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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA O PAPEL DAS CÉLULAS T CD4+ E CD8+ NO MECANISMO DE INDUÇÃO
E MANUTENÇÃO DA PROTEÇÃO A Paracoccidioides brasiliensis
MARCELO DE SOUZA FERNANDES PEREIRA
Orientador: Prof. Dr. João Santana da Silva Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Campanelli
Ribeirão Preto-SP 2006
Livros Grátis
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MARCELO DE SOUZA FERNANDES PEREIRA
O PAPEL DAS CÉLULAS T CD4+ E CD8+ NO MECANISMO DE INDUÇÃO E MANUTENÇÃO DA PROTEÇÃO A Paracoccidioides brasiliensis
Dissertação de mestrado apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, para a obtenção do grau de Mestre em Ciências – Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Ribeirão Preto 2006
Orientação: João Santana da Silva Co-orientação: Ana Paula Campanelli
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRONICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Pereira, Marcelo de Souza Fernandes
O papel das células T CD4+ e CD8+ no mecanismo de indução e manutenção da
proteção a Paracoccidioides brasiliensis.
Ribeirão Preto, 2006
102p
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP –
Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada
Orientador: Silva, João Santana
Co-Orientador: Campanelli, Ana Paula
1. Paracoccidioides brasiliensis - 2.Granulomas - 3. Imunização - 4. Resposta imune -
5. CD4KO - 6. CD8KO.
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"Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor. Mas lutamos para que o melhor fosse feito. Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos ser, mas graças a Deus não somos o que éramos!!!" (Martir Luther King).
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Dedicatórias
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Aos meus pais Benedito e Eliana, que me ensinaram que a maior herança que eles vão me
deixar não consiste em bens materiais, e sim a maior riqueza que um pai pode dar a um
filho, a educação, e isso, ninguém pode me roubar. Obrigado por me proporcionar tamanha
riqueza.
À minha irmã Andrezza, que sempre foi meu espelho.
À Juliana, pela paciência e por tantas palavras de incentivo.
A minha avó Maria, mulher de muita fibra e uma lutadora nata. A senhora é minha
inspiração diária.
Louvo a Deus por vocês existirem!
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Agradecimentos
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Um dia eu tive um sonho... Sonhei que estava andando na praia
com o Senhor e no céu passavam cenas de minha vida.
Para cada cena que passava, percebi que eram deixados dois pares
de pegadas na areia: um era meu e o outro do Senhor.
Quando a última cena da minha vida passou diante de nós, olhei para trás,
para as pegadas na areia, e notei que muitas vezes, no caminho da minha vida,
havia apenas um par de pegadas na areia. Notei também que isso aconteceu
nos momentos mais difíceis e angustiantes da minha vida. Isso aborreceu-me deveras
e perguntei então ao meu Senhor: - Senhor, tu não me disseste que,
tendo eu resolvido te seguir, tu andarias sempre comigo,
em todo o caminho? Contudo, notei que durante
as maiores tribulações do meu viver, havia apenas um par de pegadas na areia.
Não compreendo por que nas horas em que eu mais necessitava de ti,
tu me deixaste sozinho. O Senhor me respondeu:
- Meu querido filho. Jamais te deixaria nas horas de prova e de sofrimento. Quando viste na areia,
apenas um par de pegadas, eram as minhas.
Foi exatamente aí,que te carreguei nos braços. Agradeço a Deus por todas as vezes que me carregaste no colo.
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Ao Prof. Dr. João Santana da Silva, pela competência, espírito cientifico e dedicação à pesquisa, sua empolgação pela ciência é contagiante À Profa. Dra. Ana Paula Campanelli, profissionalismo que nos envolveram durante nossa convivência, pela amizade, carinho e acima de tudo por acreditar sempre em minha capacidade, me orgulho de ser seu primeiro aluno. Ao Prof. Dr. Luciano Aparecido Panagio, pelos momentos de descontração, pelas conversas e pela amizade. À Profa. Dra. Karen Cavassani, por seu carinho com que sempre me tratou desde a iniciação cientifica. Ao Prof. Dr. Gustavo P. Garlet, por seu entusiasmo contagiante desde montar uma aula em Power point até a analise de resultados, pelo exemplo de profissionalismo, pelos bate-papos e pela amizade que construímos As professoras Beatriz Rosseti Ferreira e Isabel Miranda pelos sábios comentários e sugestões durante nossas reuniões que engrandecem nossos conhecimentos científicos. A amiga Alessandra Mara Franzin, pessoa de gênio difícil, que me deu a oportunidade de conhecer o lado que poucos conhecem: o seu lado carinhoso. Pelas conversas divertidas e sérias que tivemos nesses anos e pelo companheirismo. Ao amigo Gustavo Bronzi, pelas conversas engraçadas e acima de tudo pelo suporte administrativo Ao Wander, Sávio, Edinelson, Julio, Cris, Lucia, cujo apoio técnico é fundamental, mas não só por isso, principalmente pela convivência por todos esses anos. A Ana Cristine, por sua dedicação aos alunos da pós-graduação, e pela competência com que realiza seu trabalho. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão dos recursos para a realização deste trabalho.
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Aos amigos e colegas de laboratório
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ABREVIAÇÕES BHI: Ágar Infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion)
CD4KO: Animais deficientes de MHCII
CD8KO: Animais deficientes de β2-microglobulina
DTH: Reação de hipersensibilidade tipo tardia (Delayed Type Hipersensibility)
ELISA: Ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática (Enzyme-Linked Immuno-
Sorbent Assay IFN-γ: Interferon gama
Ig: Imunoglobulina
IL: Interleucina
KO: Animal deficiente (Knockout)
MIP-1α: Proteína inflamatória de macrófago-1 alfa (Macrophage Inflammatory Protein-1
alfa)
NO: Óxido nítrico (Nitric Oxide)
Pb 18: Paracoccidioides brasiliensis cepa 18 (virulenta)
Pb 265: Paracoccidioides brasiliensis cepa 265 (avirulenta)
Pb 339: Paracoccidioides brasiliensis cepa 339 (avirulenta)
PBMC: células mononucleares do sangue periférico
PBS: Tampão salina-fosfato (phosphate buffered saline)
PCM: Paracoccidioidomicose
SBF: soro bovino fetal
sPbAg: antígenos de membrana e secretados de P. brasiliensis
Th: Linfócito T auxiliar (T Helper)
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa (Tumor Necrosis Factor alfa)
WT: Linhagem de animais geneticamente não modificada (Wild Type)
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ÍNDICE
I RESUMO................................................................................................................. 13
II ABSTRACT………………………………………………………………… 15
III INTRODUÇÃO………………………………………………………………….…. 17
IV MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................
1- Animais experimentais e infecção por Paracoccidioides brasiliensis...........
2- Cultura de Paracoccidioides brasiliensis.......................................................
3- Imunização experimental por P. brasiliensis 265..........................................
4- Preparo do inoculo..........................................................................................
5- Curva de sobrevivência..................................................................................
6- Obtenção de órgãos para análise histopatológica...........................................
7- Recuperação de fungos...................................................................................
8- Dosagem de citocinas nos órgãos de animais infectados ou não com P.
brasiliensis.....................................................................................................
9- Obtenção do soro de animais infectados e não infectados.............................
10- Obtenção do Exoantígeno............................................................................
11- Dosagem de anticorpos................................................................................
12- Análise estatística dos resultados.................................................................
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V RESULTADOS..........................................................................................................
1- Susceptibilidade de camundongos geneticamente deficientes de MHCII e β2
microglobulina à infecção por P. brasiliensis..........................................
2- Recuperação de fungos viáveis a partir de pulmão, baço e fígado de camundongos
C57BL/6, CD4KO e CD8KO.................................................
3- Análise histopatológica de secções de pulmão e fígado de camundongos WT,
CD4KO e CD8KO infectados por P. brasiliensis.................................
4-Dosagem de citocinas no pulmão de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO
após infecção por P. brasiliensis.....................................................
5- Dosagem de anticorpos séricos em animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO
infectados com P. brasiliensis.........................................................
6- Sobrevida de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO após a pré-infecção com
P. brasiliensis 265 e desafio com P. brasiliensis 18...............
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7- Recuperação de fungos viáveis de camundongos C57BL/6, CD4KO e CD8KO
após a pré-infecção com cepa avirulenta e posterior desafio com cepa virulenta de
P. brasiliensis....................................................................
8- Análise histopatológica de secções de pulmão e fígado de camundongos
imunizados e infectados por P. brasiliensis...................................................
9- Análise da produção de citocinas no pulmão de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e
CD8KO imunizados e desfiados com P. brasiliensis (cepa 18)...
10- Dosagem de anticorpos no soro de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO
imunizados e desafiados com P. brasiliensis..................................
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VI DISCUSSÃO.............................................................................................................. 71
VII CONCLUSÕES............................................................................................................ 85
VIII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 87
_____________________________________________________ Resumo
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Paracoccidioides brasisliensis é o fungo causador da paracoccidioidomicose, uma
micose endêmica na América Latina. A resposta imune celular contra P. brasiliensis é
importante na defesa do hospedeiro contra esse fungo. O papel dos linfócitos T CD4+ e
CD8+ durante a resposta primaria e secundaria não é conhecido, embora sabe-se que são
fundamentais para a formação do granuloma. Neste estudo avaliou-se o papel de células T
CD4+ e CD8+ durante uma infecção primaria e secundaria por Paracoccidioides
brasiliensis. Para tal, avaliou-se a carga fúngica e a mortalidade de camundongos
geneticamente normais (C57BL/6-WT) e geneticamente deficientes de MHCII (CD4KO) e
de β2microglobulinas (CD8KO). A ausência de linfócitos T CD4+ resultou em maior
susceptibilidade à infecção, visto que camundongos CD4KO apresentaram maior taxa de
mortalidades do que a observada em animais WT e CD8KO, alem de maior disseminação
fúngica para baço e fígado. Em relação à produção de citocinas, os animais CD4KO
falharam em produzir IFN-γ, porém, produziram grande quantidade de IL-4.Esses animais
também apresentaram menor produção de anticorpos contra antígenos do fungo. Em
contrapartida, camundongos CD8KO secretaram altas quantidades de IFN-γ e TNF-α. Com
o intuito de entender o papel de células T CD4+ e T CD8+ na indução e manutenção da
imunidade, os animais foram inoculados com leveduras de Pb265 (cepa avirulenta), e após
30 dias, desafiados com a cepa virulenta (Pb18). Animais CD4KO, quando desafiados,
apresentaram maior resistência à infecção por Pb, com redução na UFC e da taxa de
mortalidade, quando comparado aos animais não-imunizados, durante 30 dias após o
desafio, Entretanto, aos 60 dias esses animais apresentaram aumento na carga fúngica no
pulmão, baço e fígado. Por outro lado camundongos CD8KO apresentaram altas
quantidades de leveduras no baço e fígado após 30 e 60 dias de infecção. Ao analisar a
produção de citocinas após a imunização, observou-se que, camundongos CD4KO e
CD8KO apresentaram redução significativa em todas as citocinas analisadas. Os animais
selvagens imunizados são mais resistentes a infecção por P. brasiliensis quando
comparados com animais não imunizados (WT), com pequena quantidade de UFC
recuperada dos órgão aos 60 dias de infecção, alem de produzirem grande quantidades de
TNF-α, IL-4 e IL-10. Nossos resultados mostraram que é de fundamental importância a
atuação sinérgica das células T CD4+ e CD8+ para a efetuação de uma resposta protetor de
longa duração contra Paracoccidioides brasiliensis.
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Abstract
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Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis
(PCM), a Latin America endemic mycosis. The cellular immune response plays an
important role in the defense against this fungus, since it contributes for yeast cells killing,
ganuloma formation and inhibition of fungal dissemination. The role of CD4+ and CD8+ T
lymphocytes on primary and secondary immune response are unknown, however, these
cells have a critical role in the granuloma formation. In this study, we had evaluated the role
of CD4+ and CD8+ T lymphocytes during primary and secondary immune response against
Paracoccidioides brasiliensis. We had evaluated the mortality rate and the fungal load in
MHCII (CD4KO) and β2-microglobulin (CD8KO) deficient and C57BL/6 (WT) mice
infected with Pb18. The absence of CD4+ T cells resulted in increased susceptibility, since
CD4KO mice presented higher mortality rate than WT and CD8KO mice, and great fungal
dissemination to the liver and spleen. Concerning to cytokine production, we observed that
CD4KO mice presented low levels of IFN-γ when compared with WT mice, whereas, these
animals presented increasing of IL-4 production. In contrast, CD8KO mice produced
increased levels of IFN-γ and TNF-α. Our data suggest that CD4+ T cells are critical during
primary immune response against P. brasiliensis. To evaluate the role of CD4+ and CD8+ T
cells in the induction and maintenance of immunity against Pb, the knockout and WT mice
were inoculated with viable yeast cells of Pb265 (avirulent strain) and after 30 days, they
were challenged with virulent strain (Pb18). We observed that CD4KO immunized mice
presented higher resistance to Pb infection, with low mortality rate when compared with
non immunized animals and low CFU on day 60 post infection these animals presented
increasing in the fungal load in lung, liver and spleen. On other hand, CD8KO mice showed
higher amount of CFU in spleen and liver 30 and 60 days after infection. Regarding to
cytokines production, we observed that CD4 and CD8 knockout mice presented decreased
in all cytokines analyzed when compared with CD4KO and CD8KO non immunized mice.
