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MARCELO FRANCISCO POMPELLI
RESPOSTAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS DE PLANTAS DE CAFÉ CULTIVADAS EM DIFERENTES NÍVEIS DE NITROGÊNIO E
IRRADIÂNCIA
Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, para obtenção do título de Doctor Scientiae
VIÇOSA MINAS GERAIS – BRASIL
2008
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MARCELO FRANCISCO POMPELLI
RESPOSTAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS DE PLANTAS DE CAFÉ CULTIVADAS EM DIFERENTES NÍVEIS DE NITROGÊNIO E
IRRADIÂNCIA
Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, para obtenção do título de Doctor Scientiae
APROVADA: 27 de fevereiro de 2008
_______________________________
Profa. Marília Contin Ventrella
(Co-Orientadora)
_______________________________
Prof. Cláudio Pagotto Ronchi
_______________________________
Prof. Hugo Alves Pinheiro
_______________________________
Dr. Rogério Ferreira Ribas
____________________________
Prof. Fábio Murilo DaMatta
(Orientador)
ii
DEDICO
Aos meus pais, pelo dom da vida,
A minha esposa Gilmara pela maravilhosa companhia,
A minha irmã Neide por tudo e sempre...
OFEREÇO
Ao meu irmão Nelson Pompelli “in memorian”, que de onde estiver,
tenho certeza, roga pelo sucesso de seus entes queridos...
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, porque sem sua presença na minha vida, nada teria sentido, sem seu
amor e compreensão como pai, me sentiria só neste mundo.
À Universidade Federal de Viçosa (UFV) e ao Departamento de Biologia
Vegetal, pela oportunidade de realização deste curso.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela concessão da bolsa de estudos e à Fapemig pelo financiamento do projeto original.
Aos meus pais, pois sem seu amor e apoio incondicional, não estaria aqui.
Obrigado mãe, por teu amor e sacrifício em toda minha vida e pelo incentivo prestado
na superação em mais esta conquista. Obrigado pai pela sua companhia.
À minha querida esposa Gilmara, que foi mais que uma companheira, foi
amiga, conselheira, leal; adjetivos fundamentais que fazem dela uma pessoa inigualável.
Obrigado por você existir na minha vida; sem você, com certeza, não teria concluído
esta árdua tarefa.
Ao professor Fábio Murilo DaMatta, que, desde o início, me ajudou com
orientação profissional, formação e aprendizagem nesta importante etapa. Obrigado pela
sua dedicação e apoio durante o desenvolvimento deste trabalho.
À professora Marília Contin Ventrella, que dedicou muitas horas na co-
orientação. Muitas foram as dificuldades, muitas foram as superações. Obrigado pela
sua amizade, cumplicidade, paciência e correspondência nos momentos de aflição.
Aos professores da Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, Raimundo Santos
Barros, Marco Aurélio Pedron e Silva e Marcelo Ehlers Loureiro. Obrigado pelos
ensinamentos. Agradecimento especial ao professor Raimundo Santos Barros, que atuou
na co-orientação deste trabalho e não mediu esforços para juntos chegarmos ao êxito na
pesquisa.
Aos professores Hugo Alves Pinheiro e Cláudio Pagotto Ronchi e ao
Dr. Rogério Ferreira Ribas. Em especial aos professores Hugo A. Pinheiro e Cláudio
iv
P. Ronchi, que se deslocaram de suas Universidades para participação da defesa desta
tese.
Aos amigos Werner C. Antunes, Paulo C. Cavatte e Agnaldo R.M. Chaves
pelos constantes apoios metodológicos e estatísticos. Agradecimento especial ao amigo
Werner, pela parceria em um dos capítulos desta tese, fruto que nos rendeu um artigo
aceito para publicação em Annals of Applied Biology. Obrigado pela incondicional
ajuda de todos vocês.
À amiga Elaine Cristina Cabrini, pela amizade e pelos inúmeros auxílios no
laboratório; tenho fé na sua boa índole. Obrigado por tudo.
Aos colegas do grupo café (Gustavo, Diego, Carla Quinhones, Ângela Ten
Caten, Fábio Santos e Karine), pelo apoio na realização deste trabalho. Agradecimento
especial à Carla Quinhones, pelo auxílio incondicional no dia-a-dia do laboratório e pela
forte amizade.
Aos bolsistas do grupo café (Samuel, Ricardo, Elaine Celin e Fábio), sem
vocês essa etapa teria, com certeza, sido muito mais árdua. Agradecimento especial ao
amigo Samuel, cuja dedicação transpassou os limites do laboratório.
Aos funcionários Carlos Raimundo, Geraldo (Marreco), Mercês, Oswaldo,
Reginaldo, Zé Antônio e Zé Maria, pela amizade e apoio.
A todos que, de uma forma ou de outra, colaboraram para o êxito deste
trabalho, meu eterno agradecimento.
"Agradecer é admitir que houve momentos em que se precisou de alguém; é reconhecer
que o homem jamais poderá lograr para si o dom de ser auto-suficiente. Ninguém
cresce sozinho; sempre é preciso um olhar de apoio, uma palavra de incentivo, um
gesto de compreensão, uma atitude e amor. A todos vocês que compartilharam os
v
meus ideais, dedico essa vitória, com a mais profunda gratidão e respeito!"
vi
BIOGRAFIA
MARCELO FRANCISCO POMPELLI, filho de Lourdes Maria Pompelli e Domingos
Pompelli, nasceu em Chapecó (SC), em 23 de agosto de 1974. Entre 1993 e 1997 cursou
graduação em Ciências Biológicas (Licenciatura e Bacharelado) na Universidade do
Oeste de Santa Catarina. Entre 1999 e 2002 cursou Mestrado em Biotecnologia Vegetal,
Agrícola e Florestal, na Universidade Federal de Santa Catarina, defendendo a
dissertação intitulada "Morfogênese in vitro, Métodos de Micropropagação e
Conservação de Germoplasma de Dyckia distachya Hassler”; que lhe rendeu sete
artigos publicados em revistas nacionais e internacionais, além de comunicações em
congressos. No ano de 2003, cursou Pós-Graduação em nível de Extensão Universitária
em Educação à Distância, na Universidade Metodista de São Paulo. Entre de 2002 e
2004, atuou como professor titular das disciplinas de Fisiologia Vegetal e Botânica de
Fanerógamas, na Universidade do Oeste de Santa Catarina, na qual publicou, em 2002,
um livro sobre Sistemática de Fanerógamas. Em março de 2004, ingressou no
Doutorado em Fisiologia Vegetal, na Universidade Federal de Viçosa, MG. Em
fevereiro de 2008 foi aprovado, como pesquisador nível C, para desenvolver o projeto
intitulado “Inovações tecnológicas para o semi-árido nordestino: fenologia, clonagem,
capacidade de resistência à seca, salinidade e assimilação do nitrogênio em pinhão-
manso (Jatropha curcas L.)”, na Universidade Federal de Alagoas.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS .......................................................... viii
RESUMO ................................................................................................................... xii
ABSTRACT ............................................................................................................... xv
I. Introdução Geral ..................................................................................................... 01
1.1. Literatura citada ............................................................................................. 04
II. Capítulo I: Respostas alométricas e morfologia foliar em café cultivado sob diferentes níveis de irradiância e de nitrogênio ............................... 07
2.1. Introdução ...................................................................................................... 07
2.2. Materiais & Métodos ..................................................................................... 09
2.2.1. Material vegetal e condições de cultivo ............................................ 09
2.2.2. Avaliações alométricas ...................................................................... 10
2.2.3. Avaliações anatômicas ...................................................................... 10
2.2.4. Nitrogênio total .................................................................................. 11
2.2.5. Procedimentos estatísticos ................................................................. 11
2.3. Resultados e Discussão ................................................................................. 12
2.3.1. Avaliações alométricas ...................................................................... 12
2.3.2. Avaliações anatômicas ...................................................................... 14
2.5. Literatura citada ............................................................................................. 19
III. Capítulo II: Fotossíntese, metabolismo antioxidativo e fotoproteção em plantas de Coffea arabica L. avaliadas no inverno e submetidas a diferentes níveis de irradiância e nitrogênio .................................... 23
3.1. Introdução ...................................................................................................... 23
3.2. Material & Métodos ...................................................................................... 25
3.2.1. Desenho experimental ....................................................................... 25
3.2.2. Parâmetros agrometereológicos ........................................................ 25
3.2.3. Área foliar específica ......................................................................... 26
3.2.4. Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência .................................. 26
3.2.5. Ensaios bioquímicos .......................................................................... 27
viii
3.2.5.1. Clorofilas e carotenóides .................................................... 27
3.2.5.2. Açúcares solúveis, amido e aminoácidos ........................... 28
3.2.5.3. Nitrogênio total ................................................................... 28
3.2.5.4. Fluxo metabólico ................................................................ 28
3.2.5.5. Atividade da sintetase da glutamina .................................... 28
3.2.5.6. Enzimas do metabolismo antioxidativo .............................. 29
3.2.5.7. Proteínas solúveis totais ..................................................... 29
3.2.6. Danos celulares .................................................................................. 29
3.2.7. Procedimentos estatísticos ................................................................. 30
3.3. Resultados e Discussão ................................................................................. 30
3.3.1. Ambiente, características foliares e metabolismo do nitrogênio ....... 30
3.3.2. Trocas gasosas e metabolismo do carbono ........................................ 32
3.3.3. Fluorescência, fotoproteção e metabolismo antioxidativo ................ 35
3.4. Síntese dos principais resultados e conclusões .............................................. 45
3.5. Literatura citada ............................................................................................. 46
IV. Chapter III: Allometric models for non-destructive leaf area estimation in coffee (Coffea arabica and C. canephora) ...................................... 51
4.1. Abstract ......................................................................................................... 51
4.2. Introduction ................................................................................................... 52
4.3. Materials and Methods .................................................................................. 53
4.4. Results ........................................................................................................... 54
4.5. Discussion ..................................................................................................... 56
4.6. Acknowledgements ....................................................................................... 57
4.7. References ..................................................................................................... 58
5. Conclusões gerais ................................................................................................... 69
Apêndice I .................................................................................................................. 71
ix
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
A = anteraxantina
A = taxa de assimilação líquida de carbono
AC = área das células epidérmicas ordinárias
AE = área estomática
AF = área foliar total
AFE = área foliar específica
APX = peroxidase do ascorbato
CAT = catalase
CE = área do complexo estomático
CHL = clorofila
Ci/Ca = razão entre as concentrações interna e ambiente de CO2
D = fração da energia dissipada termicamente
DC = densidade das células epidérmicas ordinárias
DE = densidade estomática
DEPS = estado de epoxidação dos carotenóides do ciclo das xantofilas
DP = diâmetro polar do estômato (comprimento)
EM = espessura foliar
EP = erro-padrão da média
EROs = espécies reativas de oxigênio
F0 = fluorescência inicial
FAA50 = formalina, ácido acético glacial, álcool 50% (5:5:90; v/v)
Fm = fluorescência máxima emitida
Fm’ = fluorescência máxima sob luz
Fs = fluorescência em steady-state
FS = fotossistema
Fv/Fm = eficiência fotoquímica máxima do FSII
GR = redutase da glutationa
gs = condutância estomática
GS = sintetase da glutamina
IE = índice estomático
LE = diâmetro equatorial do estômato (largura)
MDA = aldeído malônico
x
MF = massa fresca
N = nitrogênio
P = fração da energia absorvida utilizada na fase fotoquímica da fotossíntese
PA = biomassa da parte aérea
PE = fração da energia absorvida não utilizada na fotoquímica nem dissipada
termicamente
RFA = radiação fotossinteticamente ativa
Rubisco = carboxilase/oxigenase da ribulose-1,5-bisfosfato
SOD = dismutase do superóxido
SR = biomassa do sistema radicular
V = violaxantina
Z = zeaxantina
e = déficit de pressão de vapor entre o interior da folha e a atmosfera
FSII = rendimento quântico do transporte de elétrons
GT = -glutamil hidroxamato
xi
RESUMO
POMPELLI, Marcelo Francisco, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de 2008. Respostas anatômicas e fisiológicas de plantas de café cultivadas em diferentes níveis de nitrogênio e irradiância. Orientador: Fábio Murilo DaMatta. Co-Orientadores: Marcelo Ehlers Loureiro e Marília Contin Ventrella.
Dois experimentos foram conduzidos separadamente e analisados como tal, a
fim de investigarem-se os efeitos da irradiância e da nutrição diferencial de nitrogênio
sobre (i) as respostas alométricas e morfológicas e (ii) os mecanismos de fotoproteção
em plantas de café, sob condições de inverno. Procurou-se, ainda, avaliar os atuais
modelos alométricos usados para a estimativa da área foliar do cafeeiro e propor um
novo modelo usando medições não-destrutivas do limbo foliar nas duas espécies de
cafeeiros mais cultivados no mundo (Coffea arabica e C. canephora). No primeiro
experimento, plantas de C. arabica cv Catuaí Vermelho IAC 44 foram cultivadas em
vasos de 12 L, a pleno sol ou sob redução de 50% da irradiância; para cada tratamento
de luz, três níveis de nitrogênio (0, 16 e 23 mM, respectivamente níveis deficiente,
adequado e em excesso) foram aplicados. A deficiência de N causou uma redução
marcante no acúmulo de biomassa, independentemente do ambiente lumínico. Em todo
o caso, as mudas cultivadas a pleno sol acumularam mais biomassa que as plantas
sombreadas, um forte indício de que as taxas fotossintéticas líquidas foram maiores nas
primeiras. A disponibilidade de luz, mas não de nitrogênio, promoveu alterações na
morfologia da epiderme: um aumento da expansão foliar, nas plantas sombreadas,
resultou em diminuição da densidade estomática de forma mais expressiva que a
redução o
xii
limitações difusivas. As plantas sombreadas exibiram taxas fotossintéticas
significativamente maiores em relação às das plantas cultivadas a pleno sol. Em
contraste, a capacidade fotossintética potencial foi maior nas últimas, bem como nas
plantas +N. Isso sugere que os efeitos positivos da nutrição nitrogenada sobre a
fotossíntese, in situ, pode ter sido aparentemente atenuados pelas resistências difusivas
impostas, presumivelmente, pelas baixas temperaturas noturnas. As plantas –N
apresentaram menor concentração de clorofilas, especialmente nas plantas cultivadas a
pleno sol. Nessas plantas, uma menor concentração de carotenóides, em base de massa,
e a menor atividade da peroxidase do ascorbato foram circunstancialmente associadas
ao acúmulo de H2O2, que pode ter acarretado danos às membranas cloroplastídicas. Por
outro lado, as plantas +N apresentaram maiores concentrações de clorofilas e
carotenóides, fato que possivelmente contribuiu para a elevação da fração da energia
luminosa usada na fotoquímica e uma diminuição da fração dissipada termicamente,
particularmente nas plantas cultivadas à sombra. Nas plantas cultivadas a pleno sol, a
atividade da catalase e da sintetase da glutamina (em decorrência da fotoinibição), são
evidências circunstanciais de maior atividade fotorrespiratória das plantas cultivadas a
pleno sol. Em todo o caso, a aclimatação da maquinaria fotossintética a condições de
pleno sol foi fortemente dependente da disponibilidade de nitrogênio. No terceiro
experimento, mostrou-se que as atuais metodologias de estimação da área foliar do
cafeeiro, em geral, levam a uma subestimação da área foliar real. Desenvolveu-se um
modelo potencial (Y = ß0Xß1), baseado nas duas dimensões do limbo [Área foliar =
0,6626 x (Comprimento x Largura)1,0116]; R2 = 0,996) com alta precisão
acurácia,dispersão normal dos resíduos e ausência de viés, independentemente da
cultivar, do tamanho e da forma da folha . O comprimento apenas (nas não a largura)
pode ser utilizado, com boa acurácia, para a predição da área foliar, porém às expensas
de uma ligeira perda de precisão, principalmente nas folhas com razão
comprimento/largura menor que 2,0 ou maior que 3,0 (8% das folhas amostradas).
xiii
ABSTRACT
POMPELLI, Marcelo Francisco, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, February 2008. Anatomical and physiological responses of coffee plants grown under different levels of nitrogen and irradiance. Adviser: Fábio Murilo DaMatta. Co-Advisers: Marcelo Ehlers Loureiro and Marília Contin Ventrella.
Two experiments were carried out and analysed separately in order to investigate
the effects of irradiance and nitrogen supply on (i) the allometric and morphological
responses and (ii) photoprotection mechanisms in coffee plants under winter conditions.
In addition, the currently used allometric models for estimating the area of a coffee leaf
was examined, and a new, reliable and accurate model using non-destructive
measurements of leaf dimensions for the two coffee (Coffea arabica and C. canephora)
species economically important worldwide was developed. In the first experiment,
plants of C. arabica cv Catuaí Vermelho IAC 44 were grown in 12L-pots either at full
exposure or under 50% full sunlight; for each light treatment, three nitrogen levels (0,
16, and 23 mM, which were considered as deficient, adequate, and excessive levels,
respectively) were applied. Nitrogen deficiency caused a remarkable reduction in
biomass accumulation, independently of irradiance treatments. In any case, the
seedlings grown at full exposure accumulated more biomass than the shaded
individuals, indicating that photosynthetic rates were higher in the former. Availability
of light, but not of nitrogen, led to changes in epidermis morphology: an increase of leaf
expansion in shaded plants resulted in decreased stomatal density, which was stronger
than the reduction found in stomatal index. Such changes were apparently independent
on variations in stomatal dimensions, but dependent on alterations in the mean area of
epidermal cells. In the second experiment, plants were grown as in the first experiment,
with the exception that only two nitrogen levels (0 and 23 mM) were applied. The low
night temperatures combined with high irradiances, especially in plants grown at full
exposure, significantly impaired the rate of net carbon assimilation due mainly to
diffusive limitations. Shaded plants showed greater in situ photosynthetic rates than
sun-grown plants. In contrast, the potential photosynthetic capacity was larger in the
xiv
latter, as well as in +N plants than in –N plants. This suggests that the positive effects of
nitrogen nutrition upon in situ photosynthesis should have been masked by the
remarkable diffusive resistances presumably imposed by the low night temperatures.
