MANUAL DE PROCEDIMENTOS BSICOS EM MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO HOSPITALAR

MDULO 3

PROCESSAMENTO DE MATERIAL CLNICO IDENTIFICAO DOS MICRORGANISMOS DE IMPORTNCIA CLNICA

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Introduo Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e outros Gram positivos Neisserias Enterobactrias Bactrias No Fermentadoras Bacilos Curvos ou Espiralados

7. Bacilos Gram positivos 8. Fastidiosos 9. Anaerbios 10. Interpretao de Resultados e Relatrios

Autores

Introduo Enterobactrias Fastidiosos, Espirilados, Aeromonas e Vibrio Bacilos Gram positivos Interpretao e Relatrios Dr. Carlos Emilio Levy - Centro Infantil Dr. Domingos Boldrini - Campinas SP Estafilococos e Estreptococos Dra. Angela von Nowakonski - Servio de Microbiologia Clnica do Hospital das Clinicas da UNICAMP

No fermentadores Dr Carlos Emilio Levy e Dr Igor Mimica

Anaerbios Dr. Igor Mimica e Dra.Lycia Mimica - Faculdade de Cincias Mdicas da Santa Casa de So Paulo SP

Revisores:

Dr. Lauro Santos Filho - Departamento de Cincias Farmacuticas da UFPB

Dr. Emerson Danguy Cavassin - Laboratrio de Microbiologia do Hospital das Clnicas da UE Londrina PR.

Captulo 1 INTRODUO ROTINA DE LABORATRIO 1. Introduo 2. Esquemas de Identificao: Meios de cultura 3. Microscopia: Tcnica para preparo do esfregao 4. Semeadura em Meios de Cultura 5. Incubao 6. Avaliao do crescimento e Contagem 7. Identificao 8. Esquema geral de identificao bacteriana

Captulo 2 ESTAFILOCOCOS, ESTREPTOCOCOS, ENTEROCOCOS E OUTROS COCOS GRAM POSITIVO 1. Introduo 2. Identificao preliminar 3. Identificao de estafilococos 4. Identificao de estreptococos

Captulo 3 NEISSERIAS 1. Introduo 2. Isolamento 3. Transporte e semeadura do material 4. Bacterioscopia e identificao

Captulo 4 ENTEROBACTRIAS 1. Introduo 2. Tipos de Testes Utilizados 3. Etapas da Identificao de Enterobactrias 4. Identificao da Enterobactrias de importncia Clnica 5. Identificao Sorolgica

Captulo 5 BASTONETES NO FERMENTADORES 1. Introduo e provas de identificao 2. Procedimentos para a identificao 3. Tabelas de Identificao dos Bactrias no fermentadoras 4. Tabela Geral de Consulta para identificao de Bactrias no fermentadoras 5. Referncias bibliogrficas Captulo 6 BACILOS CURVOS OU ESPIRALADOS 1. Introduo 2. Campylobacter 3. Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas 4. Referncias bibliogrficas

Captulo 7 BACILOS GRAM POSITIVO 1. Introduo 2. Orientao geral para identificao de bacilos Gram positivo 3. Corineformes 4. Listeria, Erisipelotrix e Kurthia 5. Bacilos esporulados 6. Actinomicetos 7. Referncias bibliogrficas

Captulo 8 FASTIDIOSOS 1. Caractersticas gerais 2. Bartonella 3. Bordetella 4. Brucella 5. Francisella

6. Haemophilus 7. Legionella 8. Pasteurella 9. Actinobacillus 10. Capnocytophaga 11. Eikenella 12. Kingella 13. Cardiobacterium hominis 14. Chromobacterium violaceum 15. Streptobacillus moniliformis

Captulo 9 BACTRIAS ANAERBIAS ESTRITAS 1. Introduo 2. Fatores predisponentes 3. Processamento dos materiais, identificao e teste de sensibilidade aos antimicrobianos 4. Referncias

Captulo 10 INTERPRETAO DE RESULTADOS E RELATRIOS 1. Introduo 2. Relatrios microbiolgicos 3. Anlise microbiolgica 4. Sugestes de relatrios por material 5. Referncias

Abreviaturas:

AS = gar sangue AC = gar chocolate BAL=lavado bronquio-alveolar BHI = Brain Heart Infusion (infuso cerebro-corao) CLED = gar CLED CTA = Cystine Trypticase agar DNAse = prova da Desoxi-ribonuclease EIA = imunoensaio enzimtico ELISA = teste de imunoabsoro ligado a enzima H2S = cido sulfdrico H2O2 = perxido de hidrognio (gua oxigenada) LCR = lquido cefaloraquidiano ou lquor LJ = gar Lowenstein Jensen MC = gar MacConkey mL = mililitro MYC = Mycosel NYC= meio New York City ONPG =o-nitrofenil-beta D-galactopyranosideo PCR = reao de polimerase em cadeia PYR = pyrrolidonil aminopeptidase rpm = rotaes por minuto SAB = gar Sabouraud SS = gar Salmonella Shigella SPS = Polietanol sulfonato de sdio TIO = caldo tioglicolato TMM = gar Thayer Martin modificado TSB = tripticase Soy Broth (caldo tripticase soja) UFC= unidades formadoras de colnia

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CAPTULO 1 - INTRODUO ROTINA DE LABORATRIO1. INTRODUO: O objetivo deste fascculo dar orientaes sobre procedimentos da rotina microbiolgica a partir da chegada do material bancada at a identificao dos principais microrganismos de importncia clnica. 1.1. O Mdulo 3 compreende: Esquema prtico de seleo de meios mais empregados na semeadura para isolamento de microrganismos de rotina. Leitura dos materiais semeados com base nas caractersticas das colnias, bacterioscopia e principais agentes esperados. Esquema geral de identificao. Identificao dos gneros e espcies de bactrias de importncia clnica. 1.2. O microbiologista ou responsvel pela rotina dever conferir as requisies ou pedidos de exame de cada material e a respectiva amostra para: Verificar a existncia de pedido e amostra apropriadamente identificados. Tipos de exames solicitados. Se a quantidade de material suficiente. Aspecto da amostra - purulento, lmpido, hemorrgico, etc. 2. ESQUEMAS DE IDENTIFICAO: Meios de Cultura 2.1. Cultura para fungos ou micobactrias Para fungos: Sabouraud e Mycosel, ver orientao especfica para semeadura. Para micobactrias: Lowenstein Jensen, materiais contaminados com flora devem ser previamente descontaminados (escarro, urina, BAL, fezes) 2.2. Coprocultura - recomendava-se semear em caldo enriquecedor do tipo Selenito, Tetrationato, etc., que tm valor duvidoso, sendo indicado atualmente para pesquisa de portadores. 2.3. Escarro para tuberculose - deve ser conservado em geladeira ou tratado para descontaminao, antes de semear em Lowenstein Jensen.

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Tabela 1 - Meios de cultura para semeadura dos principais materiais clnicos Indicao de exames microscpicosMEIOS DE CULTURA MATERIALAC ASX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

LminaMCX X X X X X X

TIOX

OUTRO

LJ

SAB

MYC

Abscesso profundo Ferida cutnea/cirrgica Abscesso cerebral Abscesso pulmonar Bipsia 2.10 Coprocultura (fezes) 2.2 Lquido de Dilise 2.11 Endomtrio/ Amnitico Escarro piognicos Escarro para Tuberculose 2.3 Esperma/ Prosttico Fstula/ Dreno Gnglio 2.10 Lavado Brnquico (BAL) 2.4 Lquor (LCR) 2.5 Nasal/ Orofaringe Osso (Bipsia2.10 / Aspirado) Ocular Orofaringe Ouvido Peritonial/ Asctico Pleural Ponta de cateter 2.6 Sangue/ Hemocultura 2.7 Uretral 2.9 Urina 2.8 Vaginal/ Endocervical 2.9Legenda: AS= gar sangue AC= gar chocolate CLED = gar CLED MC = gar Mc Conkey MYC = MycoselX

uma 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 uma duas duas duas SS no uma uma duas uma uma no 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 duas uma duas no uma duas uma uma uma 2.1 duas no uma TM CLED uma uma uma

X

X

TM

BAL =lavado bronco-alveolar (LBA) LJ = gar Lowenstein Jensen TIO = caldo tioglicolato TM = gar Thayer Martin (opcional) SAB = gar Sabouraud SS = gar Salmonella Shigella

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2.4. Lavado brnquico: Homogeneizar o material em Vortex; Centrifugar parte do material e fazer duas lminas com o sedimento; Se houver pedido de pesquisa de micobactrias e fungos, fazer quatro lminas; Semear 10 L com ala descartvel ou calibrada e semear em AC para contagem de colnias (1/100); Diluir 1 mL da amostra em 9,0 mL de salina estril, homogeneizar e semear 10 L em AC para contagem de colnias (1/1.000); Semear desta mesma diluio com a ala de 1 L em gar Mc Conkey para contagem de colnias (1/10.000). 2.5. Lquido Cfalo Raquidiano (LCR): Centrifugar por 10 minutos/ 2.000 RPM, quando purulento, semear sem centrifugar. Semear em AC + AS + TIO Quando solicitado, pesquisar Criptococos, usando colorao com Tinta da China.

2.6. Ponta de cateter: 5 cm da ponta do cateter deve ser rolada 5 vezes sobre a placa de AS, utilizando a tcnica semi-quantitativa de Maki. Quando enviado pedao maior de cateter pode-se injetar 1 mL de salina cultivar separadamente (lmen). A superfcie externa pode ser semeada pela tcnica de Maki 2.7. Hemoculturas positivas: Semear em AC e fazer bacterioscopia (Gram). Frascos para micobactrias, fazer bacterioscopia (Ziehl).

2.8. Urina: dever ser semeada com ala calibrada de 10 L em Agar CLED (Brolacin). Se houver pedido de bacterioscopia: colocar 10 L da urina sobre uma lmina nova e deixar secar, corar pelo Gram, e verificar a presena de bactrias. Urina para diagnstico da tuberculose: deve ser guardada em geladeira ou descontaminada antes de semear.

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2.9. Secreo vaginal, endocervical, uretral e urina: Fazer exame fresco de secreo vaginal para pesquisa de Trichomonas Centrifugar a urina para pesquisa de Trichomonas Na cultura para Neisseria gonorrhoeae suficiente gar-Chocolate. Para melhorar o isolamento, semear material endocervical e uretral, utilizando o meio seletivo de Thayer Martin. Mycoplasma e Ureaplasma swab uretral ou endocervical, removendo previamente a secreo e colhendo as clulas da mucosa por rotao do swab no canal. Usar meio de transporte especfico. 2.10. Para amostras slidas: bipsias, gnglios, amostras de tecidos, etc: Fragmentar o material com um gral e pistilo de porcelana ou vidro estreis contendo 1-2ml de salina estril ou caldo BHI ou TSB. Semear os fragmentos ou a poro lquida, e guardar o restante do material na geladeira para eventual uso. Estudos quantitativos so trabalhosos pois dependem de pesar o material slido, tritur-lo, diluir em volume definido de caldo (BHI, TSB ou Tioglicolato), bem como semear volume definido (10 ou 100L com pipeta calibrada, usando ponteira estril). O clculo para a contagem de colnias deve levar em conta o nmero de gramas de tecido usado e a diluio do caldo (UFC/grama de tecido). 2.11. Lquido de dilise: recomenda-se fazer cultura quantitativa semeando-se como urina, com ala calibrada e contagem de colnias, usando ala de 10 L e liberando o resultado em UFC/mL (multiplicando por 100). Paralelamente faz-se cultura qualitativa, semeando 2 a 3 ml em 5 ml de caldo (TSB, BHI ou Tioglicolato). No caso de cultura quantitativa negativa e qualitativa positiva, relatar: cultura positiva para (nome da bactria isolada), menor que 102 UFC/mL. 2.12. Casos especiais: No caso de secreo prosttica, em que o material bastante escasso, e existe contaminao uretral, recomenda-se semear rapidamente aps a coleta com ala calibrada de 10 L, e o resultado relatar em UFC/mL (multiplicando o nmero de colnias significativas do mesmo agente por 100),como para uroculturas.

