leveduras

IDENTIFICAÇÃO E ESTUDO DAS IDENTIFICAÇÃO E ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS CARACTERÍSTICAS

FISIOLÓGICAS DE FISIOLÓGICAS DE Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae

PRESENTES EM FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA PRESENTES EM FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA DE DE

CANA-DE -AÇÚCARCANA-DE -AÇÚCAR

Orientado: Alexandre Tourino MendonçaOrientado: Alexandre Tourino Mendonça

Orientador: Rosane Freitas SchwanOrientador: Rosane Freitas Schwan

IntroduçãoIntrodução Histórico: Histórico:

produção de bebidas através de produção de bebidas através de fermentação alcoólica remonta fermentação alcoólica remonta milhares de anos (Aquarone et al. milhares de anos (Aquarone et al. 1986).1986).

prática em decorrência da pedra prática em decorrência da pedra filosofal (Maia et al, 1993).filosofal (Maia et al, 1993).

Brasil no início da colonização; Brasil no início da colonização; difundida a partir de 1945 difundida a partir de 1945 (INDI,1882)(INDI,1882)

Produção : Produção :

Brasileira - 1,2 bilhões (Martin, Brasileira - 1,2 bilhões (Martin, 1997).1997).

Minas gerais - 120 milhões de Minas gerais - 120 milhões de litros litros (Martin,1997). (Martin,1997).

Visão geral Visão geral P Programa Mineiro de Incentivo à rograma Mineiro de Incentivo à produção produção

OBJETIVOS:OBJETIVOS:

Isolar e identificar, as leveduras por Isolar e identificar, as leveduras por

métodos tradicionais e moleculares.métodos tradicionais e moleculares.

Selecionar as que apresentarem Selecionar as que apresentarem melhores características melhores características fermentativasfermentativas.

Processo fermentativo : Processo fermentativo :

Substrato:Substrato:

•• caldo de cana-de-açúcar caldo de cana-de-açúcar

•• 78 a 86% sacarose78 a 86% sacarose

•• 10 a 20% de açúcares redutores10 a 20% de açúcares redutores

•• 0,3 e 0,5% de cinzas0,3 e 0,5% de cinzas

•• compostos nitrogenados 0,5 a 1,0%compostos nitrogenados 0,5 a 1,0%

•• pH 5,2 a 6,8 (Lima, 1975)pH 5,2 a 6,8 (Lima, 1975)

Inóculo:Inóculo:

•• Fermento caipira Fermento caipira fubá, farelo de fubá, farelo de

arroz, suco de limão ou laranja azeda arroz, suco de limão ou laranja azeda

(Neder, 1957).(Neder, 1957).

•• Milho e arroz de boa qualidade, pH do Milho e arroz de boa qualidade, pH do

pé-de- cuba 4,0 a 3,5 (Silva, 1995).pé-de- cuba 4,0 a 3,5 (Silva, 1995).

•• principal desvantagem desuniformidade principal desvantagem desuniformidade

leveduras não selecionadas. leveduras não selecionadas.

SISTEMA DE FERMENTAÇÃO:SISTEMA DE FERMENTAÇÃO:

•• Batelada simples (Aquarone et. al., 1986; Batelada simples (Aquarone et. al., 1986;

Oliveira,1993).Oliveira,1993).

•• Batelada alimentada (Maia et al., 1995)Batelada alimentada (Maia et al., 1995)

• • Processo contínuo (Silva, 1995 ; Alves, 1994)Processo contínuo (Silva, 1995 ; Alves, 1994)

Levedura:Levedura:

•• Local: folhas, frutos, grãos de cereais, Local: folhas, frutos, grãos de cereais,

etc. etc. (Kurtzman and Fell, 1998).(Kurtzman and Fell, 1998).

•• Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae + +

utilizada em utilizada em fermentações industriais (Kurtzman fermentações industriais (Kurtzman and and

Fell, 1998)Fell, 1998)

IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS:IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS:

• • Classificação Classificação fisiológicos e fisiológicos e morfológicos morfológicos (Kurtzman e Phaff, 1987; Barnett et al., (Kurtzman e Phaff, 1987; Barnett et al., 1990; 1990; Kurtzman and Fell, 1998).Kurtzman and Fell, 1998).

