Marcadores Moleculares Introduo e Histrico Descrio de Marcadores Comparao entre Marcadores Moleculares Classificao de Marcadores Moleculares Caractersticas do Genoma de Planta Aplicaes diversidade gentica mapeamento e seleo assistida

INTRODUO E HISTRICO Marcadores Moleculares

Gentica arte e seleo inconsciente da inveno da agricultura at sc. XIX

1900s - Descoberta dos princpios genticos 1920-50 - Melhoramento gentico cientfico gentica quantitativa e biometria (fentipo previsor ruim do valor gentico!)

1970-80 - Utilizao de marcadores genticos moleculares

Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genticos herdveis dos ambientais Marcadores genticos so unidades herdveis simples

cromossoma

marcadores

Polimorfismo de DNA resulta acmulo de mutaes pontual ou insero/deleo macro-rearranjos: translocaes, inverses, delees

Origem do Polimorfismo Molecular1. Mutaes pontuais - SNPsA. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ATCTCGTGATTATAGTCGTA TAGAGCACTAATATCAGCAT ex. Stio EcoRI B.

2. Pequenas delees e/ou inseres - InDelsA. ATCTCGTCTAGTCGTA TAGAGCAGATCAGCAT ATCTCGT---GTCGTA TAGAGCA---CAGCAT B.

Histrico de Marcadores1. Karl Sax (1923): props mtodo para localizao de QTLsligao entre genes de caracterstica qualitativa (cor de semente) e quantitativa (peso de semente);

Problema: ausncia de mutaes mltiplas em estoque de elite, baixa viabilidade

2. Hunter & Markert (1957) - marcas bioqumicasdesenvolveram isoenzimas em gel de amido

Histrico de Marcadores3. Hubby & Lewotin (1966)demonstraram que 30% de loci de isoenzimas exibiam polimorfismo em populaes selvagens de Drosophila;

4. 1970s - ferramentas molecularesdesenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrio; polimerases; ligases; Southern (1977);

Histrico de Marcadores5. RFLP proposto por Botstein et al. (1980)descrito para humanos

6. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987)7. VNTR por Jeffrey (1987) 8. RAPD por Rafalski et al. (1990)

Histrico de Marcadores9. SSR em plantas por Akkaya et al. (1992)10. AFLP por Zabeau & Vos (1993) 11. CAPS por Konieczny & Ausubel (1993)

12. SCAR por Paran & Michelmore (1993)13. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis

DESCRIO DOS MARCADORES MOLECULARES

Marcadores Moleculares RFLP VNTR (minissatlite) RAPD, AP-PCR, DAF PCR-especfico - SSR, ISSR, CAPS, SCARs AFLP SNPs

Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP RFLP examina diferena em tamanho de fragmentos de restrio de DNA especficos Polimorfismo deriva de mutao pontual, insero, deleo Utiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecular

Metodologia de RFLP1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos 2. Separao dos fragmentos por gel eletroforese 3. Transferncia de fragmentos de DNA para filtro

Fonte: IPGRI

Metodologia de RFLP4. Visualizao dos fragmentos de DNA sondas marcadas (32P) ou a frio

5. Anlise dos resultados bandas analisadas para alelos e/ou presena/ausncia diferenas em padro de bandas reflete diferenas genticas

A escolha de sonda/enzima de restrio crucialFonte: IPGRI

Digesto de DNA Genmico e Separao em Geldigesto

23 4

5

DNASeparao em gel 1 2 3 4 5

1

Transferncia para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose2 31

5

4

Hibridizao em Nylon ou Nitrocelulose

Construo de biblioteca genmica ou de cDNA

mRNA ou DNA

cDNA

Clone cDNA

Biblioteca de cDNA

Eletroforese

Exposio em filme de Raios-X

Hibridizao com sonda marcada

Interpretao de resultados1 1 2 3 4 2 3 4 5 6

5

Stio alvo para sonda6 Stio de restrio Insero

Fonte: IPGRI

RFLP em Cana de Acar

Sorgo

Cana

P1 P2

1:1 3:1

Hibridizao com sonda de sorgo

1:1

3:1

Hibridizao com sonda de Cana

A

Herana de RFLPsB6 Kb

F18 Kb

8 Kb

6 Kb

F26 Kb 8 Kb 6 Kb 8 Kb 6 Kb 8 Kb

Anlise de Diversidade e Filogenia por RFLP13 5 6 2 8 A13 8 6 5 2

B

C

A

B

C

11 9

4

RFLP: sondas de locos nico DNA Nuclear biblioteca genmica biblioteca de cDNA

DNA Citoplasmtico biblioteca de DNA cloroplstico e mitocondrial

Sondas de RFLP so: locos-especfica, co-dominante espcie-especfica

RFLP: sondas multi-locus Repeties em linha (tandem) - til encontrada em vrios loci altamente polimrficas

Sequncia de Minissatlite

VNTR: variable number of tandem repeats uso em DNA fingerprinting uso de seqncias repetidas de fago M13

Interpretao dos resultadosA1A1 A1 A1 A1 A2 A2 A3

A1A2

A2A3

RepetioStio de Restrio

Fonte: IPGRI

Vantagens e Desvantagens de RFLP Reprodutvel Marcadores co-dominantes Simples Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas*Fonte: IPGRI

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD Amplifica seqncias annimas de DNA usando primers arbitrrios PCR com um nico primer Mtodo rpido para deteco de polimorfismos Marcador dominante Problemas de reproducibilidade 10 bases com >50% G+C

RAPDAA AaAA Aa aa

aa

Interpretao de RAPDs Marcadores RAPD so annimos Dados binrios (presena x ausncia) RAPD so dominantes (AA = Aa) Problemas de co-migrao mesma banda, mesmo fragmento? uma banda, um fragmento?

Questionamento para filogenia banda homlogas?

PCR com primers arbitrrios:acmulo de siglas! RAPD DAF Random Amplified Polymorphic DNA DNA Amplification Fingerprinting Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por incluir todas as pequenas variaes na tcnica)Fonte: IPGRI

AP-PCR MAAP

Diferenas entre ensaios com primers arbitrrios RAPD 10mers, gel de agarose corado com brometo

DAF 5mers, gel de acrilamida e reao marcada32P

AP-PCR 10mers, gel de acrilamida e reao marcada32P

Microssatlites

Seta: alelos genoma B