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Para outros materiais escassos colhidos com swab em meio de transporte: (material de vesculas, swab de crnea ou conjuntiva, uretral, etc.), pode-se semear diretamente o swab nos meios de cultura indicados, ou tentar obter uma concentrao do material do swab colocando-o em tubo estril com 0,5 mL de salina estril e agitando no vortex (mixer). Centrifugar e utilizar o sedimento como inoculo, ou fazer esfregao para bacterioscopia.

Tabela 2 - Escolha de Meios de Cultura Seletivos em Relao ao Agente

Agente Bordetella pertussis Brucella spp Campylobacter jejuni Corynebacterium diphtheriae Legionella spp Listeria monocytogenes Mycoplasma/ureaplasma Neisseria Neisseria meningitidis Vibrio spp Obs: Existem meios cromognicos especficos para diferentes patgenos.

Meio especfico de acordo com manuais de fabricantes Agar sangue Bordet-Gengou Brucella agar Campylobacter agar Agar cisitina-telurito Agar carvo-extrato de levedura tamponado Agar Listeria McBride Transporte: Meio B10 Shepard Cultura: Meio A7 Shepard Thayer Martin Thayer Martin TCBS Salmonella spp e S. typhi, E. coli O 157 Para algumas espcies de Candida Listeria monocytogenes, etc.

3. MICROSCOPIA - Tcnica para preparo do esfregao: Utilizar lmina nova e limpa. Identificar a lmina de maneira segura. Rolar toda a superfcie do swab sobre a lmina para no destruir as clulas. Procurar no fazer esfregao espesso e nem muito delgado. Fixar rapidamente na chama. Quando material escasso, demarcar a rea do esfregao Proceder o mtodo de colorao mais apropriado.

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4. SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA: 4.1. Semeadura inicial - qualitativa Organizar as placas, pr-aquecidas em estufa(ideal para fastidiosos), ou temperatura ambiente, sobre a bancada conforme o material a ser semeado. Identific-las com o nmero da amostra e iniciais do paciente. Separar as lminas correspondentes cada exame, a serem preparadas e identific-las. Homogenizar o material, quando lquido (urina, LCR, sangue, pleural, etc.), escolher a poro mais purulenta no caso de secrees, ou no caso de fezes a parte com sangue, muco ou pus. Os swabs devero ser rolados sobre os meios de cultura, seguindo a sequncia dos mais ricos para os mais seletivos (AC, AS, MC). Com material muito lquido (LCR, pleural no purulento, concentrar o material por centrifugao a 2.500rpm (1500g) por 10-15 minutos e semear o sedimento. Na semeadura de rotina pode-se utilizar placas com divises de dois e trs compartimentos para racionalizao de gastos, mas seu uso exige maior habilidade na semeadura a fim de se obter colnias isoladas. Exs.: a) Semear hemocultura em placa trplice: gar sangue, gar chocolate e gar Mc Conkey. b) Semear secrees em placa dupla: gar sangue e gar Mc Conkey, proceder uma semeadura que permita o crescimento de colnias isoladas, etc. Tcnica de Semeadura Qualitativa - A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feito com o prprio swab (do meio de transporte), ou amostra do material removida com ala (estril) flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentrao do inculo, que permita o isolamento de todas as colnias diferentes. Recomenda-se que a semeadura e a leitura das placas sejam realizadas pelo mesmo profissional para aprimorar a tcnica de semeadura e isolamento de colnias. Fig 1 Descarregar o material num canto da placa, Flambar a ala Esfriar a ala em um canto do gar Semear partindo da ponta da primeira semeadura

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A cada mudana de direo flambar a ala e esfri-la. 4.2. Semeadura Quantitativa - Materiais indicados ou recomendados

Urina BAL (lavado bronco alveolar) Aspirado traqueal Bipsia de tecido Lquido de dilise Secreo prosttica Cateter (tcnica de Maki e outras) 4.2.1. Tcnica de Semeadura Quantitativa O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do nmero de ufc obtidas aps incubao. Utilizam-se dois artifcios para o efeito de diluio do material: uso de pequenos volumes- normalmente de 1, 10 ou 100 L. O nmero de ufc obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 mL, relativo ao volume inoculado; 1.000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por ala calibrada ou pipeta com ponteira estril. tcnicas dilucionais- costuma-se utilizar a diluio seriada do material em escala decimal, isto , 1:10, 1:100, 1:1.000... O nmero de ufc obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 mL, relativo diluio utilizada; 10, 100, 1.000..., respectivamente.

Procedimentos gerais homogeneizar o material com agitao manual em diferentes direes ou em vortex (mixer) obter o volume definido pela tcnica com o auxlio de uma pipeta com ponteira estril ou ala calibrada. No caso da ala, observar a integridade da pelcula formada at deposita-la na parte superior da placa. Ainda com a ala, sem flambar at o final da semeadura,

distribuir o material em linha reta at a outra extremidade. Perpendicularmente, distribuir o material por toda a superfcie de

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maneira uniforme. Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes, ou at que a superfcie da placa esteja seca, alterando a direo da estria (Figura 2) evitar o uso de placas midas e, aps semeada, no incubar caso haja umidade na superfcie do agar evitar o rompimento do agar, estriando o material suavemente uma suspenso com 105 ufc/mL deve resultar em um tapete de colnias que cubra toda a superfcie do agar de maneira uniforme, com colnias confluentes

Figura 1

a) Inoculo inicial

b) Espalhamento

5. INCUBAO determinados.

a incubao deve seguir alguns parmetros

5.1. Atmosfera Para bactrias no exigentes em secrees, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera ambiente. Para bactrias exigentes tais como: pneumococos, hemfilos e Neisserias ou fastidiosos incubar em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 35% de CO2). Para Campylobacter necessrio tenso de 5 a 10% de CO2 e restrio de O2 sendo conveniente o uso de geradores especficos.

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Para bactrias anaerbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita (vide captulo especfico).

5.2. Temperatura 36oC +/- 1oC a temperatura para a grande maioria das bactrias da rotina, incluindo os anaerbios e micobactrias. Fungos podem ser cultivados a 30oC ou 25 e 35oC (vide fascculo especfico) 42oC pode ser necessrio para isolar espcies de Campylobacter, Acinetobacter baumannii, e algumas espcies de Pseudomonas. 5.3. Umidade Bactrias fastidiosas e exigentes (Neisserias patognicas e hemfilos) crescem melhor se forem incubadas num recipiente com tenso de 5% de CO2 com um chumao de algodo embebido em gua estril. 5.4.Tempo Em geral a primeira leitura realizada com 18 a 24horas de incubao ou em casos de urgncia para iniciar a identificao e antibiograma, a partir de 6 horas possvel visualizar crescimento de algumas enterobactrias. Para anaerbios recomendvel a primeira leitura com 48 a 72h de incubao Para bactrias exigentes ou de crescimento lento o perodo de incubao pode ser bastante prolongado: Mycobactrias de 3 a 45 dias; Nocardia, 4 a 7 dias; Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas at 45 dias). 5.5. Leitura alguns aspectos so fundamentais na leitura inicial das placas para se estabelecer um diagnstico presuntivo e direcionar o exame. Caractersticas macroscpicas das colnias 5.5.1 Tamanho O tamanho das colnias dever ser considerado na placa como um todo, uma mesma cepa pode formar colnias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa Puntiforme (95% de acerto com poucas provas. Entretanto para as espcies dos gneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia os testes mais utilizados apresentam baixo poder de discriminao, sendo a identificao feita pelo maior percentual de probabilidade. necessrio destacar que padres no usuais podem ocorrer e que o microbiologista deve estar atento para analisar cepas que possam ter importncia clnica e epidemiolgica ou encaminh-las a Laboratrios de Referncia. Antes, no entanto, deve certificar-se que a anlise no esta sendo feita com cultura mista de bactrias. O meio de TSI inclinado em bico de flauta, de cor vermelho cereja e deve ser inoculado por picada central at o fundo, seguido de espalhamento na superfcie e incubao durante 18-24h a 35oC.

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Tabela 4 Provas do Meio de TSI1. Prpura/amarelo ( pice prpura e base amarela) =fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativos) 2. Amarelo/amarelo (pice e base amarelas)= fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 aucares) 3. Presena de gs (CO2) = bolhas ou meio fragmentado 4. H2S positivo= presena de precipitado negro

Tabela 5 - Interpretao do resultado das reaes encontradas no TSIpice Vermelho Vermelho Amarelo Vermelho Amarelo AmareloNeg = negativo

Base Vermelho Vermelho Vermelho Amarelo Amarelo Amarelov= varivel

H2S Neg Neg Neg Neg Neg Pos

Gs Neg Neg Neg V V V

Interpretao mais provvel Sem crescimento = bactria exigente Crescimento na superfcie = No Fermentador ou Gram (+) Crescimento na superfcie = Gram (+) Enterobactria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas Enterobactria Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter

Obs. A presena de H2S em bactrias lactose e sacarose negativas pode ser menos evidente pois a precipitao de sais de ferro pelo sulfeto de hidrognio depende de meio acido (Ex: Salmonella typhi)

3. ETAPAS DA IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS a. Anlise do crescimento nos meios ricos e seletivos A identificao de uma enterobactria comea com a anlise do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar: Secrees: agar sangue e Mac Conkey Lquidos nobres e bipsias: Agar chocolate e Mac Conkey Fezes: Mac Conkey e SS.

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Urina: CLED ou agar sangue e Mac Conkey, etc. Devemos considerar que : A enterobactria sempre cresce nos meios ricos (agar sangue, chocolate e CLED), bem como nos meios seletivos: agar Mac Conkey e SS. Os Gram positivos como regra no crescem em agar Mac Conkey e SS, exceto os enterococos que podem crescer. No agar Mac Conkey e SS, alm das enterobactrias e dos enterococos, podem crescer bactrias no fermentadoras e Candida. Portanto caracteriza-se uma enterobactria quando ela esta presente em todos os meios semeados, mas ainda necessrio diferenciar de outros microrganismos no muito exigentes como no fermentadores, enterococos e Candida spp. Recomenda-se a seguir realizar: b. Gram da colnia isolada Recomenda-se sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretao (diferenciar cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativoe e leveduras). c. Prova da oxidase - indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio que tambm so fermentadores. d. Prova do metabolismo fermentador - triagem utilizando os meios de OFglicose(quando suspeitar de no fermentador), TSI (Trplice Aucar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para enterobactrias. e. Srie bioqumica complementar sempre necessria para caracterizar gnero e espcie. O nmero de provas vai permitir maior ou menor discriminao(vide a seguir nvel de complexidade de provas).

As Enterobactrias caracterizam-se por se apresentarem como: bacilos Gram negativos, fermentadores da glicose, com ou sem produo de gs, oxidase negativas, reduzem nitrato a nitrito e que crescem bem no meio de Mc Conkey ou EMB. Como modelo de triagem na identificao bacteriana tem sido utilizado o meio de TSI (Triplice Aucar erro), que permite avaliar a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao de lactose e/ou sacarose e produo de H2S.

