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MARCIANE MILANSKI
SECREÇÃO DE INSULINA E EXPRESSÃO DE PKA E PKC EM
ILHOTAS DE RATAS PRENHES SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO
PROTÉICA.
CUIABÁ – MT 2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
SECREÇÃO DE INSULINA E EXPRESSÃO DE PKA E PKC EM
ILHOTAS DE RATAS PRENHES SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO
PROTÉICA.
Orientanda: Marciane Milanski
Orientadora: Profa Dra Márcia Queiroz Latorraca
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, subárea
de concentração Cirurgia, Nutrição e Metabolismo,
da Universidade Federal de Mato Grosso, para a
obtenção do título de mestre.
CUIABÁ - MT 2005
DEDICATÓRIA
À minha família,
pelo amor, incentivo e confiança
em todos os momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
À Drª. Márcia Queiroz Latorraca, amiga e professora, pelo crescimento
pessoal e profissional. Pela orientação e generosidade em todas as etapas deste
trabalho.
À minha grande amiga Vanessa Cristina Arantes, por sempre ter acreditado em
mim, pelos esclarecimentos em momentos de dúvidas e pelo companheirismo e
amizade incondicional.
Aos meus irmãos Junior e Maristela, e aos meus amigos Massao, Bernadete,
Elisa e Vanda, por me apoiarem, me ouvirem e por dividirem comigo as
dificuldades deste trabalho.
Às minhas colegas de mestrado Elisângela, Loanda, Cristiane e Gláucia pelo
companheirismo, colaboração, amizade e pelos momentos de alegria.
Ao amigo Celso Roberto Afonso pela confiança, colaboração e apoio em toda
trajetória.
Ao Dr. Carlos Henrique Fregadolli pela análise estatística deste trabalho.
À Coordenação do Curso de Pós-graduação pelo apoio financeiro para realização
dos experimentos.
Aos Professores Dr. Antônio Carlos Boschero e Dr. Everardo Magalhães
Carneiro por apoiar e tornar possível a realização dos experimentos no
Laboratório de Pâncreas Endócrino e Metabolismo – Unicamp.
Ao Professor Dr. Fabiano Ferreira pela ajuda na realização dos experimentos e
Drª Marise Auxiliadora de Barros Reis pelo auxílio na conferência do
manuscrito.
Aos colegas do mestrado que propiciaram a troca de conhecimentos durante a
realização das disciplinas.
À Secretaria de Estado de Saúde e Hospital Regional de Colider pela
concessão de licença integral das atividades profissionais, o que propiciou a
dedicação exclusiva ao curso de Mestrado em Ciências da Saúde.
À Universidade Federal de Mato Grosso pela minha formação profissional.
A todos que contribuíram, meu eterno agradecimento...
ÍNDICE RESUMO......................................................................................................... 1
ABSTRACT..................................................................................................... 2
1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 3
1.1 O Pâncreas endócrino e o mecanismo de secreção de insulina............... 4
1.2 Adaptações das ilhotas de Langerhans à restrição protéica..................... 8
1.3 Adaptações das ilhotas de Langerhans à gravidez................................... 9
2. JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 12
3. OBJETIVOS................................................................................................ 13
3.1 Objetivo geral............................................................................................. 14
3.2 Objetivos específicos................................................................................. 14
4. REFERÊNCIAS........................................................................................... 15
5. TRADUÇÃO DO ARTIGO........................................................................... 27
Introdução........................................................................................................ 28
Materiais e Métodos......................................................................................... 29
Resultados....................................................................................................... 32
Discussão........................................................................................................ 28
6. ARTIGO ORIGINAL.................................................................................... 45
Introduction...................................................................................................... 46
Materials and Methods..................................................................................... 47
Results............................................................................................................. 50
Discussion........................................................................................................ 53
References....................................................................................................... 62
1
RESUMO
Neste trabalho foi investigado o efeito da restrição protéica na secreção de insulina e na
expressão de PKA e PKC em ilhotas de ratas controles e prenhes. Ratas adultas controle
não prenhe (CN) e controle prenhe (CP) foram alimentadas com dieta normoprotéica (17%),
enquanto que ratas dos grupos hipoprotéico não prenhe (HN) e hipoprotéico prenhe (HP)
receberam dieta hipoprotéica (6%) por 15 dias. Na presença de 2,8 e 8,3 mmol/L de glicose, a
insulina secretada pelas ilhotas do CP foi maior do que pelas ilhotas do CN. Comparado com
o grupo CN a secreção de insulina pelas ilhotas do HN foi menor apenas em 8,3 mmol/L de
glicose. A secreção de insulina pelas ilhotas do HP foi maior do que pelas ilhotas do HN em
ambas as concentrações de glicose. IBMX (1 mmol/L), um inibidor da fosfodiesterase,
aumentou a secreção de insulina pelas ilhotas das ratas prenhes e este efeito foi maior nas
ilhotas do CP do que nas ilhotas do HP. Forskolin (0,01-100 mol/L), um estimulador da
adenilato ciclase, aumentou a secreção de insulina apenas nas ilhotas do CN e CP, com uma
EC50 maior nas ilhotas do CP comparado com as ilhotas do CN. A secreção de insulina
induzida pelo PMA (um estimulador da PKC) foi maior nas ilhotas do HN e HP comparadas
com seus respectivos controles, especialmente em 8,3 mmol/L glicose. A expressão de PKA,
mas não PKC, foi menor em ilhotas dos grupos hipoprotéicos em relação às dos controles,
independente do estado fisiológico das ratas. Todas as células endócrinas das ilhotas,
inclusive as células , expressaram a isoforma PKA. A distribuição citoplasmática dessa
enzima na célula não foi modificada pela prenhez e/ou restrição protéica. Concluindo,
ilhotas de ratas submetidas à restrição protéica durante a prenhez respondem de maneira
similar à ratas controles, ao menos em concentração fisiológica de glicose. A menor resposta
ao IBMX e ao forskolin indica uma menor produção de AMPc e/ou sensibilidade a ele,
associada à redução na expressão de PKAα e provavelmente na sua atividade.
Palavras chaves: Dieta hipoprotéica, secreção de insulina, PKA, PKC, prenhez, ratos.
2
ABSTRACT
In this work, we investigated the effect of protein restriction on insulin secretion and the
expression of PKA and PKC in islets from control and pregnant rats. Adult control non-
pregnant (CN) and control pregnant (CP) rats were fed a normal protein diet (17%), whereas
low protein non-pregnant (LPN) and low protein pregnant (LPP) rats received a low protein
diet (6%) for 15 days. In the presence of 2.8 and 8.3 mmol glucose/L, the insulin secretion by
CP islets was higher than by CN islets. Compared to the CN groups, the insulin secretion by
LPN islets was lower with 8.3 but not with 2.8 mmol glucose/L. The insulin secretion by LPP
islets was higher than by LPN islets at both glucose concentrations. IBMX (1 mmol/L), a
phosphodiesterase inhibitor, increased insulin secretion by islets from pregnant rats and this
effect was greater in CP islets than in LPP islets. Forskolin (0.01-100 mol/L), a stimulator of
adenylyl cyclase, increased insulin secretion only in CN and CP islets, with a higher EC50 in
CP islets compared to CN islets. The insulin secretion induced by PMA (a stimulator of PKC)
was higher in LPN and LPP islets compared to the respective controls, especially at 8.3 mmol
glucose/L. PKA, but not PKC, expression was lower in low protein islets than in the
controls, regardless of the physiological status of the rats. All endocrine cells of the islets,
including the -cells, expressed the PKA isoform. The cytoplasmic distribution of this
enzyme in -cells was not modified by pregnancy and/or protein restriction. In conclusion,
our results indicate that the response of islets from low protein rats during the pregnancy is
similar to the control rats, at least in physiologic glucose concentration. However, the lower
response to the IBMX and forskolin indicates decrease production and/or sensibility of cAMP,
associated with a decrease in PKA expression and probability, their activity.
Key Words: Low protein diet, insulin secretion, PKA, PKC, pregnancy, rats
3
1. INTRODUÇÃO
4
1. INTRODUÇÃO
1.1. O Pâncreas endócrino e o mecanismo de secreção de insulina
O pâncreas endócrino é uma glândula única, composta por quatro principais tipos de
células distribuídas por toda a porção exócrina. Essas células estão agregadas em “ilhas”
denominadas ilhotas de Langerhans. Estima-se que humanos adultos tenham
aproximadamente 2 milhões de ilhotas (2% do peso do pâncreas). São geralmente ovais e a
distribuição dos diferentes tipos de células endócrinas dentro de uma ilhota é similar na
maioria dos mamíferos (1).
Cada ilhota consiste de um aglomerado central (núcleo) de células com um manto de
células e/ou ou um manto de células e PP envolvendo-a. Em roedores cada ilhota é
composta por 2.000 a 4.000 células, das quais 70 a 80% são células β, produtoras de insulina,
5% são células δ, produtoras de somatostatina, e 15 a 20% correspondem às células α e PP,
produtoras de glucagon e polipeptídeo pancreático respectivamente, dependendo da
localização no pâncreas (2).
As ilhotas são muito bem vascularizadas: recebem 10% do suprimento sanguíneo
pancreático. Em roedores o sangue flui do centro que contém células β para as células α e δ
(via B-A-D) (3). Contudo, não está claro se a via B-A-D está presente no pâncreas humano
(1). Considerando a estrutura anatômica das ilhotas, é provável que as células β também
modulem a função de células vizinhas via interações parácrinas e autócrinas (4).
