MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA CELULAR

QBP. Martn Zavala NezMANUAL DE PRACTICAS DE Biologia Celular y Molecular Biologia Celular y Molecular MATERIA:MEDICO CIRUJANOLICENCIATURA EN:

NDICE Introduccin 3

Programa de la asignatura de Biologa CelularLineamientos en el LaboratorioFormato de cada prctica 4910

PRCTICAS

1. Diferenciacin celular11

2. Conteo celular de glbulos blancos15

3. Propiedades de la membrana 17

4. Fenmeno de transporte en las membranas22

5. Diferenciacin mitocondrial y citoplasmtica33

6. Actividad enzimtica de los peroxisomas 36

7. Mitosis en clulas vegetales8. Cariotipos en races de habaBibliografa 42 47

INTRODUCCIONLas guas consignadas en este manual procuran conducir al estudiante de primer ao universitario de medicina, en el fascinante mundo de la experimentacin biolgica. Como es apenas lgico, el trabajo de experimentacin supone una actitud protagnica y constructiva por parte del alumno; bajo la orientacin del profesor. Consiguiendo as, la confirmacin de algunos fenmenos expuestos en las clases tericas, adems de la familiarizacin del estudiante con el trabajo de laboratorio. En tal sentido, al inicio de cada prctica el profesor ofrece una breve introduccin sobre los fundamentos bsicos y metodologa de la prctica. El objetivo fundamental del manual de prcticas es presentar a los estudiantes una serie de experiencias prcticas diseadas para que no slo sigan instrucciones, sino para que aprendan a pensar y a llegar a conclusiones lgicas cuando se analizan problemas relacionados con el rea de la Biologa Celular y Molecular.La Biologa Celular y Molecular en la actualidad ha tenido un avance muy notable, ya que se ha dado la aplicacin de nuevos mtodos para el anlisis de la clula en todos sus niveles. Para tener un mayor conocimiento acerca de la organizacin molecular de la clula es necesario que sea a partir del estudio de las diferentes molculas que la conforman. Esto nos permite enfocar cada uno de los fenmenos celulares que se llevan a cabo en aquella.El manual consta de ocho prcticas, las cuales constituyen material suficiente para el desarrollo de la asignatura de Biologa Celular y Molecular. Las prcticas estn diseadas para dos horas de laboratorio, de tal manera que haya tiempo suficiente para discusin y explicaciones preliminares sobre el trabajo experimental.

PROGRAMA DE LA ASIGNATURALa materia de BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR, pretende establecer mtodos de estudio aplicables de la estructura y funcin de las clulas animal y vegetal, as como su composicin y estructura describiendo sus relaciones con las clulas vecinas y con la matriz que las rodea. OBJETIVO GENERAL DE LA MATERIA: Conocer los avances realizados en el estudio de la estructura y fisiologa celular. Explicar la naturaleza fluida de las membranas biolgicas y relacionar con los componentes lipdicos y proteicos, sealar la fluidez de las membranas y sus funciones dinmicas, los diferentes componentes del citoesqueleto, relacionarlos con sus funciones celulares y su intervencin en la modulacin de los procesos extracelulares. Describir la importancia de la comunicacin intra e intercelular para el mantenimiento de la vida celular. Referir la ultraestructura de mitocondrias y cloroplastos, y relacionarla con los procesos transductores de energa.UNIDAD I. PRINCIPALES BIOMOLECULAS DE LA MATERIA VIVA I.1 Carbohidratos. Generalidades, clasificacin e importancia. I.1.1 Glucoprotenas y glucolpidos.I.2 Lpidos. I.2.1 Generalidades, clasificacin e importancia. I.2.2 Propiedades qumicas.I.3 Aminocidos y protenas. I.3.1 Aminocidos como unidades fundamentales de las protenas. I.3.2 Generalidades sobre protenas. I.3.3 Organizacin y estructura de las protenas. I.3.4 Clasificacin de protenas y su importancia.I.4 cidos nucleicos. I.4.1 Generalidades de los cidos nucleicos como unidades de la herencia. I.4.2 Composicin qumica de los cidos nucleicos (nuclesidos y nucletidos).I.4.2 Estructura y funcin del ADN. Estructura, tipos y funcin del ARN.

UNIDAD II. INTRODUCCIN AL ESTUDIO DE LA CLULAII.1 Niveles de organizacin de la materia viva. II.1.1 tomo, molcula, coacervado, clula, tejidos, rganos, aparatos, sistemas e individuos.II.2 Origen de la vida y evolucin celular. II.2.1 Evolucin qumica y sntesis prebiolgica de compuestos orgnicos; surgimiento de las molculas orgnicas; sntesis abitica. II.2.2 Teora de Oparin-Haldane; experimentos de Miller y Urey. II.2.3 Origen y evolucin del metabolismo. II.2.4 Origen de los procariontes y eucariontes. II.2.5 Evolucin prebiolgica como antecedente del surgimiento de las primeras clulas. II.2.6 Hiptesis ms fundamentada del origen de los eucariontes (simbitica). II.2.7 Origen del ncleo y del retculo endoplsmico.II.3 Antecedentes y generalidades sobre el estudio de la clula. II.3.1 Teora celular. II.3.2 Datos histricos sobre las aportaciones y avances tecnolgicos que permitieron profundizar en el estudio de la clula. II.3.3 Postulados de la teora celular y el impacto en su momento histrico. II.3.4 Unidad y diversidad celular; los tres dominios (Archea, Eubacteria y Eucaria). II.3.5 Unidad y diversidad celular; los tres dominios (Archea, Eubacteria y Eucaria). II.3.6 Clasificacin de R. Whittaker.II.4 Mtodos para el estudio de la clula. II.4.1 Microscopa: fundamentos; microscopio fotnico, de campo claro, contraste de fases, electrnico, de transmisin y de barrido. II.4.2 Anlisis de fracciones celulares: centrifugacin diferencial, cromatografa, electroforesis y espectroscopa. II.4.3. Mtodos histolgicos: fijacin, inclusin, corte, tincin (colorantes, composicin, especificidad y clasificacin).II.5 Organizacin y estructura general de la clula. II.5.1 Procariontes: estructura y organizacin genmica; importancia y diversidad. II.5.2 Eucariontes: estructura (panorama general de los distintos organelos que componen a la clula); importancia y diversidad.

UNIDAD III. ESTRUCTURAS DE SOSTN Y DE RECONOCIMIENTO III.1 Pared celular. Estructura, funcin e importancia en procariontes (Gram positivas, Gram negativas y de Archea) y de eucariontes (hongos, algas y vegetales). III .1.1 Estructura y funcin del glicoclix.III.2 Matriz extracelular. Composicin qumica y funciones; diversidad estructural.III.3 Membrana celular de procariontes y eucariontes: composicin qumica y funcin. III.3.1 Modelo del mosaico fluido, protenas membranales integrales y perifricas.III.4 Mecanismos de transporte. III .4.1 Transporte pasivo: smosis y difusin; transporte activo; transporte masivo. III.4.1 Endocitosis: fagocitosis y pinocitosis; endocitosis constitutiva y mediada por receptores. Exocitosis.

UNIDAD IV. CITOESQUELETO Y MOVIMIENTO IV.1 Componentes del citoesqueleto. IV.1.1 Estructura, funcin e importancia de microtbulos, microfilamentos, filamentos intermedios y microtrabculas. IV.1.2 Relevancia e Importancia del citoesqueleto en las funciones celulares.IV.2 Centrolo, cuerpo basal y huso acromtico.IV.3 Asociaciones especializadas del citoesqueleto y de la matriz.IV.4 Movilidad celular: estructura de cilios y flagelos en eubacterias, eucaria y archeobacterias.