41 O TSI constitui o meio de identificao preliminar mais utilizado no mundo, sendo necessrio, no entanto, necessrio adicionar algumas provas, para completar a identificao e classificadas em dois nveis de complexidade: Nvel de complexidade 1: Motilidade, indol, lisina, uria, citrato, lactose (Mac Conkey), fenilalanina, DNAse e oxidase. Nvel de complexidade 2 - realizar as provas do nvel 1 mais: Ornitina, arginina, sacarose, arabinose, malonato, esculina e PYR.

3.1. Descrio das Principais Provas Bioqumicas a) Motilidade / H2S / Indol - Semear por picada at o fundo, e incubar 24hs/35oC.

Motilidade - Para testar motilidade pode-se utilizar os meios de Motilidade/indol com resazurina; SIM (motilidade, indol e H2S) e Mili (Motilidade, Indol e Lisina) Crescimento apenas na linha de picada = motilidade negativa Crescimento difuso em todo o meio = motilidade positiva H2S Produo de gs sulfdrico, verificado no TSI ou SIM H2S positivo = meio enegrecido H2S negativo = cor inalterada do meio Indol - Aps 24h de incubao, pingar 3-4 gotas de Kovacs na superfcie do meio presena de cor prpura = indol positivo cor do reagente = indol negativo

b) Uria de Christensen - inoculado apenas na superfcie e incubar 24h/35oC Urease positivo = cor vermelha (Proteus apresenta reao mais intensa) Urease negativo = mantm cor amarelada do meio

c) Citrato de Simmons - inocular na superfcie e incubar 24h/35oC Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio

42 Citrato negativo = cor verde (inalterado)

d) Fenilalanina - Inocular a superfcie do meio (inclinado) e Incubar 24h/35oC, aps crescimento pingar na superfcie 5 gotas do reagente cloreto frrico a 10% FA positivo = cor verde escuro na superfcie FA negativo = mantm a cor do meio inalterada 4. IDENTIFICAO DAS ENTEROBACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA 4.1. - Consideraes a) valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definio, para saber o real percentual de provas positivas ou negativas consultar a tabela geral b) PB (padro bioqumico) = probabilidade terica da bactria em questo apresentar o padro bioqumico analisado (os testes considerados so indicados pelo sinal #). Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relao s provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de ocorrncia)= 92%. c) Quando o PB baixo significa ter outro padro mais frequente. d) Os padres bioqumicos pouco freqentes, tero menor probabilidade de isolamento. e) No aplicado quando se considera gnero pois envolve vrias espcies com diferentes padres de testes (ex: Salmonella spp). f) Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (-) significa o percentual de cepas com resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+ = 75% das cepas so lisina positivas; g) V = valores >20% e 90%) o - Cultura: cresce em meios seletivos ou no em microaerofilia a 37 C por 5-7dias - Sorologia: til para determinar doena ativa por Enzima-Imunoensaio - Pesquisa no sangue, LCR e urina:microscopia em campo escuro (baixa sensibilidade) ou por imunofluorescncia direta os - Cultura: 1 . 10 dias de doena: LCR e sangue colhido com heparina em meio de Fletcher incubado temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura do sedimento urinrio alcalinizado aps a 1 semana da doena. - Sorologia: aglutinao ou ELISA so sensveis e especficos

Helicobacter pylori

Leptospira spp

- Linfa de leses observadas em campo escuro ou colorao pela prata (Fontana); presena de espiroquetas. Imunofluorescncia direta mais Treponema pallidum sensvel . - Sorologia: VDRL ou FTA-abs so muito teis para diagnstico* Recursos no citados: no teis ou no disponveis BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina

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2. Campylobacter Material: em gastroenterite colher fezes e enviar rapidamente ao laboratrio ou em meio de transporte de Cary-Blair semi-slido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais podem suportar o crescimento do C. fetus que a espcie que causa com maior freqncia infeces extra-intestinais. Microscopia: a colorao de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina bsica a 0,1% durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presena de leuccitos, mas a ausncia no contra-indica a cultura ou a suspeita diagnstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90% e elevada especificidade. Tabela 3 - Principais espcies de Campylobacter e ArcobacterBactria C. jejuni C. coli C. fetus Campylobacter spp Arcobacter* C. lari = R

Catalase + + + V +

H2S TSI neg neg neg + neg

Cresc. 0 15 C neg neg neg neg +

Cresc. 0 25 C neg neg + neg +

Cresc. 0 42 C + + neg + V

MC + + + V V

Ac.Nalidixico

Cefaloti na R R S S* V

S ou R S S ou R S ou R S

Isolamento: a maioria das espcies de Campilobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5% de CO2, 10% de CO2 e 85% de N2 (microaerofilia), obtidos com geradores especficos e no apenas com vela. Para aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtrao das fezes em filtro de acetato de celulose >0,45m. Vrios so os meios de cultura especficos para coprocultura por serem seletivos sendo na atualidade os mais recomendados o gar carvo desoxicolato cefoperazona, o meio Campy CVA (Cefoperazona , Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia gar, carvo ativado e suplemento de antibiticos). Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios no seletivos com geradores para microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42oC

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(todos crescem a 37oC). No exame direto em gota direto no microscpio entre lmina e lamnula pode-se observar a motilidade tipo hlice em movimento. As provas de crescimento devem ser feitas em gar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em microaerofilia. O teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina pode ser feito em qualquer meio no seletivo e ser considerado sensvel a presena de qualquer tamanho de halo. 3. Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas Como suspeitar da presena de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas? Duas so as principais evidncias: a) Isolamento de bactria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase positiva. b) Materiais clnicos que podem, eventualmente, serem associados com maior freqncia de isolamentos de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas:Tabela 4- Principais bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associao com diferentes quadros clnicos:Bactria/ Material clnico Vibrio cholerae V. parahaemolyticus Plesiomonas shigeloides A. hydrophila A. caviae A. veronii Diarria freqente freqente freqente freqente freqente Infeces partes moles pouco comum raro frequente raro raro Sepse raro freqente * freqente freqente freqente Outros raro raro freqente freqente freqente

*associado meningite em recm-natos

3.1. Vibrio As espcies do Gnero Vibrio so bacilos curvos ou s vezes retos, longos, anaerbios facultativos, mveis, fermentadores da glicose, em geral sem produzir gs, oxidase positivos. Alm do Vibrio cholerae, existem mais de 10 espcies patognicas para o ser humano. Algumas espcies podem causar gastroenterite, outras infeces cutneas e bacteremias. A clera, causada pelo V. cholerae produtor de toxina (dois biotipos: clssica e El Tor), responsvel por diarria secretria disseminada por via fecal-oral (gua, alimentos contaminados) em surtos e epidemias associadas a falta de

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condies sanitrias adequadas. O quadro clnico pode variar de assintomtico a diarria aguda com morte em 5 horas por desidratao e distrbio eletroltico. Casos espordicos podem ocorrer por ingesto de ostras e outros pescados crus ou mal cozidos. A coleta do material quando for fecal dever ser feita utilizando o meio de transporte de Cary & Blair, e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio devero ser encaminhadas a Laboratrio de Referncia, para registro epidemiolgico. Algumas outras espcies de Vibrios alm do V. cholerae necessitam de NaCl para crescimento. gar sangue e Mc Conkey permitem o crescimento da maioria das espcies, e neste ltimo meio as colnias so semelhantes a de bastonetes no fermentadores. A diferena que no TSI, EPM ou IAL h fermentao da glicose, como ocorre tambm com Aeromonas e Plesiomonas. So oxidase positivos, a maioria esculina negativa, DNAse positivo e quase todos crescem em caldo com NaCl 6%. 3. 2. Aeromonas e Plesiomonas Vivem em ambientes aquticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em gua de fonte, gua de lagos, guas poludas, etc. Plesiomonas preferem guas tropicais e no marinhas, sendo a Aeromonas mais tolerante s diferentes condies. Aeromonas tem sido isoladas em carnes, meio ambiente aqutico e produtos do mar, e suas diferentes espcies causam doenas no s no homem como em animais, peixes, rpteis, cobras e pssaros. Em nossa experincia comum o isolamento de Aeromonas em abscesso ps picada de cobra, lquido biliar em pacientes com colicistite, diarria, sepse (em pacientes com doena heptica crnica) e abscessos cutneos ps acidentes

(corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar Aeromonas e Plesiomonas depende da adoo do procedimento em se fazer o teste da oxidase em bactrias com caractersticas de Escherichia coli lactose negativa. As principais caractersticas das Aeromonas so: Lactose negativas, H2S negativo, fenilalanina negativo, indol positivo, motilidade positiva, e crescem bem em meios ricos e seletivos (Mc Conkey e SS).

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Tabela 5 - Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp, E.coli e Citrobacter sppBactrias/Provas E. coli Citrobacter spp Aeromonas spp1

Citrato Neg + Var

uria Neg Var Neg

lisina + Neg +

H2S Neg Var neg

Lactose + Var Neg1

Gs + + Var

Aeromonas caviae: lisina negativo e lactose positiva

Tabela 6 - Provas diferenciais para bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva: Aeromonas, Plesiomonas e VibrioProvas Cresce sem NaCl1

V. cholerae +1

Outros vibrios Neg + + +2

Aeromonas spp Plesiomonas spp + Neg + + + Neg + Neg

Cresce com 6% NaCl Oxidase DNAse1

+ + +2

Crescimento em caldo nutriente

exceto V. mimicus

Tabela 7 - Provas para diferenciar as principais espcies de Aeromonas e PlesiomonasBactria A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. jandaei A. schubertii Plesiomonas shigelloides Indol + + + + + Neg + Lis /arg /orn + + neg arabinose + + neg neg neg Neg neg Lactose neg + neg neg neg Neg neg sacarose esculina + + + + neg Neg neg + + neg + neg Neg Neg hemlise* + neg + + + Var neg

neg + neg + + + + + + neg

neg + + + + neg neg +

* sangue carneiro

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4. REFERNCIAS 1. MURRAY, P.R. Algorithms for identification of curved and spiral-shaped Gram negative rods. Manual of Clinical Microbiology, ASM, 7th ed. 1999. 712 715. 2. NACHAMKIN, I. Campylobacter and Arcobacter, in: Murray, P. R. et alli. Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology 7th. Ed. 1999, 716726.

