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Manual de Instruções para Análise por LC-MS/MS

MassChrom® Amino acids and acylcarnitines from dried blood /derivatized

Reagente diagnóstico para determinação semi-

quantitativa in vitro de Aminoácidos e Acilcarnitinas em

sangue seco por LC-MS/MS/derivatizado .

Somente para uso em diagnóstico in vitro. Artigo 55000

IM 55000 NBS E JULY 2011 R4.1 / BS Rev 00 out2014

MassChrom® Amino acids and acylcarnitines from dried blood / derivatized - LC-MS/MS

MS 10350840263

Importado e Distribuído por: BioSys Ltda. Rua Coronel Gomes Machado, 358, Centro, Niterói, RJ CEP: 24020-112 CNPJ: 02.220.795/0001-79 SAC: (21) 3907 2534 – [email protected] www.biosys.com.br Fabricado por: Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH Am Haag 12 D-82166 Gräfelfing Munique, Alemanha Fone: +49 89 18930-0 Fax: +49 89 18930-199 www.chromsystems.de

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Conteúdo..............................................................Página 1 Informações para requisição........................................................................................ 3 2 Introdução........................................................................................................................ 4 3 Sistema LC-MS/MS..........................................................................................................6

3.1....Parâmetros do equipamento..................................................................................... 6 3.2....Métodos de medição MS/MS.................................................................................... 7 3.3....Procedimento inicial.................................................................................................. 8 3.4....Desligando o equipamento (Shut down)................................................................... 8

4 Transições de massa dos analitos e padrões internos............................................... 9 5 Preparação da amostra................................................................................................... 12

5.1....Coleta e armazenamento das amostras de pacientes.............................................. 12 5.2....Reconstituição do padrão interno............................................................................. 13 5.3....Manuseio dos controles............................................................................................ 13 5.4....Procedimento de preparação das amostras............................................................. 14

5.4.1 Preparação da amostra sem placa filtrante...................................................... 14 5.4.2 Preparação da amostra com placa filtrante...................................................... 14

5.5....Estabilidade das amostras........................................................................................ 15 5.6....Materiais requeridos, mas não fornecidos................................................................ 15

6 Resultados e avaliação................................................................................................... 15 6.1....Quantificação com padrão interno............................................................................ 15 6.2....Princípios do cálculo................................................................................................. 17

7 Controle de Qualidade................................................................................................... 17 8 Valores de referência/valores de cut off...................................................................... 17 9 Fatores de conversão.................................................................................................... 18 10 Informações de segurança.......................................................................................... 19 11 Armazenamento e validade dos reagentes................................................................ 20 12 Descarte de resíduos................................................................................................... 20 12.1 Garantia..................................................................................................................... 20

13 Exemplos de cromatogramas..................................................................................... 21 13.1....Espectro de controle de aminoácidos no intervalo do cut off.................................21 13.2....Espectro de uma amostra de paciente com fenilcetonúria (PKU).......................... 21 13.3....Espectro de controle de acilcarnitinas no intervalo do cut off................................. 22 13.4....Espectro de uma amostra de paciente com MCAD................................................ 22 13.5....Espectro de uma amostra de paciente com VLCAD............................................... 23 13.6....Espectro de uma amostra de paciente com GA tipo I............................................. 23

14 Validação........................................................................................................................ 24 15 Interferentes conhecidos............................................................................................ 28 16 Problemas e soluções.................................................................................................. 29 17 Literatura........................................................................................................................ 30 Certificado............................................................................................................................ 31


1 Informações para requisição

Nº da ordem Produto

55000 55000/F

MassChrom® Kit de reagentes para análise por LC-MS/MS de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco para triagem neonatal Conteúdo para 960 análises com placa padrão de 96 poços: Fase móvel 2 x 1000 mL Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL Reagente derivatização 2 x 30 mL Tampão reconstituição 1 x 100 mL Solução de Lavagem 2 x 1000 mL Tampão de extração 1 x 200 mL Placa de 96 poços, fundo em V 10 peças Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças MassChrom® Kit de reagentes para análise por LC-MS/MS de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco para triagem neonatal Conteúdo para 960 análises com placa filtrante de 96 poços: Fase móvel 2 x 1000 mL Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL Reagente derivatização 2 x 30 mL Tampão reconstituição 1 x 100 mL Solução de Lavagem 2 x 1000 mL Solução tampão de extração 1 x 200 mL Placa filtrante de 96 poços 10 peças Placa de 96 poços, fundo em V 10 peças Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças Folha de proteção em alumínio para placa de 96 poços 10 peças Componentes disponíveis separadamente:

55001 Fase móvel 1000 mL 55002 Fase móvel 10 x 1000 mL 55004/T Padrão interno, liofilizado 1 x 25 mL 55004 55044 55044/T 55005 55006

Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL Padrão interno para succinilacetona 3 x 50 mL Padrão interno para succinilacetona 1 x 50 mL Reagente Derivatização 30 mL Tampão reconstituição 100 mL

55007 Solução de Lavagem 1000 mL 55008 Solução tampão de extração 200 mL 55010 55011

Placa de 96 poços, fundo em V 10 peças Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças

55057 Placa filtrante de 96 poços 5 peças Acessórios

55013 55015 55016

Folha adesiva paraplaca de 96 cavidades 10 peças Capilar de restrição 1 peça Colar adaptador para centrifugação 2 peças

55099 Mistura para Tuning, contêm todos os analitos 2 mL 15009 Pré-filtro em PEEK, 5µm 5 peças 15010

Suporte para pré-filtro em PEEK 1 peça

Controles (spots de sangue seco em papel de filtro)

0191 MassCheck® Controle bi-nível (I + II) de aminoácidos e acilcarnitinas, spot 2 x 3 spots 0192 MassCheck® Controle nível I de aminoácidos e acilcarnitinas, spot 1 x 3 spots 0193 MassCheck® Controle nível II de aminoácidos e acilcarnitinas, spot 1 x 3 spots