UNIDAD V. SISTEMAS MEMBRANOSOSV.1 Retculo endoplsmico. V.1.1 Estructura, funcin e importancia. V.1.2 Retculo endoplsmico rugoso: sntesis de protenas lisosomales y de secrecin (hiptesis del pptido seal). V.1.3 Retculo endoplsmico liso: estructura y funcin; sntesis de lpidos y detoxificacin celular.V.2 Aparato de Golgi. V.2.1 Estructura y funcin; modificaciones postraduccionales (glicosilaciones y sulfataciones). V.2.3 Transporte: trfico y empacamiento de productos de secrecin; procesos secretores; renovacin membranal.V.3 Lisosomas. Lisosoma primario, secundario y cuerpos residuales; mecanismos de digestin, defensa y autodigestin controlada.V.4 Microcuerpos. Peroxisomas y glioxisomas. Estructura y procesos oxidativos en los que intervienen.

UNIDAD VI. ESTRUCTURAS INVOLUCRADAS EN LA TRANSFORMACIN DE ENERGA VI.1 Mitocondria. VI.1.1 Ultraestructura: permeabilidad de la membrana, componentes de la membrana interna, espacio intermembranal y matriz. VI.1.2 Funcin e importancia en el envejecimiento celular.

UNIDAD VII. NCLEO Y REPRODUCCIN CELULAR VII.1 Ncleo. VII.1.1 Envoltura nuclear; estructura y funcin. VII.1.2 Complejo de poro y su regulacin en el transporte de materiales. VII.1.3 Cromatina y estructura cromosmica. VII.1.4 Nucleosoma. VII.1.5 Matriz nuclear; nucleoplasma, participacin en la organizacin y transcripcin del ADN.VII.2 Nucleolo. VII.2.1 Estructura y composicin (regin granular, regin fibrilar y ADN asociado). VII.2.2 Componentes ribonucleoproteicos.VII.3 Ciclo celular. VII.3.1 Fases del ciclo celular, duracin del mismo en clulas eucariontes. VII.3.2 Interfase (fase G0, G1, S, G2) eventos fisiolgicos. Divisin celular: mitosis, meiosis, citocinesis.VII.4 Control del ciclo celular.VII.5 Apoptosis (muerte celular programada). VII.5.1 Vas que conducen a la muerte celular.

UNIDAD VIII. COMUNICACIN CELULARVIII.1 Caractersticas de los sistemas de seales celulares.VIII.2 Traduccin de seales en el interior de la clula. VIII.2.1 Seal directa. VIII.2.2 Transformacin de la seal. VIII.2.3 Amplificacin de la seal. VIII.2.4 Distribucin de la seal. VIII.2.5 Moduladores de la seal.VIII.3 Adhesin intracelular. VIII.3.1 Uniones estrechas. VIII.3.2 Uniones de anclaje: mediadas por caderina y por integrinas. VIII.3.3 Uniones GAP y plasmodesmos.

LINEAMIENTOS EN EL LABORATORIOSe recomienda que se lea cada prctica antes de presentarse a la sesin de laboratorio, ya que este curso est dirigido hacia la aplicacin de tcnicas de estudio de la Biologa Celular. Para lo cual se pide el diseo y control sobre los experimentos que se estn realizando.El alumno deber observar buena conducta dentro del laboratorio y cumplir con los Lineamientos que marca el Reglamento interno de los Laboratorios:1. El uso de la bata en el laboratorio es obligatorio, NO permitiendo el acceso al mismo a ningn alumno si no se trae en ese momento.2. El alumno deber tener limpio su lugar de trabajo, por tal motivo deber depositar la basura en los cestos y no en el suelo y no se permite la ingesta de bebidas ni alimentos dentro del laboratorio.3. Al trmino de la prctica todo el material de cristalera utilizado debe estar perfectamente bien lavado y sus mesas de trabajo limpias.4. Trabaje en orden, evitando distraer a sus compaeros cuando estn realizando sus experimentos. El alumno desordenado ser suspendido de la sesin en curso.5. Est prohibido el uso de celulares dentro del laboratorio como medio de comunicacin. Solo podrn ser utilizados para la toma de fotografas de las preparaciones cuando as lo requieran, para una mayor calidad en el reporte.

FORMATO DE CADA PRCTICACada prctica consta de las siguientes secciones:1. Ttulo2. Objetivo 3. Introduccin4. Material 5. Procedimiento6. Cuestionario7. InformePara el desarrollo de la prctica, primero se establecen los objetivos; posteriormente en la introduccin se discuten los principios tericos que se aplican, las tcnicas de laboratorio requeridas y un ejemplo de clculos si fuese necesario.El procedimiento experimental incluye el material y reactivos necesarios, los avisos de seguridad pertinentes y las formas apropiadas de disponer de los desperdicios y reactivos sobrantes.El cuestionario contiene preguntas y problemas sobre el experimento y se tendrn que contestar antes con un prelaboratorio (prueba que el estudiante se prepar para la prctica), durante (comprobacin experimental) y despus de la prctica (informe).En el informe se anotaran las observaciones, datos y resultados. Asimismo se analizaran los resultados. Siendo el informe final de la prctica el documento en el que se basar la evaluacin de la misma.

PRCTICA No. 1CELULAS ANIMALES Y VEGETALESOBJETIVOEstablecer que de acuerdo con el nivel de organizacin, existen dos tipos de clulas: procariotas y eucariotas.INTRODUCCINSegn lo expresado por Curtis y Sue (2000) y Starr y Taggart (2004), las clulas animales y vegetales presentan algunas diferencias y similitudes, entre las diferencias se destaca, en la clula vegetal adems de la membrana celular, presenta pared celular compuesta de celulosa y otros polisacridos, la presencia de plstidos en la clula vegetal, constituye una de las grandes diferencias con respecto a la clula animal, las vacuolas grandes en clulas vegetales(ocupa gran parte de la clula) y vacuolas pequeas o ausentes en clulas animales es otra diferencia importante en los dos grupos. Las similitudes se tienen la presencia de ribosomas, mitocondrias, ncleo, nuclolo, complejos de Golgi.Para Gonzlez y Spinel (2004), segn la complejidad de la ultraestructura celular los organismos se dividen en procariontes y eucariontes. Los primeros o prenucleares, se caracterizan por carecer de organelos con unidad de membrana tales como ncleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi etc. como lo son las bacterias. En el grupo de los eucariontes estn los hongos, las algas, los protozoarios y dems organismos superiores vegetales y animales.La principal restriccin al tamao de la clula es la que impone la relacin entre el volumen y la superficie, esto es, en clulas grandes, la relacin superficie /volumen es menor que en clulas pequeas, lo que significa que las clulas grandes disponen de una superficie de intercambio con el medio ambiente proporcionalmente menor. Una segunda limitacin al tamao de una clula eucaritica parece estar relacionada con la capacidad del ncleo centro de control de la clula-para suministrar suficientes copias de molculas con la informacin necesaria para regular los procesos que ocurren en una clula grande, metablicamente activa (Curtis y Sue, 2000).MATERIALMicroscopioAzul de metileno

PortaobjetosRojo Sudan III

CubreobjetosColorante Wright

Mechero de alcoholFrasco lavador

Lanceta estrilAlcohol absoluto

Cubeta de tincinEosina

Cuchillas de afeitar nuevasHematoxilina

Cajas de Petri (pequeas)Lugol

Palillos de dientesCebolla

PapaTradescantia (siempre viva)