A função primária das células β das ilhotas de mamíferos é secretar quantidades
apropriadas de insulina bioativa, em resposta a nutrientes, hormônios e estímulos nervosos
para manter a homeostase glicêmica.
5
O mecanismo de secreção de insulina tem sido alvo do interesse de inúmeros
pesquisadores desde o início do século 20. O estudo desse mecanismo foi grandemente
dificultado por vários fatores, dentre os quais podemos citar: pequena massa tecidual, posição
estratégica ocupada pelas ilhotas de Langerhans no pâncreas e, ainda, à complexidade destes
microorgãos, devido à presença de células com diferentes funções (5).
A glicose é o agente estimulador mais importante da secreção de insulina, pelo menos
nos mamíferos onívoros, porém o mecanismo preciso e os fatores que estão envolvidos no
processo secretório não estão completamente entendidos (6).
Em células de mamíferos os dois primeiros passos do metabolismo da glicose são o
transporte e a fosforilação, realizados, respectivamente, por uma família de proteínas
transportadoras de glicose (GLUTs) e por enzimas que fosforilam este monossacarídeo, as
quais diferem quanto a sua distribuição tecidual e atividade catalítica (7,8). Nas células
pancreáticas os transportadores de glicose são representados pelo GLUT-2 que difere das
outras isoformas existentes nos mamíferos, por apresentar um Km alto (baixa afinidade para a
glicose) e um Vmax muito elevado (9,7).
Duas hexoquinases têm papel importante na fosforilação da glicose nas células : a
glicoquinase ou hexoquinase IV, com um Km alto (baixa afinidade para a glicose) e uma
hexoquinase com Km baixo (alta afinidade para a glicose). A enzima de alta afinidade é
fortemente inibida pela glicose-6-fosfato, o que transfere para a glicoquinase o papel
preponderante na fosforilação da glicose nas células . Esse mecanismo permite a formação
de glicose-6-fosfato apenas em concentrações fisiológicas e suprafisiológicas de glicose no
sangue. Também confere à glicoquinase a importante função de regulador do fluxo glicolítico
e, portanto, da secreção de insulina (10,11). Essa função caracteriza a glicoquinase como
“sensor” da glicose nas células (12).
6
A glicose é rapidamente transportada para dentro da célula pelo GLUT-2, fosforilada
pela glicoquinase e metabolizada na via glicolítica e no ciclo de Krebs (13,14). Na célula , o
produto do fluxo glicolítico é direcionado preferencialmente para eventos mitocondriais, o
que aumenta consideravelmente a produção de adenosina trifosfato (ATP), procedente do
metabolismo da glicose. Assim, o ATP é gerado tanto pelas reações mitocondriais quanto
pelas citosólicas. A produção de ATP citosólico é proveniente de duas reações na porção
distal na glicólise: as reações catalisadas por 3-fosfoglicerato quinase e piruvato quinase. O
ATP mitocondrial é derivado, em parte, de shuttles de hidrogênio, principalmente através das
enzimas malato aspartato (15,16) e glicerofosfato (15,17,18), as quais são muito ativas nas
células das ilhotas. A maior porção de ATP produzido, no entanto, é proveniente da
oxidação mitocondrial do piruvato derivado da glicose.
A elevação da razão adenosina trifosfato: adenosina difosfato (ATP:ADP) induz o
bloqueio de canais de K+ sensíveis a ATP (K+ATP) localizados na membrana plasmática (19).
O acúmulo relativo desse cátion provoca despolarização da membrana e conseqüente abertura
dos canais de Ca2+ voltagem-dependentes, resultando em influxo e elevação do Ca2+
citosólico (20).
O aumento do Ca2+ ativa o mecanismo secretor de insulina (exocitose dos grânulos
contendo insulina) (21). Este mecanismo é potencializado pelo próprio Ca2+, que ativa dois
complexos enzimáticos localizados na membrana plasmática: adenilato ciclase e fosfolipase C
(PLC). O primeiro gera adenosina monofosfato cíclica (AMPc), e o segundo, inositol-1,4,5-
trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG) (22). Os segundos mensageiros AMPc e DAG
amplificam o sinal de Ca2+ por facilitar o influxo do íon (23,24) e IP3 por mobilizar os
estoques de Ca2+ intracelular presentes no retículo endoplasmático (25). O AMPc e o DAG
atuam sobre os canais de Ca2+ voltagem-dependentes por meio da ativação da proteína
7
quinase dependente de AMPc (PKA) e da proteína quinase dependente de Ca2+ (PKC),
respectivamente (26,27,28,29,30,31).
Não há dúvidas que as proteínas quinases exercem função importante na regulação da
secreção de insulina pelas células pancreáticas. Há consenso de que as famílias de PKA e
PKC são de vital importância para a modulação da resposta secretória por secretagogos não
nutrientes através dos receptores, mas o seu envolvimento na secreção de insulina induzida
por nutrientes é ainda motivo de controvérsias (32).
A PKA e a PKC parecem agir na maquinaria secretória das células via mecanismos
distintos. Estudos simultâneos avaliando a capacitância da membrana e a concentração de
Ca2+ intracelular revelam que a ativação da PKA aumenta a secreção de insulina em célula
de camundongos e aumenta a corrente de Ca2+, enquanto que PKC provoca aumentos
similares na secreção, sem mudanças nos eventos elétricos (33).
Parte das incertezas sobre o papel das proteínas quinases nas células podem ser
atribuídas à expressão de múltiplas isoformas dessas enzimas. O conhecimento mais
detalhado da função dessas proteínas nas células depende do desenvolvimento de novos
métodos de detecção, ativação e inibição de isoformas individuais de proteínas quinases (32).
8
1.2. Adaptações das ilhotas de Langerhans à restrição protéica
A desnutrição protéico-calórica é um grave problema de saúde pública em várias áreas
do mundo, inclusive no Brasil. Sabe-se que essa deficiência nutricional é causa de alteração
no metabolismo dos carboidratos em crianças, adultos e animais (34).
Em geral, desnutrição calórico-protéica está associada com a diminuição da tolerância
à glicose e hipoinsulinemia. Tendo em vista que a conteúdo de insulina pancreática é normal
ou ainda maior em animais mantidos com dieta hipoprotéica, a hipoinsulinemia verificada
nesta situação pode ser conseqüência da redução do volume das células e/ou da secreção de
insulina (35).
O defeito secretório em resposta à glicose observado em ilhotas de ratos desnutridos
pode resultar de: 1) o não reconhecimento da glicose como estímulo, devido a uma expressão
reduzida do seu transportador e/ou diminuição da fosforilação da glicose pela glicoquinase
(36); 2) alteração da oxidação mitocondrial da glicose, devido a redução da atividade da
glicerofosfato desidrogenase mitocondrial na célula β, possivelmente associada a outras
anormalidades enzimáticas (37); 3) diminuição da capacidade da glicose em aumentar a
captação e/ou reduzir efluxo do Ca2+ na célula β (35,38) e 4) alteração nas vias do AMPc e
PLC e 5) quantidades reduzidas de PKCα e PKAα. (39,40).
Entretanto, os estudos já descritos sobre as causas e mecanismos de lesão da célula β
em indivíduos desnutridos, assim como das causas que levam à ruptura da homeostase da
glicose, são ainda inconsistentes. Portanto, há ainda muito a ser pesquisado até que possamos
obter um completo entendimento dessas causas e mecanismos.
9
1.3. Adaptações das ilhotas de Langerhans à gravidez
Vários estudos têm caracterizado a gravidez como uma condição de redução da
sensibilidade periférica à insulina (41). Essa condição associada à hiperfagia (42), contribui
para o aumento da demanda de insulina na gravidez. Para garantir o suprimento adequado
desse hormônio, as ilhotas pancreáticas exibem, no curso da gravidez, aumento gradual da
secreção de insulina quando estimulada com glicose (43).
Para acompanhar as mudanças no metabolismo materno e o aumento na demanda por
insulina que ocorre neste período, as ilhotas de Langernhans passam por mudanças estruturais
e funcionais.
As adaptações estruturais que ocorrem nas ilhotas de Langerhans durante a gravidez
foram sugeridas no início da década de 1930, quando se observou que, nessa situação, ocorria
um aumento do volume total das ilhotas pancreáticas (44). Desde então, numerosos métodos
quantitativos têm sido usados para examinar as modificações estruturais das ilhotas durante a
gravidez.
É consenso que há um aumento da massa total das ilhotas pancreáticas, resultante da
hiperplasia e hipertrofia e da redução da apoptose, principalmente das células β (45). Em
roedores, o aumento da proliferação das células β é primeiramente observado ao redor do
décimo dia de gravidez, com picos por volta do décimo quarto dia e retorno aos valores
encontrados na fase pré-gestacional aos vinte e um dias (46,47). Outras mudanças estruturais
verificadas nessa fase incluem: aumento das “gap junction” entre as células (48), aumento
do número de receptores de prolactina (49,50), aumento do conteúdo de proteína (51) e de
insulina nas ilhotas (52). Contudo, essas alterações estruturais não são suficientes para
explicar o aumento das concentrações séricas de insulina verificadas na gravidez.
10
Evidências sobre as mudanças funcionais nas ilhotas em resposta à gravidez foram
obtidas na década de 1960, após o desenvolvimento da técnica de radioimunoensaio sensível à
insulina. Verificou-se inicialmente que, no curso da gravidez, ocorre um aumento progressivo
na secreção de insulina tanto no estado basal, quanto no estimulado por glicose (53,54,55).