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Captulo 7 - BACILOS GRAM POSITIVOS

1. INTRODUO: Este captulo aborda os aspectos prticos para identificao dos principais bacilos Gram positivos de importncia clnica. Bactrias consideradas: a) Corineformes: Arcanobacterium spp, Corynebacterium spp, G. vaginalis, Oerskovia spp, Rhotia spp b) Bacilos Gram positivos regulares: Erisipelotrix spp, Listeria spp, Kurthia spp c) Esporulados: Bacillus spp d) Bacilos ramificados (Actinomycetos): Nocardia spp, Rhodococcus spp, Streptomyces spp Bactrias Gram positivas que so citadas no texto para fins de diagnstico diferencial, mas que foram abordadas em outros captulos so: Actinomyces spp (anaerbios), Clostridium spp (anaerbios), Lactobacillus spp (anaerbios), Mycobacterium spp (micobactrias), Outros anaerbios: Mobiluncus spp, Propionibacterium spp, Eubacterium, Bifidobacterium spp. Os Actinomyces spp e alguns Propionibacterium spp embora anaerbios, podem ser aerotolerantese, e crescer em aerobiose. 2. ORIENTAO GERAL NA IDENTIFICAO DE BGPs: Para triagem inicial dos Bacilos/cocobacilos Gram positivos algumas

observaes e provas so fundamentais: a) Colher material com antissepsia rigorosa para evitar contaminao. b) Mesmo em lquidos estreis h risco de contaminao, por isso pede-se a coleta de no mnimo duas hemoculturas. No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presena de neutrofilia reforam a hiptese de ser agente infeccioso. c) Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos

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d) Procurar sempre ter bacterioscopia do material clnico onde foi isolado o Bacilo Gram Positivo (BGP) e verificar se h predomnio do agente em questo, relevante o achado dentro de macrfagos/neutrfilos. e) Valorizar materiais nobres (sangue, LCR, pericrdico, etc.), bipsias, aspirados de abscessos, LBA, etc desde que bacterioscopia e o quadro clnico sejam compatveis; f) Cuidado com contaminao por bactrias da flora de mucosas. g) Em caso de abscessos interessante fazer semeadura quantitativa (com ala calibrada), sendo sugestivo o isolamento de >104 ufc/mL h) Em urina sugestivo quando isolado como nico agente, bacterioscopia concordante, leucocitria, sintomas de infeco urinria e contagem >105 ufc/mL. i) Observar caractersticas da colnia: cor, tamanho, cheiro, consistncia, hemlise, etc. j) Testar em quais meios cresce o BGP e suas condies de incubao. k) Para observar esporos e hifas areas algumas vezes necessrio deixar a colnia envelhecer ou crescer em meios pobres. l) sempre interessante semear em meio slido e em caldo para observar variao morfolgica. Observar ramificaes em diferentes condies e meios de cultivo m) Fazer colorao de Ziehl ou de Kinyoum para pesquisa de lcool-cido resistentes. n) Lembrar que este grupo de bactrias pode variar muito nas caractersticas morfolgicas quando observado no material clnico, culturas jovens, culturas velhas, meios slido ou lquido, meio rico ou pobre, etc. sem que represente contaminao ou cultura mista. No entanto, algumas destas bactrias so habitantes de mucosas e podem causar infeco mista associada ou no com anaerbios estritos. 3. CORINEFORMES So classificados como corineformes as seguintes bactrias:- Corynebacterium spp - Arthrobacter spp - Brevibacterium spp - Curtobacterium spp - Exiguobacterium spp

- Arcanobacterium spp- Microbacterium spp - Aureobacterium spp - Cellulomonas spp - Turicella spp

-

Dermabacter spp Gardnerella spp Rothia spp

Entre os corineformes foram selecionados aqueles de maior importncia clnica, sendo recomendvel a caracterizao e provas diferenciais apenas dos gneros: Corynebacterium spp, Arcanobacterium spp, Gardnerella spp, Rothia spp

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Tabela 1 - Principais doenas associadas aos bacilos Gram positivosBactria Actinomyces spp, A. israelii, A. naeslundii, A.viscosus, A. odontolyticus e outros Arcanobacterium spp, A.nhaemolyticum Bacillus sp, B. anthracis, B. cereus C diphtheriae, C. ulcerans C. jeikeium C. pseudotuberculosis Erysipelotrix sp Gardnerella spp Lactobacillus spp Listeria spp Nocardia spp Oerskovia spp Rhodococcus spp Rothia spp, R. dentocariosa Streptomyces spp Quadro clnico Actinomicose - doena granulomatosa predominante cervico-facial faringite, infeco de partes moles,endocardite, etc Antraz, intoxio alimentar, sepse e pneumonia em imunossuprimidos e neutropnicos difteria endocardite, bacteremia Zoonose, linfadenite e abscessos celulite em veterinrios e zona rural vaginose, endometrite, ps-parto flora oro-intestinal e vaginal, rarssimo patgeno meningite, sepses, aborto abscesso cerebral, abscesso imunocomprometidos pulmonar, etc em

bacteremia, infeco associada a corpo estranho pneumonia, abscessos, etc em imunocomprometidos endocardite, bacteremia, infeces respiratrias Oportunista, infeces de partes moles, etc.

Tabela 2 Triagem inicial para Bacilos e Cocobacilos Gram positivosBactria Actinomyces spp Arcanobacterium spp Bacillus spp Clostridium spp Corinebacterium spp Erisipelotrix rhustiopathie Gardnerella vaginalis Lactobacillus spp Mobiluncus spp Listeria spp Mycobacterium spp Nocardia spp Oerskovia spp Ppropionibacterium spp Rhodococcus spp Rhotia dentocariosa Streptomyces spp esporo anaerbio AAR* ramificado neg + + neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg + neg neg + neg neg neg + + neg neg neg neg + neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg + + neg neg V neg neg + Raro/curto neg neg neg neg neg neg neg neg V + V + V + + hemlise neg beta V V neg alfa Beta/coelho neg neg beta neg neg neg neg neg neg neg catalase V neg + neg neg neg V neg + + + + V + + + Col. coral pleomrfico Raro, hifas

Obs:pleomrfico

paliada H2S + Gram lbil mvel mvel Cresc. lento Col. laranja Col. amarela

* AAR = alcool-cido resistente

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importante destacar que os corineformes correspondem a um grupo no homogneo de bactrias com poucas caractersticas em comum sendo tambm morfologicamente muito distintos: 3.1. Corynebacterium spp O gnero Corynebacterium compreende cerca de 50 espcies, sendo cerca de 30 de algum interesse mdico. Estas espcies podem ser diferenciadas por provas como: OF glicose, reduo de nitrato, urease, utilizao de diferentes carbohidratos e reao de CAMP. Principais caractersticas: No se ramificam e no so alcool acido resistentes Em geral so catalase positivos, imveis, esculina e gelatina negativos Morfologia: Variam muito na morfologia das diferentes espcies, e mesmo mesmas culturas em diferentes condies de cultivo. So bacilos Gram positivos, retos ou ligeiramente curvos, com extremidades em geral arredondadas, com a forma de clava, podendo apresentar arranjos caractersticos em paliada ou letras chinesas, podendo ou no apresentar grnulos metacromticos, que so melhor visualizados atravs da colorao de Albert-Laybourn, e que caracterizam as bactrias conhecidas como difterides. As corinebactrias de maior importncia clnica so catalase positivas,

imveis podendo ser fermentadoras ou no. So muitas as corinebactrias que pode-se isolar em material clnico, entretanto, de pouco interesse aprofundar na caracterizao destas espcies, exceto para fins de pesquisa ou epidemiolgicos. Corinebacterias de importncia clnica: Considera-se fundamental o laboratrio de microbiologia poder caracterizar ou afastar a possibilidade de isolamento das espcies de C. diphtheriae e C. ulcerans que podem pproduzir a toxina diftrica. Outra espcie de importncia em infeces hospitalares e freqentemente isolada em material clnico a C. jeikeium. Difteria: em virtude da vainao compulsria, a difteria na atualidade uma doena rara em pacientes imunizados, mas de importncia epidemiolgica quando detectada. A infeco caracteriza-se por processo infeccioso localizado em trato respiratrio e manifestaes txicas em corao e nervos perifricos. Quadro clnico: Ocorre dor de garganta, dificuldade de deglutio, presena de pseudomembrana purulenta, dor no corpo, cefalia, nuseas e febre. A morte pode

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ocorrer por obstruo respiratria ou por miocardite. Pode ocorrer difteria cutnea com leses necrticas e, eventualmente, presena de pseudomembrana. O laboratrio deve processar o material semeando em meios no especficos como gar sangue e gar chocolate para pesquisa do Streptococcus pyogenes e outros patgenos eventuais, e encaminhar outro swab em meio de transporte para o laboratrio de referncia. Os meios especficos para a pesquisa de bacilo diftrico so os meios de enriquecimento de Loeffler e o meio seletivo e diferencial gar sangue-cistina-telurito. Coleta de material para diagnstico da difteria: O material de orofaringe ou nasofaringe deve ser colhido das bordas, abaixo da pseudomembrana purulenta. Bacterioscopia: A bacterioscopia do esfregado do material, bem como do crescimento no meio de Loeffler, aps colorao de Gram pode ser sugestiva caso sejam visualizados bacilos difterides, melhor caracterizados pela colorao de Albert-Laybourn. A identificao bioqumica das Corynebactrias potencialmente produtoras de toxina difcil em laboratrio no especializado. Recomenda-se, nestes casos, encaminhar o material ou contactar o Laboratrio de Referncia para orientao. 3.2. C. pseudotuberculosis: deve ser lembrado nos casos de veterinrios ou trabalhadores de zona rural com quadro de linfadenite, linfangite ulcerativa ou abscesso relacionado a manuseio de aborto de gado. Esta espcie pode ser produtora de toxina diftrica. As colnias so pequenas, branco-amareladas, urease positiva, CAMP reverso positivo (inibe a beta-hemlise do S. aureus em gar sangue com hemcias de carneiro).

Tabela 3 - Provas diferenciais para os corineformesBactria / Prova Arcanobacterium spp C. diphteriae C. jeikeium C. ulcerans/pseudot.* Corinebacterium spp Gardnerella vaginalis Oerskovia spp Rhotia spp1

Catalase neg + + + + Neg + var

O/F F F O F F F F F2

1

Motilidade neg neg neg neg var neg var neg

Uria neg neg neg + var neg neg neg*

Esculina neg neg neg neg neg neg + +

CAMP reverso + neg neg + neg neg neg neg

Hemlis e beta neg neg neg neg Beta neg neg2

Base CTA (cystine tripticase agar O = oxidativo e F = fermentador

gar sangue de coelho

Pseudotuberculosis

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Algumas caractersticas importantes de alguns corineformes: C. jeikeium: colnia pequena cinza ou translcida, bacterioscopia um pequeno cocobacilo gram positivo, resistente a vrios antibiticos (beta-lactmicos, gentamicina, etc). Associada a septicemia, endocardite, infeces de pele e tecido subcutneo. Infeces mais severas podem ocorrer em imunossuprimidos, como meningite, pneumonia e peritonite ou associada a prteses e procedimentos invasivos. Apresenta metabolismo oxidativo na base CTA, enquanto a maioria das Corynebacterium spp de importncia clnica so fermentadoras. Cresce em BHI com 1% de Tween 80, sendo lipoflica e no em caldo BHI sem Tween 80. Oxida a glicose, uria negativa, esculina negativa, PYR positiva.

3.3. Rothia spp - So pleomrficos podendo apresentar-se tanto na forma cocide como de bacilos. So catalase positiva, imvel e fermentador. Rhotia denticariosa: pertence microbiota da cavidade oral, e est raramente associada endocardite. So bacilos Gram positivo retos, sendo alguns ramificados. As colnias so brancas salientes e s vezes rugosas. So fermentadores da glicose e esculina positivo. 3.4. Arcanobacterium spp So bacilos Gram positivos irregulares, catalase negativa, imveis e fermentadores. Espcies: A. haemolyticum, A. pyogenes e A. bernardiae. So hemolticos, tm a hemlise melhor visualizada em sangue de coelho, e crescem melhor em CO2. Pode se apresentar como dois tipos de colnias no mesmo cultivo: lisas, mucides e brancas ou secas e cinza. Produz a prova de CAMP reverso (inibio da hemlise). Crescem em 24-48h como colnias pequenas e hemolticas. So bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatao terminal e ramificaes rudimentares. Colnias mais velhas tendem a adquirir a forma de cocobacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo tendem a formar ramificaes e em anaerobiose filamentos. Importncia clnica: Arcanobacterium haemolyticum tem sido considerado juntamente com S. pyogenes como agentes patogenicos em orofaringe, identificados e relatados com a finalidade de tratamento. Est associado com infeces de partes moles, faringite em jovens e raros casos de septicemia, endocardite e osteomielite.