2 Introdução O objetivo da triagem neonatal é o diagnóstico de doenças metabólicas hereditárias antes que causem prejuízo ao organismo da criança. De acordo com o novo Kinder-Richtlinie de Dezembro de 2004, o exame de 20 patologias alvo foi prescrito pela lei na Alemanha, oito delas podem ser determinadas por espectrometria de massa em tandem. Estas doenças incluem distúrbios no metabolismo dos aminoácidos, como a fenilcetonúria (PKU) e doença da urina do xarope de bordo (MSUD), no metabolismo dos ácidos graxos (p.ex.: deficiência da acil-CoA desidrogenase de cadeia média e muito longa; MCAD e VLCAD) e também as acidemias orgânicas como a isovalérica (IVA). Essas doenças são causadas por deficiências enzimáticas hereditárias, levando ao decréscimo ou supressão da atividade enzimática. Desta maneira, os substratos não transformados acumulam-se no organismo. Dependendo do grau da doença o produto estará presente em níveis limitados ou completamente ausente no organismo. Isto leva ao acúmulo de metabólitos potencialmente tóxicos, causando defeitos em órgãos e doenças multisistêmicas (amino e organoacidopatias). Não diagnosticados, estes distúrbios metabólicos causam lesões severas e irreversíveis à criança, mesmo em poucos dias. No caso da fenilcetonúria, ocorre retardo físico e mental da criança afetada. Uma vez que esses defeitos são hereditários, tais doenças são incuráveis e as terapias são limitadas à compensação dos sintomas. Entretanto, se a doença é diagnosticada a tempo, isto é, dentro dos primeiros dias de vida, a criança com PKU é capaz de ter uma vida normal com uma dieta livre de fenilalanina. A incidência desses distúrbios metabólicos gira em torno de 1:9.000 (PKU) e de 1:200.000 para algumas desordens no metabolismo dos ácidos graxos (VLCAD, CPT I e II). Em média, 1 em cada 3.000 recém-nascidos é afetado por uma dessas doenças. O diagnóstico laboratorial destas doenças é feito através da medida de substâncias marcadoras de elevação ou degradação, respectivamente, no sangue do recém-nascido. O sangue é coletado do calcanhar, em papel de filtro, seco e enviado ao laboratório para exame. Com a tecnologia da espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) é possível triar um amplo espectro de doenças metabólicas em uma única corrida analítica. Esse método permite a detecção simultânea e confiável de várias moléculas alvo, assim como a determinação de suas respectivas concentrações. Devido a sua alta seletividade, esta técnica dispensa o uso de uma coluna de HPLC, permitindo corridas analíticas muito curtas (2 min.). Para evitar a interferência de efeitos de supressão iônica e permitir a quantificação precisa dos analitos, o uso de padrões marcados isotopicamente é essencial. Dependendo do tipo de papel de filtro utilizado e do hematócrito da amostra, o volume de sangue no picote do disco de sangue seco (3 mm diâmetro) varia entre 2,2 e 3,3 µL de sangue. Isto permite apenas uma determinação semi-quantitativa dos analitos, e este método de triagem não deve ser utilizado como método laboratorial para diagnóstico. A triagem neonatal por LC-MS/MS deve estar sempre apoiada por diagnósticos confirmatórios baseados em genética molecular, métodos enzimáticos ou analisadores de aminoácidos. Princípio do kit: Os seguintes aminoácidos, acilcarnitinas e carnitinas livres podem ser determinados semi-quantitativamente com este kit:

Aminoácidos: alanina (Ala), arginina (Arg), ácido aspártico (Asp), citrulina (Cit), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), leucina (Leu), metionina (Met), ornitina (Orn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), tirosina (Tyr) e valina (Val), succinilacetona (SucA).

Carnitina livre e acilcarnitinas: carnitina livre (C0), acetilcarnitina (C2), propionilcarnitina (C3), butirilcarnitina (C4), isovalerilcarnitina (C5), glutarilcarnitina (C5DC), hexanoilcarnitina (C6), octanoilcarnitina (C8), decanoilcarnitina (C10), dodecanoilcarnitina (C12), tetradecanoilcarnitina (C14), hexadecanoilcarnitina (C16) e octadecanoilcarnitina (C18).

Este kit de reagentes Chromsystems foi desenvolvido para a determinação semi-quantitativa, simples e rápida, de aminoácidos, acilcarnitinas e succinilacetona em spots de sangue seco para triagem neonatal de distúrbios do metabolismo dos ácidos graxos e aminoácidos pela espectrometria de massa em tandem.


O procedimento de preparação da amostra, extremamente simples, é baseado numa extração eficiente dos analitos do papel de filtro sem passos adicionais. Para garantir uma quantificação reprodutível, este método utilizado padrão interno estável e marcado isotopicamente (deuterado) para a calibração e quantificação.

Figura 1- Fórmula estrutural dos aminoácidos, acilcarnitinas e carnitina livre.

Este kit é um método de triagem, os resultados podem variar dependendo do sistema MS/MS usado e devem ser analisados em relação a outros dados laboratoriais. A interpretação clinica dos resultados deve ser feita apenas por profissional capacitado e habilitado. Não existem estudos clínicos sistemáticos sobre a freqüência de resultados falso-positivos ou falso-negativos.


3 Sistema LC-MS/MS

Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no capítulo 10.

3.1 Parâmetros do equipamento A análise de aminoácidos, acilcarnitinas e carnitina livre requer um sistema composto por uma bomba de HPLC, um injetor e um espectrômetro de massa em tandem com sensibilidade adequada. Para prevenir variações na composição da fase móvel, o frasco que a contém deverá ser mantido fechado, mesmo durante a operação. A solução de limpeza que acompanha o kit (artigo 57007) deverá ser utilizada como solução de limpeza da agulha do injetor. Nenhuma coluna de HPLC ou forno para coluna é necessário. Para conectar o sistema de HPLC ao sistema MS/MS, é necessário um capilar de restrição (artigo 55011) com pré-filtro em PEEK (artigo 15009 e 15010). Ajustes do instrumento: Amostrador automático: Volume de injeção 10 µL Tempo de corrida: 1,7 min Gradiente de fluxo: 20 a 600 µL/min Perfil do Gradiente: Devido aos diferentes volumes mortos dos sistemas de HPLC individuais, o perfil do gradiente descrito abaixo pode ter que ser modificado, servindo apenas de base para a otimização do sistema. A janela do tempo de varredura (scan time window) do sistema tandem MS deve ser ajustada para o período de tempo no qual a intensidade do sinal alcança o nível máximo (aproximadamente 0,25 a 1,25 min.).

Tempo (min) 0 0,24 0,25 1,24 1,25 1,50 1,51

Fluxo (µL/min) 200 200 20 20 600 200 200

Caso o sistema HPLC seja incapaz de manter um fluxo constante de 20 µL/min, o método pode ser realizado alternativamente com um fluxo isocrático de 100 a 150 µL/min. Contudo, o método isocrático causa redução da sensibilidade.