Wild type immunized mice were more resistant than non immunized mice during Pb
infection and they presented low CFU on day 60 after challenge. The immunized mice
produced high levels of TNF-α, IL-4 and IL-10. Our data show that CD4+ and CD8+ T cells
have a synergistic role during secondary immune response against Paracoccidioides
brasiliensis and are critical to induce a long term protective immune response.
17
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Introdução
18
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença pulmonar, sistêmica, crônica, não
contagiosa, que tem como agente etiológico o fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis
(Pb). Geograficamente, essa doença é distribuída por toda a América Latina, onde as
principais regiões endêmicas estão localizados no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina
(LACAZ & RAMOS, 1956), sendo considerada a principal micose sistêmica da América
Latina. Estima-se que esta seja a oitava causa de mortalidade dentre as doenças infecciosas e
parasitárias no Brasil (COUTINHO et al 1999), com predomínio em áreas interioranas e
rurais, onde cerca de 60% da população é paracoccidioidina positiva. A taxa de mortalidade é
maior entre os indivíduos do sexo masculinos com idade variando entre 30 a 59 anos,
geralmente trabalhadores rurais ou indivíduos que exerçam profissões na lida com plantas e
jardins (BRUMMER et al., 1993).
O primeiro relato da doença humana foi feito por LUTZ (1908) que, detectando a
presença do fungo em lesões da mucosa oral de dois pacientes, isolou e chamou a atenção
para o seu dimorfismo. A fase micelial desenvolve-se a 23 °C, e a fase leveduriforme, a 37°C.
Tal dimorfismo depende exclusivamente da temperatura e não da natureza e da composição
dos meios de cultura (SAN BLAS & SAN BLAS, 1982).
A infecção do hospedeiro humano ocorre geralmente pela via respiratória por inalação
de conídios ou fragmentos de micélio, ou por trauma do epitélio de revestimento,
principalmente da mucosa oral, anal ou cutânea (NEGRONI & NEGRONI, 1965;
RESTREPO, 1978; DOMER et al., 1992). Um fato marcante após a inalação dos conídios e
conseqüente estabelecimento da infecção é a transformação da forma conidial saprofítica para
leveduriforme, que é patogênica (RESTREPO,1985; MCEWEN,1987).
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O estabelecimento da doença esta associada não só a fatores relacionados ao fungo
(SAN BLAS & SAN BLAS, 1977), como também ao hospedeiro (ROBLEDO et al., 1982).
Em relação aos mecanismos relacionados ao fungo pode-se citar a patogenicidade e
virulência, e em relação ao hospedeiro estão relacionados fatores como seu estado imunitário
e susceptibilidade determinada geneticamente, como descrita em animais de experimentação e
em indivíduos infectados pelo fungo (CALICH et al.,1985; CALICH et al., 1987;
RESTREPO et al.,1983; GOLDANI et al., 1991).
Na patogenia da doença, os mecanismos de escape do fungo do sistema de defesa do
hospedeiro ainda não estão esclarecidos. Tem-se postulado que características físicas e
químicas do fungo (SAN BLAS, 1993) e que componentes de sua parede celular, liberados no
foco inflamatório (FIGUEIREDO et al., 1986), teriam papel relevante.
A parede celular de P. brasiliensis é composta de lipídios, proteínas e polissacarídeos. A
quantidade de cada composto varia de acordo com a virulência da cepa e com a sua forma de
apresentação. Na fase leveduriforme, os açúcares estão presentes na forma de polímeros
caracterizados como alfa-glucana (90%), beta-glucana (5%) e pequena quantidade de
galactomanana; na fase micelial, observa-se maior quantidade de beta-glucana
(KANETSUNA et al., 1970; KANETSUNA & CARBONELL 1970, SAN BLAS et al.,
1987).
SAN BLAS et al. (1977, 1982) sugerem que a virulência de P. brasiliensis está
relacionada com a maior quantidade de α 1-3 glucana e a menor de galactomana; e
dependendo da quantidade de α 1-3 glucana periférica, poderia atuar como cápsula protetora
contra os mecanismos de defesa do organismo.
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Há outros mecanismos pelos quais componentes fúngicos poderiam influenciar a
virulência de P. brasiliensis. Proteinases produzidas por certos fungos patogênicos têm sido
reconhecidas como fatores potencialmente patogênicos. A glicoproteína de 43K, gp43,
sintetizada por P. brasiliensis é uma proteinase capaz de hidrolisar caseína, colágeno e
elastina facilitando a invasão no tecido do hospedeiro (MENDES-GIANNINI et al., 1989).
Demonstrou-se, também, que gp43 é uma proteína ligadora de laminina e que a interação
entre gp43 e laminina influencia a adesão fúngica a células epiteliais in vitro além de
aumentar a patogenicidade in vivo, como observado pelo uso do modelo em hamster. Neste
modelo, o revestimento de leveduras do fungo com laminina, antes da inoculação, acentua a
virulência fúngica e torna mais severa as lesões granulomatosas encontradas (VICENTINI et
al., 1997).
Dados obtidos de estudos clínicos de indivíduos portadores da infecção e modelos
experimentais têm demonstrado que tanto os mecanismos de imunidade inata (JIMENEZ &
MURPHY, 1984; CALICH et al., 1979; BOSCARDIN et al.; 1985; BRUMER et al., 1989)
quanto de imunidade adquirida (RESTREPO, 1982; MOSCARDI-BACCHI et al., 1989;
CANO et al., 1995) são importantes para o controle desta infecção fúngica. Da particular
inter-relação entre o hospedeiro e o parasita, na paracoccidioidomicose, decorrem
freqüentemente algumas alterações imunológicas nos indivíduos infectados, como depressão
da imunidade mediada por células (MOK & GREER, 1977) acompanhada de ativação
policlonal de linfócitos B e hipergamaglobulinemia (CHEQUER-BOU-HABIB et al., 1989).
Assim, a produção exacerbada de anticorpos e a baixa resposta imune celular caracterizam um
distúrbio imunoregulatório que pode resultar em multiplicação do fungo, já que a imunidade
celular efetiva correlaciona-se com um melhor prognóstico da doença, levando muitas vezes à
eliminação do agente infeccioso (ROBLEDO et al., 1982).
21
Como na doença humana, animais inoculados com P. brasiliensis evoluem com a
produção de citocinas como o IFN-γ e TNF-α (SILVA & FIGUEIREDO, 1991; BOCCA et
al., 1998). O TNF-α, que é induzido pelos constituintes polissacarídeos da parede celular do
fungo, tem a capacidade de promover a constante migração dos fagócitos além de atuar na
diferenciação destas células (FIGUEIREDO et al., 1993). Dados recentes de CANO et al.
(1998), demonstraram o papel protetor de IFN-γ e que esta citocina é uma das maiores
mediadoras da resistência a P. brasiliensis na infecção induzidas experimentalmente em
camundongos susceptíveis ou resistentes. A partir desse estudo experimental, os autores
observaram que, em ambas as linhagens de camundongos, a neutralização de IFN-γ endógeno
induz exacerbação da infecção pulmonar, com diminuição da resposta imune celular e
aumento dos níveis de anticorpos específicos. Em trabalho mais recente, SOUTO et al.
avaliou a evolução da infecção por P. brasiliensis em camundongos geneticamente deficientes
de IFN-γ (GKO) ou do receptor p55 de TNF-α (p55KO). Os resultados mostraram que os
animais GKO sucumbem à infecção após 15 dias da inoculação do fungo e apresentaram
grande quantidade de leveduras viáveis nos órgãos infectados. Por outro lado, os animais
p55KO, embora resistam por mais tempo à infecção, apresentam pobre formação de
granulomas e disseminação de fungos para diversos órgãos (SOUTO et al., 2000). Esses
dados indicam que ambas as citocinas são importantes para controlar a disseminação do
fungo, sendo que IFN−γ deve potencializar ações fungistáticas ou fungicidas. De fato, são
vários os relatos que apontaram a relevância tanto do IFN-γ (DALTON et al., 1993; COOPER
et al., 1993; ALLENDOERFER & DEEP, 1997) quanto do receptor p55 do TNF-α
(PFEFFER et al., 1993; VIEIRA et al., 1996) no desenvolvimento de resposta imune protetora
a agentes infecciosos.
22
Em pacientes com esta doença, observa-se uma ampla variação da resposta imune
celular (MOTA et al., 1985; BAVA et al., 1991). Alguns indivíduos desenvolvem uma
infecção pulmonar assintomática, enquanto outros podem desenvolver manifestações clínicas
dando origem a distintas formas da PCM, que podem ser classificadas em duas categorias
principais: aguda e crônica (FAVA-NETO, 1961; BRUMMER et al., 1993). Em ambas há
comprometimento das funções imunológicas mediadas por células, contudo a imunidade
humoral é preservada, com marcada ativação policlonal (CHEQUER-BOU-HABIB et al.,
1989).
Durante a manifestação da forma aguda (forma juvenil), é possível observar
características como: curso rápido e de grande severidade da doença, com intenso
comprometimento do sistema fagocítico mononuclear, culminando com o quadro de doença
sistêmica, além de evolução incidente e envolvimento de um ou mais órgãos ou sistemas
(PERAÇOLI, et al., 2003). A forma juvenil da PCM acomete até 30% dos casos de infecção
por P. brasiliensis. Esses indivíduos apresentam lesões com número elevado de leveduras,
geralmente com ausência de formações granulomatosas organizadas (FRANCO et al., 1987).
Em pacientes que apresentaram essa forma da doença são encontrados altos títulos de
anticorpos de diversos isotipos, com supressão da resposta imune celular, sendo estes
pertencentes ao pólo anérgicos da doença (LACAZ et al., 1982; BRUMMER et al., 1993).
Cerca de 70-100% (conforme região e casuística) dos casos relatados de PCM são
atribuídos a forma crônica da doença. Essa forma é predominantemente unifocal e pulmonar, e
as condições gerais de saúde do paciente implicam diretamente no grau da doença, que pode
ser leve, moderada ou severa. Os principais sintomas apresentados no inicio da infecção são
semelhantes a outras inúmeras enfermidades que acometem as vias respiratórias, podendo ser
facilmente confundidas. De maneira geral, os pacientes procuram tratamento somente quando
23
há sinais de debilitação física e respiratória. Freqüentemente, nesta fase, é possível observar
disseminação a partir do foco pulmonar inicial, ocorrendo formação de lesões extra-
pulmonares, e a médio e longo prazo, pode levar à mortalidade por PCM crônica. Portanto, o
emprego da terapia antifúngica é indispensável, e deve ser iniciado o mais urgente possível.
Pacientes enquadrados nessas condições situam-se no pólo hiperérgico da doença (LACAZ et
al., 1982).
Estudos realizados em áreas endêmicas indicam que mulheres são mais protegidas
contra a doença. Resultados obtidos in vitro demonstraram que a transformação micelio-
levedura, que é essencial para a instalação do fungo no hospedeiro, é inibida na presença de
hormônio feminino 17-β-estradiol (E2). Esse relato poderia explicar o número reduzido de
mulheres afetadas na fase adulta e a freqüência semelhante da doença em ambos os sexos até a
puberdade, quando ainda existe imaturidade sexual e os níveis desse hormônio são reduzidos
(CLEMONS & STEVES, 1990; RESTREPO et al., 1984; SAN-BLAS, 1993).
Em pacientes com esta doença, observa-se uma ampla variação da resposta imune
celular (MOTA et al., 1985; BAVA et al., 1991). Alguns indivíduos apresentam imunidade
preservada ou até mesmo exacerbada, enquanto que em outros ocorre depressão da imunidade
contra antígenos específicos e inespecíficos. O grau de depressão observado é variável,
sugerindo, desta forma, um padrão espectral para esta doença (LACAZ et al., 1982;
MUSATTI et al., 1976; YARZABAL, 1980). De forma interessante, tem-se correlacionado o
padrão da imunidade celular com a gravidade da doença e com características morfológicas da
lesão (PERAÇOLI et al., 1982; MUSATTI, 1982). Neste sentido, os indivíduos com
imunidade preservada apresentam doença geralmente menos grave, com lesões isoladas,
caracterizadas por granulomas epitelióides bem definidos, nos quais poucos fungos são
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identificados. Diferentemente, a doença observada em pacientes com depressão da imunidade
celular é geralmente grave com tendência à disseminação e as lesões são difusas, apresentando
grande quantidade de fungos.
O desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente requer a migração de
leucócitos para os sítios de infecção, processo que deve ser finamente coordenado por
citocinas, quimiocinas (DESJARDIN et al., 2002; MURRAY, 2000; SOUTO et al.,2000;
SOUTO et al., 2003) e moléculas do sistema de adesão (MOREIRA et al., 2006), que
governam a migração celular para a formação e manutenção dos granulomas.