The –N plants had the lowest concentrations of chlorophylls, especially in sun-grown
plants. In these plants, the smaller concentration of carotenoids on a fresh weight basis
and the lower activity of ascorbate peroxidase were circumstantially linked to increased
H2O2 levels, which may have caused damage to chloroplast membranes. On the other
hand, the +N plants showed higher concentrations of chlorophylls and carotenoids,
which possibly brought about an increase of the light fraction used in photochemistry
and a decrease of the light fraction dissipated thermally, particularly under shade
conditions. In sun-grown plants, activities of catalase and glutamine synthase increased
(despite the occurrence of photoinhibition), which circumstantially evidence higher
photorespiration rates in plants grown in the open. In any case, the acclimation of the
photosynthetic machinery under full sunlight was strongly dependent on the nitrogen
availability. In the third experiment, it was shown that the current main non-destructive
methodologies for estimating the area of coffee leaves underestimate the true leaf area.
A power model (Y = ß0Xß1) based on two leaf dimensions [Leaf area = 0.6626(Length x
Width)1.0116; R2 = 0.996] with high precision and accuracy, random dispersion pattern of
residuals and also unbiased, irrespective of cultivar and leaf size and shape, was
developed. Even when the length (but not width) alone was used as the single leaf
dimension, the power model developed still predicted with good accuracy the leaf area,
but at the expense of some loss of precision, as particularly found for 8% of the leaves
sampled with length-to-width ratios below 2.0 or above 3.0.
1
I. INTRODUÇÃO GERAL
Das 103 espécies descritas de Coffea (Davies et al. 2006), apenas duas,
C. arabica L. e C. canephora Pierre ex Froehner têm importância econômica no
mercado internacional, recebendo seus produtos comercializados a denominação
genérica de “café arábica” e “café robusta”, respectivamente. O café, depois do
petróleo, é considerado a principal mercadoria no mundo. Seu mercado gera,
anualmente, mais de 90 bilhões de dólares. Cerca de 8% da população mundial, i.e., 500
milhões de pessoas, estão envolvidas no mercado do café, desde o plantio até o
consumo final. Atualmente, cerca de 63% da produção mundial de café deriva-se de
café arábica e os 37% restantes, de café robusta. O Brasil, desde o século XIX, vem-se
destacando como o maior produtor mundial de café, seguido pela Colômbia e Vietnam
(DaMatta & Ramalho 2006).
Originário das florestas tropicais da África, onde é encontrado em estado
espontâneo como vegetação de sub-bosque, desenvolvendo-se, portanto,
permanentemente sob sombra, o cafeeiro expandiu-se e adaptou-se às mais variadas
condições ecológicas da faixa tropical. No Brasil, atualmente, os cafezais vêm sendo
conduzidos quase exclusivamente a pleno sol, enquanto em muitos países da América
Central, por exemplo, a espécie é mais freqüentemente cultivada em sistemas
arborizados. Não obstante, cafeeiros cultivados a pleno sol produzem satisfatoriamente
e, na maioria dos casos, mais que os plantios à sombra. Como conseqüência, o
sombreamento, como prática cultural regular, foi abandonado em várias regiões do
mundo, como no Brasil e no Quênia (Malavolta 2000). Entretanto, tem-se observado
interesse crescente na reimplantação do sombreamento em cafezais, particularmente
porque essa prática está associada à conservação de recursos do ambiente e por permitir
menor uso de insumos para uma produção sustentável de café (DaMatta & Rena 2002).
Apesar de a grande maioria dos trabalhos indicar que o cafeeiro exibe folhas
com características típicas de sombra, sua taxa de assimilação líquida de carbono (A)
pode ser maior a pleno sol que à sombra, desde que a abertura estomática não seja
limitante (DaMatta & Rena 2002). Na maioria dos trabalhos em que se observa maior A
à sombra que a pleno sol, menor condutância estomática (gs) para folhas expostas
2
parece explicar, em parte, essas observações (Freitas et al. 2003; Kumar & Tieszen
1980). Ressalte-se, todavia, que, pelo menos no Brasil, as cultivares atualmente
plantadas foram selecionadas em ensaios de competição quase sempre conduzidos a
pleno sol e, portanto, podem, potencialmente, apresentar adaptações a altas irradiâncias
em extensão superior àquelas selecionadas para ambientes sombreados (DaMatta 2004).
Com efeito, observa-se freqüentemente em cafeeiros a pleno sol, por exemplo, redução
da área foliar específica (AFE), cloroplastos com menos grana e menos tilacóides por
granum (Fahl et al. 1994), alta razão clorofila a/b e reversão da fotoinibição
relativa89 Tm(a)Tj0.09765 0 09 Tm(a)Tj0.09765 0 0 -0.09765 3060.09765 0 0 -0.09765 3274 -0.09765n0 -0.09765 2810 3199 Tm(a)T80.09765 0 0 -0.09765 2230 3889 Tm(i8Tj0-0.09765 3060 0 -0.09765 3034 3199 Tm(e)0 0 -0.09765r0 -0.09765 3091 2854 Tm(s)Tj0.09765 0á0 -0.09765 3186 3544 Tm(e)TTm(a)Tj0. 0 -0.09765 3204 2509 Tm(e)TTm(a)Tj0. 0 -0.09765 3656 3199 Tm(c3Tj0.09765 0d0 -0.09765 3447 1819 Tm(l)T10.09765 0 0 -0 Tf0.09765 0 0 -0.09765 1874 3889 Tm(3)Tj0.09765 00 0 -0.09765 3968 3199 Tm(A66j0.09765 0D0 -0.09765 3808 2854 Tm(f)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2475 3889 Tm(38Tj0.09765 0M0 -0.09765 4002 3544 Tm(9)Tj0.09765 0 0 -0.09765 4158 2509 Tm(s)630.09765 0 0 -0.09765 2230 3889 Tm(4)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2230 3889 Tm(4)Tj0.09765 0 0 -00 0 -0.09765 4452 3544 Tm(a)Tj0.09765 0&765 0 0 -0.09765 4629 1129 Tm(o)530.09765 0M0 -0.09765 4002 3544 Tm(98310.09765 0 0 -0.09765 4158 2509 Tm(s91 0 -0.09765 3060.09765 0 0 -0.0976550Tj0.09765 0 0 -0.09765 5264 3199 Tm(t)Tj0.09765 0 0 -0.09765 5320 3199 Tm(o1420 -0.09765r0 -0.09765 3091 2854 Tm(o)Tj((a)Tj0. 0 -00 0 -0.09765 5354 2509 Tm(p)310.09765 010 -0.09765 5436 2164 Tm(e)T10.09765 090 -0.09765 5530 3544 Tm(l)T10.09765 090 -0.09765 5530 3544 Tm(l6T10.09765 070 -0.09765 5752 3544 Tm(o)T10.09765 0 Tf0.09765 0 0 -0.09765 4269 3544 Tm(5)Tj0.09765 09765 0 0 -0.09765 5635 2164 Tm(a91Tm(a)Tj0.c0 -0.09765 6004 1819 Tm(p)Tj0.09765 0 0 -0.09765 4158 2509 Tm(60930 -0.09765r0 -0.09765 3091 2854 Tm(6)Tj0.09765 0 0 -0.09765 4158 2509 Tm(6)Tj(a)Tj0.c0 -0.09765 6004 1819 Tm(p3370.09765 0 0 -0.09765 5320 3199 Tm(63930 -0.09765 3060.09765 0 0 -0.0976564820 -0.09765r0 -0.09765 3091 2854 Tm(6)Tj -0.09765í0 -0.09765 6606 2164 Tm(d)T40.09765 0 0 -0.09765 5264 3199 Tm(66820 -0.09765 0 -0.09765 5320 3199 Tm(67370.09765 0i0 -0.09765 6794 2509 Tm(m)T3(a)Tj0.c0 -0.09765 6004 1819 Tm(p8810.09765 0 0 -0.09765 4158 2509 Tm(69700.09765 0 0 -00 0 -0.09765 7113 3199 Tm(e)TTm(a)Tj0.q0 -0.09765 7212 1819 Tm(s)TTm(a)Tj0. 0 -0.09765 7372 1474 Tm(l)TTm(a)Tj0.e0 -0.09765 7401 2854 Tm(r)T40.09765 09765 0 0 -009765 0 0 -0.09765 6407 3544 Tm()Tj10.09765 0i0 -0.09765 6794 2509 Tm(75774 -0.09765n0 -00 0 -0.09765 7113 3199 Tm(e)Tj(-0.09765 0 -0.09765 5320 3199 Tm(78010.09765 0 0 -0.09765 7714 3199 Tm(s900(-0.09765 0 -0.09765 5320 3199 Tm(7956m(a)Tj0. 0 -0.09765 7372 1474 Tm(8056m(a)Tj0.mf0.09765 0 0 -0.09765 8549 3199 Tm(s200(-0.097659765 0 0 -0.09765 8327 2854 Tm(r)170.09765 0i0 -0.09765 6794 2509 Tm(n)T34 -0.09765n0 -0.09765 2810 3199 Tm(i)T30.09765 0d0 -0.09765 3447 1819 Tm(85T30.09765 0 0 -0.09765 8684 3544 Tm(ç)2j(a)Tj0.c0 -0.09765 6004 1819 Tm(83274 -0.09765 0 -0.09765 8885 2164 Tm(s)06m(a)Tj0.mf0. 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da plasticidade aos diferentes ambientes lumínicos (Pandey et al. 2003). Em geral, as
plantas desenvolvem “folhas de sol” e “de sombra” quando aclimatadas a diferentes
níveis de luminosidade. Assim, folhas de sombra, por sua maior área foliar (Fahn 1990),
apresentam menos estômatos por unidade de área que uma folha característica de sol
(Onwueme & Johnston 2000; Salisbury 1927). Por outro lado, a razão entre o número
de estômatos e número de células comuns da epiderme se mantém, em geral, constante,
independentemente das condições de crescimento das plantas (Fahn 1990; Salisbury
1927; Teare et al. 1971).
O nitrogênio (N) é o quarto elemento mais abundante na composição das
plantas, depois do carbono e dos elementos da água (Epstein 1972). A alta exigência do
cafeeiro em N é um fato conhecido há muito tempo, e é acentuada com a idade da planta
(Malavolta et al. 2002), particularmente com o início da produção de grãos. Plantas
lenhosas, em geral, apresentam teores foliares médios de N em torno de 1-2%, enquanto
no cafeeiro esses teores são de 3-4%, podendo chegar a 4-5%. Ademais, valores abaixo
de 2,3% (ou em alguns casos abaixo de 2,7%) já são considerados como deficientes para
a cultura (Moraes 1981). Não havendo outros fatores limitantes, a nutrição nitrogenada
promove o rápido desenvolvimento da planta, o aumento das ramificações dos ramos
frutíferos, o número de gemas florais, a formação abundante de folhas e,
conseqüentemente, o aumento da produtividade do cafeeiro (Malavolta 1980). Sabe-se
que plantas cultivadas sob quantidades inadequadas de N não expressam totalmente seu
potencial genético, pois, sob tais condições, ocorre uma série de alterações
morfofisiológicas, afetando, negativamente, o desenvolvimento das culturas (Evans
1989). Cabe ressaltar, ainda, que plantas bem nutridas, especialmente em N, possuem,
via de regra, um sistema antioxidante (demonstrado por um aumento na atividade das
enzimas do sistema antioxidativo) e fotoprotetor mais robusto (Ramalho et al. 1998;
Ramalho et al. 2000; Yu et al. 1999), fato importante para a aclimatação da planta a
diferentes estresses, como altas irradiâncias, deficiências minerais ou baixas
temperaturas.
A área foliar de uma planta pode ser grandemente afetada pela disponibilidade
de luz e de nutrientes. Com efeito, a área foliar é uma variável-chave para a maioria dos
estudos fisiológicos e agronômicos envolvendo crescimento, interceptação de luz,
transpiração e eficiência fotossintética (Blanco & Folegatti 2005). Portanto, a área foliar
afeta fortemente o crescimento e a produtividade, e a estimativa de área foliar é, pois,
um componente fundamental dos modelos de crescimento das plantas (Lizaso et al.
2003). No cafeeiro, entretanto, o método não-destrutivo atualmente mais utilizado para
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mensuração da área foliar, desenvolvido por Barros et al. (1973), leva a uma
subestimação considerável da área foliar (Tavares-Júnior et al. 2002). Assim, o
desenvolvimento de um novo método não-destrutivo para estimar-se, precisa e
acuradamente, a área foliar do cafeeiro reveste-se de particular importância.
Pretendeu-se, neste trabalho, estudar o efeito da luz e do nitrogênio sobre as
características morfológicas da epiderme, em especial sobre a anatomia dos estômatos,
procurando-se explicar a variabilidade da densidade e do índice estomático com os
níveis de luz. Adicionalmente, avaliou-se a fotossíntese e os mecanismos de
fotoproteção do cafeeiro nas condições de inverno de Viçosa, sudeste do Brasil,
cultivando-se plantas a pleno sol e à sombra, sob dois níveis de nitrogênio. Em adição,
procurou-se avaliar os métodos atualmente utilizados para a estimação da área foliar do
cafeeiro, bem como propor um novo método não-destrutivo de mensuração, que seja, ao
mesmo tempo, confiável, preciso acurado e prático.
(Barros et al. 1973)
1.1 – Literatura citada
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7
II. CAPÍTULO I
Respostas alométricas e morfologia foliar em café cultivado sob diferentes níveis de irradiância e de nitrogênio
2.1 – Introdução
A luz é um dos fatores-chave que afeta o crescimento e a distribuição dos
tecidos ao longo da planta (Fahn 1990). A aclimatação fotossintética envolve uma
variedade de respostas, tanto em níveis anatômico, morfológico, bioquímico e
fotossintético. Há uma íntima relação entre as características foliares e a irradiância na
qual as folhas são expostas, em especial durante nos primeiros estádios do
desenvolvimento. Em geral, as plantas desenvolvem “folhas de sol” e “folhas de
sombra” quando aclimatadas a diferentes níveis de irradiância. As principais diferenças
anatômicas entre as folhas de sol e de sombra têm sido largamente documentadas. As
folhas de sol apresentam, geralmente, tecidos paliçádicos mais bem desenvolvidos,
maior superfície mesofílica por unidade de área, menor área foliar específica (AFE) e
folhas mais espessas quando comparadas a folhas desenvolvidas à sombra (Esau 1976;
Fahn 1990).
Conjuntamente com o mesofilo, a epiderme também sofre alterações
consideráveis com mudanças na intensidade luminosa. A superfície foliar, em geral, é
maior nas folhas de ambientes com algum grau de sombra, apresentando células
maiores e estômatos mais distantes entre si. Nesse sentido, a densidade estomática (DE),
que representa o número de estômatos por unidade de área, pode variar, dentre outros
fatores, com a irradiância, temperatura, concentração de CO2, e com o status hídrico da
planta, ou mesmo com o genótipo (Christophes0
8
que levam à diferenciação da epiderme (incluindo os estômatos) e outros tecidos
foliares (Fahn 1990), exibiria variações mínimas ou negligenciáveis em resposta a
variações do ambiente, conforme preconizado por Salisbury (1927). Desde 1927, pois, o
IE passou a ser usado como mais uma característica morfológica da folha, servindo,
muitas vezes, como ferramenta taxonômica (Ayodele & Olowokudejo 2006; Mishra
1997; Teare et al. 1971). Entretanto, questiona-se a invariabilidade do IE, uma vez que
já foi demonstrado que ele pode variar, dentre outros fatores, com a irradiância (Lake et
al. 2001; Pandey et al. 2003; Rahim & Fordham 1991), com a concentração de CO2
atmosférico (Miyazawa et al. 2006; Uhl & Kerp 2005) e com o status hídrico da planta
(Liao et al. 2005; Zhao et al. 2006). A despeito dessas considerações, muitos autores
descrevem que isso seria um mero erro na interpretação dos dados (Mishra 1997;
Schoch et al. 1980; Tichá 1982). Em todo o caso, correlações negativas entre o IE e a
densidade de células epidérmicas ordinárias (DC) (Liao et al. 2005; Miyazawa et al.
2006; Pandey et al. 2003) ou a área ocupada pelos estômatos (AE) (Mishra 1997), ou
ainda correlação positiva entre o IE e a DE (Hovenden & Schoor 2006; Mishra 1997;
Pandey et al. 2003; Uhl & Kerp 2005), entre o IE e a área das células epidérmicas
ordinárias (AC) (Rahim & Fordham 1991) ou mesmo entre o IE e a condutância
estomática (gs) (Miyazawa et al. 2006) têm sido reportadas em diversos trabalhos
recentes.
Em função de sua origem em ambientes sombreados, o cafeeiro vem sendo
tradicionalmente considerado como uma espécie de sombra. Todavia, há considerável
capacidade de aclimatação das plantas a pleno sol; com efeito, em muitas situações,
cafeeiros a pleno sol produzem mais que aqueles à sombra (DaMatta 2004a, 2004b).
Saliente-se que a aclimatação às altas irradiâncias parece largamente dependente do
status de nitrogênio (N) na planta (Ramalho et al. 2000), o que explicaria, pelo menos
em parte, a alta exigência do cafeeiro em N (DaMatta 2004a). Registre-se, também, que
tanto a disponibilidade de luz, como a de N, podem ter impactos significativos sobre a
fotossíntese e sobre o crescimento e a morfologia da planta (Fownes & Harrington
2004; Guo et al. 2007; Ramalho et al. 2000; Seemann 1989; Warren 2004; Warren &
Adams 2004), mas muito pouco tem sido explorado sobre os efeitos combinados desses
dois fatores em cafeeiros. Neste estudo, foram avaliados os efeitos da disponibilidade de
luz e do N sobre o crescimento e sobre a morfologia foliar em geral, e sobre a
morfologia do estômato em particular, em plantas jovens de café arábica cultivada em
vasos.
