Letícia Krauss (NATS/FIOCRUZ)

outubro 2009

Prevenção do Parto Prematuro Espontâneo Associado à Infecção Intra-Uterina:

marcadores biológicos e ensaio clínico de probióticos

Equipe da pesquisaEquipe da pesquisa•Letícia Krauss Silva – ENSP;NATS/FIOCRUZ (coord.)(coord.)•Maria Elisabeth Lopes Moreira – IFF; NATS/FIOCRUZ •Mariane Branco Alves- UERJ•Alda Maria Cruz - IOC•Antônio Luiz Almada Horta•Alcione Moraes Braga (Pró-Cardíaco)•Maria Rosa Rodrigues Batista – IFF•Karla Gonçalves Camacho- NATS/ENSP•Maria Rebelo Rezende•Alcione Moraes de Souza Braga (Pró-Cardíaco)•Fernando Antonio Ramos Guerra- IFF

Centros ColaboradoresCentros Colaboradores Instituto Fernandes Figueira (FIOCRUZ/MS)Maternidade Carmela Dutra (SMS/RJ)Hospital Maternidade Alexander Fleming (SMS/RJ)Unidade Integrada de Saúde Herculano Pinheiro (SMS/RJ)

Objetivos Gerais Objetivos Gerais do Estudodo Estudo

• Avaliar a ocorrência de marcadores biológicos selecionados e sua acurácia para predizer parto prematuro associado à infecção intra-útero em gestantes brasileiras;

• Avaliar a variação dos níveis dos marcadores selecionados após o uso precoce de probióticos;

• Avaliar a eficácia e segurança do uso precoce de probióticos especialmente elaborados, em grávidas portadoras de vaginose bacteriana ou grau intermediário, no sentido de diminuir a ocorrência de parto prematuro espontâneo e a morbi-mortalidade neonatal decorrente do nascimento prematuro associado à infecção intra-uterina.

Objetivos Específicos Objetivos Específicos do Estudodo Estudo

• Determinar o pH vaginal e avaliar a presença de vaginose bacteriana (score de Nugent), em mulheres grávidas, assintomáticas e sem risco/indicação de parto prematuro eletivo, durante o 2º trimestre da gestação;

• Avaliar a ocorrência do polimorfismo do TNF e do IL6 (174) e os níveis de citocinas inflamatórias, inclusive de fibronectina fetal, IL1 e IL6, na vagina e colo uterino no grupo de mulheres referido em a ;

• Analisar a associação entre os marcadores avaliados nos ítens a e b, e a associação desses marcadores com parto prematuro e com complicações da prematuridade e infecção intra-uterina.

Probióticos

• Bactérias probióticas, por definição, são ingredientes alimentares de micróbios vivos que têm um efeito benéfico à saúde humana (Isolauri et al, 2003, FAO/ WHO, 2002).

• A correção das propriedades de uma microbiota endógena não balanceada _ no caso, a manipulação da microbiota vaginal no sentido de interromper o processo infeccioso/ inflamatório (“alérgico”) que leva ao parto prematuro _ forma a racional da terapia probiótica.

• Estudos indicam que a colonização transitória pode ser importante e suficiente já que a microbiota não balanceada pode ser corrigida por uma curta intervenção probiótica (Isolauri et al, 2003) o que pode ser relevante para o caso da VB na gestação.

• Por causa da natureza polimicrobiana da VB, a cura, o tratamento e o manejo das recorrências são mais complexos que para muitas outras doenças causadas por um único agente infeccioso (Famularo et al, 2000).

• Os resultados insatisfatórios dos trabalhos de investigação sobre o papel dos antibióticos no tratamento da vaginose bacteriana e na prevenção do parto prematuro e danos neonatais e o conhecido papel que tem a flora microbiana normal, estável, produtora de ácido láctico, na prevenção de infecções vaginais reforçaram o interesse no potencial da bacterioterapia com bactérias lácticas probióticas no quadro da vaginose bacteriana e suas conseqüências.

• São antigas as evidências de que os lactobacilos protegem contra infecções vaginais por produzir ácido láctico, mantendo assim um pH de 4.0-4.5. Além disso, os lactobacilos inibem o crescimento de um grande número de microorganismos oportunistas vaginais, incluindo E.coli, Candida albicans, G.vaginalis, e Mobiluncus sp, por diminuir o pH vaginal produzindo, além do ácido lático, peróxido de hidrogênio (H2O2) e outros metabólitos inibitórios (Cauci et al, 2005, Famularo et al, 2000).