TomateTocino graso

Sangre humanaAgua de charca y algas

PROCEDIMIENTOPrimera actividad: Observacin de clulas vegetales1. Clulas de cebolla (Allium sp): Tome con cuidado varias hojas de cebolla y, retire la delgada capa (epidermis) que est adherida a ellas. Depostelas en una placa portaobjetos, evitando que se enrollen y agregue una gota de azul de metileno u otro colorante que se le indique. Finalmente coloque el cubreobjetos y realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos.2. Clulas de tradescantia: Se procede de la misma forma que la cebolla, pero sin agregar ningn colorante a la muestra. Realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. 3. Clulas de papa (Solanum tuberosum): Realice varios cortes (finos) de escasos micrmetros con la ayuda de cuchillas de afeitar nuevas, parte de esos cortes depostelos en una caja Petri con agua y agrgueles azul de metileno u otro colorante que se indique, el resto agrgueles directamente el colorante lugol. Realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. 4. Clulas de tomate (Lycopersicum esculentum): Retire un trozo pequeo de pulpa de tomate con la ayuda de un bistur o cuchilla de afeitar, depostelo en el portaobjeto y cbralo con el cubreobjetos. Haga las observaciones y esquemas en diferentes aumentos.Segunda actividad: Observacin de clulas animales5. Clulas de epitelio bucal: Con la ayuda de un palillo de dientes, realice un frotis de la cavidad interna de la mejilla, deposite el raspado sobre la lmina portaobjetos y haga un extendido sobre la misma. Adicione una gota de azul de metileno y coloque la laminilla cubreobjetos. Anote las observaciones y dibuje los esquemas en diferentes aumentos. Finalizada la observacin deposite las placas en el recipiente de riesgo biolgico (guardin) que hay en el laboratorio. 6. Clulas de tejido graso: Tome una cuchilla de afeitar o bistur, y haga un raspado sobre el tejido graso, depostelo en el portaobjeto y agrguele rojo sudan III. Anote las observaciones y dibuje los esquemas en diferentes aumentos.7. Clulas sanguneas: Para esta actividad es necesario un donante. Se procede de la siguiente manera: desinfecta con alcohol y algodn el rea (puncin en dedo, o vena del brazo), sin pasar dos veces por el mismo sitio (para evitar infecciones). Obtenida la muestra de sangre, deposite una gota sobre una placa portaobjetos y con la ayuda de otra placa, realice un extendido de la misma, adicinele el colorante wrigth, procurando distribuir el mismo en toda la placa. Luego, pase el portaobjeto por el mechero, haciendo varias pasadas sobre la flama (evitar quemar las clulas). Realice las observaciones y esquemas de la muestra, donde se observarn predominantemente glbulos rojos.

Observacin de algas8. Recoja agua de charcas, ri o de florero en un recipiente limpio con varios das de antelacin. En el laboratorio, tome una pequea gota del agua con la ayuda de un gotero, depostela en una lmina portaobjetos y colquele el cubreobjetos. 9. Inicie la observacin en el objetivo de 4x, y luego con los otros aumentos. Para la identificacin de gneros solicite las claves y lminas utilizadas para tal fin. Realice las figuras y anotaciones necesarias de cada gnero encontrado. En todos los casos recuerde seguir las normas generales de laboratorio, utilizando guantes de ltex en todo el transcurso de la prctica. Para la identificacin de los diferentes gneros de algas y protozoos se cuenta con manuales, claves, laminas. Solicite ayuda a los encargados de dirigir la prctica.CUESTIONARIO1. Al Identificar las diferentes partes de las clulas animales y vegetales observadas, notamos algunas diferencias. Explique2. En qu etapa de formacin del eritrocito desaparece el ncleo del mismo3. Mencione la hormona encargada de la produccin de glbulos rojos en la sangre y el lugar donde se produce.4. Escriba al menos una funcin de cada uno de los componentes celulares de la sangre.5. Qu funcin desempean los plstidos en los vegetales? Qu tipo de plstidos se conocen? Es posible identificar plstidos en clulas animales? Explique. 6. Se sabe que las grasas o triglicridos son las sustancias ms abundantes en la naturaleza. En qu rganos de las plantas y animales las podemos encontrar? Qu papel desempean y en qu proporcin estn en nuestro organismo?

PRCTICA No. 2CONTEO CELULAR DE GLBULOS BLANCOSOBJETIVOConocer y practicar el uso correcto de una cmara de Neubauer, para poder ejercitar los clculos necesarios para estimar el nmero celular de una suspensin celular, realizar y aplicar la metodologa para un recuento de Leucocitos por milmetro cbico de sangre e interpretar el resultadoINTRODUCCIN En Biologa Celular es comn el encontrarse con la necesidad de conocer el nmero de clulas que presentes en un volumen dado; por ejemplo, cuando se realizan cultivos celulares se precisa saber cuntas clulas se encuentran en un momento x (t1) con respecto al nmero de clulas que inicialmente se sembraron (t0). O bien, para saber cuntos espermatozoides hay en los eyaculados de diferentes pacientes. En tales casos se requiere de un instrumento que permita contar directamente, o bien, calcular la concentracin celular en un medio. Para resolver el problema de conteo celular, se ha optado, en algunos casos, por calibrar sistemas espectrofotomtricos, cuyo fundamento se finca en las propiedades de absorcin de la luz por parte de las clulas; sin embargo, tales sistemas son poco exactos y los resultados que se obtienen son difciles de repetir. Una alternativa a este problema es el contar directamente el nmero de clulas presentes en un volumen conocido; esto puede ser un trabajo agobiante si consideramos, por ejemplo, a las clulas procariontes, las cuales miden generalmente menos de 10 micras (>1X10-6 metros o 1X10-3 milmetros o bien 0.010 y por lo tanto se pueden encontrar muchsimas en un volumen muy pequeo. No obstante, se cuenta con la cmara de Neubauer, la cual es un instrumento muy til que permite contar clulas de distinto tamao. La cmara de Neubauer tiene la apariencia de un portaobjetos grueso, que en una cara tiene una placa muy delgada de metal, la cual se encuentra grabada con un par de cuadriculas muy finas y de medidas definidas. La cmara de Neubauer cuenta tambin con un par de muescas que permiten colocar la muestra a analizar en dos compartimientos. Por ltimo, la cmara de Neubauer se complementa con un cubreobjetos cuyo grosor es mayor, tambin, que el de los cubreobjetos convencionales. Ver la siguiente figura:

Entonces, la altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos se encuentra definida, as como el rea de la cuadricula en el portaobjetos; por lo tanto, es posible calcular el volumen contenido en cada compartimiento de la cmara de Neubauer. De esta manera, es posible conocer el volumen de muestra celular que se coloca en la cmara, ahora solo resta conocer el nmero de clulas presentes en ese volumen.Para el conteo de leucocitos, se usan mtodos sistemticos que son ms rpidos y precisos, y los mtodos manuales.Todo mtodo manual de recuento celular incluye 3 fases:Dilucin de la sangreMuestreo de la sangre diluida en un volumenRecuento de clulas en ese volumenPara el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas, que corresponden a los campos 1, 3,7 y 9.Para su dilucin, se hace lo mismo que para los hemates pero empleando la pipeta de blancos, de modo que la solucin que obtenemos es de 1/20. Se utiliza como diluyente el lquido de Turk. El lquido de Turk es hipotnico de modo que se destruyen los hemates y as no entorpecen en el recuento.El lquido de Turk consta de cido actico glaciar 2ml, violeta de genciana disolucin de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deber filtrarse a menudo para evitar levaduras y hongos.En un principio es un poco difcil distinguir los leucocitos de los restos de membranas de los hemates hemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son ms refringentes (ms brillantes) al moverlo con el microscopio que los restos de hemates. Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmtica y de la membrana nuclear (a veces ms) como lneas finas y brillantes. Esto se observa fcilmente moviendo el microscopio hacia delante y hacia atrs.MATERIAL Pipeta de Thoma para glbulos blancosBoquilla blanca

