Estabilidade e mudanas estruturais da peroxidase de rbano silvestre: microondas versus tratamento trmico convencionalABSTRACTOs efeitos de aquecimento convencional (CH) e microondas (MW) na estrutura e atividade da peroxidase de rbano silvestre (HPR) em soluo tampo foram estudados. Incubao em CH em temperaturas entre 30 e 45oC aumentou a atividade da HPR, atingindo 170% de atividade residual (RA) aps 4-6h a 45oC. O tratamento com CH a 50 e 60 oC causou a inativao da HPR: a RA foi de 5.7 e 16.7% depois de 12h, respectivamente. Mudanas estruturais secundrias e tercirias da HPR foram analisadas por dicrosmo celular (CD) e emisso de fluorescncia intrnseca, respectivamente. Quando usado CH, a ativao da enzima foi atribuda a mudanas conformacionais nas estruturas secundrias e tercirias. O tratamento por MW teve efeitos significantes na atividade residual da HPR. O tratamento por MW a 45oC/30W seguido por tratamento por CH a 45oC regenerou a atividade enzimtica. A maior perda de atividade ocorreu a 60oC/60W/30min (RA de 16.9%); sem recuperao da atividade original. A inativao da HRP tratada por MW foi relacionada perda da estrutura terciria, o que indica mudanas em todo o ambiente do triptofano.INTRODUOPeroxidases (POD) so hemeprotenas envolvidas na oxidao de uma ampla gama de substratos orgnicos e inorgnicos tendo H2O2 ou peroxidases orgnicas como oxidantes terminais. Essas enzimas foram encontradas em mltiplas isoformas em diversas frutas e vegetais. As peroxidases so enzimas bem caracterizadas e inmeros estudos tm analisado a isoforma proveniente de razes de rbano silvestre (Armoracia rusticana). A peroxidase de rbano silvestre (HRP EC 1.11.1.7) possui diversas aplicaes como no ensaio de enzima acoplada em sntese orgnica, em ensaios de quimiluminescncia, imunoensaios e tratamento de guas residuais e biorremediao. No entanto, sua aplicao industrial em sntese orgnica, como no caso da maioria das enzimas, tem sido limitada devido a sua baixa termoestabilidade e baixa atividade em solventes orgnicos, meio ideal para a solubilizao de substratos hidrofbicos. Nesse sentido, alguns estudos tm surgido na literatura relacionados utilizao de meios alternativos para biocatlise, tal como: fluidos supercrticos (SCF), lquidos inicos (IL), e o uso de irradiao de microondas.Por outro lado, as peroxidases so, em geral, no utilizadas na indstria alimentcia devido ao escurecimento de frutas e vegetais. Esse o principal problema na indstria alimentcia e considerado como um dos principais motivos de perda de qualidade durante o manuseio e o processo ps-colheita. Isso se deve a rpida degradao de antocianinas causada por PPO (polifenol oxidases) e POD, produzindo subprodutos escuros. Pesquisadores tem reportado que o aumento da atividade de POD aumenta o escurecimento enzimtico durante o armazenamento. Portanto, em alimentos, a extenso da inativao de POD um dos principais indicadores de qualidade. Desde que a reao de escurecimentos enzimtico dos produtos geralmente resulta em perda de qualidade do alimento, a preveno ou inibio do escurecimento enzimtico tem se tornado uma importante ferramenta para melhorar a qualidade dos alimentos durante seu processamento.Recentemente, com o objetivo de manter as caractersticas originais dos alimentos e reduzir os custos de produo, mtodos alternativos ao tratamento trmico convencional tm sido investigados como potenciais tecnologias para inativar a POD vegetal, tal como impulsos de campo eltrico, ultrassom, dixido de carbono supercrtico (SCCO2), pr-tratamento por radiao UV e irradiao de microondas.A irradiao de microondas (MW) oferece um mtodo limpo, barato, e conveniente de aquecimento, o que uma maneira alternativa de fornecer energia para sistemas qumicos. Os efeitos de microondas em reaes qumicas so relacionados ao atrito molecular de curto alcance devido polarizao contnua de molculas causada pela irradiao de microondas. Esse processo de dipolos ordenados (com campo eletromagntico) e desordenados (sem o campo) aumenta o atrito entre as molculas, aumentando a temperatura local e as taxas de reao. O aquecimento de lquidos usando microondas pode ser explicado pela interao da matria com o campo eletromagntico da radiao incidente, causando movimento de ons assim como de dipolos induzidos ou permanentes. O movimento dessas espcies causa gerao de calor (o chamado aquecimento dieltrico) por dois mecanismos: rotao de dipolo, que se relaciona com o alinhamento de molculas que possuem dipolos permanentes ou induzidos com o componente de campo eltrico da radiao, e conduo inica, que se refere migrao de ons dissolvidos com o campo eletromagntico oscilante. Alm do rpido aquecimento dos materiais, alguns autores consideram que as microondas podem gerar efeitos especficos (no apenas trmicos) geralmente conectados com a absoro seletiva de energia