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3.5. Gardnerella spp so pequenos bacilos ou cocobacilos irregulares, que se coram irregularmente pela violeta. A principal espcie a Gardnerella vaginalis, que tem uma classificao taxonmica incerta, para fins didticos estudada com os coryneformes. pleomrfica, Gram varivel (ora Gram negativa ora parcialmente e fracamente Gram positiva), imvel, sem cpsula. um anaerbio facultativo, fermentador lento, catalase e oxidase negativos. Crescem no gar sangue humano e de coelho produzindo hemlise beta, mas sem hemlise no agar sangue de carneiro. So visualizadas e caracterizadas no exame citolgico e/ou no Gram pela presena das clue cells, que so clulas epiteliais abarrotadas de pequenos bacilos Gram lbeis, de modo a perder sua definio morfolgica. Importncia clnica: Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade reprodutiva, mas est associada vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal em substituio ao Lactobacillus de Doderlein. A vaginose bacteriana e a presena de Gardnerella esto associadas tambm ao parto prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite. Esta bactria comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e ps-aborto. Pode causar sepse em recm-nascidos e raramente infeco urinria em adultos. 3.6. Oerskovia spp - So microrganismos cocides ou na forma de bacilos resultantes da quebra de miclios, apresentam ramificao, hifas vegetativas, sem hifas areas e penetrao no gar. Catalase positivo, motilidade varivel e fermentadores. Oerskovia turbata e O. xanthineolytica, so bactrias do meio ambiente ou solo, com pouca importncia clinica, com raros casos de bacteremia e infeces em implantes de prteses. Cresce bem em gar sangue de carneiro e no agar chocolate. Cresce mal no meio de Sabouraud dextrose. O crescimento, quando ocorre, visvel aps 24-48h em anaerobiose ou 5% CO2. Apresentam colnias amareladas, catalase positiva em aerobiose, oxidase negativa. Fermentador da glicose, sacarose e lactose, hidrolisa gelatina, amido e esculina. 4. BACILOS GRAM POSITIVO 4.1. Listeria - So bacilos Gram positivos pequenos, uniformes, no ramificados, apresentando-se s ou em pequenas cadeias. A nica espcie importante para o homem entre as sete espcies conhecidas a L. monocytogenes. Mvel a temperatura ambiente

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(25 a 28oC) e imvel a 37oC. Crescem em gar sangue, gar Chocolate, CLED, gar nutriente, TSA e agar Mueller Hinton, mas no em Mc Conkey. As colnias so pequenas, crescendo melhor entre 30 a 37oC, e crescem tambm temperatura ambiente e a 4oC em trs a quatro dias. um anaerbio facultativo, catalase positivo, oxidase negativo, que produz cido de glicose e CAMP positivo. Alm disso, verificada prova da esculina rapidamente positiva, assim como uria, gelatina, indol e H2S negativas. Importncia clnica: Encontrada na natureza no solo, em matria orgnica em decomposio, gua, leite e derivados, carne, etc. Sendp encontrada como microbiota de diversos mamferos, aves, peixes, e insetos. Tem Importncia clnica particularmente para idosos e imunocomprometidos causando meningite, encefalite ou septicemia. Na grvida a infeco pode causar amnionite, infeco do feto com aborto, parto prematuro, meningite neonatal e sepse neonatal. Pode ocorrer em surtos, em geral relacionados a contaminao de alimentos. Isolamento: a partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos, gua, etc. Semear em gar sangue de carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresa tambm com outras bases (Mueller Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigaes epidemiolgicas. Identificao: bacilo Gram positivo, hemlise beta em gar sangue de carneiro, CAMP teste positivo, motilidade positiva temperatura ambiente, hidrlise da esculina positiva e NaCl6,5%+. 4.2. Erysipelotrix rhusiopathiae - Bacilo Gram positivo curto, de extremidades arredondadas anaerbio facultativo, no esporulado, no alcool cido resistente, ocorre s, cadeias curtas ou longas, sem ramificar. Existe na natureza, em matria orgnica, urina, fezes e carcaa de animais. Vive em animais, peixes e pssaros e causa erisipela em porcos. No homem causa uma zoonose (doena ocupacional de veterinrios e manuseadores de carne e animais) caracterizada por celulite que aparece no local da inoculao aps 2 a 7 dias. Caractersticas clnicas: A leso costuma ser violcea e com muita dor, acompanhada de edema endurado, sem supurao e bem delineado nas bordas. Ocorre linfangite regional e artrite adjacente. Disseminao da doena e endocardite podem

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ocorrer, particularmente em imunossuprimidos, cujo prognstico grave. Cicatrizao pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou mses, com possibilidade de recada. Coleta do material: material ideal para isolamento a bipsia colhida de maneira assptica. Swab da leso em geral negativa, pois o agente encontra-se na profundidade da borda endurecida. Isolamento: cresce em gar sangue, gar chocolate, caldo tripticase soja, a 35oC aerobiose ou 5% de CO2. No agar sangue cresce em 24 a 72h, como colnias minsculas, lisas e transparentes, mas o outro tipo de colnia, maior, rugosa e chata pode aparecer, bem como uma hemlise esverdeada em baixo da colnia no gar sangue. As colnias lisas so bacilos ou coco-bacilos Gram positivos, s vezes corandose mal pelo Gram Identificao: catalase negativo, imvel, cresce entre 5 a 42oC e em caldo NaCL6,5%, esculina negativa, fermenta lentamente a glicose sem produzir gs, uria e indol negativos, mas caracteriza-se por crescer no TSI produzindo H2S, lactose positivo, sacarose negativo.

Tabela 4 - Principais diferenas entre bacilos e cocobacilos Gram positivosMotil. o 25 C Mvel CAMP NaCl 6,5% test Esculina

Bactria/Prova Listeria monocytogenes Enterococcus spp Streptococcus beta hemolticos Lactobacillus spp

Gram Bacilo curto ou cocobacilo regular e largo Cocos ou cocobacilos em cadeias Cocos em cadeias Cocobacilos e cadeias longas Bacilo grande, cadeias, cocide em cultura velha Bacilos e cocobacilos pleomrficos cocobacilo ou filamentos longos

Catalase

Hemlise

Obs.

+neg

beta alfa beta gama beta

+neg

+/+ +/+neg / neg

neg

neg

neg

Neg *

neg

neg

no

neg

neg / neg No usa glicose

Kurthia spp Corynebacterium spp Erysipelotrix rhusiopathiae

+ +neg

Mvel

no

neg

neg / neg

Neg

V

neg

V / neg

neg

alfa

neg

neg / neg

H2S+

* S S.agalactiae (beta do grupoB) positivo

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4.3. Kurthia - So bacilos Gram positivos grandes em cadeias ou em paralelo, ou filamentos no ramificados e em culturas velhas tendem a ficar cocides ou bacilos curtos. So aerbios estritos, no esporulados, no alcool cido resistentes; so mveis, catalase positivo e no fermentadores. Crescem em gar sangue como colnias de cor creme no hemolticas, podendo ser confundidas com Bacillus spp. Habitat e importncia: vivem no meio ambiente, na gua, solo, animais, sua carne e seus derivados. Seu papel clnico questionado, pois no h relatos recentes de isolamento em casos significativos. Bacilos Gram positivos anaerbios que devem ser diferenciados: Lactobacillus spp - Flora da boca, intestino e flora vaginal (Bacilo de Doderlein). So anerbios estritos mas crescem em gar sangue e gar chocolate como colnias muito pequenas. So imveis e catalase negativa. Sem valor patognico. Mobilluncus spp - bacilos Gram positivos anaerbios estritos, curvos, mveis que vivem na trato genital humano e reto. Encontra-se aumentado nos casos de vaginose, juntamente com a Gardnerella. Propionibacterium spp, Eubacterium spp e Bifidobacterium spp anaerbios estritos que so analisados juntamente com os demais anaerbios.

5 - BACILOS ESPORULADOS AERBIOS E ANAERBIOS FACULTATIVOS: 5.1. Genero Bacillus: compreende cerca de 50 espcies de bacilos anaerbios facultativos que podem exibir a forma esporulada, corando-se mal pela violeta, quando em colnia mais velhas. As formas vegetativas so retas largas, podendo ser grandes, isolados ou em cadeias. A forma e localizao dos endosporos so teis para sua classificao: podem ser cilndricos, ovais, redondos, e eventualmente com forma de feijo posio central, sub-terminal, terminal dilatando ou no a clula me Todos so mveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides e a maioria catalase positiva. Na presena de on bicarbonato (HCO3-) e em anaerobiose ou CO2 os B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B. megaterium apresentam cpsula polipeptdica.

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Habitat e importncia clnica - Os Bacillus spp encontram-se basicamente no solo, gua, materia orgnica animal e vegetal nas condies mais variadas de temperatura, umidade, pH, etc.As duas espcies mais importantes e que devem ser reconhecidas pelo laboratrio de microbiologia so o B. antrhacis e B. cereus. Tabela 5 - Principais espcies de Bacillus relacionadas infecoEspcie de Bacillus Quadro clnico Antrhax cutneo Anthrax intestinal Anthrax pulmonar Necrose ou gangrena em partes moles Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar Infeces pulmonares,endocardite, meningite, osteomielite e endoftalmite Infeces de partes moles, abscessos bacteremia e sepse Bacteremia e sepse Intoxicao alimentar Intoxicao alimentar Bacteremia, sepse, endocardite e infeces respiratrias Frequncia de relatos Bastante frequente Raro Raro Bastante frequente frequente Muito frequente frequente frequente Pouco frequente frequente Muito frequente raro

Antrhacis

Cereus

Circulans Licheniformis Subtilis

5.2. Bacillus cereus - pode apresentar dois tipos de intoxicao: a) caracterizado por diarria, dor abdominal, que aparecem 8 a 16h aps a ingesto do alimento contaminado (carnes, vegetais, leite, molhos, massas, doces, bolos). b) Caracterizado por nuseas e vmitos que aparecem 1 a 5 horas aps a ingesto do alimento contaminado, principalmente arroz, mas pode ser os mesmos alimentos acima. 5.3. Bacillus anthracis - o passado era causa importante de mortalidade no gado, sendo os herbvoros altamente suscetveis, sendo reduzida pela vacinao e melhores condies de higiene. O homem pode adquirir a doena em contato com animais doentes (trabalhadores rea rural e veterinrios), no manuseio industrial de ossos, l, crina, e outros produtos animais e de forma eventual, sendo a forma cutnea quase a totalidade dos casos, com raros episdios intestinais pela ingesto de carne contaminada. Potencial risco elevado na comunidade quando usado em guerra biolgica.