Green & Taylor (1972) (56), foram os primeiros a notarem um deslocamento para a
esquerda da curva dose resposta glicose-insulina em ilhotas isoladas aos dezenove dias de
gravidez, indicando o aumento da sensibilidade das ilhotas à glicose.
Parsons et al. (1992) (45), aplicando uma técnica de perfusão de pâncreas isolado com
concentrações de glicose variando entre 2,8 mM e 12,0 mM, verificaram alteração do limiar
de estimulação da secreção de insulina pela glicose e da quantidade de insulina liberada na
presença de concentrações elevadas dessa hexose. O limiar atingiu o nadir de 3,25 mM de
glicose entre o décimo segundo e décimo quinto dias, e voltou a aumentar para 4,7 mM de
glicose no vigésimo dia de gravidez. A liberação total de insulina aumentou 4,0 vezes no
décimo quinto dia e declinou para 1,4 vez no vigésimo dia de gravidez.
As alterações da secreção de insulina em resposta à gravidez têm sido atribuídas ao
aumento do metabolismo da glicose nas ilhotas pancreáticas (57). Embora importantes, as
alterações no metabolismo da glicose são insuficientes para explicar completamente o
aumento da sensibilidade das ilhotas à glicose. Os aumentos do metabolismo do AMPc e da
PLC têm sido considerados mecanismos envolvidos na queda do limiar de glicose para a
estimulação da secreção de insulina e no aumento da liberação desse hormônio. Esta hipótese
encontra reforço nas observações que em ilhotas de ratas grávidas a elevação da secreção de
insulina em resposta à glicose, está associada ao aumento da atividade da adenilato ciclase, e
conseqüente elevação da concentração do AMPc (57), e do metabolismo da PLC (58). A
perfusão de pâncreas com solução de glicose acrescida de forskolin e glucagon, agentes
11
conhecidos por elevarem o conteúdo de AMPc na célula , também aumenta a secreção de
insulina (58).
Estudos têm mostrado que as alterações da estrutura e função do pâncreas endócrino
durante a gravidez são controladas por muitos fatores, incluindo uma variedade de sinais
neurais, químicos e hormonais nas ilhotas. Dentre os hormônios envolvidos neste processo
estão a prolactina, o lactogênio placentário e o hormônio de crescimento (59,60). Ilhotas
tratadas com prolactina sofrem as mesmas alterações desencadeadas pela gravidez (46).
A prolactina exerce esses efeitos biológicos através da interação com um membro da
família de tirosina quinase JAK (Janus quinase). Uma vez ativada, a JAK fosforila STAT
(membro da família de fatores de transcrição) que migra para o núcleo e ativa a transcrição de
diversos genes, incluindo o da insulina, do GLUT2, do receptor da prolactina (49,61) e
daqueles envolvidos com a transcrição, tradução e regulação do ciclo celular além de diminuir
a expressão de genes relacionados à apoptose (62).
Considerando que o aumento da sensibilidade das ilhotas à glicose durante a gravidez
se deve também às vias AMPc/PKA e PLC/PKC e tendo em vista que a expressão e atividade
dessas quinases estão alteradas na desnutrição, este estudo teve o objetivo de avaliar o efeito
da restrição protéica durante a gravidez sobre essas vias.
12
2. JUSTIFICATIVA
As adaptações no mecanismo de secreção de insulina verificadas na gravidez têm sido
bastante estudadas nos últimos anos. Uma das razões para esse interesse vem do fato de que a
incapacidade das ilhotas maternas em responderem ao aumento da demanda de insulina na
gravidez pode contribuir para o desenvolvimento do diabetes gestacional, uma condição que
se constitui numa ameaça para o bem estar da mãe e do feto.
Na gravidez normal, a concentração de glicose no estado basal encontra-se diminuída.
O aumento de sensibilidade das células à glicose e a conseqüente diminuição do limiar de
estimulação de secreção de insulina por essa hexose são os dois processos adaptativos
verificados na gravidez que permitem o aumento da secreção de insulina em baixa
concentração de glicose. Estes processos adaptativos parecem resultar de alterações nas vias
PLC/PKC e AMPc/PKA.
Modelos animais de restrição protéica apresentam redução da sensibilidade das ilhotas
de Langerhans à glicose e da expressão da PKC e PKA (35,38,39,40).
13
3. OBJETIVOS
14
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da restrição protéica durante a prenhez sobre vias envolvidas na
determinação do limiar de estimulação da secreção de insulina por glicose em ilhotas
pancreáticas.
3.2. Objetivos Específicos
Determinar a secreção de insulina em resposta à glicose e a moduladores da vias
PLC/PKC (PMA) e AMPc/PKA (forskolin e IBMX) em ilhotas de ratas prenhes
submetidas à restrição protéica.
Determinar a expressão das enzimas PKC e PKA em ilhotas de ratas prenhes
submetidas à restrição protéica.
15
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24
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25
Os resultados desta dissertação são apresentados a seguir, no formato de artigo
científico, com o título “Insulin secretion and expression of PKA and PKC in
islets from pregnant rats fed a low protein diet”, já aceito para publicação no
The Journal of Nutrition em 12/02/2005.
26
5. TRADUÇÃO DO ARTIGO
27
SECREÇÃO DE INSULINA E EXPRESSÃO DE PKA E PKC EM ILHOTAS DE
RATAS PRENHES SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO PROTÉICA.
Marciane Milanski1, Vanessa Cristina Arantes2, Fabiano Ferreira3, Marise Auxiliadora de
Barros Reis2, Everardo Magalhães Carneiro4, Antonio Carlos Boschero4, Carla Beatriz
Collares-Buzato5 Márcia Queiroz Latorraca2*
1Secretaria de Estado da Saúde, Mato Grosso, MT, Brasil; 2Departamento de Alimentos e
Nutrição, Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá,
MT, Brasil; 3Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE), Recife, PE, Brasil, 4Departamento de Fisiologia e Biofísica e
5Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil.
* Correspondências podem ser enviadas para: Departamento de Alimentos e Nutrição,
Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), 78060-900, Cuiabá,
MT, Brasil. Telefone: xx55 65-615 8816; Fax: xx55-65-615 8811; E-mail:
Running title: Vias da PKA e PKC em ratas prenhes mal nutridas.
Este trabalho foi apresentado por Marciane Milanski como parte dos requerimentos do
Mestrado em Ciências da Saúde da Faculdade de Ciências Médicas, UFMT.
28
INTRODUÇÃO
Desnutrição e gravidez estão associadas com mudanças funcionais nas ilhotas
pancreáticas. A dieta hipoprotéica diminui a secreção de insulina em resposta à glicose (1-3)
como conseqüência a diversas alterações, incluindo: um menor tamanho e/ou volume das
células (4), o reconhecimento inapropriado da glicose como um estimulador, devido à
menor expressão do glicoreceptor e/ou menor metabolismo da glicose (5), redução da
oxidação de substrato mitocondrial causada pela redução da atividade da glicerofosfato
desidrogenase nas células , possivelmente associada com outras anormalidades enzimáticas
(6), capacidade reduzida da glicose em aumentar a captação de Ca2+ e/ou de reduzir o efluxo
de Ca2+ das células- (1,7), alteração nas vias da PLC e AMPc, e quantidade diminuída de
PKC e PKA (2,3).
Em contraste, as adaptações das ilhotas à gravidez envolvem aumento da secreção de
insulina estimulada por glicose com a redução de seu limiar de estimulação (8). Estas
mudanças adaptativas são controladas pelos hormônios lactogênicos (lactogênio placentário
e/ou prolactina) que aumentam a proliferação das células e o volume da ilhota (9), síntese
de insulina (10), a junção gap-junctional entre as células (11), e o metabolismo da glicose,
devido a maior expressão do GLUT2 (12) e atividade da glicoquinase (13) e aumento do
metabolismo do AMPc e PLC (14,15).
O sistema AMPc/PKA aumenta a secreção de insulina por estimular a fosforilação de
proteínas nos canais iônicos na membrana plasmática das células (16,17). Esta fosforilação
resulta numa despolarização mais rápida da membrana e no aumento do influxo de Ca2+
através de canais voltagem-dependentes, que eleva a concentração de Ca2+ intracelular e
aumenta a exocitose. O AMPc também aumenta a secreção de insulina por regular os passos
mais distais da maquinaria secretória (18). O aumento da atividade da adenilato ciclase e PKA
29
foi observado em ilhotas de ratas prenhes (19,14,20) com uma concomitante redução no
limiar de estimulação pela glicose nas células (8).
A ativação da PKC contribui para a secreção de insulina estimulada por glicose
(21,22). PKC é a isoenzima mais comum da família da PKC em células das ilhotas
pancreáticas (23,24), e é ativada quando as ilhotas são estimuladas por secretagogos não-
nutrientes (25). A ativação da PKC contribui para a secreção de insulina estimulada por
glicose, embora isso ainda seja controverso (26).
Neste estudo, nós investigamos o efeito da restrição protéica na secreção de insulina
em resposta à glicose, IBMX, forskolin e PMA, assim como a expressão PKA e PKC, em
ilhotas pancreáticas de ratas durante a prenhez.
