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Universidade de Cuiabá
Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas Área de Concentração em Odontologia
JUSSARA MACHADO PEREIRA
EFEITO DA SINVASTATINA SOBRE A PERIODONTITE APICAL INDUZIDA EM RATOS
ANÁLISE RADIOGRÁFICA E BIOQUÍMICA
Cuiabá 2015
JUSSARA MACHADO PEREIRA
EFEITO DA SINVASTATINA SOBRE A PERIODONTITE APICAL INDUZIDA EM RATOS
ANÁLISE RADIOGRÁFICA E BIOQUÍMICA
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas, Área de Concentração em Odontologia. Orientadora: Profª. Drª. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff.
Cuiabá 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
Bibliotecária: Daniely Cristina Bejo da Silva / CRB1 - 2939
JUSSARA MACHADO PEREIRA
Ficha Catalográfica Daniely Cristina Bejo da Silva
Bibliotecária CRB1 – 2939
Normalização Valéria Oliveira dos Anjos Bibliotecária CRB1/1713
P436e Pereira, Jussara Machado.
Efeito da sinvastatina sobre a periodontite apical induzida em ratos. Análise radiográfica e bioquímica / Jussara Machado Pereira – Cuiabá, 2015.
52 f. : il. Orientadora: Profª. Drª. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff.
Dissertação – Universidade de Cuiabá – UNIC, Programa de Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas, Cuiabá, 2014.
Inclui bibliografia.
1. Odontologia. 2. Endodontia. 3. Periodontite Apical. 4. Ratos. 5. Sinvastatina. I. Título: Efeito do uso da Sinvastatina na progressão da doença endodôntica induzida em ratos. II. Universidade de Cuiabá – UNIC.
CDU – 616.314.18
Ao meu esposo e aos meus filhos, que me encorajaram, acreditaram e ajudaram-me desde o início do meu Mestrado.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus que me deu vida, saúde, inteligência para que eu pudesse ingressar neste desafio que é cursar o Mestrado.
Ao meu marido Antonio Lisboa Pereira, que sempre esteve ao meu lado incentivando e encorajando-me durante todo o curso.
Aos meus filhos, Juliana, Isabela, e Marco Antonio, que me apoiaram a fazer este curso e também pela ajuda na digitação, impressões e gravações de CDs, com os quais tenho pouca experiência.
À minha orientadora Profª Dra. Tereza A. Delle Vedove Semenoff, a qual desde o primeiro dia de aula me encantou, com sua doçura, competência e simpatia. Muito obrigada pelos ensinamentos, orientação, e condução deste trabalho sempre com muita atenção e paciência.
Aos Professores do Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas: Alessandra Nogueira Porto, Alex Semenoff Segundo, Alexandre Meireles Borba, Álvaro Henrique Borges, Andreza Maria Fábio Aranha, Artur Aburad de Carvalhosa, Cyntia Rodrigues de Araújo Estrela, Evanice Menezes Marçal Vieira, Fábio Luiz Miranda Pedro, Luiz Evaristo Ricci Volpato, Orlando Aguirre Guedes, Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff, Vinícius Canavarros Palma. Pessoas altamente competentes que nos passaram o conhecimento científico de uma maneira bem didática, sempre nos incentivando e tornando nossos encontros em momentos agradáveis e proveitosos.
Aos meus colegas de curso do mestrado: Ana Paula da Cunha Barbosa, André Luis Fernandes da Silva, Fenanda Zanol Matos, Fernanda Silva de Assis, João Milanez Moreira Júnior, Kadyja Assis Veiga, Laura Maria de Amorim Santana, Marta Eloiza Zanelli, Paulo Artur Andrade de Albuquerque, Rejane Cristina da Cruz Nascimento, Thiago Machado Pereira, Vanessa de Souza, Yolanda Benedita Abadia Martins de Barros, Andreia Santini, Ariane Liamara Brito Sala Braum, Craudeli Moreira, Grace Emanuelle Guerreiro Dias Rocatto, Heitor Simões Dutra Corrêa, Lorena Frange Caldas, Marcondes Paiva Serra, Maria Francisca Moretti, Pâmela Juara Mendes de Oliveira, Regina Greyce da Silva Pereira Ribeiro, Renata Meira Coelho, Sandra Regina Altoé e Sebastião Dias de Oliveira. Obrigada Agradeço aos colegas pela parceria nos trabalhos, seminários; SBPqO pelo incentivo quando tinha que apresentar uma aula, achava que não poderia. Pelos laços de amizade que estabelecemos no decorrer do curso e que vamos levar pra sempre conosco.
Em especial, gostaria de agradecer ao meu amigo Heitor Simões Dutra, o qual sempre me ajudou e não mediu esforços para fazê-lo em todos os momentos que precisei! Divido este momento tão especial com você! Muito obrigado amigo!
Aos incansáveis amigos, Natalino Francisco da Silva e Fábio Augusto Buche Barros, por todo o apoio prestado na parte experimental deste trabalho. Sem eles a conclusão desta etapa seria difícil.
À Universidade de Cuiabá – UNIC nas pessoas do Reitor Rui Fava, do Pró Reitor
Acadêmico José Cláudio Perecin, e, sobretudo, ao Diretor da Faculdade de Odontologia da Universidade de Cuiabá – UNIC, Fábio Luis Miranda Pedro pelo apoio irrestrito ao oferecer todo apoio necessário à realização deste trabalho.
Ao Programa de Mestrado da Universidade de Cuiabá – UNIC representado pelo Diretor de Pós-Graduação Stricto Sensu da Kroton, Helio Suguimoto e à Coordenadora de Pesquisa e Pós-Graduação - Stricto Sensu da Universidade de Cuiabá – UNIC, Lucélia de Oliveira Santos, graças aos esforços na condução do processo educativo e de construção do conhecimento científico nesta Instituição.
Às secretárias do mestrado: Cátia Balduino Ferreira e Josieire Marques Missias pela atenção e presteza na resolução dos nossos pedidos.
Enfim, agradeço profundamente o Coordenador do Programa de Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas, Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges pelo seu incentivo, orientações e preocupação com cada aluno, conhecendo um a um por seu nome completo.