Figura 2 - Cromatograma com gradiente de fluxo


3.2 Métodos de medição MS/MS

Fundamentos do método de medição: Em um espectrômetro de massa as moléculas são analisadas por sua relação massa e carga (m/z). Para isso, as moléculas devem ser ionizadas. Na tecnologia LC-MS, a ionização por eletronebulização ou electrospray tem demonstrado ser um método brando de geração de íons moleculares. O espectrômetro de massa em tandem (MS/MS) contém dois espectrômetros de massa conectados em série. No primeiro espectrômetro (MS 1), os íons são separados por sua relação massa e carga. Em seguida, os íons atingem uma célula de colisão, onde são dissociados em fragmentos induzidos pela colisão com um gás inerte (argônio ou nitrogênio). Logo depois, o segundo espectrômetro (MS 2) analisa a fragmentação característica, outra vez pela relação m/z. Na tecnologia MS/MS, vários métodos de medição têm se mostrado confiáveis para diferentes padrões de fragmentação. Varredura de Perdas Neutras (Neutral Loss Scan): Muitos aminoácidos butilados fragmentam na célula de colisão pela perda do ácido fórmico, com massa de 102 Daltons (ver figura 4). Durante a determinação dos aminoácidos no modo de varredura de Perdas Neutras, o primeiro e o segundo espectrômetros de massa estão varrendo num intervalo de 102 unidades de massa. Isso gera um espectro de massa seletivo para muitos aminoácidos neutros e ácidos. Entretanto, nem todos os aminoácidos podem ser detectados por esse modo de varredura. Os aminoácidos citrulina e ornitina, por exemplo, perdem amônia em adição ao ácido fórmico, logo, esses aminoácidos devem ser detectados com uma varredura de Perdas Neutras de 119 (102 + 17). Por outro lado, a glicina deve ser analisada com varredura de Perdas Neutras de 56 e arginina em modo 161. Nós recomendamos que todos os aminoácidos que não possam ser detectados em varredura de Perdas Neutras 102, sejam quantificados no modo Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM).

Figura 5 - Fragmentação do íon fenilalanina pela eliminação do ácido fórmico (Neutral Loss 102)

Monitoração de Reações Múltiplas (MRM): No modo MRM, os dois espectrômetros de massa estão estaticamente ajustados para um valor de massa específico. O MS 1 seleciona a molécula ionizada de interesse, descartando íons com massas diferentes. Após a fragmentação da molécula na célula de colisão, o MS 2 detecta o fragmento característico gerado. O modo MRM garante tanto maior seletividade quanto alta sensibilidade. Basicamente, todos os analitos podem ser detectados no modo MRM. Sua desvantagem é o tempo consumido na otimização do sistema MS/MS para cada transição de massa. Varredura do Íon Precursor (Parent Ion Scan):

As acilcarnitinas butiladas formam um fragmento iônico característico de m/z = 85 na célula de colisão (ver figura 6). Durante a determinação de acilcarnitinas e carnitina livre na varredura do Íon Precursor, o MS 2 está estaticamente ajustado para m/z = 85, enquanto o MS 1 realiza varredura das moléculas ionizadas que deram origem ao fragmento. Isto gera um espectro de massa muito seletivo para as acilcarnitinas.


Figura 6 - Fragmentação de acilcarnitinas butiladas pela perda de fragmento iônico característico m/z = 85

R = cadeia alquílica (p. ex.: R = CH3 para acetilcarnitina).

3.3 Procedimento inicial Antes de iniciar uma análise:

1. Antes de iniciar uma seqüência analítica, as bombas de vácuo do sistema MS/MS devem estar em operação por no mínimo 8 horas. 2. Limpe o sistema com aproximadamente 10 mL de fase móvel em fluxo de 200 µL/min. 3. Injete repetidamente os controles preparados, até que dois espectros de massa sucessivos apresentem valores de concentração e intensidade de sinal bem próximos. 4. Após cumprir as etapas descritas acima, a corrida analítica pode ser iniciada.

Para a operação correta do sistema LC-MS/MS, leia o manual do equipamento. Se necessário, realize um curso de treinamento no uso do equipamento com seu fabricante.

3.4 Desligando o equipamento (Shut down) Para períodos em que o equipamento não esteja sendo utilizado, recomenda-se desligar a bomba do HPLC. A fase móvel pode permanecer dentro do sistema, sem o risco de cristalização de sais nos selos da bomba. As bombas de vácuo do sistema LC-MS/MS devem permanecer operando o tempo todo. Para prolongar a vida média da fonte de ionização e da célula multiplicadora, o sistema MS/MS deverá ser colocado no modo de repouso (stand-by).

4 Transições de massa dos analitos e padrões internos As tabelas que seguem mostram as transições de massa recomendadas e os métodos de medição para os analitos e padrões internos isotopicamente marcados.


Aminoácidos:

Substância Método de medição Transição de massa

Alanina Neutral Loss Scan 102 146 > 44

Alanina-D4 Neutral Loss Scan 102 150 > 48

Ácido Aspártico Neutral Loss Scan 102 246 > 144

Ácido Aspártico-D3 Neutral Loss Scan 102 249 > 147

Ácido Glutâmico Neutral Loss Scan 102 260 > 158

Ácido Glutâmico-D5 Neutral Loss Scan 102 265 > 163

Leucina Neutral Loss Scan 102 188 > 86

Leucina-D3 Neutral Loss Scan 102 191 > 89

Metionina Neutral Loss Scan 102 206 > 104

Metionina-D3 Neutral Loss Scan 102 209 > 107

Fenilalanina Neutral Loss Scan 102 222 > 120

Fenilalanina-D5 Neutral Loss Scan 102 227 > 125

Tirosina Neutral Loss Scan 102 238 > 136

Tirosina-D4 Neutral Loss Scan 102 242 > 140

Valina Neutral Loss Scan 102 174 > 72

Valina-D8 Neutral Loss Scan 102 182 > 80

Arginina MRM 231 > 70

Arginina-D7 MRM 238 > 77

Citrulina MRM 232 > 113

Citrulina-D2 MRM 234 > 115

Glicina MRM 132 > 76

Glicina-¹³C2-¹5N MRM 135 > 79

Ornitina MRM 189 > 70

Ornitina-D6 MRM 195 > 76

Prolina MRM 172 > 116

Prolina-D7 MRM 179 > 123

Succinilacetona MRM 211 > 109

Succinilacetona-¹³C5 MRM 216 > 114

Carnitina livre e acilcarnitinas:

Substância Método de medição Transição de massa

Carnitina Parent Ion Scan 218 > 85

Carnitina-D9 Parent Ion Scan 227 > 85

C2-Carnitina Parent Ion Scan 260 > 85

C2-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 263 > 85







C5DC-Carnitina Parent Ion Scan 388 > 85

C5DC-Carnitina-D6 Parent Ion Scan 394 > 85
















As massas apresentadas são um ponto inicial para otimizações. A posição exata do sinal de máxima intensidade pode variar para cada sistema MS e tem que ser determinada pelo tuning (pelo menos uma posição após o ponto decimal), utilizando a Mistura para Tuning (ordem no. 55099 e 55098), que contém todos os analitos e padrões internos. A quantificação dos analitos é feita pela comparação da intensidade do sinal com o padrão interno isotopicamente marcado correspondente. Várias acilcarnitinas de interesse diagnóstico, para as quais os padrões internos isotopicamente marcados ainda não estão disponíveis, também podem ser medidas com este kit, através da comparação do sinal com padrões deuterados que apresentem o mesmo comprimento de cadeia. Acilcarnitinas com comprimento de cadeia igual mostram aproximadamente o mesmo fator de resposta. Entretanto, este kit é validado somente para aqueles analitos com padrões internos deuterados disponíveis, descritos na tabela acima.