Tubo de gomaTubos de ensayo con anticoagulante

Papel parafilmCmara de Neubauer

CubrehematmetroMicroscopio

GasasAlcohol al 70%

Sangre venosaLquido de Turk

PROCEDIMIENTO1. Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica puncin venosa. La sangre es recogida en un tubo lila con EDTA2. Colocar el tubo de plstico y la boquilla para aspirar en la pipeta3. Llenar la pipeta de glbulos blancos con sangre hasta la marca 0.5 para realizar una dilucin de 1/20. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Si la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente4. Introducir la pipeta en el tubo o frasquito que contiene el diluyente (liquido de Turk) y absorber hasta la marca 11, no deben quedar burbujas.5. Se tapan ambos extremos de la pipeta con papel parafilm y se coloca en un rotador automtico o se hace rotar manualmente de 2-3 minutos6. Montar la laminilla de vidrio en la cmara para recuento. Debe estar limpia y seca.7. Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequea cerca de un extremo de la cmara para que por capilaridad se llene exactamente.8. Dejar 3 minutos que los leucocitos se sedimenten9. Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. y contar en los 4 cuadrados angulares.10. En el recuento se incluyen las clulas que cubren o tocan por dentro o por fuera las lneas limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeo de recuento y no se consideran los que estn en los lmites inferior y derecho.11. Los recuentos de leucocitos, al igual que los eritrocitos, se expresan como concentraciones, que en este caso seran nmero de clulas por unidad de volumen de sangre, que es 1mm3Despus de contar los glbulos blancos de los 4 cuadrados angulares, se suman el total de ellos y con dicha cantidad de hace el siguiente clculo:N de leucocitos x mm3= altura x dilucin x reaN de leucocitos x mm3= 1/10 x 1/20 x 4 = 1/10 000N de leucocitos x mm3= 4/200 = 1/50N de leucocitos x mm3= N de leucocitos contados x 50

CUESTIONARIO1. Esquematiza las partes que conforman a la cmara de Neubauer2. Bajo qu condiciones se puede utilizar dicha cmara?3. Qu utilidad biolgica tiene?4. Representa la distribucin celular observada por la cmara

PRCTICA No. 3PROPIEDADES DE LAS MEMBRANASOBJETIVOComprobar algunas propiedades de las membranas biolgicas como lo es la permeabilidad selectiva, el efecto que pueden tener algunos agentes qumicos sobre las mismas y conozca la importancia del entorno para mantener su integridad. INTRODUCCIN La vida como la conocemos hoy no existira si no existieran las membranas. Estas estructuras definen el lmite entre lo que se considera una clula y su entorno. En el caso de las clulas eucariotas, las membranas tambin definen las organelas internas. Las membranas tienen una funcin ms compleja que ser simples barreras delimitantes, son estructuras activas donde ocurren procesos metablicos como transporte de molculas, transduccin de seales, respiracin celular y generacin de potenciales elctricos entre otros. Es por esto que las membranas estn constituidas no solo de lpidos sino tambin de protenas y carbohidratos. La proporcin de cada una de estas macromolculas depender de la funcin de cada membrana en particular, la cual a su vez depende de la clula a la cual pertenece. Por ejemplo, la membrana plasmtica de un hepatocito de ratn est constituida proporcionalmente de 45% de protenas, 27 % de Fosfolpidos, 25 % de colesterol y 3% de otras macromolculas. La estructura de las membranas biolgicas aceptada hoy en da es aquella descrita en el modelo del mosaico fluido. En este modelo se establece que los Fosfolpidos forman una bicapa en la cual las regiones no polares de cada capa se encuentran hacia adentro de la misma y las regiones polares de cada capa se encuentran hacia afuera, en interaccin con el medio acuoso. Las protenas se encuentran embebidas en este mar de Fosfolpidos con interacciones generalmente de tipo no covalente. Las membranas son impermeables a la mayora de los solutos polares y permeables a los solutos no polares. En general, a mayor nmero de grupos polares (-OH, -O, -NH2) en una molcula polar, menor ser su permeabilidad a travs de una membrana. Por lo tanto, para el intercambio de la mayora de los solutos polares existen mecanismos controlados que pueden implicar inversin de energa. Otro factor que afecta la permeabilidad de una molcula es su tamao o peso molecular. A mayor peso, la molcula es menos permeable. Los eritrocitos son clulas sanguneas cuya funcin principal es transportar oxgeno a los tejidos. Esta funcin es llevada a cabo por la hemoglobina, una protena que contiene grupos heme, responsable del color rojo que presentan los eritrocitos. Durante el proceso de maduracin de estas clulas, la hemoglobina producida se disuelve en el citoplasma y alcanza concentraciones muy altas (cerca del 34% del peso del eritrocito); las organelas intracelulares como ncleo, retculo endoplsmico y mitocondria se pierden. Los eritrocitos son entonces vestigios de clulas, destinadas a sobrevivir, en el caso de los bovinos, por unos 120 das.De esta forma, midiendo los tiempos de hemlisis, se puede comparar la permeabilidad de una serie de molculas orgnicas. A su vez, la presencia de hemlisis al aadir diferentes agentes qumicos permitir evidenciar cmo la interaccin de los mismos con la membrana puede tener efectos irreversibles en su estructura. MATERIAL Cloruro de sodio 0.9%: Pesar 0.9 gramos de cloruro de sodio y llevar a 100 ml con agua destilada. Solucin saturada de jabn Cloroformo Etanol Solucin de eritrocitos lavados, no usar eritrocitos de oveja Pipeta de 10 ml y pipeta Pasteur

PROCEDIMIENTOPrecaucin: el da de hoy usted trabajar con muestras biolgicas. Una regla de oro preventiva es trabajar cualquier muestra biolgica como potencialmente infecciosa. El uso de guantes es recomendado. Si ocurre algn derrame, avise inmediatamente al instructor ms cercano. Lavado de eritrocitos:MaterialTubos de ensaye de 75 X 12 mmMuestra de sangreSolucin salina fisiolgicaTcnicaCentrifugar la muestra para separar el suero o plasma de los glbulos rojos. Pasar el suero o plasma a otro tubo limpio rotulado.Con una pipeta Pasteur, colocar 0.2 - 0.5ml de glbulos rojos en cada tubo.Completar con solucin salina hasta 1cm del borde.Centrifugar durante 1-2minutos para sedimentar las clulas.Extraer la solucin salina.Agitar el tubo para resuspender los glbulos rojos. Esta secuencia constituye el primer lavado.Repetir los pasos 3-6 por lo menos dos veces. En el ultimo lavado, la solucin salina debe ser clara, sin signos de hemolisis.Nota: Para que se pueda observar el fenmeno a estudiar es necesario no mezclar eritrocitos de distinto origen en un mismo tubo Actividad uno 1. A 10 ml de cloruro de sodio al 0.9% colocados en cada uno de 4 tubos de ensayo, aada 2 gotas de eritrocitos lavados. 2. Conserve uno de los tubos como control y a los otros 3 adales respectivamente, 2 gotas de una solucin saturada de jabn, cloroformo (agente irritante, manipular con cuidado) y alcohol etlico. 3. Agite repetidamente y deje la solucin en reposo durante 15 minutos.4. Observe los tubos y comprelos con el controlActividad dos MATERIALPipeta de 5ml con pipeta Pasteur Soluciones 0.3M de: urea, tiourea, glicerol, glucosa y sacarosa Solucin de eritrocitos lavados con cloruro de sodio al 0.9% Cloruro de sodio 0.9%: Pesar 0.9 gramos de cloruro de sodio y llevar a 100 ml con agua destilada. Cronmetro PROCEDIMIENTO1. Coloque 2 ml de la solucin 0.3 M a probar (urea, glucosa, etc) en un tubo de ensayo rotulado y adicione una gota de sangre mezclando inmediatamente. 2. Mida el tiempo de hemlisis. El tubo control del experimento de hemlisis causada por agentes qumicos es utilizado como control de no hemlisis. 3. Repita el procedimiento una vez ms para corroborar el tiempo de hemlisis

CUESTIONARIO 1. Elabore un cuadro con los resultados obtenidos de tiempo de hemlisis versus sustancia utilizada, ordenados de mayor tiempo de hemlisis a menor tiempo de hemlisis 2. Tomando en cuenta los resultados del cuadro elaborado y la estructura molecular de las sustancias utilizadas, explique si los datos obtenidos concuerdan o no con lo esperado tericamente.

