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JOAQUIM GONÇALVES DE AZEVEDO NETO

Efeito do agonista do receptor da nociceptina/orfanina FQ, Ro65-6570, no

comportamento do tipo ansioso de camundongos desamparados

Dissertação a ser apresentada à

Universidade Federal do Rio

Grande do Norte para obtenção

do título de Mestre em

Psicobiologia.

Natal (RN)

2017




Dissertação apresentada à

Universidade Federal do Rio

Grande do Norte para obtenção

do título de Mestre em

Psicobiologia.

Orientadora: Profa. Dra. Elaine

Cristina Gavioli

Natal (RN)

2017

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de

Biociências – CB

Azevedo Neto, Joaquim Gonçalves de.


comportamento do tipo ansioso de camundongos desamparados / Joaquim Gonçalves

de Azevedo Neto. - Natal, 2017.

68 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de

Biociências, Programa de Pós-graduação em Psicobiologia.

Orientador: Elaine Cristina Gavioli.

1. Estresse - Dissertação. 2. Receptor NOP - Dissertação. 3. Nociceptina -

Dissertação. 4. Desamparo Aprendido - Dissertação. I. Gavioli, Elaine Cristina. II.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 159.944.4




BANCA EXAMINADORA

Prof. Elaine Cristina Gavioli

(Presidente)

Prof. Vanessa de Paula Soares Rachetti

(Examinador Externo ao Programa)

Prof. Mirian Graciela da Silva Stiebbe Salvadori

(Examinador Externo à Instituição)

Natal (RN)

2017

O conhecimento tem um começo, mas não um fim.

(Autor Desconhecido)

Agradecimentos

Gostaria de agradecer a toda minha família, que sempre me apoiou e

acreditou em meu potencial. Em especial ao meu pai e minha mãe, os quais

sempre me incentivaram a estudar e conhecer novas formas de pensamento. À

eles devo tudo o que me tornei hoje e por tal motivo, agradeço, bem como a

minha irmã, sempre demonstrando interesse pelo trabalho por mim realizado,

por mais que não conseguisse compreendê-lo.

À Profa. Elaine, por ter me aceito de forma tão calorosa em seu

laboratório, acreditou em meu potencial e me instigou a investigar, questionar e

atestar observações. Sempre com um ouvido cativo, me ensinou o que é

pesquisa e como ela é feita, me levando a amadurecer, tanto com elogios,

quanto críticas e constatações, quando por momentos não dei o meu melhor.

Lembro-me das suas aulas que assisti, tanto do mestrado como da iniciação a

docência e meu pensamento sempre era em como você é uma profissional

íntegra e competente. É um grande orgulho ter podido conhecê-la melhor e

trabalho com você durante esses 2 anos.

Aos meus amigos, que ouviam minhas reclamações e frustrações quando

por ventura um experimento não ia como esperado ou quando havia alguma

apresentação importante a ser feita. Sempre percebi a forma de vocês me

acolherem e se interessarem com o estudo que realizei, obrigado!

Por fim, ao pessoal do laboratório, com os quais pude conviver por 2 anos

e estreitar laços. Em especial Laila, Victor e Epifânio. Laila por ser uma mentora

que me ensinou os métodos laboratoriais necessários e sempre esteve disposta

a ajudar, bem como Victor, meu companheiro de curso e, durante o mestrado,

de laboratório. Ainda, Layse e Wilton que sempre e eu repito: sempre quiseram

ajudar e participar dos experimentos, das horas de conversas sobre nossas

vidas, apoiando uns aos outros durante as tardes no laboratório.

Muitíssimo obrigado a todos que fizeram esse momento possível.

Dedico esse trabalho a minha família que

sempre me apoiou e acreditou em meu

potencial. A todos os amigos queridos que

padeceram por causa da depressão e

infelizmente não estão mais entre nós. Espero

poder contribuir para a diminuição do

sofrimento de tantas pessoas que lutam

contra essa doença.

Saudades eternas,

Joaquim.

RESUMO

Nociceptina-orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo, que atua como ligante endógeno do receptor NOP. O receptor NOP tem ampla expressão no sistema nervoso e sua ativação induz efeitos inibitórios, causando redução da liberação de neurotransmissores e/ou inibição do disparo neuronal, dependendo do sítio (pré ou pós-sináptico) no qual é expresso. Estudos in vivo têm demonstrado o envolvimento do sistema N/OFQ-receptor NOP na modulação dos estados emocionais. Este estudo visou avaliar os efeitos do agonista NOP, Ro65-6570, sobre as alterações comportamentais de camundongos submetidos a uma situação de estresse incontrolável. Para tanto, foi utilizado o modelo do desamparo aprendido (DA), que emprega eletrochoques, incontroláveis e imprevisíveis, nas patas dos animais como evento estressor para induzir um fenótipo do tipo desamparado, que consiste num déficit do comportamento de escape do compartimento eletrificado. Nem todos os animais expostos ao DA desenvolvem o fenótipo do tipo desamparado, logo, dois grupos distintos foram observados: camundongos desamparados e não-desamparados. Após a exposição ao DA, foram realizados testes para observar as alterações comportamentais que o estresse causou, como labirinto em cruz elevado (LCE), natação forçada e campo aberto. Foi observado efeito ansiogênico do DA nos camundongos desamparados, com diminuição no número de entradas e tempo gasto nos braços abertos do LCE, quando comparados aos grupos não-desamparados e naive. Após essa etapa, foi avaliada a ação do diazepam (1 mg/kg, via i.p.) e do agonista NOP, Ro65-6570 (1 mg/kg, via i.p.), no comportamento do tipo ansioso dos animais desamparados, bem como em sua locomoção. O diazepam foi capaz de reverter o comportamento do tipo ansioso observado no teste do LCE pelos camundongos desamparados, sem prejuízo na locomoção dos animais. De forma similar, a administração de Ro65-6570 também apresentou efeito ansiolítico somente nos camundongos desamparados, sem afetar a atividade locomotora. Em conclusão, este estudo aponta o sistema da N/OFQ-receptor NOP como um alvo terapêutico inovador para o tratamento de transtornos psiquiátricos relacionados ao estresse.