de microondas por molculas polares. De acordo com esse conceito, a irradiao de microondas resulta numa mudana das propriedades termodinmicas dos sistemas reativos. Um exemplo desse efeito seria a reduo na energia de ativao livre de Gibbs das reaes devido ao armazenamento de energia de microondas como energia de vibrao de uma molcula ou grupo funcional (efeito de entalpia), ou pelo alinhamento das molculas (efeito de entropia). Alm disso, acredita-se que as microondas favorecem a eficincia das colises moleculares devido orientao de molculas polares envolvidas na reao. Essas propriedades fazem da irradiao de microondas uma importante ferramenta para aplicao em processos enzimticos, incluindo inativao de peroxidases. um fato conhecido que durante o aquecimento dieltrico, a radiao penetra no material para que ocorra transferncia de calor a partir do centro do material para a superfcie. Este tipo de transferncia causa aquecimento do material e um rpido aumento da sua temperatura. Uma caracterstica notvel do aquecimento dieltrico a sua seletividade para certos tipos de materiais, especialmente para aqueles com caractersticas polares e constante dieltrica elevada (um parmetro que indica a capacidade de armazenar energia electromagntica), como solues aquosas de glicose ou outros acares e compostos inicos, por exemplo. No caso particular de misturas, o aquecimento preferencial de certos componentes pode resultar na formao de pontos quentes no interior da amostra, isto , regies em que a temperatura est bem acima da temperatura mdia de amostras. Em relao aos efeitos de MW na estabilidade da POD, alguns trabalhos foram desenvolvidos com foco na inativao da enzima. Por outro lado, h uma falta de informao acerca de alteraes conformacionais da enzima provocadas por irradiao de MW.A peroxidase de rbano (HRP) uma tpica e amplamente estudada representante de heme peroxidases classe III, e a sua estrutura e propriedades bioqumicas tem sido bem caracterizadas. A isoenzima C de HRP uma glicoprotena monomrica com um peso molecular de ~44 kDa. Esta protena contm um grupo heme prosttico enterrado na regio central da protena. Alm disso, esta enzima contm quatro pontes de dissulfeto e liga dois ons Ca2 +, proximal e distal ao grupo heme, que no participam diretamente nas reaes catalisadas, mas desempenham um papel importante na manuteno da estrutura da protena, garantindo, assim, a atividade enzimtica da HRP.O principal elemento da estrutura secundaria dessa enzima a -hlice. Estudos cristalogrficos mostraram que 44% dos resduos de aminocidos esto arranjados em 12 -hlices e 2% em -folhas. A isoenzima HRP C contm um nico triptofano (Trp117), permitindo a investigao de mudanas conformacionais por tcnicas de fluorescncia. A emisso de fluorescncia intrnseca do triptofano extremamente sensvel a alteraes no seu microambiente. A intensidade de emisso est relacionada com a conformao da protena, que pode expor ou enterrar os resduos internos de triptofano. Em HRP como em outras enzimas contendo heme, devido transferncia de energia intramolecular do triptofano-heme, a emisso de fluorescncia intrnseca dos resduos de triptofano extinta. Alteraes conformacionais e desnaturao aumentam a distncia entre o resduo de triptofano e o grupo heme. Como resultado, o efeito de esfriamento heme da emisso do triptofano enfraquecida e a intensidade de fluorescncia aumenta.Assim, as alteraes na estrutura da cavidade heme que afetam a distncia / orientao entre o heme e o triptofano podem afetar a fluorescncia intrnseca da HRP. Alm disso, a variao do microambiente em torno do resduo Trp (Trp117) pode alterar o mximo de emisso de fluorescncia do triptofano. A fluorescncia intrnseca da HRP grandemente dependente da transferncia de energia de fluorescncia do triptofano para heme. A radiao UV-CD longa (190-250 nm) e o espectro de emisso de fluorescncia do triptofano fornecem informaes sobre a estrutura secundria e terciria da protena.O presente trabalho focado na investigao dos efeitos de MW e aquecimento convencional sobre a estrutura e atividade da HRP. Para isso, a HRP foi selecionada como uma enzima modelo e a influncia das MW e dos tratamentos convencionais na atividade residual da enzima e na conformao da enzima foram investigada usando tcnicas de UV-CD de ondas longas e espectroscopia de fluorescncia.PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS2.1 QumicosA isoenzima C HPR foi comprada da Sigma (RZ=3.0). Os substratos guaiacol e perxido de hidrognio 30% foram obtidos da Reagen e Vetec, respectivamente.2.2 Preparao da soluo de HPRA soluo de HPR foi preparada dissolvendo 15,9mg do p em 25mL de tampo fosfato Na2HPO4.2H2O-100mM pH 6,0 (0,636 mg p/mL). A concentrao de HRP para os experimentos com MW e aquecimento convencional foram de 15.9 M, considerando uma massa molecular de 