9
2.2 – Material & Métodos
2.2.1 – Material vegetal e condições de cultivo
Os experimentos foram conduzidos em Viçosa (20º45’S, 42°54’W, 650 m de
altitude), Minas Gerais, em fatorial 2 x 3, sendo duas irradiâncias (pleno sol e à sombra
– 50%) e três níveis de nitrogênio (0, 16 e 23 mM), seguindo-se de um delineamento
inteiramente casualizado. Mudas de café (C. arabica L. cv Catuaí Vermelho IAC 44),
com 3-4 pares de folhas, foram plantadas em vasos de 12 L, contendo uma mistura de
60% de areia e 40% de solo. Após a análise da composição da mistura, realizou-se a
adubação e a correção do pH do substrato, de acordo com análise de solo e
recomendações técnicas para a cultura. A umidade do substrato foi mantida próxima à
capacidade de campo, via irrigações periódicas. Metade das plantas foi cultivada a pleno
sol, e a outra metade, sob telado (sombrite®), com 50% da radiação solar. Nos primeiros
45 dias após o transplante, as plantas foram fertiirrigadas quinzenalmente com solução
nutritiva completa de Hoagland (Epstein 1972). Após esse período, 250 mL de solução
nutritiva de Hoagland, modificada ou não, foram aplicados semanalmente, de modo a
obterem-se três níveis de N: 0, 16 e 23 mM (Tabela 1), respectivamente, níveis de N
deficiente, adequado e em excesso para a cultura. As avaliações e amostragens foram
realizadas entre novembro de 2005 e março de 2006, utilizando-se das folhas mais
novas, totalmente expandidas.
Tabela 1. Composição de macro e micronutrientes de solução nutritiva de Hoagland (Epstein 1972), com modificações, de modo a fornecer três níveis de N. A composição dos demais micronutrientes foi mantida conforme Epstein (1972).
Sal 0 mM 16 mM 23 mM
KCl 4 mM --- ---
KH2PO4 2 mM --- ---
CaCl2 4 mM --- ---
MgSO4 1 mM 1 mM 1 mM
KNO3 --- 6 mM 6 mM
NH4H2PO4 --- 2 mM 2 mM
Ca(NO3)2 4H2O --- 4 mM 4 mM
NH4NO3 --- --- 1 mM
NaNO3 --- --- 6 mM
Fe-EDTA 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM
10
2.2.2 – Avaliações alométricas
Cinco meses após o plantio, as plantas foram fracionadas em parte aérea
(folhas e caule) e sistema radicular. As seguintes características morfológicas foram
avaliadas:
(i) área foliar total, (ii) área foliar específica, (iii) biomassa da parte aérea (PA),
(iv) biomassa do sistema radicular (SR), (v) biomassa total e (vi) razão PA : SR. Para a
determinação da área foliar total, as folhas foram digitalizadas, com a utilização de um
scanner de mesa Genius 1200XE (KYE Systems UK Ltd., Croydon, Surrey, UK) e as
imagens foram analisadas pelo software Image-Pro® Plus (version 4.1, Media
Cybernetics, Inc., Silver Spring, EUA). Na determinação do acúmulo de biomassa, as
frações foram secas em estufa 70ºC, 72 h, quando sua massa foi determinada. Para
determinação da AFE, dez discos foliares, de 1,4 cm2, foram secos até peso constante.
Para cálculo da AFE utilizou-se da seguinte fórmula: (Carmello-Guerreiro 1995)
)(sec
)(cos)(
212
kgamassa
mdisdosfoliaráreakgmAFE
2.2.3 – Avaliações anatômicas
De cada repetição, coletou-se uma folha completamente expandida, que foi
fixada por 48 h, em FAA50, e mantida em etanol 70% (Johansen 1940) até o uso.
Fragmentos foliares foram tratados com clorofórmio, 95%, 2 h, sob agitação e, em
seguida, com etanol 70% e água corrente. Posteriormente, os fragmentos foram tratados
com NaOH 10%, 2 h, sob agitação, seguidos de NaOCl 10% até completa clarificação
dos tecidos. Subseqüentemente, os fragmentos foram corados com solução de violeta
cristal, 1%, por 48 h. Os fragmentos foram, então, desidratados em série etílica /
xilólica, e montados entre lâmina e lamínula com resina sintética (Permount®). Para a
determinação da densidade estomática e das células ordinárias da epiderme, foram
escolhidos, aleatoriamente, 20 campos de 0,171 mm2, de acordo com Salisbury (1927).
Para determinação do IE utilizou-se da fórmula: IE (%) = [(DE) / (DE + DC)] x 100, em
que DE e DC, significam, respectivamente densidade estomática e densidade das células
ordinárias da epiderme. A partir das medidas de comprimento e largura do estômato,
obtiveram-se a razão comprimento : largura e a área do estômato, considerando-o como
uma elipse [área =
x (C/2) x (L/2)], em que C e L representam o comprimento e
largura, respectivamente. A área das células epidérmicas ordinárias foi obtida por
subtração entre a área total do campo microscópico e a área ocupada pelos complexos
estomáticos. A densidade das células ordinárias foi calculada a partir de 20 campos,
11
com auxílio do programa de análise de imagens, descrito abaixo. Para a determinação
da espessura foliar, fragmentos fixados em FAA50 foram incluídos em 2-hidroxietil-
metacrilato (Leica Microsystems Nussloch, GmbH, Heibelberg, Alemanha), segundo as
recomendações do fabricante, seccionados a 7 m e corados com azul de toluidina
(O’Brien et al. 1965) e montados entre lâmina e lamínula com resina sintética
(Permount®). Todas as medições foram obtidas com auxílio do programa Image Pro®
Plus version 4.1 (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, EUA).
10 m
Co
mp
rim
en
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Largura
Po
ro
2.2.4 – Nitrogênio total
Amostras foliares foram secas a 70oC, por 72 h, das quais se determinaram o
nitrogênio orgânico (Jackson 1958) e o nitrogênio nítrico (Cataldo et al. 1975). A soma
das duas frações representa o nitrogênio total.
2.2.5 – Procedimentos estatísticos
Cada unidade experimental foi composta por uma planta por vaso. As
análises de correlações foram feitas utilizando-se do programa estatístico Statistica 7.0
(StatSoft, Inc., Tulsa, Oklahoma, EUA) e as diferenças entre as médias dos tratamentos
foram analisadas pelo teste estatístico de Newman Keuls, mediante o programa
estatístico Sigmaplot 9.0 com Sigmastat integration (Systat Software, Inc., San Jose,
CA, EUA).
(Salisbury 1927)
Figura 1. Complexo estomático, evidenci-ando a tomada das dimensões do estômato (diâmetro polar: comprimento e diâmetro equatorial: largura). Em cinza, são represen-tadas as células subsidiárias. A área do com-plexo estomático foi tomado pelo contorno das células subsidiárias e células- guarda.
12
2.3 – Resultados e Discussão
2.3.1 – Avaliações alométricas
O cultivo das mudas de cafeeiro a pleno sol causou uma diminuição
significativa na área foliar total e na AFE (13,5% e 16%, respectivamente; Tabela 2).
Por outro lado, o acúmulo de biomassa de raízes e biomassa total foi, em média, maior
(50% e 19%, respectivamente) nas plantas cultivadas a pleno sol que à sombra (Tabela
2). Menor área foliar, porém com maior acúmulo de biomassa, indica que a fotossíntese
das plantas a pleno sol, ao longo do tempo, deve ter sido maior que nas plantas à
sombra. Essas informações suportam as sugestões de DaMatta (2004a,b) de que o
cafeeiro não deve ser considerado uma espécie de sombra, apesar de ter evoluído em
ambientes sombreados.
Via de regra, a maioria dos pesquisadores parece concordar que mudas de café
crescem melhor à sombra que a pleno sol (Maestri & Barros 1977). Todavia,
geralmente, em experimentos em que se comparam plantas nas duas condições de
irradiância, o volume de substrato em que as plantas crescem é, ordinariamente, muito
pequeno. Como a pleno sol a evapotranspiração é maior que à sombra, uma menor
disponibilidade de água para mudas a pleno sol poderia explicar o seu menor
crescimento. O fato de a planta apresentar folhas maiores (e maior área foliar) (Tabela
2) e mais verdes (maior concentração de clorofila por unidade de massa; dados não
mostrados) à sombra que a pleno sol, pode transmitir uma falsa percepção de maior
vigor da planta à sombra. Nesse contexto, cultivando mudas de café por sete meses em
sacolas (11 x 22 cm; ~850 cm3), Paiva et al. (2003) verificaram que, sob 50% de
sombreamento, as mudas apresentavam maior área foliar e massa seca que a pleno sol;
os mesmos autores verificaram, também, que a razão parte aérea : sistema radicular (em
base de massa) foi, respectivamente, 6,0 e 5,6, nas plantas sob 50% de sombra e a pleno
sol. Observa-se, no presente trabalho (Tabela 2), que, ao contrário daqueles autores, a
razão PA : SR foi, respectivamente, 2,2 e 1,5, nas plantas sob 50% de sombra e a pleno
sol. Elevados valores de razão PA : SR são indicativos de uma forte restrição espacial
ao crescimento radicular e, assim, provavelmente, o balanço entre as raízes e a parte
aérea é perdido, i.e., as raízes não conseguem suprir a parte aérea, especialmente de
água (Poorter & Nagel 2000), diferentemente do que foi aqui observado, em que o
crescimento radicular não foi diminuído pelo volume do substrato. Ademais, as plantas
cultivadas à sombra apresentam maior área foliar total e específica e maior razão de
massa foliar (Tabela 2), e as plantas cultivadas a pleno sol maior biomassa do sistema
13
radicular. Assim, verifica-se que o cafeeiro cultivado à sombra aloca mais biomassa
para a parte aérea que radicular, enquanto as cultivadas a pleno sol alocam,
proporcionalmente, mais biomassa para o sistema radicular, de forma a compensar a
maior demanda evaporativa da parte aérea nas condições de plena irradiância. Tomados
em conjunto, essas informações sugerem que o cafeeiro, mesmo na fase de muda, pode
crescer a maiores taxas a pleno sol que à sombra, desde que o volume de substrato não
limite a disponibilidade de água para a planta como um todo. Em todo o caso, não se
pode descartar potenciais diferenças interespecíficas no que diz respeito ao crescimento
das plantas de café a pleno sol e à sombra, bem como o papel diferencial de
fitorreguladores (e.g. auxinas, giberelinas) na expansão celular (Kende et al. 1998;
Yang et al. 1996) e na alocação diferencial de biomassa ao longo da planta.
O suprimento de nitrogênio, de modo semelhante à irradiância, também alterou
a partição de biomassa das plantas. Verificou-se que as plantas supridas com 16 e
23 mM de N acumularam mais biomassa total quando em comparação com as
deficientes. Entretanto, a nutrição nitrogenada se traduziu em efeitos mais significativos
no acúmulo de biomassa na PA do que no SR, fato também reportado em mudas jovens
de Picea engelmannii cultivadas sob 10 ou 100 mg N L-1, tanto a pleno sol quanto
Tabela 2. Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0, 16 e 23 mM) sobre os teores foliares de N e variáveis alométricas em plantas jovens de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Médias ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Plantas à sombra Plantas a pleno sol Parâmetros
0 mM 16 mM 23 mM 0 mM 16 mM 23 mM
N total (g kg-1 MS)
19,9 ± 0,7 Ac
32,1 ± 1,3 Ab
35,7 ± 0,5 Aa
20,1 ± 0,2 Ac
29,2 ± 1,0 Ab
37,2 ± 0,8 Aa
Área foliar total (dm2)
8,4 ± 0,6 Ab
19,9 ± 0,8 Aa
21,3 ± 1,4 Aa
7,2 ± 0,7 Bb
17,8 ± 0,8 Ba
17,9 ± 1,8 Ba
Área foliar específica (m2 kg-1)
15,9 ± 0,6 Aa
13,6 ± 0,8 Aa
14,5 ± 0,8 Aa
14,1 ± 0,4 Ba
11,6 ± 0,8 Ba
11,3 ± 0,6 Ba
Biomassa das folhas (g)
6,1 ± 0,5 Ab
14,1 ± 0,7 Aa
15,2 ± 1,1 Aa
5,6 ± 0,5 Ab
15,3 ± 0,8 Aa
14,5 ± 1,6 Aa
Biomassa da parte aérea (g)
9,5 ± 0,8 Ab
19,5 ± 1,0 Aa
20,8 ± 1,6 Aa
9,4 ± 0,9 Ab
22,1 ± 1,6 Aa
20,7 ± 2,5 Aa
Biomassa do sistema radicular (g)
7,6 ± 1,1 Ba
7,9 ± 0,7 Ba
8,4 ± 1,6 Ba
10,8 ± 1,5 Aa
14,1 ± 1,4 Aa
11,0 ± 2,2 Aa
Biomassa total (g)
17,2 ± 1,9 Bb
27,4 ± 1,7 Ba
29,2 ± 3,0 Ba
20,2 ± 2,4 Ab
36,2 ± 2,9 Aa
31,7 ± 4,3 Aa
Parte aérea / Sistema radicular
1,33 ± 0,11 Ab
2,51 ± 0,11 Aa
2,69 ± 0,25 Aa
0,91 ± 0,06 Bb
1,62 ± 0,09 Ba
2,04 ± 0,23 Ba
14
sob 30% de irradiância (McKinnon & Mitchell 2003). Dessa forma, a razão PA : SR
elevou-se com o aumento do suprimento de N, independentemente do regime de luz
empregado (Tabela 2). Assim, acredita-se que a partição de biomassa entre a parte aérea
e radicular tenha sofrido alterações diferenciais com a adubação nitrogenada, de
maneira semelhante ao anteriormente reportado em plantas de mandioca cultivadas em
diferentes concentrações de nitrogênio (Cruz et al. 2003).
15
plantas cultivadas à sombra, a expansão celular pode ter sobrepujado as divisões
celulares que acarretam aumento do número de células, uma vez que se observou um
aumento médio de 35% na área individual das células e uma redução média de 20% da
sua densidade (Tabela 3). Apesar do fato do número de divisões celulares ser controlado
geneticamente (Nadeau & Sack 2003), o ambiente pode exercer forte pressão e alterar
esse padrão; dessa forma, folhas sombreadas, freqüentemente, apresentam incremento
do número de divisões celulares, como forma de incrementar a área foliar, conforme
descrito para Populus sp. (Ceulemans et al. 1995). Em alguns casos, tanto o número de
divisões celulares quanto a área média das células podem ser aumentados com a
diminuição da intensidade luminosa (Friend & Pomeroy 1970; Salisbury 1927; Yano &
Terashima 2001). A análise de correlações (Tabela 4) demonstra que houve uma
interação negativa significativa (r = -0,987 p = 0,001) entre a densidade das células
epidérmicas ordinárias e a sua área, de modo que, com o sombreamento, a área foliar
unitária é maior, fato que eleva também o volume das células epidérmicas e,
conseqüentemente, reduz sua freqüência. Comportamento semelhante ao observado
neste estudo também foi reportado em Allium sativum (Rahim & Fordham 1991).
As folhas de C. arabica têm padrão dorsiventral, com parênquima lacunoso,
ocupando, em média, 74% do volume do mesofilo (Tabela 3), além de serem
hipoestomáticas, com estômatos paracíticos (Figura 1). Não se verificou diferenças
significativas entre a espessura foliar das plantas cultivadas a pleno sol ou à sombra.
Entretanto, tanto as superfícies adaxial e abaxial da epiderme foram mais espessas nas
plantas cultivadas à sombra que a pleno sol (Tabela 3). É possível, porém, que, devido a
maior demanda evaporativa das plantas cultivadas a pleno sol, a composição da parede
periclinal externa das folhas destas plantas apresentem uma maior proporção de ceras e
cutícula que nas plantas cultivadas à sombra, em especial na superfície adaxial da
epiderme, conforme anteriormente demonstrado para a espécie (Fahl et al. 1994). Cabe
ressaltar, ainda, que o parênquima paliçádico foi significativamente mais espesso nas
folhas desenvolvidas a pleno sol n
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Sabe-se que a diferenciação estomática é uma característica estabelecida
durante os primeiros estádios do desenvolvimento da folha (Nadeau & Sack 2002;
Radoglou & Jarvis 1990), mas a rota exata ou sinalização que governa essa
diferenciação não está totalmente esclarecida (Bergmann 2004; Lake et al. 2001;
Miyazawa et al. 2006; Salisbury 1927; Serna & Fenoli 2000). Recentemente, tem-se
relatado que, durante a ontogenia foliar, DE e IE são influenciados pela intensidade de
luz e pela concentração de CO2 na qual as folhas maduras se encontravam, o que sugere
que tais folhas tenham um papel significativo no desenvolvimento das novas folhas,
provavelmente pela geração de um sinal sistêmico que envolve a planta como um todo
(Brownlee 2001; Köhler & Mueller-Roeber 2004; Lake et al. 2001; Miyazawa et al.
2006; van Hoof et al. 2006; Yano & Terashima 2001). Apesar de alguns relatos sobre a
alteração do IE em folhas expostas a diferentes irradiâncias (Brownlee 2001; Lake et al.
2001; Miyazawa et al. 2006; Pandey et al. 2003; Rahim & Fordham 1991), pouco se
conhece sobre as reais causas dessa alteração.
Tabela 3. Efeito do sombreamento sobre as características anatômicas da folha, em plantas jovens de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Médias ± EP (n = 10). Letras maiúsculas denotam diferenças significativas (teste t, p = 0,05) entre as médias dos tratamentos.