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais e dieta: Todos os experimentos com os animais foram aprovados pelo Comitê de
Ética de Animal de Experimentação da Unicamp (CEEA/IB-UNICAMP). Fêmeas virgens de
ratas Wistar (90 dias), foram obtidas do biotério central da Unicamp. O acasalamento foi feito
colocando machos com fêmeas durante a noite, e a prenhez foi confirmada através do
esfregaço vaginal e verificação da presença de espermatozóides. As fêmeas prenhes foram
separadas aleatoriamente e mantidas do primeiro até o 15ª dia de prenhez com dieta
isocalórica contendo 6% de proteína (dieta hipoprotéica) ou 17% de proteína (dieta controle).
Quatro grupos de ratas foram usados neste estudo: grupo controle não prenhe (CN) e controle
prenhe (CP), alimentados com dieta controle, e grupo hipoprotéico não prenhe (HN) e
hipoprotéico prenhe (HP), alimentados com dieta hipoprotéica. Durante o período
experimental, as ratas tiveram livre acesso à comida e água e foram mantidas em ciclo de 12 h
claro/escuro a 22ºC. No final do período experimental as ratas alimentadas foram pesadas e
30
sacrificadas por decapitação. As amostras de sangue foram coletadas e o soro foi estocado a
temperatura de -20ºC para a subseqüente quantificação de insulina. A glicemia (27),
albuminemia (28) e proteínas totais sérica (29) foram determinadas imediatamente após a
decapitação.
Isolamento de ilhotas e secreção de insulina: O pâncreas foi removido e digerido com
colagenase como descrito anteriormente (30). Na primeira série de experimentos, grupos de
cinco ilhotas foram incubados por 90 min a 37ºC em tampão de Krebs-bicarbonato contendo
glicose (2,8 e 8,3 mmol/L) equilibrado com uma mistura de 95% O2 - 5% CO2 para dar um pH
de 7,4. O meio de incubação continha (mmol/L): NaCl 115, KCl 5, CaCl2 2,56, MgCl2 1,
NaHCO3 24 e albumina bovina (3 g/L). Na segunda série de experimentos, a secreção de
insulina foi medida em resposta a: 1) glicose (2,8 mmol/L) na ausência e presença de
Isobutilmetilxantina (IBMX) (1 mmol/L), 2) glicose (2,8 mmol/L) associada com crescentes
concentrações de forskolin (0,01-100 mol/L), e 3) glicose (2,8 ou 8,3 mmol/L) na ausência
ou presença de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (0,1 mol/L). A insulina liberada foi
determinada por radioimunoensaio usando insulina de rato como padrão. A concentração de
forskolin que produziu 50% da resposta máxima (EC50) foi expressa como média do logaritmo
negativo (pD2).
Imunohistoquímica: O pâncreas de todos os grupos experimentais foi dissecado, fixado em
formaldeído 10% (v/v, em 100 mmol/L tampão fosfato) por pelo menos 12 h e incluído em
parafina. Pares de secções seriadas (5 m) de tecido incluído em parafina foram colocadas em
lâminas de vidro previamente silanizadas, desengorduradas e hidratadas com TBS (50
mmol/L) e incubadas por 30 min com solução de peróxido de hidrogênio não diluído (Sigma,
St. Louis, MO) para bloquear peroxidase endógena. Após 1 h de incubação com TBS
31
contendo 5% de leite em pó desnatado e Tween 20 a 0,1%, cada par das secções foi incubado
por uma noite com anticorpo primário para PKA (Santa Cruz, CA) ou insulina (Dako,
Carpinteria, CA) (diluído 1:50 em TBS contendo 3% leite em pó desnatado). A distribuição
tecidual de PKA foi detectada usando biotina avidina peroxidase de coelho (ImmunoCruz
Staining System-Santa Cruz). Para a imunoreação da insulina, as secções foram incubadas por
90 min com anticorpo (IgG cobaia) conjugado com peroxidase (diluído 1:1500 em TBS
contendo 1% leite em pó desnatado) e desenvolvido com 3,3´diaminobenzidina (DAB)
(Sigma). Todas as secções foram contrastadas com hematoxilina de Ehrlich e fotografadas
usando câmera digital (CoolSNAP-Pro, Media Cybernetics) acoplada ao microscópio Nikon
Eclipse E800. Os controles negativos para a imunoreação foram obtidos pela omissão do
anticorpo primário.
Western blotting: Após o isolamento, grupos de ilhotas foram centrifugadas (15,000 g para a
formação de pellets) e ressuspensas em 50-100 L de tampão de homogeneização contendo
inibidor de protease (31,32). As ilhotas foram sonicadas e foi determinada a quantidade total
de proteínas (33). Amostras contendo 70 g de proteína foram incubadas por 5 min a 80ºC
com tampão Laemmli 4X concentrado (1 mmol/L de fosfato de sódio, pH 7,8, 0,1% azul de
bromofenol, 50% glicerol, 10% SDS, 2% mercaptoetanol) (4:1, v/v) e a corrida realizada em
géis de poliacrilamida (8%) a 120 V por 30 min. A eletrotransferência das proteínas para
membranas de nitrocelulose (Bio-Rad) foi feita por 1 h a 120 V em tampão contendo metanol
e SDS. Depois de checada a eficiência da transferência pela coloração da membrana com
Ponceau, as mesmas foram bloqueadas com leite desnatado 5% em TTBS (10 mmol de
Tris/L, 150 mmol de NaCl/L, 0,5% Tween 20) por uma noite a 4ºC. PKC e PKA foram
detectadas nas membranas após 2 h de incubação em temperatura ambiente com anticorpo
específico (anti-PKA: IgG policlonal de coelho; anti-PKC: IgG monoclonal de
32
camundongo; Santa Cruz); diluído 1:500 em TTBS contendo 3% leite em pó desnatado. A
detecção foi feita por quimiluminescência (SuperSignal West Pico, Pierce) após incubação
com anticorpo secundário (horseradish peroxidase-conjugated)
Análise Estatística: Os resultados foram expressos como média EPM para o número de
ratos (n) indicado. Para ilhotas, o n se refere ao número de experimentos feitos. Inicialmente
foi aplicado o teste de Bartlett para verificar a homogeneidade das variâncias. Para corrigir a
heterogeneidade das variâncias ou normalidade (34), os valores da insulina sérica e da
secreção de insulina em resposta à glicose foram transformados em logaritmo, e a EC50 foi
transformada em logaritmo neperiano. Os parâmetros séricos, peso corporal, secreção de
insulina em resposta à glicose (2,8 e 8,3 mmol/L), EC50 e expressão da PKC e PKA foram
analisados por ANOVA a dois fatores (estado nutricional e estado fisiológico). A secreção de
insulina estimulada pela glicose (2,8 mmol/L), mais IBMX e glicose (2,8 ou 8,3 mmol/L),
mais PMA, foi avaliada pela análise de variância a três fatores (estado nutricional, estado
fisiológico e ausência ou presença de IBMX ou PMA). Quando necessário, estas análises
foram complementadas pelo teste de Tukey-HSD para determinar a significância das
diferenças individuais. O nível de significância foi estabelecido em P< 0,05. Os dados foram
analisados usando o programa Statistic Software (Statsoft, Tulsa, OK).
RESULTADOS
1- Características dos ratos: Independentemente do estado nutricional, ratas prenhes tiveram
peso corporal maior e concentração de glicose sérica menor do que as ratas não prenhes. Ao
final do período experimental, os níveis séricos de proteínas totais, albumina e insulina não
diferiram entre os grupos (Tabela 1).
33
TABELA 1 - Peso final e concentrações séricas de proteínas totais, albumina, insulina e
glicose de ratas dos grupos controle e hipoprotéico, prenhes e não prenhes1
Grupos
Controle Hipoprotéico
Variáveis
Não- prenhe Prenhe Não- prenhe Prenhe
Peso corporal, g 258 8
(12)
290 7*
(13)
263 6
(11)
298 8*
(11)
Proteínas totais, g/L 58 2
(8)
51 7
(8)
57 8
(8)
62 3
(7)
Albumina, g/L 32 0,5
(12)
32 0,4
(13)
32 0,8
(11)
33 1,0
(11)
Insulina, nmol/L 0,15 0,02
(12)
0,16 0,03
(13)
0,13 0,01
(11)
0,15 0,02
(11)
Glicose, mmol/L 9,9 0,6
(12)
7,5 0,9*
(12)
8,7 0,8
(10)
7,0 0,3*
(11)
1 Valores expressos em média EPM do número de ratos entre parênteses. * Diferença entre as não-prenhes, P < 0,05
2- Secreção de insulina: A secreção de insulina em baixa concentração de glicose (2,8
mmol/L) foi significativamente maior em ilhotas das ratas dos grupos CP e HP quando
comparadas aos seus respectivos grupos controle CN e HN (Figura 1A). Com uma maior
concentração de glicose (8,3 mmol/L), a secreção de insulina pelas ilhotas do HN foi menor
do que nas ilhotas do CN (P< 0,05). No entanto, a prenhez aumentou a resposta secretória em
ambos os grupos nutricionais. Portanto, ilhotas do HP e CP tiveram secreção de insulina
similar (Figura 1B).
34
Em concentração de glicose não estimulatória (2,8 mml/L), o IBMX (Figura 2) não
alterou a secreção de insulina pelas ilhotas do CN, mas a liberação de insulina foi
significativamente aumentada pelas ilhotas do HN (P< 0,05). Em ilhotas de ratas prenhes, a
potenciação de secreção de insulina pelo IBMX foi menor no grupo HP do que no grupo CP
(Figura 2).