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Quadro clnico: A forma cutnea no tratada pode ser fatal (menos de 20% dos casos), principalmente quando a leso prxima a cabea ou pescoo. As formas pulmonares e intestinais so mais graves pela dificuldade de diagnstico. No local de inoculao da forma cutnea aparece aps 2 a 3 dias uma pequena mancha ou ppula, seguida no dia seguinte de um anel de vesculas em torno da ppula, que ulcera, seca, escurece formando uma escara caracterstica que cresce, fica mais espessa e aderente aos planos profundos. O edema pode ser importante, mas tem a caracterstica de ser indolor e sem pus. A forma intestinal semelhante forma cutnea atingindo a mucosa com leses e eventualmente gastroenterite. No antraz pulmonar o esporo inalado transportado pelos macrfagos do pulmo para o sistema linftico onde os esporos germinam e causam septicemia que fatal. Chama ateno que a evoluo nos casos fatais inicialmente caracterizada por sintomas leves como fadiga, mal-estar e febre baixa, ou s vezes at sem sintomas, quando repentinamente se instala dispnia, cianose, febre elevada, desorientao, falncia circulatria, choque, coma e morte em poucas horas. Em geral a bacteremia importante. Coleta de material: swab do exudato de leses podem ser teis; na escara, remover a crosta e colher material com swab ou com tubo capilar, usando luvas. Na forma intestinal fezes podem ser colhidas. Ps-mortem, sangue venoso ou de sangramento de mucosas (sangue no coagula) pode evidenciar o bacilo na bacterioscopia. No antraz pulmonar a hemocultura til nos casos graves, mas o material pulmonar oferece menor chance de isolamento. Isolamento: em casos clnicos os Bacillus esto na forma vegetativa, mas em alimentos, produtos secos de animais(ossos, crina,pelo) o Bacillus dever estar em forma esporulada e haver necessidade de ativ-los a 62,5oC por 15 minutos (choque trmico). Os Bacillus crescem com facilidade em meios pobres ou ricos. Dependendo do material (ex: fezes) poder haver necessidade de usar meio seletivo com adio de polimixina (100.000U/L). Colnias grandes de cor creme crescem no gar sangue. Tabela 6 - Diferenas entre Bacillus spp e Clostridium sppBacillus spp Clostridium spp Endosporos em aerobiose Endosporos em anaerobiose Catalase positivos Catalase negativos

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Tabela 7 - Diferenas entre B. cereus, B. anthracis e espcies relacionadasEspcies B. cereus B. anthracis B. thurigiensis B. cereus subsp. mycoides Col. no gar sangue Esverdeado claro Branco acinzentado Esverdeado claro Rizoides / espalhando Motilidade Hemlise Penicilina Citrato Lecitinase Res Sem Res Res

+neg

+neg

+var var

+Fraco +

+neg

+Fraco +

+ +

+

* agar sangue de carneiro

O B. antrhacis virulento pode ser testado para produo de cpsula semeandose em gar nutriente com 0,7% de bicarbonato de sdio em jarra com vela. O crescimento ser mucide e a cpsula poder ser evidenciada com a tinta da china. 6. ACTINOMICETOS Grupo de bactrias Gram positivo que apresentam como caractersticas em comum a produo de filamentos ou hifas vegetativas, sendo que alguns tambm apresentam hifas areas, semelhanas de composio de parede e padro de cidos graxos celulares. Neste grupo sero abordados os seguintes gneros: Nocardia spp,

Rhodococcus spp, Streptomyces spp. O gnero Oerskovia, embora apresente hifas vegetativas analisado juntamente com os corineformes. Outros actinomicetos raros ou de menor importncia clnica no considerados so: Gordona spp, Tsukamurella spp, Actinomadura spp, Nocardiopsis spp.

Informaes importantes sobre Actinomicetos: Para a adequada caracterizao dos Actinomicetos, que apresentam alguma semelhana morfolgica com os fungos, importante considerar: a) a origem do material, valorizando os abscessos, b) a quantidade de microrganismos isolados e correlao com a bacterioscopia do material c) possibilidade de contaminao com bactrias da mucosa oral, d) pigmento da colnia, e) anlise morfolgica da bactria pelo microcultivo em lmina idntico ao utilizado na seco de Micologia, empregando gar fub sem dextrose a 25oC.

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Tabela 5 - Identificao presuntiva de actinomicetosGnero Nocardia Rhodococcus Oerskovia Rhotia Miclio areo Condio Metabolismo glicose oxidativo neg neg neg oxidativo Fermentativo fermentativo

+neg neg neg

6.1. Nocardia spp - So bacilos Gram positivo ramificados e filamentosos, aerbios estritos, catalase positivo, imveis, que se fragmenta em bacilos e cocos irregulares. Produz hifas areas medida que o cultivo envelhece. Existem 12 espcies sendo as mais importantes N. asteroides e N. brasiliensis. Importncia - Est associada ao solo e vegetais. As formas clnicas podem ser bem distintas: pulmonar (abscessos), extra-pulmonar localizada, sistmica, sistema

nervoso central (abscessos), partes moles e micetoma. considerada uma bactria oportunista pois a maioria dos casos no cutneos e micetomas ocorrem em pacientes imunocomprometidos. Coleta - Quando colhido o material por puno, bipsia ou mesmo swab da leso profunda, ele deve ser processado rapidamente e existe uma caracterstica do material descrita como grnulos de enxofre, especialmente nos micetomas. Bacterioscopia e Histologia - A bacterioscopia pode revelar bacilos irregulares com ramificaes e parcialmente ou fracamente lcool-cido resistentes pelo Ziehl ou colorao de Kinyoun. Cortes histolgicos corados pela hematoxilina-eosina caracterizam os grnulos, mas no os filamentos da bactria. O Gram ou a colorao de metenamina prata de Gomori so teis. Isolamento e Identificao - No bactria exigente, crescendo em gar sangue, agar chocolate, gar Sabouraud dextrose, gar seletivo para Legionella e Lowenstein Jensen. Cresce entre 72h a 14 dias. Com exceo da N. asteroides, a maioria das nocardias apresentam beta-hemlise em gar sangue de carneiro. Crescem em meio de parafina (como fonte nica de carbono), juntamente com Rhodococcus e algumas micobactrias. Em microcultivo possvel visualizar as hifas ramificando-se em angulo reto, podendo apresentar ramificaes secundrias, bem como hifas areas. Em cultura mais velhas em gar tornam-se visveis as hifas areas nas colnias rugosas. As micobactrias

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de crescimento rpido podem apresentar ramificaes bem curtas em angulo agudo e sem ramificaes secundrias. Uma caracterstica importante a cor das colnias em Sabourad dextrose gar ou mesmo em outros meios: salmo ou laranja claro N. asteroides laranja escuro N. brasiliensis A Nocardia brasiliensis uria positivo, citrato positivo e gelatina positiva. A Nocardia asteroides uria positivo, citrato varivel e gelatina negativa. 6.2. Rhodococcus spp - Importncia das nove espcies conhecidas. O R. equi uma bactria oportunista, causando pneumonia em imunocomprometidos, apresentando uma evoluo lenta e granulomatosa, com infiltrados que evoluem para cavitao. Pode

causar tambm abscessos no sistema nervoso central, tecido subcutneo, linfadenite, etc. Diagnstico clnico diferencial deve ser feito com micobactrias, fungos, nocardia e actinomyces. Hemoculturas com elevada freqncia podem ser positivas. Material para diagnstico: Lavado bronco-alveolar (LBA), bipsias,

hemocultura e mesmo escarro. Em material clnico o Rhodococcus pode ser visualizado no interior de macrfagos e extra-celular, na forma de cocos ou coco-bacilos. Em hemoculturas, LBA e escarro eventualmente pode ser observado na forma filamentosa. Identificao - Em microcultivo o R. equi cresce de forma tpica como cocobacilo ou bacilo em zig-zag. Em Heart Infusion gar (HIA) cresce em 6 horas a 35oC como bacilo Gram positivo e em 24 horas apresenta-se cocide. A forma de ramificaes rudimentares a partir dos filamentos pode ocorrer em culturas jovens em meio lquido. A colorao pelo Ziehl ou Kinyoun pode revelar a fraca alcool-cido resistncia. Em HIA cresce entre 28 e 35oC, entre 2 a 4 dias, mas no a 45oC. Pode crescer na forma de colnias rugosas (com hifas areas) ou lisas ou mucides. Pode apresentar a cor coral ou rosa plido que so mais freqentes, mas pode ser amarela ou incolor. 6.3. Streptomyces spp Alguns milhares de espcies de Streptomyces j foram caracterizados, sendo na quase totalidade saprfitas. O Streptomyces somaliensis responsvel pelo micetoma de cabea e pescoo. Outras espcies foram identificadas em casos de pericardite crnica e infeces de partes moles ps-traumticas (S. griseus).

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Caracterizao: O abscesso pode revelar a presena de grnulos duros. O Gram vai revelar uma massa de bacilos Gram positivo finos. No fastidioso, cresce em Sabouraud dextrose melhor incubado a temperatura ambiente entre 4 a 10 dias. Pode-se visualizar no microcultivo hifas finas e longas com ramificaes, hifas areas e condios (via assexuada de propagao com forma arredondada como contas de colar). No alcool-cido resistente, e apenas os condios podem apresentar esta ppropriedade; metaboliza a glicose por oxidao e cresce a 50oC. As colnias so mais secas com, diferentes pigmentos (creme, marron, preto, etc) e presena ou no de hifas areas. Uma caracterstica importante das colnias o cheiro de terra molhada.

7. REFERNCIAS:

1. Mc NEIL, M.M., BROWN, J.M. Actinomycetes: epidemiology and microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 7(3): 357- 417, 1994.

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Captulo 8 - FASTIDIOSOS

1. CARACTERSTICAS GERAIS DOS FASTIDIOSOS Este grupo heterogneo de bactrias apresenta como caracterstica comum exigncias especiais de condies de cultivo, em relao s enterobactrias e a maioria dos no fermentadores. Estas condies variam para cada microrganismo, podendo ser necessidade de CO2, crescimento lento podendo necessitar at 30 dias de incubao (brucella), adio de fatores especiais de crescimento, etc. Pontos-chave para classificao: so bactrias Gram negativas ou Gram lbeis (coram-se de forma tnue pela safranina). muitos mas no todos MacConkey. para teste de fermentao de carbohidratos exigem uma base mais rica como o CTA (vide meios de cultura), o inculo deve ser bem denso e muitas vezes necessrio a adio de 2 ou 3 gotas de soro de coelho ou cavalo para permitir o crescimento nos meios utilizados para provas bioqumicos. Exceto as Capnocytophaga spp que crescem formando colnias grandes e com aparncia de vu em torno da colnia, os demais fastidiosos crescem lentamente e exigem 48 a 72 horas para as colnias ficarem bem visveis, embora diminutas. Alguns destes potenciais patgenos esto associados a sndromes clnicas bem definidas, embora no frequentes como a brucelose, tularemia, etc. importante nestes casos obter informaes adicionais com o mdico assistente ou o paciente/familiares para facilitar o processo de identificao microbiolgica. Sempre valorizar isolados de hemocultura, principalmente se ocorrer em mais de uma amostra, ou materiais de bom valor preditivo de infeco como o LCR, lquidos pleural, pericrdico, sinovial, BAL, etc. Cabe destacar que alguns fastidiosos podem positivar sistemas automatizados de hemoculturas e a bacterioscopia pode ser aparentemente negativa tanto pelo pequeno tamanho da bactria como pela m colorao pela safranina. so coco-bacilos e oxidase positivos, no crescem em