Parâmetros Plantas a pleno sol Plantas à sombra
Área foliar unitária (dm2) 0,41 ± 0,01 B 0,56 ± 0,02 A
Densidade estomática (estômatos mm-2) 184,42 ± 3,59 A 138,84 ± 4,57 B
Índice estomático (%) 20,08 ± 0,23 A 19,09 ± 0,28 B
Densidade das células ordinárias (células mm-2) 733,65 ± 7,95 A 587,86 ± 13,11 B
Diâmetro polar do estômato ( m) 26,80 ± 0,18 ns 26,89 ± 0,23 ns
Diâmetro equatorial do estômato ( m) 17,79 ± 0,10 ns 17,85 ± 0,16 ns
Área do estômato ( m2) 374,72 ± 3,81 ns 377,24 ± 5,25 ns
Área do complexo estomático ( m2) 1136,46 ± 36,14 ns 1137,94 ± 24,02 ns
Área das células ordinárias ( m2) 1069,09 ± 21,79 B 1437,24 ± 26,75 A
Superfície adaxial da epiderme ( m) 23,17 ± 0,70 B 25,50 ± 0,42 A
Superfície abaxial da epiderme ( m) 16,11 ± 0,39 B 17,28 ± 0,43 A
Parênquima paliçádico ( m) 58,97 ± 1,40 A 54,71 ± 1,24 B
Parênquima lacunoso ( m) 163,85 ± 4,70 A 155,21 ± 4,71 A
Espessura total da folha ( m) 262,1 ± 5,83 A 252,7 ± 5,58 A
PP : PL 0,37 ± 0,01 A 0,35 ± 0,01 A
Espaços de ar no PL (%) 21,63 ± 0,80 B 25,96 ± 0,77 A
Demonstrou-se, neste estudo, que as células ordinárias da epiderme têm uma
alta plasticidade, diferentemente do que ocorre com as células subsidiárias ou mesmo
17
com as células-guarda. O sombreamento das folhas acarretou uma elevação de 35% na
área das células epidérmicas ordinárias e uma redução de 20% da sua freqüência, fato
que, em conjunto afetam diretamente o IE, uma vez que foi evidenciado neste estudo,
uma interação positiva entre o IE e a DC (r = 0,500 p = 0,05), e negativa entre o IE e
AC (r = -0,571 p = 0,001). Apesar disso, nenhuma alteração significativa foi percebida
nas dimensões das células subsidiárias ou mesmo nas das células-guarda. Em função
disso, o IE das folhas desenvolvidas a pleno sol e à sombra foi, respectivamente,
20,08% e 19,09%, uma elevação de 5,2% em favor das folhas de sol. Situações
semelhantes às apresentadas neste estudo também foram reportadas em Allium sativum
(Rahim & Fordham 1991), em Arabidopsis thaliana (Lake et al. 2001), em Populus
trichocarpa (Miyazawa et al. 2006) e em Ginkgo biloba (Pandey et al. 2003). Não
obstante, a alteração do IE não foi correlacionada com nenhuma das características
estomáticas avaliadas (Tabela 4), de forma distinta do apresentado por muitos autores,
que descrevem que as alterações no IE são reflexos da alteração das dimensões do
estômato, uma vez que a elevação da DE, com conseqüente diminuição das suas
dimensões, elevaria o IE na mesma proporção (Ceulemans et al. 1995; Ciha & Brun
1975; Lake et al. 2001; Liao et al. 2005; Rahim & Fordham 1991; Salisbury 1927).
Tabela 4. Coeficientes de correlação entre as características foliares, em plantas jovens de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. IE = índice estomático, AF = área foliar, AFE = área foliar específica, DE = densidade estomática, DC = densidade das células epidérmicas, DP = diâmetro polar do estômato, LE = diâmetro equatorial do estômato, AE = área estomática, CE = área do complexo estomático, AC = área das células epidérmicas, EM = espessura foliar. Os valores são significativos a p = 0,05 (*), p = 0,01 (**), p = 0,001 (***), ou não significativos (ns; p > 0,05).
IE AF AFE DE DC DP LE AE CE AC EM
IE ___ -0,423
* -0,018
ns 0,767 ***
0,500 *
0,179 ns
0,344 ns
0,318 ns
0,090 ns
-0,571 ***
-0,236 ns
AF ___ ___ 0,315
ns -0,736
*** -0,769
*** 0,033
ns -0,398
* -0,223
ns 0,273
ns 0,744 ***
-0,162 ns
AFE ___ ___ ___ -0,415
* -0,548
** -0,203
ns 0,171
ns -0,010
ns -0,130
ns 0,538
** -0,399
ns
DE ___ ___ ___ ___ 0,937
* 0,035
ns 0,221
ns 0,149
ns -0,027
ns -0,956
*** 0,029
ns
DC ___ ___ ___ ___ ___ -0,041
ns 0,115
ns 0,038
ns -0,086
ns -0,987
*** 0,181
ns
DP ___ ___ ___ ___ ___ ___ 0,300
ns 0,799 ***
0,309 ns
-0,007 ns
-0,217 ns
LE ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ 0,813
*** -0,326
ns -0,086
ns -0,340
ns
AE ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ -0,019
ns -0,049
ns -0,343
ns
CE ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ -0,043
ns -0,020
ns
AC ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ -0,160
ns
EM ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
18
Ad
PP
LCPL
Ab
FV
Figura 2. Superfície abaxial (A, B) da folha, seção transversal da folha (C, D) e seção paradérmica do parênquima lacunoso (E, F) de plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol (A, C, E) ou à sombra (B, D, F). Ad = Superfície adaxial da folha, Ab = superfície abaxial da folha, PP = parênquima paliçádico, PL = parênquima lacunoso, PE = Parede periclinal externa, PI = Parede periclinal interna, LC = lacunas de ar no parênquima lacunoso, Cl = cloroplastos, FV = feixe vascular, Es = Estômato, CS = Cavidade estomática. Barra 50 m
Neste estudo, a DE foi afetada pelo sombreamento em maior extensão que o IE
(33% e 5,2%, respectivamente), variações similares às relatadas em Ginkgo biloba
(Pandey et al. 2003) e em Vigna sinensis (Schoch et al. 1980). Com o aumento da
expansão foliar, em resposta ao sombreamento, houve uma redução na DE, sem
alterações aparentes nas dimensões dos estômatos, porém com alterações significativas
na área média das células ordinárias da epiderme (Tabela 4 e Figura 2). Isso sugere que
19
a diferenciação estomática seja regulada por um mecanismo morfofisiológico diferente
daquele que determina a divisão ou a expansão das células epidérmicas e comprova a
plasticidade diferencial das células ordinárias da epiderme na alteração do IE com a
alteração nos níveis de irradiância.
Os resultados apresentados neste trabalho mostram que o sombreamento afeta a
DE e o IE, embora as alterações neste último sejam mais discretas. Essa alteração
diferencial faz da última uma característica mais aplicável para inferências taxonômicas,
enquanto a primeira é mais adequada para indicar a plasticidade morfológica da espécie
aos diferentes ambientes de luz. Neste sentido, as variações em IE ou mesmo em DE,
em café, podem ser atribuídas à maior plasticidade das células epidérmicas ordinárias, e
não às células estomáticas como apresentado para outras espécies (Ciha & Brun 1975;
Hovenden & Shimanski 2000; Mishra 1997; Onwueme & Johnston 2000; Pallardy &
Kozlowski 1979; Poole & Kürschner 1999).
2.5 – Literatura citada
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23
III. CAPÍTULO II
Fotossíntese, metabolismo antioxidativo e fotoproteção em plantas de Coffea arabica L. avaliadas no inverno e submetidas a diferentes níveis
de irradiância e nitrogênio
3.1 – Introdução
O café arábica é originário das florestas tropicais da África, onde é encontrado
em estado espontâneo como vegetação de sub-bosque. Entretanto, as cultivares
largamente utilizadas no Brasil foram selecionadas em ensaios de competição quase
sempre conduzidos a pleno sol e, portanto, podem, potencialmente, apresentar
adaptações a altas irradiâncias em extensão superior àquelas selecionadas para
ambientes sombreados (DaMatta 2004). Em todo o caso, o cafeeiro, a pleno sol, pode
ser submetido a um excesso de energia radiante que, por seu turno, pode limitar a
fotossíntese pela inativação dos centros de reação, devido, em parte, à superexcitação da
cadeia de transporte de elétrons, que gera espécies reativas de oxigênio (EROs, e.g.
H2O2, 1O2, OH , O2
-) danosas aos lipídios de membrana (Blankenship 2006). Não
obstante, as plantas podem reduzir a absorção da luz, e.g. via redução da concentração
de clorofilas e aumento da reflectância da radiação incidente (Lambers et al. 1998).
Adicionalmente, a fotoproteção pode ser alcançada pelo aumento da dissipação do
excesso de energia via carotenóides ou pela elevação do metabolismo das EROs, que,
em geral, envolve três mecanismos: (i) a participação de antioxidantes (e.g. -tocoferol,
-caroteno, luteína, violaxantina, anteraxantina e zeaxantina) associados às membranas
lipídicas, (ii) pequenas moléculas antioxidantes solúveis em água (e.g. ascorbato,
glutationa) e (iii) antioxidantes enzimáticos incluindo as enzimas dismutase do
superóxido, catalase, peroxidase do guaiacol e as enzimas do ciclo ascorbato-glutationa
(e.g. peroxidase do ascorbato, redutase do monodesidroascorbato e redutase do
desidroascorbato) (Nishiyama et al. 2006). Coletivamente, esses mecanismos podem
24
largamente minimizar potenciais aumentos na concentração de EROs (Blankenship
2006; Bray et al. 2000; Holt et al. 2005). Sem um sistema fotoprotetor eficaz, pode
ocorrer fotoinibição da fotossíntese, caracterizada por um declínio sustentado no
rendimento quântico da fotossíntese e um decréscimo da eficiência fotoquímica máxima
do fotossistema (FS) II (Fv/Fm) e, em muitos casos, por um decréscimo no rendimento
quântico potencial do FSII (Corcuera et al. 2005; DaMatta & Maestri 1997; Ögren
1991). Nesse sentido, a participação dos carotenóides na fotoproteção da maquinaria
fotossintética é de fundamental importância (Demmig-Adams et al. 1996b).
As plantas são capazes de aclimatar suas taxas fotossintéticas a diferentes
intensidades luminosas, o que implica em mudanças substanciais no conteúdo e/ou
composição da maquinaria fotossintética (Demmig-Adams et al. 1996b). Registre-se
que a aclimatação a diferentes ambientes lumínicos pode grandemente depender da
disponibilidade de nutrientes (Lambers et al. 1998), particularmente o N (Evans &
Poorter 1997). Nesse sentido, a fertilização nitrogenada, via de regra, tem efeitos
positivos sobre o crescimento e pode atenuar os efeitos deletérios de condições
ambientais sub-ótimas, i.e., temperaturas marginais (Hikosaka 1997; Lawlor et al. 1987;
Ramalho et al. 2003) e altas intensidades luminosas (Carelli et al. 2006; Evans &
Poorter 1997; Fahl et al. 1994; Ferrar & Osmond 1986; Osmond 1987).
O cafeeiro é uma espécie lenhosa sempre-verde que apresenta taxas de
assimilação líquida de CO2 (A) relativamente baixas, não excedendo a 12 mol CO2
m-2 s-1 (Andrade Neto 2005; DaMatta 2004). Nas condições de inverno de Viçosa,
sudeste do Brasil, tem-se observado taxas negligenciáveis de crescimento (Barros &
Maestri 1974; DaMatta et al. 1999; Silva et al. 2004) em paralelo a uma redução
marcante das taxas de fotossíntese (Chaves et al. 2008; Silva et al. 2004), fato atribuído
tanto a limitações estomáticas como não estomáticas. Portanto, a baixa utilização
fotoquímica da luz pode resultar em fotodanos principalmente no inverno, época em que
são comuns noites com baixas temperaturas seguidas de dias ensolarados. Ademais,
nessa época e, em condições de campo, as folhas do cafeeiro podem exibir menor
concentração de N, em função da grande remoção desse elemento pelos frutos (até 95%
do N total da planta; Cannell 1975), que são colhidos normalmente até junho, fato que
pode levar a uma deficiência nitrogenada na planta. Em última análise, a deficiência de
N poderia exacerbar a ocorrência 56 2 84.81 0.56250 81.93 -2 0.09765 0 6509765 0 0 -0.09765 3777 10811 Tm3901 Tm(a)Tj0.09765 0 0 -0.097086 Tm(a)Tj0.09765 0 0 -0.09765 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2840 118.09765 5137 10466 Tm(o)Tj0965 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -020965 33412 11d.09765 5335 10121 Tm(r)Tj0909765 0 0 -0.09765 3462 11846 Tm(r)T50.09765 0 0 -0.09765 4362 11846 Tm(c)Tj0865 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -060865 33412 110.09765 5734 10121 Tm(e)Tj0
a
ecs7T5 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -627.09765 0 0 -0.09765 4174 11846 Tm(ê)T60.09765 0 0 -m.09765 6490 8396 Tm(e)Tj0.90 -0.09765 3777 10811 Tm3901 Tm(a)Tj0.090..09765 0 0 -0.09765 2185 11846 Tm(o)T67..09765 0 0 -0.09765 6882 9431 Tm(t)Tj02.09765 0 0 -0.09765 3851 11846 Tm(c)T692.09765 0 0 -0.09765 7064 8741 Tm(a)Tj02.09765 0 0 -0.09765 3851 11846 Tm(c)T712.09765 0 0 -s.09765 7209 10121 Tm(n)Tj00765 2840 118.09765 5137 10466 Tm(o)T725609765 0 0 -0.097-0.09765 7432 11156 Tm(a)Tj2309765 0 0 -0.09765 7064 8741 Tm(a)Tj52765 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 - 0 3uei
o
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olttC
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u
Eet
uu
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drNpnaixdc
o
ásc
rta
25
típicas de inverno do sudeste do Brasil, a principal região produtora de café arábica do
mundo.
Os objetivos deste trabalho foram, portanto, avaliar o comportamento
fotossintético e fotoprotetor de plantas de café no inverno submetidas a diferentes níveis
de N e avaliar os efeitos da disponibilidade desse elemento sobre a aclimatação das
plantas a diferentes ambientes lumínicos.
(Cannell 1975; Ramalho et al. 2000)
3.2 – Material & Métodos
3.2.1 – Desenho experimental
Os experimentos foram conduzidos em Viçosa (20º45’S, 42°54’W, 650 m de
altitude), Minas Gerais, em fatorial 2 x 2, sendo duas irradiâncias (pleno sol e à sombra
– 50%) e dois níveis de nitrogênio (0 e 23 mM), seguindo-se um delineamento
inteiramente casualizado. Mudas de café (C. arabica L. cv Catuaí Vermelho IAC 44),
com 3-4 pares de folhas, foram plantadas em vasos de 12 L, contendo mistura de 60%
de areia e 40% de solo. Após a análise da composição da mistura, realizou-se a
adubação e a correção do pH do substrato, de acordo com análise química e
recomendações técnicas para a cultura. A umidade do substrato foi mantida próxima à
capacidade de campo, via irrigações periódicas. Metade das plantas foi cultivada a pleno
sol, e a outra metade, sob telado (sombrite®), com 50% da radiação solar. Nos primeiros
45 dias após o transplante, as plantas foram fertiirrigadas quinzenalmente com solução
nutritiva completa de Hoagland (Epstein 1972). Após esse período, 250 mL de solução
nutritiva de Hoagland, modificada ou não, foram aplicados semanalmente, de modo a
obterem-se dois níveis de N: 0 e 23 mM, conforme a Tabela 1. As avaliações e
amostragens foram realizadas entre junho e julho de 2007, utilizando-se das folhas mais
novas, totalmente expandidas, do terceiro ou quarto par, a partir do ápice, de ramos
plagiotrópicos.
3.2.2 – Parâmetros agrometeorológicos
O déficit de pressão de vapor entre o interior da folha e a atmosfera ( e) foi
calculado conforme Landsberg (1986). Para isso, foram tomadas, ao longo do período
de avaliação das trocas gasosas, as temperaturas do ar (bulbo seco e bulbo úmido) e da
folha, utilizando-se, respectivamente, de um psicrômetro e de um termopar associado à
pinça de um fluorômetro modulado (FMS2, Hansatech, Norfolk, Reino Unido).
26
A radiação fotossinteticamente ativa (RFA) foi medida com um sensor também
acoplado à pinça do fluorômetro. Alternativamente, RFA foi também medida com um
fotômetro/radiômetro (Li-185, LI-Cor, Lincoln, Nebraska, EUA). (Landsberg 1986)
Tabela 1. Composição de macro e micronutrientes da solução nutritiva de Hoagland (Epstein 1972), com modificações, de modo a fornecer dois níveis de N. A composição dos demais micronutrientes foi mantida conforme Epstein (1972).
Sal 0 mM (–N) 23 mM (+N)
KCl 4 mM ---
KH2PO4 2 mM ---
CaCl2 4 mM ---
MgSO4 1 mM 1 mM
KNO3 --- 6 mM
NH4H2PO4 --- 2 mM
Ca(NO3)2 4H2O --- 4 mM
NH4NO3 --- 1 mM
NaNO3 --- 6 mM
Fe-EDTA 0,1 mM 0,1 mM
3.2.3 – Área foliar específica (AFE)
Dez discos de 1,4 cm2 foram coletados de cada planta, secos em estufa a 70ºC,
por 72 h, quando sua massa foi determinada. Para cálculo da AFE utilizou-se da
seguinte fórmula:
)kg(asecmassa
)m(cosdisdosfoliarárea)kgm(AFE
212
3.2.4 – Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência
A taxa de assimilação líquida do carbono (A), a condutância estomática (gs) e a
razão entre as concentrações interna e ambiente de CO2 (Ci/Ca) foram medidas às 12:00-
14:00 h, em sistema aberto, sob concentração de CO2 ambiente, com um analisador de
gases a infravermelho portátil (LICOR 6400, Li-COR, Lincoln, Nebraska, EUA).