44kDa. As analises microscpicas foram feitas com 5.3 M.2.3 Medida de atividadeA atividade enzimtica da peroxidase foi determinada por um mtodo colorimtrico, com base na alterao da absorbncia a 470 nm devido formao de tetraguaiacol (produto da oxidao do guaiacol). O meio de ensaio da peroxidase continha tampo fosfato 100 mM (pH 6,0); preparao de enzima, guaiacol 100 mM, e H2O2 2,0 mM, a 25 C. Uma unidade de enzima [U] foi definida como a quantidade de enzima suficiente para produzir 1 mol de produto em 1 min. As atividades foram expressas em U/mL. A reao foi monitorada por um espectrofotmetro de UV-vis (L-180, Hitachi, Tquio, Japo). As experincias de controle (brancos) foram sempre realizadas utilizando o mesmo procedimento, mas na ausncia de peroxidase.A atividade residual (RA) da HPR foi obtida atravs da seguinte expresso, onde CH e MW representam aquecimento convencional e por microondas, respectivamente.RA(%)= [atividade da HRP depois do tratamento (CH ou MW) / atividade da HPR antes do tratamento (CH ou MW)] * 1002.4 Equipamentos e procedimento de aquecimento convencional (CH)A soluo de HRP (255,6 1,3 U / mL) (3,0 mL) foi colocada num tubo hermeticamente selado e imersa num banho termosttico (Nova Tecnica, Piracicaba, Brasil). O tempo de aquecimento foi medido depois de a temperatura da soluo atingir o desejado (30, 40, 45, 50 e 60 C).Este intervalo de temperatura foi escolhido para favorecer a atividade mxima da enzima, tendo em vista, por exemplo, a sua utilizao em sntese orgnica. Alm de inativao da enzima com mxima eficincia em temperaturas mais baixas, interessante para a indstria de alimentos. Aps a incubao, em tempos estabelecidos, amostras de 0,4 ml foram recolhidas e, em seguida, 0,1 mL foi utilizado para a determinao da atividade da enzima e o volume restante foi diludo trs vezes para anlise de fluorescncia e CD. A atividade da HRP tratada com CH (45 e 60 C, por 15 e 30 min) foi monitorada aps 6, 12, 24 e 72 h de armazenamento a 30 C.2.5 Equipamentos e procedimento de microondas (MW)Todos os experimentos usando MW foram realizados em escala unitria de um modelo de reator de microondas Discover SP (CEM Corporation, Matthews, Estados Unidos), capaz de fornecer 300W de potncia contnua de microondas. O reator de microondas consiste numa cmara interna cilndrica de 25 mm de dimetro e 100 mm de altura. O design cilndrico assegura irradiao uniforme ao longo de todo o volume de trabalho. O reator foi operado em modo de ciclo de energia (PC), onde o poder de irradiao, o intervalo de arrefecimento, e o nmero de ciclos so definidos para valores desejveis. O sistema modula a irradiao por ligar e desligar a energia (no limite de temperatura inferior e superior) durante um nmero predefinido de ciclos.O reator foi operado com temperatura controlada (45 e 60 C). A soluo HRP (2,0 ml) foi exposta a ciclos de irradiao de MW de 30 e 60 W durante 15 e 30 minutos de tratamento. Um sensor infravermelho localizado no fundo da cmara monitorava a temperatura da reao. A temperatura foi controlada com ar comprimido soprado para dentro da cmara. Este ar de refrigerao foi concebido para operar em diferentes nveis de presso e, ou em modo de fluxo contnuo ou intermitente.A atividade da HRP tratada com MW foi monitorada aps 6, 12, 24 e 72 horas a 30 C. As amostras tratadas a 45 C / 30W por 15 e 30 min foram submetidos a tratamento CH a 45 C e alquotas foram coletadas nos mesmos horrios da HRP tratada apenas com CH a 45 C. Todos os experimentos (CH MW) foram conduzidos, pelo menos, em duas repeties autnticas.2.6 Anlise de dicrosmo circular da HRPEspectros de CD foram registrados em um espectropolarmetro Chirascan (Fotofisica Aplicada, Surrey, Reino Unido), com um cadinho de quartzo de 1,00 mm de comprimento temperatura ambiente (25 C). Os espectros CD foram verificados na faixa UV longa (260-190 nm), com trs repeties a 50 nm / min, largura de banda = 0,2 nm. Todos os espectros de CD medidos tiveram sua linha de base corrigida com o respectivo espectro do tampo. Os dados de elipticidade bruta () em mili graus (mdeg) a 222 nm foram expressos em termos de elipticidade bruta residual (%), considerando-se a elipticidade bruta da HRP no tratada como 100% de estrutura secundria.2.7 Anlise de espectroscopia de fluorescncia da HPROs espectros de fluorescncia do triptofano foram medidos com um espectrofluormetro modelo FP-6300 (Jasco Corporation, Tquio, Japo), utilizando um cuvete de quartzo de 1,00 cm de comprimento ptico a temperatura ambiente (25 C). Todas as amostras foram observadas aps o tratamento. Os espectros de emisso (em de 290 a 400 nm) foram obtidos no mximo comprimento de onda de excitao ex = 280 nm e representam o valor mdio de trs verificaes.3. RESULTADOS E DISCUSSO3.1 Aquecimento convencional3.1.1 Atividade residualA estabilidade trmica de HRP foi investigada