A todos que me incentivaram e acreditaram em mim, meu muito obrigado.
"Não to mandei eu? Sê forte e corajoso; não temas, nem te espantes, porque o Senhor, Teu Deus, é contigo por onde quer que andares.”
Josué 1:9
RESUMO
RESUMO
PEREIRA, J. M. Efeito da sinvastatina sobre a periodontite apical induzida em ratos: análise radiográfica e bioquímica. 2015. 52 f. Dissertação (Mestrado) – Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá - UNIC, Cuiabá, 2015.
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da sinvastatina na progressão da periodontite apical induzida em ratos. Para tanto, 36 ratos Wistar, previamente selecionados, foram divididos em 3 grupos (N=12). Grupo Controle (GC); Grupo Periodontite Apical (GPA); Grupo Periodontite Apical Associada à Sinvastatina (GPAS). Durante trinta dias experimentais, o GPAS recebeu diariamente 6mg de sinvastatina diluída em água, através de gavagem. No segundo dia do ensaio o GPA e o GPAS foram anestesiados e submetidos à abertura coronária do primeiro molar inferior direito. No trigésimo primeiro dia experimental, todos os grupos foram submetidos à anestesia e coleta de sangue. Em seguida sucedeu-se a eutanásia por excesso de anestésico, sendo as mandíbulas removidas e fixadas em formol. Para a mensuração das regiões periapicais, foram realizadas radiografias de forma padronizada. Estas foram projetadas em tela branca, por um projetor de imagens, sempre posicionado à mesma distância de dois metros. Dessa forma, foi possível que os perímetros dos espaços do ligamento periapical fossem demarcados em papel sulfite. Os papéis foram digitalizados e estes perímetros foram mensurados. Além disso, avaliou-se a massa corporal e o lipidograma. Os dados foram submetidos à análise estatística (ANOVA e Tukey). Os resultados demonstram que o GPA (3425,20 + 655,51) apresentou os maiores perímetros para espaço do ligamento periapical, seguido pelo GPAS (1543,58+780,34) e GC (648,50+243,55), respectivamente (p<0,05). Em relação ao lipidograma percebe-se o efeito da sinvastatina avaliando-se a quantidade de glicose, triglicérides, HDL, VLDL (p<0,05). Para a massa corporal o GPA foi o que mais ganhou peso (264,75+44,11); seguido pelo grupo GC (252,00+44,36); e GPAS (245,41+42,56). Os três grupos apresentaram diferenças estatísticas entre si, de forma decrescente (p<0,05). A partir desta metodologia, foi possível concluir que o uso do fármaco sinvastatina diminuiu a progressão do aumento do espaço do ligamento periapical em ratos, quando analisadas em radiografias. Palavras-chave: Sinvastatina. Ratos. Periodontite Apical. Endodontia.
ABSTRACT
ABSTRACT PEREIRA, J. M. Effect of simvastatin on induced apical periodontitis in rats: radiographic and biochemical analysis. 2015. 52 f. Dissertation (Master) - Post-Graduate Program, University of Cuiabá – UNIC, Cuiabá, 2015.
The objective of this study was to evaluate the effect of simvastatin on the progression of apical periodontitis induced in rats. For this, 36 rats were divided into 3 groups selected (N = 12). Control Group (CG); Periodontitis Group Apical (GPA); Periodontitis Group Apical Associated with simvastatin (GPAS). For thirty days experimental period, the GPAS received daily 6mg simvastatin diluted in water by gavage. On the second day of the test the GPA and the GPAS were anesthetized and coronal opening of the mandibular first molar. In the thirty-first experimental day, all groups were anesthetized and blood collection. Then it came to euthanasia by excess anesthetic, with the jaws removed and fixed in formaldehyde. To measure the periapical regions in a standardized way radiographs were taken. These are designed in white screen for a projector images, always positioned at the same distance of two meters. Thus, it was possible that the perimeters of the periapical ligament spaces were demarcated on bond paper. The papers were scanned and these perimeters were measured. In addition, we evaluated the body mass and the lipid profile. Data were subjected to statistical analysis (ANOVA and Tukey). The results demonstrate that GPA (3425.20 + 655.51) showed the highest LA, followed by GPAS (1543.58 + 780.34) and GC (648.50 + 243.55), respectively (p <0.05). Regarding lipid realize the effect of simvastatin assessing the amount of glucose, triglycerides, HDL, VLDL (p <0.05). For body mass GPA was the most gained weight (264.75 + 44.11); followed by the control group (252.00 + 44.36); and GPAS (245.41 + 42.56). The three groups were statistically similar to each other, in decreasing order (p <0.05). From this methodology, it was concluded that the use of the drug simvastatin decreased the progression of rising periapical ligament space in rats, when analyzed on radiographs. Keywords: Simvastatin. Rats. Periapical Periodontitis. Endodontics.
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Médias e Desvios Padrão dos Perímetros dos espaços do Ligamento Periapical. ............................................................................................ 41
Tabela 2 - Médias e desvios padrão dos componentes lipídicos e da glicose mensurados nos exames de sangue dos animais do GPAS, GPA e GC. ....................................................................................................... 41
Tabela 3 - Médias e desvios padrão das diferenças de peso (em gramas) entre as aferições finais e iniciais dos animais dos GPAS, GPA e GC (N=12). ................................................................................................. 42
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Demonstração do procedimento de acesso coronário com broca esférica número 1011 (1A); checando o acesso e removendo o tecido pulpar coronário com sonda clínica (1B) e visão final do acesso coronário (1C)........................................................................................... 37
Figura 2 - Figura demonstrativa de uma radiografia realizada do Grupo Periodontite Apical Induzida Associada a Sinvastatina. ........................... 38
LISTA DE ABREVIATURA
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT Alanina transaminase
AST Aspartato transaminase
BA Bahia
BMP Proteínas morfogenéticas do osso (Bone morphogenetic proteins)
BMP-2 Proteína morfogenética do osso-2 (Bone morphogenetic proteins-2)
COX-2 Cicloxigenase.