•• Kits de identificação : Api System, Any Kits de identificação : Api System, Any Analbalab Products Anc., Nunclon Delta Analbalab Products Anc., Nunclon Delta S1 S1 pouca abrangência (Fleet e Mian, 1987 ; pouca abrangência (Fleet e Mian, 1987 ; Augustyn, 1991).Augustyn, 1991).

•• Identificação molecular (%G+C) (Nakase Identificação molecular (%G+C) (Nakase e e Komagata, 1970), PCR - ”polimerase Komagata, 1970), PCR - ”polimerase chain chain reaction” (Thangavelu and Wheals, reaction” (Thangavelu and Wheals, 1999). 1999).

PRODUTOS ORIUNDOS DA FERMENTAÇÃO:PRODUTOS ORIUNDOS DA FERMENTAÇÃO:

1 -1 - Etanol: produzido em maior quantidade. Etanol: produzido em maior quantidade.

•• utilizado para fabricação de combustível e utilizado para fabricação de combustível e

bebidas.bebidas.

- - principais bebidas produzidas por principais bebidas produzidas por fermentação fermentação são:são:

-- fermentadas: cerveja, vinho, cidra; fermentadas: cerveja, vinho, cidra;

- - destilada: aguardente, rum, uísque, destilada: aguardente, rum, uísque,

“ “saque” (Walker, 1998). saque” (Walker, 1998).

Tabela de bebidas alcoólicas:Tabela de bebidas alcoólicas:

Bebida Cerveja Uísque Vinho Destiladas

Matéria Prima cevada +(arroz e milho)

Cevada(malte),

cevada, trigo

Uva Cevada, milho,melaço, uva,soro de leite,

etc.

Pré-tratamento

Fermentação domalte

fermentação esmagamentomaceração

variáveldependendo do

substrato

Fermentação S.cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiaeflora natural

S. cerevisiae eK. marxianus(soro de leite)

Reciclagem delevedura

Sim Não Não Não

Destilação Não Sim Não Sim

Maturação Pouca longa (anos) longa (anos) Sim

Álcool final %(v/v)

3 – 6 40 – 45 8 – 12 35 – 56

Adaptado de Walker, 1998.

• • Etanol pode ser usado como fonte de Etanol pode ser usado como fonte de

carbono (Red e Peppeler, 1973).carbono (Red e Peppeler, 1973).

•• Crescimento aeróbico em etanol é baixo Crescimento aeróbico em etanol é baixo

(Strathern et al., 1982).(Strathern et al., 1982).

2 -2 - Glicerol, ácido succínico, ácido Glicerol, ácido succínico, ácido

acético.acético.

• • Glicerol e ácido succínico produtos Glicerol e ácido succínico produtos secundários produzidos em maior secundários produzidos em maior quantidade (Jennings, 1984)quantidade (Jennings, 1984)

•• Composto importante para o Composto importante para o

“flavour” de “flavour” de bebidas alcoólicas (Omori, 1976)bebidas alcoólicas (Omori, 1976)

•• Metabólito osmoregulador (Jovall et Metabólito osmoregulador (Jovall et

al., al.,

1990; Tokuoka, 1993).1990; Tokuoka, 1993).

•• Ácido succínico 60% da produção primeira Ácido succínico 60% da produção primeira

hora de hora de

fermentação (Basso et al., 1996)fermentação (Basso et al., 1996)

•• produzido produzido leveduras (Alves, 1994) leveduras (Alves, 1994)

•• isolando-se o pH isolando-se o pH ácido succínico ácido succínico ação ação

sinergística com etanol sinergística com etanol efeito efeito antimicrobiano antimicrobiano

(Basso et al., 1994). (Basso et al., 1994).

•• ácido acético ácido acético contaminação bacteriana contaminação bacteriana

(Whiting, (Whiting,

1976) 1976)

Identificação de Identificação de Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae cerevisiae por técnicas tradicionais e por técnicas tradicionais e

moleculares.moleculares.

• • Introdução:Introdução:

- - Diferenciação entre leveduras Diferenciação entre leveduras

Saccharomyces e não-Saccharomyces e não-Saccharomyces Saccharomyces

(Martin, 1997).(Martin, 1997).

- - Técnicas empregadas; Kits de Técnicas empregadas; Kits de

identificação, identificação, testes bioquímicos e testes bioquímicos e

fisiológicos, técnicas fisiológicos, técnicas moleculares entre moleculares entre

outras.outras.