Puede utilizar los siguientes datos como referencia: Cuadro 1. Permeabilidad relativa de algunas sustancias, segn el dimetro de la molcula.SustanciaDimetro (nm)Permeabilidad relativa

Agua0.3001

Urea0.3606X104

In cloruro hidratado0.3861X10-8

In potasio hidratado 0.396 6X10-11

Sodio 0.512 2X10-11

Glicerol 0.620 6X10-4

Glucosa 0.860 9X10-6

3. Describa el efecto en los eritrocitos con cada una de las soluciones saturadas usadas.4. Investigue con base en qu mecanismo cada una de las soluciones saturadas de jabn, cloroformo y alcohol etlico causan lisis de los eritrocitos. Hemlisis producida por efecto de la permeabilidad

PRCTICA No. 4FENMENOS DE TRANSPORTE EN LAS MEMBRANASOBJETIVOEstudiar algunos factores que afectan el funcionamiento de las membranas celulares.INTRODUCCINLas membranas celulares son barreras selectivas que separan las clulas y forman compartimientos intracelulares. Entre sus funciones estn:La membrana celular est formada por una capa doble de Fosfolpidos, protenas y carbohidratos. Cada Fosfolpido est compuesto por glicerol, cidos grasos y fosfato, que en conjunto crean una barrera hidrofbica entre los compartimientos acuosos de la clula. Las protenas permiten el paso de molculas hidroflicas a travs de la membrana, determinan las funciones especficas de sta e incluyen bombas, canales, receptores, molculas de adhesin, transductores de energa y enzimas. Las protenas perifricas estn asociadas con las superficies, mientras que las integrales estn incrustadas en la membrana y pueden atravesar completamente la capa doble. La funcin de los carbohidratos adheridos a las protenas (glicoprotenas) o a los Fosfolpidos (glicolpidos) es la de adhesin y comunicacin intercelular. El colesterol, que es un esteroide (lpido), determina la fluidez de la membrana.Para que la clula funcione eficientemente, debe mantenerse en la misma un ambiente estable conocido como homeostasis. Para mantener este equilibrio existen mecanismos para el transporte selectivo de materiales hacia el interior o exterior de la clula. Las membranas de la clula son selectivamente permeables, permitiendo el paso de algunas sustancias o partculas (molculas, tomos, o iones), e impidiendo el paso de otras. Esta selectividad se debe a la capa doble de Fosfolipidos de la membrana. La manera en que las molculas pasan por la membrana depende en parte de la polaridad de las mismas. Las molculas hidrofbicas, o no polares, pasan con relativa libertad a travs de la capa de lpidos, mientras que molculas hidroflicas, o polares, incluyendo el agua, y las molculas de mayor tamao, pasan a travs de canales formados por protenas transportadoras. La regulacin del transporte de las molculas, o la direccin en que se mueven depende de su gradiente de concentracin (diferencia en concentracin entre dos lugares).TRANSPORTE CELULAR: DIFUSIN Y OSMOSISPara que la clula funcione eficientemente, debe mantenerse en la misma un ambiente estable conocido como homeostasis. Para mantener este equilibrio existen mecanismos para el transporte selectivo de materiales hacia el interior o exterior de la clula. Las membranas de la clula son selectivamente permeables, permitiendo el paso de algunas sustancias o partculas (molculas, tomos, o iones), e impidiendo el paso de otras. Esta selectividad se debe a la capa doble de Fosfolpidos de la membrana. La manera en que las molculas pasan por la membrana depende en parte de la polaridad de las mismas. Las molculas hidrofbicas, o no polares, pasan con relativa libertad a travs de la capa de lpidos, mientras que molculas hidroflicas, o polares, incluyendo el agua, y las molculas de mayor tamao, pasan a travs de canales formados por protenas transportadoras. La regulacin del transporte de las molculas, o la direccin en que se mueven depende de su gradiente de concentracin (diferencia en concentracin entre dos lugares).Las molculas se mueven constantemente debido a su energa cintica y se esparcen uniformemente en el espacio disponible. Este movimiento, llamado movimiento browniano, es la fuerza motriz de la difusin.Difusin, se define como el movimiento natural de las partculas de un rea de mayor concentracin a un rea de menor concentracin hasta alcanzar un equilibrio dinmico, en el cual el movimiento neto de partculas es cero. La difusin no requiere gasto de energa por parte de la clula y por lo tanto es un movimiento pasivo. Cuando la clula transporta sustancias en contra de un gradiente de concentracin (de un rea de menor concentracin a un rea de mayor concentracin) se requiere energa (ATP) y sucede movimiento activo.El componente principal de la clula es el agua, que acta como solvente (el agente que disuelve) de solutos orgnicos e inorgnicos. El movimiento de agua a travs de una membrana selectivamente permeable se llama osmosis (difusin de agua) y sucede siempre del rea de mayor concentracin de agua (con menor concentracin de soluto) al rea de menor concentracin de agua (con mayor concentracin de soluto). El agua se mover entonces, a favor de un gradiente de concentracin hacia el rea de mayor concentracin de soluto (donde hay una menor concentracin de molculas de agua libres). Cuando la clula contiene una concentracin de solutos mayor que su ambiente externo, se dice que la clula est en una solucin hipotnica, y como consecuencia, el agua entra a la clula causando que se expanda. Si la concentracin de solutos es mayor fuera de la clula, se dice que la clula est en una solucin hipertnica; la clula pierde agua y se encoge. Si las concentraciones de soluto son iguales en ambos lados de la membrana, se dice que la clula est en una solucin isotnica, donde el movimiento neto es cero.Las clulas animales funcionan ptimamente en ambientes isotnicos. En las clulas vegetales, sin embargo, cuando la vacuola se llena de agua, sta ejerce presin contra la pared celular hasta llegar a un punto donde se impida que entre ms agua (presin de turgencia) y la clula se encuentra trgida (firme), lo cual es el estado ideal de estas clulas. Por otra parte, si la clula vegetal pierde agua, la clula sufre plasmlisis al separarse la membrana celular de la pared celular, lo cual suele ser letal para la clula.MATERIAL Agua destiladaGradilla

Bao de agua a 70CVasos de precipitado de 250 ml

Bao de agua a 37CBetabel

Hielo6-Tubos de ensayo

NeveraVaso con hielo

NavajaPinzas para tubo de ensayo

Plato para calentar u hornillaAguja de diseccin

Pipetas de 5 mlTermmetro

ReglaMarcador de cera

PROCEDIMIENTOA. Efecto de la temperaturaEn este ejercicio se usar la planta de remolacha (Beta vulgaris), cuyas clulas almacenan en la vacuola central el pigmento violeta betacianina.1. Corte seis pedazos de remolacha (15 mm de largo) con un sacabocado y colquelos en tubos de ensayo rotulados del 1 al 6.2. Aade 5 ml de agua al tubo 6 y colquelo en el congelador por 30 min.3. Aade 5 ml de agua al tubo 5 y colquelo en el bao de hielo por 30 min.4. Aade 5 ml de agua al tubo 1 y colquelo en un bao de agua caliente a 70 C durante 1 min. Despus de 20 min, remueva el pedazo de remolacha del tubo.5. Deje que la temperatura del bao baje a 55 C y haga lo mismo con el tubo 2.6. Repita el procedimiento de arriba con el tubo 3 a 37 C y con el tubo 4 a 20 C.7. Compare la intensidad de color de las soluciones en los tubos.8. Coloque los resultados (intensidad de color vs. temperatura) en la Tabla 7.1.Tabla 7.1 Efecto de temperaturaTuboTemperatura

Intensidad de color (1 = menos intenso; 6 = ms intenso)

170 C

255 C

337 C

420 C

5En bao de hielo

6En congelador

B. Efecto de solventesEn este ejercicio se observar cmo algunos solventes actan sobre las membranas. El instructor preparar este experimento.

