GUVs individuais potencializa a explosão de GUVs, devido à distribuição não
homogênea do BP100 na superfície da vesícula em decorrência da injeção local. Os
experimentos obtidos com o protocolo de diluição de GUVs em uma solução de
BP100 mostraram que a maioria das GUVs de POPC puro perdia a assimetria inicial
de açúcares, o que era visualizado por uma diminuição do contraste óptico,
significando que a membrana tornava-se permeável, mas as vesículas permaneciam
íntegras. No entanto, o BP100 causou explosão de GUVs de POPC:POPG 70:30
mesmo nesse arranjo experimental, mostrando que o mecanismo de ação do BP100
parece ser modulado pela presença de lipídios negativos na membrana. Uma
hipótese para explicar tal evento é que o BP100, por possuir parte da sequência de
aminoácidos da melitina, tenha uma ação semelhante à deste peptídeo, causando
abertura de poros e vazamento lento em vesículas com carga líquida zero e
rompendo vesículas contendo POPG.
As Figuras 54 e 55 mostram exemplos de diluição de GUVs de POPC puro e
POPC:POPG 70:30, respectivamente, em uma solução 50 µM BP100. A Figura 55A
mostra a perda de contraste gradual de uma GUV de POPC puro após a diluição em
BP100. Além disso, é possível observar a formação de domínios na superfície da
GUV (7 min) como mostrado anteriormente no protocolo de injeção. Na Figura 55B
são mostradas imagens obtidas de diferentes regiões da amostra ~20 minutos após
a diluição, onde se observam várias GUVs que foram permeabilizadas e que
portanto perdaram o alto contraste óptico.
118
Figura 54. GUVs de POPC com 50 μM de BP100 num aumento de 63 vezes, as escalas representam em A 10 μm e em B 20 μm, A. Em 7 min pôde -se observar a perda de contraste da GUV, assim como em 7 min e 22 s e 9 min, B. Várias GUVs no campo de visão do microscópio com perda de contraste até 26 minutos após adição do BP100.
A Figura 55 A mostra duas GUVs que apresentam domínios em sua
superfície e que acabam rompendo-se após ~9 min. O BP100 também causou perda
de contraste em algumas GUVs de POPC:POPG 7:3, como mostram as imagens
obtidas 10 min e 10 min 30 s após a diluição (Figura 55 B), mas a quantidade de
eventos de bursts/rompimento foi nitidamente maior. Além disso, muitas GUVs sem
contraste romperam-se, como mostra a sequência de três GUVs na Figura 55 B (de
11 min 39 s até 12 min 30 s).
119
Figura 55. GUVs de POPC:POPG 7:3 num aumento de 63 vezes com adição prévia de 50 μM de BP100, a escala representa 20 μm, A. Em 7 minutos de observação, é possível ver agregados de peptídeo com lipídeo na superfície das GUVs. Em 8 min e 48 s pode-se notar a perda de contraste da GUV inferior e agregados de lipídeo com BP100, em 9 min e 11 s ocorre o rompimento da GUV inferior e em 9 min e 30 s o rompimento da GUV superior, B. Várias GUVs sem contraste de fase no mesmo vídeo.
Algumas GUVs, principalmente nas preparações de POPC puro, tinham em
seu interior várias vesículas menores. A injeção de BP100 nessas GUVs mostrou
que o BP100 causou mudanças morfológicas nas vesículas encapsuladas, sem que
120
a vesícula externa sofresse permeabilização e perda de contraste óptico. Como não
foram obtidos exemplos suficientes de vesículas internalizadas em GUVs de
POPC:POPG 7:3, não está claro se a penetração do BP100 ocorre somente em
GUVs de POPC puro, ou também em GUVs contendo POPG.
A Fig. 56 mostra dois exemplos dessa capacidade de penetração do BP100.