A tabela seguinte mostra algumas acilcarnitinas adicionais, com seus respectivos valores de transição de massa e padrões internos isotopicamente marcados recomendados. Tais informações são apenas uma sugestão, representando a prática corrente de muitos laboratórios de triagem. O kit de reagentes Chromsystems não é validado para esses analitos. Acilcarnitinas adicionais sem padrão interno explícito:

Substância Transição de massa Padrões internos recomendados

C3DC-Carnitina 360 > 85 C3-Carnitina-D3

C4OH-Carnitina 304 > 85 C4-Carnitina-D3

C4DC-Carnitina 374 > 85 C4-Carnitina-D3

C5:1-Carnitina 300 > 85 C5-Carnitina-D9








C16:1OH-Carnitina 470 > 85 C16-Carnitina-D3







5 Preparação da amostra

Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no capítulo 10.

5.1 Coleta e armazenamento das amostras de pacientes A coleta de sangue para triagem neonatal deve ocorrer entre 48 e 72 horas após o nascimento. O sangue é coletado do calcanhar do recém-nascido por gotejamento em papel de filtro e colocada em repouso até que esteja seca. Recomenda-se que sejam utilizados papéis de filtro aprovados e específicos para o teste. Amostras com EDTA ou heparina não devem ser utilizadas pois podem levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos. Descrição resumida das etapas da coleta:

1. Limpe a área do calcanhar do recém-nascido destinada à punção com anti-séptico. Seque com

cotonete estéril.

2. Perfure o calcanhar com uma lanceta estéril. A ponta da lanceta deve ser menor que 2 mm, pois, perfurações profundas podem ferir crianças pequenas.

3. Descarte a primeira gota de sangue com um cotonete estéril.

4. Colha a próxima grande gota de sangue com o papel de filtro, aguardando até que a amostra seja adsorvida no papel e preencha totalmente o círculo delimitado. Não aplique uma gota de sangue sobre a outra e nem colha em ambos os lados do papel, pois isto altera o volume de sangue coletado por spot e pode produzir falsos resultados patológicos.

5. Preencha cada um dos círculos remanescentes no papel de filtro, repetindo o mesmo procedimento, com uma única gota de sangue.

6. Cuidados com o local de punção deve estar de acordo com a prática comum do hospital/laboratório

7. Deixe o sangue coletado secar por 4 horas, repousando o papel de filtro em uma superfície horizontal,

não-absorvente, em temperatura ambiente.

8. Envie as amostras secas em papel de filtro para o laboratório, dentro de 24 horas. Para instruções detalhadas da coleta da amostra, consulte o manual do fabricante do papel de filtro ou as orientações padronizadas.

A estabilidade das amostras de sangue seco é de até 21 dias em temperatura ambiente (20 a 25ºC) ou refrigeradas (2 a 8ºC). Para períodos mais longos de armazenamento, proteja as amostras da umidade e congele-as a < –18ºC. Evite temperaturas acima de 37ºC por vários dias, isto pode causar a diminuição de alguns aminoácidos.


5.2 Reconstituição do padrão interno O padrão interno (artigo 55004) é utilizado como padrão de calibração para cada amostra e é rastreável a substâncias de referência isotopicamente marcadas adquiridas de fornecedor certificado. Após reconstituição, uma quantidade definida de padrão interno é adicionada a amostra e, então, submetido a todo o procedimento de preparação das amostras. O padrão interno liofilizado é reconstituído com exatamente 50 mL de solução tampão de extração (artigo 55008). Abra o frasco do padrão interno e dissolva o conteúdo com 5 mL de solução tampão de extração. Deixe o frasco em repouso à temperatura ambiente por cerca de 5 minutos, agite ocasional e suavemente. Transfira o conteúdo do frasco para um balão volumétrico de 50 mL. Enxágüe o frasco do padrão interno duas vezes com 5 mL de solução tampão de extração e transfira o líquido para o balão volumétrico. Complete o volume do balão volumétrico para 50 mL com a solução tampão de extração e homogeneíze. Evite a exposição direta à luz. A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada no folheto de informações que acompanha o padrão. Estabilidade padrão interno reconstituído: O padrão interno reconstituído é estável por até três semanas se mantido bem fechado, protegido da luz e refrigerado (2 a 8°C).

5.3 Manuseio dos controles Os controles nível I (artigo 0192) e nível II (artigo 0193), disponíveis na forma de spots de sangue seco em papel de filtro são submetidos a todo o procedimento de preparação das amostras. Os controles assim preparados são incluídos em cada série analítica para monitorar a exatidão e a precisão do sistema. A embalagem com fechamento tipo zip contêm o material controle, envelopes com dissecante e um cartão indicador de umidade. O cartão indicador de umidade deve ser verificado sempre que a embalagem do controle for aberta. Se o indicador apresentar uma mudança da cor azul para rosa, em 50%, os envelopes com dissecante devem ser retirados e regenerados mediante aquecimento a 60ºC por 4 horas em forno de secagem. Para evitar condensação, os controles armazenados em temperaturas abaixo de -18ºC devem ser mantidos na embalagem, até que esta atinja a temperatura ambiente, para então ser aberta. Imediatamente após o uso, os controles remanescentes devem ser novamente acondicionados em suas embalagens zip, feche bem e congele abaixo de -18°C. Uma fita de registro de temperatura está fixada na embalagem dos controles. Uma mudança permanente da cor branca para preta indica que a temperatura correspondente no indicador foi alcançada. Evite temperaturas acima de 37ºC por mais de cinco dias. Decréscimo na concentração dos analitos (aminoácidos) pode ocorrer. Evite exposição direta à luz do solar. A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada no folheto de informação que acompanha o controle.

Atenção: Este produto foi fabricado a partir de pool de sangue total humano testado, fornecendo resultados negativos para anticorpos HIV-1+2, HIV-, HCV- e HBV-DNA (PCR), antígeno HBs, anticorpos HBc, anticorpos HCV e TPHA. Como não existem métodos que dêem segurança absoluta de que produtos contendo materiais de fonte humana serão livres de agentes infecciosos, um possível risco de infecção deve ser levado em conta. Este produto também pode conter agentes desconhecidos e outros patógenos para os quais não existem testes aprovados. Nós assim recomendamos considerar todos os produtos contendo material de fonte humana como potencialmente infeccioso e manipulá-lo com o mesmo cuidado destinado a amostras de pacientes potencialmente infecciosas.