Palavras-chave: nociceptina/orfanina FQ, labirinto em cruz elevado, ansiedade,

receptor NOP, estresse incontrolável, camundongo.

ABSTRACT Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) is a heptadecapeptide, acting as an endogenous ligand of the NOP receptor. The NOP receptor has wide expression in the central nervous system and its activation induces inhibitory effects, causing reduction of neurotransmitters release and/or inhibition of neuronal firing, depending on the site (pre or post-synaptic) in which it is expressed. In vivo studies have showed the involvement of the N/OFQ-NOP receptor system in the modulation of emotional states. This study aimed to evaluate the effects of the NOP agonist, Ro65-6570, on the mouse behavioral changes after an uncontrollable stressful situation due to unpredictable electric footshocks. To achieve this aim, the learned helplessness model (LH) was used as a stressor to induce a helpless behavior. Helpless phenotype consists of a deficit in the escape behavior of the electrified compartment. Not all animals exposed to the LH developed the helpless phenotype, and then two distinct groups were observed: helpless and non-helpless mice. After the LH, tests were performed aimed to identify the behavioral changes induced by stress, such as elevated plus maze (EPM), forced swimming and open field. LH exposure induced anxiogenic-like effects in helpless mice. In fact, when compared to non-helpless and naive controls, helpless mice displayed decreased number of entries and time spent in the open arms of the EPM. After then, the effects of diazepam (1 mg/kg, via ip) and the NOP agonist, Ro65-6570 (1 mg/kg, via ip) were assessed in the anxiogenic-like behavior of helpless mice, as well as in spontaneous locomotion. Diazepam was able to reverse the anxiogenic-related behaviors of helpless mice in the EPM, without affecting locomotion. Similarly, the administration of Ro65-6570 induced anxiolytic effects only in helpless mice, without changes in the locomotor activity. In conclusion, this study supports to the N/OFQ-NOP receptor system as an innovative therapeutic target for the treatment of psychiatric disorders related to stress.

Key-words: nociceptin/orphanin FQ, elevated plus maze, anxiety, NOP receptor,

uncontrollable stress, mouse.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................13

1.1 O estresse e suas implicações fisiológicas ........................................ 16

1.2 Transtornos psiquiátricos relacionados ao estresse. .......................... 19

1.3 Farmacoterapia dos transtornos psiquiátricos relacionados ao estresse 22

1.4 O sistema nociceptina-orfanina FQ – receptor NOP .............................. 23

1.4.1 Papel do sistema da nociceptina/orfanina FQ–receptor NOP na

ansiedade e depressão ............................................................................ 24

2. OBJETIVOS ..............................................................................................28

2.1 Geral ...................................................................................................... 28

2.2 Específicos ............................................................................................ 28

3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................29

3.1 Animais .................................................................................................. 29

3.2 Drogas e tratamentos ............................................................................ 29

3.3 Testes comportamentais ........................................................................ 29

3.3.1 Estresse induzido por eletrochoque incontrolável: modelo do

desamparo aprendido ............................................................................... 29

3.3.2 Labirinto em cruz elevado ................................................................ 30

3.3.3 Teste do campo aberto .................................................................... 31

3.3.4 Teste da natação forçada ................................................................ 31

3.4 Delineamento Experimental ................................................................... 32

3.4.1 Etapa 1: Avaliação do comportamento emocional de camundongos

submetidos a situação de estresse incontrolável, com Labirinto em Cruz

Elevado 24 h após o estresse................................................................... 32


submetidos a situação de estresse incontrolável, com Natação Forçada 24

h após o estresse ..................................................................................... 33

3.4.3 Etapa 3: Investigação do efeito de diazepam e Ro65-6570, agonista

NOP, no comportamento de camundongos submetidos a situação de

estresse incontrolável ............................................................................... 34

3.5 Análise Estatística .................................................................................. 37

4. RESULTADOS ..........................................................................................39

4.1 Etapa 1: Avaliação do comportamento emocional de camundongos

submetidos a situação de estresse incontrolável, com Labirinto em Cruz

Elevado 24h após estresse .......................................................................... 39


submetidos a situação de estresse incontrolável, com Natação Forçada 24 h

após estresse .............................................................................................. 41

4.3 Etapa 3: Investigação do efeito de diazepam e Ro65-6570, agonista

NOP, no comportamento de camundongos submetidos a situação de

estresse incontrolável .................................................................................. 44

5. DISCUSSÃO .............................................................................................48

6. CONCLUSÃO ...........................................................................................56

7. REFERÊNCIAS .........................................................................................57

12

LISTA DE ABREVIAÇÕES

5-HT – Serotonina.

ACTH - Hormônio adrenocorticotrófico.

AMPc - Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico.

BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro.

CRH - Hormônio liberador de corticotrofina.

DA - Desamparo aprendido.

HPA - Hipotálamo-hipófise-adrenal.

I.C.V. – Intracerebroventricular.

I.P. – Intraperitoneal.

LC - Locus coeruleus.

LCE - Labirinto em cruz elevado.

LTE - Labirinto em T elevado.

N/OFQ - Nociceptina/orfanina FQ.

NDR - Núcleo dorsal da rafe.

RNAm - RNA mensageiro.

SNC - Sistema nervoso central.

TEPT - transtorno de estresse pós-traumático.

TNF - Teste da natação forçada.

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema ilustrativo do eixo HPA (Bear et al., 2002). Após o estímulo

estressor, ocorre a liberação de CRH pelos neurônios do núcleo paraventricular

do hipotálamo, o CRH se liga aos receptores da hipófise anterior, promovendo a

síntese e liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) que estimula o

cortéx da glâncula suprarrenal a liberar corticoesteroides na corrente sanguínea,

promovendo mudanças fisiológicas adaptativas.

Figura 2 - Esquema ilustrativo da relação dos glicocorticoides com a diminuição

da expressão de BDNF, que é revertida após tratamento com antidepressivos

(Silva Meleiro et al., 2014).