MATERIAL Soluciones de acetona y metanol2 a 4 huevos de gallina10 ml de aceiteGradilla para tubos de ensayoUn betabel MTODO1. Rotule seis tubos de ensayo de 1 al 6.2. Aada 5 ml de las siguientes soluciones a los tubos de ensayo:Tubo 1: metanol 1 %Tubo 2: metanol 25 %Tubo 3: metanol 50 %Tubo 4: acetona 1 %Tubo 5: acetona 25 %Tubo 6: acetona 50 %3. Corte seis pedazos de remolacha de 15 mm y colquelos en los tubos de ensayo.4. Luego de 30 min, remueva la remolacha y observe la intensidad de color para cada solucin.5. Qu tubo mostr la mayor intensidad de color?6. Rotule seis tubos adicionales y aada lo siguiente a cada uno:Tubo A: 1 ml de agua + 1 ml de acetonaTubo B: 1 ml de agua + 1 ml de metanolTubo C: 1 ml de aceite + 1 ml de acetonaTubo D: 1 ml de aceite + 1 ml de metanolTubo E: Un poco de clara de huevo + 1 ml de metanolTubo F: Un poco de clara de huevo + 1 ml de acetonaCUESTIONARIO1. Qu tubo mostr ms intensidad de color?2. Qu indica la intensidad del color?3. Cmo afectan las temperaturas altas a las membranas celulares?4. Qu le pasa a las clulas en temperaturas bajas?5. En qu tubos se observaron reacciones?6. Basado en lo que se observ en los tubos de ensayos (refirindose a los tubos 1 - 6 y A - F), cmo afecta la acetona a la membrana?7. Cmo afecta el metanol a la membrana?8. Qu indican los resultados sobre los componentes de la membrana?C. Difusin de molculas en aguaEn este ejercicio, se estudiar el movimiento browniano de las molculas y el efecto de la temperatura sobre dicho movimiento.MATERIAL Dos vasos de precipitado de 200 mlAgua fraAgua a temperatura ambienteColorante vegetalPROCEDIMIENTO1. Aade agua a temperatura ambiente a un vaso y al otro vaso aada agua fra.2. Deje los vasos reposar por 10-15 min para que no haya movimiento del agua.3. Aada cuidadosamente una gota de colorante a cada envase y observe la dispersin de la gota.4. Afect la temperatura la difusin del tinte? Explica tu observacin.D. Difusin a travs de una membrana selectivamente permeable (dilisis)En este ejercicio se usar una membrana de dilisis que posee poros de un tamao determinado y que acta como una membrana selectivamente permeable.MATERIAL Un vaso de precipitado de 500 mlUna bolsa de dilisis y cordn o bandas de gomaRejilla y tubos de ensayo pequeosBao de mara y matraz pequeo con aguaPinzas de tubo de ensayoReactivo de BenedictSolucin de yodoCilindro graduadoSolucin de glucosa 30 % y solucin de almidn 1 %. Se usarn aproximadamente 25 ml de cada una por mesa (150 ml de cada solucin por laboratorio).PROCEDIMIENTO1. Corte la bolsa de dilisis a 25 cm de largo y pngala en agua por unos minutos para abrirla.2. Aada a la bolsa aproximadamente la mitad de la solucin de glucosa y la mitad de la solucin de almidn.3. Cierre la bolsa con un cordn o con una banda de goma, de forma que luego pueda abrirla4. Mezcle la solucin dentro de la bolsa y enjuague con agua la superficie externa de la bolsa; anote el color inicial de la solucin dentro de la bolsa.5. Aada varias gotas de la solucin de yodo a un vaso (beaker) con 300 ml de agua hasta obtener un color dorado.6. Coloque la bolsa de dilisis dentro del agua por 30 min

Saque la bolsa del agua y colquela en un vaso (beaker) vaco. Anote el color de la solucin dentro de la bolsa y comprela con la solucin en el primer vaso.8. Realice la prueba de Benedict para las dos soluciones contenidas en las bolsas.9. Cules son los resultados de este experimento para las pruebas de yodo y de Benedict?D. Osmosis en clulas animales y vegetalesEn los siguientes ejercicios se observar qu ocurre al poner clulas animales y vegetales en soluciones con concentraciones diferentes de solutos.MATERIALBotellas con soluciones de sacarosa (0.1, 0.3 y 0.6 M)Elodea frescaGradilla

Botella con sangreTubos de ensaye de 13 X 100

GoterosAgujas de diseccin

PortaobjetosMicroscopio compuesto

CubreobjetosLpiz de cera

Papel toallaPapel para lente

PROCEDIMIENTO1. Rotule tres tubos de ensayo: 0.1, 0.3 y 0.6 M.2. Aada soluciones de sacarosa de diferentes osmolaridades Tubo 1: 3 ml de solucin de sacarosa 0.1 MTubo 2: 3 ml de solucin de sacarosa 0.3 MTubo 3: 3 ml de solucin de sacarosa 0.6 M3. Aada 3 ml de sangre a cada tubo, y observe la apariencia de la mezcla.4. Rotule y prepare cuatro laminillas:Laminilla 1: Gota de sangre, coloque el cubreobjetos y observe los eritrocitos bajo el microscopio.Laminilla 2: Gota de la mezcla del tubo 1 (0.1 M), coloque el cubreobjetos, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1.Laminilla 3: Gota de la mezcla del tubo 2 (0.3 M), coloque el cubreobjetos, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1.Laminilla 4: Gota de la mezcla del tubo 3 (0.6 M), coloque el cubreobjetos, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1.5. Qu le pas a las clulas al entrar en contacto con cada una de las soluciones? Por qu?6. Cules de las soluciones usadas fueron hipotnicas, hipertnicas e isotnicas para los eritrocitos?7. En qu solucin sucedi hemlisis de los eritrocitos y por qu8. Por qu ocurri la crenacin?9. Qu indican los resultados acerca de la concentracin de solutos en el plasma sanguneo?D. 2. Clulas vegetalesPROCEDIMIENTO1. Rotule y prepare cuatro laminillas segn se indica a continuacin. Coloque un cubreobjetos y observe con el microscopio:Laminilla 1: Hoja de Elodea con una gota de agua de estanque.Laminilla 2: Gota de la solucin de sacarosa 0.1 M y una hoja de ElodeaLaminilla 3: Gota de la solucin de sacarosa 0.3 M y una hoja de ElodeaLaminilla 4: Gota de la solucin de sacarosa 0.6 M, una hoja de Elodea2. Qu le pas a las clulas al entrar en contacto con cada una de las soluciones?3. Cules de las soluciones fueron hipotnicas, hipertnicas e isotnicas con respecto a la clula?4. Por qu ocurri plasmlisis en una de las soluciones?5. Cul es la diferencia entre plasmlisis y crenacin?6. Por qu no ocurre lisis (rompimiento de la clula) en la clula vegetal?7. En qu tipo de solucin ocurri turgencia?

PRCTICA No. 5CLOROPLASTOS Y MITOCONDRIASOBJETIVO Identificar los cloroplastos y las mitocondrias en clulas vegetales.INTRODUCCINLos cloroplastos se caracterizan por la presencia de pigmentos, como la clorofila y los carotenoides. Por medio del proceso de la fotosntesis produce oxgeno y la mayor parte de la energa qumica que es utilizada para los organismos vivientes.Los cloroplastos se localizan principalmente en las hojas de las plantas superiores y en las algas. Estos organelos capturan la energa de la luz y la transforman en ATP y diversos alimentos. La forma de los cloroplastos vara, puede ser esfrica, ovoide, discoidea, de clava o vesiculosa. Estos organelos se encuentran dentro del citoplasma, especficamente agrupados cerca del ncleo.Las mitocondrias son organelos granulares o filamentosos que se encuentran en el citoplasma de las clulas.Aproximadamente el 90% de la energa de la clula se mantiene gracias a las reacciones qumicas que ocurren en las mitocondrias. Por ello se les llama: La central de energa de la clula. Una mitocondria est rodeada por dos membranas, la exterior es lisa y encierra al organelo y la interior se dobla en una serie de pliegues o dobleces. Estos pliegues llamados crestas mitocondriales son ms abundantes en las clulas con actividad metablica intensa y aqu es donde ocurren la mayor parte de las actividades respiratorias de la clula.

