márcio valle cortez
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
LINFADENOMEGALIAS PERIFÉRICAS EM PACIENTES HIV+/AIDS: ESTUDO DE 104 PACIENTES. IMPORTÂNCIA DA COMBINAÇÃO DOS EXAMES ANÁTOMOPATOLÓGICO, MICOLÓGICO, EXAME DIRETO, CULTURA
E PCR PARA O DIAGNÓSTICO
MARCIO VALLE CORTEZ
MANAUS
2010
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MARCIO VALLE CORTEZ
LINFADENOMEGALIAS PERIFÉRICAS EM PACIENTES HIV+/AIDS: ESTUDO
DE 104 PACIENTES. IMPORTÂNCIA DA COMBINAÇÃO DOS EXAMES ANÁTOMOPATOLÓGICO, MICOLÓGICO, EXAME DIRETO, CULTURA
E PCR PARA O DIAGNÓSTICO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. Sinésio Talhari Co-Orientador: Prof. Dr. Reynaldo Dietze
MANAUS
2010
Ficha Catalográfica
C828l Cortez, Marcio Valle. Linfadenomegalias perféricas em pacientes
HIV+/AIDS: estudo de 104 pacientes. Importância da combinação dos exames anatomopatológico, micológico, exame direto, cultura e PCR para o diagnóstico / Marcio Valle Cortez. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2012.
44 f. : il.
Dissertação de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical – UEA/FMT, 2012.
Orientador: Prof. Dr. Sinésio Talhari. Co- orientador: Prof. Dr. Reynaldo Dietze
1. Linfadenite – pacientes – HIV/AIDS I. Título.
CDU: 616.9 Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária da Escola Superior de Ciências da Saúde – UEA Sheyla Lobo Mota.
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
LINFADENOMEGALIAS PERIFÉRICAS EM PACIENTES HIV+/AIDS: ESTUDO DE 104 PACIENTES, IMPORTÂNCIA DA COMBINAÇÃO DOS EXAMES ANATOPATOLÓGICO, EXAME DIRETO, EXAME MICOLÓGICO, CULTURA E PCR PARA O
DIAGNÓSTICO.
MÁRCIO VALLE CORTEZ
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________ Prof. Sinésio Talhari, Dr.
Presidente
________________________________ Prof. Luiz Carlos de lima Ferreira, Dr.
Membro
__________________________ Prof. Marcelo Távora Mira, Dr.
Membro
iii
Dedico este trabalho
Aos meus pais César e Graça Cortez
pelo apoio e estímulo sem limites
À minha esposa Carolina,
pelo incentivo diário para seguir em frente
Aos meus sogros Sinésio e Anette
pela motivação e estímulo a realização deste trabalho
Aos meus irmãos Ítalo, Marcelo (in memoriam) e Thayza.
Pela nossa união, amizade e respeito.
iv
AGRADECIMENTOS
Muitas pessoas foram igualmente fundamentais para a
realização deste trabalho. Ficam aqui registrados
meu reconhecimento e sincera gratidão.
Ao Professor Doutor Luis Carlos de Lima Ferreira, pelo incentivo a pesquisa
desde os tempos da graduação, quando orientou meu primeiro projeto de
Iniciação Científica.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Reynaldo Dietze,
pelo exemplo, dedicação e oportunidade.
À Professora Doutora Cintia Mara Costa de Oliveira e a Farmacêutica Lorena Angélica Castanho Ramos pela realização das reações de PCR.
À Professora Doutora Rossicléia Lins Monte pela realização das análises
bacteriológicas e pelo constante estímulo a realização deste trabalho
Aos doutores José Ribamar Araújo e Rosilene Assis, patologistas da Gerência de Patologia, pelas análises histopatológicas.
Às acadêmicas de medicina e bolsistas de Iniciação científica do Centro
Universitário Nilton Lins,Bruna Backsmann Braga e Débora Zotteli dos Reis
pelo apoio na revisão dos prontuários médicos e organização dos dados.
À toda equipe da Pós-Graduação em Doenças Tropicais e Infecciosas, especialmente a Profa. Maria das Graças Barbosa, Profa. Maria
Paula Mourão, Prof. Marcus Lacerda e funcionários Marcos
André Castro, Maria da Conceição Tufic e Bruno Rudar.
À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM), Universidade do Estado do Amazonas (UEA), Superintendência da Zona Franca de Manaus
(SUFRAMA), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM), que apoiaram a realização deste estudo.
À Marlize, funcionária exemplar do Arquivo médico,
v
pelo carinho e ajuda na recuperação dos prontuários.
A Felipe Sardinha e Julita Nascimento de Castro
pelo auxílio com os exames laboratoriais.
Aos amigos da Pós-Graduação Alex Panizza, Ana Karla L. Freire, Camila Helena A. Bôtto de Menezes, Cléber Nunes Alexandre, Giuseppe Figliuolo,
Jean Francisco Venturim Samonek, João Bosco de lima Gimaque João Ricardo Rodrigues Maia e Lorena Angélica C. Ramos, por tornarem nossa longa
jornada de aulas e seminários momentos tão agradáveis.
A todos os pacientes participantes deste estudo, meu respeito e sincera gratidão.
vi
EPÍGRAFE
"É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar; é melhor tentar, ainda que em vão,
que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver ..."
Martin Luther King
"Há homens que lutam um dia e são bons.
Há outros que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam toda a vida.
Esses são os imprescindíveis."
Bertolt Brecht
vii
RESUMO
INTRODUÇÃO: A linfadenomegalia periférica constitui-se no acometimento inflamatório dos gânglios linfáticos e é comum em pacientes HIV+/AIDS. O diagnóstico das infecções associadas a essa condição é complexo, face as várias etiologias. A identificação rápida da causa é essencial, diante da gravidade da maioria desses pacientes. A tuberculose e a histoplasmose estão entre os agentes infecciosos mais frequentes. Também, devem ser afastadas causas frequentes de linfadenites, tais como as relacionadas a linfoma, sarcoma de Kaposi e outras.OBJETIVO: Através de estudo retrospectivo, avaliar a importância da biópsia cirúrgica excisional com finalidade de diagnóstico etiológico de linfadenomegalias periféricas de pacientes HIV+/AIDS. MÉTODOS: Neste trabalho foi desenvolvido protocolo para biópsias excisionais de linfonodos, adotando-se os seguintes procedimentos: exame direto de esfregaços, corados pelo método de Ziehl-Neelsen (ZN), cultura em meio de Loewenstein-Jensen (L-J), exame anátomo-patológico, micológico e reação em cadeia da polimerase (PCR). RESULTADOS: Ao todo foram incluídos 104 pacientes, verificando-se, no exame histopatológico: 36% (38 pacientes) com linfadenite crônica inespecífica (LCI), linfadenite tuberculosa em 26% (27), linfoma em 10,5% (11) e histoplasmose, 8,7% (9). Através da cultura em meio L-J, os exames positivos para linfadenite tuberculosa aumentaram para 30%. Fez-se PCR em todos os casos e através deste exame foi possível de detectar M.tb em 6 dentre 38 amostras com diagnóstico anatomopatológico de LCI. Três desses pacientes foram acompanhados, exibiram sintomas de TB e curados após tratamento específico. CONCLUSÃO: Os dados obtidos neste trabalho sugerem que em todos os casos de linfadenopatia deve-se realizar exame histopatológico, micológico, exame direto, cultura em L-J ou Ogawa e PCR. O PCR pode ser útil na detecção precoce e correta de casos de TB extrapulmonar nos pacientes com Aids apresentando linfadenopatias, evitando-se tratamentos empíricos e desenvolvimento de eventuais cepas resistentes.
Palavras -chave: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, Linfadenomegalias periféricas, Tuberculose, PCR, Diagnóstico
viii
ABSTRACT
INTRODUCTION: Lymphadenitis is common among HIV+/AIDS patients. The diagnosis of its associated conditions is complex especially for tuberculosis (TB). A rapid and specific detection of M. tuberculosis is necessary to adequate treatment excluding other non-tubercle mycobacteria (NTM) as well as other causes of lymphadenitis like lymphoma, histoplasmosis and others. OBJECTIVE: Evaluate in a prospective study, the importance of excisional biopsy to the ethiologic diagnosis of the periferic Lymphadenitis is common among HIV+/AIDS patients. METHODS: Here, we developed a protocol using the following procedures: direct bacterial smears detection using Ziehl-Neelsen (ZN) staining, Lowenstein-Jensen (L-J) culture, histological examination, and polymerase chain reaction (PCR). RESULTS: A total of 104 patients were included and we observed in histopathological examinations: 36% (38 patients) with non-specific lymphadenitis (NSL), tuberculous lymphadenitis 26% (27), lymphoma in 10.5% (11) and histoplasmosis 8.7% (9). With the addition of L-J culture the positive results for tuberculous lymphadenitis increased up to 30%. PCR was able to detect M.tb DNA in 6 out of 38 samples among NSL samples. Three of these patients were followed and later exhibited clinical symptoms of TB and cured with anti-tuberculosis treatment. CONCLUSION: The data obtained with this work suggests that all lymphadenopathies cases should be tested for histopathological examination, L-J or Ogawa cultures and PCR. In fact, PCR assays can be useful for early and accurate detection of extra-pulmonary TB in Aids patients with lymphadenitis avoiding empirical treatment and possibility of development of multidrug resistant strains.