Os parâmetros de fluorescência da clorofila (CHL) a foram também determinados
naqueles horários, bem como na antemanhã, nas mesmas folhas utilizadas para as
medições das trocas gasosas, por meio do fluorômetro com pulso modulado, descrito
acima. Após serem adaptados ao escuro, por 30 min, tecidos foliares foram inicialmente
expostos a pulsos de luz vermelho-distante [1-2 mol (fótons) m-2 s-1] para a
determinação da fluorescência inicial (F0). Em seguida, pulsos de luz saturante, com
27
irradiância de 6000 mol (fótons) m-2 s-1 e duração de 1 s, foram aplicados para
determinar-se a fluorescência máxima emitida (Fm). Nas amostras adaptadas ao escuro,
a eficiência máxima do FSII foi estimada pela razão entre as fluorescências variável e
máxima, Fv/Fm = (Fm-F0)/Fm. Para a obtenção da fluorescência em steady-state (Fs),
utilizou-se uma irradiância actínica artificial de 500 e 1000 mol (fótons) m-2 s-1,
respectivamente para plantas cultivadas à sombra ou a pleno sol. Essa irradiância,
aplicada por 300 s, foi equivalente à irradiância média interceptada pelas folhas à
sombra e ao sol. Subseqüentemente, pulsos de luz saturante [6000 mol (fótons) m-2 s-1;
1 s] foram aplicados para medir-se a fluorescência máxima das amostras sob luz (Fm’).
Com esses parâmetros, estimou-se a fração da energia absorvida utilizada na fase
fotoquímica da fotossíntese (P), a fração da energia dissipada termicamente (D) e a
fração de energia absorvida não utilizada na fotoquímica nem dissipada termicamente
(PE) (Demmig-Adams et al. 1996b).
3.2.5 – Ensaios bioquímicos
Para a determinação da atividade da sintetase da glutamina (GS) e de
carboidratos e aminoácidos, amostras foliares foram coletadas entre 7:00-9:00 h. Para a
determinação de enzimas do metabolismo antioxidativo, e danos celulares, amostras
foliares foram também coletadas entre 12:00-14:00 h. Para determinação da
concentração de pigmentos, amostras foliares foram coletadas na antemanhã e entre
12:00-14:00 h. Todo o material vegetal foi imediatamente congelado em nitrogênio
líquido e, em seguida, armazenado a -80ºC, até o uso.
3.2.5.1 – Clorofilas e carotenóides
Dois discos foliares foram homogeneizados em acetona 90%, a 4ºC.
O homogenato foi transferido para um microtubo, e expurgado com N2 gasoso durante
2 min. Após 30 min de repouso, os microtubos foram centrifugados a 15000 g, 10 min,
4ºC. O sobre.09765 0 (g)Tj0.09765 0 0 -0.09765 7000 10366.09765 0 0 -0.09765 3158 68166 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 96766 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3158 68320 Tm(.09765 0 (g)Tj0.09765 0 0 -0.09420 Tm(.09765t09765 0 0 -0.09765 3476 6471 TTm(e)Tj0.09760.09765 0 0 -0.09765 3807 10611 Tm(C)Tj0.09765 0 0 -0.09765 3735 49917 Tm(b)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2786 13836 Tm(.09765t09765 0 0 -0.09765 3476 64811 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 3957 49948 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 94048 Tm00 10366 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 4349 10220 Tm(.09765f09765 0 0 -0.09765 4289 96761 Tm(o)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2686 14361 Tm(o)Tj0i)Tj0.09765 0 0 -0.09765 4519 96764 Tm(.09765f09765 0 0 -0.09765 4289 96036 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 3957 44636 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 4331 75611 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 4744 78518 Tm(r)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2853 14864 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 4900 78513 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 95013 Tm00 10366 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 5472 71121 Tm(.09765.09765 0 0 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0.3161 TTz(En2Tm3.31 Tc88.56 2103.81 0.5661 T81.93 - Tc79( 1- 785.17 -66 76.21 -67Tc70.12 -60 63.87 -4 57.93 -1 c66 T.1 T46.87 3967.1 T3Tc39.62 3106.21 7.1 T33.93 1.17 c31(En0.66366 28.43 -6107.21 -3 c07.62 5.87 26.17 14( 12En21( 1c09(En26( 129.21 79.56 29.21 315 1c0921 35( 12E.87 37.87 27 39.93 c07.1 Tm Tf3.12 43 2021 43Tc18.17 66 T.43 67.6 T14.87 40.66Tc12.81 37.86 T1.21 34.21 T1.21 31Tc11.21 79.1 T12.(En2687 T3 24.6 Tc14.87 1 T16( 112.6 T165 18( 1c15.17 0.66366 1.21 -6 1.21 -61 c1.21 -96 l33.21 -96 l33.21 -33 l33.21 -27 34.31 -2 T3543 -69 c365 1-66 38.62 -64 4T.1 T-6 Tc44.43 -9785.17 -8950.66T-9 c53.68 -8 57.21 -9 6243 -6 Tc67(En-6 Tm.93 -17 76.21 -21 c76.21 -96 l92.21 -96 lhfQBT048 Tf0.09765 0 0 -0.09765 2583 98766 TT7830.24992z2:00f0.09L0.F1 2048 Tf100 Tz( )Tj/F1 2048 Tf0.09765 0 0 -0.09765 1874 10021 T2136)Tj/O09765 0 0 -0.09765 2942 1001 T12136)Tj/ )Tj0.09765 0 0 -0.09765 2932 1096 T12136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 2252 78561 T2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 2686 10361 T2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 2187 1091 TT2136)Tj/p09765 0 0 -0.09765 2187 10623 T2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 2686 10723 T2136)Tj/s09765 0 0 -0.09765 2292 10801 T2136)Tj/t09765 0 0 -0.09765 2853 10718 T2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 2686 1095 T12136)Tj/ )Tj0.09765 0 0 -0.09765 2932 13021 T2136)Tj/f09765 0 0 -0.09765 3186 8196 TT2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 2686 1326 TT2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 3874 10353 T2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 3424 75021 T2136)Tj/.09760.09765 0 0 -0.09765 3807 1066 T12136)Tj/i09765 0 0 -0.09765 3735 4991 TT2136)Tj/d09765 0 0 -0.09765 2786 13837TT2136)Tj/.09765 0 0 -0.09765 3963 1032 TT2136)Tj/n1 2048 Tf0.09765 0 0 -0.09765 4906 8502 TT2136
28
440 nm, e as áreas dos cromatogramas dos respectivos padrões (VKI, Horsholm,
Dinamarca), obtidos naquele comprimento de onda, de acordo com método descrito em
Ramalho et al. (1997). O estado de epoxidação dos carotenóides do ciclo das xantofilas
(DEPS), envolvendo os componentes do ciclo das xantofilas, violaxantina (V),
anteraxantina (A) e zeaxantina (Z), foi calculado con
30
(Biosystems LTDA, São José dos Pinhais, PR, Brasil). Detalhes adicionais estão
descritos em Lima et al. (2002). (Lima et al. 2002)
3.2.7 – Procedimentos estatísticos
À exceção dos parâmetros fotossintéticos e de fluorescência, que foram
tomados em blocos, as demais variáveis foram submetidas à análise de variância
segundo delineamento inteiramente casualizado. Quando necessário, os dados foram
transformados para seguir uma distribuição normal, usando-se para isso o teste de
Kolmogorov-Smirnov. As análises de correlações foram feitas utilizando-se do
programa estatístico Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, Oklahoma, EUA) e as
diferenças entre as médias dos tratamentos foram analisadas pelo teste t, mediante o
programa estatístico Sigmaplot 9.0 com Sigmastat integration (Systat Software, Inc.,
San Jose, CA, EUA).
3.3 – Resultados e Discussão
3.3.1 – Ambiente, características foliares e metabolismo do nitrogênio
Nos meses de avaliação, a temperatura mínima média foi de 8,7ºC, e a máxima,
de 25,5ºC. Entretanto, foi comum o registro de temperaturas abaixo de 6ºC e superiores
a 28ºC (Figura 1). Grande parte das coletas foi realizada no mês de julho, quando se
registraram as temperaturas anuais mais baixas (a média anual das temperaturas
mínimas e máximas foram, respectivamente, 15,8ºC e 26,6ºC). Salienta-se que, em
Viçosa (MG), durante o inverno, há predominância de baixas temperaturas,
especialmente noturnas, com baixa nebulosidade e baixa umidade relativa do ar ao
longo do dia. Em todo o caso, as plantas dos diferentes ambientes lumínicos estiveram
expostas a déficits de pressão de vapor similares, em torno de 3,0 kPa, ao meio-dia
(Figura 2).
O teor foliar de nitrogênio total foi, em média, 58% maior nas plantas +N em
relação às plantas –N, que exibiram teores deficientes de N, i.e., inferior a 27 g kg-1 MS
(Moraes 1981), independentemente do ambiente lumínico, ao contrário das plantas +N,
em que o teor foliar foi superior a 30 g kg-1 MS (Tabela 2), independentemente da
irradiância. O aumento da disponibilidade de N foi acompanhado por aumento do teor de
aminoácidos solúveis totais (30%) e de proteínas solúveis totais (146%), bem como na
atividade da GS (~115%) (Tabela 2). Resultados semelhantes foram observados em
31
plantas de Manihot esculenta cultivadas com 3 e 12 mM de N (Cruz et al. 2004).
Mesmo sem efeito aparente do sombreamento sobre a concentração de aminoácidos totais
(Tabela 2), a atividade da GS foi significativamente maior (30%) nas plantas cultivadas a
pleno sol em comparação àquelas sob sombra (Tabela 2) para um dado nível de N. Essas
diferenças sugerem que o aumento relativo da atividade da enzima nas plantas a pleno sol
possa estar mais diretamente associado à fotorrespiração que com a síntese de novos
aminoácidos (Guo et al. 2007; Linka & Weber 2005; Oliveira et al. 2002).
A fotorrespiração também poderia explicar a maior atividade da GS nas plantas +N, uma
vez que se sabe que a atividade da enzima é diminuída sob deficiência do mineral (Cruz et
al. 2003).
Tem
pera
tura
(ºC
)
A
0,0
8,0
16,0
24,0
32,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 290,0
8,0
16,0
24,0
32,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
B
Temperatura (ºC
)
Figura 1: Temperaturas máximas ( ) e mínimas ( ) diárias registradas em junho (A) e julho (B) de 2007. As linhas horizontais representam a média mensal daquelas temperaturas e as regiões grifadas de cinza, as datas de coleta. Fonte: Estação Climatológica, UFV.
Aa
e (k
Pa)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
+ N N
AaAa Aa
Figura 2: Déficit de pressão de vapor entre o interior da folha e a atmosfera ( e) em plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol (colunas vazias) ou sob 50% de irradiância (colunas cheias) em 0 ou 23 mM de N. Cada coluna representa a média ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
32
A AFE foi, em média, 7% maior nas plantas desenvolvidas à sombra em relação
àquelas desenvolvidas a pleno sol (Tabela 2). Em contrapartida, as plantas +N mostraram
menor AFE (em média 8%) quando comparadas às plantas –N. A influência da
irradiância sobre a AFE tem sido largamente documentada em diferentes espécies
vegetais (Fahn 1990; Salisbury 1927; Valladares et al. 2000), em que folhas de sombra,
por receberem menor intensidade de fluxo de fótons, traduzem esse efeito pelo aumento
da área foliar por unidade de massa. Por outro lado, parece não haver relação entre a
nutrição mineral e a AFE, num padrão que se acredita ser mais influenciado pela alocação
diferencial dos nutrientes, em especial o nitrogênio, entre as plantas dos distintos
ambientes lumínicos do que da nutrição per se (Evans & Poorter 1997; Fahl et al. 1994;
Valladares et al. 2000). Neste estudo, entretanto, o incremento da disponibilidade de N
promoveu redução na AFE em extensão maior que o efeito da luz (Tabela 2).
Tabela 2: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre as características foliares, frações nitrogenadas, aminoácidos livres totais, atividade da sintetase da glutamina (avaliadas pela produção de -glutamil hidroxamato; GT) e proteínas solúveis totais em plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Médias ± EP (n = 6-10). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúscula s
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p 11285sa e metabolismo do carbono2048 Tf0.08935 0 0 -0.08935 2627 5799 Tm.
33
por outros autores sob condições semelhantes de cultivo às deste estudo (DaMatta et al.
1997; Silva et al. 2004). Dentre os mecanismos que explicariam os baixos valores de A,
em café, a baixa condutância difusiva, i.e. estomática e mesofílica, parece ser
preponderante nessa resposta (Araújo 2006; Silva et al. 2004). De qualquer modo, o frio
afeta negativamente as taxas fotossintéticas, tanto no cafeeiro (DaMatta et al. 1997;
Ramalho et al. 2003; Silva et al. 2004) como em outras espécies lenhosas (Corcuera et
al. 2005), devido, em parte, ao comprometimento da capacidade de fixação do CO2
provocada pelas baixas temperaturas. Todavia, é provável que limitações difusivas
tenham papel de destaque na magnitude de A, fato evidenciado pelos baixos valores de
gs e de Ci : Ca. Com efeito, tem-se sugerido, para o cafeeiro, que as baixas temperaturas
noturnas podem afetar em larga extensão gs, independentemente de as temperaturas
diurnas serem adequadas às trocas gasosas (Bauer et al. 1985). Acredita-se, também,
que, em café, o frio possa diminuir a condutância mesofílica, reduzindo a
disponibilidade de CO2 nos sítios de carboxilação da rubisco e, pois, afetando
negativamente A (Bauer et al. 1985; Silva et al. 2004). Cumpre ressaltar que, apesar da
estimativa de Ci ser sujeita a uma série de erros potenciais, especialmente quando gs é
baixa, parece razoável admitir-se que, devido à natureza homobárica das folhas do café,
não se tenha sobrestimado a razão Ci : Ca (DaMatta 2003). Por outro lado, salienta-se
que a capacidade fotossintética potencial, que pode ser deduzida da radioatividade total
incorporada (ensaio sob condições saturantes de luz e CO2 e, portanto, sem efeitos de
limitações difusivas) foi inferior nas plantas –N em relação às plantas +N,
independentemente se cultivado à sombra ou a pleno sol (Tabela 4). Isso demonstra que
os efeitos positivos da nutrição nitrogenada sobre a fotossíntese, in situ, devem ter sido
aparentemente atenuados ou mesmo anulados pelas resistências difusivas impostas
presumivelmente pelas baixas temperaturas noturnas, especialmente nas plantas a pleno
sol (cf. Tabelas 3 e 4).
Os tratamentos aplicados não afetaram consistentemente as concentrações de
glicose e de frutose (Figura 3). Em contraste, os teores de sacarose e de amido foram
menores nas plantas –N que nas +N, independentemente da irradiância. Considerando-
se que as plantas –N acumularam menos biomassa (dados não mostrados), os seus
menores teores de sacarose e de amido podem ser um reflexo de uma menor taxa de
fotossíntese, integrada ao longo do tempo nas plantas –N.
34
Tabela 3: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a assimilação líquida de carbono (A), a condutância estomática (gs) e a razão entre a concentração interna e externa de CO2 (Ci : Ca) em plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Cada valor representa a média ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Plantas a pleno sol Plantas à sombra Características
–N +N –N +N
A ( mol CO2 m-2 s-1) 1,5 ± 0,1 Ba 1,6 ± 0,1 Aa 2,1 ± 0,2 Aa 2,1 ± 0,3 Aa
gs (mmol m-2 s-1) 19,0 ± 0,7 Aa 12,2 ± 0,1 Ab 13,1 ± 0,7 Ba 10,8 ± 1,0 Ab
Ci : Ca 0,55 ± 0,04 Aa 0,46 ± 0,05 Aa 0,46 ± 0,04 Aa 0,41 ± 0,04 Aa
Tabela 4: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a partição do 14C fotossintético em folhas de plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Valores de radioatividade incorporada nas diferentes frações (aniônica = ácidos orgânicos; catiônica = aminoácidos; neutra = açúcares solúveis totais; e insolúvel = amido e componentes de parede celular) são expressos em kBq m-2. Valores representam a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Plantas a pleno sol Plantas à sombra Frações
–N +N –N +N
Aniônica 60 ± 1,0 Ab 87 ± 1,0 Aa 58 ± 2,5 Ab 77 ± 1,4 Ba
Catiônica 79 ± 1,4 Ab 162 ± 4,8 Aa 69 ± 2,8 Ab 146 ± 3,4 Ba
Neutra 1202 ± 21,3 Ab 1833 ± 24,5 Aa 1111 ± 23,7 Bb 1724 ± 22,7 Ba
Insolúvel 139 ± 1,4 Aa 86 ± 1,0 Ab 98 ± 4,3 Ba 89 ± 1,6 Ab
Total 1480 ± 21,2 Ab 2168 ± 25,4 Aa 1337 ± 23,6 Bb 2036 ± 21,6 Ba
Os dados de fluxo metabólico (Tabela 4), obtidos sob condições ótimas de luz,
CO2 e temperatura, indicam que as plantas cultivadas a pleno sol exibiram maior
capacidade fotossintética (maior radioatividade total incorporada; 6-10%) quando
comparadas às plantas de sombra, a despeito de A ter sido ligeiramente, porém
significativamente, menor nas plantas ao sol. Verificou-se, ainda, que a capacidade
fotossintética potencial das plantas –N foi, em média, 33% menor que a das plantas +N
em fixar o 14CO2. Todavia, a partição de 14C para a síntese de amido foi maior nas
plantas –N (Tabela 4). Nessas plantas, pode ter ocorrido um desbalanço entre C e N, de
forma que grande parte do carbono fotossintético foi acumulada transientemente nas
folhas, sob a forma de amido primário, em vez de seguir para síntese de aminoácidos e
ácidos orgânicos, como deve ter ocorrido nas plantas suplementadas com N. Essa
hipótese pode ser confirmada pelo efeito inverso na síntese de açúcares solúveis, que foi
maior nas plantas suplementadas. Além disso, o NO3-, per se, pode diretamente afetar a
35
síntese de amido, por reprimir a atividade da pirofosforilase da ADP-glicose, mas não
da sintase da sacarose-fosfato, sugerindo que a síntese de amido poderia ser estimulada
sob baixos níveis de N (Stitt et al. 1989).
glic
ose
mm
ol k
g M
F-1
0,00
1,00
2,00
3,00
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5,00
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AaAaAa
Ab
Ab
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
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BaAbAa
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1,00
2,00
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5,00
0,00
40,00
80,00
120,00
160,00
Bb
Ab
AaAa
Aa
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+ N N + N N
frutose mm
ol kg M
F-1
amido m
mol kg
MF
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saca
rose
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g M
F-1
Figura 3: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a concentração de açúcares solúveis e amido em plantas de Coffea arabica L. As plantas foram cultivadas a pleno sol (colunas vazias) ou sob 50% de irradiância (colunas cheias). Cada coluna representa a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
3.3.3 – Fluorescência, fotoproteção e metabolismo antioxidativo
A razão Fv/Fm das plantas –N cultivadas a pleno sol foi menor que 0,75
(Figura 4), valor inferior ao mínimo encontrado nas plantas cultivadas à sombra, porém
semelhante ao valor apresentado por DaMatta et al. (1997) para cafeeiros avaliados no
inverno. Nas plantas –N, cultivadas a pleno sol, independentemente do horário de
avaliação, houve queda discreta (10%), porém significativa na razão Fv/Fm, fato não
observado entre as plantas +N e –N cultivadas à sombra (Figura 4). Possivelmente,
devido aos efeitos combinados das baixas temperaturas noturnas e altas irradiâncias
diurnas, valores de Fv/Fm inferiores a 0,65 foram observados nas plantas –N cultivadas a
pleno sol (Figura 4). Os menores valores de Fv/Fm reportados no inverno podem estar
relacionados à presença de um aceptor de elétrons parcialmente reduzido, possivelmente
devido à baixa mobilidade da plastoquinona sobre a membrana tilacoidial,
36
especialmente após noites frias seguidas de dias com altas irradiâncias (Havaux 1987;
Larcher & Neuner 1989), como acontece em Viçosa, no inverno. Ressalte-se, ainda, que
essa redução pode ter sido uma conseqüência, e não uma causa, da perda de capacidade
de assimilação do carbono, na medida em que menores taxas de fotossíntese
requereriam menos ATP e menos NADPH (Silva et al. 2004). Ressalte-se, também, que
decréscimos sustentados na razão Fv/Fm, no inverno, têm sido associados com a
retenção noturna de grandes quantidades de zeaxantina e anteraxantina, fato atribuído
aos efeitos inibitórios do frio sobre a enzima desepoxidase da violaxantina, que converte
a zeaxantina e anteraxantina a violaxantina, com a diminuição da irradiância (Demmig-
Adams & Adams III 1992; Demmig-Adams et al. 1996a). Neste estudo, o acúmulo
noturno de anteraxantina e zeaxantina (Tabelas 4 e 5) são evidências circunstanciais de
que o frio tenha afetado aquela enzima, fato suportado pela correlação negativa entre o
acúmulo de A+Z e a queda de Fv/Fm (r = -0,832 p
0,001; Figura 6a). Outras
evidências de que o frio, por inibir a desepoxidase da violaxantina, provoca diminuições
significativas na razão Fv/Fm também foram reportadas em outras espécies (Logan et al.