• • Objetivo:Objetivo:

-- Identificar leveduras Identificar leveduras Saccharomyces Saccharomyces ee

nãonão-- Saccharomyces , Saccharomyces , isoladas a partir da isoladas a partir da

fermentação alcoólica para a produção de fermentação alcoólica para a produção de

aguardente, por métodos tradicionais aguardente, por métodos tradicionais

(teste bioquímicos e morfológicos) e pela (teste bioquímicos e morfológicos) e pela

técnica de PCR.técnica de PCR.

Material e Métodos:Material e Métodos:

•• Amostragem: 10 alambiques no Sul de Amostragem: 10 alambiques no Sul de

Minas Gerais.Minas Gerais.

• • Processamento da amostra: WL (Difco); Processamento da amostra: WL (Difco); YW YW

pH 3,5 e CCL.pH 3,5 e CCL.

•• Isolamento e purificação.Isolamento e purificação.

•• Identificação:Identificação:

Método tradicional de identificação:Método tradicional de identificação:

Fermentação de carboidratos:Fermentação de carboidratos:

Assimilação de compostos de Assimilação de compostos de

carbono e nitrogênio. carbono e nitrogênio.

Osmotolerância a 10%.Osmotolerância a 10%.

Resistência à cicloheximida.Resistência à cicloheximida.

Crescimento a 35 e 37Crescimento a 35 e 37C.C.

Microcultivo.Microcultivo.

Técnica de PCR (Reação em cadeia da Técnica de PCR (Reação em cadeia da

polimerase):polimerase):

PCR- três fases:PCR- três fases:

- - Desnaturação Desnaturação 94 94C por 5 minutos;C por 5 minutos;

- - Anelamento Anelamento 61 61C por 30 segundos;C por 30 segundos;

-- Extensão Extensão 72 72C por 5 minutos.C por 5 minutos.

Amostra + Solução EnzimáticaAmostra + Solução Enzimática

25ºC/30’25ºC/30’

Master MixMaster Mix

Taq Taq dNTP dNTP Tampão Tampão Primer Primer ÁguaÁgua

Master Mix + AmostraMaster Mix + Amostra

Cuba de eletroforeseCuba de eletroforese50 min a 150 V50 min a 150 V

TermocicladorTermociclador

Análise por PCR das levedurasAnálise por PCR das leveduras

- Presença de bandas indica linhagens de - Presença de bandas indica linhagens de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae

- Ausência de bandas - não - - Ausência de bandas - não - SaccharomycesSaccharomyces

DNA DNA amplificadoamplificado

DNA não DNA não amplificadoamplificado

Local de Local de aplicação da aplicação da amostra de amostra de DNADNA

Amostras de DNA + Amostras de DNA + tampão de corridatampão de corrida

Local onde Local onde não houve não houve amplificação amplificação de DNAde DNA

Local onde houve Local onde houve a amplificação do a amplificação do DNADNA

DNA + tampãoDNA + tampão

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Análise das amostras:

• produtores que fazem diluição do caldo e

suplementam o caldo com ingredientes (Fubá

), tem melhores rendimentos.

• fermentações que apresentaram

predominância da espécie Saccharomyces

cerevisiae não tiveram problemas de

fermentação.

Parâmetros físicos-químicos do Parâmetros físicos-químicos do mosto de cana-de-açúcar.mosto de cana-de-açúcar.

Alambique Temperatura (ºC) pHetanol (%)

Ar mosto1 24 28 3,50 6.22 25 30 3,70 6.53 25 29 3,80 7.04 27 30 3,00 4.05 27 25 3,90 5.06 25 32 3,20 4.87 22 30 4,10 3.58 25 31 3,20 6.09 27 32 3,18 7.010 25 30 4,00 6.1

População leveduriforme encontradaPopulação leveduriforme encontradaem 10 alambiques no Sul de Minas Geraisem 10 alambiques no Sul de Minas Gerais

LevedurasAlambique (UFC/ml x 107) Espécies (números de isolados)

1 2,2 S.cerevisiae (29), não –Saccharomyces (7)

2 40 S.cerevisiae (27), não –Sccharomyces (9)

3 40 S.cerevisiae (30), não –Saccharomyces (7)








Identificação do gênero Identificação do gênero SaccharomycesSaccharomyces : :

• • Técnica tradicional:Técnica tradicional:

- Dos 387 isolados 132 foram - Dos 387 isolados 132 foram identificados como identificados como

S. cerevisiae.S. cerevisiae.

• • Técnica molecular PCR:Técnica molecular PCR:

- Dos 387 isolados 158 foram - Dos 387 isolados 158 foram identificados como identificados como

S. cerevisiae.S. cerevisiae.

Caracterização bioquímica e Caracterização bioquímica e molecular de molecular de Saccharomyces Saccharomyces

cerevisiaecerevisiaeFermentam:Fermentam:Glicose, sacarose e frutose.Glicose, sacarose e frutose.