• Muitos efeitos probióticos não são, todavia, relacionados somente às

mudanças da microbiota, como indicado por culturas. Realmente,

uma parte importante dos efeitos benéficos dos probióticos está

relacionada aos seus efeitos imunomoduladores: aumento da

atividade imunológica assim como da atividade anti-inflamatória

(Isolauri et al, 2003).

• Todavia, as incertezas sobre os mecanismos envolvidos na

imunidade vaginal e sobre o conjunto de características metabólicas,

além de outras, das bactérias a serem usadas como probióticos,

adicionam dificuldades ao desenho de intervenções eficazes e

seguras relacionadas não só à VB mas também aos desfechos parto

prematuro e morbidade neonatal (Famularo et al,2001).

• O tratamento ecológico da VB através da colonização da

vagina com lactobacilos exógenos é atraente e apresenta

plausibilidade biológica tanto para a VB quanto para o parto

prematuro, e os resultados até agora dos ensaios sobre a sua

eficácia para resolver o problema VB, embora relativamente

pequenos, são consistentes e bastante favoráveis. Todavia, a

eficácia dos probióticos para as conseqüências da VB, parto

prematuro e morbidade neonatal, embora plausível, não foi

estudada.

O probiótico utilizado no projeto foi o desenvolvido e testado por Reid e colaboradores

• Lactobacillus rhamnosus GR-1 • Lactobacillus reuteri RC-14

• Além dos atributos desejáveis do ponto de vista da eficácia dos probióticos anti VB, já referidos aderência às células epiteliais da vagina, apoptose de micróbios patogênicos, produção de H2O2 e de bacteriocinas antagônicas ao crescimento de microorganismos atípicos, e atividade anti-TH2 _ um probiótico para a VB precisa ser seguro.

• Os lactobacilos e bifidobactérias são considerados geralmente, em princípio, seguros porque são componentes da flora comensal humana e porque vem sendo há muito tempo utilizados na indústria de alimentos e em duchas, inclusive por gestantes, sem efeitos deletérios (de Vrese e Schrezenmeir, 2002, Reid, 1999, WHO, 2002).

• Embora os lactobacilos tenham sido identificados em culturas do sangue e de outros órgãos, infecções por lactobacilos são raras (Isolauri et al,2003). Hemoculturas positivas para lactobacilos ocorreram em 0.24% dos pacientes em um estudo finlandês e em 0,1% dos pacientes em um estudo francês, sendo que tais infecções ocorreram em pacientes com imunodeficiência (de Vrese e Schrezenmeir, 2002, Reid & Devillard,2004).

Segurança dos probióticos

Os resultados do screening de marcadores biológicos e de probióticos na VB/Intermediária permitirão:

• avaliar seu uso como uma nova proposta tecnologica de tratamento precoce da vaginose bacteriana em nosso meio e

• subsidiar o desenho de estratégias eficientes de screening para diminuir a ocorrência de partos prematuros e conseqüências neonatais associadas à infecção intra-uterina.

Triagem clínica no Pré-natal

• Avaliar se a gestante apresenta critérios de exclusão que impossibilitem sua participação no projeto.

• Identificação dos fatores de risco.

Critérios de Exclusão Absolutos

• Gestação múltipla;• Incompetência ístmo-cervical (circlagem em gestação

atual);• Feto com malformações congênitas maiores em

gestação atual;• Diabetes Melitus insulino-dependente;• Hipertensão Arterial sistêmica em uso de medicação. • Sem história de HÁ mas com PA com sistólica >=150 e

diastólica >=110, repetindo-se os índices em decúbito lateral

Critérios de Exclusão Absolutos

• Antibioticoterapia após a 8ª semana da gestação atual, inclusive por suspeita clínica de infecção urinária baixa;

• Diagnóstico de sífilis ou gonorréia na gestação atual;• Asma requerendo terapia intermitente ou crônica;• Corticoterapia recente (até um mês antes)/contínua;• Doença hemolítica perinatal;• Lupus Eritematoso Sistêmico.