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A topografia da fonte de isolamento uma pista importante, pois diferentes espcies de Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Capnocytophaga, Actinobacillus, Eikenella, Kingella, Cardiobacterium podem ser encontrados em pele e mucosas, a Gardnerella e Cardiobacterium no trato genital, etc. Como a alguns exigem tratamento com drogas no habituais, extremamente importante chegar a definio de gnero ou encaminhar a Laboratrio de Referncia. Outro motivo relevante para a correta identificao a importncia epidemiolgica que o agente possa ter em surtos ou mesmo em casos isolados, como o caso da brucelose, legionelose e Bordetella pertussis. A Pasteurella spp embora includa neste grupo, cresce com facilidade em gar Sangue, gar Chocolate, comportando-se no TSI MacConkey e oxidase positivo. Alguns dos fastidiosos esto relacionados a contato com saliva, sangue, fezes, atravs de acidente perfuro-cortante ou mordida de animais domsticos ou silvestres (Pasteurella, Bartonella, Francisella e Brucella). Destaca-se ainda a necessidade de precaues especiais no manuseio de alguns destes agentes pelo potencial patognico (Brucella e Francisella). Com base na importncia clnica e epidemiolgica este grupo de bactrias ser dividido em dois grupos: Grupo A e Grupo BQuadro 1 - Grupo A (maior interesse clnico e epidemiolgico)Bactria Bordetella pertussis /parapertussis Bartonella spp Brucella spp Francisella spp Haemophilus spp Legionella spp Pasteurella spp Hospedeiro principal Homem Via de transmisso Secrees de vias areas

como fermentador, mas no cresce em

Gatos. Humanos com a Mordida ou arranho de gato doena. Outros desconhecidos. Picada de piolho infectado Leite e derivados, carne , sangue Mamferos domsticos secrees de animais doentes Picada de carrapato ou mosquito Animais silvestres infectado em zona endmica Homem Meio ambiente/gua Animais domsticos/selvagens Secrees de vias areas Inalao de gua contaminada Mordida e secrees de animais domsticos e selvagens

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Tabela 1- Principais provas diferenciais entre os fastidiososBactrias / Provas Actinobacillus actinomycetemcomitans Bartonella spp Bordetella pertussis Brucella spp Capnocytophaga spp Cardiobacterium hominis Chromobacterium spp Eikenella corrodens Francisella tularensis Haemophylus influenzae Kingella spp Legionella spp Pasteurella spp Streptobacillus spppos f* = positivo fraco pos = positivo

Oxidase neg/+f* neg pos pos neg pos var pos neg pos f* pos pos f pos negneg = negativo

catalase pos neg var pos neg neg pos neg pos f pos neg pos f pos neg

Motil. neg var neg neg neg neg pos neg neg neg neg pos f neg negAS = A. sangue

AS pos pos neg pos pos pos pos pos neg neg pos neg pos

ACH pos pos neg pos pos pos pos pos pos pos pos neg pos

var = varivel

ACH = A. chocolate

Tabela 2 - Principais fastidiosos, material clnico para diagnstico, meio especfico para isolamento e tempo para crescimento da colniaBactria Bordetella pertussis Bartonella spp Brucella spp Francisella spp Haemophilus spp Legionella spp Pasteurella spp Material clnico Swab nasofaringe Sangue, gnglios, bipsias Sangue/aspirado de medula Gnglios, bipsias Sangue, LCR, etc. Secrees ou aspirados de trato respiratrio inferior Sangue, LCR, leses Meio especfico Meio de Bordet & Gengou gar chocolate, gar sangue carneiro. Rotina de hemocultura ou meio de Castaeda gar chocolate enriquecido gar chocolate de cavalo Meio especfico BCYE* gar sangue, gar chocolate Iincubao 7 dias 5 a 15d At 30d 7 dias 48-72h at 7d 7 a 14 d 24 a 72h

*agar extrato de levedura, carvo, com pirofosfato frrico e alfa-cetoglutarato.

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2. Bartonella A classificao taxonmica dos membros do genero Bartonella ainda no definitiva e agrupa as espcies B. bacilliformis, B. quintana, B. henselea, B. elizabethae e Afipia felis. B. bacilliformis - o agente etiolgico da verruga peruana (febre de Oroya), doena restrita aos Andes, caracterizada por profunda anemia, trombocitopenia, adenopatia, mialgia, delrio, coma e alta mortalidade. B quintana - causa de doena febril que atacou soldados na I Gerra Mundial, conhecida como febre das trincheiras e relacionado a picada de piolhos e baixa higiene. Caracterizada por febre e bacteremia com durao varivel e ainda no bem conhecida.Casos associados infeco por HIV foram relatados. B. henselea pode apresentar quadro de bacteremia principalmente em

imunossuprimidos bem como relacionada doena da arranhadura do gato. O quadro de bacteremia caracteriza-se de forma insidiosa por fadiga, dores no corpo, perda de peso e com febre progressiva . A doena da arranhadura do gato manifesta-se inicialmente com uma ppula ou pstula cerca de uma semana no local de contato com animal (gato ou co novo que arranha ou morde) Aps 1 a 7 semanas aprece adenopatia regional1/3 dos pacientes apresentam febre e em 1/6 ocorre supurao do gnglio, sendo que a maioria evolui sem outros sintomas. A cura espontanea ocorre entre 2 a 4 meses. B. quintanae B. henselae podem causar quadro de angiomatose bacilar caracterizado por proliferao neovascular envolvendo pele, gnglios e fgado. B. elizabethae ainda pouco conhecida. Afipia felis - foi considerada h alguns anos como o agente etiologico da doena da arranhadura do gato, que hoje atribuida B. henselae. Seu papel patognico no est bem esclarecido. 2.1. Isolamento - As bartonellas podem ser isoladas de hemoculturas, leses cutneas bipsias e gnglios.O SPS (polianetol sulfonato) que o anticoagulante usado nas hemoculturas inibidor das Bartonellas, porisso deve-se usar outro anticoagulante. Quando h suspeita clinica, deve-se incubar por pelo menos sete dias, at 40 dias. Vrios meios enriquecidos podem permitir o crescimento das Bartonellas. O caldo infuso

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corao de preparo recente, com 5-10% de sangue desfibrinado de coelho ou cavalo so adequados, como tambm o agar chocolate. No Bactec pode crescer mas no aciona o alarme de CO2.Exigem umidade a 35-37oC por 3 a 4 semanas. B. bacilliformis e Afipia fellis crescem melhor entre 25 a 30oC. 2.2. Identificao - Colnias podem crescer rugosas ou lisas, de um mesmo material.So bacilos Gram negativos pequenos, as vezes curvos. As espcies quintana e henselae, que so mais isoladas so caracterizados pelas seguintes provas: catalase e oxidase negativas, motilidade em lmina presente e que no devida a flagelos (no tem), mas a fmbrias, percebendo-se a agitao da clula. O perodo de incubao que longo (> que sete dias) e a B henselae bem aderente ao meio. Tabela 3 - Provas para diferenciao de espcies de Bartonella e de A.felisProva Catalase Oxidase Uria Flagelo motilidade baciliformis + neg neg + + neg neg +* quitanae neg neg neg neg +* henselae elizabetae neg neg neg neg neg + + + + A. felis

Motilidade por fmbrias

3. Bordetella O genero Bordetella compreende as espcies B. pertussis, responsvel pela coqueluche ou tosse comprida, B. parapertussis, com quadro clnico semelhante a coqueluche, mas em geral menos severo. Ambas so patgenos exclusivos dos humanos. A B. bronchiseptica e B. avium so bactrias comensais de mamferos e aves, causando a primeira infeces em ces (tosse dos canis) e a B. avium rinotraquete em perus. So patgenos oportunistas para humanos que entram em contato com estes animais. Foram classificadas mais recentemente para o Genero Bordetella as espcies holmesii e hinzii. 3.1. Identificao - as Bordetellas so, cocobacilos Gram negativos pequenos e aerbios estritos. A safranina deve ser corada pelo Gram durante 2 minutos para melhorar a

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colorao. Para B. pertussis e parapertussis os Laboratrios de Referncia devem dispor de identificao sorolgica para acelerar a identificao. 3.2. Clnica da coqueluche - A Bordetella pertussis causa a coqueluche em crianas no vacinadas, com clnica bastante caracterstica: Perodo prodrmico, que inicia 5 a 10 dias aps a aquisio do agente, com sintomas semelhantes a um resfriado ou gripe. Fase altamente contagiosa e com sintomas inespecficos. Segue-se o perodo paroxstico com quadro de tosse convulsiva, persistente e caracterstica seguida de inspirao ruidosa. Podem ser acompanhadas de cianose e vmito e vrias complicaes como convulses, insuficincia respiratria, encefalopatia, infeces secundrias, etc. A convalescena ocorre cerca de quatro semanas aps inicio dos primeiros sintomas. Tabela 4 - Provas diferenciais para espcies de BordetellaProvas/espcies Oxidase Motilidade Uria Crescimento em AS e ACH Cresc em B&G ou Regan-Lowe Crescimento em SS pertussis + neg neg neg + 3-6d neg para pertussis neg neg + em 24horas + + 2-3d neg bronchiseptica + + + em 4horas + + 1-2d + avium + +* neg + +1-2d + holmesii neg neg neg + +1-2d + hinzii + + v + +1-2d +

B. pertussis necessita de meio especfico: Bordet&Gengou (infuso de batata + glicerol + sangue de carneiro) o ou Regan Lowe. * mais evidente a 25 C AS = agar sangue ACH = agar chocolate

3.3. Material clnico / Semeadura e identificao - So adequados o swab ou aspirado de nasofaringe e semeadura imediata em meios especficos e em gar sangue para afastar B. pertussis. Na atualidade no se justifica dispor de meio de Bordet & Gengou ou outro, mas em caso de suspeita solicitar auxlio de Laboratrio de Referncia. Para frmula de meios de cultura vide manuais de fabricantes de meios de cultura. A prova de imunofluorescncia deve ser utilizada em material de nasofaringe juntamente com a cultura que mais especfica. 4. Brucella A brucelose uma doena de sintomas vagos, que cursa de forma insidiosa com febre baixa, calafrios, sudorese noturna, cefalia, mialgia e artralgia. Pode ser

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acompanhada na forma crnica de alteraes hematolgicas importantes como leucopenia, pancitopenia, trombocitopenia, anemia hemoltica, etc. Est associado ingesto de leite e derivados e carne de mamferos, de modo que veterinrios, aougueiros ou trabalhadores rurais que manipulam carne e sangue destes animais e acidentes em laboratrios. A hemocultura exige tempo superior a rotina de 5-7 dias de incubao. importante a informao mdica de suspeita clnica para orientar o laboratrio na pesquisa e caracterizao do agente. 4.1. Materiais clnicos - Sangue, aspirado de medula, aspirado e bipsia de gnglios, fgado, bao, LCR, etc. A partir do segundo dia de febre as hemoculturas podem ser positivas, ocorrendo tambm hemoculturas positivas em pacientes afebris. Outro recurso utilizado para facilitar o isolamento o mtodo de lise-centrifugao: a) Colher 5 a 10mL de sangue em tubo de 50mL com 1,5mL de citrato de sdio a 4% b) Adicionar cerca de 40mL de gua destilada estril c) Centrifugar 2.000g por 30 minutos d) Transferir 0,5mL do sedimento para uma placa de gar sangue e semear Pode-se fazer o mesmo com LCR e aspirado de medula. Incubar 35oC em estufa entre 5 a 10% de CO2 (com gerador de CO2 ou estufa apropriada). 4.2. Isolamento e Identificao - As brucellas crescem bem em gar sangue, gar chocolate, Tripticase Soy Agar e Brucella agar. O crescimento visvel com 48 a 72 horas. Colnias so pequenas, brancas a creme, e ao Gram visualiza-se cocobacilos bem finos e pequenos. So aerbio OF oxidativos, crescem nos frascos de hemocultura, meio de Thayer Martin, gar sangue, gar chococolate, mas no no Mc Conkey. Espcies mais importantes so: melitensis, abortus, suis e canis uria positivos: B. suis (1 a 30 minutos), B. canis (1 a 30 minutos) e B. abortus (1 a 2 h) no meio uria de Christensen H2S com tira de acetato (+) = B.abortus e de B.suis (biotipo 1) Necessidade de CO2 para crescimento: biotipos de B. abortus e B. ovis

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Tabela 5- Provas diferenciais entre cocobacilos Gram negativosTeste/ Bactria Brucella spp Bordetella bronchiseptica Acinetobacter spp Moraxella phenylpyruvica Pasteurella spp* Haemophilus influenzae

Oxidase Motilidade Uria Crescimento em AS MC

+ neg + + neg

+ + + + Neg

neg neg Var + +

+ neg + + +

+ neg Var + neg

+ neg var neg neg

cresce no TSI como fermentador acidificando pice e base sem gs.