Em todas as concentrações de forskolin (0,01-100 mol/L), a secreção de insulina
pelas ilhotas dos grupos hipoprotéicos foi menor do que nos grupos controles, independente
do estado fisiológico (dados não mostrados). Em ilhotas de ratas dos grupos HN e HP, o
aumento da secreção de insulina, ainda que em altas concentrações de forskolin, foi apenas
marginal. Em ilhotas de ratas CN, um aumento significativo da secreção de insulina foi visto
apenas em altas concentrações de forskolin (1-100 mol/L) enquanto que em ilhotas do grupo
CP, forskolin aumentou a secreção de insulina apenas em 0,1 mol/L. A concentração de
forskolin que estimulou metade da resposta máxima (EC50) foi significativamente afetada pelo
estado nutricional (F (1,12)= 71,96, p= 0,000) e estado fisiológico (F(1,12)= 465,35, p= 0,000),
assim como pela interação entre ambos os estados (F(1,12)= 25,54, p= 0,000). Então, a prenhez
reduziu os valores da EC50 nos grupos controle e hipoprotéico. Contudo, a EC50 para o grupo
HP foi maior do que para o grupo CP (HP= 0,026 0,004 mol/L, n= 4; HN= 0,461 0,210
mol/L, n= 4; CP= 0,002 0,001 mol/L, n= 4; CN= 0,240 0,022 mol/L, n= 4).
A Figura 3A e B mostra que, em 2,8 e 8,3 mmol/L de glicose, PMA aumentou a
secreção de insulina mais acentuadamente em ilhotas do grupo HP comparada com as ilhotas
do CP. Em 2,8 mmol/L de glicose (Figura 3A), a secreção de insulina induzida pelo PMA foi
4,3 vezes e 8 vezes maior em ilhotas dos grupos HN e HP comparada com seus respectivos
controles (HN e HP sem PMA). Em ilhotas do CN, PMA induziu aumento na secreção de
insulina 6,3 vezes e 4,2 vezes em ilhotas do CP (P< 0,05). Em 8,3 mmol/L de glicose,
(Figura 3B) o aumento de secreção de insulina provocado pelo PMA nas ilhotas do HN e CN
35
foi 4,7 vezes e 6,5 vezes, respectivamente (P< 0,05). Em ilhotas HP e CP, o aumento foi de
5,4 vezes e 3,6 vezes em relação aos respectivos controles (sem PMA) (P< 0,05).
A expressão da PKA em ilhotas de ratas alimentadas com dieta hipoprotéica (HN e
HP) foi 33% menor do que em ratas controles (CN e CP). Um significante efeito do estado
nutricional (F(1,12)= 13,36; p= 0,003), mas não do estado fisiológico (F(1,12)= 0,03; p= 0,856)
foi observado. Contudo, não houve interação entre os dois estados (F(1,12)= 0,84; p= 0,377)
(Figura 4A). Não houve diferença da quantidade de PKC em ilhotas de qualquer dos grupos
de ratas (Figura 4B) e, conseqüentemente, nenhum efeito significativo do estado nutricional
(F(1,14)= 3,93; p=0,067) e estado fisiológico (F(1,14)= 1,33; p=0,269), e nenhuma interação entre
eles (F(1,14)= 3,83; p= 0,070).
A imunohistoquímica revelou uma maior expressão da PKA em células das ilhotas
do que no parênquima exócrino e esta enzima foi também detectada em células de ductos e
nervos (dados não mostrados). A marcação dupla para PKA e insulina mostrou que esta
quinase foi expressa por células e células não-. A distribuição citoplasmática da PKA
nas células da ilhota não foi modificada pela prenhez e/ou restrição protéica (Figura 5).
DISCUSSÃO
Perda de peso e hipoalbuminemia são freqüentemente vistas em roedores alimentados
com dieta hipoprotéica por um longo período (35). Porém, estas alterações clássicas não são
observadas após curto período em dieta hipoprotéica (15 dias), assim como no presente
estudo. No entanto, já se observa uma alteração significativa na capacidade da ilhota em
secretar insulina em resposta à glicose. Quando ilhotas de ratas do HN foram estimuladas com
concentração fisiológica de glicose (8,3 mmol/L), a secreção de insulina foi menor do que a
observada nas ilhotas do CN.
36
Durante a gravidez, a produção de insulina e a sensibilidade do pâncreas endócrino à
glicose aumentam para permitir uma resposta apropriada à resistência periférica à insulina
(36,37). Estas observações foram confirmadas neste estudo pela comparação da secreção de
insulina de ilhotas dos grupos CP e CN em 2,8 e 8,3 mmol/L de glicose (Figura 1A e B).
Além disso, nos ratos submetidos à restrição protéica, a prenhez aumentou a resposta das
células em concentração fisiológica de glicose. Mudanças nas concentrações de
glicoquinase, hexoquinase e GLUT2, assim como no metabolismo da glicose, são centrais no
processo adaptativo na gravidez, e é bem aceito que os lactogênios placentários exercem uma
função crucial nestes processos (13).
Já que a geração de AMPc é importante por reduzir o limiar de estimulação por
glicose nas células (8), nós examinamos a resposta secretória da insulina em 2,8 mmol/L de
glicose na presença de IBMX, um inibidor da fosfodiesterase, e na presença de concentrações
crescentes de forskolin, um ativador da adenilato ciclase, que aumenta os níveis de AMPc
intracelular. O IBMX induziu uma resposta secretória menos potente em ilhotas do HP do que
em CP. Em adição, a EC50 mostrou que a potência do forskolin foi significativamente
reduzida em ilhotas de ratas alimentadas com dieta hipoprotéica, comparada com aquelas que
receberam dieta normal. A prenhez diminuiu a EC50 em ambos os estados nutricionais, mas
em menor grau em ratas do grupo hipoprotéico do que as do controle.
Na ausência ou em baixa concentração de glicose, o aumento na concentração de
AMPc tem pouco ou nenhum efeito sobre a secreção de insulina (16). Em ratas normais, o
AMPc potencializa a secreção de insulina apenas acima do limiar de estimulação pela glicose
(por volta de 5,6 mmol/L), sendo este também o limiar de estimulação do metabolismo do
AMPc em células (38). Em ilhotas de ratas prenhes, assim como ilhotas tratadas com
prolactina, o limiar de secreção de insulina estimulada por glicose é reduzido para
aproximadamente 3 mmol/L (8). Este fenômeno poderia explicar a maior sensibilidade das
37
ilhotas CP em menores concentrações de forskolin comparadas com ilhotas CN (0,01 vs 1,0
mol/L). Forskolin praticamente falhou em estimular a secreção por ilhotas de ratos com
restrição protéica, independente do estado fisiológico, indicando que o sistema AMPc/PKA
nas ilhotas destes ratos está inoperante ou atenuado severamente. A redução da geração de
AMPc pelas ilhotas dos grupos hipoprotéicos pode ser conseqüência da menor taxa de
metabolismo da glicose e geração de fatores de acoplamento, com uma subseqüente redução
da concentração de Ca2+ intracelular e nos níveis do complexo Ca2+-calmodulina que
finalmente estimula a adenilato ciclase (39,40).
A resposta reduzida para o IBMX e forskolin pelas ilhotas do grupo hipoprotéico
poderia indicar uma diminuição na quantidade da subunidade catalítica da PKA, o maior
mediador do sinal de transdução da via do AMPc. Uma vez que dieta hipoprotéica reduz a
expressão de PKA em ilhotas de ratos (3), nós examinamos a participação desta quinase no
controle da secreção de insulina nas ilhotas de ratos submetidos à restrição protéica prenhes e
não prenhes. A isoforma PKA foi detectada em todas as células endócrinas da ilhota,
incluindo as células . A distribuição citoplasmática desta enzima na célula não foi
modificada pela prenhez e/ou restrição protéica. Entretanto, o imunoblotting mostrou que a
expressão de PKA foi significantemente menor em ilhotas de ratos submetidos à restrição
protéica quando comparado aos controles, independente do estado fisiológico.
Há duas possibilidades de explicação para a diminuição dos níveis de PKA em ilhotas
de ratos alimentados com dieta hipoprotéica. Primeira, a dieta poderia afetar diretamente a
expressão e tradução de diversos genes, incluindo de enzimas chaves envolvidas no processo
secretório. Segundo, a dieta hipoprotéica poderia influenciar o eixo endócrino-neuronal (41) e
alterar a regulação da expressão da PKA por diferentes hormônios (42,43). Então, a menor
secreção de insulina em resposta ao IBMX e forskolin vista em ilhotas de ratas submetidas à
38
restrição protéica, pode resultar da produção reduzida de AMPc, secundária à menor taxa de
metabolismo da glicose e à diminuição das concentrações de PKA.
A dieta hipoprotéica também reduz a expressão de PKC em ilhotas pancreáticas (2) e
sua atividade em diferentes tecidos (44). Entretanto, como mostrado aqui, a restrição protéica
por um período curto de tempo falhou em alterar a expressão da PKC. Na verdade, ilhotas
de ratas prenhes submetidas à restrição protéica secretaram proporcionalmente mais insulina
em resposta ao PMA, do que secretaram as ilhotas dos controles. Uma vez que a ativação da
PKC está envolvida na secreção de insulina por ilhotas de ratas em resposta a altas
concentrações de glicose (22) e, já que a gravidez ativa as vias PLC/PKC no pâncreas (45,46),
a maior secreção de insulina pelas ilhotas das ratas prenhes submetidas à restrição protéica em
relação às controles prenhes na presença de PMA, pode ter ocorrido às custas do aumento da
atividade da PKC.