1998a; Verhoeven et al. 1997). Com efeito, a queda da razão Fv/Fm, associada com
elevação de F0, nas plantas cultivadas a pleno sol, porém mais marcantemente nas
plantas –N, pode ainda ser atribuído à fotoinativação do FSII, possivelmente associada à
degradação da proteína D1 (Martínez-Ferri et al. 2004; Ramalho et al. 2003), ou então a
um desacoplamento parcial e temporário entre as antenas e os centros de reação dos
fotossistemas (DaMatta & Maestri 1997). A persistência da fotoinativação do FSII nas
plantas –N, cultivadas a pleno sol, pode ser confirmada pela ausência de recuperação
do Fv/Fm na antemanhã. Em contraste, os maiores valores de Fv/Fm das plantas +N,
especialmente naquelas cultivadas à sombra, mostram que estas foram menos afetadas
pela imposição dos estresses, na medida em que exibiram recuperação da eficiência do
FSII (Figura 4), com maiores valores de P e menores de D e PE (Figura 5). (DaMatta et
al. 1997)As membranas tilacoidais das plantas aclimatadas às baixas irradiâncias
possuem uma grande concentração de pigmentos-antena associados aos centros de
reação dos fotossistemas e uma menor quantidade de componentes de transporte de
elétrons (Anderson 1986). A elevação na concentração de carotenóides e/ou uma
redução da concentração de clorofilas pode auxiliar as plantas a minimizar a
fotooxidação (Corcuera et al. 2005). Dessa forma, uma menor concentração de
clorofilas nas plantas cultivadas a pleno sol, sem alterações significativas nos níveis de
N nas folhas, fez reduzir a razão CHL/N nessas plantas, indicando que o decréscimo na
concentração de clorofilas não foi diretamente associado à disponibilidade de N. Nesse
37
contexto, a menor concentração de CHL pode ser considerada como um mecanismo de
ajuste entre a absorção e a utilização fotoquímica da luz. Portanto nas plantas cultivadas
a pleno sol, bem como naquelas deficientes em N, uma menor concentração de
clorofilas, e menor razão CHL/N, seria vantajoso, uma vez que diminuiria a absorção de
fótons, contribuindo, assim, na atenuação dos efeitos deletérios das altas irradiâncias
(Martínez-Ferri et al. 2004). Ademais, como A e Z também são capazes de dissipar o
excesso de luz absorvida, atenuando a formação de 1O2, o aumento do pool de
xantofilas, tanto em base de massa ou de CHL, e a conversão de V em A e Z (Tabelas 6
e 7) nas folhas das plantas –N, independentemente da irradiância, podem indicar maior
capacidade fotoprotetora (Logan et al. 1998a). Entretanto, a menor absorção de luz e a
fotoproteção associada ao ciclo das xantofilas não foram suficientes para evitar danos à
maquinaria fotossintética, visto que foram registrados, nas plantas cultivadas a pleno
sol, menores valores de Fv/Fm e maiores valores de F0 (Figura 4), além de maiores
concentrações de H2O2, MDA e maiores taxas de extravasamento de eletrólitos (Tabela
8; ver à frente).
50
90
130
170
210
50
90
130
170
210
F0
B
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
FF
vm
/
C
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
FF
vm
/
12:00 h 05:00 h
D
Aa*
Bb*
Ba*Ab*
F0
A
12:00 h 05:00 h
Aa
Bb
AaAa
Ab
Aa
Ab
Aa*Aa*
Ba*
Ba*
Aa
Plantas a pleno sol Plantas à sombra
Figura 4: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 mM; colunas pretas) e 23 mM; colunas cinzas) sobre a fluorescência basal (F0) e a eficiência fotoquímica máxima do FSII (Fv/Fm) em plantas de Coffea arabica L. As plantas foram cultivadas a pleno sol (A, C) ou sob 50% de sombreamento (B, D). Cada coluna representa a média ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística entre os horários, para um mesmo nível de nitrogênio e irradiância, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância estatística entre os níveis de nitrogênio, dentro de um mesmo horário e irradiância (teste t, p = 0,05) e asteríscos (*) denotam significância entre os níveis de irradiância (teste t, p = 0,001).
38
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Ab
A
Bb
Aa
Ba
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Ba
Aa
Bb
Ab
0,00
0,05
0,10
0,15
Ba
Aa
Ba
Aa
B
C
+ N N
+ N N
P
D
PE
Figura 5: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a fração da energia utilizada na fase fotoquímica da fotossíntese (A), da energia dissipada na forma de calor (B) e na energia não utilizada na fase fotoquímica e nem dissipada como calor (C), avaliadas em plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol (colunas vazias) ou sob 50% de irradiância (colunas cheias). Cada coluna representa a média ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Embora uma das principais respostas freqüentemente observadas em plantas
desenvolvidas à sombra seja o decréscimo da razão CHL a/b, neste trabalho (Tabela 5),
a exemplo de outros relatos em café (Chaves et al. 2008; Dias 2006; Fahl et al. 1994),
tal razão parece responder pouco ou nada às variações na irradiância. Ademais, houve
pequena ou nenhuma alteração na razão clorofilas/carotenóides entre plantas ao sol e
sob sombra, quando o padrão esperado de resposta seria um decréscimo relativo nessa
razão nas plantas à plena exposição solar, de modo a permitir-lhes uma maior
capacidade de dissipação da energia de excitação, principalmente via operação do ciclo
das xantofilas (Demmig-Adams & Adams III 1996; Ma et al. 2003). Por outro lado,
verificou-se, uma queda, da antemanhã para o meio-dia, da concentração de CHL, com
a elevação da irradiância, fato também relatado em outros estudos (Corcuera et al. 2005;
Martínez-Ferri et al. 2004), o que poderia auxiliar na redução da absortância foliar nas
horas de maior elevação solar.
39
Tanto em base de CHL como em base de massa, independentemente dos
tratamentos e dos horários de avaliação, a luteína foi o principal carotenóide acumulado
nas plantas (em média 41,3% na antemanhã e 38% ao meio-dia) (Figura 7). O teor dos
demais carotenóides variou, de forma que a violaxantina foi o segundo principal
carotenóide na antemanhã (20%) e o de menor acúmulo ao meio-dia (3,9%). Com a
elevação da irradiância, a zeaxantina tomou lugar de destaque, passando da quinta para
a segunda colocação (6,4% e 24% na antemanhã e meio-dia, respectivamente).
A posição dos demais carotenóides variou pouco, mas dentre estes pode-se destacar o
-caroteno, com acúmulo relativo de 5,7 e 9,9% na antemanhã e ao meio-dia,
respectivamente. Em base de CHL, a concentração de anteraxantina, luteína, zeaxantina
e -caroteno foi maior nas plantas –N em comparação às +N, especialmente nas plantas
expostas a pleno sol, as quais apresentaram menor razão / -caroteno devido à queda
mais acentuada nos níveis de -caroteno que nos de -caroteno (Tabela 6).
Tais resultados confirmam o papel da luteína, zeaxantina e do -caroteno como os
principais carotenóides envolvidos na dissipação térmica da energia radiante e estão em
consonância com os dados apresentados para o gênero Coffea (Ramalho et al. 2003) ou
mesmo para outras espécies lenhosas (Corcuera et al. 2005; Demmig-Adams et al.
1996b; Valladares et al. 2000). Ressalte-se, também, que as correlações da razão Fv/Fm
com as concentrações de zeaxantina (r = -0,674) e de zeaxantina mais anteraxantina (r =
-0,832) na antemanhã (Figura 6a) sugerem que o acúmulo noturno desses carotenóides
deve ter papel de destaque na queda da razão Fv/Fm. Resultados semelhantes foram
também reportados em Vitis labrusca (Chen & Chen 2003), em Mahonia repens (Logan
et al. 1998b) e em outras espécies herbáceas (Logan et al. 1998a). Apesar de o frio ter
causado danos aos fotossistemas, fato evidenciado pelas variações em Fv/Fm e F0
(Figura 4), os maiores conteúdos absolutos de carotenóides em base de massa, incluindo
aqueles do ciclo das xantofilas, especialmente nas plantas +N cultivadas à sombra
(Tabela 5 e 7), traduziu-se-lhes, possivelmente, em maior capacidade de dissipar a
radiação excessiva. Como conseqüência, a formação de H2O2, MDA e extravasamento
de eletrólitos (Tabela 8) foram reduzidos. Saliente-se, também, que houve uma
correlação positiva entre a concentração de N e a razão Fv/Fm (Figura 6b), o que sugere
que a manutenção de elevada eficiência fotoquímica do FSII pode ser altamente
dependente da disponibilidade de N.
40
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0,60 0,65 0,70 0,75 0,80
Fv/Fm
A
+
Z
(chl
)
A
0,85 0,90
BN
Fv/Fm0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
15
18
21
24
27
30
33
36
Figura 6: Correlações de Pearson entre a concentração (em base de clorofila) de anteraxantina + zeaxantina (A + Z) e a razão entre as fluorescências variável e máxima (Fv/Fm) (r = -0,832, p = 0,001) (A) e entre a concentração foliar de N e a razão Fv/Fm (r = 0,596, p = 0,001) (B), em plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol e sob 50% de irradiância. Os dados foram obtidos na antemanhã.
Tabela 5: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre o conteúdo foliar de clorofilas e carotenos em plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Valores representam a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística entre os horários, para um mesmo nível de nitrogênio e irradiância, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância estatística entre os níveis de nitrogênio, dentro de um mesmo horário e irradiância (teste t, p = 0,05); asteríscos (*) denotam significância entre os níveis de irradiância (teste t, p = 0,001).
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Características 05:00 h 12:00 h
05:00 h 12:00 h
-N +N -N +N
-N +N -N +N
CHL (a + b) (g kg-1 MF)
1,65 Ab
3,37 Aa
1,03 Bb
2,56 Ba
1,79 Ab*
4,02 Aa*
1,62 Ab*
3,82 Aa*
CHL (a / b) (g kg-1 MF)
2,61 Aa
2,67 Aa
2,83 Aa
2,55 Aa
2,61 Aa
2,61 Aa
2,88 Aa
2,63 Aa
CHL / Carot. (g kg-1 MF)
2,60 Aa
2,96 Aa
2,23 Aa
2,95 Aa
2,88 Aa
3,08 Aa
2,97 Aa
3,21 Aa
CHL / N (mg kg-1)
80,48 Aa
125,35
Aa 50,42 Bb
75,90 Aa
99,15 Ab*
133,26 Aa*
81,12 Ab*
99,15 Aa*
Carot. / N (mg kg-1)
18,90 Aa
25,23 Aa
13,36 Ba
16,70 Aa
25,02 Aa*
28,70 Aa*
21,02 Aa*
20,89 Aa*
Carotenóides totais (g kg-1 MF)
0,42 Ab
0,71 Aa
0,29 Bb
0,53 Ba
0,52 Ab
0,87 Aa
0,35 Bb
0,79 Aa
41
Tabela 6: Conteúdo foliar de xantofilas e carotenos em plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância em 0 e 23 mM de N. Os valores são expressos em g kg-1 de clorofila e representam a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística entre os horários, para um mesmo nível de nitrogênio e irradiância, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância estatística entre os níveis de nitrogênio, dentro de um mesmo horário e irradiância (teste t, p = 0,05); asteríscos (*) denotam significância entre os níveis de irradiância (teste t, p = 0,001).
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Características
05:00 h 12:00 h 05:00 h 12:00 h
-N +N -N +N
-N +N -N +N
Neoxantina 32,8 Aa 34,8 Aa 28,4 Aa 34,5 Aa 56,1 Aa* 37,3 Ab* 32,4 Ba* 34,6 Aa*
Violaxantina 52,8 Aa 40,5 Ab 5,4 Ba 7,3 Ba
72,5 Aa 43,2 Ab 5,0 Bb 16,7 Ba
Anteraxantina 30,6 Aa 20,4 Aa 23,6 Aa 9,5 Bb
40,6 Aa 14,1 Ab 13,0 Ba 13,8 Aa
Luteína 97,2 Aa 91,9 Aa 114,1 Aa 92,5 Aa
157,8 Aa 93,1 Ab 85,6 Ba 79,3 Aa
Zeaxantina 20,4 Ba* 12,4 Ba* 116,8 Aa*
54,2 Ab*
37,0 Aa 7,9 Bb 52,2 Aa 31,4 Aa
-Caroteno 4,5 Aa 4,4 Ba 6,2 Aa 8,7 Aa
4,5 Ba* 5,6 Ba* 9,3 Ab* 12,9 Aa*
-Caroteno 17,1 Ba 11,2 Ba 30,1 Aa 18,0 Ab
14,1 Ba 13,0 Ba 23,8 Aa 21,7 Aa
-Caroteno 0,28 Ab 0,40 Aa 0,21 Ab 0,54 Aa
0,32 Ab* 0,44 Ba* 0,40 Ab* 0,60 Aa*
V + A + Z 103,8 Aa
73,4 Aa 145,7 Aa 70,9 Ab
150,1 Aa 65,1 Ab 70,2 Ba 61,8 Aa
A + Z 50,9 Ba* 32,9 Bb* 140,3 Aa*
63,6 Ab*
77,5 Aa 21,9 Ab 65,2 Aa 45,1 Ab
DEPS 0,33 Ba 0,28 Ba 0,87 Aa 0,78 Aa
0,36 Ba 0,20 Bb 0,84 Aa 0,62 Ab
0
Acú
mul
o re
lativ
o (%
)
A
-caroteno-carotenoZeaxantinaLuteínaAnteraxantinaNeoxantinaViolaxantina
20
40
60
80
100B
0
Acúm
ulo relativo (%)
20
40
60
80
100
+ Nplantas à sombra plantas a pleno sol plantas à sombra plantas a pleno sol
N N + N N + N N + N
Figura 7: Acúmulo relativo de carotenóides do ciclo das xantofilas, -caroteno e -caroteno em plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância em 0 ou 23 mM de N. Os dados foram avaliados na antemanhã (A) e ao meio-dia (B). Cada porção de coluna representa a média de seis repetições.
42
Tabela 7: Conteúdo foliar de xantofilas e carotenos em plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância em 0 e 23 mM de N. Os valores são expressos em mg kg-1
MF e representam a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística entre os horários, para um mesmo nível de nitrogênio e irradiância, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância estatística entre os níveis de nitrogênio, dentro de um mesmo horário e irradiância (teste t, p = 0,05); asteríscos (*) denotam significância entre os níveis de irradiância (teste t, p = 0,001).