at 48 h. A atividade foi medidas aps a incubao de amostras a temperaturas variando de 30 a 60C. Como mostra a Fig. 1A e B, a atividade da HRP altamente dependente da temperatura, exceto para 40C. Houve uma perda significante de atividade enzimtica quando a temperatura foi aumentada acima de 45C. Por outro lado, em temperaturas de 30 a 45C, a enzima mostrou atividade residual superior a 100% em todos os tempos de incubao investigados.A 30C com 4 e 8 h de incubao, houve um ligeiro aumento na atividade da enzima (RA: 107,5%). Houve uma tendncia de aumento da RA a esta temperatura chegando a RA de 135% aps 48 h de incubao (Fig. 1). A mesma tendncia geral foi observada a 40C, mas com um aumento menos pronunciado, e a RA alcanou valores de at 115% aps 48 h de incubao. Em tempos de incubao de 4-6 h a 45C foi observado um aumento acentuado na atividade RA (RA em torno de 170% aps 4-6 h). Aps 8 h, houve uma diminuio na RA, que tende a estabilizar em torno de 135-140 %. A 50C, analogamente a 45C, tambm houve ativao da enzima, mas em tempos de processamento mais curtos. Para esta temperatura, aps a ativao inicial (0,5-6 h), foi observada uma reduo contnua na atividade residual. A 60C, a HRP foi inativada (perda sbita da atividade a partir de 0,5h) a partir do incio do armazenamento. A RA para os tempos de 2, 8 e 12h foram de 95, 63 e 17%, respectivamente.Outros autores tambm mostraram ativao de peroxidase vegetal depois de tratamento trmico. Ciou et al. estudou o efeito do calor sobre a atividade da POD do pericarpo de castanhas de gua (Trapa Taiwanen-sis Nakai). A atividade da POD, originalmente de 38 unidades / g de amostra, aumentou levemente em amostras do pericarpo que foram aquecidas de 30 a 40C por 10-60 min. Alm disso, a atividade da POD aumentou rapidamente quando as amostras foram tratadas a 50-60C por 10-60 min. A maior atividade da POD foi a 60C, com 30 min de tratamento trmico. A POD neste vegetal foi quase completamente inativada quando a temperatura foi aumentada para 100C em 10 min.As tendncias observadas na Fig. 1 podem estar relacionadas com relao entre a alterao na energia livre (G) envolvida no desdobramento da protena e a temperatura. Normalmente as protenas exibem um valor mximo de G a 37C; a esta temperatura, as foras que mantm a protena no seu estado nativo, N, so mais intensas. A temperatura na qual U (estado desdobrado) e N esto em equilbrio (G = 0) chamada de ponto de fuso (Tm) e a temperaturas mais altas do que este valor, o processo de desnaturao espontneo (G 0). Uma vez que este aumento na entropia vibracional (S> 0) associado com as perdas de calor envolvidas na quebra das ligaes do estado nativo, pode-se ressaltar que um aumento da entalpia compensado por um aumento de entropia, que a base para a compensao de entalpia-entropia verificada para a desnaturao trmica de protenas, sugerindo que a desnaturao pelo calor controlada principalmente por foras entrpicas.Os resultados sugerem que entre 30 e 45C as interaes no estado nativo so maximizadas, mantendo nos mesmos valores os ngulos de toro e das cadeias de polipeptdeos e baixa entropia, explicando a auto ativao da enzima. A 50 e 60C h uma diminuio no G de desdobramento devido, principalmente, ao fator entrpico, tornando-se negativo e espontneo, o que poderia explicar a inativao da enzima a estas temperaturas.3.1.2 Anlise de CDComo mostrado na Fig. 2A (aps 12 h de tratamento CH), o espectro de CD de UV-longa da HRP no tratada e nativa tem bandas caractersticas de estrutura de -hlice, a 208 e 222 nm, de acordo com a literatura. As intensidades dos dois picos negativos nos espectros de CD da HRP diminuram com o aumento da temperatura sob CH, como mostrado na Fig. 2A, indicando perda parcial do contedo de -hlice da HRP. Este resultado mostra que o CH provoca alteraes conformacionais na enzima, mas h ainda estrutura secundria residual mesmo aps incubao a 60C.A Fig. 2B mostra o teor relativo de -hlice (a 222 nm) da HRP antes e aps o processamento trmico para todas as temperaturas (valores superiores a 98% no foram mencionados). Os teores relativos de -hlice aps CH a 30 e 40C em 48 horas foram de 85,4 e 81,4%, respectivamente. A 45C, perda da estrutura secundria ocorre mais rapidamente com perda de 22% da estrutura secundria com apenas 4 horas de incubao. Como ocorreu a 30 e 40C, a diminuio do contedo de -hlice foi acompanhada por uma forte ativao da enzima (RA 174,7%). Assim, as alteraes conformacionais observados a 30-45C pode promover a ativao da enzima. Ressalte-se que temperaturas entre 30 e 45C podem modificar a estrutura secundria da HRP promovendo um melhor acesso do substrato a regio do centro ativo, ajudando a ativao da enzima.A 50C aps 2 horas, a elipticidade residual foi de 76,9% (perda de 23% da estrutura secundria) e a atividade da enzima aumentou 23%%. A