Assimilam:Assimilam: Galactose, trealose, D-xylose, Galactose, trealose, D-xylose, D-manitol, Sacarose, Lactose, L- D-manitol, Sacarose, Lactose, L-arabinose, Ác. Succinico, Maltose, arabinose, Ác. Succinico, Maltose, Rafinose, D-ribose, Ác. Cítrico .Rafinose, D-ribose, Ác. Cítrico .

Não assimilaram:Não assimilaram: nitratos de potássio, nitratos de potássio,

eritritol e M-inositol e celobiose.eritritol e M-inositol e celobiose.

Não apresentaram crescimento:Não apresentaram crescimento: meio sem meio sem

vitamina , 100 e 1000ppm de vitamina , 100 e 1000ppm de

cicloheximida, não formaram película cicloheximida, não formaram película

quando crescida a 35 e 37quando crescida a 35 e 37C, não C, não

apresentaram resposta positiva ao teste apresentaram resposta positiva ao teste

de osmotolerâcia com 10% de NaClde osmotolerâcia com 10% de NaCl ..

Comparação entre o método tradicional e a Comparação entre o método tradicional e a

técnica técnica

de PCR:de PCR:

Técnica tradicional pode levar a erros de Técnica tradicional pode levar a erros de

leitura que serão detectados pelo PCR já que leitura que serão detectados pelo PCR já que

esta técnica é mais sensível.esta técnica é mais sensível.

CONCLUSÕES:CONCLUSÕES:

•• Considerando rapidez e sensibilidade, a Considerando rapidez e sensibilidade, a

técnica PCR pode ser utilizada para a técnica PCR pode ser utilizada para a

identificação de leveduras contaminantes. identificação de leveduras contaminantes.

•• Da mesma forma pode ser possível Da mesma forma pode ser possível

acompanhar durante a safra a permanência acompanhar durante a safra a permanência

ou não do fermento empregado inicialmente.ou não do fermento empregado inicialmente.

•• Limitação da técnica de PCR - dependente Limitação da técnica de PCR - dependente do conhecimento do genoma do do conhecimento do genoma do microrganismo em estudomicrorganismo em estudo.

Estudo fisiológico das leveduras Estudo fisiológico das leveduras fermentativas.fermentativas.

• • IntroduçãoIntrodução

- - Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae - principal agente - principal agente biológico para conversão de açúcar a etanol.biológico para conversão de açúcar a etanol.

- - Capacidade de produção da toxina “Killer”Capacidade de produção da toxina “Killer”

-- Microrganismo com alta capacidade de Microrganismo com alta capacidade de produção produção alcoólica.alcoólica.

• • Objetivo:Objetivo:

- - Selecionar o isolado de Selecionar o isolado de Saccharomyces Saccharomyces

cerevisiaecerevisiae de melhor adaptação e de melhor adaptação e

produção alcoólica, para ser aplicado produção alcoólica, para ser aplicado

para a ppara a produçãorodução de aguardente. de aguardente.

• • Material e Métodos:Material e Métodos:

-- Microrganismos Microrganismos

* * 158 isolados identificados como 158 isolados identificados como Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae . .

-- ”Screening” da capacidade fermentativa: ”Screening” da capacidade fermentativa:

* * tubos de ensaio com tubos de Durham tubos de ensaio com tubos de Durham

invertidos invertidos meio basal + carboidrato meio basal + carboidrato (Glicose,(Glicose,

sacarose e frutose).sacarose e frutose).

- - Fermentação em ErlenmeyerFermentação em Erlenmeyer

** 50 isolados de 50 isolados de Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae , que apresentaram produção de , que apresentaram produção de COCO2 2 em menor tempo. em menor tempo.

** frascos com meio de cultura MF, frascos com meio de cultura MF, esterilizados e inoculados, com cultura com 24 esterilizados e inoculados, com cultura com 24 horas de crescimento.horas de crescimento.