Figura 3 - Estrutura da prépro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ

em ratos, camundongos e seres humanos (Mogil & Pasternak, 2001).

Figura 4 - Desenho experimental do protocolo 1 para avaliação do

comportamento de camundongos expostos a situação de estresse incontrolável

e submetidos aos seguintes testes comportamentais: labirinto em cruz elevado,

campo aberto e natação forçada.

Figura 5 - Desenho experimental do protocolo 2 para avaliação do

comportamento emocional de camundongos expostos a situação de estresse

incontrolável e submetidos aos seguintes testes comportamentais: natação

forçada, labirinto em cruz elevado e campo aberto.

Figura 6 - Desenho experimental do protocolo escolhido para avaliação do

comportamento de camundongos expostos a situação de estresse incontrolável

(modelo do desamparo aprendido).

Figura 7 – Grupos de animais utilizados para a avaliação do efeito do diazepam

(1 mg/kg) na etapa 3.

Figura 8 – Grupos experimentais empregados na avaliação do efeito do agonista

do receptor NOP, Ro65-6570, na etapa 3.

Figura 9 – Protocolo 1 realizado na Etapa 1 deste estudo para avaliação de

alterações comportamentais decorrentes da exposição ao estresse incontrolável.

14

Figura 10 - Efeito da exposição à situação de estresse incontrolável sobre o

comportamento de camundongos submetidos ao teste do labirinto em cruz

elevado (Protocolo 1): (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b)

Percentagem de entradas nos braços abertos e (c) Frequência de entradas nos

braços fechados do aparato.


comportamento de camundongos submetidos ao teste do campo aberto

(Protocolo 1): (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5

min de observação no aparato.


comportamento de camundongos submetidos ao teste da natação forçada

(Protocolo 1): a) Tempo de imobilidade no cilindro com água.

Figura 13 – Protocolo 2 realizado na Etapa 2 deste estudo para avaliação de

alterações comportamentais decorrentes da exposição ao estresse incontrolável.


comportamento de camundongos submetidos ao teste da natação forçada

(Protocolo 2): a) Tempo de imobilidade no cilindro com água.


comportamento de camundongos submetidos ao teste do labirinto em cruz

elevado (Protocolo 2): (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b)




comportamento de camundongos submetidos ao teste do campo aberto

(Protocolo 2): (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5

min de observação no aparato.

Figura 17 - Efeito do benzodiazepínico diazepam no comportamento de

camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do labirinto

em cruz elevado: (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b)



15

Figura 18 - Efeito do benzodiazepínico diazepam na atividade locomotora dos

camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do campo

aberto: (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5 min

de observação no aparato.

Figura 19 - Efeito do agonista NOP Ro65-6570 no comportamento de

camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do labirinto

em cruz elevado: (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b)



Figura 20 - Efeito do agonista NOP, Ro65-6570, na atividade locomotora dos

camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do campo

aberto: (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5 min

de observação no aparato.

16

1. INTRODUÇÃO

1.1 O estresse e suas implicações fisiológicas

O estresse é um estado decorrente da percepção de estímulos

potencialmente nocivos que perturbam a homeostasia do organismo (McEwen,

2004). Sendo o encéfalo a estrutura principal que caracteriza uma determinada

situação como estressante, estando responsável pelas mudanças

comportamentais produzidas a partir de um evento estressor (McEwen, 2000).

O estresse possui um grande valor adaptativo, uma vez que inicia no organismo

uma mudança em nível fisiológico para a superação de uma situação

desafiadora, com ativação do sistema nervoso autônomo e do eixo hipotálamo-

hipófise-adrenal (HPA), liberação de hormônios e aumento da pressão

sanguínea, preparando assim o organismo para uma situação de luta ou fuga

(McEwen, 2007).

Na resposta inicial ao estresse, o hipotálamo, região basal do diencéfalo,

ativa a divisão simpática do sistema nervoso autônomo, assim como o eixo HPA,

desencadeando alterações fisiológicas para superação do desafio. A ativação do

eixo HPA ocorre a partir da liberação de CRH pelos neurônios do núcleo

paraventricular do hipotálamo, que posteriormente se ligam em receptores da

hipófise anterior, promovendo a síntese e liberação do hormônio

adrenocorticotrófico (ACTH) e a subsequente liberação de corticoesteroides na

corrente sanguínea. O ACTH agirá no córtex da glândula adrenal para facilitar a

liberação de glicocorticoides, tais como o cortisol que preparam o organismo

para reagir ao estímulo estressor, com liberação de estoques energéticos e

supressão da resposta imune (J. Kim & Gorman, 2005). Porém, quando o

estresse se torna crônico, ocorre depósito de gordura abdominal, decorrente de

mudanças no metabolismo da glicose, imunossupressão e problemas

circulatórios, pela ativação constante do sistema nervoso autônomo (Mesquita,

Lobato, Lima, & Brito, 2014)

A elevação de glicocorticoides na corrente sanguínea decorrente de

exposição a uma situação de estresse agudo atua no hipocampo, por este

apresentar quantidades significativas de receptores para glicocorticoides, que

17

uma vez ativados atuam inibindo o eixo HPA e facilitando a formação de

memórias de valor emocional (Radley, 2012). Entretanto, em situações de

estresse crônico, quando os níveis de glicocorticoides permanecem altos, esse

sistema regulatório fica prejudicado, mantendo assim elevado de maneira

prolongada o cortisol plasmático. Em níveis baixos, os glicocorticoides têm maior

afinidade pelos receptores mineralocorticoides do hipocampo, sem apresentar

dano ao tecido, porém, se os níveis séricos de glicocorticoides mantêm-se

elevados (como no caso do estresse crônico), ocorre maior ativação dos

receptores glicocorticoides no hipocampo, que tem ação pró-apoptótica,

podendo causar dano tecidual e subsequente disfunção cognitiva e atrofia

estrutural do hipocampo (Kurek et al., 2016).