KEY WORDS: Polymerase chain reaction, Tuberculosis, Acquired Immunodeficiency Syndrome, Diagnosis, Lymphadenopathy, Opportunistic infections
ix
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
TESE
AIDS Acquired Imune Deficency Syndrome
BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente
CDC Centers for Diseases Control
FMT-AM Fundação de Medicina tropical do Amazonas
HAART Hihgly Active Antiretroviral Therapy
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
LAV Vírus da Llinfadenopatia Associada
LGP Linfadenopatia Generalizada Persistente
OMS Organização Mundial de Saúde
PCR Protein Chain Reaction
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adiquirida
SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SIRI Síndrome Inflamatória da Recosntituição Imunológica
TARV Tratamento Anti-retroviral
TB Tuberculose
UNAIDS Programa Conjunto das Nações Unidas
WHO World Health Organization
AIDS Acquired Imune Deficency Syndrome
BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente
CDC Centers for Diseases Control
FMT-AM Fundação de Medicina tropical do Amazonas
HAART Hihgly Active Antiretroviral Therapy
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
x
LISTA DE SÍMBOLOS
% percentual
+ positivo
oC graus centígrados µm micrômetro
µL microlitro
cm centímetro
g grama
Kg kilograma
nm nanômetro
mg miligrama
ml mililitro
mm milímetro
mm3 milímetro cúbico
xi
LISTA DE FIGURAS
Dissertação Figura 1. Linfonodos superficiais e vasos linfáticos da cabeça e pescoço...
03
Figura 2. Vasos linfáticos e linfonodos dos membros superiores................ 03 Figura 3. Vasos linfáticos e linfonodos dos membros Inferiores................. 04 Figura 4. Prevalência estimada de HIV em novos casos de Tuberculose.... 08 Figura 5. Resultado do PCR em Gel de Agarose 2%................................... 18 Figura 6. Imagem de paciente HIV positivo, portador de linfadenopatia
cervical, submetido à biopsia excisional de gânglio............................................................................................
19
xii
LISTA DE TABELAS
Dissertação Tabela 1. Distribuição dos casos de tuberculose diagnosticados no
Amazonas no período de 2006 a agosto de 2010.....................
09 Artigo
Table 1. Main causes of lymphoadenopathies in HIV+ individuals after histopathological diagnosis………………………………………..
35
Table 2. Comparison of PCR positivity with different classic diagnostic procedures for tuberculosis (Ziehl-Neelsen, L-J culture or histopathology) among HIV lymphadenitis patients…………….
36
Table 3. Summary of the PCR positive and negative results as
compared to the other methods used in the protocol to detect tuberculosis in HIV patients……………………………………….
37 Table 4. Comparison of PCR positivity with “gold standard” diagnostic
of Tuberculosis as considered positive sample in L-J culture or histopathology among HIV lymphadenitis patients………….
38
xiii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 1 1.1 Sistema Linfático................................................................................ 1 1.1.1 Órgãos do Sistema Linfático .............................................................. 2 1.1.2 Linfonodos.......................................................................................... 2 1.2 Histórico e situação da AIDS.............................................................. 4 1.3 Linfadenomegalias e AIDS................................................................. 7 1.4 Linfadenomegalias e Co-infecção Aids/Tuberculose.......................... 7 1.5 Linfadenomegalias e Co-infecção Aids/Histoplasmose .................... 10 1.6 Linfadenomegalias e Síndrome Inflamatória da Reconstrução
Imunológica (SIRI).........................................................................................
11 2. OBJETIVOS........................................................................................ 2.1 Geral................................................................................................... 2.2 Específicos.........................................................................................
13 13 13
3. METODOLOGIA................................................................................. 3.1 Desenho do estudo............................................................................. 3.2 Universo do estudo............................................................................. 3.2.1 População do estudo.......................................................................... 3.2.2 Critérios de inclusão........................................................................... 3.2.3 Critérios de exclusão.......................................................................... 3.3 Procedimentos do estudo.................................................................... 3.3.1 Análises clínicas laboratoriais............................................................. 3.3.2 Análise histopatológica........................................................................ 3.3.3 Análise imunohistoquímica.................................................................. 3.3.4 Análise micológica............................................................................... 3.3.5 Análise bacteriológica......................................................................... 3.3.6 Análise da PCR...................................................................................
3.3.6.1Extração de DNA Genômico de micobactérias.................................. 3.3.6.2 Amplificação do DNA genômico de micobactérias por PCR ........... 3.4 Técnica cirúrgica................................................................................. 3.5 Análise estatística...............................................................................
14 14 14 14 15 15 15 15 15 16 16 17 18 18 18 19 20
4. RESULTADOS.................................................................................... 4.1 Artigo submetido a publicação............................................................
21 22
5. CONCLUSÃO..................................................................................... 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................
40 41
7. ANEXOS............................................................................................. 44 7.1 Aprovação no comitê de ética em pesquisa em seres humanos....... 44
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Sistema linfático
O sistema linfático, é uma via acessória da circulação sangüínea,
permitindo que os líquidos dos espaços intersticiais possam fluir para o
sangue sob a forma de linfa (do latim lympha=água). Os vasos linfáticos
podem transportar proteínas e mesmo partículas grandes que não poderiam
ser removidas dos espaços teciduais pelos capilares sangüíneos.É uma
rede complexa de órgãos linfóides, linfonodos, ductos linfáticos, tecidos
linfáticos, capilares linfáticos e vasos linfáticos que produzem e transportam
a linfa dos tecidos para o sistema circulatório, ou seja, é constituído por uma
vasta rede de vasos semelhantes às veias (vasos linfáticos), que se
distribuem por todo o corpo e recolhem o líquido tissular que não retornou
aos capilares sangüíneos, filtrando-o e reconduzindo-o à circulação
sangüínea.O sistema linfático também é um importante componente do
sistema imunológico, pois colabora com os leucócitos para proteção contra
infecções bacteriana, virais e fúngicas.(1)
Ao contrário do sangue, que é impulsionado através dos vasos pela
força do coração, o sistema linfático não é um sistema fechado e não tem
uma bomba central. A linfa depende exclusivamente da ação de agentes
externos para poder circular. A linfa move-se lentamente e sob baixa
pressão, principalmente,consequente à compressão provocada pelos
movimentos dos músculos esqueléticos que pressionam o fluido através
dele. A contração rítmica das paredes dos vasos também ajuda o fluido
através dos capilares linfáticos. A linfa tem uma particularidade de grande
importância prática,não coagula como o sangue, o que faz com que a lesão
de seus vasos coletores maiores espoliem o indivíduo rapidamente.(1,2)
O sistema linfático possui três funções interrelacionadas: Remoção dos
fluidos em excesso dos tecidos corporais, absorção dos ácidos graxos e
transporte subsequente da gordura para o sistema circulatório e produção
de células de defesa (linfócitos, monócitos e plasmócitos).(1)
2
1.1.1 Órgãos do sistema linfático O baço, os linfonodos, as tonsilas palatinas, a tonsila faríngea e o timo
são órgãos do sistema linfático . Estes órgãos contém uma armação que
suporta a circulação dos linfócitos A e B e outras células do sistema
imunológico, tais como os macrófagos e células dendríticas. Quando micro-
organismos invadem o corpo ou o mesmo encontra outro antígeno,esses
são transportados do tecido para a linfa. A linfa é conduzida pelos vasos
linfáticos para o linfonodo regional. No linfonodo, os macrófagos e células
dendríticas fagocitam os antígenos, processando e apresentando-os aos
linfócitos, os quais poderão iniciar a produção de anticorpos ou servir como
células de memória para reconhecer o antígeno no futuro.(2)
1.1.2 Linfonodos
São pequenos órgãos em forma de feijão, localizados ao longo dos
canais do sistema linfático. São os órgãos linfáticos mais numerosos do
organismo. Armazenam linfócitos. Quando ocorre uma infecção, podem
aumentar de tamanho e ficar doloridos enquanto estão reagindo aos
microorganismos invasores. Eles também liberam os linfócitos para a
corrente sanguínea. Possuem estrutura e função muito semelhantes às do
baço. Distribuem-se em cadeias ganglionares (ex: cervicais, axilares,
inguinais etc).(Figura1,2 e 3).Os linfonodos tendem a se aglomerar em
grupos (axilas, pescoço e virilha). Quando uma parte do corpo fica
infeccionada ou inflamada, os linfonodos mais próximos se tornam dilatados
e sensíveis. Existem, aproximadamente 400 glânglios no homem, desses
160 encontram-se na região cervical.(2)
3
Figura 1 : Linfonodos Superficiais e Vasos Linfáticos da Cabeça e do Pescoço. Fonte: NETTER, Frank H.. Atlas de Anatomia Humana. 2ed. Porto Alegre: Artmed, 2000.