GC Grupo controle.
GPA Grupo periodontite apical induzida.
GPAS Grupo periodontite apical induzida associada à sinvastatina.
HDL Lipoproteína de alta densidade - (high density lipoprotein).
IBM - SPSS Máquinas de negócio internacionais (international business machines) - Pacote estatístico para as Ciências Sociais (Statistical Package for the Social Sciences)
IHB Instrução de Higiene Bucal
KG Sorensen Kristian Georg Sorensen
LDL Lipoproteína de baixa densidade - (low density lipoprotein).
mg Miligramas.
mg/kg Miligramas por quilograma.
mL Mililitros
MMP Metaloproteinases.
MT Mato Grosso
N Número de indivíduos
NIC Nível de Inserção Clínica.
NOS Óxido nítrico sintase.
NY Nova York
OPG Osteoprotegerina
PDGF Fator de crescimento de plaquetas (platelet-derived growth factor)
PLGA Lactic-co-glycolic acid.
PR Paraná
RANKL Fator nuclear kappa-β ligante.
RAR Raspagem e alisamento radicular.
SP São Paulo
SS Sangramento à sondagem.
SVT Sinvastatina.
TAP Tempo de atividade de protombina.
TNFα Fatores de necrose tumoral alpha.
VEGF Fatores de crescimento de endotélio vascular
VHDL Lipoproteína de muito alta densidade - (very high density lipoprotein).
VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade - (very low density lipoprotein).
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 22
1.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA .......................................... 28
2 CAPÍTULO – 1 - EFEITO DA SINVASTATINA SOBRE A PERIODONTITE APICAL INDUZIDA EM RATOS. ANÁLISE RADIOGRÁFICA E BIOQUÍMICA .................................................................................................. 31
2.1 INTRODUÇÕES ............................................................................................. 33
2.2 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 36
2.2.1 Delineamento Experimental da Pesquisa ................................................... 36
2.2.2 Coleta das Amostras .................................................................................... 37
2.2.3 Métodos de Análises dos Dados ................................................................. 39
2.3 RESULTADOS ............................................................................................... 41
2.4 DISCUSSÃO ................................................................................................... 44
2.5 CONCLUSÃO ................................................................................................. 48
REFERÊNCIAS DO CAPÍTULO 1 ................................................................. 50
1 REVISÃO DE LITERATURA
22
1 REVISÃO DA LITERATURA
A obesidade atinge atualmente altos índices epidemiológicos na
humanidade e tem sido ligada a inúmeras doenças, o que tem determinado o
envolvimento de diversas áreas do conhecimento na tentativa de auxiliar a resolução
deste sério problema de saúde pública1,2.
Dentre os problemas que decorrem da obesidade, está a alta quantidade
de colesterol no sangue. Neste sentido, as quantidades dos colesteróis: Lipoproteína
de muito baixa densidade - VLDL (very low density lipoprotein), lipoproteína de baixa
densidade - LDL (low density lipoproteins), e lipoproteína de alta densidade - HDL
(high density lipoprotein) se desequilibram, podendo desencadear severas
complicações no organismo de muitos mamíferos3.
Delahoy et al. (2009)4 desenvolveram uma revisão sistematizada de forma
a avaliar 15 ensaios clínicos, que no geral, demonstraram uma estreita relação entre
o LDL e as doenças cardiovasculares são capazes de ocasionar um processo
inflamatório de coagulação determinante de várias causas de mortes ou graves
sequelas nos indivíduos afetados. Esses processos patológicos têm levado o Estado
a investir altas cifras na tentativa de minimizar os problemas e, acima de tudo,
ocasionam uma piora na qualidade de vida do indivíduo afetado e das pessoas que
com ele convivem5.
A etiopatogenia dessas doenças se assemelha às alterações da cavidade
oral, por apresentarem o processo inflamatório em comum. Entretanto, no caso da
maioria das enfermidades da polpa dentária, da doença cárie e da doença
periodontal, a origem está ligada à infecção6.
Uma das alternativas para auxiliar a resolução do problema da
hipercolesterolemia é o uso de medicações com princípio ativo das estatinas, que dá
origem à sinvastatina (SVT)7.
Apesar de não ser o objetivo inicial ou principal da sinvastatina, tem-se
encontrado uma associação entre a administração da mesma e algumas alterações
no metabolismo ósseo8 pesquisadores têm observado o efeito da administração de
SVT na perda óssea causada por periodontite induzida em ratas ovariectomizadas.
O fármaco foi inserido topicamente no sulco vestibular do primeiro molar inferior
direito dos animais, duas vezes por semana, durante quatro semanas. Os resultados
demonstram que a SVT determinou menor progressão de perda óssea na região de
23
inserção do fármaco. Além disso, os resultados histológicos atestam menor
progressão da doença e menor inflamação nas regiões analisadas.
Além disso, tem buscado-se compreender melhor o efeito da ligação da
SVT e da ciclogenase - 2 inibidora, sobre a redução de proteínas morfogenéticas e
também, no estímulo da formação óssea in vivo. Neste sentido, os autores utilizaram
cultura de células e perceberam que a hipótese da capacidade de estímulo do
crescimento ósseo a partir do uso deste medicamento, é plausível. Em um primeiro
momento não foram encontrados efeitos colaterais no tecido neoformado. Apesar
dos mecanismos envolvidos ainda não serem totalmente conhecidos, há uma
relação entre a proteína morfogenética do osso-2 (BMP-2), óxido nítrico sintase
(NOS) e cicloxigenase (COX-2) no processo de formação do tecido ósseo9.
Em ampla revisão da literatura sobre o uso da estatina e seus
correspondentes na regeneração óssea10; cita vários conceitos e possíveis
mecanismos de ação. O autor descreve estudos sobre o efeito do medicamento no
metabolismo ósseo, seja através de aplicação local ou sistêmica.