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Características
05:00 h 12:00 h 05:00 h 12:00 h
-N +N -N +N
-N +N -N +N
Neoxantina 55,4 Ab 114,5 Aa 29,6 Bb 87,9 Ba 73,4 Ab* 152,2 Aa*
51,6 Bb* 129,0 Ba*
Violaxantina 90,1 Ab 134,8 Aa 5,4 Bb 18,6 Ba
100,1 Ab* 176,4 Aa*
8,0 Bb* 62,7 Ba*
Anteraxantina 48,3 Aa 65,7 Aa 19,8 Ba 24,2 Ba
51,8 Aa 56,9 Aa 20,6 Bb 53,2 Aa
Luteína 162,9 Ab
301,3 Aa 104,9 Bb 235,7 Ba
211,9 Ab* 379,9 Aa*
136,1 Bb*
298,0 Ba*
Zeaxantina 32,4 Ba 39,9 Ba 96,8 Aa 137,4 Aa
47,1 Aa 31,8 Bb 83,0 Aa 121,1 Aa
-Caroteno 7,6 Ab 14,5 Aa 6,5 Ab 21,4 Aa
7,5 Bb* 23,0 Ba* 14,5 Ab* 45,6 Aa*
-Caroteno 27,1 Aa 36,7 Aa 29,7 Ab 44,5 Aa
22,9 Bb* 52,8 Ba* 37,2 Ab* 80,1 Aa*
-Caroteno 0,28 Aa 0,40 Aa 0,21 Ab 0,54 Aa
0,32 Ab* 0,44 Ba* 0,40 Ab* 0,60 Aa*
V + A + Z 170,8 Ab
240,4 Aa 122,0 Ab 180,2 Ba
198,9 Ab 265,1 Aa 111,5 Bb 237,0 Aa
DEPS 0,33 Ba 0,28 Ba 0,87 Aa 0,78 Aa
0,36 Ba 0,20 Bb 0,84 Aa 0,62 Ab
Avaliaram-se quatro enzimas importantes na remoção de EROs. Enquanto a
SOD e a GR são distribuídas em vários compartimentos celulares (e.g. mitocôndria,
cloroplasto) a APX é tipicamente cloroplastídica (Bray et al. 2000), enquanto a CAT se
restringe basicamente aos peroxissomos (Buchanan & Wolosiuk 2006). As atividades
da SOD e da GR não foram significativamente afetadas pelos tratamentos. Por outro
lado, a atividade da APX foi significativamente menor nas plantas –N, especialmente à
sombra, em relação às plantas +N, enquanto a atividade da CAT foi menor nas plantas à
sombra em relação às plantas a pleno sol, independentemente da nutrição nitrogenada
(Figura 8). Registre-se que a CAT é a principal enzima responsável pela remoção de
H2O2 produzido na fotorrespiração (Buchanan & Wolosiuk 2006) e, portanto, sua maior
atividade a pleno sol (~23%) pode ser tomada como evidência indireta do aumento da
fotorrespiração a pleno sol, reforçando a sugestão feita anteriormente de que maiores
atividades de GS, a pleno sol, também estaria associada com diferenças na magnitude
da fotorrespiração. Nas plantas –N, a redução da atividade da APX sem alterações na
atividade da SOD pode ter acarretado maior acúmulo de H2O2 nessas plantas, fato
circunstancialmente suportado pela relação negativa (-0,845 p 0,001) entre a atividade
da APX e a concentração de H2O2. De modo oposto, a maior atividade da APX nas
plantas +N pode estar associada à uma maior capacidade de metabolizar EROs,
conforme sugerido para Mahonia repens (Logan et al. 1998b). Considerando-se os
43
Tabela 8: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), aldeído malônico (MDA) e extravasamento de eletrólitos em plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Médias ± EP (n = 7). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Plantas a pleno sol Plantas à sombra Características
–N +N –N +N
H2O2 (mmol kg-1 MS) 6,38 ± 0,25 Aa 2,61 ± 0,09 Ab 3,84 ± 0,10 Ba 0,67 ± 0,05 Bb
Aldeído malônico ( mol kg-1 MS)
186,3 ± 7,5 Aa 96,7 ± 3,4 Ab 190,7 ± 19,4 Aa 79,0 ± 3,6 Ab
Extravasamento de eletrólitos (%) 6,14 ± 0,60 Aa 2,44 ± 0,17 Ab 6,06 ± 0,41 Aa 2,83 ± 0,23 Ab
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Aa
Aa
AaAa
0
20
40
60
80
100
Bb
Ab
AaAa
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
Ba
Aa
Ba
Aa
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0AaAa
AaAa
SO
D U
g
MF
-1
AP
X U
g M
F-1
GR
U g
MF
-1
CAT
U g
M
F-1
N
+ N
N
+ N
Figura 8: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a atividade da dismutase do superóxido (SOD), peroxidase do ascorbato (APX), catalase (CAT) e redutase da glutationa (GR) em plantas de Coffea arabica L. As plantas foram cultivadas a pleno sol (colunas vnt
s ) v oaa
as
44
plantas desenvolvidas sob altas irradiâncias, conforme já sugerido em café (Ramalho et
al. 2000) e também para outras espécies (Chen & Chen 2003; Logan et al. 1998a). Em
todo o caso, sugere-se, aqui, que a maior atividade da APX, associada à maior
disponibilidade de N, tenha papel de destaque na fotoproteção das plantas +N.
45
3.4 – Síntese dos principais resultados e conclusões
Níveis mais elevados de N, nas plantas suplementadas, promoveu maior síntese
de aminoácidos e proteínas solúveis totais nessas plantas, fato associado, pelo menos em
parte, à maior atividade da GS.
As baixas temperaturas noturnas, aliadas às altas irradiâncias, especialmente
nas plantas cultivadas a pleno sol, afetaram significativamente a assimilação líquida de
carbono, devido, principalmente, a limitações difusivas. Nas plantas cultivadas à
sombra, todavia, reportaram-se taxas fotossintéticas significativamente maiores quando
comparadas às plantas de sol. A capacidade fotossintética potencial, entretanto, foi
maior nas plantas a pleno sol, bem como nas +N. Isso demonstra que os efeitos
positivos da nutrição nitrogenada sobre a fotossíntese, in situ, devem ter sido
aparentemente atenuados pelas resistências difusivas impostas, presumivelmente, pelas
baixas temperaturas noturnas.
As plantas –N apresentaram folhas amareladas, i.e., mostraram menor
concentração de clorofilas (Tabela 5; Apêndice 1), com redução ainda mais pronunciada
nas plantas cultivadas a pleno sol. Nessas plantas, ocorreu menor concentração de
carotenóides, em base de massa, e menor atividade da APX, fatos possivelmente
associados ao acúmulo mais pronunciado de H2O2, que pode ter acarretado danos às
membranas cloroplastídicas. Por outro lado, as plantas +N apresentaram maiores
concentrações de clorofilas e carotenóides, fato que contribuiu para a elevação de
P (31%) e queda de D (18,5%), de forma ainda mais pronunciada nas plantas cultivadas
à sombra. Em todo o caso, verificou-se que a aclimatação do cafeeiro a pleno sol
envolve uma combinação entre a menor absorção de luz (devido à diminuição da
concentração de clorofila) e um aumento da dissipação térmica nas antenas dos
fotossistemas. Nas plantas cultivadas a pleno sol, houve maior atividade da CAT, apesar
da ocorrência de fotoinibição crônica. Tal fato, associado com a maior atividade da GS,
são indícios circunstanciais de maior atividade fotorrespiratória das plantas cultivadas a
pleno sol, que levaria a um maior consumo de poder redutor, menor impacto sobre os
fotossistemas e maior capacidade fotoprotetora. Em todo o caso, a aclimatação da
maquinaria fotossintética a condições de plena irradiância é fortemente dependente da
disponibilidade de N. Estes resultados explicam, pelo menos em parte, as altas
exigências em N pelo cafeeiro quando cultivado a pleno sol, apesar de suas baixas taxas
de fotossíntese e de eficiência fotossintética do uso desse elemento.
46
2.5 – Literatura citada
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51
IV. CHAPTER III
Allometric models for non-destructive leaf area estimation in coffee
(Coffea arabica and C. canephora)1
W.C. Antunes2, M.F. Pompelli2, D.M. Carretero2 & F.M. DaMatta2
1 Manuscript in press to publication in Annals of Applied Biology, 2008 2 Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa, 36570-000 Viçosa, MG, Brasil
Correspondence
F.M. DaMatta, Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa,
36570-000 Viçosa, MG, Brasil
E-mail: [email protected]
Running title: Leaf area estimation in coffee
4.1 – Abstract
We aimed to evaluate the currently used allometric models, as well as to propose a reliable and accurate model using non-destructive measurements of leaf length and/or width, for estimating the area of leaves of eight field-grown coffee cultivars. For model construction, a total of 1,563 leaves were randomly selected from different levels of the tree canopies and encompassed the full spectrum of measurable leaf sizes (0.3 to 263 cm2) for each genotype. Power models better fit coffee leaf area than linear models. To validate the model, an independent data set of 388 leaves was used. We demonstrated that the currently used allometric models are biased, underestimating the area of a coffee leaf. We developed a single power model (Y = ß0X
ß1) based on two leaf dimensions [Leaf area = 0.6626(Length x Width)1.0116; standard errors: ß0 = 0.0064, ß1 = 0.0019; R2 = 0.996] with high precision and accuracy, random dispersion pattern of residuals and also unbiased, irrespective of cultivar and leaf size and shape. Even when the length (but not width) alone was used as the single leaf dimension, the power model developed still predicted with good accuracy the leaf area, but at the expense of some loss of precision, as particularly found for 8% of the leaves sampled with length-to-width ratios below 2.0 or above 3.0.
Keywords: Coffea arabica, Coffea canephora, estimating model
52
4.2 – Introduction
Among 103 species of the Coffea genus (Davies et al. 2006), Coffea arabica L.
(arabica coffee) and C. canephora Pierre ex Froehner (robusta coffee) dominate the
world coffee trade, being responsible for about 65% and 35%, respectively, of world
coffee production. Coffee is one of the most important commodities in international
agricultural trade, generating over US$ 90 billion each year and involving about 500
million people in its management, from cultivation to final product for consumption.
It is currently grown in some 80 countries in four continents. Brazil is the world’s
largest coffee producer, followed alternately by Colombia and Vietnam. Many African
countries including Uganda, Burundi, Rwanda and Ethiopia have coffee as their main
source of foreign exchange (DaMatta & Ramalho 2006).
Leaf area (LA) is a key variable for most agronomic and physiological studies
involving plant growth, light interception, photosynthetic efficiency, evapotranspiration,
and responses to fertilisers and irrigation (Blanco & Folegatti 2005). Therefore, LA
strongly influences crop growth and productivity and estimation of LA is a fundamental
component of crop growth models (Lizaso et al. 2003). However, the measurement of
the surface area of a large number of leaves is often costly, time-consuming and
destructive. A modelling approach involving linear relationships between LA and one or
more dimensions of the leaf is an inexpensive, rapid, reliable, and a non-destructive
alternative for accurately measuring LA (Lu et al. 2004; Williams III & Martinson
2003). However, in many studies the adequacy of the model assumptions for estimating
LA has not been carefully examined. In this regard, small or minor violations of the
underlying assumptions can invalidate the inferences drawn from the analysis in a major
way. A simple and effective method for detecting model deficiencies in regression
analysis is the examination of residual plots. Residual analysis may lead to suggestions
of structure or point to information in data that might be missed or overlooked if the
analysis is based only on summary statistics (Chatterjee & Hadi 2006).
The most commonly used method employing leaf dimensions for estimating
the area of a coffee leaf was proposed by Barros et al. (1973). They obtained a linear
model without intercept in which the LA (dependent variable) can be calculated as the
product of the leaf length (L) and width (W) (independent variables) multiplied by a K
coefficient (0.667). Other two similar equations [LA = 0.63LW, with the K coefficient
derived as the ratio of LA to the product of L and W (Awantramani & Gopalakrishna
1965); and LA = 0.220 + 0.649 LW, with coefficients estimated using least square
linear regression analysis (Rey & Alvarez 1991)] were also proposed for estimating the
53
area of a coffee leaf. However, these equations have been chosen based only on values
obtained for the coefficient of determination (R2) and the standard error of estimates,
without assessing their accuracy. In fact, Tavares-Júnior et al. (2002), confronting the
method of Barros et al. (1973) against a standard method for measuring LA, found that
it was biased, significantly underestimating the true leaf area. In addition, these models
were just developed for a single arabica coffee genotype, and hence no information is
available on whether or not such models can be successfully extrapolated to other coffee
genotypes. From the a.09765 0 0 -0.09765 379p9 Tm(0)Tj0.09765 0 0 -0.090.09765 0 0 -0.09765 3790 30.09765r9 1819 Tm(l)Tj0.09765 0 0 -07i
, 3250.09765 0 0 -0.09765 4429 2854 Tm(e)Tj( )100.09765 0 0 -0.09765 2608 3544 Tm( )Tj0.09765 0i0 -0.09765 4552 2509 Tm(e)T40.09765 0 0 -0.09765 4676 2854 Tm(r)9j0.09765 0 0 -0.09765 2419 3544 Tm(489j0.09765 0 0 -0.09765 4374 2854 Tm(l9550.09765 0 0 -0.09765 3516 3544 Tm(e)Tj(51400.09765 0 0 -0.09765 3701 3544 Tm(52290.09765 0 0 -0.09765 2063 3544 Tm(c)T90.09765 0 0 -0.09765 5760 2164 Tm(d)Tj( 5250.09765 0 0 -0.09765 5804 2509 Tm(r5920.09765 0i0 -0.09765 4552 2509 Tm(e)Tj0.09765 0g9765 5600 2509 Tm(e)Tj( )T765 0 0 -0.09765 379p9 Tm(0)Tj0.09758T765 0 0 -0.r9765 5760 2164 Tm(d)Tj( )T465 0 0 -0.09765 379p9 Tm(0)Tj0.09760T465 0 0 -0.u0 -0.09765 6029 1474 Tm(a)T40.09765 0 0 -0.09765 2608 3544 Tm(61920.09765 0l0 -0.09765 6189 2854 Tm(t)T80.09765 0 0 -0.09765 6353 2509 Tm(f)Tj( )T40.09765 0 0 -0.09765 6189 2854 Tm(t)Tj765r9 1819 Tm(l)Tj0.09765 0 0 -076)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2608 3544 Tm(66660.09765 0 0 -0.09765 6189 2854 Tm(t721765r9 1819 Tm(l)Tj0.09765 0 0 -0768100.09765 0 0 -0.09765 6841 2854 Tm(d)Tj( )060.09765 0 0 -0.09765 3701 3544 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -0.09765 7299 2854 Tm(c)Tj0.09765 0 0 -0.09765 7299 2854 Tm(c)Tj5 0 0 -0.u0 -0.09765 6029 1474 Tm(73Tj5 0 0 -0. 0 -0.09765 7378 2164 Tm(r)T00.09765 0 0 -0.09765 3701 3544 Tm(75280.09765 0 0 -0.09765 6189 2854 Tm(75840.09765 0 0 -0.09765 3516 3544 Tm(e)Tj(77690.09765 0 0 -0.09765 4676 2854 Tm(792j0.09765 0 0 -0.09765 2163 3544 Tm(802j0.09765 0 0 -0.09765 8639 2509 Tm(d12j0.09765 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(e)120.09765 0l0 -0.09765 8237 2509 Tm(e)Tj( )640.09765 0 0 -0.09765 7970 2854 Tm(f)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2163 3544 Tm(85Tj0.09765 0r0 -0.09765 8501 2164 Tm(d)Tj( )940.09765 0L0 -0.09765 8716 2164 Tm(h)T765 0 0 -0.A0 -0.09765 8883 2854 Tm(s)Tj( )Tj/F1 2048 Tf0)Tj65 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(a)Tj0)Tj65 0s9765 1930 2509 Tm(t)Tj( )T10)Tj65 0 0 -0.09765 2263 3544 Tm(t)Tj0)Tj65 0 0 -0.09765 2516 2509 Tm(i15j0)Tj65 0 0 -0.09765 1874 2164 Tm(m30j0)Tj65 0 0 -0.09765 2572 2509 Tm(a3960)Tj65 0 0 -0.09765 2263 3544 Tm(t4520)Tj65 0 0 -0.09765 2516 2509 Tm(i5Tj0)Tj65 0o0 -0.09765 2519 3544 Tm(e)Tj0)Tj65 0n0 -0.09765 2632 2164 Tm(f)Tj( )830)Tj65 0o0 -0.09765 2519 3544 Tm(e)Tj0)Tj65 0f0 -0.09765 2927 2509 Tm(,)Tj( )230)Tj65 0c0 -0.09765 3037 2509 Tm(s)T20)Tj65 0o0 -0.09765 2519 3544 Tm(321j0)Tj65 0f0 -0.09765 3171 2509 Tm(g)T90)Tj65 0f0 -0.09765 3171 2509 Tm(g)Tj0)Tj65 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(343f0)Tj65 0 0 -0.09765 3412 2854 Tm(d)Tj( )980)Tj65 0 0 -0.09765 2516 2509 Tm(36540)Tj65 0s9765.09765 3671 1819 Tm(r)Tj( )T70)Tj65 0n0 -0 379p9 Tm(0)Tj0.09765T70)Tj65 0 0 -0.09765 3874 1474 Tm(e)960)Tj65 0 0 -0.09765 3986 1819 Tm(c)8j0)Tj65 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(i)Tj0t42520
44180e
y. 7100f4
h10j051Tj0d 53930u5490
ed
d613j0
68 T0
62 T0a3 T0d6629066840
68380
6
n
715j0n 3330
775220
7a6T078560
791j0
e 0760
81320
e 3950
84840
u5840o
880600
s s
54
individual leaf (taken as a reference) was measured with an area meter
(Area Measurement System, Delta-T Devices, Cambridge, UK).
Several linear and non-linear regression models between L and W dimensions
and LA were run for each genotype. Equality of a set of linear regression models among
genotypes was examined using the test for model identity (slopes and intercepts)
described by Graybill (2000). Here, we present only linear and power relationships
since they better fit coffee LA than other tested models. When power models
(Y = ßoXß1) were used, both dependent and independent variables were subjected to
logarithmic transformation before analysis. To compare the estimated LA with the
observed LA graphical procedures described by Graybill (2000) were adopted.
Statistical criteria for model selection were based on the F test, coefficient of
determination, standard error of estimates, and dispersion pattern of residuals. These
criteria allowed us to evaluate the occurrence of bias, and model precision and accuracy.
In this regard, bias denotes the statistical difference between a population mean or test
results and an accepted reference or true value, accuracy represents the overall distance
between the estimated (or observed) value and the true value, and precision denotes the
variation among individual measurements (variance) (see further details in Walther &
Moore 2005). (Graybill 2000; Walther & Moore 2005)
All the statistical analyses were performed using the software Statistica version
7.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA), DataFit version 8.0.32 (Oakdale Engineering, Oakdale,
PA, USA) and Minitab 14 (Minitab Inc, State College, PA, USA).