Em conclusão, nossos resultados indicam que ilhotas de ratas submetidas à restrição
protéica durante a prenhez respondem de maneira similar às ratas controles, ao menos em
concentração fisiológica de glicose. Entretanto, a menor resposta ao IBMX e ao forskolin
indica uma menor produção de AMPc e/ou sensibilidade a ele, associada à redução na
expressão da PKA e, provavelmente na sua atividade.
Agradecimentos: Os autores agradecem L.D. Teixeira, C. R. Afonso e M. B. Leonardo pela
assistência técnica, e S. Hyslop pela correção do inglês. Este trabalho foi financiado pela
fundação Brasileira FAPESP (grant n. 02/13218-0), CNPq (grant n. 479138/2003-6) e
FINEP/PRONEX (grant n. 134/97).
39
Figura 1 – Secreção de insulina estimulada por glicose em ilhotas de ratas controle não
prenhe (CN), controle prenhe (CP), hipoprotéica não prenhe (HN) e hipoprotéica prenhe (HP).
Grupos de cinco ilhotas foram incubadas por 90 min em meio Krebs-bicarbonato contendo
2,8 (A) e 8,3 (B) mmol/L de glicose. As colunas representam a secreção de insulina
(acumulada em 90 min) expressa em média EPM de 5-9 experimentos independentes.
Médias sem letras iguais diferem-se significativamente, P <0,05.
0
50
100
150 A
b
a
b
a
CN CP HN HP0
500
1000
1500 B
b
a
c
a
Secr
eção
de
insu
lina
(pm
ol/il
hota
.90
min
)
0
50
100
150 A
b
a
b
a
CN CP HN HP0
500
1000
1500 B
b
a
c
a
Secr
eção
de
insu
lina
(pm
ol/il
hota
.90
min
)
40
Figura 2 – Secreção de insulina induzida por IBMX em ilhotas de ratas controle não prenhe
(CN), controle prenhe (CP), hipoprotéica não prenhe (HN) e hipoprotéica prenhe (HP) em
meio contendo 2,8 mmol/L de glicose. As colunas representam a secreção de insulina
(acumulada em 90 min) expressa em média EPM de 5-6 experimentos independentes.
Médias sem letras iguais diferem-se significativamente, P <0,05.
CN CN CP CP HN HN HP HP0
1000
2000
3000
IBMX (1 mmol/L) - + - + - + - +
d d ce
a
cd
b
cd
Secr
eção
de
insu
lina
(pm
ol/il
hota
.90
min
)
CN CN CP CP HN HN HP HP0
1000
2000
3000
IBMX (1 mmol/L) - + - + - + - +
d d ce
a
cd
b
cd
Secr
eção
de
insu
lina
(pm
ol/il
hota
.90
min
)
41
Figura 3 – Secreção de insulina estimulada por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) em
ilhotas de ratas controle não prenhe (CN), controle prenhe (CP), hipoprotéica não prenhe
(HN) e hipoprotéica prenhe (HP) em meio contendo 2,8 (A) e 8,3 (B) mmol/L de glicose. As
colunas representam a secreção de insulina (acumulada em 90 min) expressa em média
EPM de 5-7 experimentos independentes. Médias sem letras iguais diferem-se
significativamente, P <0,05.
0
250
500
750
1000 A
e
b
d
c
e
c
e
a
CN CN CP CP HN HN HP HP0
1000
2000
3000
4000
5000 B
PMA (100 nM) - + - + - + - +
f
b
e
c
a
ed
g
Secr
eção
de
insu
lina
(pm
ol/il
hota
.90
min
)
0
250
500
750
1000 A
e
b
d
c
e
c
e
a
0
250
500
750
1000 A
e
b
d
c
e
c
e
a
CN CN CP CP HN HN HP HP0
1000
2000
3000
4000
5000 B
PMA (100 nM) - + - + - + - +
f
b
e
c
a
ed
g
Secr
eção
de
insu
lina
(pm
ol/il
hota
.90
min
)
42
Figura 4 – Análise por Western blot da subunidade PKA (A) e da PKC (B) em ilhotas de
ratas controle não prenhe (CN), controle prenhe (CP), hipoprotéica não prenhe (HN) e
hipoprotéica prenhe (HP). As colunas estão em média EPM de 4 experimentos
independentes. Médias sem letras iguais diferem-se significativamente, P <0,05.
0
25000
50000
75000
100000
a
bb
a
PKA
0
25000
50000
75000
100000
a
bb
a
PKA
CN CP HN HP0
25000
50000
75000
Uni
dade
s ar
bitr
ária
s de
var
redu
ra
A
B
PKC
43
Figura 5 – Distribuição da proteína quinase A α (PKA) no pâncreas endócrino de ratas
controle não prenhes (a), controle prenhes (b), hipoprotéica não prenhe (c) e hipoprotéica
prenhe (d). A imunolocalização da PKA (a-d) e insulina (e-h) foi feita em pares de secções
seriadas do pâncreas de todos os grupos experimentais usando método padronizado biotina-
avidina-peroxidase. Note que a isoforma da PKA foi imunodetectada dentro de todas as
células endócrinas da ilhota, incluindo as células secretoras de insulina. Essas células
mostraram uma distribuição citoplasmática desta enzima que não foi modificada pela prenhez
e/ou restrição protéica. Bar = m.
44
6. ARTIGO EM INGLÊS
45
INSULIN SECRETION AND EXPRESSION OF PKA AND PKC IN ISLETS
FROM PREGNANT RATS FED A LOW PROTEIN DIET
Marciane Milanski1, Vanessa Cristina Arantes2, Fabiano Ferreira3, Marise Auxiliadora de
Barros Reis2, Everardo Magalhães Carneiro4, Antonio Carlos Boschero4, Carla Beatriz
Collares-Buzato5, Márcia Queiroz Latorraca2*
1Secretaria de Estado da Saúde, Mato Grosso, MT, Brazil; 2Departamento de Alimentos e
Nutrição, Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá,
MT, Brazil; 3Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE), Recife, PE, Brasil, 4Departamento de Fisiologia e Biofísica and
5Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.
* To whom correspondence should be addressed: Departamento de Alimentos e Nutrição,
Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), 78000-000, Cuiabá,
MT, Brazil. Phone: +55-65-615 8816; Fax: +55-65-615 8811; E-mail: [email protected]
Running title: PKA and PKC pathways in pregnant, malnourished rats
This work is part of a dissertation presented by Marciane Milanski as partial fulfillment of the
requirements for a Master’s degree in Health Science at the Faculdade de Ciências Médicas,
UFMT.
46
INTRODUCTION
Malnutrition and pregnancy are associated with functional changes in pancreatic islets.
A low protein diet impairs insulin secretion in response to glucose (1-3) as a consequence of
several alterations, including a smaller size and/or cell volume of -cells (4), an inappropriate
recognition of glucose as a stimulus because of low glucoreceptor expression and/or
decreased metabolism of glucose (5), a reduction of mitochondrial substrate oxidation caused
by impaired activity of the -cell mitochondrial glycerophosphate dehydrogenase, possibly
associated with other enzymatic anomalies (6), a diminished capacity of glucose to increase
the Ca2+ uptake and/or to reduce Ca2+ efflux from -cells (1,7), an alteration in the cAMP and
PLC pathways, and diminished amounts of PKC and PKA (2,3).
In contrast, the adaptation of islets to pregnancy involves increased glucose-stimulated
insulin secretion with a reduction in the threshold for stimulation (8). These adaptative
changes are controlled by lactogenic hormones (placental lactogen and/or prolactin) that
increase -cell proliferation and islet volume (9), insulin synthesis (10), and gap-junctional
coupling among -cells (11), enhance glucose metabolism, through greater GLUT2 expression
(12) and glucokinase activity (13) and increase the metabolism of cAMP and PLC (14,15).
The cAMP/PKA system enhances insulin secretion by increasing the phosphorylation
of ion channels in the membrane of -cells (16,17). This phosphorylation results in faster
membrane depolarization and increased Ca2+ influx through voltage-dependent channels that
elevates [Ca2+]i and enhances exocytosis. cAMP also increases insulin secretion by regulating
more distal steps of the secretory machinery (18). Enhanced adenylyl cyclase and PKA
activity have been observed in islets from pregnant rats (19,14,20) with a concomitant
reduction in the threshold for the stimulation of -cells for glucose (8).
47
The activation of PKC contributes to glucose-stimulated insulin secretion (21,22).
PKC is the most common PKC isoenzyme in pancreatic islet-cells (23,24), and is activated
when islets are stimulated by non-fuel secretagogues (25). The activation of PKC
contributes to glucose-stimulated insulin secretion (26), although this is still controversial.
In this study we investigated the effect of protein restriction on insulin secretion in
response to glucose, IBMX, forskolin and PMA, as well as PKA and PKC expression, in
rat pancreatic islets during pregnancy.
MATERIALS AND METHODS
Animals and diet: All of the animal experiments were approved by the institutional
Committee for Ethics Committee in Animal Experimentation (CEEA/IB-UNICAMP). Virgin
female Wistar rats (90 d old) were obtained from the university’s breeding colony. Mating
was done by housing males with females overnight, and pregnancy was confirmed by the
examination of vaginal smears for the presence of sperm. Pregnant females were separated at
random and maintained from the first until the 15th day of pregnancy on isocaloric diets
containing 6% (low protein diet) or 17% (control diet) protein. Four groups of rats were used
in this study: control non-pregnant (CN) and control pregnant (CP) groups, fed a control diet,
and low protein non-pregnant (LPN) and low protein pregnant (LPP) groups, fed a low
protein diet. During the experimental period, the rats had free access to food and water and
were housed on a 12 h light/dark cycle at 22ºC. At the end of this experimental period, the fed
rats were weighed and killed by decapitation. Blood samples were collected and allowed to
clot and the sera were stored at -20ºC for the subsequent measurement of insulin. The serum
glucose (27), serum albumin (28) and serum total protein (29) levels were determined
immediately after decapitation.