Na fase inicial da infecção por P. brasiliensis, observa-se, no sítio inflamatório, um
infiltrado de leucócitos polimorfonucleares e mononucleares. Esta resposta pode ser induzida
pela liberação de constituintes da parede celular do fungo, os quais teriam a capacidade de
estimular a migração dos leucócitos . Com o progredir da infecção, ocorre diferenciação dos
leucócitos migrados (COELHO et al., 1994). Observa-se também migração preferencial de
monócitos que, no tecido, onde são identificados como histiócitos, e quando em contato com o
fungo e seus constituintes, sofrem alterações morfológicas e diferenciam-se em histiócitos
epitelióides e em células gigantes multinucleadas (MOSCARD-BACCHI et al., 1989). Estas
células apresentam-se, ainda, dispostas de forma organizada, constituindo uma lesão
circunscrita e bem definida, o granuloma epitelióide, que corresponde à lesão fundamental da
paracoccidioidomicose (FRANCO & MONTENEGRO, 1980; MIYAJI & NISHIMURA,
1983).
Durante a formação do infiltrado inflamatório é evidente a presença de linfócitos CD4+
e CD8+. Os linfócitos são responsáveis pela defesa do hospedeiro contra o fungo, ocupando a
porção mais externa do granuloma, sendo sua função definida pela produção de citocinas e
atividade antifúngica direta, levando a lise de fagócitos. O papel de células T CD4+ e CD8+ no
25
desenvolvimento das lesões granulomatosas induzidas por P. brasiliensis ainda não está bem
estabelecido. Entretanto, estudos com camundongos atímicos infectados com P. brasiliensis
demonstraram que estes animais são susceptíveis à infecção, apresentando maior
disseminação da doença e menor sobrevida que os eutímicos (MIYAJI M & NISHIMURA K.
1983), ressaltando assim a importância da resposta celular mediada por células T durante esta
infecção fúngica.
A imunidade celular mediada por células T, e em particular células CD4+, é considerada
a principal defesa do hospedeiro contra fungos patogênicos (ROMANI, L. 1997). De fato,
indivíduos HIV positivos, que apresentam baixa quantidade de células T CD4+, são mais
susceptíveis a infecções por patógenos como M. tuberculosis, M. avium, Histoplasma
capsulatum e Pneumocystis carinii (BARNES et al., 1992; MARSHALL et al., 1999). De
forma semelhante, em modelo experimental, animais geneticamente deficientes de células T
CD4 ou animais deficientes de MHCII apresentam maior carga micobacterial, quando
infectados com M. tuberculosis. Adicionalmente, animais depletados de células CD4 ou ainda,
deficientes dessa população celular são incapazes de formar granulomas eficientes durante a
infecção por S. mansoni (HERNANDEZ et al., 1997). De fato, a importância dessa população
de células T é confirmada ao analisarmos indivíduos com criptococcose disseminada que
apresentam baixo número de células T CD4+ e conseqüentemente não conseguem eliminar o
fungo de seus tecidos, mesmo após o emprego de tratamento eficiente (MITCHELL &
PERFECT, 1995; POWDERLY, 1996), sugerindo que células T CD4+ são essenciais tanto
para aquisição de imunidade protetora como para o combate de infecções fúngicas
oportunistas. De maneira semelhante, camundongos geneticamente deficientes de células T
CD4+ (CD4KO) apresentam maior susceptibilidade à infecção por listeria e à salmonela,
26
mostrando-se prejudicados na ausência dessas células, ressaltando dessa forma a importância
dessa população celular durante a resposta a diversas infecções.
A importância das células T CD4+ na paracoccidioidomicose foi comprovada em
animais de experimentação infectados pelo fungo. Demonstrou-se, por exemplo, que
camundongos C57BL/6 infectados e depletados de células T CD4+ apresentaram
disseminação do fungo, comprometimento de múltiplos órgãos, com a severidade progressiva
da infecção caracterizada por lesões difusas e perda do padrão granulomatoso que se observa
nos animais infectados e não tratados com anticorpos capazes de depletar a subpopulação de
células T CD4+. Provavelmente, as células T CD4+ atuariam promovendo a migração de
células fagocíticas para o sítio inflamatório, bem como, a diferenciação dessas células. Isso
resultaria na formação do granuloma epitelióide, que teria a função de circunscrever o fungo,
de impedir a sua disseminação e mesmo de promover a sua eliminação (FIGUEIREDO et al.,
1992, UTIEL., 1998).
Em relação ao papel das células T CD8+ na paracoccidioidomicose experimental, um
estudo realizado por CANO e colaboradores em 2000 mostra que após a depleção de células T
CD8+, camundongos susceptíveis à infecção por P. brasiliensis foram incapazes de eliminar
leveduras dos pulmões. A falha no processo de “clearence” pulmonar foi responsável por
aumentar a quantidade de leveduras presente no baço e fígado desses animais, caracterizando
assim o quadro de disseminação fúngica para tecidos extrapulmonares. De maneira contrária,
o mesmo tratamento empregado em camundongos resistentes ao fungo, foi responsável por
um aumento significativo na quantidade de leveduras recuperadas dos pulmões desses
animais, contudo, não alterou a carga fúngica de baço e fígado. Além disso, a depleção de
células T CD8+ foi responsável por um aumento na reação de hipersensibilidade tardia (DTH)
de animais susceptíveis, mas não em camundongos resistentes à infecção por Pb. O mesmo
27
estudo mostra, em exames histopatológicos, que a depleção de células T CD8+ não prejudica a
organização e o desenvolvimento do granuloma, evidenciando uma atividade protetora
proeminente dessas células na resposta imune durante a paracoccidiodomicose (CANO et al.,
2000). No entanto, a depleção de células por adição de anticorpos monoclonais pode não
alcançar 100% de eficiência, o que levaria a uma interpretação incorreta dos resultados.
Células T CD8+ possuem papel fundamental na resposta imune contra vírus e tumores,
podendo também contribuir para a imunidade a fungos (SCHMITZ, 1999; DOHERTY, 1992;
DEEPE, 1994; ZHOU, 2001; HUFFNAGLE, 1991; HILL, 1991). Existem distintas vias para
a ativação de células T CD8+. Alguns modelos apontam a necessidade de células T CD4+ para
ativação de células T CD8+ naive. Entretanto, células T CD8+ citotóxicas podem ser induzidas
sem a necessidade do auxilio de linfócitos T CD4+ (BULLER,1987; STEVENSON, 1998),
sendo capazes de prover sua ativação (WANG, 2001). Allendorfer em 1999, mostrou em um
estudo que as células T CD8+ são capazes de mediar a imunidade secundária ou vacina,
mesmo na ausência de células T CD4+ durante a infecção por H. capsulatum. Observou-se
também que as células CD4+ seriam dispensáveis durante a resposta secundaria à Leishmania
major (RHEE, 2002), sendo que mesmo na ausência dessas células é possível montar uma
resposta celular eficiente e duradoura.
Outros trabalhos apontam para a fundamental importância das células T CD4+ durante
as respostas secundarias. Um estudo realizado por Romani e colaboradores em 2000 mostra
que o tratamento de animais imunocompetentes com antígenos de Aspergillus fumigatus é
capaz de promover proteção. Essa proteção é mediada por células T CD4+ antígeno-
especificas que são secretoras de IFN-γ e IL-2, mediando, dessa forma, uma resposta protetora
de padrão Th1. Além disso, após um experimento de transferência adotiva de células, essa
28
proteção via células T CD4+ foi capaz de proteger os receptores naive contra a aspergilose
pulmonar (CENCI et al., 2000). De maneira semelhante, resultados obtidos por WANG e
LIVINGSTONE em 2003, mostraram que as células T CD4+ “helper” são importantes durante
a expansão e diferenciação de células T CD8+, uma vez que na ausência de células CD4+ foi
possível detectar células T CD8+ responsivas. Entretanto, essas eram ineficientes em produzir
IL-2 e IFN-γ após re-estimulo com antígenos específicos, mostrando a necessidade de essas
células serem primadas por células CD4+.
Infecções repetidas por fungos oportunistas são raras em indivíduos imunocompetentes,
mesmo em áreas endêmicas, sugerindo que as infecções anteriores estimulam a imunidade
protetora. Contudo, a necessidade das células T CD4+ primarem células T CD8+, mediando a
proliferação, diferenciação e geração de memória, ainda permanece controversa nas diferentes
infecções fúngicas.
O entendimento dos mecanismos envolvidos na manutenção da resposta imune contra
P. brasiliensis é essencial, já que o papel das subpopulações de linfócitos durante essa
infecção é incerto. Nesse trabalho, nós estudamos a função dos linfócitos T CD4+ e CD8+ na
indução e manutenção da imunidade protetora ao Paracoccidioides brasiliensis.
OBJETIVO - Avaliar o papel de células T CD4+ e CD8+ na indução e manutenção da
resposta imune protetora a Paracoccidioides brasiliensis.
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______________________________________________________________________
Material e métodos
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1-Animais experimentais e infecção por Paracoccidioides brasiliensis.
Foram usados camundongos machos C57BL/6 selvagens (WT), geneticamente
deficientes de células T CD4+(MHCII KO) e CD8+, com 6-8 semanas de idade. Todos os
animais foram mantidos no biotério do Departamento de Bioquímica e Imunologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Esses animais foram infectados por via intravenosa
com 1x106 leveduras viáveis de Pb18.
2-Cultura de Paracoccidioide brasiliensis.
A cepa de P. brasiliensis 18 (Pb18), que possui alta virulência, bem como a
cepa 265 (Pb265) cepa de baixa virulência (gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Roberto
Martinez, Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto-SP) foram utilizadas nesse trabalho. As
cepas foram mantidas na fase leveduriforme à temperatura de 37°C em meio Fava-Neto. Para
preservação da virulência, o fungo foi alternadamente mantido por subculturas em meio BHI e
passagens em animais (Brummer et al, 1990). As leveduras utilizadas para inoculação em
animais foram obtidas de culturas de colônias retiradas de BHI-Agar após recuperação
fúngica de lisado de órgãos. A viabilidade foi determinada conforme descrito previamente
(Calich et al, 1978).
3-Imunização experimental por P. brasiliensis 265.
Camundongos C57BL/6 selvagens (WT), geneticamente deficientes de células
CD4+(MHCII KO) e CD8+, foram imunizados através de inoculação intravenosa de 2x106
leveduras viáveis de P. brasiliensis cepa 265. Após 30 dias, os camundongos foram desafiados
por via intravenosa, pelo plexo orbital, com 1x106 leveduras viáveis da cepa 18. Os animais
31
infectados foram monitorados para sobrevida e analisados no período de 7, 15, 30, e 60 dias
após a infecção.
4-Preparo do inóculo
Após teste de viabilidade, quantidades arbitrarias de P. brasiliensis foram
colocadas em tubos de vidro contendo 2 mL de PBS e perolas de vidro estéreis. As leveduras
foram (colocadas em tubos de vidro contendo perolas de vidro e PBS estéril) agitadas por 10
segundos em vórtex e lavadas em PBS estéril, em centrifugação a 1000 rpm/4°C/10 minutos.
Em seguida as leveduras foram ressuspendidas em 5 mL de PBS estéril, aspiradas em seringa
descartável de 10mL epassadas através de agulha 25x8, para completa separação de grumos.
Em seguida foi efetuada nova centrifugação (nas mesmas condições mencionadas acima) e as
leveduras foram contadas em câmara de Neubauer. A concentração de leveduras fúngica foi
ajustadas para 1,0x107 leveduras/mL em PBS estéril, sendo que 100µL dessa solução foram
inoculados em cada animal.
5-Curva de sobrevivência
A sobrevida dos animais foi avaliada através da observação diária da morte dos
camundongos após a infecção, estabelecendo-se um prazo máximo de observação de 100
dias. Neste período foram acompanhados 10 camundongos WT, 10 CD4KO, e 10 CD8KO e o
experimento foi realizado 2 vezes. Os animais que sobreviveram após o período de
experimento foram mortos.
6-Obtenção de órgãos para analise histopatológica
32
Três animais de cada grupo foram sacrificados em períodos de 15, 30 e 60 após
a infecção. Fragmentos do pulmão, fígado e baço foram fixados em formal tamponado e,
após 6 horas, desidratados em álcool 70% e clarificados em xilol. Os órgãos foram inclusos
em blocos de parafina e cortes de 5µm de espessura foram obtidos com o auxilio de um
micrótomo. Os cortes foram dispostos em lâminas e incubados a 59-60°C para fixação. Em
seguida, foram lavados em xilol para retirada do excesso de parafina e reidratados com
concentrações decrescentes de álcool (do absoluto ao 80%). Os cortes reidratados foram
corados com hematoxilina e eosina (H.E), desidratados com concentrações crescentes de
álcool (de 80% ao absoluto), lavados com xilol e cobertos com lamínulas.