Figura 1 - Esquema ilustrativo do eixo HPA (Bear et al., 2002). Após o estímulo

estressor, ocorre a liberação de CRH pelos neurônios do núcleo paraventricular

do hipotálamo, o CRH se liga aos receptores da hipófise anterior, promovendo a

síntese e liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) que estimula o

cortéx da glâncula suprarrenal a liberar corticoesteroides na corrente sanguínea,

promovendo mudanças fisiológicas adaptativas.

18

O estado de alerta observado na resposta ao e)stresse ocorre devido à

ativação, em nível de sistema nervoso central, do locus coeruleus, principal

núcleo noradrenérgico do encéfalo, responsável por produzir resposta

comportamental cardiovascular característica de medo. O locus coeruleus

enerva diferentes regiões límbicas relacionadas à resposta ao estresse, como a

amígdala, hipotálamo, hipocampo e córtex pré-frontal (Galvão-coelho, Nicole

Leite, 2015).

Estruturas corticais mais recentes evolutivamente, como é o caso do

córtex pré-frontal, permitem um processamento mais consciente do estímulo

estressor e uma resposta compatível. Além da noradrenalina, os níveis de

dopamina apresentam-se elevados no córtex pré-frontal em situações adversas,

conferindo ao indivíduo um estado de vigilância e foco (Joëls & Baram, 2009).

Outro neurotransmissor envolvido no comportamento de defesa é a serotonina,

que parece apresentar papel importante na regulação da resposta ao estímulo

estressor, através de ativação de neurônios serotoninérgicos no núcleo dorsal

da Rafe, que inervam, dentre outras estruturas límbicas, a amígdala,

responsável pelo processamento de estímulos nocivos (Shikanai, Kimura, &

Togashi, 2013). Ainda, o GABA (ácido gama-aminobutírico), principal

neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central (SNC), desempenha

papel importante na modulação da resposta ao estresse, inibindo áreas

cerebrais límbicas, como amígdala e hipocampo (McEwen, 2007).

O contato com um evento estressor desequilibra a homeostasia do

organismo, que entra em estado de alostasia, isto é, ocorre a ativação de

mecanismos fisiológicos que visam reestabelecer a homeostasia através de

mudança e resposta à situação estressora (Galvão-coelho, Nicole Leite, 2015).

A alostasia é frequentemente descrita como algo benéfico para o indivíduo, pois

gera uma resposta adaptativa a uma determinada situação. Entretanto, a

ativação dos sistemas alostáticos gera déficit energético para o indivíduo,

chamado de carga alostática (McEwen, 2004, 2007). Em situações de estresse

crônico, a constante ativação dos mecanismos alostáticos leva à sobrecarga

alostática, que pode desencadear em transtornos mentais, a partir da atrofia de

regiões límbicas importantes, como o hipocampo, da desregulação do eixo HPA

19

e seus mecanismos compensatórios e comprometimento da atividade de

neurotransmissores (McEwen & Seeman, 1999; McEwen & Wingfield, 2003).

1.2 Transtornos psiquiátricos relacionados ao estresse

É amplamente reconhecido na literatura que o estresse leva a mudanças

fisiológicas no organismo que, dependendo do nível de ameaça e tempo de

exposição à situação estressora, desencadeiam no indivíduo disfunções que

podem evoluir para um transtorno psiquiátrico (Agid, Kohn, & Lerer, 2000).

Dentre os transtornos mentais relacionados ao estresse, pode-se

destacar transtornos com uma relação mais causal da situação adversa

traumática ou estressante no desenvolvimento da psicopatologia, de modo que

a exposição do indivíduo a um evento adverso traumático ou estressante é

critério de diagnóstico, como o transtorno de estresse agudo e o transtorno de

estresse pós-traumático (TEPT). Essa categoria difere-se da dos transtornos de

ansiedade, pois muitos indivíduos expostos a situações traumáticas

desenvolvem um fenótipo com características clínicas mais relevantes que a

ansiedade em si, como sintomas anedônicos e disfóricos, externalizações de

raiva e agressividade, além de sintomas dissociativos, sendo, portanto,

categorizados como transtornos relacionados a traumas e a estressores.

Ademais, o quadro clínico dessas patologias apresenta uma combinação dos

sintomas mencionados (com ou sem sintomas de ansiedade e medo) (DMS-V,

2013).

A ansiedade patológica é um transtorno psiquiátrico comum, geralmente

associado a sintomas como medo, apreensão, pânico, nervosismo; podendo

acometer também os sistemas cardiovascular, respiratório, gastrointestinal

(Martin, Lewin, & Thompson, 2003). Dentre os transtornos de ansiedade com

maior prevalência na população, segundo a quinta edição do Manual Diagnóstico

e Estatística dos Transtornos Mentais (DSM-V, 2013), destaca-se: transtorno de

pânico, fobia específica, transtorno de ansiedade social, transtorno de ansiedade

generalizada. Os transtornos de ansiedade estão entre as psicopatologias mais

20

prevalentes na população. Uma revisão sistemática recente estimou a

prevalência global do transtorno de ansiedade em 6,7% da população (Steel et

al., 2014). Ainda, a prevalência dos transtornos de ansiedade em mulheres é

significativamente maior que nos homens, segundo (Kessler & Petukhova,

2012).

Outra psicopatologia que pode ser desencadeada pelo estresse é o

transtorno depressivo (J. Kim & Gorman, 2005). De acordo com o DSM-V (2013),

a depressão maior é caracterizada por humor depressivo ou perda de interesse

nas atividades cotidianas. Além disso, o paciente experimenta, pelo menos,

quatro sintomas adicionais de uma lista que inclui: alterações de apetite ou peso,

alterações de sono, diminuição da energia e fadiga, sentimentos de

desvalorização pessoal ou culpa, dificuldades em concentrar-se ou tomar

decisões, pensamentos recorrentes de morte, planos ou tentativas suicidas

(APA, 2013). Estima-se que sua prevalência varie entre 7,1% em países de alta

renda e 6,0% em países de baixa renda (Steel et al., 2014). Com frequência,

ocorre comorbidade entre sintomas ansiosos patológicos e quadros psicóticos

(Fava et al., 2004). A chamada “depressão ansiosa” pode ser caracterizada

como uma manifestação comórbida dos sintomas clássicos de ansiedade em um

paciente com diagnóstico de transtorno depressivo (Fava et al., 2004).