Na Figura 56 A são observadas mudanças morfológicas nas GUVs internas sem que
haja perda de contraste (ou permeabilização) da GUV externa. Essa mudança
morfológica é a mesma que ocorre na formação de buds discutida anteriormente na
Figura 51. Na Figura 56 B pode-se observar que além de mudanças morfológicas
ocorrem também a formação de domínios ou agregados de peptídeo e lipídeo nas
GUVs internas, mesmo a membrana da GUV externa permanecendo impermeável
aos açúcares.
Com os resultados dos experimentos das GUVs pode-se afirmar que o BP100
atua tanto em membranas de carga líquida zero (GUVs de POPC puro) e
membranas de caráter aniônico (GUVs de POPC:POPG 7:3). A adição do peptídeo
em GUVs causa inicialmente um aumento da curvatura espontânea da membrana
devido à ligação com a monocamada externa, seguida da formação de domínios na
superfície das vesículas, indicando uma possível dobra da membrana mediada pela
ligação peptídica. Em alguns casos, a ligação ao BP100 promoveu também uma
agregação entre GUVs, assim como visto extensamente em dispersões de LUVs.
Posteriormente, foi observada com maior frequência a perda de contraste em GUVs
de POPC puro e a explosão de GUVs de POPC:POPC 70:30, de forma semelhante
à observada para a melitina (Mally et al., 1768).
121
Figura 56. GUVs de POPC puro num aumento de 63 vezes com adição de BP100 pela micropipeta, a escala representa 10 μm. A. Em 53,5 s é observado a flutuação da vesícula interna a GUV maior e em 71,8 ocorre o rompimento da GUV maior liberando as GUVs internas, B. Outra grade GUV com GUVs internas, em 312 s ocorre eu rompimento.
Os resultados obtidos com as GUVs corroboram as conclusões a que
chegamos com as cinéticas de vazamento de LUVs contendo CF e PTS. Os
experimentos com as GUVs permitiram visualizar todos os fenômenos causados
pelo BP100 detectados pelos outros métodos.
Baseados nos experimentos de microscopia óptica pode-se propor que a taxa
inicial de vazamento lenta observada nas cinéticas com CF e PTS ocorra
122
concomitante à formação de domínios na superfície das vesículas. As cinéticas, bi
ou trifásicas, indicaram que ocorre uma estruturação lenta do peptídio na membrana
que é sensível a força iônica. A alta taxa de vazamento atingida em tempos maiores
indicaria a permeabilização total da membrana e/ou a explosão das vesículas.
As medidas de mobilidade eletroforética confirmaram a ligação do BP100
tanto nas membranas neutras como em LUVs contendo PG e as análises de
diâmetro hidrodinâmico comprovaram a agregação de LUVs aniônicas a partir de
concentrações definidas de BP100 no meio. Esta agregação foi verificada também
nos experimentos de LUVs contendo PTS mas não com as LUVs contendo CF por
causa da alta força iônica.
A estruturação que o BP100 sofre quando se liga às LUVs pode ser
observada nos experimentos de dicroísmo circular com a mudança na estrutura
secundária do BP100, de randômica em água para uma alfa-hélice com o aumento
da carga negativa das LUVs.
O que se pode sugerir com estes resultados é que o BP100 em meio aquoso
tem estrutura ao acaso e que o peptídeo permanece com a mesma estrutura quando
em contato com LUVs de PC. Porém, ele é capaz de mudar o potencial de superfície
dessas vesículas, ligando-se na bicamada lipídica, formando domínios na
membrana, buds, levando ao vazamento e até rompimento da vesícula se em altas
concentrações. A ausência de mudança de estrutura do peptídeo indica que ele não
forma poros efetivos e assim o vazamento dessas LUVs e GUVs de PC são lentos.
Assim, em membranas de carga negativa, o BP100 atua com diferentes
velocidades chegando a ter uma ação detergente como observado nos resultados
de GUVs e fluorescência.
123
O BP100 tem sido bastante estudado por diversos pesquisadores devido às
suas características antimicrobianas. Entre os trabalhos realizados com esse
peptidio destacam-se os de Ferre et al. Apesar de todos os trabalhos já realizados
com o BP100 acreditamos que nossos estudos apresentam resultados diferentes
dos obtidos em trabalhos anteriores de outros grupos.