elipticidade residual diminui continuamente ao longo do tempo. A 50C, pode ser sugerido que quando a perda da estrutura secundria da HRP excede ~ 30% a enzima inativada. A 60C a enzima mostrou apenas perfil de inativao a partir de 0,5 h. Em contraste com outras temperaturas, a 60C a perda da estrutura secundria na gama de 24-30% foi relacionada com a desativao da enzima.Os resultados sugerem que as alteraes na estrutura secundria da HRP ocorrem em stios especficos da enzima dependendo da temperatura qual se encontra exposta. Pequenas alteraes na estrutura secundria da enzima a baixas temperaturas (30-45C) tm efeito de ativao, enquanto a temperaturas mais elevadas (principalmente a 60C) o efeito sobre a enzima deletrio sobre a sua atividade.A desnaturao trmica da HRP tambm foi estudada por Chattopadhyay e Mazumdar por anlises detalhadas de CD e fluorescncia. A temperatura foi elevada de 20 para 95C em passos de 2C com um tempo de equilbrio de 2 minutos a cada temperatura. Os autores propuseram a via de desdobramento envolvendo dois estados intermedirios. O estado nativo da HRPc (N), em desnaturao trmica, vai para o estado desdobrado final atravs de pelo menos dois estados intermedirios, U e U. O estado intermedirio U tem estrutura secundria quase intacta da HRPc nativa, mas com uma diferena na estrutura terciria devido mudana na cavidade heme. A mudana de elipticidade da HRPc a 222 nm indicou uma fuso de dois estados da estrutura secundria da enzima com um valor Tm aparente (o ponto mdio da transio) de 74C. Foi mostrado que a HRP, mesmo a 93C, no perde a sua estrutura secundria completa. Os resultados indicaram que uma segunda fase de fuso da coluna vertebral da HRPc possivelmente ocorre a uma temperatura mais elevada do que 93C e a estrutura secundria residual a esta temperatura pode surgir devido estabilizao atravs de ligaes dissulfeto inter-helicoidais na enzima. Considerando-se o perodo de incubao de 12 h (tempo em que foi possvel encontrar diferenas significativas no teor de estrutura secundria da enzima), o Tm encontrado foi de 45C (Fig. 2C). Esta temperatura pode ser justificada porque sabido que o grau de modificaes estruturais em protenas fortemente dependente da temperatura e do tempo, tendo em conta o tempo de exposio de 12 h e o intervalo de temperatura do presente trabalho (30-60C), portanto os resultados obtido foram consistentes com a literatura.3.1.3 Anlise de fluorescnciaAs alteraes ambientais nas cadeias laterais aromticas como resultado de alteraes conformacionais em protenas podem ser analisadas por espectroscopia de fluorescncia intrnseca. As alteraes na emisso de fluorescncia podem estar relacionadas a alteraes estruturais na protena: uma diminuio da emisso de fluorescncia pode ocorrer como uma consequncia da proximidade de supressores, tais como dissulfeto e ligaes de hidrognio, e os centros metlicos ativos das enzimas (por exemplo, grupo heme).Alm disso, o deslocamento da emisso mxima do triptofano tambm indicativo de alteraes na sua proximidade resultante de alteraes estruturais da HRP. Uma diminuio na polaridade do microambiente na vizinhana do resduo de triptofano (reduzida exposio ao solvente do resduo Trp, por exemplo, por agregao ou empacotamento molecular) induz um deslocamento para o azul da emisso mxima (desvio do mximo de emisso para comprimentos de onda mais curtos). Em contraste, um aumento da polaridade do microambiente na vizinhana do resduo de triptofano (exposio do triptofano ao ambiente aquoso, por exemplo, devido ao desdobramento da protena) produz um desvio para o vermelho do seu valor mximo de emisso (para maiores comprimentos de onda).A Fig. 3A representa os espectros de emisso de fluorescncia da HRP no comprimento de onda de excitao de 280 nm depois de aquecimento convencional (30-60C) com 12 h de incubao. O espectro de fluorescncia adquirido para a HRP no tratada caracterizado por um pico nico, em em (max) ~327 nm, o que sugere que o Trp117 protegido a partir do solvente. A intensidade de emisso de fluorescncia da HRP foi baixa, provavelmente porque a fluorescncia do triptofano foi extinta devido transferncia de energia intramolecular Trp-heme na HRP nativa.O comprimento de onda de emisso mximo, em (max), da HRP tratada foi 313 nm; este amplo leque de desvio azul foi de aproximadamente 14 nm, o que indica que o ambiente do triptofano foi alterado para um ambiente menos polar atravs de tratamento trmico. Este desvio para o azul pode ser causado por uma diminuio na constante dieltrica do meio ambiente prximo ao Trp117, para a HRP processada. Como mostrado na Fig. 3A, a intensidade de fluorescncia aumentou com a temperatura de exposio (entre 30 e 45C). Os resultados indicam que a incubao da HRP entre 30 e 45C promove uma mudana na localizao do stio ativo da enzima para regies mais apolares conduzindo