MATERIALMicroscopio pticoSol. Glucosa o dextrosa al 5%

BisturSol. De Janus Green 0.001%

PortaobjetosElodea

CubreobjetosApio

Toallas de papelPlanta de musgo o lama

Papel filtroGotero

PROCEDIMIENTO1. En un tallo de apio, corte una tira delgada de 1 cm de longitud, conteniendo dos venas del tallo de apio. 2. Coloque sobre un portaobjetos con la superficie hacia arriba y agrega solucin de glucosa al 5 %. 3. Utilice una navaja de bistur corta paralelamente entre las venas. De esta manera obtn un corte paralelo a las venas lo ms delgado posible. 4. Cubre con un cubreobjetos eliminando el exceso de lquido con una toalla de papel. Observa al microscopio utilizando un objetivo de 40X.5. Quite la preparacin del microscopio. Coloca un trozo de papel absorbente en la orilla del cubreobjetos de tal manera que se absorba la solucin que contiene su preparacin; en el extremo opuesto coloca unas gotas de Jannus Green al 0.001 % introducindose este colorante a la preparacin por debajo del cubreobjetos. 6. Elimine el exceso de lquido con un trozo de papel absorbente.7. Observe la preparacin al microscopio utilizando el objetivo de 40X, y con la ayuda de tu profesor observa con el objetivo de 100X. (las mitocondrias se tien de color azul, perdiendo el color minutos despus por la accin de la hidrogenasa).8. Corte dos hojas de Elodea, toma las hojas en tus manos por algunos minutos (para que tome una temperatura cercana a la del cuerpo).9. Coloque las hojas en el centro del portaobjetos una por el haz y otra por el envs y aade una gota de agua.10. Cubre con un cubreobjetos y elimina el exceso de lquido con papel absorbente. Observa al microscopio con el objetivo de 40X.11. Observe como se mueven los cloroplastos en el citoplasma girando alrededor del ncleo celular. Dibuja lo observado.

CUESTIONARIO.1. Qu son las mitocondrias y qu funcin realizan?2. En qu parte de la clula se localiza a las mitocondrias?3. Cmo se llama el pigmento verde que contienen los cloroplastos?4. Qu son los plstidos y cmo se clasifican?5. Cul es la funcin de los cloroplastos?6. Por qu razn a los vegetales verdes se les da el nombre de productores o seres auttrofos?.7. Escribe el nombre de las estructuras internas del cloroplasto.

PRCTICA No. 6ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LOS PEROXISOMASOBJETIVODemostrar in vitro la actividad enzimtica de los Peroxisomas en diferentes clulas. INTRODUCCINLos peroxisomas se denominan as porque generalmente contienen una o ms enzimas que utilizan oxgeno molecular para eliminar tomos de hidrgeno a partir de substratos orgnicos especficos a travs de una reaccin oxidativa que produce perxido de hidrgeno.Elperoxisomaes una organela celular que consta de una membrana, constituida por una doble capa lipdica que contiene diversasprotenas.En su interior se halla una matriz peroxisomal, que contiene protenas de funcin enzimtica.Los peroxisomas se halla en todos los tejidos, pero predomina en el hgado, en el rin y en el cerebro durante el perodo de formacin de lamielina.Los peroxisomas tienen mltiples funciones. Destacan las relacionadas con el metabolismolipdico.Entre ellas se hallan las reacciones de degradacin, como la-oxidacinde los cidos grasos de cadena muy larga(AGCML:de ms de 22 tomos de carbono) y delcido fitnicoy tambin reacciones de formacin de plasmalgenos(lpidoscomplejos localizados en la mielina),colesterolycidos biliares.La-oxidacinperoxisomalde los AGCML acorta la longitud de su cadena para que puedan seguir degradndose en el interior de lamitocondria.

MATERIAL

12 tubos de ensayoHgado de pollo

1 gradillaCorazn de pollo

1 estuche de diseccinRin de pollo

2 cajas de PetriRama de apio

5 vasos precipitados de 100mlPapa

1 pipeta de 10 mlHCl

1 MecheroAlcohol

1 Mortero con pistilo Hidrxido de sodio

Perxido de hidrgeno

PROCEDIMIENTO1. Corte 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de apio, colcalo en hielo.2. Corte 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de papa, colcalo en hielo.3. Corte 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de carne (hgado, rin y corazn), colcalo en hielo.4. Enumere los tubos del 1 al 6 y adiciona 2 ml de perxido de hidrgeno (PRECAUCIN) A cada tubo adiciona el tejido tal como se anota en la tabla5. En cada uno de los tubos se debe determinar la presencia o ausencia de 02, inmediatamente despus de adicionar el tejido tapa el tubo con el dedo pulgar y coloca en la boca del mismo tubo, un palillo en punto de ignicin (no acerques los tubos a tu cara o a la de tus compaeros)6. Repite los pasos 4 a 6 para los otros tejidos.

TUBOPapaAL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

1Machacado

2Cocido

3Con HCl

4Con Etanol

5Con NaOH

6Sin ninguna alteracin

TUBOApioAL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

1Machacado

2Cocido

3Con HCl

4Con Etanol

5Con NaOH

6Sin ninguna alteracin

TUBOHgadoAL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

1Machacado

2Cocido

3Con HCl

4Con Etanol

5Con NaOH

6Sin ninguna alteracin

TUBOCoraznAL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

1Machacado

2Cocido

3Con HCl

4Con Etanol

5Con NaOH

6Sin ninguna alteracin

TUBORinAL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

1Machacado

2Cocido

3Con HCl

4Con Etanol

5Con NaOH

6Sin ninguna alteracin

CUESTIONARIO1. Cul es la estructura y funcin de los peroxisomas?2. Qu es la enzima y como se relaciona con las peroxisomas?3. Cul es la funcin de los glioxisomas en la germinacin de las semillas de aceite de ricino?4. Cul son los efectos del etanol y cido clorhdrico sobre las enzimas?5. Al cocinar los alimentos demasiado Cmo influye en la actividad de las enzimas? en lista las enzimas presentes en el peroxisoma6. Anota las enzimas caractersticas de los glioxisomas, que no estn presentes en los peroxisomas?PRCTICA No. 7MITOSIS EN CLULAS VEGETALESOBJETIVO Observar clulas eucariotas de vegetales y animales e identificar la organizacin de genoma en interfase y mitosis.INTRODUCCINEl estudio de los cromosomas de clulas eucariotas con el microscopio ptico se hace preferencialmente en metafase, cuando estos tienen la morfologa y estructura definida.La observacin de la estructura del genoma en interfase, est fuera de la resolucin del microscopio ptico, sin embargo, en algunas clulas es posible observar el cromosoma X heterocromatizado que se identifica como un corpsculo, el cuerpo de Barr o cromatina sexual.La mitosis es el proceso celular por el cual las clulas somticas se dividen para originar nuevas clulas hijas, son las encargadas de provocar el crecimiento y desarrollo de un organismo, esto es, las clulas aumentan en nmero por divisin, como resultado de la mitosis. Los ncleos resultantes mantienen el mismo nmero e identidad de los cromosomas de la clula de la cual derivan.La mitosis es un proceso bajo control gentico, el cual ha sido dividido en cuatro fases: PROFASE, METAFASE, ANAFASE y TELOFASE. Teniendo cada una de estas sus etapas intermedias correspondiente. Adems de la etapa terminal de la divisin celular llamada CITOCINESIS Este proceso celular ocurre en todas las regiones meristemticas o puntos de crecimiento de una planta

MATERIAL

2 PortaobjetosRaices primarias de Allium cepa (cebolla)

2 cubreobjetosClulas de epitelio bucal

1 Vidrios de relojBarniz de ua transparente

1 Estuche de diseccin

1 Lmpara de alcoholHCl 1 N

1 MicroscopioAc. Actico 45%

1 pinzasOrceina actica

PROCEDIMIENTOPreparacin de los meristemos1. Cortar de 1-2 cm la parte terminal de las races y colocar en vidrio de reloj con orceina actica. Cuidar que los meristemos queden perfectamente cubiertos con el colorante.2. Calentar a la llama de la lmpara de alcohol, retirar al desprenderse vapores, enfriar y volver a calentar suavemente por 2-3 veces, cuide que la temperatura no ponga en ebullicin el colorante, ya que esto daa los meristemos.3. Enfre y transfiera cada una de las races a un portaobjeto, corte 2 mm despus del pice, aada una gota de orcena y coloque encima el porta, presione con la punta de un lpiz la zona donde se encuentra el meristemo y mediante golpes con la goma del lpiz, disprselo en monocapa, quite el exceso de colorante.4. Observe al microscopio a 40X.