Figura 2: Vasos Linfáticos e Linfonodos dos Membros Superiores. Fonte: NETTER, Frank H.. Atlas de Anatomia Humana. 2ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. R
o Inferior
4
Vasos Linfáticos e Linfonodos do Membro Inferior
Figura 3: Vasos Linfáticos e Linfonodos dos Membros Inferiores.Fonte: NETTER, Frank H.. Atlas de Anatomia Humana. 2ed. Porto Alegre: Artmed, 2000.
1.2 Histórico e situação da Aids
Os primeiros casos da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA
ou AIDS - acquired immune deficiency syndrome) foram observados nos
Estados Unidos em 1981, quando cinco pacientes, jovens, homossexuais
masculinos, apresentando um tipo raro de pneumonia por Pneumocystis
carinii (nomenclatura atual: Pneumocystis jirovecii), associada a
imunodepressão celular, foram relatados ao Centro de Controle de Doenças
dos Estados Unidos. (3)
O HIV é um retrovírus da família Retroviridae, gênero Lentivirus.
Apresenta dois tipos biológicos, HIV-1 e HIV-2, os quais diferem
geneticamente. Ambos causam doença de evolução crônica, com longo
5
período de latência clínica, replicação viral persistente nas células T-CD4-
positivas. (4)
O HIV é constituído por duas cópias de RNA que são parte do complexo
protéico e ácido nucléico. As partículas virais do HIV-1 apresentam diâmetro
de aproximadamente 100 nm, sendo envolvidas por uma membrana
lipoprotéica. Cada partícula viral contém 72 complexos de glicoproteínas, os
quais são integrados à membrana lipídica e compostos de trímeros de uma
glicoproteína externa, a gp120, e uma proteína transmembrana, a gp41. As
partículas virais são constituídas de todos os mecanismos enzimáticos
necessários para a sua replicação intracelular, sendo elas: a transcriptase
reversa, a protease e a integrase. (5)
Cada partícula viral depende da expressão de determinados genes para
a sua correta replicação. Os principais genes encontrados no HIV-1 são:
gag (grupo antígeno), pol (polimerase), e env (envelope). O HIV-1
apresenta, ainda, os genes tat e rev, os quais codificam proteínas
regulatórias essenciais à replicação; e os genes vif, vpr, vpu e nef, que expressam diversos constituintes da partícula viral. (5)
Atualmente, a aids é considerada um dos mais importantes problemas
de saúde pública no mundo. De acordo com o boletim do Programa
Conjunto das Nações Unidas para HIV/aids, existem, no mundo, 33 milhões
de pessoas infectadas pelo HIV. (6)
O Brasil ocupa posição de destaque no contexto global desta pandemia,
com, aproximadamente, 730.000 pessoas portadoras do vírus HIV.Até a
metade da década de 90, o número de casos novos de AIDS,em todo o
país, apresentava tendência de crescimento contínuo, tendo atingindo, em
1998, aproximadamente 19 casos por 100 mil habitantes. Destes casos,
80% estavam concentrados nas regiões Sudeste e Sul. Desde 1998, apesar
das altas taxas de incidência, estas regiões vêm apresentando lento, porém
constante processo de estabilização do número de novos casos.
Recentemente, tendência semelhante tem sido também observada na
6
região Centro-Oeste. Nas regiões Norte e Nordeste, ocorre crescimento dos
coeficientes de incidência. (6,7)
Até junho de 2008 foram notificados 18.155 novos casos na Região
Norte. No Estado do Amazonas, entre 1986 e junho de 2009, foram
notificados 4.022 pacientes com aids. Em 2008, 436 novos casos foram
diagnosticados, sendo 384 procedentes de Manaus, a capital do estado. (8)
De acordo com o Ministério da Saúde, no Brasil, a aids é caracterizada
como sub-epidêmica, tendo, no inicio da década de 80, atingido
principalmente, os usuários de drogas injetáveis (UDI), homens que fazem
sexo com homens (HSH) e pacientes que receberam transfusão de sangue
e hemoderivados. (7)
Atualmente, apesar do coeficiente de incidência de aids manter-se com
índices elevados - 19,5 casos por 100 mil habitantes, houve declínio do
número de novos casos. Essa redução tem sido observada na população
com idade menor que 5 anos e em indivíduos do gênero masculino, com
redução das taxas de incidência nos grupos de 13 a 29 anos. Nas faixas
etárias superiores a 40 anos, tem-se verificado crescimento da incidência.
Outras tendências observadas: 1) estabilização na proporção de casos
consequentes à transmissão homo/bissexual entre indivíduos do sexo
masculino; 2) aumento proporcional entre os heterossexuais; 3) redução
importante e persistente dos casos em usuários de drogas injetáveis. (7)
Após 1998, o número de casos novos mostrou-se estável entre as
mulheres com 13 a 24 anos; porém, com crescimento persistente em
praticamente todos os outros grupos de idade. (7)
No Brasil, até junho de 2006, aproximadamente, 192 mil óbitos foram
associados a aids. Após a introdução da política de acesso universal,
gratuito, ao tratamento anti-retroviral (TARV), que combina drogas com
diferentes mecanismos de ação, observou-se importante queda na taxa de
mortalidade. A partir do ano 2000, esta taxa estabilizou-se em 6,4 óbitos por
7
100 mil habitantes, sendo mais evidente nos Estados de São Paulo e no
Distrito Federal. (7)
1.3 Linfadenomegalias e Aids
A linfadenomegalia periférica associada a Aids é uma das
manifestações clínicas desta doença que mais chama a atenção no quadro
inicial. Em virtude disto, a primeira denominação deste vírus foi Vírus da
Linfadenopatia Associada (LAV), sendo mais tarde denominado Vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV). (9)
A infecção pelo HIV provocando Aids é atualmente considerada um dos
maiores problemas de saúde pública. A linfadenomegalia na infecção pelo
HIV é muito comum. Independente de outras causas, a própria infecção
pelo HIV pode produzir Linfadenomegalia Generalizada Persistente
(LGP).(10)
O HIV é um vírus linfotrópico e sua cinética da replicação é rápida na
infecção assintomática estável, com considerável variação na magnitude de
replicação. Inúmeras infecções oportunistas e malignidades podem ser
responsáveis pelo aumento de linfonodos em pacientes HIV +/Aids. (11)
1.4 Linfadenomegalia e Co-infecção Aids/Tuberculose
A tuberculose é um exemplo de infecção que requer a imunidade celular
para o seu controle. A expansão mundial da epidemia pelo Vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV) possibilitou que a interação com a
tuberculose modificasse a curva de decréscimo desta última países
desenvolvidos e, em outros, com poucos recursos econômicos e
sanitários,onde a endemia por tuberculose já era alta, o problema agravou-
se. O HIV aumenta o risco de reativação da infecção tuberculosa latente e
acelera a progressão após a primo-infecção ou re-infecção. De modo geral,
a infecção tuberculosa é importante fator de piora no prognóstico dos
pacientes infectados pelo HIV. (12)
8
Na década de 80, após nítido período de declínio observado nas
décadas anteriores, ocorreu aumento nos casos de tuberculose que
coincidiu com a epidemia pelo HIV e a tuberculose extrapulmonar tornou-se
mais frequente com o advento da infecção pelo vírus HIV.(13)
Em 1993, a tuberculose já era considerada uma emergência global pela
Organização Mundial de Saúde. Atualmente, segundo dados da
Organização Mundial de Saúde um terço da população mundial encontra-se
infectada pela tuberculose, são 9,4 milhões de casos novos em 2008
(139/100.000), destes cerca de 15% estão infectados pelo HIV (1,3
milhões)(Figura 4). Isso representa uma mortalidade anual de 1,3 milhões
dentre os pacientes TB/HIV negativos e 465.000 nos TB/HIV positivos. dos
22 países responsáveis por 80% dos casos notificados no mundo, o Brasil
ocupa a 18ª posição.No Brasil, em 2008, foram diagnosticados
aproximadamente 80.000 novos casos (42/100.000), e mortalidade de
aproximadamente 5.000 óbitos. Representa a 7ª causa em custos com
internação no Sistema Unico de Saúde por doença infecciosa e a 1ª causa
de morte em pacientes com AIDS. A maioria dos casos é diagnósticado em
grandes centros urbanos sendo 70% dos casos concentrados em 315 dos
5.570 minicípios brasileiros . As maiores incidências estão nos estados do
Amazonas (73,5), Rio de Janeiro (73,2 por 100 mil habitantes), Mato grosso
(56,1), Pernambuco (47,61) e Ceará (50,7). As menores taxas de incidência
do país foram registradas em Goiás (15,3), Distrito Federal (16,7) e
Tocantins (18,1).