a uma conformao na qual o stio ativo mais protegido, o que explica a ativao da enzima a estas temperaturas.Alm disso, os dados de intensidade de emisso de fluorescncia normalizada (em comparao com a rea do espectro de emisso da HRP no tratada) so mostrados na Fig. 3 e indicam que entre 30 e 45C a intensidade de fluorescncia aumentou com o tempo de exposio. A partir de todos os valores de temperatura empregues, intensidades de fluorescncia mais baixas foram encontrados em 60C. Essa diminuio na intensidade de fluorescncia sugere que foras de estabilizao que mantm a estrutura terciria foram comprometidas ou mesmo ocorreu a perda de resduo de triptofano prximo ao grupo heme, indicando desnaturao e perda de atividade da enzima, o que corrobora com o perfil de inativao da enzima em 60C. Em outras palavras, a 60C, o stio ativo (regio heme) gradualmente "removido" da estrutura da enzima conduzindo perda da estrutura terciria da HRP. A diminuio da intensidade de fluorescncia tambm pode ser correlacionada com o processo de agregao de protenas. Alm disso, os ons de clcio so importantes tanto para a atividade quanto para a manuteno da estrutura proteica em torno da regio heme; estudos tm demonstrado que a perda de clcio corresponde perda de heme e que a perda de heme leva a perda de atividade. A 50C, a emisso de fluorescncia mxima foi observada aps 2 h, precisamente ao mesmo tempo em que foi observada a ativao da enzima mais elevada (RA 123,2%); aps este perodo de incubao a emisso de fluorescncia diminuiu gradualmente.Os resultados apresentados indicam que a 45C a ativao da enzima ocorre como resultado de alteraes conformacionais na sua estrutura terciria, enquanto que a regio do stio ativo de maior proteo mas acessvel ao substrato por meio de alteraes na sua estrutura secundria, que se torna menos comprimida . Em contraste, a 60C, estruturas secundrias e tercirias foram alteradas bruscamente por disrupo de importantes interaes que mantm a protena ativa; assim, o reconhecimento do substrato pelo stio ativo da enzima j no era possvel.Os resultados aqui obtidos indicam que as reaes de sntese sob CH catalisada por HRP devem ser conduzidas em torno de 45C, preservando a estabilidade trmica da enzima. No entanto, se o objetivo principal a desativao da enzima, as reaes devem ser realizadas a temperaturas acima de 60C. Com base nos resultados obtidos, as temperaturas de 45 e 60C foram escolhidas para avaliar o efeito de MW sobre a estrutura e a atividade da HRP.3.2 Estabilidade de HRP em microondas3.2.1 Atividade residualOs efeitos da potncia de irradiao (30 e 60 W) e do tempo (15 e 30 min) sobre a atividade da HRP a temperaturas de 45 e 60C sob MW foram avaliados e comparados com CH nas mesmas condies (15 e 30 min). As atividades foram medidas aps o tratamento com MW e CH aps 6, 12, 24 e 72 h de armazenamento a 30C. Os resultados so mostrados na Fig. 4A-D.A utilizao de MW a 45C por 15 minutos resultou numa reduo de -60% na atividade da HRP a 30 e 60 W. Aps 30 min de tratamento, a HRP exibiu 55 e 37% de RA com 30 e 60 W de energia, respectivamente. A enzima tratada a 45C por 15 e 30 min sob CH apresentou maior atividade, na ordem de 46% (RA 146%). A seguir, a atividade da HRP a 30C aps tratamento a 45C mostrou que a atividade no foi alterada significativamente aps 72 h (141% de RA). Notavelmente, em contraste com os resultados obtidos no CH a 45C (ativao da enzima), o tratamento de MW a 45C causou diminuio da atividade da HRP. A 45C, aps tratamento de MW, a enzima mostrou uma tentativa de reativao aps 6 e 24 horas, mas aps estes tempos, h uma tendncia para a perda de atividade, e esta perda foi mais pronunciada na enzima tratada com 60 W.A fim de confirmar o efeito de ativao visto em 45C (CH), amostras tratadas com MW a 45C / 30 W durante 15 e 30 minutos (cerca de 55% de RA) foram ainda submetidas a CH a 45C (Fig. 4E). Os dados mostram que, aps 1 h a 45C, a atividade da HRP foi restabelecida atingindo uma RA de 96 e 89% para os tratamentos durante 15 e 30 min, respectivamente. Aps 48 h, a RA foi de aproximadamente 100%.Muitos exemplos na literatura relatam o restabelecimento da atividade de POD de vegetais com tratamento CH para valores de atividade prximos do valor original. A capacidade da POD de reativar depois de ser desnaturadas por calor varia com as condies de tratamento e com as espcies de vegetais, e pode diferir entre as isoenzimas da mesma espcie. As condies de tratamento, a fonte de enzima, e tipo da isoenzima desempenham um papel na determinao do grau de inativao reversvel. Uma reativao de 16% de sua atividade original foi observada em extrato de espargos verdes, e no repolho aps incubao de 2,5 h de incubao a 30C seguida de aquecimento a 75C. Thongsook e Barret estudaram a inativao e reativao trmica de POD de brcolis. Os autores relataram