48
Islet isolation and insulin secretion: The pancreas was removed from rats and digested with
collagenase as described elsewhere (30). In the first series of experiments, groups of five
islets were incubated for 90 min at 37ºC in Krebs-bicarbonate buffer containing glucose (2.8
and 8.3mmol/L) and equilibrated with a mixture of 95% O2 - 5% CO2 to give a pH of 7.4. The
incubation medium contained (mmol/L): NaCl 115, KCl 5, CaCl2 2.56, MgCl2 1, NaHCO3 24
and bovine serum albumin (3 g/L). In the second series of experiments, the insulin secretion
was measured in response to: 1) glucose (2.8 mmol/L) in the absence and presence of IBMX
(1 mmol/L), 2) glucose (2.8 mmol/L) associated with increasing concentrations of forskolin
(0.01-100 mol/L), and 3) glucose (2.8 or 8.3 mmol/L) in the absence or presence of PMA
(100 nM). The insulin released was measured by radioimmunoassay using rat insulin as the
standard. The forskolin concentration producing a response that was 50% of the maximum
(EC50) was expressed as the mean negative logarithm (pD2).
Immunohistochemistry: Pancreata from all experimental groups were dissected, fixed in
10% formaldehyde (v/v, in 100 mmol/L phosphate-buffered saline) for at least 12 h and
embedded in paraffin. Pairs of serial sections (5 m) of paraffin-embedded tissue were picked
up on silane-treated glass slides, dewaxed, hydrated with 50 mmol/L Trizma-buffered saline
(TBS) and incubated for 30 min with undiluted hydrogen peroxide solution (Sigma, St. Louis,
MO) to block endogenous peroxidase. After a 1 h incubation with TBS containing 5% dry
skimmed milk and 0.1% Tween 20, each pair of sections was incubated overnight with
primary antibodies to PKA (Santa Cruz, CA) or insulin (Dako, Carpinteria, CA) (diluted
1:50 in TBS containing 3% dry skimmed milk). The tissue distribution of PKA was detected
using the rabbit biotin-avidin-peroxidase ImmunoCruz Staining System (Santa Cruz) whereas
for the insulin immunoreaction, the sections were incubated for 90 min with anti-guinea pig
IgG conjugated with peroxidase (diluted 1:1500 in TBS containing 1% dry skimmed milk)
49
and developed with 3,3´diaminobenzidine (DAB) (Sigma). All of the sections were
counterstained with Ehrlich´s hematoxylin and photographed using a digital camera
(CoolSNAP-Pro, Media Cybernetics) coupled to a Nikon Eclipse E800 microscope. The
negative controls for the immunoreaction were obtained by omitting the primary antibodies
from the incubation.
Western blotting: After isolation, groups of islets were pelleted by centrifugation (15,000 g)
and then resuspended in 50-100 L of homogenization buffer containing protease inhibitors
(31,32). The islets were sonicated and the total protein content was determined (33). Samples
containing 70 g of protein from each experimental group were incubated for 5 min at 80ºC
with 4X concentrated Laemmli sample buffer (1 mmol of sodium phosphate/L, pH 7.8, 0.1%
bromophenol blue, 50% glycerol, 10% SDS, 2% mercaptoethanol) (4:1, v/v) and run on 8%
polyacrylamide gels at 120 V for 30 min. Electrotransfer of proteins to nitrocellulose
membranes (Bio-Rad) was done for 1 h at 120 V in buffer containing methanol and SDS.
After checking the efficiency of transfer by staining with Ponceau S, the membranes were
blocked with 5% skimmed milk in TTBS (10 mmol of Tris/L, 150 mmol of NaCl/L, 0.5%
Tween 20) overnight at 4ºC. PKC and PKA were detected in the membranes after a 2 h
incubation at room temperature with anti-PKA rabbit polyclonal IgG and anti-cPKC
mouse monoclonal IgG (Santa Cruz; diluted 1:500 in TTBS containing 3% dry skimmed
milk). Detection was done using enhanced chemiluminescence (SuperSignal West Pico,
Pierce) after incubation with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody.
Statistical analysis: The results were expressed as the mean SEM for the number of rats (n)
indicated. For islets, n refers to the number of the experiments done. Bartlett’s test for the
homogeneity of variances was initially used to check the fit of the date to the assumptions for
50
parametric analysic of variance. To correct for variance heterogeneity or normality (34),
serum insulin and insulin secretion in response to glucose were log-transformed, and the EC50
were ln-transformed. The serum parameters, body weight, insulin secretion in response to
glucose (2.8 and 8.3 mmol/L), EC50 and expression of PKC and PKA were analyzed by
two-way analysis of variance (nutritional status and physiological status). The insulin
secretion stimulated by glucose (2.8 mmol/L) plus IBMX and glucose (2.8 or 8.3 mmol/L)
plus PMA was evaluated by three-way analysis of variance (nutritional status, physiological
status and absence or presence of IBMX or PMA). When necessary, these analyses were
complemented by the Tukey-HSD test to determine the significance of individual differences.
The level of significance was set at P< 0.05. The data were analyzed using the Statistic
Software package (Statsoft, Tulsa, OK).
RESULTS
1- Characteristics of the rats: Regardless the nutritional status, pregnant rats had a higher
body weight and lower serum glucose concentrations than non-pregnant rats. At the end of the
experimental period, serum total protein, albumin and insulin levels did not differ among the
groups (Table 1).
51
TABLE 1 - Final body weight and serum total protein, albumin, insulin and glucose levels of
control and low protein, pregnant and non-pregnant rats1
Groups
Control Low protein
Variables
Non-pregnant Pregnant Non-pregnant Pregnant
Body weight, g 258 8
(12)
290 7*
(13)
263 6
(11)
298 8*
(11)
Total protein , g/L 58 2
(8)
51 7
(8)
57 8
(8)
62 3
(7)
Albumin, g/L 32 0.5
(12)
32 0.4
(13)
32 0.8
(11)
33 1.0
(11)
Insulin, nmol/L 0.15 0.02
(12)
0.16 0.03
(13)
0.13 0.01
(11)
0.15 0.02
(11)
Glucose, mmol/L 9.9 0.6
(12)
7.5 0.9*
(12)
8.7 0.8
(10)
7.0 0.3*
(11)
1 Values are means SEM of the number of rats shown in parentheses * Different from Non-pregnant, P < 0.05
2- Insulin secretion: The insulin secretion at a low concentration of glucose (2.8 mmol/L)
was significantly higher for islets from CP and LPP rats when compared with their respective
CN and LPN control groups (Fig. 1A). With high glucose (8.3 mmol/L), the insulin secretion
by LPN islets was lower than for CN islets ( P< 0.05). Pregnancy increased the secretory
response in both nutritional groups. Thus, LPP and CP islets had a similar insulin secretion
(Fig. 1B).
At non-stimulatory concentrations of glucose (2.8 mml/L) IBMX did not alter the
insulin secretion by CN islets, but significantly increased the insulin release by LPN islets (
52
P< 0.05). In islets from pregnant rats, the potentiation of insulin secretion by IBMX was
lower in the LPP group than in the CP group (Fig. 2).
At all forskolin concentrations (0.01-100 mol/L), the insulin secretion by islets from
the low protein groups was lower than in the control groups, regardless of the physiological
status. In islets from LPN and LPP rats, the increase in insulin secretion, even at high
concentrations of forskolin, was only marginal. In islets from CN rats, a significant increase in
insulin secretion was seen only at higher concentrations of forskolin (1-100 mol/L) whereas
in CP islets forskolin increased insulin secretion only at 0.1 mol/L. The half-maximal release
concentration of forskolin was significantly affected by nutritional (F (1,12)= 71.96, p= 0.000)
and physiological (F(1,12)= 465.35, p= 0.000) status, as well as by the interaction between both
statuses (F(1,12)= 25.54, p= 0.000). Thus, pregnancy reduced the EC50 value in the control and
low protein groups. However, the EC50 for the LPP group was higher than for the CP group
(LPP= 0.026 0.004 mol/L, n= 4; LPN= 0.461 0.210 mol/L, n= 4; CP= 0.002 0.001
mol/L, n= 4; CN= 0.240 0.022 mol/L, n= 4) (data not shown).
Fig. 3A and B show that, at 2.8 and 8.3 mmol glucose/L, PMA increased the insulin
secretion more markedly in islets from LPP rats compared with CP islets. At 2.8 mmol
glucose/L (Fig. 3A), insulin secretion induced by PMA was 4.3-fold and 8-fold higher in
islets from the LPN and LPP groups compared to the respective controls (LPN and, LPP
without PMA). In CN islets, PMA increased the insulin secretion by 6.3-fold, and by 4.2-fold
in CP islets ( P< 0.05). At 8.3 mmol glucose/L, (Fig. 3B) the increase in insulin secretion
provoked by PMA in LPN and CN islets was 4.7-fold and 6.5-fold, respectively( P< 0.05). In
LPP and CP islets, the increase was 5.4-fold and 3.6-fold relative to the respective controls
(no PMA) ( P< 0.05).