Dentre as hipóteses que visam explicar as bases neurobiológicas dos

transtornos psiquiátricos desencadeados por estresse, é possível destacar a

hiperestimulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) acarretando num

elevado nível de corticosteroides no sangue (McEwen, 2000), bem como

ativação repetida do sistema nervoso autônomo. Ao fim do estímulo estressor, a

resposta autonômica simpática deveria cessar e os níveis sanguíneos de cortisol

voltar ao estado basal, porém caso essa inativação não seja alcançada, a

hiperestimulação desse eixo pode causar consequências patológicas, como

transtornos depressivos, ansiosos, entre outros (J. Kim & Gorman, 2005). Tais

alterações na ativação do eixo HPA promovem de maneira direta e indireta a

disfunção da neurotransmissão monoaminérgica no sistema nervoso central

(SNC), envolvendo principalmente serotonina (5-HT), noradrenalina e dopamina

(C. H. Duman & Duman, 2015).

21

Figura 2 – Esquema ilustrativo da relação dos glicocorticoides com a diminuição

da expressão de BDNF, que é revertida após tratamento com antidepressivos

(Silva Meleiro et al., 2014).

Estudos também demonstraram que o fator neurotrófico derivado do

cérebro (BDNF) parece ter papel importante, já que estímulos estressores

podem diminuir a expressão de BDNF no hipocampo de animais expostos a

situação de estresse incontrolável (R. S. Duman & Monteggia, 2006). Cabe

salientar que a deficiência na disponibilidade de fatores neurotróficos contribui

para alterações neuroanatômicas. De fato, foi observado volume hipocampal

reduzido em pacientes depressivos, proporcional ao tempo de curso da doença,

além da atrofia neural de regiões límbicas fundamentais para o processamento

de emoções (R. S. Duman & Monteggia, 2006; Sapolsky, 2001).

Os transtornos psiquiátricos, sobretudo os desencadeados a partir do

estresse, apresentam complicações fisiológicas passíveis de tratamento através

da farmacoterapia, a fim de reduzir os sintomas e melhor a qualidade de vida

dos pacientes, entretanto, esses fármacos têm limitações na terapêutica que

22

fazem o desenvolvimento por novos compostos muito relevante (Berton &

Nestler, 2006)

1.3 Farmacoterapia dos transtornos psiquiátricos relacionados ao

estresse

Dentre os fármacos utilizados para o tratamento da ansiedade, os

benzodiazepínicos são descritos como ansiolíticos clássicos, os quais

conseguem aliviar agudamente os sintomas patológicos de ansiedade. Os

fármacos da classe dos benzodiazepínicos atuam sobre os receptores GABAA,

que são canais iônicos de Cl- dependentes de ligante regulados pelo

neurotransmissor inibitório GABA e induzem efeitos ansiolíticos e sedativos

(Sieghart, 2006). Por atuar em todo sistema nervoso central, a ação do fármaco

é generalizada e o maior desafio da terapia clínica que faz mão de

benzodiazepínicos é a obtenção de um efeito ansiolítico adequado sem sedação,

incoordenação motora e dependência química (Kent, Mathew, & Gorman, 2002).

Como alternativa aos benzodiazepínicos para tratamento da ansiedade, podem

ser empregados fármacos antidepressivos, que em última análise aumentam a

concentração de monoaminas sinápticas, em especial de 5-HT e noradrenalina

(Nemeroff & Owens, 2002).

Cabe salientar que os antidepressivos também são empregados para o

tratamento da depressão, bem como de transtornos relacionados ao estresse, o

que reforça a ideia de sobreposição das bases neuroanatômicas e

neuroquímicas coenvoltas na mediação destes transtornos psiquiátricos. No

entanto, os atuais fármacos antidepressivos apresentam problemas na

terapêutica, a citar: o elevado tempo para início de seus efeitos sobre o paciente,

fazendo com que muitos só sintam os efeitos adversos sem melhora em seu

quadro psiquiátrico, levando ao abandono do tratamento. Além de apresentar

resposta terapêutica satisfatória após a primeira prescrição de um fármaco

antidepressivo para menos de 50 % dos pacientes deprimidos (Berton & Nestler,

2006).

Por tais motivos, a busca e identificação de novas moléculas com perfil

ansiolítico e antidepressivo, que apresentem efeito terapêutico rápido e poucos

efeitos colaterais, tornam-se necessária (Berton & Nestler, 2006). Para tanto, o

23

estudo dos sistemas neuropeptidérgicos pode representar um alvo promissor

para a identificação de novos fármacos antidepressivos e ansiolíticos (Holmes,

Heilig, Rupniak, Steckler, & Griebel, 2003; Werner & Coveñas, 2013), em

especial o sistema N/OFQ-receptor NOP. Dessa maneira, compostos que

modulem esse sistema podem ter aplicação clínica no tratamento de transtornos

psiquiátricos, já que o uso de antagonistas do receptor NOP induzem efeito

antidepressivo (E. C. Gavioli et al., 2003, 2004; Vitale et al., 2009), enquanto que

seus agonistas promovem ação ansiolítica (Gavioli et al.,, 2002; Jenck et al.,

1997).

1.4 O sistema nociceptina-orfanina FQ – receptor NOP

A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo

(FGGFTGARKSARKLANQ), com estrutura semelhante à dinorfina A, sendo o

ligante endógeno seletivo do receptor NOP. Embora a N/OFQ apresente uma

estrutura química semelhante aos opioides endógenos, este peptídeo não se liga

aos receptores opioides e, nem tampouco, os ligantes opioides apresentam

afinidade pelo receptor NOP (Cox et al., 2000). Porém, considerando as

semelhanças estruturas, a nociceptina/orfanina FQ e seu receptor pertencem à

grande família dos opioides. Em nível celular, o receptor NOP é um receptor

acoplado à proteína G que quando ativado reduz a entrada de Ca+2, eleva o

efluxo de K+ e leva a redução da produção de AMPc (Connor, Vaughan, Chieng,

& Christie, 1996; Vaughan & Christie, 1996). Desse modo, a ativação de

receptores NOP evoca efeitos inibitórios, causando redução da liberação de

neurotransmissores (Schlicker & Morari, 2000) e, dependendo do local do

receptor (seja esse pré- ou pós-sinápticos), pode diminuir a taxa de disparo dos

neurônios (Heinricher, 2003).