Critérios de Exclusão Relativos

• Sangramento vaginal ativo, não considerar sangramento prévio.

• Suspeita clínica de vaginose bacteriana ou tricomoníase (queixa de secreção aumentada e coceira, ardência ou odor): deve ser realizado exame especular para a confirmação diagnostica. Caso positivo a gestante deve ser tratada conforme a rotina do serviço e excluída do estudo. Caso negativo, deverá ser admitida no estudo;

Exame clínico

• Exame clínico ginecológico para avaliação:pH vaginal.Colheita de material vaginal para análise do

Nugent e citocinas inflamatórias .Colheita de material de mucosa oral para

genótipo.

Avaliação do pH vaginal

• É a determinação da “acidez” do ambiente vaginal que está relacionada com a composição da flora vaginal

• Colocação da paciente em posição ginecológica para realização de exame clínico especular.

• Medição do pH vaginal aplicando fita medidora de pH no terço médio da parede lateral da vagina utilizando pinça de Cherron para direcionar a aplicação da fita.

Avaliação do pH vaginal

• Verificação do pH vaginal através da comparação da cor obtida com o padrão do pH.

• Anotação do mesmo em cartão anexo ao kit de coleta imediatamente após sua verificação.

Avaliação do pH vaginal

• Em caso de pH vaginal > 4,5 a paciente será submetida a coleta de material vaginal para bacterioscopia (Nugent) e análise de citocinas inflamatórias além de material de mucosa oral para genótipo.

• Em caso de pH vaginal < 4,5 na primeira consulta, na consulta subsequente, caso a paciente ainda apresente IG < 19semanas e 06dias deve ter o pH novamente avaliado de forma semelhante. (repescagem)

Colheita de secreção vaginal para o Nugent

• Com a paciente em posição ginecológica e com espéculo estéril alocado no canal vaginal, introduzir swab seco em parede lateral da vagina (terço médio com o superior), mantendo-o por 10 segundos.

• Aplicar conteúdo obtido em lâmina de vidro com área fosca previamente identificada.

• Acondicionar lâmina em recipiente plástico igualmente identificado.

Coleta de secreção vaginal para citocinas Coleta de secreção vaginal para citocinas inflamatóriasinflamatórias

• 1. Identificar o tubo (eppendorf) com nome completo da gestante, data e hora da colheita de material e data de nascimento.

• 2.Iniciar procedimento com gestante em posição ginecológica e com espéculo descartável não lubrificado devidamente introduzido e posicionado no canal vaginal.

• 3.Posicionar swab de poliéster (Dacron) estéril, haste de plástico no ostio do cervix da gestante. Manter swab alocado no óstio por 10(dez) segundos para obter saturação.

• 4. Retirar o swab e cortar sua haste (com tesoura) num comprimento que permita sua colocação dentro do eppendorf

• 5. Acondicionar o swab depois de cortado no eppendorf com solução tamponada de fosfato (400microL, diluição final 1:5).

• 6. Imediatamente após a colheita do material biológico e vedação do eppendorf, este deverá ser transportado para o freezer do projeto, na unidade

( -20°C).• 7. Esta operação deve ser realizada para um 2º

swab.

Coleta de mucosa oral para avaliação Coleta de mucosa oral para avaliação de genótipode genótipo

• Esfregar a ponta do cotonete na mucosa oral por cerca de 15 segundos.

• Introduzir a ponta contendo o material biológico dentro do tubo eppendorf

• Cortar a haste do cotonete (com tesoura) para possibilitar o fechamento do tubo de acondicionamento.

• Identificar o tubo com nome completo da gestante, data e hora da colheita de material e data de nascimento.

• Posicionar o eppendorf em caixa para estocagem de tubos de criopreservação.

• Guardar a -20° C.

Coleta de mucosa oral para Coleta de mucosa oral para avaliação de genótipoavaliação de genótipo

A repescagem

• Resgate de mulheres que na 1ª consulta foram excluídas devido a pH < 4,5 ou Nugent (-).

• A idade gestacional no momento da nova análise do pH e coleta de material para Nugent e marcadores biológicos deve ser inferior a 19 semanas e 6 dias.