Dentre os mecanismos de ação, encontra-se o estímulo da atividade
osteoblástica e inibição da atividade osteoclástica, induzida por proteínas
morfogenéticas do osso (BMP). Através dos mecanismos de retroalimentação as
cadeias de proteínas cinases são capazes de ativar fatores de necrose tumoral
alpha (Tumor Necrosis Factor – TNFα) e aumentar a atividade das proteínas ósseas
morfogenéticas (Bone morphogenetic proteins – BMP). Outro fator relevante é a
atuação dos fatores de crescimento provenientes de adipócitos frente a um estímulo
inflamatório, o qual interfere suprimindo a diferenciação osteoclástica10,11.
Destaca-se ainda, no mesmo trabalho, a descrição do aumento da
atividade da fosfatase alcalina e seu consequente efeito mineralizador, bem como,
aumento de alguns componentes da matriz ósseas como a sialoproteína óssea, a
osteocalcina e o colágeno tipo I. O efeito anti-inflamatório ocorre ao reduzir a
produção de interleucina-6 e interleucina-8, ambos com forte ligação na progressão
de doenças em tecido conjuntivo, principalmente na sua variação do tecido
ósseo10,12.
A sinvastatina apresenta algumas similaridades com o alendronato,
principalmente na manutenção e renovação óssea. (2012)13 avaliaram o impacto
local e sistêmico de uma associação do alendronato e sinvastatina com objetivo de
induzir a regeneração óssea ao redor dos defeitos ósseos. Os resultados
24
demonstram que a SVT foi capaz de auxiliar o preenchimento ósseo em quase todos
os grupos que receberam a SVT. Esta hipótese deixa claro o potencial desta
substância em atuar no metabolismo ósseo, seja de forma individual ou associada
ao alendronato.
Outro mecanismo de ação da SVT relacionado com o metabolismo ósseo
é sua capacidade de estimulação dos fatores de crescimento de endotélio vascular
(VEGF) de uma maneira dose-dependente10,14.
Objetivando analisar a neoformação óssea induzida por sinvastatina, Wu
et al. (2008)15 realizaram a extração de dentes de ratos e inseriram no interior do
alvéolo dental a sinvastatina associada a um dispositivo de liberação lenta
denominado poli-lático-co-ácido glicólico (lactic-co-glycolic acid - PLGA), o que
possibilitou a avaliação do processo de reparo em diferentes tempos experimentais.
Os resultados demonstram o potencial biológico deste produto no estímulo da
formação inicial das fibrinas, bem como, a ação osteoindutiva e de antirreabsorção,
minimizando-se a cascata inflamatória ligada à destruição óssea ou ao atraso em
caso de presença de doenças como a diabetes e ao uso do tabaco15.
No mesmo grupo de pesquisa, realizaram-se testes em cultura de célula
objetivando-se verificar a possibilidade de potencializar o efeito regenerador ósseo
do fármaco. Para tanto, o fator de crescimento de plaquetas (platelet-derived growth
factor - PDGF) foi unido à Sinvastatina. Esta associação utilizada em dispositivos de
liberação lenta PLGA foi capaz de potencializar o mecanismo de ação através da
proliferação blástica e organização das mitoses16.
Dois anos depois, os pesquisadores associaram a sinvastatina ao PDGF
e inseriram esta mistura em alvéolos dentários de ratos, recém-submetidos à
exodontia, utilizando-se também o mecanismo de liberação lenta PLGA. Ao observar
os diferentes tempos experimentais, percebeu-se que aos 28 dias, tempo protocolar
para verificação de reparo ósseo alveolar, a osteoblastogênesis e a maturação
óssea estavam mais completas que nos outros grupos de análise – grupo controle
negativo, grupos onde somente a sinvastatina ou o PDGF foram utilizados17.
Com objetivo de avaliar o efeito da sinvastatina em ratos submetidos à
indução de periodontite induzida através de ligadura, Dalcico et al.(2013)6
administrou através de gavagem doses de SVT em diferentes concentrações. Para
avaliação da perda óssea foram utilizadas mensurações de perda óssea morfológica
e histológica. Além disso, realizou-se a análise das metaloproteinases (MMP) 1 e 8;
25
do receptor ativador de fator nuclear kappa-β ligante (RANKL), de proteínas ósseas
morfogenéticas (BMP) e osteoprotegerin (OPG). Os resultados da pesquisa
demonstram que o uso de SVT melhorou os indicadores de perda óssea alveolar
nos parâmetros histológicos e histométricos, além de todos os parâmetros
imunoinflamatórios estudados demonstrarem atividade anti-inflamatória e
antioxidante. Um fator relevante é que apenas na maior concentração, de 30
miligramas por quilograma (mg/kg) houve um aumento no tempo de atividade de
protombina (TAP) comparado ao grupo controle. Para os indicadores de atividade do
fígado, com importante papel na resposta inflamatória, não houve diferenças nos
níveis de aminotransferase aspartato (AST) e alcalino fosfatase (ALT). As
conclusões dos autores clarificam o potencial da SVT em promover uma resposta
anti-inflamatória local e sistêmica com repercussões significativas de periodonto de
ratos com indução de periodontite.
Rao et al. (2013)18 realizaram, inclusive, um ensaio clínico em humanos
com o uso da SVT como coadjuvante ao tratamento da periodontite. Para esta
finalidade os autores avaliaram pacientes portadores de periodontite e fumantes
distribuídos em dois grupos: Grupo Teste (n=20) – raspagem e alisamento radicular
(RAR), instrução de higiene bucal (IHB) – através de duas escovações dentais
diárias pela técnica de Bass e uso tópico de gel de sinvastatina a 1,2%. Grupo
Controle (N=20) – RAR, IHB e aplicação tópica de gel placebo. Os pacientes foram
avaliados por exame clínico periodontal - Profundidade de Sondagem (PS), do
sangramento à sondagem (SS) e apresentou ganho no Nível de Inserção Clínica
(NIC) - e exame radiográfico um dia após o tratamento, aos três, seis e nove meses.