7-Recuperação de fungos
Animais infectados com P. brasiliensis foram mortos aos 15, 30 e 60 dias após
a infecção. Os fragmentos do pulmão baço e fígado foram retirados e submetidos a pesagem
em vials criogenicos contendo 1mL de PBS estéril. Lisados celulares de baço e fígado e
pulmão foram obtidos após a homogeneização com triturador mecânico (Ika-Werke, GMB4 &
Co. KG, Germany) e diluídos 1:10. Alíquotas de 100µL dessa diluição foram semeadas em
placas contendo Agar BHI (Oxoid Basingstoke, Hampshire, England) suplementado com
caldo filtrado de cultura da cepa 339 de P. brasiliensis e soro fetal bovino. A avaliação da
recuperação de fungo foi realizadaa partir da contagem de unidades formadoras de colônias
(UFC) de 7-14 dias de cultivo, corrigidas por grama de órgão e os resultados expressos em
UFC/g do órgão.
8-Dosagem de citocinas nos órgão de animais infectados ou não com P. brasiliensis
33
Animais selvagens (WT), bem como animais geneticamente deficientes de
CD4+ ou CD8+, infectados ou não, tiveram seus órgãos retirados (pulmão e baço) retirados em
diferentes dias de infecção. Estes órgãos foram pesados e divulsionados no homogeneizador
de tecidos (OMNI International 2000) em PBS 1x estéril, pH 7.2, contendo inibidor
enzimático (Protease inhibitor, Boehringer Mannhim, Germany). O homogeneizado foi
centrifugado a 250 g por 10 minutos à 4°C, e o sobrenadante colhido e estocado a -20°C ate
os ensaios de ELISA. Placas para ELISA de alta afinidade (Corning Costar Europe
Badhoevedrop, The Netherlands) foram recobertas (50µL/poço) com anticorpos monoclonais
específicos para a citocina a ser dosada, diluídos (10µg/mL) em tampão carbonato-
bicarbonato 0,006M, pH 9.5 (execto IFN-gama que foi diluído em tampão feito conforme
instrução do fabricante) e incubadas por 24 horas a 4°C. As placas foram lavadas três vezes
com solução tamponada de fosfato (PBS), pH 7.2, contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) em
lavador automático de placas (ImmunoWash 1575, Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA)
e incubadas com solução de PBS acrescido de 5% leite em pó desnatado (PBS-M), durante 1ª
2 horas à temperatura ambiente. A solução de PBS-M foi descartada e a placa lavada uma vex
com PBS-T. Aos poços da placa foram adicionadas as diluições dos padrões (curva padrão) e
as amostras, em duplicatas. A placa foi incubada a 4°C em câmara úmida por 24 horas,
lavadas seis vezes com PBS-T e os anticorpos secundários específicos para cada citocina
foram adicionadas, sendo que para IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-γ os anticorpos utilizados estão
conjugados com biotina (anti IL-4, 11b11, anti-IL-10: R&D Systems , anti-IL-12: C15.6 e
IFN-g: Pharmigen); e para TNF-α utilizamos anticorpo feito em coelho não marcado (Santa
Cruz, CA). Novamente, as placas foram incubadas por 1 hora a 37°C em câmara úmida e
lavadas 6 vezes com PBS-T. Logo após, adicionado às placas avidina-peroxidase (exceto para
34
placas de detecção de TNF-α), conforme instruções do fabricante (vector Lab. Inc.
Burlingame, CA, USA) e as mesmas foram incubadas por 1 hora à 37°C. As placas foram
novamente lavadas (6 vezes) com PBS-T e aos poços acrescentado o substrato da peroxidase,
o Tetra-methyl-benzidine (TMB, KPL, Gaithrsburg, MA, USA). A reação colorimetrica foi
bloqueada após 10 minutos com acido sulfúrico (Merck) 1N e a leitura realizada a 490nm em
leitura realizada a 490nm em leitor de microplacas (Emax, Molecular Devices Corporation,
Sunnyvale, CA, USA) A concentração das diferentes citocinas nos sobrenadantes dos órgãos
analisados foi determinada a partir dos valores obtidos com a curva-padrão realizada com as
diferentes diluições da citocina recombinante.
9- Obtenção do soro de animais infectados e não infectados
O sangue de animais infectados ou não foi coletado via retro-orbital em
diferentes dias após a infecção. O soro obtido através da centrifugação do sangue total a 1000
g por 5 minutos foi aliquotado (100µL), congelado e armazenado á uma temperatura de -20ºC
até o momento do uso.
10-Obtenção do Exoantigeno
Foram selecionados, ao acaso, três tubos contendo a cepa 18 do P. brasiliensis
cultivada como descrito acima. Uma massa celular fúngica foi gentilmente coletada e
suspensa em 1 mL de PBS 1x estéril, homogeneizada por 30 segundos em Vortex e
centrifugada a 1000 g por 10 minutos. O sobrenadante, contendo o exoantigeno, foi colhido e
a concentração protéica determinada por meio de um kit comercial de dosagem protéica (kit
Pierce, Rockford, IL, USA).
35
11- Dosagem de anticorpos
Anticorpos específicos para os antígenos produzidos por P. brasiliensis foram
medidos no soro de animais infectados por Pb 18 pelo método de ELISA. Placas de
poliestireno foram recobertas com 5µg/mL de exoantigeno de Pb 18, diluído em tampão
carbonato de sódio pH 9,5. As placas foram incubadas “overnight” a 4ºC e em seguida lavadas
com uso de lavador automático (ImmunoWash 1575, Biorad Laboratories, Hercules, CA,
USA) por 3 vezes com PBS pH 7,2 contendo 0,05% de TWEEN 20. A etapa seguinte foi a de
blqueio, onde 100µL de tampão PBS pH 7,2 com 5% de leite em pó desnatado (Nestlé,
Araçatuba, SP, Brasil) foram adicionados em cada poço. Após incubação por 2 horas à
temperatura ambiente, a etapa de lavagem foi repetida. Em seguida as amostras foram
adicionadas em duplicata, em diluições de 1:100 até 1:800 em tampão de bloqueio. As placas
foram incubadas por 3 horas à temperatura ambiente e em seguida lavadas. Para dosagem de
IgG total, utilizamos anticorpo de cabra conjugado com peroxidase (Zymed-Invitrogen, CA,
USA). Para dosagem de IgG2a e IgG1, utilizamos anticorpos de coelho e, em seguida,
anticorpos de cabra anti-coelho marcado com peroxidase (Zymed-Invitrogen, CA, USA).
Após lavagem foram adicionados em cada poço solução contendo substrato e cromogeno da
peroxidase, TMB (KPL, Gaithersburg, MA, USA). Esperou-se o desenvolvimento de cor por
no máximo 15 minutos, quando a reação foi finalizada pela adição de H2SO4 1N. A leitura foi
feita em leitor de ELISA eMax (Molecular Devices, Sunnyvle, CA, USA), medindo-se a
densidade óptica por poço, a 450ηm. A densidade óptica de cada diluição do soro foi
comparada e subtraída da leitura o branco e a leitura expressa em DO.
12-Análise estatística dos dados
36
Utilizamos análise de variância (ANOVA) e o método de Tukey-Kramer para
determinar as diferenças existentes entre o grupo experimental de camundongos
geneticamente normais (C57BL/6) e os grupos de animais geneticamente deficientes (CD4KO
e CD8KO), bem como entre animais infectados e não infectados. Para realização desta analise
utilizamos o programa estatístico GraphPad Prism versão 3.02 para Windows (GraphPad
Software, San Diego, Califórnia, USA).
37
______________________________________________________________________ Resultados
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1- Susceptibilidade de camundongos geneticamente deficientes de MHCII e β2
microglobulina à infecção por P. brasiliensis.
Com o intuito de determinar o papel de células T CD4+ e CD8+ durante a infecção por
P. brasiliensis, camundongos selvagens (WT), geneticamente deficientes de MHCII (CD4KO)
e geneticamente deficientes de �2-microglobulina (CD8KO) foram infectados com 1x106
leveduras viáveis de P. brasiliensis por via intravenosa. A sobrevida dos animais foi observada
durante 100 dias após a infecção.
Os resultados mostraram que 45% dos animais CD4KO sucumbiram à infecção por
volta do 35º dia de infecção, e após 55 dias todos os animais já estavam mortos. De forma
surpreendente, 100% dos animais CD8KO sobreviveram à infecção durante o período
observado, semelhante ao observado para os animais selvagens (WT) (Figura 1). Esses
resultados mostraram que a ausência de células T CD4+ está relacionada com um aumento da
susceptibilidade dos animais a infecção por P. brasiliensis, sugerindo um papel essencial para
essas células na proteção contra o fungo.
2- Recuperação de fungos viáveis a partir de pulmão, baço e fígado de
camundongos C57BL/6, CD4KO e CD8KO.
Com o intuito de observar a capacidade de animais WT (selvagens), CD4KO e
CD8KO em conter o crescimento e a proliferação fúngica, analisou-se a quantidade de
unidades formadoras de colônia (UFC) recuperadas do pulmão, baço e fígado dos grupos
experimentais nos dias 15, 30 e 60 após a infecção. Após 15 dias de infecção animais CD8KO
apresentaram cerca de 10.000 leveduras recuperadas dos pulmões, o que é significativamente
maior do que o observado nos pulmões de animais CD4KO e WT (Figura 2A). Nos períodos
39
40
41
Nos períodos de 30 e 60 dias, a quantidade de leveduras recuperadas do pulmão de animais
CD8KO aumentou gradativamente (Figura 2B e 2C), chegando a 40.000 leveduras
recuperadas por grama de tecido no período de 60 dias (Figura 2C).
A quantificação de leveduras no fígado de animais selvagens e geneticamente
deficientes de linfócitos T CD4+ e CD8+ revelou que animais CD8KO apresentaram números
diminutos de leveduras recuperadas do tecido, com valores semelhantes ao observado para os
camundongos selvagens, em todos os períodos analisados (Figura 2A, 2B e 2C). De modo
contrário, altas quantidades de leveduras foram recuperadas do fígado de animais CD4KO
infectados com Pb18, aos 15 dias de infecção (5.000 UFC) (Figura 2A), já no período de 30
dias a quantidade de UFC duplicou, chegando a 12.000 UFC por grama de tecido, sendo os
mesmos valores observados aos 60 dias após a infecção (Figura 2C).
A análise do número de leveduras viáveis recuperadas do baço revelou que
camundongos WT e CD8KO não apresentaram números representativos de leveduras
recuperadas desse tecido, e esse padrão foi mantido durante todos os períodos analisados
(Figura 2A, 2B e 2C). Em contrapartida, animais CD4KO apresentaram um aumento
significativo na quantidade de fungo no baço, sendo recuperado cerca de 500 UFC por grama
de tecido aos 30 dias (Figura 2B) e 1.500 UFC no período de 60 dias pós-infecção (Figura 2C)
(P<0,001).
Estas observações sugerem que células T CD4+ são importantes para mediar
resistência à Pbmicose, uma vez que a ausência desta população celular levou a maior
disseminação do fungo para o baço e fígado.
3- Análise histopatológica de secções de pulmão e fígado de camundongos WT,
CD4KO e CD8KO infectados por P. brasiliensis.
42
A partir das amostras de pulmão e fígado obtidas de animais WT, CD4KO e CD8KO
infectados por P. brasiliensis foram confeccionados cortes histológicos que foram corados
com hematoxilina e eosina para a análise microscópica.
No tecido pulmonar de camundongos WT, aos 15 dias de infecção, observou-se um
infiltrado inflamatório composto predominantemente por células polimorfonucleares, com
presença de eosinófilos e neutrófilos na porção mais externa do granuloma. Além disso
estavam presentes macrófagos epitelióides. Alguns desses macrófagos já se apresentavam em
fase de fusão, dando origem às células gigantes multinucleadas ou células de Langerhans
envolvendo as células fúngicas, localizadas no interior da lesão, contudo não se detectou uma
estrutura bem organizada (Figura 3A). Aos 30 dias, observou-se granulomas epitelióides
maduros, com limites bem definidos, onde se detectou a presença de células epitelióides e
células gigantes multinucleadas no centro das lesões, bem como linfócitos e macrófagos ao
redor, alem de leveduras, predominantemente, na porção central, tendo sido detectada a
presença de polimorfonucleares porém em menor quantidade quando comparado ao período
de 15 dias (Figura 3B). Após 60 dias de infecção observou-se que animais WT mantiveram o
padrão celular semelhante ao observado aos 30 dias de infecção, porém com diminuição na
quantidade de polimorfonucleares e regressão no tamanho dos granulomas. Adicionalmente,
observou-se grande número de leveduras mortas (Figura 3C).
De maneira semelhante, observa-se em animais CD4KO durante o 15º dia de infecção
a presença de leucócitos polimorfonucleares, como neutrófilos e eosinófilos. Observou-se
também a ausência de células epitelióides e células gigantes multinucleadas (Figura 3D). A
resposta granulomatosa apresentada por animais selvagens e CD4KO durante esse período foi
basicamente composto por células da resposta imune inata. Aos 30 dias, os animais CD4KO
43
44
apresentaram granulomas no pulmão com presença de células mononucleares, na porção mais
externa do granuloma, além de uma grande quantidade de polimorfonucleares (Figura 3E). A
análise do desenvolvimento das lesões granulomatosas no pulmão de animais CD4KO revelou
no 60º dia após a infecção a presença de granulomas sem limite bem definido, além disso não
apresentam células diferenciadas, com poucos neutrófilos e grande quantidade de células
mononucleares (Figura 3F).