5.4 Procedimento de preparação das amostras

5.4.1 Preparação da amostra sem placa filtrante - somente para amino ácidos e acilcarnitinas

1. Picotagem da amostra: Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3 mm da amostra de sangue seco e coloque dentro de um poço da placa de 96 poços. 2. Extração: Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Tampe a placa com a folha de proteção e agite por 20 minutos a 600 rpm, em temperatura ambiente. 3. Transferência/Evaporação: Remova a folha de proteção da placa. Transfira o sobrenadante para uma nova placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar. Importante: evitar permanecer umidade nas placas pois isso interfere na derivatisação 4. Derivatisação: Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Selar a placa com a folha de proteção e incubar a 60°C e 600 rpm por 15 minutos. 5. Evaporação Remova a folha de proteção da microplaca. Evapore a 60°C e 600 rpma para secar sobre fluxo de ar. Cuidado: uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reganete de derivatização! Trabalhe sob exaustor. 6. Reconstituição do eluato

Adicione 100 µl do tampão de reconstituição. Agite a 600 rpm por 1 minuto.

7. Injeção: Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS. 8. Controle de Qualidade: A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais em cada corrida analítica.

5.4.2 Preparação da amostra com placa filtrante - somente para amino ácidos e acilcarnitinas

1. Picotagem da amostra: Coloque uma placa filtrante em uma placa de 96 poços com fundo em V. Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3 mm da amostra de sangue seco e coloque dentro de um poço da placa filtrante. 2. Extração: Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Tampe a placa filtrante com a folha de proteção (artigo 55011) e agite ambas as placas por 20 minutos a 600 rpm, em temperatura ambiente. 3. Centrifugação/ Evaporação: Remova a folha de proteção da placa. Filtre o sobrenadante para a placa de 96 poços com fundo em V, por centrifugação a 4000 rpm por 2 minutos. Descarte a placa filtrante e evapore a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar. Importante: evitar permanecer umidade nas placas pois isso interfere na derivatisação 4. Derivatisação: Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Selar a placa com a folha de proteção e incubar a 60°C e 600 rpm por 15 minutos.


5. Evaporação Remova a folha de proteção da microplaca. Evapore a 60°C e 600 rpma para secar sobre fluxo de ar. Cuidado: uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reganete de derivatização! Trabalhe sob exaustor. 6. Reconstituição do eluato

Adicione 100 µl do tampão de reconstituição. Agite a 600 rpm por 1 minuto. 7. Injeção: Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS. 8. Controle de Qualidade: A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais em cada corrida analítica.

5.4.3 Preparação da amostra incluindo succinilacetona

1. Picotagem da amostra: Coloque uma placa filtrante em uma placa de 96 poços com fundo em V. Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3 mm da amostra de sangue seco e coloque dentro de um poço da placa filtrante. 2. Extração: Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Tampe a placa filtrante com a folha de proteção (artigo 55011) e agite ambas as placas por 20 minutos a 600 rpm, em temperatura ambiente. 3. Transferência: Remova a folha de proteção da placa. Transfira o sobrenadante para uma nova placa de 96 poços. 4. Extração do succinilacetona Adicione 150 ul de Padrão Interno para succcinilacetona (ref. 55044) aos spots de sangue restantes. Tampe a placa filtrante com a folha de proteção e agite a placas por 30 minutos a 600 rpm, a 60°C. Importante: assegurar que o sistem amntenha a temperatura a a 60°C durante a incubação.

5. Transferência / Evaporação:

Remova a folha de proteção da placa. Combine o sobrenadante com o primeiro sbrenadante em uma nova placa de 96 poços com fundo em V. Evapore a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar. Importante: cuidado em não secar em excesso as amostras pois isso pode levar a perda de succinilacetona. Evitar permanecer umidade nas placas pois isso interfere na derivatisação

6. Derivatisação: Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Selar a placa com a folha de proteção e incubar a 60°C e 600 rpm por 15 minutos. Importante: assegurar que o sistem amntenha a temperatura a a 60°C durante a incubação.

7. Evaporação Remova a folha de proteção da microplaca. Evapore a 60°C e 600 rpma para secar sobre fluxo de ar. Importante: cuidado em não secar em excesso as amostras pois isso pode levar a perda de succinilacetona. Cuidado: uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reganete de derivatização! Trabalhe sob exaustor.

8. Reconstituição do eluato Adicione 200 µl do tampão de reconstituição. Agite a 600 rpm por 1 minuto.

9. Injeção:

Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS.

10. Controle de Qualidade: A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais em cada corrida analítica


Atenção: Use somente os reagentes, placas de 96 poços e folhas de proteção fornecidas no kit. Variações na preparação das amostras irão alterar a eficiência do kit.

5.5 Estabilidade das amostras Os eluatos/amostras, depois de preparados, são estáveis em temperatura ambiente (20 a 25°C) ou refrigerados (2 a 8ºC) por 10 dias (em frasco de vidro bem fechado e protegido da luz). Para períodos mais longos, congelar a temperatura abaixo de -18C. Os eluatos descongelados devem ser bem homogeneizados antes da injeção.

5.6 Materiais requeridos, mas não fornecidos

Esse kit é para determinação semi-quantitativa de aminoácidos e acilcarnitinas em gotas de sangue seco para triagem neonatal, que adicionalmente requer os seguintes equipamentos não inclusos no kit:

Espectrômetro de massa em tandem com software de avaliação;

Sistema de HPLC com bomba, injetor e amostrador automático;

Picotador automático ou manual, para picotar as amostras, 3 mm em diâmetro;

Agitador de placas de microtitulação para extração das amostras;

Ventilador de ar quente para evaporação das amostras

Presilhas de borracha (elástico) para prender as folhas de proteção às placas de 96 poços;

Pipeta ou pipeta multicanal, 60-200 µL;

Ponteiras;

Exaustor

Balão volumétrico com capacidade para 50 mL;

6 Resultados e avaliação

6.1 Quantificação com padrão interno O padrão interno é utilizado como um calibrador individual para cada amostra, reduzindo assim os efeitos de matriz ao mínimo. Para este fim, a amostra (controle, paciente) é misturada com uma quantidade definida de padrão interno. As concentrações dos compostos isotopicamente marcados no padrão interno dependem do lote e serão encontradas nos folhetos informativos que acompanham os padrões. O volume de sangue utilizado é fundamental para a quantificação bem sucedida das amostras. O volume de sangue obtido através do picote de um disco de sangue seco depende do diâmetro do disco picotado, do hematócrito da amostra e do material do papel de filtro utilizado. Usando um picote com 3 mm de diâmetro, um hematócrito entre 0,35 e 0,45 e um papel de filtro da marca Whatman 903, o volume médio de sangue é de 3,1 µL. Uma vez que o volume de sangue varia de amostra para amostra, este procedimento de triagem é método de determinação semi-quantitativo. Para confirmar resultados de triagem positivos, testes diagnósticos adicionais devem ser realizados. Antes de iniciar a análise quantitativa de amostras de pacientes, é recomendado realizar vários testes de corrida, injetando os controles preparados repetidamente, até que dois sucessivos espectros de massa apresentem valores de concentração e de intensidade de sinal quase idênticos. Dependendo do software utilizado, os valores dos componentes do padrão interno e o volume de sangue ou a concentração do padrão interno relacionada à amostra é necessária. Entre com as concentrações (ver folheto informativo) do padrão interno na tabela de análise.