9
Figura 4: Prevalência estimada de HIV em novos casos de Tuberculose em
2008 Fonte: World Health Organization. Global tuberculosis control: a short
update to the 2009 report.
Na Região Norte, Manaus, com população de 1.731.992 habitantes, é a
capital que apresenta um dos piores indicadores,com incidência de
93,5/100.000, a mais elevada do país, representando 70% do total de
notificações do estado do Amazonas. Em 2009, foram notificados 2.772
casos, dos quais 277(10%) eram HIV positivo, entretanto 1.187(42%)
pacientes não foram avaliados quanto a infecção pelo HIV (Figura 4). A
incidência de casos bacilíferos, a forma mais infectante da doença, foi de
47,1/100.000 habitantes. A taxa de abandono 14% (aceitável 5%) e a taxa
de mortalidade 3,7/100.000 habitantes. Neste período, somente 48,6%
(16.475/33.897) da meta de busca de sintomáticos respiratórios foi
atingida.(14)
10
Tabela 1: Distribuição dos casos de tuberculose diagnosticados no Amazonas
no período de 2006 a agosto de 2010, quanto ao status de investigação para
HIV.Fonte: Sistema de Informação de Agravos de Notificação SINAN,2010
HIV 2006 2007 2008 2009 2010 TOTAL Total 2.489 2.726 2.774 2.772 1.525 12.286 Não realizado 1.567 1.705 1.591 1.187 611 6.661 Negativo 398 587 726 1.106 453 3.270 Em andamento 369 238 223 191 269 1.290 Positivo 146 185 217 277 192 1.017 Ignorado/Branco 9 11 17 11 - 48
O envolvimento extrapulmonar pode ser observado em mais de 50% dos
pacientes apresentando a co-infecção Aids/Tuberculose. O risco de
tuberculose extrapulmonar e bacteremia aumenta com o avanço da
imunosupressão.(15,16)
A tuberculose ganglionar é a forma mais comum de tuberculose
extrapulmonar. Dentre esse grupo, a adenopatia cervical é a mais comum; o
envolvimento inguinal, axilar, mesentérico, mediastinal e intramamário
também tem sido descritos. A linfadenomegalia ocorre,principalmente entre
pessoas de 20 a 40 anos. Nos Estados Unidos é mais comum em mulheres
e imigrantes. (17)
Os pacientes HIV+ geralmente apresentam linfadenomegalias
associadas a febre, sudorese noturna e perda ponderal. Os gânglios
apresentam aumento discreto, são firmes e indolores. Na maioria dos
pacientes a tuberculina á postiva e a radiografia de tórax é normal. Os
gânglios podem fistulizar, liberando exsudato e a pesquisa de BAAR pode
ser positiva. A punção/biópsia é indicada para o diagnóstico citológico,
através da histopatologia, baciloscopia e cultura para micobactérias.O
método molecular de melhor desempenho é a PCR, mas não há estudos
sobre a acurácia no uso rotineiro.(18)
11
1.5 Linfadenomegalia e Co-infecção Aids/histoplasmose. A histoplasmose é uma infecção fungica de distribuição global,sendo a
micose endêmica mais comum em pacientes HIV +.(19,20)
A doença é endêmica na América Latina e caracterizada por vasto
espectro de manifestações clínicas, desde quadros discretos até doença
disseminada severa. A maioria dos pacientes apresenta manifestações
respiratórias. A forma aguda de histoplasmose é geralmente uma doença
autolimitada, com febre, calafrios, tosse não produtiva, cefaléia e mal estar
generalizado. A infecção generalizada é usualmente observada em
neonatos e imunocomprometidos, especialmente na AIDS. Até 25% dos
pacientes com AIDS, em áreas endêmicas, podem apresentar infecção
aguda, reativação de foco latente ou quadros disseminados.(21)
A incidência estimada de histoplasmose diseminada em áreas
endêmicas é de 5 a 20% nos pacientes com AIDS. No Brasil, a incidência
exata é desconhecida mas é aceito que a maioria da população está sobre
risco de exposição ao H. Capsulatum (22).
A ocorrência de linfadenomegalia na histoplasmose disseminada varia
de 3 a 19% .O uso da cultura de tecido ganglionar para o diagnóstico não
tem sido realizada na rotina. Como se sabe, o melhor método para o
diagnóstico de histoplasmose disseminada é a identificação do H.
Capsulatum através de cultura de aspirado de medula óssea, com
positividade de até 81% relatada na literatura.(21,22)
1.6 Linfadenomegalia e Síndrome Inflamatória da Reconstrução Imunológica (SIRI).
Durante a terapia antituberculosa, os linfonodos acometidos podem
aumentar de volume ou novos linfonodos podem surgir, representando uma
resposta imunológica à micobacteria destruida. Fenômeno similar ocorre em
pacientes com infecção pelo HIV que após o início do tratamento
antiretroviral apresentam aumento dos linfócitos T-CD4+. Esse fenômeno é
12
conhecido atualmente com Síndrome Inflamatória da Reconstituição
Imunológica. A SIRI é uma reação relacionada a terapia antiretroviral de alta
atividade ou HAART, sigla inglesa de highly active antiretroviraltherapy em
pacientes infectados pelo HIV. A SIRI constitui uma resposta atípica a
diversos patógenos oportunistas, tais como Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium avium complex, Cytomegalovirus,herpes varicella-zoster
dentre outros.(24)
A incidência real de SIRI durante a TARV é desconhecida; entretanto
NARITA et. al. verificaram uma prevalência de 36% de SIRI em doentes
com tuberculose. (23)
O tratamento dessa complicação do tratamento da AIDS inclui a
continuação da terapia primária contra o patógeno causador da infecção
que desencadeou a SIRI com objetivo de reduzir a carga antigênica,
manutenção da HAART e, eventualmente, o uso de antiinflamatórios não
estteroidais e corticosteróides.(25)
O diagnóstico de SIRI é difícil na prática clínica e possui como
diagnóstico diferencial a falha terapêutica ou resistência medicamentosa e
outras infecções oportunistas. A biópsia do gânglio para os exames de
rotina é fundamental para o diagnóstico.(26)
13
2.0 OBJETIVOS
2.1 Geral
Através de estudo retrospectivo, avaliar a importância da biópsia
cirúrgica excisional com finalidade de diagnóstico etiológico de
linfadenomegalias periféricas de pacientes HIV +.
2.2 Específicos
2.2.1 Avaliar a importância dos recursos diagnósticos disponíveis na
rotina da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM), tais
como histopatologia, micologia e bacteriologia no diagnóstico etiológico
da adenomegalias periféricas.
2.2.2 Avaliar os principais diagnósticos anatomopatológicos das
linfonodomegalias examinadas em relação aos outros exames
laboratoriais.
2.2.3 Verificar nesses pacientes, a importância da PCR como exame
complementar para o diagnóstico etiológico da tuberculose.
2.2.4 Estabelecer protocolo para futuras biópsias excisionais de
pacientes com Aids.
14
3.0 METODOLOGIA
3.1 Desenho de Estudo
Trata-se de estudo retrospectivo, descritivo e exploratório da avaliação de
aspectos histopatológicos, micológicos, bacteriológicos e moleculares de
pacientes HIV + , portadores de linfadenomegalias sob acompanhamento
ambulatorial / hospitalar da FMT-AM.
3.2 Universo de Estudo
3.2.1 População de Estudo
Foram utilizados dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais de 104
pacientes HIV + sob acompanhamento ou internados na FMT-AM, que
realizaram biópsia excisional de linfonodos por solicitação de seus medicos
assistentes. A biópsia era solicitada quando o diagnóstico etiológico não era
possível com métodos clinicos e exames complementares não invasivos.
Todos os pacientes incluídos neste estudo realizaram biópsia excisional
de linfonodos no centro cirúrgico da FMT-AM. O material coletado foi dividido
em fragmentos e colocado em formol a 10% para exame anátomopatológico,
soro fisiológico 0,9% para exame micológico e bacteriológico, e solução
tampão para o armazenamento a -70C no laboratório de microbacteriologia.