A análise histopatológica das lesões pulmonares de animais CD8KO aos 15 dias,
demonstrou que o padrão celular apresentado é semelhante aos animais WT, entretanto,
observou-se também a presença de células mononucleares. No período de 30 dias pós-
infecção, observou-se granulomas muito bem estruturados, com alta quantidade de linfócitos e
células mononucleares. Detectou-se também a presença de células em alto grau de
diferenciação, como células epitelióides, células gigantes, além de polimorfonucleares (Figura
3H). Aos 60 dias, observou-se a formação de uma estrutura tipicamente granulomatosa, com
células mononucleares presentes, predominantes na região externa, e a presença de
polimorfonucleares no interior da lesão (Figura 3I). Adicionalmente, observou-se aumento no
número de leveduras nas lesões, apontando para uma deficiência na capacidade de eliminar o
fungo.
A análise histopatológica do tecido hepático de animais WT revelou que aos 15 dias
observou-se um padrão celular muito semelhante ao encontrado no pulmão desses animais
durante o mesmo período. As estruturas granulomatosas eram compostas principalmente por
polimorfonucleares localizados na porção mais distal das lesões, com presença de eosinófilos
45
e neutrófilos, além de células mononucleares. Adicionalmente, observou-se a presença de
macrófagos epitelióides e células gigantes multinucleadas localizados ao redor do fungo.
Entretanto, observou-se a formação de granulomas epitelióides sem limites bem definidos,
caracterizando lesões granulomatosas imaturas (Figura 4A). Aos 30 dias, observou-se em
animais selvagens, granulomas epitelióides maduros, sendo possível detectar células gigantes
epitelióides no centro da lesão e linfócitos ao seu redor, com áreas bem delimitadas e uma
baixa quantidade de leveduras nesses granulomas (Figura 4B). A análise histológica do tecido
hepático aos 60 dias mostrou que, animais WT apresentaram granulomas bem formados com
o mesmo padrão observado nos pulmões (Figura 3C e 4C). Durante os períodos analisados,
observou-se a presença de granulomas em diferentes estágios em um mesmo período, dessa
forma, tivemos em uma mesma lamina a presença de granulomas maduros, bem organizados,
bem como a presença de granulomas imaturos com diferentes graus de organização.
A análise de lesões hepáticas de animais CD4KO aos 15 dias revelou a presença de
polimorfonucleares, entre eles neutrófilos, nesse período não detectou-se granulomas
compactos e bem formados (Figura 4D). No período de 30 dias, animais CD4KO,
apresentaram granulomas formados basicamente por células polimorfonucleares, com baixa
quantidade de macrófagos epitelióides, bem como células gigantes multinucleadas (Figura
4E). Animais CD4KO apresentaram um padrão desorganizado da resposta inflamatória
granulomatosa no fígado, sendo basicamente formado por células polimorfonucleares, porém
foram observados poucos linfócitos presentes na lesão. Adicionalmente, grande quantidade de
leveduras viáveis no interior dos granulomas foi observada (Figura 4F). Nesse grupo
experimental observa-se, com o transcorrer da infecção, um aumento contínuo de leveduras e
estas estavam viáveis no tecido, (dados da UFC; Figuras 2A-2C), bem como um grande a
46
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aumento no número de granulomas frouxos, o que poderia caracterizar a ineficiência da
resposta, a qual propiciaria a proliferação fúngica extrapulmonar.
De forma interessante, em animais CD8KO aos 15 dias, observou-se granulomas com
tamanhos pequenos, quando comparados a animais WT. Essas lesões granulomatosas eram
constituídas predominantemente por mononucleares, sendo possível observar também a
presença de células de Langerhans no interior dessa estrutura (Figura 4G). Um dado
interessante observado na análise histológica do fígado de animais CD8KO foi a presença de
áreas que indicaram morte celular. Aos 30 dias, estes animais demonstraram um padrão
semelhante ao observado aos 15 dias, entretanto nesse período (30 dias) detectou-se a
presença de poucos polimorfonucleares, com predomínio de mononucleares, principalmente
linfócitos (Figura 4H) e o mesmo fenômeno semelhante a morte celular foi observado nesse
periodo. Apesar de apresentarem um maior número de leveduras no pulmão, animais CD8KO
aos 60 dias de infecção apresentaram granulomas atípicos, porém compactos e eficientes em
conter a proliferação fúngica no fígado. Todas as lesões observadas nesse grupo experimental
apresentaram uma quantidade pequena de fungos no seu interior e ainda apresentaram lesões
com menor tamanho do que os observados em animais WT e CD4KO. Quanto à composição
celular, observamos um padrão celular semelhante ao apresentado nos períodos de 15 e 30
dias pós-infecção (Figuras 4G, 4H e 4I).
4-Dosagem de citocinas no pulmão de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO
após infecção por P. brasiliensis.
Uma vez determinada a maior susceptibilidade de animais CD4KO à infecção por P.
brasiliensis , o passo seguinte foi avaliar se a produção de citocinas se relacionaria com esse
quadro. Para tal, avaliou-se a produção de IFN-γ, TNF-α (resposta predominantemente Th1),
48
IL-4 (resposta Th2) e IL-10 (predominante em respostas com padrão regulatório) no macerado
do tecido pulmonar de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO após infecção por
P.brasiliensis (Figura 5)
Os resultados demostraram que animais WT produzem TNF-α, IL-4 e IL-10 em níveis
detectáveis, porém não elevados, durante a infecção por P. brasiliensis, no período de 30 dias
(Figura 5A), e esses níveis não são alterados no período de 60 dias pós-infecção (Figura 5B).
Em contrapartida, a produção de IFN-γ no pulmão de animais selvagens foi elevada aos 30
dias de infecção, sendo que essa elevação persiste aos 60 dias pós-infecção (Figura 5).
A análise da produção de citocinas no macerado de pulmão de animais CD4KO
demonstrou a presença de IL-4 em quantidade significativamente maior do que a observada
no pulmão de animais WT e CD8KO (P<0,05), no período de 30 dias de infecção (Figura
5A). No período de 60 dias, a quantidade de IL-4 aumentou de forma significativa, sendo 2
vezes maior em relação ao período anterior, superior aos valores encontrados para os animais
WT (P<0,001) (Figura 5B). Quanto à produção de IL-10, observou-se quantidades
semelhantes à detectada no pulmão de animais WT, sem alteração significativa no período de
30 dias (Figura 5A). Entretanto, aos 60 dias de infecção esses animais produziram cerca de 3
vezes mais IL-10 que o período anterior, sendo este valor significativo quando comparado ao
observado em animais WT (P<0,001) e CD8KO (P<0,05) (Figura 5B). A produção de TNF-α,
não mostrou diferença estatística entre animais WT e CD4KO no período de 30 dias (Figura
5A). Contudo, observou-se um aumento significativo dessa citocina no pulmão de animais
CD4KO após 60 dias de infecção (P<0,001) (Figura 5B). A análise da produção de IFN-γ por
animais CD4KO, revelou que camundongos deficientes de células T CD4+, produziram baixa
49
50
quantidade de IFN-γ (Figura 5A). Entretanto, a produção desta citocina aumentou no período
de 60 dias pós-infecção (Figura 5B).
Em relação à produção de citocinas por animais CD8KO observou-se que aos 30 dias de
infecção houve uma baixa produção de IL-4, semelhante ao observado para os animais WT no
mesmo período (Figura 5A). Todavia, essa quantidade aumentou aproximadamente 10 vezes
nos 60 dias após a infecção por Pb (Figura 5B) (P<0,001). Animais CD8KO produzem grande
quantidade de IL-10 no período de 30 dias de infecção, e este valor foi estatisticamente maior
do que o observado para os animais WT e CD4KO (P<0,001) no mesmo período (Figura 5A).
De forma interessante, observa-se um decréscimo na quantidade de IL-10 aos 60 dias de
infecção, mantendo uma diferença significativamente maior (P<0.05) em relação aos animais
selvagens. Animais CD8KO produziram uma quantidade significativamente maior de TNF-α
que os animais WT e CD4KO (Figura 5A), durante o período de 30 dias de infecção
(P<0,001). Entretanto, aos 60 dias pós-infecção houve uma diminuição na produção dessa
citocina (Figura 5B). A análise da produção de IFN-γ por animais deficientes de células T
CD8+, mostrou que aos 30 dias de infecção esses animais produziram altas quantidades dessa
citocina, e essa quantidade é significativamente maior do que a produzida por animais
CD4KO no mesmo período (P<0,001) (Figura 5A). De maneira interessante, observou-se um
aumento de 2 vezes na produção dessa citocina por animais CD8KO após 60 dias de infecção
(Figura 5B).
5- Dosagem de anticorpos séricos em animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO
infectados com P. brasiliensis.
IgG total:
51
Com a evolução da infecção por P. brasiliensis animais WT apresentaram um aumento
gradativo na quantidade de anticorpos produzidos específicos para os antígenos do fungo e
estes atingem valores máximos no período de 60 dias após a infecção (Figura 6A).
Durante os períodos de 15 e 30 dias, animais CD4KO apresentaram quantidades
semelhantes à observada em animais WT. Porém estes valores não foram significantemente
maiores que os produzidos por animais CD4KO não infectados e foi mantida após 60 dias de
infecção (Figura 6A).
Em relação aos animais CD8KO, não se detectous diferenças na produção dessa classe
de anticorpos entre animais não infectados e infectados após 15 e 30 dias. Entretanto, aos 60
dias pós-infecção ocorreu um aumento significativo na produção de anticorpos da classe IgG
específicos, sendo superior ao observado no soro de animais WT e CD4KO (Figura 6A).Além
da avaliação de IgG total presente no soro de animais infectados foi realizada a dosagem de
anticorpos IgG3 e IgG1 específicos, sendo estes predominantes em respostas de padrão Th1 e
Th2, respectivamente.
IgG1 e IgG3.
A analise da produção de IgG1 e IgG3 por animais WT revelou que estes produzem
níveis semelhantes de anticorpos IgG3 e IgG1 (Figura 6B e 6C) em seu soro em todos os
períodos observados, exceto aos 60 dias onde se observa um pequeno aumento na produção de
IgG1, quando comparada à produção de IgG3 (Figura 6B e 6C). Estes resultados indicam que
estes animais desenvolvem um padrão misto de resposta humoral. Os animais CD4KO
produziram níveis semelhantes de anticorpos IgG1 e IgG3 e observou-se um pequeno
aumento dos níveis desses anticorpos nos períodos de 30 e 60 dias pós-infecção (Fig. 6B e
6C)
52
53
Os dados mostraram que a produção de IgG3 no soro de animais CD8KO (Figura 6B)
aumentou gradativamente atingindo seu pico máximo após 60 dias de infecção, sendo esses
valores maiores do que os observados em animais WT e CD4KO durante os períodos de 30 e
60 dias pós-infecção. De maneira semelhante, camundongos CD8KO produzem níveis mais
elevados de imunoglobulina IgG1 especifica, quando comparado aos animais CD4KO,
principalmente, aos 60 dias de infecção (Figura 6C). Porém, foi evidente que apesar desses
animais possuírem um padrão misto de resposta, com níveis detectáveis de IgG1 e IgG3, os
níveis de IgG3 são superiores aos níveis de IgG1 (Figura 6B e 6C), o que indicaria um
predomínio de uma resposta Th1 nestes animais.
6- Sobrevida de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e CD8KO após a pré-infecção
com Pb 265 e desafio com Pb 18.
Após estabelecermos o papel das células T CD4+ e CD8+ durante a resposta primária a
infecção por P. brasiliensis, avaliou-se o papel dessas células durante a efetivação da resposta
imune de memória, para tal, camundongos selvagens (WT), geneticamente deficientes de
células T CD4+ (MHCII-KO) e camundongos geneticamente deficiente de β2 microglobulina
(CD8KO) foram pré-infectados com leveduras do fungo Pb265 (avirulento) por via
intravenosa. Decorridos 30 dias, esses animais foram desafiados com 1x106 leveduras da cepa
virulenta do fungo (Pb18).
Com o intuito de analisar se nosso modelo de “imunização” foi efetivo em alterar a
sobrevida desses animais, os animais dos diferentes grupos experimentais foram
acompanhados durante 100 dias.
54
Durante a análise da sobrevida dos animais WT e CD8KO, observou-se que não há
alteração na taxa de sobrevida dos animais após o processo de imunização (Figura 7A e C).
Entretanto, a análise da sobrevida de animais CD4KO após a pré-infecção com Pb265,
mostrou que animais CD4KO tornaram-se mais resistentes à infecção, uma vez que nenhum
dos animais desse grupo morre durante o período observado (100 dias), apresentando 100% de
sobrevida (Figura 7B). O que difere de modo significante ao observado em animais CD4KO
não imunizados, que sucumbiam até os 70 dias de infecção (Figura 7B). É importante
salientar que após a infecção por P. brasiliensis 265, os animais WT, CD4KO e CD8KO não
apresentaram alteração na taxa de mortalidade, além disso, a infecção não foi capaz de induzir
doença, mesmo em animais geneticamente deficientes.