que a reativao ocorreu rapidamente, dentro de 10 min aps a enzima aquecida (durante 0,5-5 min / 75C) ser arrefecida e incubada temperatura ambiente. A extenso da reativao variou de 0 a 50%, dependendo das condies de aquecimento (temperatura e tempo). Neste mesmo estudo, os autores mostram que a HRP pode regenerar 20% da sua atividade a temperatura ambiente mesmo aps tratamento trmico a 100C sob CH. Gui et al. estudou a inativao de HRP por SCCO2 a 55C sob presso (80-300 bar). Tratamento de SCCO2 teve efeitos significativos sobre a atividade residual da HRP; a atividade residual foi de apenas 12% a 300 bar. Depois de uma armazenagem de 7 dias a 4C, observou-se a restaurao da atividade residual e a reverso do teor relativo de -hlice, enquanto a intensidade de fluorescncia relativa retomada com exceo para o tratamento a 300 bar. Inativao ultrassnica de POD de tomate foi realizada por ultrassons a 15-75% de energia ultrassnica por 20-150 s. Observou-se que, conforme a energia ultrassnica aumentava, ocorria o aumento da taxa de inativao. Inativao completa da POD foi observada usando 50% de potncia por 150 s e na potncia de 75% por 90 s de tratamento ultrassnico. Os autores tambm observaram regenerao de atividade da POD. Observou-se que em 15 e 25% da potencia ultrassnica, a RA aumentou linearmente, ao passo que em potncias de 40, 50 e 75%, a RA teve um aumento no linear.Assim, a 60C, o efeito da potncia de irradiao foi observado aos 15 e 30 min. Em ambos os perodos de incubao, a enzima apresentou maior inativao com 60 W de potncia chegando a uma RA de 16,9% na condio de 60C / 60 W / 30 min. A HRP tratada com MW a 60C apresentou atividade reduzida mesmo aps 6-72 h, indicando que a inativao por MW a 60C irreversvel.Os resultados sugerem que as reaes de sntese sob irradiao de microondas catalisadas por HRP no so recomendadas. O tratamento CH a 60C por 15 e 30 minutos no alterou significativamente a atividade da peroxidase (RA perto de 100%), no entanto, houve uma perda gradual da atividade em ambas as condies, atingindo 90 e 80% de RA aps 72 h de tratamento a 60C por 15 e 30 min, respectivamente. Os resultados mostram a ineficcia do CH a 60C para inativar a enzima com tempos de processamento curtos. Em contraste, MW mostrou-se eficiente para a inativao da enzima (com foco na conservao de alimentos). A atividade residual aps 8 h de incubao a 60C foi de 62,6%, enquanto a RA foi de apenas 16,9% aps tratamento de MW a 60C / 60 W / 30 min. Os resultados corroboram o trabalho anterior: alguns estudos tratam da inativao de peroxidases vegetais com MW, mas so evasivos no que diz respeito aos efeitos das MW na estrutura das enzimas. POD de gua de coco foi inativada com tratamento de MW a 90C e POD de beterraba vermelha foi inativada, 90% de reduo de atividade foi alcanada a apenas 200 W / 5 min. O efeito do pr-tratamento com MW na cintica de inativao da peroxidase foi tambm estudado por Zheng e Lu em gua de branqueamento de espargos verdes; eles mostraram que MW pode ser utilizado como um pr-tratamento eficaz para acelerar a inativao da peroxidase. Soysal e Soylemez determinaram a atividade da peroxidase de cenoura sob CH e MW sem controle de temperatura (70-700 W, por 15 s-12 min), em todos os experimentos a HRP foi desativada.Em especial, a HRP apresenta nove potenciais locais de N-glicosilao que podem ser reconhecidos na sequncia primria a partir da sequencia Asn-X-Ser/Thr (onde "X" representa um resduo de aminocido) e destes, oito so glicosilados. Um heptassacardeo ramificado contribui com 75-80% dos glicanos, mas o perfil de carboidratos da HRP C heterogneo, e muitos glicanos menores tambm foram caracterizados. Esses, invariavelmente, contm dois GlcNAc terminais e vrios resduos de manose. Outra complicao a variao do tipo de glicano presente em qualquer um dos locais de glicosilao. O teor total de carboidratos da HRP C um pouco dependente da fonte da enzima e valores entre 18 e 22% so tpicos. Foi presumido no presente trabalho que MW envolvia absoro direta de energia pelos grupos funcionais que suportam condutividade inica ou efeito de rotao de dipolo, no caso da HRP, as regies glicosiladas da enzima podem ser um bom material de absoro da radiao de microondas. O seu dipolo pode rapidamente reorientar sob MW, destruindo a estrutura tridimensional da enzima, mais severamente em comparao com CH.3.2.2 Anlise de CDA Fig. 5 mostra os resultados no que diz respeito anlise de CD aps os tratamentos de MW e CH. A Fig. 5B mostra os espectros de CD da HRP de controle (nativa) e tratada com MW a temperaturas de 45 e 60C (B1 e B2, respectivamente). Tratamentos CH a 45 e 60C, por 15 e 30 min resultaram em contedo secundrio em torno de 81,5 1,63% sem inativao da HRP. A Fig. 5A mostra nenhuma diferena significante no contedo de estrutura secundria aps tratamento a 45C