** inóculo padronizado para inóculo padronizado para ABS ABS 600mm.600mm.

** amostras retiradas com: 2, 8, 12, 24 e amostras retiradas com: 2, 8, 12, 24 e 36 horas após a incubação.36 horas após a incubação.

** análises cromatográficas: etanol, análises cromatográficas: etanol, glicose, frutose; utilizando cromatografia glicose, frutose; utilizando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).líquida de alta pressão (HPLC).

** peso seco. peso seco.

- - Fermentação em pequena escala (2 litros)Fermentação em pequena escala (2 litros)

* * levedura: CA 116 - fermentador de levedura: CA 116 - fermentador de

bancada bancada

(LH. SGI - 2 L)(LH. SGI - 2 L)

** dois meios: MF dois meios: MF biomassa; Caldo de biomassa; Caldo de

cana-de cana-de

açúcar diluído açúcar diluído fermentação fermentação propriamente propriamente

dita.dita.

** 5 bateladas sucessivas . 5 bateladas sucessivas .

** amostragem: 12 em 12 horas. amostragem: 12 em 12 horas.

• • RESULTADOS E DISCUSSÃO:RESULTADOS E DISCUSSÃO:

--”Screening” de fermentação”Screening” de fermentação

** Foram selecionadas as leveduras Foram selecionadas as leveduras

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae que que apresentaram apresentaram

produção de COprodução de CO22 em menor tempo em em menor tempo em

glicose, frutose e sacarose.glicose, frutose e sacarose.

Avaliação da capacidade fermentativa de Avaliação da capacidade fermentativa de isolados de isolados de Saccharomyces cerevisiae.Saccharomyces cerevisiae.

12 horasIsolados de levedura glicose sacarose frutose33 220 15 218 28 141 155 525 508 135140 139 111 76 162 108 123 498 261 128164 486 271 222 36 96 262 245 272 112503 163 509 363 116 143 85 526 506 160208 515 219 250 251 264 467 159 387147

3/ 3 3/ 3 3/ 3

14 213 214 78 92 101 117 118 246 493494 468 471 149 75 21 153 138 08 52293 403 405 470 469 79 81 82 12 27 40235 432 438 447 113 449 439 453 457 129130 150 216 132 133 136 37 145 146 148445 253 263 265 266 267 472 475 476485 163 164

2/ 3 2/ 3 2/ 3

268 511 273 347 358 510 496 499 490317 207 332 269 156 466 464 157 158161 178 197 198 199 203 209 211

1/ 3 1/ 3 1/ 3

** 50 isolados de 50 isolados de Saccharomyces Saccharomyces

cerevisiaecerevisiae

fermentaram glicose, frutose e fermentaram glicose, frutose e

sacarose sacarose

com a mesma velocidade.com a mesma velocidade.

- Fermentação em frascos:

** produção de etanol foi inversa ao consumo

de glicose.

** 24% de glicose foi consumida nas primeiras

horas de fermentaçãomultiplicação celular

** produção de etanol pequena 36 molar

Consumo de glicose e produção de etanolConsumo de glicose e produção de etanol

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

t

eta

no

l

0

10

20

30

40

50

60

gli

cose

etanol

glicose

* * após 8 horas após 8 horas fermentação fermentação

propriamente dita.propriamente dita.

** produção máxima 12 horas produção máxima 12 horas (melhores leveduras).(melhores leveduras).

** pH não interferiu na atividade das pH não interferiu na atividade das leveduras.leveduras.

** melhor rendimento e melhor rendimento e produtividade produtividade levedura CA levedura CA 116.116.

Produtividade de etanol com 12 Produtividade de etanol com 12 horas de fermentação.horas de fermentação.

Levedura Protdutividadeetanol/ biomassa

Produtividade deetanol /ART

Produtividade deetanol/tempo de

fermentação525 0.1624 0.4807 0.400676 0.1077 0.4873 0.3980

108 0.0965 0.5059 0.4172123 0.1840 0.5009 0.4140128 0.1155 0.5515 0.4544164 0.1244 0.5473 0.4495486 0.1555 0.4827 0.3992271 0.1727 0.5205 0.4304503 0.1700 0.5101 0.4236509 0.1301 0.4923 0.4088116 0.1862 0.5863 0.4873143 0.1005 0.4696 0.3886506 0.1059 0.5116 0.4241160 0.115 0.5125 0.4241208 0.1660 0.4647 0.4116

Rendimento em percentagem de Rendimento em percentagem de etanol produzido.etanol produzido.