7- Recuperação de fungos viáveis de camundongos C57BL/6, CD4KO e CD8KO
após a pré-infecção com cepa avirulenta e posterior desafio com cepa virulenta de P.
brasiliensis.
Com o intuito de observar se a pré-infecção com Pb265 (cepa avirulenta) altera a
capacidade dos animais WT (selvagens), CD4KO e CD8KO em conter o crescimento e a
proliferação fúngica após o desafio por Pb18 (cepa virulenta), analisou-se a quantidade de
unidades formadoras de colônia (UFC) recuperadas do pulmão, baço e fígado dos grupos de
animais experimentais nos dias 30 e 60 após a infecção.
Animais WT imunizados apresentaram diminuição na carga fúngica recuperada do
pulmão, baço e fígado comparado com animais WT não imunizados (Figura 8A, 9A e 10A)
55
56
57
58
59
durante o período de 30 e 60 dias. Esses resultados mostraram que a imunização adotada foi
eficiente e conferiu maior resistência à infecção, uma vez que levou a diminuição da carga
fúngica nos tecidos.
Em relação aos animais CD4KO, susceptíveis a proliferação fúngica no fígado, mas
não no pulmão (Figura 2), observou-se que a prévia inoculação com Pb 265 levou a uma
redução na quantidade de fungos recuperados em todos os órgãos no período de 30 dias pós-
infecção (Figuras 8B, 9B e 10B), sugerindo aumento de resistência à infecção. O mesmo
grupo de animais apresentou grande carga fúngica no fígado e baço aos 60 dias pós-infecção,
um padrão similar ao observado em animais não imunizados (Figuras 8B, 9B e 10B). Notou-
se aumento na carga fúngica no pulmão de tais animais (Figura 8B), diferindo
significativamente dos animais não imunizados que não apresentaram crescimento fúngico no
pulmão.
Os animais CD8KO aos 30 dias de infecção também apresentaram aumento da carga
fúngica no pulmão, órgão anteriormente afetado (Figuras 8C). Além disso, o fígado e baço
desses animais aos 60 dias após infecção apresentaram um grande aumento na quantidade de
UFC recuperadas nesse período (Figuras 9C e 10C). Nesse período detectamos também o
aumento acentuado no numero de UFC recuperadas do pulmão desses animais (Figuras 8C).
8- Análise histopatológica de secções de pulmão e fígado de camundongos
imunizados e infectados por P. brasiliensis.
O tecido pulmonar de animais WT pré-inoculados com Pb 265, 30 dias após o desafio
com Pb18 (Figura 11A e 11B), apresentou pequenos granulomas, compactos, com presença de
polimorfonucleares além de mononucleares com aparente ausência de leveduras, sugerindo
uma resposta imune efetiva e controle da infecção. Aos 60 dias, os animais WT imunizados
60
61
apresentaram pequeno infiltrado inflamatório com presença predominante de células
mononucleares e ausência de células polimorfonucleares (Figura 11B).
Animais CD4KO imunizados no 30º dia de infecção desenvolveram lesões
granulomatosas envolvidos por fibroblastos, no interior da lesão granulomatosa observa-se a
presença de macrófagos, além de grande quantidade de células gigantes que apresentaram
pequena quantidade de leveduras viáveis no seu interior (Figura 11C). A análise histológica
do pulmão de animais CD4KO após a imunização, de maneira intrigante, demonstrou que aos
60 dias pós-infecção observa-se um grande infiltrado inflamatório difuso em cerca de 70%
dos pulmões, não sendo possível observar lesões granulomatosas típicas, nem mesmo
presença de leveduras nesse período (Figura 11D). Entretanto, dados do experimento de UFC
mostraram altas taxas de leveduras viáveis presente nesse órgão durante o referido período
(Figura 11B).
A análise histológica de pulmão de animais CD8KO imunizados revelou, aos 30 dias de
infecção, a presença de granulomas com estrutura desorganizada, com presença de poucas
células gigantes epitelióides, muitos polimorfonucleares e baixa quantidade de
mononucleares, sendo possível observar leveduras viáveis no interior da lesão (Figura 11E).
Aos 60 dias, a análise histopatológica em animais CD8KO após a imunização revelou que os
granulomas possuem estrutura organizada, porém mostraram-se ineficientes no processo de
eliminação do fungo. Observou-se uma grande quantidade de células epitelióides porém não
muito diferenciadas, além de polimorfonucleares e células T ao redor da lesão (Figura 11F).
A análise do fígado dos grupos experimentais mostrou que, animais selvagens (WT),
aos 30 dias pós-infecção apresentaram lesões formadas principalmente por célula
mononucleares, pequenas com poucas leveduras no seu interior, poucas células gigantes, e
62
acumulo de leucócitos polimorfonucleares (Figura 12A). Aos 60 dias de infecção, em animais
WT imunizados observou-se granulomas em fase de resolução, com poucas células no local
da lesão, sendo essas principalmente células mononucleares. Além disso, não se observou
leveduras no interior das lesões, o que seria mais um indicativo da resolução da infecção
(Figura 12B).
Semelhante ao padrão apresentado por animais selvagens aos 30 dias, animais CD4KO
mostraram a presença de células mononucleares predominando durante esse período, e a
presença de poucos polimorfonucleares (Figura 12C). Aos 60 dias, os animais CD4KO
apresentaram uma grande quantidade de células mononucleadas no local da lesão
granulomatosa, em contrapartida detectou-se a grande quantidade de fibras colágenas tanto ao
redor quanto no interior da lesão (Figura 12D).
Bem semelhante à estrutura granulomatosa apresentada por animais CD8KO não-
imunizados, os CD8KO imunizados apresentaram lesões granulomatosas constituídas
predominantemente por mononucleares, sendo possível observar também a presença de
células de Langerhans no interior dessa estrutura (Figura 12E). A análise das lesões hepáticas
de animais CD8KO imunizados aos 60 dias pós infecção mostrou um infiltrado inflamatório
constituído predominantemente por células mononucleares localizados na região mais externa
do granuloma, e no interior da lesão observou-se a presença de poucos polimorfonucleares,
com grande presença de células gigantes multinucleadas (Figura 12F).
9- Análise da produção de citocinas no pulmão de animais C57BL/6 (WT),
CD4KO e CD8KO imunizados e desfiados com P. brasiliensis (cepa 18).
Observou-se alteração nos níveis das citocinas IL-4 e IL-10 produzidas por animais
WT após a imunização no período de 30 dias (Figura 5A e 13A), quando comparado aos
63
64
65
animais não imunizados. Esses valores foram significativamente maiores do que os observado
em animais CD4KO e CD8KO no mesmo período (P<0,001) (Figura 13A). A análise da
produção de IL-4 no período de 30 dias, em animais selvagens imunizados, mostrou que
houve um acentuado aumento na produção desta citocina nesse período (Figura 13A) em
comparação ao aos animais WT não imunizados durante o mesmo período (Figura 5A e 5B).
Entretanto, aos 60 dias, houve uma redução drástica na produção dessa citocina por esses
animais sendo dez vezes menor que o período anterior (Figura 13A e 13B). Quanto à
produção de IL-10, semelhante ao ocorrido com IL-4, animais WT após o processo de
imunização mostraram uma maior quantidade da citocina IL-10, sendo 4 vezes maior em
animais imunizados durante os primeiros 30 dias de infecção (Figura 5B e 13B). Aos 60 dias,
observamos uma pequena diminuição dessa citocina durante esse período, porém altos níveis
dessa citocina foram mantidos altos, e essa quantidade também foi maior do que apresentada
por animais não-imunizados (Figura 5B e 13B). Após a imunização, animais WT foram
estimulados a produzirem TNF-α, e essa quantidade produzida foi cerca de 4 vezes maior que
a dos animais não imunizados durante o período de 30 dias de infecção (Figura 5A e 13A).
Entretanto, aos 60 dias, detectamos acentuada queda na produção dessa citocina, voltando a
apresentar níveis semelhantes aos animais não imunizados durante esse período (Figura 5B e
13B). Quanto a produção de IFN-γ por animais selvagens após a imunização, observamos que
aos 30 dias pós-infecção esses animais produziram as mesma quantidades que animais não
imunizados, entretanto, aos 60 dias, os animais imunizados apresentaram uma quantidade
menor dessa citocina, quando comparado aos animais não imunizados durante o mesmo
período (Figura 5A e 13A). Esses dados demonstraram que o modelo de imunização
66
empregado favorece o aumento na produção de citocinas do padrão Th2 em animais selvagens
e, conseqüente direcionamento para esse tipo de resposta.
A análise das citocinas produzidas por animais CD4KO imunizados demonstrou que
altos níveis de IL-10 são produzidos durante o período de 30 dias pós-infecção apresentando
um aumento de 3 vezes em relação aos animais CD4KO não imunizados (Figura 5A e 13A),
contudo, ao compararmos aos animais WT imunizados observamos que esses níveis foram
inferiores no mesmo período (Figura 13A), entretanto essa diferença não foi significativa. A
quantidade de IL-10 detectada aos 60 dias pós-infecção em camundongos CD4KO
imunizados, foi semelhante ao observado nos mesmos animais no período de 30 dias de
infecção (Figura 13A e 13B). Acerca da produção de IL-4 durante o 30º dia de infecção,
observou-se baixos níveis de IL-4 com quantidades inferiores à produzida por CD4KO não
imunizados, porém sem diferença significativa (Figura 13A e 5A). Aos 60 dias de infecção,
não se observou alteração na produção desta citocina. Nesse período, os animais CD4KO após
a imunização apresentaram níveis iguais aos detectados aos 30 dias (Figura 13). Porém a
quantidade dessa citocina apresentou-se significativamente reduzida em relação aos animais
CD4KO não imunizados durante o período de 60 dias (Figura 13B e 5B). Quanto a produção
de TNF-α, os dados mostraram que mesmo após a imunização, animais CD4KO produziram
quantidade semelhante aos animais não imunizados aos 30 dias de infecção. Aos 60 dias pós-
desafio com Pb18, esses animais não apresentam alteração na produção dessa citocina,
diferente do observado em animais não imunizados que apresentaram aumento na quantidade
de TNF-α aos 60 dias, quando comparado aos 30 dias pós-infecção. De maneira semelhante,
a produção de IFN-γ por animais CD4KO imunizados não apresentou diferença após os
períodos de 30 e 60 dias pós-desafio (Figura 13A e 13B).
67
A análise da produção de citocinas após a imunização em animais CD8KO revelou a
presença de baixos níveis de IL-4 e IL-10 após 30 dias de infecção. Aos 60 pós-infecção
observa-se aumento na produção dessas citocinas, principalmente na produção de IL-10, que
aumentou 4 vezes, em relação ao período de 30 dias de infecção (Figura 13B), e IL-4
aumentou 2 vezes. Em relação as citocinas de padrão Th1(TNF-α e IFN-γ), os dados
mostraram que essas citocinas são produzidas, em níveis semelhantes aos observado em
camundongos WT imunizados durante os período de 30 dias pós-infecção (Figura 13A).
Entretanto, essa quantidade foi inferior à observada em animais CD8KO não imunizados
(Figura 5A e 11A). Aos 60 dias de infecção os níveis de IFN-γ mantiveram-se inalterados, e
iguais ao observado aos 30 dias de infecção (Figura 13A). Contrariamente, aos 60 dias
observou-se uma diminuição nos níveis de TNF-α, níveis esses semelhantes ao apresentado
por animais CD8KO não imunizados durante o período de 60 dias pós-infecção (Figura 5B).
10- Dosagem de anticorpos no soro de animais C57BL/6 (WT), CD4KO e
CD8KO imunizados e desafiados com P. brasiliensis.
IgG total:
Uma vez que a imunização com a cepa 265 do P. brasiliensis (não virulenta), levou a
proteção animais WT (total) e CD4KO (parcial) e não protegeu animais CD8KO à infecção
por P. brasiliensis, avaliou-se a resposta humoral desenvolvida por estes animais, através da
dosagem por Elisa de IgG total, IgG1 (Th2) e IgG3 (Th1).
Os dados mostraram que a imunização foi eficiente em estimular a produção de IgG
total em camundongos WT durante os períodos observados, 30 e 60 dias (Figura 14A).
Entretanto, esse aumento, aos 30 dias, não foi significativo quando comparado com os
68
69
resultados observados em animais controle (Figura 14A). Adicionalmente, os dados nos
mostraram um pequeno aumento nos níveis dessas Igs aos 30 dias pós-desafio, quando
comparado com animais WT não imunizados (Figura 6A e 14A). Aos 60 dias, esses níveis
aumentaram de modo significativo sendo bem evidenciados ao compararmos aos animais não
imunizados.
Ao analisar os dados dos animais CD4KO fica evidenciado que a imunização não foi
eficiente em estimular a produção de IgG durante o período de 30 dias (Figura 14A). Porém,
aos 60 dias pós-infecção, os dados mostraram um aumento nesses níveis, quando comparados
com animais CD4KO não imunizados (Figuras 6A e 14A).
De maneira semelhante, a imunização em animais CD8KO não foi capaz de induzir
uma resposta eficiente por células B na fase inicial da infecção (período de 30 dias). Contudo,
aos 60 dias (Figura 14A), notou-se aumento nos níveis dessa classe de anticorpos presente no
soro desses animais, quando comparado aos animais CD8KO não imunizados (Figuras 6A e
14A).