Os experimentos de Ferre et al., por exemplo, foram feitos com LUVs
contendo N-NBD-PE, uma fosfolipídio com uma sonda fluorescente que é
incorporada na membrana lipídica, e CoCl2 como supressor. Na presença de CoCl2
apenas a fluorescencia das moléculas de N-NBD-PE na face externa das LUVs é
suprimida. Com a adição do BP100 e rompimento da bicamada ocorre a entrada do
CoCl2
Os experimentos de agregação do Ferre, et al. mostram que ocorre
agregação de LUVs de 100 para 1000 nm quando há uma razão de 0,12
peptídeo/lipídeo e nos experimentos de potencial zeta foram analisadas somente 3
nas LUVs levando a supressão da fluorescência do N-NBD-PE. As cinéticas
de vazamento, feitas em tampão 10 mM HEPES em pH 7,4 com 150 mM de NaCl,
em LUVs de POPC e POPC-Col, eram hiperbólicas e em vesículas contendo PG
obteve-se fluorescência máxima logo após a adição do BP100 com várias razões de
peptídeo/lipídeo. Esses resultados são próximos dos obtidos nesta dissertação em
relação ao comportamento das cinéticas e das composições lipídicas de membranas
estudadas, porém aqui foram estudadas diferentes composições de LUVs em
diversas razões de peptídeo:lipídeo. O uso de duas metodologias diferentes de
fluorescência permitiu verificar o efeito de força iônica na ligação do peptidio e
mostrar a sua eficiência já que mesmo em 300 mM de NaCl, ocorre a formação de
poros e lise das vesículas.
124
razões de peptídeo e lipídeo notando-se uma mudança de carga na superfície da
membrana.
Nesta dissertação a quantificação do ponto de equivalência não foi feita por
causa da turvação da solução devido a agregação das vesículas. Nós observamos,
entretanto, que a mobilidade eletroforetica (e, portanto, o potencial zeta) muda
pouco com LUVs contendo acima de 20 % de PG. Porem, mesmo assim, o BP100
se liga mais nas LUVs contendo mais PG. Isto significa que as cargas “aparecem”
com a ligação do peptidio, apesar de não contribuírem para aumentar a carga da
vesícula como um todo. Este fenômeno se deve a troca iônica entre os ions Na+,
Tris/H+
A estruturação do BP100 na ligação com LUVs contendo PG foi verificada por
CD pela primeira vez neste trabalho o que levou à sugestão de organização de um
poro na bicamada das LUVs.
e o BP100 que também é carregado positivamente.
A caracterização do efeito de BP100 nas GUVs também foi essencial para
mostrar que as diferentes fases das cinéticas correspondem a fenômenos de
organização do peptidio na membrana, que cada etapa tem duração diferente que
depende da carga efetiva da membrana e não de sua carga residual, medida pelo
potencial zeta. Por atuar em membranas negativas e apresentar baixa atividade em
membranas neutras e com colesterol, O BP100 é um grande candidato a maiores
estudos para verificação da sua eficácia e potência.
125
5. CONCLUSÕES
O peptídeo antimicrobiano BP100 mostrou-se capaz de permeabilizar
vesículas de fosfolipídios preparadas com diferentes misturas de fosfatidil colina:
fosfatidilglicerol (PC:PG) em alta e baixa força iônica.
Em vesículas grandes unilamelares (LUVs) de PC, as velocidades de
vazamento de marcador fluorescente foram muito lentas, semelhantes aos
experimentos controle na ausência de peptídeo. A presença de PG nas LUVs, em
porcentagens acima de 20%, leva a cinéticas sigmoidais. Em LUVs contendo
apenas PG a velocidade de vazamento foi muito rápida e não foi possível verificar o
tipo de cinética com a aparelhagem utilizada. O acréscimo da carga negativa das
vesículas aumentou significativamente a efetividade do peptídeo no vazamento.