Foram revisados os laudos de histopatologia, bacteriologia, micologia e
PCR para micobactérias de todos os pacientes .
O projeto foi realizado no Centro Cirúrgico, Gerência de Patologia, Sub-
Gerência de Micologia e Gerência de Bacteriologia, nas dependências da
FMT-AM
15
3.2.2 Critérios de Inclusão
Foram incluídos neste estudo pacientes do sexo masculino ou feminino,
com sorologia positiva para HIV, apresentando linfadenomegalias periféricas,
que realizaram biópsia excisional na FMT-AM entre março de 2007 a março
2009.
3.2.3 Critérios de Exclusão
Foram excluídos deste estudo pacientes que apresentem:
• idade inferior a 12 anos;
• pacientes que não realizaram PCR;
3.3 Procedimentos do estudo
3.3.1 Análises clínicas laboratoriais
Foram analisadas, a partir de prontuários e banco de dados informações dos
seguintes exames laboratoriais:
1- Sorologia para HIV; 2- Contagem de células CD4-positivas; 3- Resultado de exames anátomo-patolólico, micológico e bacteriológico;
3.3.2 Análise histopatológica
Todos as amostras recebidas foram fixadas em solução aquosa de
fomaldeído tamponada a 3,7 % por 24 h. Posteriormente, as mesmas foram
desidratadas em alcoóis, clarificadas em xilol e banhadas em parafina.Foram
realizados cortes em microcitário de parafina com 5ηm de espessura,
pescagem e secagem em estufa entre 56 e 58 °C. Após 24 h, as lâminas
foram coradas pela técnica da hemotoxilina-eosina, e, posteriormente, quando
necessário, pelo Wade, Grocott, ácido-periódico de Schiff para doenças
granulomatosas e imuno-histoquímica, no caso de suspeita de linfoma (
Dabbs 2006 ).
16
3.3.3 Análise imuno-histoquímica
Nos casos em que a hipótese diagnóstica foi de linfoma à análise
histopatológica, fez-se imunoistoquímica para as seguintes células CD4, CD8,
CD68 e CD1a-positivas. Os cortes histopatológicos, foram desparafinizados e
hidratados com seqüências de xilol e álcool, e água. Em seguida, os cortes
foram submetidos às seguintes etapas:
A) Recuperaçâo antigênica em tampão citrato a 10 mM/ pH 6 para o
anticorpo S100 e EDTA a 0,1 mM para CD4 e CD8, em panela de pressão,
durante 4 minutos contados a partir da fervura, após o esfriamento, seguiram
as lavagens em água corrente e destilada.
B) Bloqueio da peroxidase endógena com solução de peróxido de
hidrogênio a 3% em metanol, em dois banhos 10 minutos cada, seguida de
lavagens com água destilada e PBS.
C) Reação utilizando o Complexo Avidina-biotina/ Estreptavidina-biotina-
peroxidase (HSU et al, 1981). Após o bloqueio da peroxidase os cortes foram
incubados por 18 horas a 4oC com anticorpos primários com as seguintes
diluições- 1: 3000 para S100 e 1: 300 para CD4 e CD8. Em seguida, foram
lavados e incubados com anticorpos secundários.
D) Para revelação as lâminas foram incubadas em solução substrato de
Diaminobenzidina-DAB ao abrigo da luz por tempo variando de 3 a 5 minutos,
em seguida as lâminas foram coradas e montadas (Miller et al., 1995).
3.3.4 Análise micológica
As amostras eram recebidas em recipiente estéril com soro
fisiológico, identificadas e processadas da seguinte maneira: Retirado o
fragmento da biopsia do recipiente, colocava-se o mesmo sobre uma lâmina
fazendo um corte ao meio com a lâmina do bisturi estéril. Utilizando-se
metade da amostra, era feito o esfregaço (imprint) em 3 lâminas e
posteriormente a amostra era seccionada em 7 pedaços. Estes fragmentos
eram inoculados em 6 tubos e uma placa: 2 tubos com meio
17
Sabouraud, 2 tubos com meio Mycosel, 2 tubos com meio BHI e uma placa
de niger. Dos tubos identificados, um de cada permanecia em estufa
37ºC e os outros três tubos e a placa de niger em temperatura ambiente.
Após ter feito os esfregaços (imprint) pingava-se uma gota de KOH 10% na
primeira lâmina, uma gota de tinta Nankim na segunda, e uma gota de
Lactofenol na terceira. Posteriormente, as lâminas eram levadas ao
Microscópico ótico para o
exame direto. A outra metade do fragmento de biopsia era armazenada em
recipiente com soro fisiológico (eppendorf) 1ml a 2ml, identificado, e
mantida congelada até a liberação do laudo.
3.3.5 Análise bacteriológica
Os fragmentos de linfonodos foram recebidos no Laboratorio de
Bacteriologia da FMTAM, em frascos estéries com solução salina. Para
isolamento primário o procedimento foi o seguinte: Os fragmentos eram
transferidos para graal estéril e macerados com pistilo. Como os tecidos foram
coletados assepticamente, o macerado era transferido para um tubo de
centrifuga de 50 mL e centrifugado a 3000xg, por 15 minutos a 4ºC.
Descartado o sobrenadante, deixando aproximadamente 2mL. Depois de
ressuspenso o sedimento, alíquotas de 200 ul foram semeados em meios de
cultura LJ Lowenstein-Jensen e Ogawa-Kudoh e preparadas laminas para
coloração pelo método de Ziehl-Neelsen conforme orientações do Ministério da
Saúde (Tuberculose- Diagnóstico Laboratorial- Baciloscopia – Série Telelab-
Brasilia-; 2001). Incubados em estufas comuns à 37ºC, sendo observados
semanalmente por um período de até 60 dias.
A prova de niacina foi realizada para a confirmação da espécie M.
tuberculosis, seguindo-se recomendação contida no Manual de Bacteriologia
da Tuberculose ( Brasil. Ministério da Saúde. Manual de bacteriologia da
tuberculose. Rio de Janeiro: Centro de Referência Prof. Hélio Fraga; 3ª ed.
2005.)
18
3.3.6 Análise da PCR
As amostras de tecido a fresco (biopsias de linfonodos) eram
armazenadas em microtubos de 1,5 mL estéril, sendo algumas preservadas
sem conservante ou fixador e outras em 200 µL de tampão contendo Tris-
EDTA (2,5mM). Amostras de cultura foram utilizadas para obtenção dos
controles positivos. Três colônias de cada tubo foram colocadas em um tubo
tipo falcon contendo 5 mL de Tris-HCl pH 8.0 e inativadas por fervura durante
10 minutos antes de proceder a extração do DNA genômico bacteriano.
3.3.6.1 Extração de DNA genômico de micobactérias
Após pré-tratamento das amostras (quando necessário) foi realizada a
extração do DNA micobacteriano, utilizando o kit Qiamp DNasy Blood &
Tissue (QIAGEN), conforme as recomendações do fabricante.
3.3.6.2 Amplificação do DNA genômico de micobactérias por PCR
O DNA genomico de M tuberculosis foi amplificado pela reação em
cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores que amplificam um
fragmento de 123 pb sendo a seqüência sense: 5’- CCT GCG AGC TAG GCG
TCG G-3’ e antisense: 5’- CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3’. Baseado no
protocolo descrito por Marchetti et al 1998. O ciclo de amplificação foi 95 °C
por 5 mim. Para desnaturação seguido de 35 ciclos de 95°C por 30 seg, 60°C
por 1 min e 72°C por 30 seg e extensão final a 72°C por 5 min.
O produto de PCR foi analisado em gel de agarose 2% corado com
brometo de etideo visualizado em transluminador de UV e fotografado em
sistema de foto documentação digital (figura 5).
19
Figura 5: Resultado do PCR em Gel de agarose 2%
3.4 Técnica cirúrgica
Todas as biópsias foram realizada no centro cirúrgico da Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas. Os pacientes eram posicionados em decúbito
dorsal horizontal, seguido de anti-sepsia com iodo povidine tópico na região da
adenomegalia (cervical, inguinal ou axilar). Colocação de campos, anestesia
local e incisão na pele de aproximadamente 3cm. Posteriormente realizava-se
dissecção do tecido celular subcutâneo e reparo com fio de catgut 2.0 do
linfonodo com o objetivo de evitar-se a manipulação excessiva do mesmo.
Após a exerese do gânglio, era revisada a hemostasia, aproximação to decido
celular subcutâneo e fechamento da pele com fio de nylon 3.0 em pontos
separados. A peça cirúrgica era então secçionada ao mio no seu maior eixo.