RENDIMENTO ( % )LEVEDURA 12 HORAS 24HORAS

525 74.30 70.7676 73.82 71.00108 77.38 59.09123 76.78 67.74128 83.88 67.71164 83.36 67.20486 74.03 64.65271 79.82 68.01503 78.57 72.56509 75.82 62.08116 90.38 74.85143 72.08 67.33506 78.65 52.78160 76.34 53.49208 71.87 59.60

- - Fermentações em bateladas Fermentações em bateladas

sucessivassucessivas

* * O rendimento e a produtividade do O rendimento e a produtividade do

isolado CA 116 foi comprovado em 5 isolado CA 116 foi comprovado em 5

bateladas .bateladas .

* * O maior rendimento e produtividade O maior rendimento e produtividade

observado na última batelada pode observado na última batelada pode

ter sido devido a uma maior ter sido devido a uma maior

adaptação da levedura ao meio de adaptação da levedura ao meio de

cultura (caldo de cana-de açúcar).cultura (caldo de cana-de açúcar).

Rendimento e produtividade da Rendimento e produtividade da levedura CA 116 em cinco bateladas.levedura CA 116 em cinco bateladas.

Batelada1

Batelada2

Batelada3

Batelada4

Batelada5

Etanol/biomassa 0.9388 0.7875 0.5329 2.5345 2.5688Etanol/ART 0.3333 0.1898 0.1974 0.5807 0.7406Etanol/tempo 0.3130 0.2867 0.2998 0.7904 0.9834Rendimento

%58 53 55 90 95

• • CONCLUSÕESCONCLUSÕES

- - A produção de etanol foi significativamente A produção de etanol foi significativamente

diferente para as linhagens de diferente para as linhagens de

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae testadas. testadas.

-- De um total de 158 isolados, cinqüenta De um total de 158 isolados, cinqüenta

foram selecionadas pelo testes de Durham foram selecionadas pelo testes de Durham

com bom índice fermentativo. com bom índice fermentativo.

-- Quinze dentre as cinqüenta Quinze dentre as cinqüenta S. cerevisiaeS. cerevisiae

produziram maior quantidade em torno de produziram maior quantidade em torno de

110 µmolar em média, estatisticamente elas 110 µmolar em média, estatisticamente elas

foram iguais no período 12 horas de foram iguais no período 12 horas de

fermentação.fermentação.

- - A levedura CA 116 foi selecionada A levedura CA 116 foi selecionada por ter apresentado a mais alta por ter apresentado a mais alta produtividade e maior rendimento produtividade e maior rendimento alcoólico.alcoólico.

- - A CA 116 apresentou a A CA 116 apresentou a

importante característica de importante característica de

floculação.floculação.

AGRADECIMENTIOSAGRADECIMENTIOS

À ProfÀ Profaa. Dr. Draa. Rosane Freitas Schwan.. Rosane Freitas Schwan.À ProfÀ Profaa. Dr. Draa. Eliana Pinheiro de Carvalho. . Eliana Pinheiro de Carvalho. Aos Profs. Alan Wheals e Eustáquio Souza Dias. Aos Profs. Alan Wheals e Eustáquio Souza Dias. Aos colegas de laboratório (Sílvia, Charles, André, Aos colegas de laboratório (Sílvia, Charles, André, Cláudia, Cristina, Míriam, Valéria, Daniela, João, Cláudia, Cristina, Míriam, Valéria, Daniela, João, “Carolinas” e Márcio).“Carolinas” e Márcio).Aos amigos Ivana, Beto, Joelma, Dulcinéia, Creuza, Aos amigos Ivana, Beto, Joelma, Dulcinéia, Creuza, Newton, Cidinha, Janaína, Débora, Kelly e Margarita.Newton, Cidinha, Janaína, Débora, Kelly e Margarita.Às secretárias Gicelda e Andreia.Às secretárias Gicelda e Andreia.Aos colegas do DCAAos colegas do DCAAos Professores do DCA e funcionários do DCA, Aos Professores do DCA e funcionários do DCA, Biblioteca, DBI, PRPG e DRCA pela atenção.Biblioteca, DBI, PRPG e DRCA pela atenção.Enfim a todos que direta ou indiretamente Enfim a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste trabalho.colaboraram para a realização deste trabalho.

Muito Obrigado!Muito Obrigado!

leveduras

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