Aminoácidos:

Substância Concentração (µmol/L) Concentração relacionada à amostra para 200 µL de padrão interno / 3,1 µL de sangue

(µmol/L)

Alanina-D4 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Arginina-D7 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Ácido Aspártico-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Citrulina-D2 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Ácido Glutâmico-D5 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Glicina-13C2-15N Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Leucina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Metionina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Ornitina-D6 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Fenilalanina-D5 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Prolina-D7 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Tirosina-D4 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Valina-D8 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

Acilcarnitinas e Carnitina livre:


(µmol/L)

C0-Carnitina-D9 Ver folheto informativo Ver folheto informativo





C5DC-Carnitina-D6 Ver folheto informativo Ver folheto informativo








Nota: O folheto informativo, que acompanha o padrão interno, contém os valores a serem inseridos. Metabólitos da tirosina (SucA):


(µmol/L)

Succinilacetona- 13C5 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

O volume de amostra de sangue seco é proporcional ao tamanho do disco picotado. Se qualquer outro tamanho de picote do disco de sangue seco, diferente de 3 mm de diâmetro, for utilizado, favor ajustar as concentrações do padrão interno de acordo. Para assegurar que as condições do LC-MS/MS não sofreram variações durante a corrida analítica, os controles preparados devem ser injetados durante a corrida e novamente ao final. Para o manuseio correto do software, entre em contato com o fabricante, se necessário.


6.2 Princípios do cálculo As concentrações dos analitos nas amostras são calculadas de acordo com o seguinte princípio: Intensidade do sinal da substância A no espectro de massa da amostra

= AAmostra

Intensidade do sinal do padrão interno no espectro de massa da amostra

=ISAmostra

Concentração C do padrão interno relacionada a amostra (tabelas 4 e 5) =CPadrão

A concentração CAnalito,Amostra na amostra é então calculada como a seguir:

CAnalito,Amostra (µmol/L) = _AAmostra x CPadrão ISAmostra

7 Controle de Qualidade Controles adicionais podem ser incluídos em cada corrida analítica para monitorar a exatidão e precisão das análises (Controles Chromsystems, spot de sangue seco, artigo 0192 e 0193).

8 Valores de referência/valores de cut-off

* Cut-off a 99,5% determinado em estudo piloto com 1500 neonatos do centro da University Hospital of Leipzig ** Cut-off a 99,5% determinado em estudo piloto com 2500 neonatos do Medical University of Vienna

Aminoácidos:

Analito Cut off (µmol/L)*

Cut off (µmol/L)**

Alanina 743 561

Arginina 35 47

Ácido Aspártico 270 147

Citrulina 33 34

Ácido Glutâmico 710 800

Glicina 717 834

Leucina 270 226

Metionina 22 45

Ornitina 350 258

Fenilalanina 92 82

Prolina - - Tirosina 225 197

Valina 198 191

Succinilacetona - 1,16



Analito Cut off (µmol/L)*

Cut off (µmol/L)**

C0-Carnitina 60,3 49,8

C0, cutoff baixo 5,2 8,0





C5DC-Carnitina 0,34 0,22








Esses valores de cut off devem servir apenas como base, uma vez que variam de acordo com o grupo de pacientes estudados e com o sistema MS/MS utilizado. Cada laboratório deve determinar seus próprios valores de cut off em estudos pilotos, sob supervisão e avaliação de especialistas.

9 Fatores de conversão Aminoácidos:

Analito µmol/L em mg/L mg/L em µmol/L

Alanina x 0,0891 x 11,223

Arginina x 0,1742 x 5,7405

Ácido Aspártico x 0,1331 x 7,5126

Citrulina x 0,1752 x 5,7081

Ácido Glutâmico x 0,1471 x 6,7967

Glicina x 0,0751 x 13,321

Leucina x 0,1312 x 7,6237

Metionina x 0,1492 x 6,7020

Ornitina x 0,1322 x 7,5666

Fenilalanina x 0,1652 x 6,0536

Prolina x 0,1151 x 8,6858

Tirosina x 0,1812 x 5,5191

Valina x 0,1172 x 8,5361

Succinilacetona x 0,1581 x 6,3231


Analito µmol/L em mg/L mg/L em µmol/L

C0-Carnitina x 0,1612 x 6,2019





C5DC-Carnitina x 0,2753 x 3,6319



C10-Carnitina x 0,3154 x 3,1701

C12-Carnitina x 0,3435 x 2,9109

C14-Carnitina x 0,3715 x 2,6915

C16-Carnitina x 0,3996 x 2,5023

C18-Carnitina x 0,4276 x 2,3384


10 Informações sobre substâncias perigosas As seguintes informações devem ser observadas e as respectivas medidas de segurança deverão ser adotadas. Maiores informações podem ser obtidas nos respectivos folhetos de segurança dos materiais (www.chromsystems.de) ou mediante solicitação.

Produto/ Símbolos de perigo Risco

Fase móvel (artigo 55001, 55002)

Xn (nocivo)

F (altamente inflamável)

R11-20/21/22-36 Altamente inflamável. Nocivo por inalação, ingestão e contato com a pele. Irritante aos olhos. S16-36/37 Manter longe de ignição, não fumar. Utilizar jaleco e luvas.

Solução de limpeza (artigo 57007)

Xn (nocivo)



Solução tampão de extração (artigo 57008)

T (tóxico)


R11-23/24/25-39/23/24/25 Altamente inflamável. Tóxico por inalação, ingestão e contato com a pele. Tóxico: perigo de sérios danos irreversíveis por inalação, ingestão e contato com a pele. S7-16-36/37-45 Manter o frasco bem fechado. Manter longe de ignição, não fumar. Utilizar jaleco e luvas. Em caso de acidente ou mal estar, procurar auxílio médico imediatamente, de preferência levar esse manual.

Mistura para tuning (artigo 57099)

Xn (nocivo)



Esses componentes não são classificados como perigosos de acordo com a legislação da União Européia: Padrão Interno (artigo 57004) Controles MassCheck em sangue seco (artigos 0191, 0192, 0193).