24

Figura 3 - Estrutura da prépro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ

em ratos, camundongos e seres humanos (Mogil & Pasternak, 2001).

Foi observado que o receptor NOP é amplamente expresso no sistema

nervoso central, em especial no prosencéfalo, sistema límbico, regiões olfatórias,

tálamo e em diversas áreas relacionadas a estímulos emocionais. O receptor

NOP é encontrado também nos núcleos serotoninérgicos, dopaminérgicos e

noradrenérgicos, como núcleos da Rafe, locus coeruleus, núcleo do trato

solitário, área tegumentar ventral e substância nigra (Mollereau et al., 1994; Neal

et al., 1999). Entretanto, o precursor da N/OFQ, a proteína pré-pró-nociceptina

(ppN/OFQ) é mais expressa em regiões límbicas (Boom et al., 1999) .Um padrão

similar de expressão de N/OFQ e do receptor NOP foi observado em roedores e

humanos (Peluso et al., 1998). Estudos in vivo demonstraram que a N/OFQ

modula uma variedade de funções biológicas, como estado emocional,

transmissão de dor, aprendizado e memória, atividade locomotora, dependência

química, motilidade gastrointestinal e resposta imune (Lambert, 2008).

1.4.1 Papel do sistema da nociceptina/orfanina FQ–receptor NOP na ansiedade

e depressão

Muitos estudos apontam os neuropeptídios e seus receptores como alvos

para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da ansiedade e

depressão (Holmes et al., 2003; Werner & Coveñas, 2013). Ratos com mutações

em genes que codificam esses neuropeptídios ou seus receptores trouxeram

novas evidências do papel do sistema peptidérgico na modulação de transtornos

afetivos (Holmes et al., 2003).

25

Diversos estudos pré-clínicos apontam para um efeito do tipo ansiolítico

induzido pela ativação do receptor NOP (Gavioli & Calo, 2006). Dentre estes

estudos, destaca-se o primeiro deles no qual foi observado que a administração

intraventricular de N/OFQ entre doses de 0,1 e 3 nmol gerou aumento do tempo

gasto em compartimentos iluminados, além de aumentar o número de punições

em testes de conflito operante e o tempo gasto em espaços aberto por roedores

(Jenck, 1997). Também convém destacar que o agonista não-peptídico do

receptor NOP, Ro64-6198, promoveu resposta do tipo ansiolítica no teste do

labirinto em cruz elevado (Jenck et al., 2000). Experimentos utilizando dois

antagonistas distintos para o receptor NOP demonstraram que a administração

aguda deles não modifica os níveis de ansiedade em roedores (Gavioli & Calo,

2006). Entretanto, Duzzioni e colaboradores (2011) demonstraram que a

administração do antagonista UFP-101 foi capaz de gerar efeitos do tipo

ansiolítico em roedores expostos ao Labirinto em T Elevado (Duzzioni, Duarte,

Leme, Gavioli, & Lima, 2011).

Além disso, um estudo mais recente demonstrou que a administração do

antagonista NOP, JTC-801 foi capaz de reverter o comportamento do tipo

ansioso induzido por estresse prolongado, indicando uma possível ação

ansiolítica induzida pelo bloqueio do receptor NOP (Zhang, Simpson-Durand, &

Standifer, 2014). Evidências na literatura sugerem que a ação ansiolítica da

N/OFQ poderia ocorrer devido à modulação do sistema monoaminérgico.

Estudos in vitro demonstraram que o N/OFQ inibe a liberação de

neurotransmissores (Schlicker & Morari, 2000), incluindo 5-HT e noradrenalina,

intrinsecamente relacionados no controle da ansiedade e medo (Millan, 2003;

Risbrough & Stein, 2006).

Redrobe e colaboradores (2002) foram os primeiros a observar que a

administração de antagonistas do receptor NOP induziu efeito do tipo

antidepressivo em camundongos no teste da natação forçada (Redrobe, Calo’,

Regoli, & Quirion, 2002). Estudos posteriores confirmaram esse efeito do tipo

antidepressivo em roedores (Gavioli et al., 2003; 2004). Dentre os efeitos

antidepressivos, foi observado em roedores que a administração aguda de

antagonistas do receptor NOP, tanto peptídicos, como UFP 101 e

[Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2, quanto não peptídicos, como J-113397, SB-612111 e

26

LY2940094, reduziram o tempo de imobilidade na tarefa da natação forçada e

da suspensão pela cauda, sugerindo um efeito antidepressivo (Gavioli et al.,

2003; 2004; Gavioli e Calo´, 2006). Vitale et al. (2009) demonstraram que a

administração crônica de antagonistas do receptor NOP foi capaz de reverter as

mudanças comportamentais e bioquímicas (aumento da concentração de

corticosterona e mudanças nos níveis de 5-HT) observadas em ratos expostos

ao modelo de estresse crônico variado de maneira similar ao antidepressivo

imipramina (Vitale et al., 2009). Recentemente, o nosso grupo de pesquisa

mostrou que o bloqueio do receptor NOP, induzido farmacologicamente por

antagonistas como o SB612111 e o UFP-101, foi capaz de reduzir a latência

para o escape e o número de escapes, semelhante ao efeito induzido pelo

antidepressivo nortriptilina (Holanda et al., 2016). A redução no tempo de

imobilidade foi vista em animais tratados com SB-612111 submetidos ao teste

de natação forçada (Asth et al., 2016) e no teste de suspensão pela cauda após

a indução de comportamento do tipo depressivo com a administração de LPS

(Medeiros et al., 2015). Ainda, evidências genéticas também indicam que a

sinalização endógena do N/OFQ-NOP está envolvida em situações de

desespero comportamental em roedores. Em camundongos knockout para o

gene do receptor NOP (NOP-/-) houve redução no tempo de imobilidade no teste

de suspensão pela calda e natação forçada quando comparados aos animais

selvagens (NOP+/+) (Gavioli et al., 2003; 2004). Além disso, Rizzi et al. (2011)