Consulta Pós-randomização

Consulta Pós-tratamento

Prevenção do Parto Prematuro Espontâneo Prevenção do Parto Prematuro Espontâneo Associado à Infecção Intra-Uterina: Ensaio Associado à Infecção Intra-Uterina: Ensaio

Clínico de ProbióticosClínico de Probióticos

Banco de Dados

TELA DE IDENTIFICAÇÃO

1º ATENDIMENTO

Aderência ao estudo

Aderência ao estudo em novembro

Devolução de frascos

80%(83)

20%(21)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

Sim Não

Aderência ao estudo em novembro

Devolução de frascos por maternidade

69%(20)

31%(9)

83%(15)

17%(3)

83%(35)

17%(7)

87%(13)

13%(2)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Sim Não

CD

MAF

HP

IFF

Aderência ao estudo novembro

Aderência autodeclarada ao final do tratamento

7%(7)

9%(9)

85%(88 )

0%10%20%

30%40%50%60%

70%80%90%

Não Parcial Sim

autodeclarada  

Não 7 7%

Parcial 9 9%

Sim 88 85%

total 104 1

Aderência ao estudo

Classificação de aderência:Classificação de aderência:Ótima=>85%Boa=70-85%Média=50-70%Ruim=<50%

Aderência contabilizada ao final do tratamentocom base na devolução de frascos

9%(7)

5%(4)

15%(12)

14%(11)

58%(47)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Duvidosa Ruim Regular Boa Ótima

Aderência ao estudo novembro

  Contabilizada  

Declarada Duvidosa Ruim Regular Boa Ótima Total

N     2 3   5

      40,00% 60,00%   100%

      16,67% 27,27%   6,17%

P 1 2 1 1 2 7

  14,29% 28,57% 14,29% 14,29% 28,57% 100%

  14,29% 50,00% 8,33% 9,09% 4,26% 8,64%

S 6 2 9 7 45 69

  8,70% 2,90% 13,04% 10,14% 65,22% 100%

  85,71% 50,00% 75,00% 63,64% 95,74% 85,19%

Total 7 4 12 11 47 81

  8,64% 4,94% 14,81% 13,58% 58,02% 100%

  100% 100% 100% 100% 100% 100%

Distribuicao de NUGENT no Primeiro atendimento (randomizadas ou não) n= 1302

109876543210

Nugent_at1

25,0%

20,0%

15,0%

10,0%

5,0%

0,0%

Per

cen

t

Resultados Validação citocinas

1. Os testes funcionaram;2. As curvas padrão ficaram dentro do limite recomendável pelo

teste e as citocinas foram detectadas nas amostras. 3. Tanto as citocinas IL1b quanto IL-ra foram quantificadas no

material biológico examinado. Tendo em vista os limites mínimo e máximo de detecção dos testes, bem como associados com dados existentes na literatura quanto a quantificação de IL-1B, optou-se por utilizar a diluição 1:2.

4. Quanto a IL-1ra, não houve material suficiente para realizar a quantificação de todas as pacientes e assim optamos por utilizar apenas a metade do kit, com apenas um pouco por ponto e não em duplicata.

5. As amostras analisadas excederam o limite de detecção do teste, mesmo na diluição 1:2.   Ainda temos uma quantidade de testes para analise,  o que nos permitira repetir o experimento agora utilizando diluções maiores.

R2 = 0,1439

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 200 400 600 800 1000

IL-1B pg/ml

Sc

ore

de

Nu

ge

nt

Série1

Linear (Série1)

Curva de análise IL-1BCurva de análise IL-1B

análise IL-1Banálise IL-1B

Em 40 casos analisados foi encontrada correlação entre o score de Nugent (0-10) com a concentração de IL-1B, com R2= 0.27.

Resultados Neonatais

Desfecho Placebo Intenção de Tratar RR Total Total (%)

PP [28S, 30S) 1 0 1 0,2%

PP [30S, 32S)* 0 1 1 0,2%

PP [32S_ 34S)** 5 2   7 1,1%

PP <34S 6 3 200% 9 1,4%

PP [34S, 37S) 9 7 129% 16 2,5%

RN A TERMO 302 301 603 96,0%

TOTAL 317 311   628 100,0%

* ADERÊNCIA DUVIDOSA

** UMA GESTANTE NÃO ADERENTE