Nenhum anti-inflamatório ou antibiótico pode ser ingerido pelos pacientes seis
meses antes ou durante o tempo experimental nem qualquer complemento de
higiene, como bochechos ou mesmo fio dental, foi permitido. Os resultados
demonstram que 35 dos 40 pacientes completaram o estudo e estes não
apresentaram qualquer reação à droga ou ao placebo. O grupo Teste apresentou
redução significativa da PS, do SS e apresentou ganho no NIC comparado ao grupo
placebo. Radiograficamente o Grupo Teste demonstrou redução significante aos 6 e
9 meses comparado ao grupo placebo. O grupo SVT apresentou maior frequência
de preenchimento de defeitos ósseos vertical, se comparado ao placebo nos
períodos de seis e nove meses18.
Montero et al. (2014)19 desenvolveram uma revisão sistemática sobre o
26
uso tópico da sinvastatina na regeneração óssea. O objetivo foi resumir os artigos
bem delineados sobre o uso da sinvastatina na promoção da regeneração óssea,
além de evidenciar o que suporta estas descobertas.
Diante dos achados, percebe-se que 76,2% dos artigos são dos últimos 5
anos e envolveram estudos em animais, sendo estes 66, 6% com ratos ou coelhos,
utilizando regiões extra orais. Os autores ainda informam que apenas quatro ensaios
clínicos randomizados demonstraram que a administração tópica da SVT no local de
análise obteve sucesso nos achados clínicos19.
Os referenciados autores relatam que a sinvastatina parece contribuir
efetivamente para a formação óssea e na regeneração periodontal direta no local da
liberação de SVT; existiram ainda vários estudos entre a associação de fórmulas
polimérica biodegradável a SVT. Este fator ocorre pelo fato da sinvastatina ser
insolúvel em água, tal como um hidrogel de gelatina ou microesfera de PLGA, que
ao lado de outros transportadores, mostraram-se capazes, de libertar biomoléculas
formadoras de osso19,20. Os autores destacam que os resultados da aplicação tópica
de SVT são favoráveis, quer seja ela introduzida sozinha21 ou combinada22 com
biomateriais19.
Apesar dos fatores positivos, alguns trabalhos apontam alguns
insucessos nas tentativas de osteoindução por sinvastatina na superfície de
implantes dentários, e algumas repostas negativas ao associar a sinvastatina com
matriz óssea bovina em defeitos críticos realizados em calota craniana19,23.
Diante do exposto, parece haver poucos trabalhos analisando a hipótese
do presente estudo, ou seja, compreender melhor a interferência da SVT no
periodonto periapical24-26. Contudo, os mecanismos de ação e as possibilidades de
aplicação deste fármaco levam-nos a crer que a análise do efeito da SVT na
progressão das doenças periapicais é relevante e perfeitamente plausível de ser
realizada. Desta forma, sua ação frente aos processos infecto inflamatórios
presentes no periodonto marginal e apical merece maiores elucidações.
1.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA
28
1.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA
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30
through enhancement of the transcription factor Forkhead/winged helix box protein O3a. J Endod 2013 May; 39(5):619-25
2 CAPÍTULO – 1 - EFEITO DA SINVASTATINA SOBRE A PERIODONTITE APICAL INDUZIDA EM RATOS. ANÁLISE RADIOGRÁFICA E BIOQUÍMICA
2.1 INTRODUÇÃO
33
2.1 INTRODUÇÕES
Mesmo com o advento de modernas técnicas de prevenção e tratamento
de inúmeras doenças, a saúde bucal ainda é considerada um problema em todo o
mundo1. As doenças bucais mais comumente encontradas são as cáries e
periodontais 1,2. O foco de infecção induzido por biofilme dental encontrado na
cavidade oral3 representa um importante elemento na produção de inflamação
gerada pelo organismo4,5, além de causar outros problemas relacionados com o bem
estar e a saúde integral da pessoa6.
A sinvastatina (SVT) é uma das várias estatinas utilizadas no tratamento
da hipercolesterolemia, ou seja, dos níveis de colesterol da corrente sanguínea que
podem provocar sérios danos à saúde, a exemplo das doenças cardiovasculares7.
Seu mecanismo de ação sistêmico, atualmente é explorado por várias
áreas do conhecimento8,9, entretanto, deve-se atentar que esta droga tem como
indicação clínica atuar no alto acúmulo de colesterol e seus subprodutos. Apesar
dos seus comprovados benefícios, assim como a maioria dos fármacos, seu uso
prolongado está associado a efeitos colaterais10,11.
Na odontologia, vários estudos têm buscado relacionar a SVT ao reparo e
à regeneração óssea12-14. Fato muito ambicionado em diversas ocasiões da clínica
odontológica, especialmente naquelas onde há necessidade de extensas
reabilitações bucais. Naturalmente, há um percurso na busca de informações e
capacidade de gerar benefícios através dos conhecimentos gerados com a pesquisa
científica. Neste sentido, muitos estudos apontam para o melhor entendimento do
mecanismo de ação da SVT, que parece atuar localmente, atuando na cascata
imuno-inflamatória15.
Mais recentemente, além da regeneração óssea, alguns pesquisadores
objetivaram verificar a ação da SVT nas doenças periodontais16, de tal forma que um
grupo de pesquisadores17, dividiram 40 pacientes, fumantes e portadores de
periodontite, em dois grupos de tratamento: raspagem e alisamento radicular e
sinvastatina associada a raspagem e alisamento radicular de forma pareada para
sexo e idade. A média de redução de sondagem, profundidade e média de ganho de
nível clínico de inserção foi maior no grupo SVT do que o grupo placebo em todas as
visitas. Além disso, significativamente maior percentagem média de preenchimento
de osso foi observada no grupo SVT em comparação com o grupo placebo.
34
Estudos de indução de periodontite apical são relevantes18 e nos dias
atuais são utilizados na busca do entendimento da etiopatogenia da doença. Parece
que o efeito da sinvastatina nas doenças induzidas no periodonto apical de ratos é
uma proposta plausível19-21 e pode contribuir com informações que em pesquisas in
vitro ou em humanos não seriam possíveis16.
Neste sentido, compreender a ação da sinvastatina, utilizada
sistemicamente (via oral), na região periapical é pertinente e importante,
especialmente quando analisada em um modelo animal largamente utilizado e bem
aceito na literatura18,22.