11 Armazenamento e validade dos reagentes Reagentes não abertos podem ser utilizados até a data de validade estabelecida no rótulo, desde que as condições de estocagem indicadas no rótulo sejam obedecidas. Condições de armazenamento dos reagentes:

Produto Condição

Fase móvel Temperatura ambiente

Solução de limpeza Temperatura ambiente

Solução tampão de extração Temperatura ambiente

Reagente de derivatisação Temperatura ambiente

\tampão recosntituição Temperatura ambiente

Placa de 96 poços Temperatura ambiente

Folhas de proteção para placas de 96 poços Temperatura ambiente

Mistura para tuning 2 a 8ºC

Padrão Interno Abaixo de -18ºC

Controles nível I e nível II, spot Abaixo de -18ºC

Mistura para tuning para succinilacetona 2 a 8ºC

Os reagentes devem ser fechados e armazenados nas condições estabelecidas tão logo sejam utilizados. Se nada tiver sido previamente determinado, a validade de um reagente em uso deverá ser de 1 ano após sua abertura, não excedendo o seu respectivo prazo de validade. Para calibradores e controles, ver os capítulos 5.2 e 5.3 deste manual.

12 Descarte de resíduos A fase móvel, a solução de limpeza, a solução tampão de extração, o padrão interno, o reagente de derivatisação, o tampão de reconstituição, a mistura para tuning e qualquer resíduo das amostras extraídas contêm solventes orgânicos e devem ser descartadas de acordo com as diretrizes locais e legislação vigente.

12.1 Garantia

Estas instruções de uso devem ser lidas atentamente antes da utilização do produto e as instruções nela contidas devem ser rigorosamente cumpridas. A confiabilidade dos recados do ensaio não poderá ser garantida em caso de desvio às instruções. .


13 Exemplos de cromatogramas

13.1 Espectro do controle de aminoácidos no intervalo do cut-off

13.2 Espectro de uma amostra de paciente com fenilcetonúria (PKU)

13.3


13.3 Espectro do controle de acilcarnitinas no intervalo do cut-off

13.4 Espectro de uma amostra de paciente com MCAD


13.5 Espectro de uma amostra de paciente com VLCAD

13.6 Espectro de uma amostra de paciente com acidemia glutárica tipo I (GA I)


14 Validação Para verificar a linearidade e para validar o método, foram utilizadas amostras de sangue acrescentadas de quantidades definidas de aminoácidos e acilcarnitinas. Alíquotas múltiplas dessas amostras foram submetidas ao procedimento de preparo descrito neste manual. Recuperação: A recuperação analítica foi determinada a partir do coeficiente angular da curva de calibração, obtida com amostras de sangue acrescentadas de quantidades definidas de aminoácidos e acilcarnitinas e soluções padrões diluídas. Aminoácidos:

Analito Recuperação (%)

Alanina 85

Arginina 67

Ácido Aspártico 77

Citrulina 89

Ácido Glutâmico 72

Glicina 82

Leucina 77

Metionina 90

Ornitina 69

Fenilalanina 86

Prolina* 81

Tirosina 88

Valina 79

* a determinação deste analito foi realizada no AB Sciex API4000 Acilcarnitinas e Carnitina livre:

Analito Recuperação (%)

C0-Carnitina 88

C2-Carnitina 84

C3-Carnitina 81

C4-Carnitina 83

C5-Carnitina 88

C5DC-Carnitina 82

C6-Carnitina 86

C8-Carnitina 94

C10-Carnitina 87

C12-Carnitina 97

C14-Carnitina 88

C16-Carnitina 90

C18-Carnitina 93


Linearidade e limite de quantificação O limite de quantificação e a linearidade foram determinados por diluição de um eluato de amostras de sangue preparada com padrão interno. O método é considerado linear a partir do limite de quantificação até o limite máximo. Aminoácidos:

Analito Limite de quantificação aproximado (µmol/L)*

Limite máximo de linearidade (µmol/L)

Alanina 15,6 2000

Arginina 2 2000

Ácido Aspártico 15,6 2000

Citrulina 2 2000

Ácido Glutâmico 15,6 2000

Glicina 15,6 2000

Leucina 15,6 2000

Metionina 2 2000

Ornitina 2 2000

Fenilalanina 2 2000

Prolina* 4,8 2400

Tirosina 15,6 2000

Valina 15,6 2000


Analito Limite de quantificação aproximado (µmol/L)*

Limite máximo de linearidade (µmol/L)

C0-Carnitina 1,6 200


C3-Carnitina 0,2 50

C4-Carnitina 0,2 25

C5-Carnitina 0,2 25

C5DC-Carnitina 0,2 25

C6-Carnitina 0,2 25

C8-Carnitina 0,2 25






*O limite de quantificação depende do sistema LC-MS/MS empregado.


Precisão intra-ensaio: A determinação da precisão intra-ensaio foi realizada em três diferentes concentrações, a partir da média e coeficiente de variação de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra. Aminoácidos:

Analito Coeficiente de variação (%), n=10 (concentração em µmol/L)

Alanina 3,4 (495) 5,2 (806)

Arginina 4,9 (44) 5,6 (204)

Ácido Aspártico 8,1 (85) 5,5 (241)

Citrulina 5,8 (61) 4,1 (232)

Ácido Glutâmico 4,9 (439) 5,6 (761)

Glicina 3,4 (411) 6,6 (1120)

Leucina 3,7 (246) 5,4 (511)

Metionina 7,1 (55) 7,0 (201)

Ornitina 6,4 (214) 4,6 (445)

Fenilalanina 4,3 (120) 4,6 (464)

Prolina* 4,9 (418) 4,5 (615)

Tirosina 8,6 (178) 6,4 (500)

Valina 6,9 (293) 6,8 (515)



C0-Carnitina 6,8 (53,5) 5,9 (110)

C2-Carnitina 5,2 (29,0) 6,3 (65,7)

C3-Carnitina 10,4 (5,57) 8,6 (12,3)

C4-Carnitina 14,8 (1,01) 10,9 (3,77)

C5-Carnitina 12,8 (0,66) 15,0 (2,36)

C5DC-Carnitina 13,1 (0,57) 14,7 (2,14)

C6-Carnitina 13,8 (0,46) 6,3 (1,75)

C8-Carnitina 15,6 (0,51) 6,5 (1,87)

C10-Carnitina 14,8 (0,62) 10,4 (2,00)

C12-Carnitina 13,0 (0,58) 10,4 (2,26)

C14-Carnitina 13,2 (0,54) 11,0 (2,14)

C16-Carnitina 4,8 (4,75) 5,5 (10,9)

C18-Carnitina 9,4 (2,52) 11,8 (7,44)