Metade da amostra era enviada em formol a 10% para análise histopatológica
e a outra metade era subdividida em 3 fragmentos os quais eram enviados em
sorofisiológico 0,9% para análise bacteriológica e micológica e em solução
tampão realização da PCR (Figura 7).
20
Histopatologia
PCR BacteriologiaMicologia
A
C
B
Figura 6: A) Paciente HIV positivo, portador de linfadenopatia cervical,
submetido a biópsisa excisional de gânglio; B)Secção do gânglio em seu maior
plano de clivagem; C) Fragmentos da biósia enviados para análise
histopatológica, micológica, baciloscopia(Ziehl-Nielsen), cultura (Loewenstein-
Jensen e Ogawa-Kudoh) e PCR.
3.5 Análise Estatística
Foi realizada a análise descritiva de todos os dados. Para as variáveis
quantitativas, foram calculadas a média e o desvio padrão. Para as variáveis
qualitativas, foram calculadas as freqüências absolutas e relativas, com os
respectivos intervalos de confiança. O software utilizado para armazenar e
analisar os dados foi o programa Excel for Windows e pacote estatístico
MINITAB 14.
Na análise da correlação foram utilizados para as variáveis qualitativas
os testes estatístico do Qui-quadrado e o Teste Exato de Fisher. Para as
variáveis quantitativas foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson
com o cálculo do p-valor para a hipótese de que exista correlação entre as
variáveis.
21
4.0 RESULTADOS
Os resultados e a discussão serão apresentados na forma de artigo
original.
22
HIV-associated lymphadenitis: The importance of PCR as complementary assay for the diagnosis of tuberculosis.
Márcio Valle CORTEZ1,2* M.D., Cintia Mara Costa de OLIVEIRA1Ph.D., Rossicléia Lins
MONTE1, M.Sc., José Ribamar de ARAÚJO1 M.D., Bruna Backsmann BRAGA2,
Débora Zotteli dos REIS2, Luis Carlos de Lima FERREIRA1 M.D.Ph.D., Milton Ozório
MORAES1,3 Ph.D., Sinésio TALHARI1,2 M.D. Ph.D.
Institutional affiliation:
1-Fundação de Medicina Tropical do Amazonas FMTAM; Departamento de Dermatologia/DST/AIDSa e Universidade do Estado do Amazonas.
2- Centro Universitário Nilton Lins, Curso de Medicina.
3- Laboratório de Hanseníase, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz
FIOCRUZ; Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas
FAPEAM.
*Corresponding author:
Dr. Márcio CORTEZ. ([email protected]).
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
Rua Pedro Teixeira 25 Dom Pedro I
ZIP-CODE 69040-000
Tel: (092) 3238-1711
Running title:
Protocol for diagnosis of HIV-associated tuberculosis using fresh lymph nodes
a- Place where the work was performed.
23
RESUMO
INTRODUÇÃO: A linfadenite é comum em pacientes HIV+. O diagnóstico das
infecções associadas a essa condição é complexo, especialmente para
tuberculose (TB). A detecção rápida e específica do M. tuberculosis é
necessária para o tratamento adequado. Também, devem ser afastadas
causas frequentes de linfadenites, tais como as relacionadas a linfoma,
histoplasmose, e outras. MÉTODOS: Neste trabalho foi desenvolvido protocolo
para biópsias excisionais de linfonodos, adotando-se os seguintes
procedimentos: exame direto de esfregaços corados pelo método de Ziehl-
Neelsen (ZN), cultura em meio de Loewenstein-Jensen (L-J), exame anátomo-
patológico e reação em cadeia da polimerase (PCR). RESULTADOS: Ao todo
foram incluídos 104 pacientes, verificando-se, no exame histopatológico: 36%
(38 pacientes) com linfadenite crônica inespecífica (LCI), linfadenite
tuberculosa em 26% (27), linfoma em 10,5% (11) e histoplasmose, 8,7% (9).
Através da cultura em meio L-J, os exames positivos para linfadenite
tuberculosa aumentaram para 30%. Com o PCR foi possivel de detectar M.tb
em 6 dentre 38 amostras de LCI. Três desses pacientes foram acompanhados,
exibiram sintomas de TB e foram curados após tratamento específico.
CONCLUSÃO: Os dados obtidos neste trabalho sugerem que em todos os
casos de linfadenopatia deve-se realizar exame histopatológico, cultura em L-J
ou Ogawa e PCR. O PCR pode ser útil na detecção precoce e correta de casos
de TB extrapulmonar nos pacientes com Aids e linfadenopatias, evitando-se
tratamentos empíricos e desenvolvimento de eventuais cepas resistentes.
24
ABSTRACT
INTRODUCTION: Lymphadenitis is common among HIV+ patients. The
diagnosis of its associated conditions is complex especially for tuberculosis
(TB). A rapid and specific detection of M. tuberculosis is necessary to adequate
treatment excluding other non-tubercle mycobacteria (NTM) as well as other
causes of lymphadenitis like lymphoma, histoplasmosis and others. METHODS:
Here, we developed a protocol using the following procedures: direct bacterial
smears detection using Ziehl-Neelsen (ZN) staining, Lowenstein-Jensen (L-J)
culture, histological examination, and polymerase chain reaction (PCR).
RESULTS: A total of 104 patients were included and we observed in
histopathological examinations: 36% (38 patients) with non-specific
lymphadenitis (NSL), tuberculous lymphadenitis 26% (27), lymphoma in 10.5%
(11) and histoplasmosis 8.7% (9). With the addition of L-J culture the positive
results for tuberculous lymphadenitis increased up to 30%. PCR was able to
detect M.tb DNA in 6 out of 38 samples among NSL samples. Three of these
patients were followed and later exhibited clinical symptoms of TB and cured
with anti-tuberculosis treatment. CONCLUSION: The data obtained with this
work suggests that all lymphadenopathies cases should be tested for
histopathological examination, L-J or Ogawa cultures and PCR. In fact, PCR
assays can be useful for early and accurate detection of extra-pulmonary TB in
Aids patients with lymphadenitis avoiding empirical treatment and possibility of
development of multidrug resistant strains.
KEY WORDS
Polymerase chain reaction, Tuberculosis, Acquired Immunodeficiency Syndrome, Diagnosis, Lymphadenopathy, Opportunistic infections
25
INTRODUCTION
The Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection leading to AIDS is
still considered to be one of the major public health problems worldwide.
According to the most recent statistics from the Joint United Nations Program
on HIV/AIDS (UNAIDS) approximately 33 million people are living with HIV,
67% of whom live in sub-Saharan Africa. Despite greater knowledge and
awareness, the HIV/AIDS pandemic continues unabated throughout all areas of
the world. One of the main problems of HIV infection is that various
opportunistic pathogens and malignancies may lead to different diseases and
the enlargement of the lymph nodes, lymphadenitis, is a very common
symptom1,2.
Tuberculosis is one of the main causes of in HIV lymphadenitis patients and
the risk of extrapulmonary tuberculosis and mycobacteremia increases with
advancing immunosuppression and patients with HIV infection, especially in
developing countries3-5. It is estimated that around 500,000 TB deaths among
HIV-positive people worldwide6. In Brazil, for TB only, 94.000 new cases were
estimated in 2009, nearly 42 cases per 100.000 people. The state of Amazonas
and the city of Manaus have very high incidences with 73.5 and 81.7 per
100.000 people, respectively, in 20067,8.
Excisional biopsy of the lymph nodes with histopathological examination,
AFB stain, and mycobacterial culture is the diagnostic procedure of choice.
Rapid direct microscopy has low sensitivity and culture takes 3 to 6 weeks.
Therefore, a protocol exploring complementary of diagnostic techniques for TB
diagnosis are necessary, especially in health settings with a high prevalence of
HIV/TB co-infection9-12. In this regard, in house conventional polymerase chain
reaction (PCR) based on amplifying the IS6110 insertion element can be used
for the amplification of Mycobacterium tuberculosis (M.tb) DNA and offers the
potential of a sensitive, specific and rapid diagnostic for ruling out or considering
pulmonary or extra pulmonary tuberculosis 13-15.
In the present study, in a hospital setting from the Tropical Medicine
Foundation of Amazonas (from Portuguese FMTAM, Fundação de Medicina
Tropical Amazonas) with a high burden of TB and HIV, we investigated the
26
effectiveness of a protocol combining PCR along with histopathological
examination, ZN staining and L-J culture to diagnose TB using lymph nodes
excisional biopsies.