demonstrou que ratos knockout para esse receptor também apresentam um

fenótipo do tipo antidepressivo. Estudos com animais knockout para receptor

NOP mostraram ainda que o efeito antidepressivo dos antagonistas NOP

desaparecia quando tais drogas foram administradas nestes animais (Gavioli et

al., 2003). Cabe também salientar que um estudo pré-clínico recente, publicado

em 2015, observou alívio dos sintomas depressivos após 8 semanas de

tratamento com o LY2940094, um antagonista do receptor NOP (Post et al.,

2015).

Além do papel biológico já descrito para os ligantes NOP na mediação de

estados ansiosos e depressivos, diversos estudos sugerem que o sistema da

nociceptina/orfanina FQ atue na regulação das respostas ao estresse. Para

tanto, sistemas considerados como grandes vias de manutenção da

27

homeostasia durante o estresse, como o eixo HPA e o sistema nervoso

autônomo, parecem ser modulados pelo sistema da nociceptina/orfanina FQ

(para revisão Fulford, 2015). Estudos in vivo utilizando infusões de N/OFQ

demonstraram que este pepídeo é capaz de regular a expressão de CRF no

hipotálamo e que antagonistas do receptor NOP prolongaram a resposta do eixo

HPA ao estresse agudo por contenção (Leggett, Jessop, & Fulford, 2007). Ainda,

foi observado que o estresse modula os níveis endógenos de N/OFQ e diminui

a expressão de RNAm do receptor NOP (Delaney et al., 2012; Leggett, Dawe,

Jessop, & Fulford, 2009). Em um estudo utilizando a técnica de eletrofisiologia

ex vivo observou-se que diante de um evento estressor, a ativação do receptor

NOP é capaz de suprimir com maior eficiência a frequência de disparos de

neurônios serotoninégicos no núcleo dorsal da Rafe (Nazzaro et al., 2009),

sugerindo que adaptações induzidas pelo estresse no sistema da N/OFQ alteram

a neurotransmissão serotoninérgica.

Diante do acima exposto, o sistema da N/OFQ – receptor NOP

desempenha um papel importante tanto na resposta ao estresse, como nas

patologias a ele associadas. Por tal motivo, mecanismos que elucidem a

modulação desse sistema são de extrema importância e devem ser estudados.

Diferentes modelos animais de estresse devem ser utilizados para uma melhor

compreensão de como o sistema da N/OFQ - receptor NOP interage com a

circuitaria neuronal e contribui para o desenvolvimento de transtornos

psiquiátricos. Em última instância, estudos nesta área contribuem para o

desenvolvimento de novos fármacos com maior eficácia, sobretudo no

tratamento de doenças com alta prevalência na população, como é caso de

psicopatologias relacionadas ao estresse, visto que os medicamentos

atualmente utilizados na clínica apresentam limitações em seus efeitos

terapêuticos.

28

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

O presente estudo tem como objetivo estudar o efeito da ativação do

receptor NOP nos comportamentos relacionados à ansiedade e depressão de

camundongos submetidos a sessões de eletrochoques incontroláveis.

2.2 Específicos

1. Investigar se animais submetidos a situação de estresse incontrolável

apresentam modificações nos comportamentos relacionados à

ansiedade e depressão, bem como alteração locomotora;

2. Avaliar o efeito do fármaco tradicionalmente utilizado na clínica para

alívio de sintomas da ansiedade, diazepam, no comportamento de

animais submetidos à situação de estresse incontrolável;

3. Estudar o efeito do agonista do receptor NOP, Ro65-6570, no

comportamento de camundongos naive e daqueles submetidos à

situação de estresse incontrolável.

29

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram empregados camundongos Swiss machos (30-35 g) provenientes

do biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte. Os animais foram alojados em, no máximo, 12

por caixa 33 x 40 x 16 cm com livre acesso a comida e água e mantidos em um

ciclo de 12 horas luz-escuro (luzes acessas às 6:00 h), com uma temperatura de

23±1oC. Todos os procedimentos experimentais feitos de acordo com as

recomendações da Lei 11.794 de 08/10/2008 (Lei Arouca) e aprovado pelo

Comitê de Ética no Uso de Animais/UFRN (Protocolo N°061/2016).

3.2 Drogas e tratamentos

Para a realização deste estudo, foram utilizadas as seguintes drogas:

Diazepam (1 mg/kg, ip, 30 min antes do teste, solubilizado em salina), um

fármaco benzodiazepínico, com a finalidade de estabelecer um controle

positivo para futuras comparações de efeito ansiolítico;

Agonista NOP: Ro65-6570 (1 mg/kg, ip, 30 min antes do teste, diluído em

DMSO 1%), de acordo com Asth e colaboradores (2016).

O agonista NOP foi doado pelo Prof. R. Guerrini (Dept. of Biotechnology

and Pharmaceutical Chemistry, University of Ferrara, Itália).

3.3 Testes comportamentais

3.3.1 Estresse induzido por eletrochoque incontrolável: modelo do desamparo

aprendido

O desamparo aprendido foi realizado em camundongos Swiss machos. O

teste do desamparo aprendido utiliza uma shutlle box, composta por dois

30

compartimentos (50 x 30 x 30 cm) separados por uma porta-guilhotina (12 x 25

cm). A shuttle box foi confeccionada em acrílico preto, enquanto no piso existem

barras de aço inoxidável (0,3 cm de largura e 1 cm de distância), local onde são

disparados os choques elétricos. A sessão de indução do desamparo foi

realizada no dia 1, no qual os animais foram submetidos a 180 sessões de

choques elétricos inescapáveis na pata (0,5 mA, 20 s de duração com intervalos

médios entre as tentativas de 15 s - variando de 10-20 s).