IgG1 e IgG3.
Ao analisar a produção de anticorpos IgG1 e IgG3 específicos aos antígenos do Pb
após a imunização, observou-se que não houve alteração nos níveis de IgG1 e IgG3 em
camundongos WT imunizados quando comparado com animais não imunizados nos períodos
de 30 e 60 dias pós-infecção (Figuras 6B e 6C, 14B e 14C), indicando um padrão misto de
resposta Th1/Th2.
A análise da produção de IgG1 e IgG3 por animais CD4KO nos mostrou que esses
animais produziram baixos níveis dessas imunoglobulinas após o processo de imunização, e
esses níveis foram inferiores aos observados em animais não imunizados, durante o período
de 30 e 60 dias pos-infecção (Figuras 6B e 6C, 14B e 14C)
70
De forma interessante, ao analisar a produção de IgG1 e IgG3 específicos em animais
CD8KO observou-se uma inversão no padrão de secreção de Ig, uma vez que a imunização
levou ao aumento na produção de IgG1 (Figura 14C), principalmente no período de 60 dias
pós-infecção, quando comparado aos animais CD8KO não imunizados. Além disso, os dados
mostraram que os níveis de IgG3 se mantêm durante esse período após a imunização (Figura
14B).
71
Discussão
72
A paracoccidioidomicose é uma doença sistêmica e as interações entre o fungo e o
hospedeiro humano determinam eventos imunopatológicos que são importantes para o
controle da disseminação fúngica. A resposta inflamatória a esse fungo é granulomatosa, e sua
formação e manutenção refletem o estado imunitário do hospedeiro, podendo se estabelecer
correlação entre a imunidade celular, as alterações histopatológicas e a gravidade da doença
(PERAÇOLI et al., 1982; MUSATTI, 1982). Pacientes com esta micose apresentam diferentes
graus de comprometimento da resposta imune celular, desde anergia até resposta imune
aparentemente preservada. O grau de depressão observado é variável, sugerindo, desta forma,
um padrão espectral para esta doença (MUSATTI et al., 1976; YARZABAL, 1980; LACAZ et
al., 1982). Neste sentido, os indivíduos com imunidade preservada apresentam doença
geralmente menos grave, com lesões isoladas, caracterizadas por granulomas epitelióides bem
definidos, nos quais poucos fungos são identificados. Diferentemente, a doença observada em
pacientes com depressão da imunidade celular é geralmente grave com tendência a
disseminação e as lesões são difusas, apresentando grande quantidade de fungos. Embora esta
heterogenidade de apresentação da PCM tenha sido correlacionada com a intensidade de
depressão da resposta imune do hospedeiro (MOTA et al., 1985), os mecanismos envolvidos
em modular este fenômeno ainda não são completamente conhecidos. A lesão granulomatosa
da paracoccidioidomicose se caracteriza pela constante migração de células do sistema imune
para o foco da infecção. Nessa resposta observa-se a migração preferencial de monócitos, que
são identificados como histiócitos no tecido pulmonar, os quais quando em contato com o
fungo e seus constituintes, sofrem alterações morfológicas que proporcionam a diferenciação
em histiócitos epitelióides e em células gigantes multinucleadas (MOSCARD-BACCHI et al.,
1989). Estas células apresentaram-se, ainda, dispostas de forma organizada, constituindo uma
lesão circunscrita e bem definida, o granuloma epitelióide, que corresponde à lesão
73
fundamental da paracoccidioidomicose (FRANCO & MONTENEGRO, 1980; MIYAJI &
NISHIMURA, 1983). Além disso, pode-se detectar a presença de células T. Estas células são
responsáveis pela defesa do hospedeiro contra o fungo, ocupando a porção mais externa do
granuloma. Sua função é definida pela produção de citocinas e atividade antifúngica direta,
levando a lise de fagócitos que contenham o fungo. Buscando esclarecer o papel de células T
CD4+ e CD8+ no desenvolvimento e manutenção das lesões granulomatosas induzidas por P.
brasiliensis, avaliou-se a capacidade de animais deficientes de MHCII (CD4KO) e deficientes
de β2m (CD8KO) durante a resposta imune após a infecção por P. brasiliensis.
Ao avaliar a resposta imune de animais CD4KO durante a infecção por Paracoccidioides
brasiliensis, os resultados mostraram que esses animais são mais susceptíveis que animais
selvagens a esta infecção fúngica, apresentando taxa de mortalidade igual a 100% (Figura-1).
No tecido pulmonar desse grupo experimental foi possível observar baixa quantidade de
fungos nas lesões, principalmente nos períodos de 30 e 60 dias pós-infecção (Figura-2A-C -3E
e F), mostrando uma eficiente eliminação do fungo no tecido pulmonar mesmo na ausência de
células T CD4. A eficiência da resposta pulmonar desses animais pode estar relacionada com a
presença de células T CD8+ neste tecido (dados não mostrados). Assim, em nosso modelo
experimental parece que a ausência de células T CD4+ não prejudica a migração de células
citotóxicas (CD8+) durante a infecção pulmonar. Essas células podem estar migrando em
direção à quimiocina MIP-1α, que está diretamente relacionada com a migração de células T
CD8+ (SCHALL et al., 1993; DENIS, 1995; SERODY et al., 2000). Dados da literatura
demonstraram que altas concentrações de MIP-1α são detectadas no lavado broncoalveolar de
pacientes com PCM (FORNAZIM et al., 2003). O aumento desta quimiocina pode indicar um
74
papel importante durante a regulação da migração e ativação de células inflamatórias, dentre
elas, células T CD8+.
Visto a maior susceptibilidade desses animais a esta infecção fúngica (Figura 1), o
menor número de leveduras recuperadas do pulmão de animais CD4KO foi inesperado,.
Contudo, apesar de apresentarem maior resistência à infecção pulmonar, houve a
disseminação do fungo para tecidos extrapulmonares (baço e fígado), revelando que a
ausência de células T CD4+ torna os animais incapazes de controlar a disseminação do fungo
(Figura 2A, B, C). A maior disseminação fúngica pode ser devido às alterações morfológicas
que encontrados no tecido pulmonar de animais deficientes de células T CD4. Os granulomas
desenvolvidos não apresentaram limites bem definidos, o que poderia facilitar a disseminação
do fungo.
Outro fator que poderia contribuir para a maior susceptibilidade de animais CD4KO a
infecção por P. brasiliensis seria o perfil de produção de citocinas desenvolvido por estes
animais. De fato, animais CD4KO apresentaram, de maneira interessante, um aumento na
produção de citocinas IL-4 e IL-10 no tecido pulmonar e estas citocinas estão diretamente
relacionadas com o quadro de susceptibilidade durante a infecção por P. brasiliensis
(BERNARD et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; PINA et al., 2004). Contudo, a presença de
IL-10 é importante para regular a resposta, (VAN DEN BROEK et al., 2000), evitando lesões
teciduais exacerbadas. Embora animais CD4KO tenham apresentado uma grande quantidade
de citocinas do padrão Th1, como IFN-γ e TNF-α, essas citocinas podem estar tendo sua
função inibida pela presença de IL-4 e IL-10, de fato, observou-se uma baixa diferenciação de
macrófagos em células gigantes multinucleadas, fato este que também pode contribuir para a
ineficiência da formação do granuloma.
75
A produção de IL-4 e IL-10 no pulmão de animais CD4KO poderia estar influenciando
no perfil de produção de imunoglobulinas. De fato, os resultados apresentados mostram
alterações na produção de anticorpos por animais CD4KO. A produção de anticorpos aponta
para a ausência de anticorpos opsonizantes, que facilitaria o processo de fagocitose das
leveduras e, conseqüentemente, sua eliminação. Na infecção por Candida albicans foi
demonstrado a importância dos anticorpos (células B) na opsonização e neutralização do
fungo, o que contribuiu para a maior resistência à infecção (WAGNER et al., 1996). De modo
semelhante, durante a infecção por M. tuberculosis observou-se que animais desprovidos de
células B apresentam número elevado na CFU recuperada dos órgãos (VORDERMEIER et al.,
1996).
Esses resultados comprovam o papel de células T CD4+ e sua importância na formação
de uma resposta granulomatosa eficiente. A importância das células T CD4+ em infecções
fúngicas têm sido descrita em diversos modelos experimentais que mostraram que a depleção
desse subtipo celular está relacionada com o aumento da mortalidade após a infecção por
Criptococcus neoformans (MODY et al.,1990) e P. brasiliensis (FIGUEIREDO et al., 1993,
UTIEL 1998). Confirmando esta afirmação, indivíduos infectados com HIV, que apresentam
baixa quantidade de células T CD4+ estão predispostos à infecção por diferentes fungos
oportunistas. De forma relevante, as funções atribuídas aos fagócitos mononucleares como
fagocitose, apresentação de antígenos e secreção de citocinas podem ser moduladas por células
T, em particular T CD4+, como mostrado nas infecções por Histoplasma capsulatum, C.
neoformans, Mycobacterium tuberculosis (GOMEZ et al.,1988; MODY et al.,1990;
HUFFNAGLE et al., 1991). Desta forma, a ausência dessas células, em nosso modelo,
implicaria em ativação ineficiente dos macrófagos e células B, fazendo com que ocorra a
76
ausência do “burst” respiratório o que prejudicaria a eliminação de P. brasiliensis, favorecendo
sua disseminação para o baço e o fígado.
Em relação à importância de células T CD8+, animais deficientes de β2 microglobulina
são resistentes à infecção por P. brasiliensis. Estes animais desenvolveram lesões
granulomatosas bem delimitadas no pulmão, com presença de linfócitos, polimorfonucleares e
células mononucleares ao redor das leveduras, porém as lesões eram maiores que o observado
em camundongos selvagens. Além disso, observou-se a presença de células com alto grau de
diferenciação, sendo possível detectar a presença de células epitelióides e células gigantes
(Figura-3H). Contudo, estes animais mostram-se ineficientes na eliminação do fungo, tendo
sido detectada a presença de grande quantidade de leveduras viáveis recuperadas a partir do
pulmão desses animais. Os dados obtidos sugerem a importância de células T CD8
(citotóxicas) durante o processo de eliminação de P. brasiliensis, e sua ausência está
relacionada com o aumento da susceptibilidade à infecção pulmonar, como demonstrado
anteriormente (CANO et al. 2000).
De forma interessante, ao analisar a recuperação fúngica em tecidos extrapulmonares
(baço e fígado), fica evidente que animais deficientes de células T CD8 apresentam menor
disseminação do fungo. Fato este confirmado pela análise histológica do tecido hepático onde
se observou a presença de granulomas pequenos, constituídos predominantemente por
mononucleares e células de langerhans no interior dessa estrutura (Figura 4G), e baixa
quantidade de leveduras. Essa maior resistência à disseminação fúngica pode estar relacionada
com o aumento do número de células T CD4+ nesses animais, o que pode acarretar em um
maior acúmulo destas células no local da lesão, dessa forma, maior produção de citocinas
importantes para a ativação de macrófagos e destruição das leveduras (BRUMMER et
77
al.,1988a; BRUMMER et al.,1988b; SOUTO et al., 2000). Como mencionado anteriormente,
citocinas como TNF-α e IFN-γ estão diretamente relacionadas com o controle desta infecção
fúngica e também por influenciarem na formação das lesões granulomatosas. No tecido
pulmonar de animais CD8KO foi possível detectar uma grande quantidade de citocinas do
padrão Th1, como IFN-γ e TNF-α, entretanto, os altos níveis dessas citocinas e a ativação dos
macrófagos locais não estaria sendo suficiente para promover uma resposta imune adequada
contra o fungo no tecido pulmonar. Uma vez que de forma sistêmica, observa-se que a
ausência de células T CD8 não influencia de forma significante a resposta dos animais a
infecção por P. brasiliensis.
Ainda em relação a menor capacidade de animais CD8KO em controlar a infecção
pulmonar, os altos níveis de IL-4 e IL-10 detectados no pulmão de animais poderiam explicar a
maior susceptibilidade desses animais à infecção pulmonar. IL-10 é uma citocina
imunoreguladora que atua modulando negativamente a ativação de macrófagos (VAN DEN
BROEK et al., 2000), em nosso estudo os altos níveis de IL-10 detectados poderia estar
influenciando na ativação do macrófago e conseqüente eliminação do fungo. Fato este que
pode ser confirmado pela diminuição na produção de TNF-α, aos 60 dias pós-infecção (Figura
5B). É importante mencionar que ambas as citocinas (IFN-γ e TNF-α) são ativadoras da
enzima oxido nítrico sintetase induzível (iNOS), que catalisa a produção de óxido nítrico,
caracterizado por ser uma molécula importante na morte tanto de conídios como leveduras de
P. brasiliensis (BOCCA et al.,1998; GONZALEZ et al., 2000), e as alterações na produção de
TNF-α poderiam influenciar na eliminação do fungo, justamente por diminuírem a produção
de óxido nítrico. Outra explicação plausível seria o papel central de células T CD8 na
eliminação do fungo do tecido pulmonar e contenção da disseminação fúngica. Fato este que
78
pode ser confirmado pelos dados obtidos com animais CD4KO que são mais resistentes a
infecção pulmonar, justamente por apresentarem um acumulo de células T CD8 no pulmão.