4.4 – Results
Separate regression models that estimate LA from L, W, and the L-W product
did not differ significantly (a = 0.05) among genotypes for the L-W power model we
developed (Table 1) and for the other power models (Table 2). Therefore, data for these
genotypes were pooled and single regression models were fitted to the combined data.
The coefficient of determination adjusted for the degrees of freedom (Ra2) for all tested
models was highly significant, exceeding 97.5% (Table 2). Noteworthy, the linear
models without (LA = 0.667 LW) and with (LA = 0.220 + 0.649 LW) intercept
respectively developed by Barros et al. (1973) and by Rey & Alvarez (1991) showed
good precision (low SE; Table 2) but were biased (-0.051 and -0.074, respectively,
p = 0.0001), leading to a significant underestimation of LA (Fig. 1). The linear model
(LA = 0.701 LW) we developed had also good precision, but its bias (0.002, p = 0.0001)
55
led to an overestimation of LA (Fig. 1). It is also worth noting that the model assuming
an elliptical shape of leaves failed to adequately predict LA, that is, it also led to an
overestimation of LA (data not shown) probably because coffee leaves are not perfectly
elliptical.
The biased model LA = 0.701 LW was modified by introducing a constant ßo
(-0.527). Compared with this model, the modified model (LA = -0.527 + 0.706 LW)
showed similar and high Ra2 value, but was more precise and accurate and unbiased
(Table 2, Fig. 2A). Nonetheless, the dispersion pattern of residuals did not follow a
normal distribution (i.e. a heteroscedastic behaviour) when the L-W product approaches
zero (Fig. 2A, inset). This feature translates into underestimation of LA, especially for
small leaves with L < 5 cm or W < 2 cm (relative errors of 60%).
The best estimation of the area of a coffee leaf could be obtained through the
power model LA = 0.6626(LW)1.0116. This model, in addition to showing high Ra2,
accuracy and precision, and lack of bias (Table 2, Fig. 1, Fig. 2B), could also rigorously
estimate LA regardless of leaf dimensions (Fig. 2B, inset, Fig. 3). The reduction of
estimation errors was manifested through the increasing Fcalc and the decreasing sum of
residual squares as compared with the linear regression models (Table 2).
A simplification of the L-W power model was tested by taking a single-leaf
dimension (Fig. 4A), either L (LA = 0.2132L2.1176) or W (LA = 2.1125W1.8643)
(Table 2). When developing such a model, we noted that the residual scatter plot had a
heteroscedastic behaviour (shown for L in Fig. 4B, but also valid for W, data not
shown). In this context, the ordinary least square method for estimating the model
coefficients cannot be reliably used unless corrective action for removing
heteroscedascity needs to be adopted (Chatterjee & Hadi 2006). This was done by
logarithmic transformation of data resulting in residual scatter plot with random mean
and variance distribution (Fig. 4C). The developed power models based on single-
dimension factors, when compared with the L-W power model, showed a slight
decrease in Ra2 and lower precision, but with similar accuracy (Table 2, Fig. 1).
In fact, the LA estimated by the power models strongly agreed with the observed values,
with R2 = 0.977, 0.982, and 0.996, respectively for L, W, and L-W models (Fig. 5).
In the model validation analysis, the 0 and 1 coefficients were compared by
using the calibration and validation data sets. As shown in Fig. 6, the predictive power
of the L and L-W models performed well whereas the W model failed to adequately
predict the area of an individual leaf.
57
crops like black pepper (Kandiannan et al. 2002), grapevine (Williams III & Martinson
2003), and dwarf coconut tree (Sousa et al. 2005).
Differences in leaf shape may occur even within individuals, as found in Salix
viminalis (Verwijst & Wen 1996). In the current study, however, we did not find
consistent differences in leaf shape (as judged from the L/W ratio; Verwijst & Wen
1996) within and between coffee species (data not shown). In contrast, random
differences in leaf shape among the sampled leaves were detected. Whereas caution
must be exercised when using the L model for estimating the area of leaves with L/W
ratios below 2.0 or above 3.0, the L-W power model allowed reliable LA estimations
regardless of differences in leaf shape (Fig. 3). Nonetheless, bearing that limitation in
mind, the single-leaf dimension power model incorporating L may be an interesting
option since it requires measurement of only one leaf dimension, thus simplifying
measurement procedures (Williams III & Martinson 2003), an important aspect
specially in field when a large number of leaves has to be monitored. Furthermore,
when using the L model there is obviously no need to measure W, which is not as easily
gauged as L because the need of considering an imaginary perpendicular line to the leaf
L and also because fully expanded coffee leaves are not always perfectly flat. These
facts must be judiciously considered when measuring W to obtain reliable LA
estimations using the L-W model.
In conclusion, we developed simple predictive models to accurately estimate
the area of leaves for all the genotypes we investigated, including the most widely
grown cultivars of both arabica and robusta coffee in Brazil. Power models better fit
coffee LA than linear models, and thus the earlier proposed models should be avoided
for LA estimation. Compared with the L-W power model, the L-based model also
allowed reliable LA estimations, but at the expense of some loss of precision, as
particularly found for 8% of the sampled leaves (2.0 < L/W ratio < 3.0). In contrast,
irrespective of cultivar and leaf developmental stages and shapes, we demonstrated that
the L-W power model is an excellent and non-destructive tool for studying leaf growth
and development in coffee.
4.6 – Acknowledgements
Scholarships granted by the Brazilian Government (W.C. Antunes and
M.F. Pompelli – CNPq, and D.M. Carretero – CAPES) are gratefully acknowledged.
Special thanks are due to Mr. Geraldo de Jesus for his assistance in the selection of
leaves in Germplasm Bank of the Federal University of Viçosa. This study was partially
58
funded by the Minas Gerais State Research Foundation, Brazil (Grant CAG APQ-3995-
3.08/7).
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59
Table 1.
Analysis of variance (ANOVA) for model (Y = ßoXß1) identity test, in which X is the product of
length and width. Both dependent and independent variables were log-transformed before analysis. Data derived from the calibration data set (n = 1,563 leaves). Source of variation (SV), degrees of freedom (DF), sum of squares (SS), mean squares (MS), and calculated F (Fcalc).
SV DF SS MS Fcalc
Parameters (16) (3,377.2199)
- Reduction (ß’s)
2 3,377.1977 - Reduction (Ho)
14 0.0222 0.00159 1.26 Residual 1,546 1.9518 0.00126 Total 1,562 3,379.1717
F5%(14,8) = 1.69
60
Table 2.
Statistical models, regression coefficients, standard errors of estimates (SE), coefficients of determination adjusted for the degrees of freedom (Ra
2), degrees of freedom of residuals (R-DF), residual sum of squares (R-SS) and calculated F (Fcalc) and equations of leaf area as a function of linear dimensions of leaves (length, L, and width, W) of diverse coffee genotypes.
Model Coefficients SE Ra2 R-DF R-SS F calc Estimative of LA (Y)
Y# = ß1x + ei ß1 = 0.667 - 0.9889 430 - - Y = 0.667*L*W
ßo = 0.2197ß1 = 0.649
Y = ß1x + ei ß1 = 0.70125 0.000797 0.9957 1,562 9,855.56 360,018.6 Y = 0.70125*L*Wßo = -0.52665 0.001165ß1 = 0.70604 0.094246ßo = 0.66256 0.006137ß1 = 1.01156 0.001871ßo = 0.21318 0.005606ß1 = 2.11756 0.009113ßo = 2.11246 0.030150ß1 = 1.86425 0.006936
Y = ßoxß1ei 0.9833 1,561 38,076.51 91,018.5 Y = 2.11246*W1.86425
Y = ßoxß1ei 0.9781 1,561 49,827.86 69,044.8 Y = 0.21318*L2.11756
Y = ßoxß1ei 0.9959 1,561 9,615.62 368,800.9 Y = 0.66256*(L*W)1.01156
Y = 0.2197 + 0.649*L*W
Y = ßo + ß1x + ei 0.9958 1,561 9,659.45 367,120.6 Y = -0.52665 + 0.70604*L*W
Y## = ßo + ß1x + ei - 0.9425 878 - -
# Barros et al. (1973)
## Rey & Alvarez (1991)
61
Figure legends
Figure 1. Statistical analysis of the deviation of the estimated area from the observed area for an individual leaf. Leaf area for coffee was estimated using several models in which 0 and 1 are coefficients. Vertical bars denote means, and spreads denote 95% confidence intervals of the difference. L = length; W = width. See further details in the text.
Figure 2. The relationship between estimated leaf area and leaf dimensions (L, length; W, width) for eight coffee genotypes using a linear (A) and a power (B) model. The initial portion of analysis of dispersion pattern of residuals for the respective models is shown in the insets. Arrow indicates an underestimated area for small leaves when using the linear model (A – inset).
Figure 3. Difference between the real leaf area and the calculated leaf area for the different models and classes of length-to-width (L/W) ratio. Vertical bars denote means, and spreads denote 95% confidence intervals. Statistical differences (p = 0.05, t test) are denoted by asterisks.
Figure 4. The relationship between estimated leaf area and leaf length (L) for eight coffee genotypes using a power model (A). Symbols as in Figure 11. In the insets, dispersion pattern of residuals relative to the model Y = 0(L) 1 (B) and dispersion pattern of log-transformed residuals of that model presenting a homoscedastic distribution (C) are shown.
Figure 5. The relationship between estimated and observed leaf area for eight coffee genotypes. Symbols as in Figure 11. Leaf area was estimated using power models (see Table 14) based on both single leaf dimensions, length (A) or width (B), and the product of two-leaf dimensions, length and width (C). Dotted line represents the 1:1 relationship.
Figure 6. Statistical comparisons of the 0 and 1 coefficients of the power models Y = ßo(X)ß1
using the calibration (black circles; n = 1,563) and the validation (white circles; n = 388) data sets. Vertical bars represent the 99% confidence intervals for coefficient means.
Figure 7. 0 estimation in the model = ßo(LW)ß1 as a function of sample size. Vertical bars represent the 99% confidence intervals for the 0 coefficient means. The numbers above the bars denote the sample size (n = 10) (A). The entire data set was composed by a sample of 1,563 leaves. In the inset, inverted polynomial regression for 0 deviation as a function of leaf size showing the approximate minimum sample size (indicated by the arrow) to develop a regression model to reliably predict the area of coffee leaves (B).
62
Est
imat
ed d
iffe
renc
e (c
m2
leaf
-1)
Fig. 1
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
-3.5
Obs
erve
Bar
ros
et a
l.
(197
3)
ß 1(L
W
ß o
+
ß o(L
W)
*
*
Rey
and
Alv
arez
(1
991)
*
ß o(W
)ß1
ß o(L
)ß1
63
0
50
100
150
200
250
300
64
L/W classes
Est
imat
ed d
iffe
renc
e (c
m2
leaf
-1)
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
Fig. 3
ß1(LW)
ßo(LW)ß1
ßo(L)ß1
ßo(W)ß1
ßo + ß1(LW)
L/W > 3.0 *
*
*
*
*
L/W < 2.0 2.0 < L/W < 3.0
*
65
Length (cm)
0 5 10 15 20 25 30 35
Lea
f ar
ea (
cm2 )
0
50
100
150
200
250
300
Fig. 4
0 5 10 15 20 25 30
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
ABLength (cm) Residual0,00,20,40,60,81,01,21,41,6Log10 (L) Residual C 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 Y = 0.2132(L)21 176 Ra2 = 0.978
66
Est
imat
ed le
af a
rea
(cm
2 )
0
50
100
150
200
250
300
100
150
200
250
300
Observed leaf area (cm2)050100150200250300050100150200250300 Fig. 5 A B C Y = 0.987X Ra2 = 0.9770 Y = 0.992X Ra2 = 0.9820 Y = 0.998X Ra2 = 0.9960
67
's c
oeff
icie
nts
Fig. 6
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
^
^
Y = ßo(LW)ß1
ß1
ßo
^
^
Y = ßo(L)ß1
ßo
ß1
^
^
Y = ßo(W)ß1
ßo
ß1
68
Sample size
o
Fig. 7
10
20 100 50
200 300 1563
A
B
^
0.80
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0.00
0 200 400 1400 1600
Var
iabi
lida
de (
0)
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
69
V. CONCLUSÕES GERAIS
Neste trabalho, foram realizados dois experimentos, conduzidos
separadamente e analisados como tal, para investigar os efeitos da irradiância e da
nutrição diferencial de nitrogênio sobre (i) as respostas alométricas e morfológicas e
(ii) os mecanismos de fotoproteção em plantas de café avaliadas no inverno.
Procurou-se, ainda, avaliar as atuais metodologias de estimação da área foliar do
cafeeiro e propor uma nova equação que permitisse a estimação com acurácia e
precisão da área foliar do cafeeiro nas duas espécies mais cultivadas no Brasil
(Coffea arabica e C. canephora).
No primeiro experimento, verificou-se que a deficiência de N acarretou
redução marcante no acúmulo de biomassa, independentemente do ambiente lumínico.
Em todo o caso, mesmo na fase de muda, as plantas cultivadas ao sol acumularam mais
biomassa que as plantas à sombra, um forte indício de que as taxas fotossintéticas
líquidas foram maiores nas primeiras. Verificou-se, ainda, que os efeitos da nutrição
nitrogenada sobre as características alométricas e morfológicas avaliadas foram mais
relevantes entre 0 e 16 mM de N que entre 16 e 23 mM de N. Dessa forma, a nutrição
supra-ótima de N (23 mM) não teria efeitos significativos, tal que justificasse sua
utilização a nível de campo. A disponibilidade de luz, mas não a de N, promoveu
alterações na morfologia da epiderme; com o aumento da expansão foliar, em resposta
ao sombreamento, houve redução na densidade estomática, que foi bem mais
pronunciada que a redução observada no índice estomático. Essas alterações ocorreram
sem variações aparentes nas dimensões dos estômatos, porém com alterações
significativas na área média das células ordinárias da epiderme, sugerindo uma
plasticidade diferencial das células ordinárias da epiderme na alteração do índice
estomático, em resposta a variações da irradiância.
No segundo experimento, as plantas foram submetidas a dois níveis de N
(0 e 23 mM), sendo também cultivadas a pleno sol e à sombra; entretanto, as plantas
foram avaliadas no inverno. As baixas temperaturas noturnas, aliadas às altas
irradiâncias, especialmente nas plantas cultivadas a pleno sol, afetaram
significativamente a assimilação líquida de carbono, devido, principalmente, a
70
limitações difusivas. Nas plantas cultivadas à sombra, todavia, reportaram-se taxas
fotossintéticas significativamente maiores quando comparadas às de plantas a pleno sol.
A capacidade fotossintética potencial, por outro lado, foi maior nas plantas a pleno sol,
bem como nas plantas +N. Isso demonstra que os efeitos positivos da nutrição
nitrogenada sobre a fotossíntese, in situ, devem ter sido aparentemente atenuados pelas
resistências difusivas impostas, presumivelmente, pelas baixas temperaturas noturnas.
Verificou-se ainda, que as baixas temperaturas noturnas, afetam diretamente a eficiência
do FSII, tal que a razão Fv/Fm é fortemente reduzida nas plantas cultivadas a pleno sol,
de modo ainda mais pronunciado nas plantas deficientes em N. Essas plantas, todavia,
apresentaram menor concentração de clorofilas, com redução ainda mais pronunciada
nas plantas cultivadas a pleno sol. Nessas plantas, ocorreu, ainda, menor concentração
de carotenóides, em base de massa, e menor atividade da APX, fatos possivelmente
associados ao acúmulo mais pronunciado de H2O2, que pode ter acarretado danos às
membranas cloroplastídicas. Por outro lado, as plantas +N apresentaram maiores
concentrações de clorofilas e de carotenóides, fato que contribuiu para a elevação de P e
queda de D, de forma ainda mais pronunciada nas plantas cultivadas à sombra. Nas
plantas cultivadas a pleno sol, houve maior atividade da CAT, apesar da ocorrência de
fotoinibição crônica. Tal fato, associado com a maior atividade da GS, são indícios
circunstanciais de maior atividade fotorrespiratória das plantas cultivadas a pleno sol.
Em todo o caso, a aclimatação da maquinaria fotossintética a condições de pleno sol foi
fortemente dependente da disponibilidade de N.
Adicionalmente, foram avaliadas as principais metodologias não-destrutivas de
estimação da área foliar do cafeeiro, verificando-se que essas metodologias, em geral,
levam a uma subestimação da área foliar. Desenvolveu-se, neste trabalho, uma nova
equação para estimar-se, não-destrutivamente, a área foliar; o modelo foi desenvolvido
a partir de oito genótipos de café (arábica e robusta), gerando-se uma equação potencial
(x = 0,663 CL1,012) (x = área foliar, C = comprimento, L = largura) capaz de estimar
com alta precisão (99,6%), acurácia e ausência de viés a área de folhas de diferentes
idades, forma e tamanho em cafeeiros. Uma simplificação do modelo pôde ser
alcançada a partir de apenas uma dimensão linear da folha, gerando-se uma equação do
tipo x = 0,213 L2,118. Nesse modelo, a precisão foi ligeiramente reduzida (97,8%).
Entretanto, o modelo pode ser perfeitamente utilizado para folhas com razão
comprimento/largura entre 2,0 e 3,0, onde se enquadra a maioria (92%) das 1563 folhas
utilizadas no desenvolvimento dos modelos em questão, ou mesmo em experimentos
que não requeiram tamanha precisão na estimação da área foliar.
71
APÊNDICE I
Arquitetura da copa de plantas de Coffea arabica L. cultivadas sob 0, 16 e 23 mM de N (respectivamente da direita para a esquerda) a pleno sol (A) e à sombra (B). Verificar que nas plantas +N (16 e 23 mM) a alocação de biomassa foi maior que nas plantas -N (0 mM). Verificar ainda que nas plantas deficientes ocorreu um maior amarelamento das folhas, de modo ainda mais pronunciado nas plantas cultivadas a pleno sol, evidência indireta de maior comprometimento do sistema fotossintético e fotoprotetor.
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