Precisão inter-ensaio: A determinação da precisão inter-ensaio foi realizada em três diferentes concentrações, a partir da média e coeficiente de variação de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra, em 10 diferentes séries de testes. Aminoácidos:


Alanina 6,5 (493) 6,9 (820)

Arginina 9,4 (41) 8,8 (201)

Ácido Aspártico 9,9 (80) 8,8 (233)

Citrulina 7,9 (58) 7,5 (233)

Ácido Glutâmico 7,9 (423) 8,2 (750)

Glicina 7,1 (404) 7,5 (1126)

Leucina 7,0 (239) 6,8 (513)

Metionina 9,6 (54) 9,0 (204)

Ornitina 8,9 (208) 8,4 (449)

Fenilalanina 7,7 (117) 7,3 (466)

Prolina* 10,4 (446) 11,0 (685)

Tirosina 8,4 (171) 7,5 (494)

Valina 9,3 (278) 8,1 (526)



C0-Carnitina 8,8 (53,9) 9,6 (112)

C2-Carnitina 7,8 (27,6) 7,2 (64,7)

C3-Carnitina 9,8 (5,41) 10,7 (12,5)

C4-Carnitina 14,0 (0,97) 11,9 (3,71)

C5-Carnitina 18,0 (0,60) 13,60 (2,31)

C5DC-Carnitina 20,3 (0,57) 15,5 (2,19)

C6-Carnitina 16,1 (0,45) 10,8 (1,82)

C8-Carnitina 15,7 (0,49) 12,3 (1,89)

C10-Carnitina 15,1 (0,59) 10,8 (2,13)

C12-Carnitina 14,6 (0,61) 12,0 (2,26)

C14-Carnitina 13,5 (0,54) 11,9 (2,11)

C16-Carnitina 8,9 (4,42) 10,0 (10,5)

C18-Carnitina 11,3 (2,34) 12,0 (7,36)


15 Interferentes conhecidos

Isoleucina interfere com leucina. A concentração medida na amostra é um somatório das concentrações dos dois aminoácidos.

Hidroxiprolina interfere com leucina. O valor padrão da hidroxiprolina é insignificante comparado ao da leucina. Hidroxiprolina não deve causar qualquer falso aumento da concentração de leucina durante a análise de rotina.

Metionina sulfona interfere com tirosina. Metionina sulfona é um produto de degradação da metionina. A concentração padrão da Metionina em crianças é de aproximadamente 20 µmol/L e as concentrações máximas esperadas de metionina sulfona estão dentro dessa faixa. O valor patológico de tirosina é de aproximadamente 300 µmol/L. Desta forma, metionina sulfona não deve causar acréscimos significativos na concentração de tirosina durante análises de rotina.

Metionina sulfóxido interfere com metionina, tirosina e fenilalanina. Metionina sulfóxido é um produto da oxidação da metionina. In vivo, metionina sulfóxido é reduzida novamente a metionina pela ação da enzima metionina sulfóxido redutase. Logo, em condições in vivo, não devem existir concentrações patológicas de metionina, tirosina e fenilalanina causadas pelo aumento da concentração de metionina sulfóxido.

Sarosina interfere com alanina. A concentração de sarosina em relação à alanina, contudo, é negligenciável. Portanto, a sarosina não deve causar falsa elevação dos resultados de alanina.

A creatina, um suplemento alimentar utilizado para aumentar a massa muscular, interfere com alanina e leucina.

O metabólito do analgésico Metamizol (ex. Dipirona Sódica) interfere com a C2-carnitina.

Acilcarnitinas isobáricas com fragmentações idênticas são medidas como somatório. Isto aplica-se aos seguintes pares de acilcarnitinas: C3DC/C4OH; C4DC/C5OH; C5DC/C6OH, etc.

Asparagina interfere com ornitina. A concentração máxima de asparagina em crianças é de 140 µmol/L. Somente concentrações de asparagina acima de 300 µmol/L podem causar um aumento de 20% na concentração de ornitina. Asparagina não deve causar qualquer falso aumento da concentração de ornitina durante análise de rotina.

Aditivos em materiais plásticos (placas de microtitulação, folhas de proteção) usados na preparação das amostras, podem interferir consideravelmente com algumas acilcarnitinas, gerando resultados falso-positivos. Logo, este kit de reagentes da Chromsystems contém todos os materiais plásticos necessários para a análise, devidamente testados e classificados como livre de interferentes.

Em pacientes com dietas parenterais, com substituição de tirosina por acetiltirosina, pode ocorrer decréscimo na concentração de tirosina. A razão elevada entre as concentrações de Fenilalanina e Tirosina (Phe/Tyr) pode indicar falsamente fenilcetonúria, mesmo com a concentração de fenilalanina em valores normais.

Pacientes em uso de pivalina como antibiótico podem apresentar concentrações elevadas de C5-Carnitina, devido à formação de pivalilcarnitina (isômero da isovalerilcarnitina). Embora nenhuma desordem metabólica exista, uma acidemia isovalérica (IVA) pode ser falsamente indicada.

Para o esclarecimento de quaisquer outras questões envolvendo possíveis interferências, entre em contato com a assessoria científica da Biosys, através de e-mail ou telefone, ou mande um e-mail para [email protected].


16 Problemas e Soluções Problema Possível causa Solução Gradiente de fluxo não está sendo gerado

Bomba do HPLC Ar no sistema Fluxo inconstante

Checar bomba de HPLC (vazamentos, bolhas de ar) Degaseificar o sistema de HPLC (purga) Checar a bomba do HPLC

Sinais interferentes Sistema de injeção contaminado Frascos do amostrador automático contaminados Selos dos frascos

Limpar com metanol ou injetar fase móvel 10 vezes Usar frascos novos ou limpá-los com metanol Usar outros selos

Perda de sinal Defeito no injetor Defeito na bomba Sistema MS/MS não está pronto

Checar o injetor Checar a bomba Checar o sistema MS/MS

Diminuição da sensibilidade

Fonte de íons contaminada Espectrômetro de massa contaminado Vazamento na válvula de injeção Multiplicadora degradada

Limpe a fonte de íons Limpe o espectrômetro de massa Checar o injetor Substitua à multiplicadora

Sinal com pouca intensidade

Massas imprecisas Amostrador automático sem exatidão

Realize a calibração das massas Checar a acurácia

Ausência de vácuo

Defeito na bomba de vácuo Vazamento no sistema de vácuo

Checar todas as bombas de vácuo Checar tubulações e conexões

Sem suprimento de gás

Defeito no gerador de nitrogênio Defeito no compressor Cilindro de gás vazio Pressão do gás inadequada

Checar o gerador de nitrogênio Checar compressor Substituir o cilindro de gás Ajustar a pressão do gás


17 Literatura

manual de instruções para análise hplc para - biosys.com.br · uma vez que esses defeitos são...

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