De forma interessante, animais CD8KO produzem anticorpos IgG3 (Th1) de uma
maneira mais efetiva e superior que animais CD4KO e WT (Figura 6A). A presença desse
isotipo diretamente relacionada com o desenvolvimento de um padrão de resposta Th1, que
sabidamente se relacionam com o melhor controle desta infecção fúngica. Adicionalmente,
pode-se inferir que a produção desta classe de imunoglobilina auxiliaria na inibição na
disseminação fúngica, uma vez que esses anticorpos são importante nos processos de
opsonização e neutralização de antígenos, o que contribui para uma resposta protetora às
diferentes infecções (DROMER et al., 1998; FLEURIDOR et al., 1999). Os dados obtidos
comprovaram a importância de células T CD8 (citotóxicas) durante o processo de eliminação
de P. brasiliensis, e sua ausência esta relacionada com o aumento da susceptibilidade à
infecção pulmonar convergindo com os dados observados por Cano et al (CANO et al. 2000).
Mas em relação à infecção sistêmica a ausência dessa população celular não influencia de
forma significante no estado geral dos camundongos.
Dados da literatura sugerem que células T CD4 são dispensáveis em promover
imunidade protetora mediada por vacinas contra infecções fúngicas pulmonares (blastomicose
e histoplasmose) (ALLENDORFER et al., 1999). No intuito de avaliar o papel de células T
CD4 e CD8 em mediar à imunidade protetora a infecção por P. brasiliensis, CD4KO e
CD8KO foram imunizados com uma cepa menos virulenta (ou avirulenta) de
Paracoccidioides brasiliensis (Pb265), e 30 dias após a imunização foram desafiados com
uma cepa virulenta de P. brasiliensis (Pb18) e a resposta imune avaliada.
79
De acordo com dados recentes da literatura (WÜTHRICH et al., 2003), os resultados
mostraram que as células T CD8 são capazes de mediar proteção contra a PCM letal, na
ausência de células T CD4+. Animais CD4KO após a imunização apresentaram um aumento
na sobrevida, igual ao observado para animais WT e CD8KO imunizados e não imunizados
(Figura 7). Esta melhora na sobrevida correlaciona-se com menor recuperação do fungo no
pulmão, porém somente durante o período inicial 30 dias pós-desafio. Após a imunização,
animais CD4KO desenvolveram lesões granulomatosas melhor estruturadas e organizadas,
quando comparado a animais não imunizados. Estes resultados demonstraram o importante
papel das células T CD8+ durante o desenvolvimento de uma resposta imune secundária inicial
e efetiva contra o fungo. Por outro lado, essa maior resistência persiste por volta de 75 dias
após a imunização dos animais CD4KO, não sendo desta forma duradoura. Os dados de
recuperação fúngica demonstraram bem este quadro, sendo possível observar que 60 dias pós-
desafio esses animais apresentaram altos índices de UFC recuperadas em todos os órgãos.
Ao analisar a produção de citocinas desse grupo experimental, observamos que após a
imunização esses animais produzem baixas quantidades de citocinas mesmo no período de 60
dias, diferindo de animais CD4KO não-imunizados que apresentaram aumento nos níveis de
todas citocinas aos 60 dias pós-infecção. Uma vez que citocinas podem influenciar diretamente
no processo de mudança de isotipo de imunoglobulinas, analisou-se a presença de anticorpos
no soro desses animais. Os resultados revelaram que animais CD4KO imunizados não
produzem altos níveis dos anticorpos, apresentando números semelhantes aos obtidos antes da
imunização. Dessa forma, os resultados sugerem que células T CD4+ são fundamentais durante
o processo de indução de uma resposta imune de memória eficiente e duradoura durante a
infecção por Pb.
80
É importante salientar que, inesperadamente, animais CD8KO imunizados
apresentaram alta quantidade de fungos recuperados do pulmão no período de 30 dias pós-
desafio, quantidade essa, que é semelhante àquela apresentada por animais CD8KO não
imunizados em um período mais tardio da doença (60 dias). De maneira intrigante, essa
quantidade de leveduras aumenta de forma exorbitante aos 60 dias em animais imunizados,
entretanto, não só houve um aumento no número de leveduras presente nos pulmões, mas
também no baço e fígado. Esses dados afirmam a importância das células T CD8+ durante a
infecção por Paracoccidioides brasiliensis, possuindo papel fundamental tanto durante o
evento de resposta imune primária, bem como na resposta secundária, e sua função citotóxica
sendo primordial para a eliminação do Pb. Assim, a ausência dessas células durante o processo
de imunização leva ao aumento da susceptibilidade à infecção por P. brasiliensis.
Ao analisar a produção de anticorpos de camundongos CD8KO após a imunização
ficou evidente que os níveis de IgG desses animais são inferiores aos apresentados por animais
WT imunizados (Figura-3). Adicionalmente, é possível observar um aumento nos níveis de
IgG1 (Th2) (Figura-4B) produzido por esses animais, corroborando com os dados mostrados
na analise histopatológica e UFC, onde os animais CD8KO após a imunização mostraram um
aumento na susceptibilidade à infecção, com disseminação fúngica para baço e fígado. Estes
dados demonstram a importância da resposta humoral associada à resposta celular durante o
estabelecimento da resposta protetora contra o fungo.
A produção de citocinas por animais deficientes CD8KO após a imunização, é
surpreendente, visto que é evidente que esses animais são incapazes de produzir uma resposta
efetiva contra o fungo. Os dados mostraram a presença de grandes quantidades de citocinas
pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ) e baixa produção de citocinas reguladoras (IL-4 e IL-10)
81
no pulmão destes animais. Esta falta de balanço na produção de citocinas por animais CD8KO
pode estar diretamente relacionada com o dano tecidual apresentado no tecido pulmonar
destes animais. Entretanto, aos 60 dias, é visível o aumento na quantidade de citocinas
antiinflamatórias e reguladoras, fato que, associado à diminuição nos níveis de TNF-α
influenciariam diretamente no processo de eliminação do patógeno e maior susceptibilidade á
infecção após a imunização. Além disso, os níveis elevados das citocinas IL-4 e IL-10
estariam inibindo a ativação dos macrófagos e acarretando em menor produção de iNOS e
consecutivamente NO, diminuindo assim a capacidade microbicida dos macrófagos.
As células T CD8+ têm sido mostradas eficientes em mediar respostas secundárias a
Histoplasma capsulatum (ALLENDORFER et al., 1999) ou vacina imunitária a Leishmania
major (RHEE et al., 2002) na ausência de células T CD4+. De fato, nossos dados apontaram
um papel fundamental das células T CD8 na proteção contra P. brasiliensis após o processo de
imunização. Entretanto, ao analisarmos animais geneticamente não modificados após o
processo de imunização, que são imunizáveis e capazes de montar uma resposta eficiente e
duradoura, fica evidente a fundamental importância da tríade APC/CD4/CD8 no processo de
indução de uma memória imunológica duradoura, uma vez que na ausência de células T CD4+,
temos a indução de resposta de memória, contudo, essa não é capaz de se manter por um longo
período, como o observado por outros pesquisadores (KAECH et al., 2002; CASTELLINO et
al., 2006).
De fato, ao analisar os dados de UFC de animais selvagens após o processo de
imunização, observamos que ocorre diminuição nos números de leveduras viáveis recuperadas
a partir de todos os órgãos (pulmão, baço e fígado) no período de 60 dias após o desafio,
mostrando assim que esses animais são imunizáveis e capazes de montar uma resposta
82
eficiente e duradoura, evidenciando assim a fundamental importância da ação simultânea das
células CD4+/CD8+/APC no processo de indução de uma memória imunológica duradoura
durante a infecção por Paracoccidioides brasiliensis, uma vez que na ausência de células T
CD4+, temos a indução de resposta de memória, contudo, essa não é capaz de se prolongar por
um longo período (KAECH et al., 2002; CASTELLINO et al., 2006).
Ao analisar a produção de citocinas de animais WT imunizados temos de maneira
surpreendente, animais WT produzem altas quantidades de IL-10 e IL-4 no período de 30 dias
de infecção, porém, a quantidade alta de citocinas diretamente relacionadas ao perfil de
susceptibilidade à PCM é acompanhada por altos níveis de citocinas pró-inflamatórias como
TNF-α e IFN-γ. Aos 30 dias após a imunização esses animais apresentam grandes quantidades
de TNF-α, citocina diretamente relacionada com o padrão de citocinas predominantemente
Th1, que envolve a produção de citocinas IL-2 e IFN-γ que estão associadas com a resistência
a paracoccidioidomicose experimental (BRUMMER et al.,1993). Provavelmente, as IL- 4 e
IL-10 estão sendo responsáveis pela regulação da resposta imune ao Pb, o que previne o
hospedeiro de montar uma resposta imune exacerbada, com grande quantidade de IFN-γ
(GAZZINELLI et al., 1996; VAN DEN BROEK et al., 2000). Estudos mostram que o excesso
de IFN-γ durante a resposta inflamatória a diferentes patógenos é a grande responsável por
lesões teciduais. Entretanto, a ausência de IFN-γ durante a infecção por P. brasiliensis está
diretamente relacionada a formas mais severas da doença, com isso podemos concluir que
IFN-γ é fundamental durante a resposta inflamatória. Todavia, é importante que seja
minuciosamente regulada para prevenir resposta exacerbada e danosa ao hospedeiro. Esse
quadro fica evidenciado em animais WT imunizados que possuem menor destruição tecidual,
conforme demonstrado nos resultados. Entretanto, aos 60 dias, é possível notar uma grande
83
diminuição na produção de IL-4, essa diminuição é acompanhada pela diminuição acentuada
nos níveis de TNF-α. A diminuição na produção de TNF-α foi esperada, uma vez que no
período de 60 dias pós-infecção é possível observar uma acentuada queda na carga fúngica
recuperada nos pulmões desses animais, que pode ser considerada fase de reparo tecidual,
onde o agente infeccioso é ausente e a necessidade de uma resposta inflamatória com altos
níveis de TNF-α, para ativar a função microbicida dos macrófagos, mostra-se dispensável.
Esses dados são confirmados quando observamos a análise histológica desses animais.
A analise da presença de anticorpos no soro de animais WT imunizados, que são
eficientemente protegidos após a imunização, com inibição do crescimento e disseminação de
leveduras nos órgãos observados, mostram uma alta produção de anticorpos da classe IgG,
sendo essa superior à observada antes da imunização, principalmente a produção de IgG3
apresenta-se em elevação. IgG3 está predominantemente presente em respostas Th1. Estudos
têm demonstrado que animais FCR-/-, onde a opsonização e a citotoxidade celular mediada
por anticorpos (ADCC) (TAKAI et al., 1994) são ausentes, mostram-se mais susceptíveis a
infecções fúngicas (YUAN et al., 1998) e bacterianas (RAVETCH & CLYNES, 1998).
Em resumo, nossos dados mostram que a susceptibilidade à infecção pulmonar dos
animais está diretamente relacionada com a produção de citocinas e anticorpos, com altas
quantidades de IL-4 e IL-10. A disseminação fúngica para baço e fígado pode ser conferida a
baixa quantidade de anticorpos IgG3 presente no soro.
Adicionalmente, os resultados obtidos durante o decorrer de nosso estudo sugerem que
as lesões granulomatosas, que são a expressão tecidual mais importante e característica da
infecção por Pb, têm sua manutenção modulada por células T CD4+ e T CD8+. O mecanismo
de ação das células T CD4+ estaria intimamente ligado com a aquisição de competência para
84
manter a lesão granulomatosa compacta com células diferenciadas capaz de conter o
crescimento fúngico. Essas células promoveriam ainda a diferenciação dos fagócitos
mononucleares, cuja ativação levaria à aquisição de atividade microbicida mais eficiente para
a eliminação ao fungo. Já as células T CD8+ estariam associadas com a capacidade de
eliminação das leveduras. Além disso, fica evidente a fundamental importância da atuação
sinérgica de células T CD4+/CD8+/APC no processo de indução de uma memória imunológica
duradoura, uma vez que na ausência de células T CD4+, temos a indução de resposta de
memória, porém não duradoura durante a infecção por P. brasiliensis.
85
___________________________________________________________________________________ Conclusões
86
Baseado nos resultados apresentados podemos concluir que:
• Animais CD4KO são mais susceptíveis à infecção por P. brasiliensis, por
produzirem baixas quantidades de IFN-γ e altas quantidade de IL-4 e IL-10, além
disso são ineficientes em produzir anticorpos,
• A imunização em animais CD4KO levou a uma proteção parcial, sugerindo que, as
células T CD4+ são importantes para a manutenção da imunidade protetora contra P.
brasiliensis,
• Camundongos CD8KO são mais resistentes durante a infecção experimental por P.
brasiliensis, produzem citocinas e anticorpos de padrão Th1,
• A imunização de animais CD8KO não induz a proteção à infecção por P.
brasiliensis.
87
______________________________________________________________________ Referências Bibliográficas
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