De modo que, constitui objetivo deste trabalho avaliar o efeito da
sinvastatina no aumento do espaço do ligamento periapical induzido em ratos.
2.2 MATERIAIS E MÉTODOS
36
2.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Inicialmente, 36 ratos adultos, machos, com 2 meses de idade, da
espécie Rattus Novergicus da linhagem Wistar, com peso inicial de
aproximadamente 210 gramas, foram selecionados no biotério do hospital
veterinário da Universidade de Cuiabá – Unic, Campus Beira Rio, Cuiabá-MT. Os
mesmos passaram por uma adaptação ao novo ambiente durante duas semanas e
foram mantidos em nove caixas moradia (polietileno 60x40x35) em número de 4
animais por caixa, com ração padronizada e água ad libitum, sob ciclo claro/escuro
de 12 horas, temperatura controlada a 23° C e umidade ± 60%. (Ceua – UNIC
protocolo 003/2014).
2.2.1 Delineamento Experimental da Pesquisa
Os animais foram randomicamente divididos, por um auxiliar técnico que
desconhecia os objetivos da pesquisa em três grupos experimentais: Grupo
Periodontite Apical Induzida Associada à Sinvastatina (GPAS N=12); Grupo
Periodontite Apical Induzida (GPA N=12) e Grupo Controle Negativo (GC).
No primeiro dia do experimento, os animais do grupo GPAS iniciaram a
ingestão diária de seis miligramas de sinvastatina (Cápsulas com 6mg, Natupharma
– Farmácia de Manipulação, Cuiabá–MT), através de gavagem – realizada através
de seringa de 10ml (BD do Brasil, Curitiba-PR) acoplada a 10 cm de cânula para
injeção (Scalp vein 18G, Venescalp, Feira de Santana – BA, Brasil). A administração
da droga ocorreu durante os 30 dias experimentais de forma ininterrupta.
Para o procedimento de indução da periodontite apical, todos os animais,
com exceção dos do GC, receberam anestesia, através da administração
intramuscular de 0,1 mL de cloridrato de cetamina (Dopalen, Agribrands, Saúde
Animal, Paulínia, SP, Brasil) associado a 0,05 mL de cloridrato de xilazina (Rompun,
Bayer. Saúde Animal, São Paulo, SP. Brasil), para cada 100 gramas de peso
corporal23.
Para o acesso coronário e consequente indução de doença periapical dos
grupos GPAS e GPA foram utilizadas brocas esféricas (1011-KG - Sorensen, Cotia,
SP, Brasil) adaptadas em caneta de alta rotação refrigerada com objetivo de criar
um acesso à câmara pulpar do primeiro molar inferior direito (Figura 1).
37
Figura 1 - Demonstração do procedimento de acesso coronário com broca esférica número 1011 (1A); checando o acesso e removendo o tecido pulpar coronário com sonda clínica (1B) e visão final do acesso coronário (1C).
Após o ato operatório, uma dose de dipirona sódica (2,5 mg para cada
100g de peso corporal) foi injetada intramuscularmente em cada animal dos grupos
GPA e GPAS.
O GC não recebeu nenhum tipo de intervenção, porém foi mantido no
mesmo ambiente dos demais grupos.
2.2.2 Coleta das Amostras
Após 30 dias experimentais, os animais foram novamente anestesiados
com injeção intramuscular de 0,1 mL de cloridrato de cetamina (Dopalen,
Agribrands. Saúde Animal, Paulínia, SP, Brasil), associado com 0,05 mL de
cloridrato de xilazina (Rompun, Bayer. Saúde Animal, São Paulo, SP. Brasil) por 100
g de peso corporal. Após a administração da anestesia, a pele da parede abdominal
foi seccionada na base do abdômen, na diagonal, formando um "V". Após o
deslocamento da pele, o acesso à cavidade abdominal foi obtido. Os órgãos internos
foram deslocados para permitir a visualização da veia cava posterior. O sangue foi
colhido por punção da veia cava com agulha 25x7 (Vacutainer - Becton Dickinson,
Plymouth, UK) num tubo de 5 mL.
Após a coleta de sangue os animais foram eutanasiados por excesso de
anestésico, através da aplicação de 0,5 mL de cloridrato de cetamina (Dopalen,
Agribrands, Saúde Animal, Paulínia-SP, Brasil) associado a 0,25 mL de cloridrato de
38
xilazina (Rompun, Bayer. Saúde Animal, São Paulo-SP. Brasil) por 100g de peso
corporal e as mandíbulas foram removidas e fixadas em formol a 10% por 48 horas.
Após esse período de fixação das peças, iniciou-se a tomada das
radiografias, de modo que, o feixe de Raios-X penetrasse na peça cirúrgica
perpendicularmente com tempo de exposição de 0,1s. Todas as radiografias foram
realizadas no mesmo período, como o mesmo aparelho de Raios-X.
As películas foram então processadas em processadora automática
Processadora AT 2000 (Ribeirão Preto – SP, Brasil).
As radiografias (Figura 2) de todos os grupos foram projetadas em tela
branca, com aumento de dez vezes, e os perímetros dos espaços do ligamento
periapical foram demarcados em papel sulfite. Os papéis foram digitalizados e os
perímetros foram mensurados através o programa Imagem Lab 2000 por um
avaliador calibrado que desconhecia os grupos analisados.
Figura 2 - Figura demonstrativa de uma radiografia realizada do Grupo Periodontite Apical Induzida Associada a Sinvastatina.
Para os parâmetros de peso, os animais foram pesados em balança
semianalítica (BL 3200H, Shimadzu, Kyoto, Japão) utilizando-se da diferença entre
as médias dos pesos obtidos no início e no final do experimento.
Para os parâmetros sanguíneos foram verificadas as quantidades de
HDL, VLDL, LDL e triglicerídeos.