METHODS
Patients
From march 2007 to march 2009, the samples of 104 HIV-positive patients
submitted to lymph node biopsies by the same surgeon at Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas in Manaus, Amazon, Brazil were evaluated for
the etiological determination. All patients submitted to the procedure were
previously investigated by the assistant infectologist and no diagnosis was
confirmed. The protocol was approved by the Ethical Committee at the FMTAM
under the number 756-10 and patients enrolled in the procedure signed an
informed consent.
Surgical Technique
All biopsies were carried out in the operating room of the FMTAM. Patients
were placed in the supine position, followed by antisepsis at the lymph node
region (cervical, inguinal or axillary). Placement of fields, local anesthesia and
skin incision of approximately 3cm were performed. Subsequently, dissection of
the subcutaneous tissue and lymph node repair were done with catgut wire 2.0,
to avoid excessive manipulation. After resection of the ganglion, approximation
of the subcutaneous tissue and skin closure with nylon 3.0 sutures were
completed. The specimen was sliced in half and on side was sent to
histopathological processing, while the other side was divided in three equal
parts and sent to PCR, ZN staining and microbiology.
27
Histopathology
Fixation and imunostaining were performed as previously described16.
Briefly, all samples were fixed in phosphate-buffered paraformaldehyde solution
(4%), embedded in paraffin and stained with hematoxylin-eosin (H&E) and
Wade and subsequently, when necessary, by Wade Grocott, periodic acid-
Schiff for granulomatous diseases. In certain cases of suspected lymphoma
immunohistochemistry according to Dabbs and colleagues were employed 16,17.
Mycobacterial staining and culture
A fragment of each tissue (lymph nodes) was stored in vials with sterile
saline. For primary isolation procedure, fragments were transferred to a sterile
grail with 5ml of sterile saline and pistil macerated while the suspension was
transferred to a 50 ml tube and centrifuged at 3,000xg for 15 minutes at 4° C.
The supernatant was discarded, but approximately 2 mL of the resulting
solution was used to resuspend the pellet, and 200 ul aliquots were plated on
culture media (LJ Lowenstein Jensen, incubated at 37 °C and observed weekly
for a period of 60 days.
Then, slides for staining by the Ziehl-Neelsen were prepared according to
the Brazilian Ministry of Health regulations. The proof of niacin was performed
to confirm the species M. tuberculosis, following a recommendation contained in
the Handbook of Tuberculosis Bacteriology 18,19.
Sample storage, DNA extraction and PCR
The tissue samples were stored in 200 uL of TE. Extraction of
mycobacterial DNA was performed using the kit Qiamp DNasy Blood & Tissue
(QIAGEN) according to manufacturer's instructions. Polymerase chain reaction
(PCR) using primers that amplify a fragment of 123 bp of IS 6110 region (sense:
5'-CCT AGC GCG TAG GCG TCG G-3' and antisense: 5'- CTC GTC CAG CGC
CGC TTC GG-3') were used. The cycling conditions were: 95 ° C for 5 min
followed by 35 cycles of 95 °C for 30 sec, 60 °C for 1 min and 72 °C for 30 sec
and final extension at 72 °C for 5 min (Mastercycler – EP Gradient S®
Eppendorf). The PCR products were analyzed in 2% agarose gel stained with
ethidium bromide visualized in transluminator UV and photographed in digital
28
photo documentation system (T26M EasyDOC 100® BioAgency). All samples
were tested for β-tubulin to evaluate inhibition of the PCR reaction. Primers and
conditions were used as follows20. All samples tested positive in the PCR.
Culture samples were used to obtain positive controls. Three colonies were
placed in a Falcon tube containing 5 mL of Tris-HCl and inactivated by boiling
for 10 minutes before extraction of mycobacterial DNA as described before.
RESULTS
Patients demographics
During a two-year period, 104 HIV-positive patients were submitted to
lymph node excisional biopsy at FMTAM. Among them, 77% (80 patients) were
males and 23% (24) females. The mean age was 32 years (range, 15-72
years), and the male to female ratio was 3.3:1. The most frequent site of biopsy
were cervical 72% (75), followed by inguinal 24% (26), axillary 1.9% (2) and
forearm 0.9% (1).
In table 1, we observed the most frequent diagnosis using
histopathological examination. As expected the most frequent disease was
tuberculous lymphadenitis (26%), although the majority of the samples
remained undiagnosed (unspecific lymphadenitis with 36%). Then, we observed
Hodgkin’s (5.7%) and non-Hodgkin’s Lymphoma cases (4.8%), histoplasmosis
(8.7%) Kaposi’s sarcoma (2.8%).
Samples were also processed for microbiological culture and staining
(mycobacteria) and PCR. This integrated view provides a possibility of fill the
gaps in different methods evaluated alone. We observe results of each method
as compared to PCR in table 2.
According to the diagnostic resources available, the Mycobacteria
staining (Ziehl-Neelsen) were positive in 13 out if 104 (12.5%). When we
compared to PCR positivity with mycobacteria staining (ZN+) 11 samples were
positive in both (PCR+ and ZN+). There were 02 samples ZN+ and PCR- (Table
2). Thus, the sensitivity and specificity as observed was 84% and 81%,
29
respectively, although the analysis of these two samples indicated that one was
non-tubercle mycobacteria in L-J culture and the other was a leprosy case in
histopathological assessment (Table 3, lines 21 and 24).
When tissue suspensions were cultured in L-J medium, positivity was
detected in 11 samples that were also positive for PCR. Other 3 samples
exhibiting PCR- and L-J+ were detected, 2 were NTM (Mycobacterium sp.) that
came out also with the diagnosis of tuberculous lymphadenitis (table 3 lines 24
and 25). The other sample was M. tuberculosis in L-J culture and also tested
positive for tuberculous lymphadenitis in the histological analysis (Table 3, line
23). Thus, the sensitivity and specificity as observed was 78% and 81%,
respectively (Table 2). But, in this case, the analysis along other methods
confirmed one case of false negative in PCR. On the other hand, the other two
PCR- cases (NTM in L-J and histopathological examination consistent of
tuberculous lymphadenitis) are very suggestive of false positive results in the
histopathological examination.
In addition, it was found that 11 samples were PCR- and histopathology+
for TB (Table 2), that represents a lower sensitivity of 62% and increased
specificity of 84%. But, actually, among these samples only three were L-J+
testing for NTM (2) and M.tb (1) as presented earlier. All other samples (8) were
negative for any of the tests used (Table 3, line 22). Conversely, 12 samples
were PCR+ and histopathology-. It was observed that these PCR+ results were:
one histoplasmosis case, one lymphoma, two samples grow in L-J culture and
six samples showed a compatible histological result of SNL (Table 3, lines 2-7).
Finally, a combined analysis, considering the “diagnosis of tuberculosis”
as a positive result of either L-J+ or histopathology+ results show that 19
samples were PCR+ that was also confirmed by any of the gold standards used.
On the other hand, nine samples were PCR+, L-J- and histopathology-. These
nine samples would be classified as false positive results (Table 4). Analyzing
these results, 6 out 9 samples were diagnosed as non-specific lymphadenitis.
The other three PCR+ cases that could not be included as TB, was suggestive
of histoplasmosis, hyperplasia and lymphoma in the histological evaluation as
30
described earlier (Table 3, lines 2,7). Overall we observed 63% of sensitivity
and 87% of specificity.
DISCUSSION
TB drastically increased since the advent of HIV infection, while
extrapulmonary involvement can be seen in more than 50% of patients with
concurrent AIDS and tuberculosis. These demographic data are similar to
previous studies from Brazil, but different from that observed in USA, which
found a higher prevalence among females10,21. Extra-pulmonary TB is the major
cause of HIV-associated lymphadenitis although different countries with
prevalence rates of TB vary from 30-80% of the cases. In Brazil and India the
rates of extrapulmonary TB, as confirmed, here was around 30%3-5;8.
In our sample, among those 104 samples analyzed, all of them were
patients that could not be diagnosed by traditional methods for tuberculosis, i.
e., X-ray, clinical findings and PPD were not conclusive, suggesting a clear
indication for lymph node resection for diagnostic purposes. Moreover, this
protocol using fresh lymph nodes provides new insights of sensitivity and
specificity for a conclusive diagnosis of TB in HIV patients with lymphadenitis.
Along with the freshness of the sample, the use of concomitant classical ZN, L-J
culture and histopathological examination adding also PCR allowed us a
thorough view of the potential of these methods especially with the association
of PCR in TB diagnosis. For example, among PCR- and ZN+ samples, we
observed two false negative results, but the observation of these two samples
using the other methods cleared the picture. In matter of fact, one sample was
NTM as confirmed by L-J culture, while the other had histopathological
diagnosis of lepromatous leprosy and did not grown in culture, as expected.