Adição de colesterol na bicamada das LUVs diminuiu a atividade do BP100.
As porcentagens de vazamento dos marcadores fluorescentes foram maiores
em baixa força iônica. Aparentemente, íons podem deslocar BP100 da superfície
das vesículas, diminuindo assim a atividade do peptídeo.
Em vesículas gigantes, GUVs, tanto nas preparadas apenas com PC quanto
nas contendo misturas de PC:PG, foi possível observar que a adição de BP100,
produz pontos escurecidos na superfície das vesículas e diminuição do seu
diâmetro. Observou-se também agregação de vesículas, formação de brotos na sua
superfície, perda de contraste e, posteriormente, rompimento das mesmas com o
vazamento de conteúdo.
O BP100 alterou a mobilidade eletroforética das LUVs de PC confirmando sua
ligação às vesículas. Nas LUVs contendo misturas de PC:PG observou-se
agregação e diminuição da mobilidade eletroforética.
126
Verificou-se, por dicroísmo circular, que o BP100 apresenta estrutura ao
acaso em meio aquoso. Em presença de LUVs de PC sua estrutura não se alterou.
Portanto, apesar de o BP100 se ligar nas LUVs de PC, evento confirmado pela
mudança de mobilidade electroforética, o peptídeo provavelmente tem uma
constante de associação baixa e não foi capaz de formar poros, o que explica o
pequeno vazamento observado nos estudos de fluorescência aonde a concentração
de BP100 utilizada foi menor do que com as GUVs.
Em presença de LUVs contendo PG, o BP100 adquiriu uma conformação em
α hélice. Assim sugerimos que conformação em α hélice facilita a formação de poros
levando ao vazamento das vesículas.
O conjunto dos dados obtidos até o momento é sugestivo de que o P100 atua
ligando-se, preferencialmente, às vesículas negativas formando estruturas similares
a poros, devido a sua conformação em α hélice, através dos quais o conteúdo
interno das vesículas extravasa. Essa atividade do peptídeo depende da sua
concentração, força iônica do meio e da porcentagem de carga negativa da vesícula.
Portanto, o BP100 apresentou características essenciais para atuar em
membranas de bactérias tais como, melhor atividade sobre membranas aniônicas,
boa atividade mesmo em alta força iônica e menor atividade em membranas
contendo colesterol. Estas características o qualificam como um possível candidato
para uso farmacológico.
127
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7 - SÚMULA CURRICULAR
1.DADOS PESSOAIS Mariana Canale Manzini Local e data de nascimento: São Paulo/SP Brasil, 11-Ago-1984. 2.EDUCAÇÃO Colégio Albert Sabin, São Paulo/SP Brasil, 1994-2002. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas/SP Brasil, 2008. Farmácia. 3.FORMAÇÃO COMPLEMENTAR -Curso de verão, USP, 2010. -Curso de síntese/encapsulamento e fármacos – UNICAMP -Curso de Fitoquímica e Farmacologia de Produtos Farmacêuticos de Origem Vegetal da IV semana de Química no Instituto de Química da UNICAMP –UNICAMP -XXIV curso de Toxicologia e Toxicologia Clínica (2005) - UNICAMP 4.OCUPAÇÃO Bolsista de Mestrado CNPQ, Mar-2009 – Mar-2011. Analista de Farmacovigilância, Bayer HealthCare Mar-2011-atual. 5.PUBLICAÇÕES (Artigos Completos e Resumos em Congressos) Resumos em Congressos: Manzini, M.C., Daghastanli, K.R.P., Riske, K.A., Rodrigues, M.A., Bemquerer, M.P., Cuccovia, I.M., (2011) BP100 Interaction with Membrane Models: Effects of Peptide/Lipid Ratio and Relative Interfacial Charge, XL Annual Meeting of Brazilian Biochemistry and Molecular Biology Society Foz do Iguaçu, PR, Brazil, April 30th to May 3rd, 2011.