39
2.2.3 Métodos de Análises dos Dados
Para análise estatística dos resultados, os dados originais foram
submetidos a testes preliminares, visando verificar a normalidade da amostra, com
auxílio do software IBM- SPSS 20 (IBM). As comparações entre as médias das
imagens, massa c foram efetivadas pela análise de variância univariada (ANOVA)
com teste Post Hoc de Tuckey (comparação entre os grupos – para imagens, massa
corporal e bioquímica), sendo os pressupostos de aderência dos resíduos à
distribuição normal e homogeneidade de variâncias avaliadas pelos testes de
Shapiro–Wilk
Para verificação da calibragem do examinador, utilizou-se teste t de
Student. O grau de significância para todos os testes foi de 5%.
2.3 RESULTADOS
41
2.3 RESULTADOS
Os perímetros dos espaços do ligamento periapical dos primeiros molares
inferiores, foram mensurados. Os resultados demonstram que o GPA teve as
maiores progressões das lesões apicais, seguido pelo GPAS e GC respectivamente,
com diferença estatística entre todos os grupos (p<0,05) - Tabela 1.
Tabela 1 - Médias e Desvios Padrão dos Perímetros dos espaços do Ligamento Periapical. Grupos N Média Desvio padrão
GPAS 12 1543,58* 780,34
GPA 12 3425,20Ŧ 655,51
GC 12 648,50 § 243,55
Os símbolos *, Ŧ e § demonstram diferença estatística entre os grupos. GPAS – Grupo Periodontite Apical associado à Sinvastatina. GPA – Grupo Periodontite Apical. GC – Grupo Controle. (ANOVA de uma via p<0,05).
Em relação à bioquímica sanguínea, percebe-se a ação do fármaco
utilizado no estudo em diversos exames comparado aos GPA e GC. Em relação às
variáveis glicose, triglicerídeos, HDL, e VHDL a medicação demonstra ação direta
comparada aos demais grupos (p<0,05). Ao contrário, para as variáveis Colesterol e
LDL não houve diferenças estatísticas entre os grupos (p>0,05). Tabela 2
Tabela 2 - Médias e desvios padrão dos componentes lipídicos e da glicose mensurados nos exames de sangue dos animais do GPAS, GPA e GC.
Lipidograma Grupos N Média Desvio Padrão
Glicose GC 12 152,46* 26,76
GPAS 10 110,79Ŧ 14,32 GPA 10 145,53* 19,74
Colesterol GC 12 98,80* 20,20
GPAS 10 86,04* 15,02 GPA 10 92,29* 18,10
Triglicérides GC 12 98,90* 19,62
GPAS 10 75,50Ŧ 28,12 GPA 10 93,81* 23,14
HDL GC 12 47,50* 4,57
GPAS 10 43,16* 5,42 GPA 10 30,97Ŧ 7,96
LDL GC 12 31,52* 8,05
GPAS 10 27,73* 14,10 GPA 10 28,61* 11,97
42
Tabela 2 – Médias e desvios padrão dos componentes lipídicos e da glicose mensurados nos exames de sangue dos animais do GPAS, GPA e GC. Continua
Lipidograma Grupos N Média Desvio Padrão
VLDL GC 12 19,78* 3,92
GPAS 10 13,39Ŧ 5,62 GPA 10 15,10Ŧ 3,49
Os símbolos * e Ŧ demonstram diferenças estatísticas entre os grupos. GPAS – Grupo Periodontite Apical associado à Sinvastatina. GPA – Grupo Periodontite Apical. GC – Grupo Controle. (ANOVA de uma via p<0,05). , HDL - Lipoproteína de alta densidade, LDL - Lipoproteína de baixa densidade, VLDL - Lipoproteína de muito baixa densidade.
Em relação ao peso dos animais, houve diferença estatística entre todos
os grupos com a seguinte ordem decrescente GPA; GC e GPAS, (p<0,05). Tabela 3.
Tabela 3 - Médias e desvios padrão das diferenças de peso (em gramas) entre as aferições finais e iniciais dos animais dos GPAS, GPA e GC (N=12).
Grupos Média do Peso Inicial Média do Peso Final
Diferença de Peso Final e Inicial
Desvio padrão
GPAS 213,80 277,02 63,22* 10,96
GPA 218,22 311,28 93,06Ŧ 15,50
GC 216,44 287,56 71,12§ 12,51
Os símbolos *, Ŧ e § demonstram diferença estatística entre os grupos. GPAS – Grupo Periodontite Apical associado à Sinvastatina. GPA – Grupo Periodontite Apical. GC – Grupo Controle. (ANOVA de uma via p<0,05).
2.4 DISCUSSÃO
44
2.4 DISCUSSÃO
A hipótese do trabalho busca uma compreensão da plausibilidade
biológica entre a progressão da doença apical induzida da periodontite apical, com o
uso do fármaco sinvastatina. Esta modulação, conforme demonstrado por estes
resultados, parece oferecer boas e interessantes perspectivas. Considera-se, ainda,
o uso sistêmico conforme utilizado na metodologia deste trabalho, ou até mesmo
com outras formas com o uso local no periodonto apical em futuros trabalhos.
Na atualidade, a obesidade acomete grande parte da população23 e tem
ocasionado sérios problemas relacionados com as doenças cardiovasculares7,
diabetes, doenças renais crônicas, acidentes vasculares encefálicos, além de outras
enfermidades associadas24. Estudos apontam para a relação entre o processo de
inflamação humana e o sobrepeso ou ainda, a obesidade mórbida25. Neste sentido,
parece que as células adiposas, através da produção de interleucinas chamadas de
adipocinas, mais especificamente a resistina, a leptina e a adiponectina, interferem
nos processos inflamatórios ocorridos no organismo26. Pensando a respeito à da
atuação da sinvastatina acredita-se que é possível uma diminuição da inflamação,
exatamente por diminuir a quantidade de colesteróis na corrente sanguínea.