Mtodo para la cromatina sexual-cuerpo de Barr1. En porta objetos perfectamente lavados y desengrasados (alcohol etlico-cido actico 45%, 3:1), coloque una muestra de epitelio bucal (enjuague varias veces la boca), tomando por raspado suave con un abatelenguas, haga frotis de hombre, etiqutelos.2. Hidrolice con HCl 1N por 30-60 segundos y absorba el cido actico por goteo, cubra con un portaobjetos y selle con barniz. Observa al microscopio a 100X

InformeMeristemos

Descripcin

Cromatina Sexual

Descripcin

CUESTIONARIO 1. Qu es el cariotipo? Explique cmo hara usted uno.2. Qu aplicacin dara usted a la observacin de las clulas meristemticas?3. Qu diferencia hay entre la mitosis de clulas animales y vegetales?4. Investiga cmo Barr y Bertram (1949), encontraron cromatina sexual.5. Investiga que dice la hiptesis de Mary Lyon, respecto a la heterocromatizacin del cromosoma X6. De acuerdo a la hiptesis de Lyon explica por qu en hombres con una formula cromosmica 46XY, no se observa la cromatina sexual o cuerpo de Barr.

Prctica No.8CARIOTIPOS EN RACES DE HABAObjetivoRealizar un cariotipo en una clula eucariota de un vegetal.IntroduccinEn 1931, Levintsky llam cariotipo al complemento cromosmico particular de un individuo grupo afn de individuos. Las caractersticas del cariotipo son constantes para las especies y pueden utilizarse, al igual que la morfologa externa, para su clasificacin taxonmica. Su anlisis comparativo nos permite inferir relaciones filogenticas entre los diferentes taxa. Definido tanto por el nmero como la forma de los cromosomas, es posible mediante el anlisis de estas caractersticas detectar la diversidad de mecanismos citolgicos surgidos en el curso de la evolucin de los seres vivos. Con base en el cariotipo es posible observar si existen nmeros anormales de cromosomas e identificar el sexo de los organismos. Los cariotipos se definen con respecto a las siguientes caractersticas: 1. Nmero de cromosomas 2. Tamao absoluto y relativo de cada cromosoma 3. Relacin de brazos cromosmicos 4. Posicin centromrica 5. Constricciones secundariasMaterial y reactivosMicroscopio compuestoHCL 1N

PortaobjetosAlcohol al 70%

Cubreobjetoscido actico al 45%

Aguja de diseccin (recta)Solucin de acetocarmin

Navajas de afeitar o bisturAceite de inmersin

Colorante FeulgenOrtho-Para diclorobenceno

Farmer (alcohol etlico absoluto: cido actico glacial proporcin 3:1)

Material biolgico: Semillas de haba germinadas de 10 das de edad o races recin cortadas de plantas jvenes. (Material preparado por el alumno).Procedimiento:1. Se deben seleccionar los pices radicales de las habas que presenten mejores condiciones, es decir que no tengan lesiones o manchas cafs. 2. Se ponen a pretratar en 8 Hidroxiquinoleina u Ortho-Para dicloro benceno durante 2 a 3 horas a 4 C. 3. Se colocan en fijador Farmer (Alcohol etlico absoluto: cido actico glacial en proporcin 3:1) durante 24 horas y se cambian a Alcohol 70% hasta su utilizacin. 4. Despus de la fijacin de las races se lleva a cabo una hidrlisis colocando las mismas en HCl 1N durante 16 min a 60C. 5. Inmediatamente se pasan al colorante Feulgen pera la tincin de los cromosomas por lo menos una hora. 6. Se realizan cortes muy finos del pice y se colocan estos cortes en un portaobjetos limpio y seco con gotas de Acetocarmn o acetorceina, las suficientes para cubrir totalmente los tejidos. Se calientan brevemente en la lmpara de alcohol evitando que llegue a ebullicin. 7. Posteriormente se coloca el cubreobjetos y se presiona con la goma de un lpiz cuidando de no romper el cubreobjetos, se puede presionar con el pulgar poniendo encima papel filtro o toalla sanita para quitar exceso de colorante.Nota: Tenga cuidado de no dejar deshidratar los tejidos, esto es, deber de agregar un reactivo enseguida del otro, teniendo un breve espacio para secarlo. 8. Despus se pueden adicionar gotas de cido actico al 45 %, colocando el cubreobjetos y observando al microscopio.InformeDeber ubicar distintos campos celulares, teniendo especial atencin en aquellas clulas que presenten los cromosomas bien separados.Cuestionario1. Por qu cree usted que se observan mejor los cromosomas en metafase 2. Mittica y no en otra fase celular? 3. Podra trabajar con semillas sin germinar para poder observar los cromosomas? 4. Explique por qu los cromosomas se pueden teir con acetorcena. 5. Describa al menos 4 cariotipos en plantas, colocando en una tabla comparativa el nmero de cromosomas, tamao, forma y posicin del centrmero.

BIBLIOGRAFIA1. Lehninger Albert. Bioqumica (Las bases moleculares de la estructura y funcin celular). Ediciones Omega. 1990.2. Laguna Jos. Bioqumica. Ediciones La Prensa Medica Mexicana. 1999.3. Caracterizacin de biomolculas. Mauricio D. Carbajal Tinoco. Premios Nbel en Ciencias 2002: Qumica4. Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K.Roberts y J.D. Watson Biologa Molecular de la Clula (1996) 3. Edicin (traducido de la 3. edicin inglesa, 1994). Ediciones Omega S.A., Barcelona. 5. Alberts, B., D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K.Roberts Y Peter Walter (1998) Essential Cell Biology, Garland Publishing, Inc. New York & London. 6. TERRS Speziale Arturo M; Clnica y Laboratorio: Ciencia y Tecnologa; 2 ed; ed. Graphimedic S.A. de C.V; Mxico 2002.7. PRESIDENCIA DE LA REPBLICA; CGEA, Gua tcnica para la elaboracin de manuales de procedimientos; Coleccin guas tcnicas, serie organizacin y mtodos nm. 9.8. ANDERSON, Shauna C, Susan Cockayne; Qumica Clnica; 1 ed; trad. Ma. Teresa Aguilar; ed. Interamericana-McGraw-Hill; Mxico, 1995.9. KAPLAN, A. Lawrence, Amadeo J. Pesce; Qumica Clnica Teora, anlisis y correlacin; 3 ed; trad. Tania Carren Valencia; ed. Javier Ortega Cesea; Mxico 1996LINKOGRAFIA 1. Mxico, Secretara de Salud, Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos, Diario Oficial de la federacin, ao 2000. Internet: http://www.salud.gob.mx/2. El gerenciamiento del laboratorio de anlisis clnicos con la visin de la calidad total. Internet: http://www.sarda.org.ar/Revista%20sard%c3%A1/2002/28-33.pdf

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