Considerando que a Brucella de dificil caracterizao em laboratrio no especializado, encaminhar a laboratrio de referncia para confirmao. Suspeitar quando houver quadro clnico sugestivo, obtendo-se isolado de sangue ou medula, crescimento de cocobacilos finos pouco corados, oxidase e catalase positivos, que crescem lentamente em gar sangue ou chocolate. Soroaglutinao util como elemento da caracterizao.

5. Francisella tularensis um coco-bacilo pequeno, Gram negativo, imvel e pleomrfico, aerbio estrito e capsulado. Apresenta grande resistncia no meio ambiente, sobrevivendo semanas em meios midos, carcaas de animais, gua, lama, etc. Constitui o agente da tularemia, uma doena de animais selvagens e com vrios vetores hematfagos. transmitida principalmente por carrapatos, mas tambm por mosquitos e nos Estados Unidos prevalece o biovar A que mais grave. No hemisfrio sul prevalece o biovar B que apresenta forma clnica mais leve, sendo pouco diagnosticada principalmente por desconhecimento do agente. 5.1. Fontes e transmisso direta - Centenas de animais selvagens e incluindo alguns domsticos (incluindo ces, gatos e pssaros) podem ser portadores deste agente. Cerca de uma dezena de diferentes insetos servem de vetores. A transmisso pode ocorrer tambm em contato direto com animais pela mordida, sangue, carne contaminada e eventualmente gua e inalao de aerossis.

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5.2. Quadro clnico - extremamente infectante, devendo ser manipulado em cabine de segurana nivel 2 para material clnico e nvel 3 para culturas positivas. Bastam 10 microrganismos injetados por via subcutnea ou 25 inaladas para causar a doena. Logo aps a penetrao do agente, em geral pela pele, aparecem sintomas semelhantes a gripe: febre, tremores, cefalia e dor generalizada. Aps perodo de incubao de 2 a 10 dias forma-se uma lcera no local de penetrao, que pode durar meses. Os gnglios regionais aumentam e ocorre necrose. Se ocorrer invaso sangunea, o quadro de endotoxemia tpico se manifesta. Estes casos so pouco freqentes e ocorrem quando h grande inoculao ou paciente imunocomprometido. A mortalidade alcana 60%, ocorrendo toxemia, cefalia intensa, febre elevada e contnua, com delirios, prostrao e choque. A forma ulcero-ganglionar ocorre em cerca de 80% dos casos relatados. A lcera endurada, eritematosa, que no cicatriza. Outras formas relatadas so oculoganglionar, em orofaringe, ganglionar sem lcera,, pleuropulmonar e gastrointestinal. 5.3. Material para isolamento - Os materiais que oferecem maior chance de positividade so a partir de raspados de lceras, biopsiase escarro. A Francisella cresce em agar chocolate suplementado com Isovitalex . Laboratrio de Referncia deve ser consultado sobre recursos disponveis ou encaminhamento de cepas suspeitas. 5.4. Diagnstico microbiolgico - A bacterioscopia de material clnico de leses ou bipsias raramente ajuda, pois o microrganismo muito pequeno e cora-se mal pelo mtodo de Gram. Este agente deve ser lembrado sempre que houver doena associada a picada de carrapato e formao de lcera com comprometimento ganglionar. Entretanto, o diagnstico microbiolgico difcil, sendo na maioria das vezes feito com base em testes de aglutinao em amostras pareadas colhidas com intervalo de 2 a 3 semanas e congeladas a -20oC.

6. Haemophylus6.1. Importncia clnica - Diferentes espcies pertencentes ao genero Haemophilus podem ser encontradas como flora normal da nasofaringe e orofaringe, chegando a 50% da populao geralmente cepas no capsuladas, embora tambm cepas do H. influenzae b possam apenas representar colonizao(rara nos adultos e cerca de 5% nas crianas).

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Para considerar o isolamento de Haemophilus papel patognico fundamental associar clinica . Vrias so as infeces causadas por H. influenzae, sendo por H. influenzae do tipo b as cepas mais virulentas, entretanto a partir da dcada passada, com a disponibilidade de vacinao, houve uma drstica reduo na importncia desta bactria nas populaes vacinadas. Doenas causadas pelo H. influenzae b principalmente na infncia: Meningite, Epiglotite, Pericardite, Pneumonia, Artrite sptica, Osteomielite, Celulite facial, Raramente: peritonite e infeco urinria em crianas menores que cinco anos. Doenas causadas por cepas no b e no tipveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a doena de base predisponente como neoplasia, AIDS, alcoolismo, DPOC, etc.): Traqueobronquite e pneumonia, Bacteremia, Conjuntivite, Ootite (2a causa depois do pneumococo), Sinusite. 6.2. Haemophilus aphrophilus - Importncia clnica Microbiota do trato respiratrio superior, especialmente em placas dentrias e sulco gengival. Endocardite e abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia esto associados a este agente, particularmente em pacientes com comprometimento imunolgico. No necessariamente a endocardite est relacionada leso valvular prvia, mas a associao com embolia arterial freqente nestes casos. Existem relatos tambm de isolamento em otites, sinusites e epiglotites, etc. 6.3. Haemophilus ducrey - o agente do cancro mole, sendo na atualidade raramente isolado, pela menor incidncia da doena, contaminao das leses com flora genital e frequente uso prvio de antibiticos. Colhido de ulceras genitais, removendo-se previamente a secreo superficial ou lavando com salina estril e utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer esfregao a ser corado pelo Gram. Em geral de difcil cultivo. Emprega-se gar chocolate de cavalo com base GC ou Mueller Hinton. A colocao de um disco de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram positivas. bacterioscopia aparecem cocobacilos Gram lbeis agrupados e cadeias como cardumes.

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Identificao de espcies de Haemophilus: Anaerbio facultativo No crescem no TSI e no OF-Glicose O melhor meio de cultura para Haemophilus influenzae o gar chocolate com sangue de cavalo. A base GC usada para Neisserias indicada, embora os hemfilos cresam com outras bases como Columbia e Mueller Hinton. H necessidade de umidade e CO2 entre 3 a 5% para o H. influenzae e H.aphrophilus. O gar chocolate suporta muito bem o crescimento dos Haemophilus, mas para outros fastidiosos recomenda-se adicionar suplemento de crescimento (vitox, isovitalex ). As diferentes espcies de haemfilos podem dar reao de oxidase positiva fraca e demorada (cerca de 25 a 20 segundos). Em amostras de LCR pode ser til a aglutinao com partculas de ltex, mas a confirmao bioqumica e sorolgica em laboratrio de referncia necessria. antibiograma realizado em meio padronizado HTM (vide meios de cultura). As provas para caracterizao dos hemfilos so: Tabela 6 - Principais provas para diferenciar algumas espcies de HaemophilusExige fator X Exige fator V

Haemophylus

hemlise

uria

Indol

Glic

Sac

Lac

catalase

influenzae haemolyticus parainfluenzae ducrey aphrophilus

+ + neg + neg

+ + + neg neg

neg + neg fraca neg

Var + var neg neg

var var var neg neg

neg + + neg +

neg neg + neg +

neg neg neg neg +

+ + var neg neg

Obs.: vide leitura de fatores X e V

Glic = glicose Sac = sacarose

Lac = lactose Var = varivel neg = negativo

Verificar hemlise em gar sangue de cavalo Fermentao de aucares com base CTA e 1% de aucar adicionado de fator X e V (vide meios de cultura)

Tcnica para testar fatores X e V: a) usar meio agar tripticase soja ou BHI agar b) discos comerciais impregnados com os fatores X=hemina/hematina e V=NAD ou coenzima I.

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c) semear a bactria como se fosse fazer um antibiograma e colocar os discos com pina a uma distncia de 1,5cm um disco do outro. Flambar a pina antes e aps a retirada de cada disco. d) aps 24h de incubao em jarra com vela e umidade a 35oC, verificar crescimento prximo aos discos: Haemophilus influenzae - Crescimento entre os discos (exige X e V)

Haemophilus parainfluenzae Exige fator X

Haemophilus ducrey Exige fator V

X

V

X

V

Isolamento - No isolamento primrio no agar chocolate as colnias costumam ser pequenas de cor beje claro, com odor caracterstico. No agar sangue ocasionalmente pode-se detectar o crescimento em torno de colnias de Staphylococcus aureus , que produz o fator V e utilizada como prova alternativa utilizao dos discos e denominada prova do satelitismo. Prova do satelitismo: Tcnica - Semear com swab uma suspenso em salina cerca de 1 a 2 da escala Mac Farland no centro de uma placa de gar sangue de carneiro. Semear em uma nica estria um repique de S. aureus hemoltico (ATCC 23922). Incubar 18 a 24h em jarra com vela e umidade ou CO2. Verificar crescimento de colnias pequenas prximas a zona de hemlise do estafilococo. Encaminhar cepas isoladas de lquidos nobres (sangue, LCR, pleural, pericrdico) a Laboratrios de referncia para confirmao e sorotipagem.

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6.4 H. aphrophilus - Crescem bem em gar chocolate no isolamento primrio e em gar sangue de carneiro nos subcultivos sem exigncia de fatores X e V, mas as colnias so muito pequenas de cor amarelada, cheiro de cola e necessitam de 48 a 72h para boa visualizao. Em caldo tem a caracterstica de aderir as paredes do tubo, como o Actinobacillus actinomycetemcomitans. No crescem em Mac Conkey. Para todos os hemfilos fazer o teste da beta-lactamase para verificar a resistncia penicilina

7. Legionella :7.1. Importncia clnica - Pneumonia com ou sem sepsis a manifestao clinica mais importante, podendo ocorrer infeces de partes moles e sinusite. Est em geral associada a surtos cuja fonte a gua contaminada com este agente. Largamente distribuda na natureza em ambiente mido e gua potvel e ocasionalmente em chuveiros. Esta associada a presena de outras bactrias e amebas de vida livre na gua. A presena de bactrias do genero Legionella em material clnico humano est invariavelmente associado doena clnica. 7.2. Espcies e Manifestaes clnicas - Existem algumas dezenas de espcies de Legionella sendo a espcie mais importante a L. pneumophila, sorogrupos 1 e 6. A doena pode ser sub-clnica, forma no pulmonar, pneumonia e doena extra-pulmonar. A forma no pulmonar tem perodo de incubao curto (horas a dias), sendo auto-limitada e sem evidncias radiolgicas de comprometimento pulmonar. Sintomas: febre, mal-estar, mialgia e tosse. A pneumonia a forma mais freqente de manifestao da doena, acompanhada dos mesmos sintomas acima descritos para a forma no pulmonar e em geral com tosse no produtiva. A doena apresenta rpida progresso e nos casos graves a formao de abscessos so sugestivos da legionelose. Bacteremia comum e comprometimento dos mais variados orgos e tecidos j foram descritos. 7.3. Recursos diagnsticos mais utilizados - cultura, Imuno-fluorescncia e aglutinao pelo lt