Epidemiologicamente, há na atualidade, uma relação ainda considerada
fraca entre a obesidade e a Odontologia27, mas a plausibilidade desta hipótese
merece maiores evidências para esclarecer este tema28. Assim considera-se uma
grande faixa da população que usa permanentemente o fármaco sinvastatina e isto,
já conduzem a uma significativa diminuição dos colesteróis da corrente sanguínea e
consequente diminuição da inflamação no corpo e complicações médicas ligadas a
obesidade. Imediatamente após este raciocínio, percebe-se o campo de pesquisa na
área do uso da sinvastatina e avaliação de indicadores de saúde bucal acerca das
lesões de origem endodôntica. A relação causa e efeito é uma diminuição dos
mediadores citados em torno de qualquer inflamação no corpo humano, inclusive na
cavidade oral, e o foco do estudo. Suspeita-se de um efeito anti-inflamatório na
doença de origem endodôntica, conforme os resultados encontrados no estudo;
contudo compreende-se ser apenas hipótese os primeiros achados, principalmente
por carência de estudos sobre o tema relacionado a esta relação26-27.
Alterações do aparelho cardiovascular estão associadas à presença de
dislipidemia em todas as partes do mundo29. Para o tratamento destes processos, o
45
medicamento sinvastatina, do grupo das estatinas, tem sido largamente utilizado
pelo custo, fácil acesso e poucos efeitos colaterais30. Este fármaco dentro de suas
funções é capaz de diminuir os lipídeos na corrente sanguínea e tem sido
relacionado a diminuição e modulação do processo inflamatório30, regulação da
apoptose e alteração na função do fibroblastos e neoformação óssea14. Apesar de
não ter estas indicações originalmente, a sinvastatina começa a ser explorada pelas
suas propriedades físicas e químicas na Odontologia32-34. Entretanto, fortes
considerações devem ser exploradas sobre a farmacocinética com objetivo de
potencializar resultados e principalmente segurança na forma de uso.
A este respeito não foram observados efeitos colaterais nos animais.
Neste estudo por protocolo dos pesquisadores sempre se observa o comportamento
do sistema nervoso central através de aparatos de labirinto em cruz elevado e
campo aberto, além de indicadores sistêmicos de consumo de água, alimentação e
sintomas clínicos como a perda de pelo, a diarreia, entre outros sintomas básicos
relacionados a saúde.
A hipótese de que a sinvastatina atua diminuindo a quantidade de
interleucinas inflamatórias, baseia-se na diminuição destes produtos e subprodutos
inflamatórios na corrente sanguínea. Estes são capazes de proporcionar a
diminuição local da inflamação, mesmo diante de um processo infeccioso, a qual
não é indicação do fármaco8,17. Esta característica torna-se importante, pois de
forma geral, parece haver um estímulo do sistema imune capaz de evitar a ação do
biofilme na progressão das doenças infectoinflamatórias35,36. A partir disso, estudos
bem iniciais, mas existentes têm apontado, inclusive, para utilização deste
medicamento no tratamento de doenças como a periodontite apical19-21.
A etiopatogenia da doença endodôntica é desconhecida em muitos
aspectos37. Sabe-se de forma geral que é acometida por um biofilme formado em
grande parte por microrganismos como Cândida albicans, Enterococus faecalis36,
Porphiromona endodontalis39 entre outras. A partir da inserção da sinvastatina neste
processo infecto-inflamatório busca-se, além de maiores esclarecimentos sobre a
ação do fármaco no periodonto, alcançar uma excelência na manipulação da
inflamação apical de forma a propiciar uma modulação do processo de progressão
da doença periapical induzida, a qual no modelo experimental do rato parece ser
plausível e possível conforme fundamentação já apresentada.
46
Metodologicamente, é imprescindível ressaltar que o modelo de indução da
periodontite apical, é amplamente aceito desde o início do uso deste modelo
experimental. Outros fatores relevantes é a facilidade de poder repetir a
metodologia, fácil execução e relativo baixo custo comparado com outras
metodologias18. Com relação à dosagem e forma de administração do fármaco nos
animais, embasamos nosso método em outro artigo 40 e complementado em estudo
piloto.
Outro ponto clínico-laboratorial relevante, é que os indicativos do
lipidograma e da glicose foram alterados, tanto no período do estudo piloto, como
durante a fase experimental propriamente deste estudo. Dentre os achados do
estudo percebeu-se que o processo inflamatório conduziu à mudança significativa
sistemicamente como alteração do peso e do sangue. Este fator demonstra a
capacidade do fármaco em atuar em qualquer processo inflamatório inclusive na
cavidade bucal, como demonstrado. Apesar destes fatores, vale destacar que entre
a coleta e a chegada do sangue no laboratório, ocorreu hemólise de duas amostras
do GPAS e duas do GPA. E, embora nenhum animal tenha tido óbito durante o
experimento, o tamanho da amostra destes grupos diminuiu, apesar de ainda ter
uma força amostral satisfatória.
O método de análise radiográfica utilizada comtemplou todos os requisitos
de padronização. Entre estes cuidados, estão as tomadas radiográficas, no
processamento e leitura dos dados (examinador calibrado). Ao observar as imagens
obtidas do grupo de animais que usaram sinvastatina, de forma geral sempre
apresentaram menor destruição no periápice dental comparado aos ratos que não
fizeram uso da medicação, bem como dos submetidos a indução de periodontite
apical. Claramente, a Sinvastatina demonstrou a modulação para menor do
processo inflamatório apical do dente, fato que impulsiona a elaboração de novas
pesquisas com intuito de tornar este fármaco propriamente ajustado para o uso em
humanos, com indicação de diminuir ou evitar uma inflamação destrutiva na região
do periodonto apical dos elementos dentais.
Ressalta-se que os resultados são consistentes, e o trabalho possibilita
interessante dúvida de como melhor utilizar os mecanismos de ação deste produto,
já estabelecido no mercado, de custos baixos, acessível à população e de efeitos
colaterais diminutos. Diante dos itens descritos, vislumbra-se uma possível indicação
e utilização da sinvastatina para evitar ou diminuir a ação da doença endodôntica.
2.5 CONCLUSÃO
48
2.5 CONCLUSÃO
A partir desta metodologia, foi possível concluir que o uso da sinvastatina
acarretou menores espaços do ligamento apical de dentes submetidos a indução de
doença periapical em ratos.
REFERÊNCIAS DO CAPÍTULO 1
50
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