Thus, an integrative approach using ZN, L-J and histopathological examination
along with PCR indicated that our PCR assay sensitivity would be 100%, higher
than a comparison of ZN and PCR alone. Indeed, the use of fresh and whole
lymph nodes indicates that our results are equally sensitive than others in the
literature in the Amazon region also probing IS6110 region. An evaluation of
PCR in the paraffin-embedded ganglion to detect M.tb showed only 40%
31
positivity among ZN+ samples16. When a nested PCR was used to identify M.tb
positivity in skin biopsies of suspected cutaneous TB, PCR positivity in ZN+
samples were 66%15. Our results suggest 63% of positivity (sensitivity) when
compared to a combination of L-J culture and histopathological examination
(Table 4). Indeed, PCR are still failing to detect some TB cases defined only by
histopathological analysis (8 cases), although showing expected rates in the
literature15,16. Since we have a conventional low cost PCR, it is likely that
inhibition or even a low detection range of the PCR reaction might be at work.
Maybe optimizing a real-time PCR reaction using primers and probes to this
region could overcome the average sensitivity and could also improve the
detection towards resistance in multiplex assays 22,23.
Nevertheless, it is clear that a screen of each case using a wide portfolio
of methods is necessary because of their increasing capacity in resolving the
diagnosis. For example, PCR along with L-J culture and ZN staining was able to
detect one case of misdiagnosis in histopathological assessment. The diagnosis
of avium/intracellulare complex is not likely since PCR and L-J culture were
positive for TB. We also observe a case of co-infection (TB-histoplasmosis) and
another case of Lymphoma and TB. It is noteworthy that 6 cases after
histopathological examination (non-specific lymphadenitis) are inconclusive for
diagnostic purposes, but these samples were PCR+. In a matter of fact, three of
these 6 patients were followed and developed TB in 3-6 months of follow-up.
They were treated with anti-tuberculosis treatment (ATT) and recovered well.
Considering these results, we demonstrate that the use of PCR in fresh
samples increased suitably in our hands the rates of TB detection (and possibly
early TB associated with HIV) and should be introduced in the routine laboratory
for diagnosis of lymphadenitis. Indeed, in India, the use of PCR for confirmation
of histopathological findings indicated that 3 out 20 PCR+ samples could also be
considered false positive cases, but following ATT treatment patients recovered
well24. Moreover, in Thailand using paraffin-embedded ganglion with necrotizing
non-granulomatous lymphadenitis suggested that PCR was able to detect six
positive samples that were not formally included as tuberculosis by any other
method25. These data put together suggest that PCR is detecting indeed early
cases of TB, especially considering that extrapulmonary TB is the major cause
32
of HIV associated lymphadenitis. Although our protocol is laborious and
requires support of surgical infra-structure, the combination of histopathological
examination, microbiology and PCR assays is very robust. Thus, the accuracy
of PCR was 80% compared to the combined classical methods for TB
diagnosis. The use of this integrated approach including PCR to screen
lymphadenitis patients towards TB detection would help a definitive diagnosis
reducing multidrug resistance and failure of the treatment26,27. It has been
proven that PCR is cost-effective at a Brazilian TB/HIV reference hospital. The
costs per correctly diagnosed case were almost US$ 50 and US$ 13 for AFB
smear plus culture and AFB smear plus PCR dot-blot, respectively13. Thus, it is
highly cost-effective to use PCR in a molecular pathology routine of a hospital.
In conclusion, we observe, here, that the use of integrated approach with
introduction of low cost PCR, along with classic microbiological assays, and
histopathological examination can improve significantly the accurate detection
of M. tuberculosis infection aiding expedite clinical decision and improvement of
the quality of life for HIV patients reducing time of hospital admissions relapses
and drug resistance.
ACKNOWLEDGEMENTS
We would like to acknowledge Reinaldo Dietze from NDI and Lorena Angélica
Castano Ramos for DNA extraction. MOM is research fellow from CNPq. BBB
and DZR are in academic trainees with CNPq fellowships (PROIC-UNL). This
project was partially supported by FMTAM grants.
CONFLICT OF INTEREST
We would like to declare that there are no conflicts of interests whatsoever.
33
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36
TABLES
Table 1- Main causes of lymphoadenopathies in HIV+ individuals after histopathological diagnosis
Diagnosis Number of patients (n=104)
Non-specific Lymphadenitis (including dermatopathic and granulomatous, and reactive follicular hiperplasia)
38 (36%)
Tuberculous lymphadenitis 27 (26%)
Histoplasmosis 9 (8.7%)
Hodgkins Lymphoma 6 (5.7%)
Non-Hodgkins Lymphoma 5 (4.8%)
Kaposi Sarcoma
3 (2.8%)
Toxoplasmosis 2 (1.9%)
othersa 14 (13.4%) a- Paracococcidiodes mycosis, leprosy, mycobacterial lymphadenitis, inconclusive (no histological changes) neurofibroma, metastasis, and adenoma;
37
Table 2- Comparison of PCR positivity with different classic diagnostic procedures for tuberculosis (Ziehl-Neelsen, L-J culture or histopathology) among HIV lymphadenitis patients.
Mycobacteria staining
(Ziehl-Neelsen)
Culture (L-J)a Histopathology
Posb Neg Pos Neg Pos Neg
PCR Pos 11 17 11 17 18 12
Neg 2 74 3 73 11 63
Sensitivity 84% 78% 62%
Specificity 81% 81% 84%
Accuracy 81% 80% 77%
a-L-J- Lowenstein-Jensen, b-Pos-Positive, c-Neg- Negative.
38
Table 3- Summary of the PCR positive and negative results as compared to the other methods used in the protocol to detect tuberculosis in HIV patients.
L-Ja Culture ZNb Staining
PCR Histopathology
Nc OBS:
1 M.tbd + + Avium/Intracelulare complex 1 Possible false
histopathology
2 - - + Histoplasmosis 1 Co-infection
3 - - + Non-specific Lymphadenitis (with also reactive follicular hyperplasia)
6 Early TB infection?
4 M.tb - + Non-specific Lymphadenitis 1 TB
5 - - + Non-Hodgkins lymphoma 1 Lymphoma + TB
6 - + + Mycobacterial lymphadenitis 1 TB?
7 M.tb + + Inconclusive 1 TB
8 M.tb + + Tuberculous lymphadenitis 5 TB
9 M.tb - + Tuberculous lymphadenitis 3 TB
10 - + + Tuberculous lymphadenitis 2 TB
11 - - + Tuberculous lymphadenitis 6 TB
12 - - - Adenoma 1 -
13 - - - Inconclusive (absence of mycobacteria and fungi)
2 Inconclusive
14 - - - Histoplasmosis 8 Histoplasmosis
15 - - - Non-specific lymphadenitis (Dermatopathic, Granulomatous lympadenitis, and Reactive follicular hiperplasia)
30 Inconclusive
16 - - - Toxoplasmic lymphadenitis 2 Toxoplasmosis
17 - - - Hodgkin lymphoma 6
18 - - - Non-Hodgkin lymphoma 4
19 - - - Kaposi’s sarcoma 3
20 - - - Others (mononucleosis, LLC, metastatic carcinoma, neurofibroma, paracoccidiodomicosis)
5
21 - + - Leprosy 1 Leprosy
22 - - - Tuberculous lymphadenitis 8 TB
23 M.tb - - Tuberculous lymphadenitis 1 TB (false negative PCR)
24 NTMe + - Tuberculous lymphadenitis 1 NTM (Possible false histopathological result)
25 NTM - - Tuberculous lymphadenitis 1 NTM
26 - - - Inconclusive 2 inconclusive
a- Lowenstein-Jensen b- Ziehl-Neelsen c- N-number of patients; d- M.tb -Mycobacterium tuberculosis, e- NTM-non-tubercle mycobacteria
39
Table 4- Comparison of PCR positivity with “gold standard” diagnostic of Tuberculosis as considered positive sample in L-J culture or histopathology among HIV lymphadenitis patients.
L-Ja Culture OR Histopathology
Posb Negc
PCR Pos 19 09
Neg 11 65
Sensitivity 63%
Specificity 87%
Accuracy 80%
a-L-J- Lowenstein-Jensen, b-Pos-Positive, c-Neg- Negative.
40
5.0 CONCLUSÕES
Os dados obtidos neste trabalho sugerem que em todos os casos de
linfadenopatia deve-se realizar exame histopatológico,micológico, cultura em
L-J ou Ogawa e PCR.
O PCR pode ser útil na detecção precoce e correta de casos de TB
extrapulmonar nos pacientes com Aids e linfadenopatias, evitando-se
tratamentos empíricos e desenvolvimento de eventuais cepas resistentes.
41
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7.0 ANEXOS
7.1 Aprovação no comitê de ética em pesquisa em seres humanos