durante 15 minutos com 60 e 30 W em comparao com a HRP no tratada. Aps 30 min, a perda da estrutura secundria ocorre em aproximadamente 10% com 30 e 60 W. Os resultados sugerem que a perda de atividade a 45C (MW) pode no ser devido a alteraes conformacionais no nvel da estrutura secundria da enzima.O tratamento a 60C provoca perda de 5,6% da estrutura secundria aps 15 min / 30 W, em outras condies estudadas o contedo de -hlice foi perdido na ordem de 20%. Em contraste com o que foi observado a 45C, a 60C a estrutura da enzima tornou-se menos compacta e, como ocorreu a 60C sob CH, houve reduo da atividade da enzima. Os resultados sugerem que o tratamento a 60C sob MW induziu mudanas de conformao no teor de -hlice em regies semelhantes da protena quando tratadas sob CH a 60C.Alguns estudos de inativao de HRP mostram que a perda de atividade da HRP est diretamente relacionada com a perda da estrutura secundria. O tratamento de peroxidase de rbano por campo eltrico pulsado (PEF) mostrou que o teor relativo de -hlice diminuiu em 35% e ~60% depois do PFE e aquecimento a 100C durante 5 min, respectivamente. O tratamento com HRP combinado com dixido de carbono supercrtico (SCCO2) a 55C / 1 h, resultou em valores de RA prximos queles observados com o tratamento de presso no SCCO2. As estruturas secundrias e tercirias da HRP aps o tratamento com SCCO2 foram alteradas tal como sugerido por anlise de CD e anlise de espectroscopia de fluorescncia, respectivamente. O contedo relativo de -hlice na HRP diminuiu e a intensidade relativa de fluorescncia intrnseca (IRF) aumentou medida que a presso era elevada. A inativao da HRP tratada com SCCO2 correspondeu estreitamente perda do teor de -hlice e ao aumento da intensidade de emisso de fluorescncia.3.2.3 Anlise de fluorescnciaA Fig. 6 mostra os espectros de emisso de fluorescncia obtidos para solues de HRP antes e depois do processamento por MW (15 a 30 min). O mximo comprimento de onda de emisso, em (max), da HRP tratada com MW foi observado a 324 nm; muito prximos ao em (max) da enzima nativa (327 nm), indicando que no houve mudanas significativas na polaridade do ambiente que rodeia o stio ativo da enzima.O tratamento CH a 45C / 30 min leva a IRF de 5,4, enquanto a 60C, atinge-se IRF de cerca de 1,2 aps 15 minutos. A 60C (CH) a inativao da enzima era evidente e os menores valores de intensidade de fluorescncia foram observados (Fig. 3). A comparao entre a rea do espectro de emisso de fluorescncia da HRP no tratada e da HRP tratada para todas as condies estudadas de MW revelam que as intensidades de fluorescncia foram inferiores as obtidas anteriormente (Fig. 6).Sabe-se que o aumento da temperatura por aquecimento convencional promove mudanas na estrutura secundria e terciria da enzima. Dependendo da extenso e localizao destas alteraes na enzima, a estrutura secundria pode no ser comprimida, o que melhora o acesso ao stio ativo pelo substrato e tambm pode promover a migrao do stio ativo para regies mais apolares, protegendo-o, o que aumenta atividade da enzima. A 45C sob CH, a HRP foi ativada por esses eventos. A 60C / CH, os danos estrutura terciria da enzima levaram a sua inativao. Em contraste, o tratamento com MW a 45C conduz diminuio da estrutura terciria da HRP e inativao da enzima. Em outras palavras, o tratamento com MW promove a perda instantnea da estrutura terciria. O stio ativo (regio heme) instantaneamente "removido" da estrutura da enzima, levando perda das estruturas tercirias e tridimensionais da HRP.A 45C, as mudanas na estrutura terciria so pouco influenciadas pelo tempo de irradiao e pela potencia. A 60C os valores de intensidade foram ligeiramente superiores aos obtidos a 45C e aumentados (1,2-1,6) na seguinte sequncia: 30 W/15 min-60 W/15 min-30 W/30 min-60 W/30 min, indicando que a 60C maiores potncias e tempos de irradiao promovem alteraes mais drsticas na estrutura tridimensional da enzima. O dano na estrutura terciria causado pelo tratamento de MW sugere que este mtodo uma estratgia excelente para inativar enzimas indesejveis na indstria alimentcia. Alm disso, os dados sugerem que MW no constitui um meio de reao ideal para a realizao de reaes catalisadas por peroxidases, mesmo a baixas temperaturas.4. CONCLUSESNeste estudo, o tratamento com MW teve efeitos significativos sobre a atividade residual da HRP, e quanto maior a temperatura e irradiao de energia no tratamento, maior foi a perda de atividade da HRP, sendo que a menor atividade residual da HRP foi de apenas 16,9% a 60C/60 W/30 min. Os resultados indicam que os tratamentos CH e MW induziram diferentes alteraes estruturais na HRP. A inativao/ativao da enzima sob CH regulada por alteraes na estrutura secundria e terciria da enzima, enquanto sob MW, a inativao da HRP regulada principalmente por alteraes na estrutura terciria.