The PKA expression in islets from rats fed a low protein diet (LPN and LPP) was
33% lower than in control rats (CN and CP). A significant effect of nutritional (F(1,12)= 13.36,
53
p= 0.003) but not of physiological (F(1,12)= 0.03, p= 0.856) status was observed. However,
there was no interaction between these statuses (F(1,12)= 0.84, p= 0.377) (Fig. 4A). There was
no difference in the PKC content of islets from any of the groups of rats was not different
(Fig. 4B), and hence, no significant effect of nutritional (F(1,14)= 3.93, p=0.067) and
physiological (F(1,14)= 1.33, p=0.269) status, or any interaction between them (F(1,14)= 3.83, p=
0.070).
Immunohistochemistry revealed a greater expression of PKA in islet cells than in the
exocrine parenchyma; this enzyme was also detected in ductal cells and nerves (data not
shown). Dual immunostaining for PKA and insulin in serial pancreatic sections showed that
this kinase was expressed by -cells and non--cells. The cytoplasmic distribution of PKA
in islet cells was not modified by pregnancy and/or protein deprivation (Fig. 5).
DISCUSSION
Weight loss and hypoalbuminemia are frequently seen in rodents fed a low protein diet
for a long time (35). After the short period on a low protein diet (15 days) used here, these
classic alterations were not yet present, but there was a significant alteration in the capacity of
the islets to secrete insulin in response to glucose. When islets from LPN rats were challenged
with a physiological concentration of glucose (8.3 mmol/L), the insulin secretion was lower
than for CN islets.
During pregnancy, insulin production and the sensitivity of the endocrine pancreas to
glucose increase to allow an appropriate response to increased peripheral resistance to insulin
(36,37). These observations were confirmed here by comparing the insulin secretion of islets
from the CP and CN groups at both concentrations of glucose. In low protein rats, pregnancy
improved the responsiveness of -cells to a physiological concentration of glucose (Fig.1A
54
and B). Changes in the glucokinase, hexokinase and GLUT2 levels, as well as in glucose
metabolism, are central to the adaptative process in pregnancy (13), and it is well accepted
that placental lactogens play a crucial role in this process.
Since the generation of cAMP is important for reducing the glucose stimulatory
threshold of -cells (8), we examined the insulin secretory response to 2.8 mmol glucose/L in
the presence of IBMX, a phosphodiesterase inhibitor, and in the presence of increasing
concentrations of forskolin, an activator of adenylyl cyclase, that increases the intracellular
levels of cAMP levels in -cells. IBMX induced a less potent secretory response in LP than in
CP islets. In addition, the EC50 showed that the potency of forskolin was significantly reduced
in islets from rats fed a low protein diet compared to these fed a normal diet. Pregnancy
decreased the EC50 in both nutritional status, but to a lower degree in protein-deprived rats
than in control rats.
In the absence of glucose or at low concentrations of this sugar, an increase in cAMP
content has little if any effect on insulin secretion (16). In normal rats, cAMP increases the
insulin only above the threshold for glucose (around 5.6 mmol/L), this is also the threshold for
the stimulation of cAMP metabolism in islet -cells (38). In islets from pregnant rats, as well
as in prolactin-treated islets, the threshold for glucose-stimulated insulin secretion is reduced
to approximately 3 mmol/L (8). This phenomenon could explain the higher sensitivity of CP
islets to lower concentrations of forskolin compared to CN islets (0.01 vs. 1.0 mol/L).
Forskolin practically failed to stimulate secretion in islets from protein-restricted rats,
regardless of the physiological status, hence indicating that the cAMP/PKA system in islets
from these rats is inoperative or is severely attenuated. A reduced generation of cAMP by low
protein islets may be a consequence of a lower rate of glucose metabolism and the generation
of coupling factors, with a subsequent reduction in the intracellular Ca2+ concentration and in
the levels of the Ca2+-calmodulin complex that ultimately stimulates adenylyl cyclase (39,40).
55
The reduced response to IBMX and forskolin by protein-deprived islets could indicate
a decrease in the amount of the -catalytic subunit of PKA, the major mediator of the cAMP
signal transduction pathway. Since a low protein diet reduces PKA expression in rat islets
(3), we examined the participation of this kinase in the control of insulin secretion by islets
from protein-deprived rats that were or were not pregnant. The PKA isoform was detected in
all endocrine cells of the islets, including the -cells. The cytoplasmic distribution of this
enzyme in -cells was not modified by pregnancy and/or protein deprivation. However,
immunoblotting showed that the PKA expression was significantly lower in islets from low
protein rats compared to the control rats, regardless of the physiological status.
There are two possible explanations for the decrease in PKA levels in islets from rats
fed a low protein diet. First, diet could directly affect the expression of several genes and their
encoded proteins, including key enzymes involved in the secretory process. Second, a low
protein diet could influence the neuronal-endocrine axis (41) and alter the regulation of the
expression of PKA by different hormones (42,43). Thus, the reduced insulin secretion in
response to IBMX and forskolin seen in islets from protein-restricted rats may result from a
reduced production of cAMP secondary to a diminished rate of glucose metabolism and a
decrease in PKA levels.
A low protein diet also reduces the expression of PKC in pancreatic islets (2) and its
activity in several tissues (44). However, as shown here, protein deprivation for a short period
of time failed to alter PKC expression. Indeed, islets from pregnant protein-deprived rats
secreted proportionally more insulin in response to PMA than did control islets. Since the
activation of PKC is involved in insulin secretion by rat islets in response to high
concentrations of glucose (22), and since pregnancy activates the PLC/PKC pathway in the
pancreas (45,46), the increased insulin secretion by islets from pregnant low protein rats in
56
relation to control pregnant rats in presence of PMA may have occurred at the expense of
increased PKC activity.
In conclusion, our results indicate that the response of islets from low protein rats during the
pregnancy is similar to the control rats, at least in physiologic glucose concentration.
However, the lower response to the IBMX and forskolin indicates decrease production and/or
sensibility of cAMP, associated with a decrease in PKA expression and probability, their
activity.
Acknowledgments: The authors thank L.D. Teixeira, C.R. Afonso and M.B. Leonardo for
technical assistance, and S. Hyslop for editing the English.
57
Figure 1 – Glucose stimulation of insulin secretion by islets from control non- pregnant (CN),
control pregnant (CP), low protein non-pregnant (LPN) and low protein pregnant (LPP) rats.
Groups of five islets were incubated for 90 min in Krebs-bicarbonate medium containing 2.8
(A) and 8.3 (B) mmol/L of glucose. The columns represent the cumulative 90 min insulin
secretion and are the mean SEM of 5-9 independent experiments. Means without a common
letter differ, P <0.05.
0
50
100
150 A
b
a
b
a
CN CP LPN LPP0
500
1000
1500 B
b
a
c
a
Insu
lin s
ecre
tion
(pm
ol/is
let.9
0 m
in)
58
Figure 2 – IBMX-induced insulin secretion by islets from control non-pregnant (CN), control
pregnant (CP), low protein non-pregnant (LPN) and low protein pregnant (LPP) rats in
medium content 2.8 mmol glucose/L. The columns represent the cumulative 90 min insulin
secretion and are the mean SEM of 5-6 independent experiments. Means without a common
letter differ, P <0.05
CN CN CP CP LPN LPN LPP LPP 0
1000
2000
3000
IBMX (1 mmol/L) - + - + - + - +
d d c e
a
cd
b
cd Insu
lin s
ecre
tion
(pm
ol/is
let.9
0 m
in)
59
Figura 3 – Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) stimulation of insulin secretion in islets
from control non-pregnant (CN), control pregnant (CP), low protein non- pregnant (LPN) and
low protein pregnant (LPP) rats in medium containing 2.8 (A) and 8.3 (B) mmol glucose/L.
The columns represent the cumulative 90 min insulin secretion and are the mean SEM of 5–
7 independent experiments. Means without a common letter differ, P <0.05
0
250
500
750
1000 A
e
b
d
c
e
c
e
a
CN CN CP
CP LPN LPN LPP LPP 0
1000
2000
3000
4000
5000 B
PMA (100 nM) - + - + - + - +
f
b
e
c
a
e d
g
Insu
lin s
ecre
tion
(pm
ol/is
let.9
0 m
in)
60
Figure 4 - Western blot analysis of PKA subunit (A) and PKC content (B) in islets from
control non-pregnant (CN), control pregnant (CP), low protein non-pregnant (LPN) and low
protein pregnant (LPP) rats. The columns are the mean SEM of 4 independent experiments.
Means without a common letter differ, P <0.05
0
25000
50000
75000
100000
a
bb
a
PKA
CN CP LPN LPP0
25000
50000
75000
Arb
itrar
ysc
anni
ngun
its
A
B
PKC
0
25000
50000
75000
100000
a
bb
a
PKA
0
25000
50000
75000
100000
a
bb
a
PKA
CN CP LPN LPP0
25000
50000
75000
Arb
itrar
ysc
anni
ngun
its
A
B
PKC
61
Figure 5 – Protein kinase A α (PKA) distribution in endocrine pancreas of control non-
pregnant (a), control pregnant (b), low protein non-pregnant (c) and low protein pregnant (d)
rats. Immunolocalization of PKA (a-d) and insulin (e-h) was done in pairs of serial sections
of pancreas of all experimental groups using a standard biotin-avidin-peroxidase method.
Note that the PKA isoform was immunodetected within all endocrine cells of the islets,
including the insulin-secreting -cells. These cells showed a cytoplasmic distribution of this
enzyme was not modified by pregnancy and/or protein deprivation. Bar = m.
62
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