A sessão de screening ocorreu 24 h após a sessão de indução (dia 2)

sendo composta de 30 ciclos de 20 s cada. Cada ciclo é dividido em dois blocos

de 10 s, no primeiro bloco o animal recebe aleatoriamente, dentro desse

intervalo, um eletrochoque, com duração variável de 1 a 10 s. O segundo bloco

é o período de descanso para o animal com duração de 10 s. Na sessão de

screening, a porta que conecta os dois compartimentos da shuttle box

permanece aberta e são considerados em desamparo aprendido os

camundongos que falharem em mais de 20 tentativas em sair do comportamento

no qual receberam o choque elétrico. Os animais que não entrarem em

desamparo também foram utilizados no experimento, porém são considerados

animais não-desamparados.

No dia 3, os animais foram divididos em grupos (desamparados, não-

desamparados e controles naive) e os fármacos diazepam, Ro65-6570, salina

ou veículo (quando necessário) foram administrados antes dos testes

comportamentais. Os testes do campo aberto, labirinto em cruz elevado e

natação forçada foram, então, realizados com o intuito de avaliar se os

tratamentos poderiam modular as alterações comportamentais observadas em

decorrência da exposição ao estresse. O grupo controle passou por todas as

etapas do experimento, mas foram tratados com salina (ou veículo, de acordo

com a droga em teste) para efeito de comparação.

3.3.2 Labirinto em cruz elevado

O labirinto em cruz elevado é um aparato feito em madeira e consiste em

dois braços abertos (30x6 cm) e dois braços fechados de mesmo tamanho e com

31

paredes de 15 cm de altura (30x6x16 cm). Ambos os braços partem de uma

plataforma central (5x5 cm) e são elevados igualmente do chão (40 cm). Cada

camundongo foi, então, posicionado no centro do labirinto, com a cabeça voltada

para o braço aberto e foi permitida a exploração do aparato por 5 minutos. Foi

considerada a entrada em algum dos braços, quando as quatro patas do animal

cruzarem o dado braço. Durante cada exposição, foram registrados os seguintes

comportamentos: número de entradas e tempo gasto nos braços abertos e

fechados. As porcentagens de entradas e de tempo nos braços abertos foram

calculadas e utilizadas como parâmetros indicativos do comportamento do tipo

ansioso. O número de entradas nos braços fechados foi utilizado como

parâmetro indicativo da atividade locomotora. Entre as exposições de cada

animal, o aparelho foi limpo com uma solução diluída de álcool 5%.

3.3.3 Teste do campo aberto

O teste de campo aberto consiste em um quadrado delimitado (40 cm x

40 cm), com paredes de 40 cm de altura confeccionado em acrílico preto. Cada

animal foi colocado individualmente no aparato e sua atividade motora foi

monitorada por 30 minutos, divididos em blocos de 5 minutos, através do

software ANY-MAZE (Stoelting Co., EUA). Após os 30 minutos, os animais foram

retirados e o aparato foi limpo com álcool 5%. A distância percorrida (em metros)

no campo foi registrada.

3.3.4 Teste da natação forçada

A tarefa da natação forçada foi realizada como previamente descrita por

Porsolt et al. (1977). Resumidamente, consiste em colocar os camundongos

individualmente em cilindros de vidro (altura 18,5 cm, diâmetro 12,5 cm)

contendo água (23°C ±1°C) para um teste de natação. Ao final de cada sessão

de natação, o animal foi removido do cilindro, colocado em uma caixa forrada

com papel por 15 min, e após este período retornou para a caixa moradia. A

água do cilindro foi trocada após a avaliação comportamental de cada animal. O

32

tempo de imobilidade (tempo no qual o animal permanece flutuando, fazendo

apenas os movimentos necessários para manter sua cabeça acima da água), é

um parâmetro previamente validado para detectar os efeitos antidepressivos das

drogas nesta tarefa (Detke et al., 1995) e este comportamento foi registrado para

cada animal.

3.4 Delineamento Experimental


submetidos a situação de estresse incontrolável, com Labirinto em Cruz Elevado

24 h após o estresse

Os animais foram expostos a uma situação de estresse incontrolável e

inescapável, constituída por choques nas patas, como descrito acima. Conforme

ilustrado na figura 4, a partir do dia 3, o comportamento dos mesmos animais foi

avaliado nos testes do labirinto em cruz elevado, campo aberto (dia 4) e natação

forçada (dia 5), respeitando um intervalo de 24 h entre os testes, para os

seguintes grupos abaixo:

- Animais controle naive, que não passaram pelo estresse incontrolável;

- Animais desamparados, que passaram pelo estresse incontrolável e

desenvolveram o fenótipo desamparado;

- Animais não-desamparados, que passaram pelo estresse incontrolável e não

desenvolveram o fenótipo desamparado.

Neste estudo, cerca de 70 % dos animais que foram submetidos ao

paradigma de choques nas patas apresentaram o fenótipo desamparado.

33

Figura 4 - Desenho experimental do protocolo 1 para avaliação do comportamento de camundongos expostos a situação de estresse incontrolável e submetidos aos seguintes testes comportamentais: labirinto em cruz elevado, campo aberto e natação forçada.



após o estresse

Os animais foram expostos a uma situação de estresse incontrolável e

inescapável, constituída por choques nas patas, conforme descrito

anteriormente. Considerando que na primeira etapa deste estudo, o teste da

natação forçada foi realizado no último dia de experimentos (dia 5), optou-se por

testar o efeito de outro protocolo, no qual o teste da natação forçada foi realizado

24 h após o modelo de desamparo aprendido (dia 3). Conforme ilustrado na

Figura 5, o comportamento dos animais submetidos ao estresse foi avaliado da

seguinte forma: teste da natação forçada (dia 3), labirinto em cruz elevado (dia

4) e campo aberto (dia 5), respeitando um intervalo de 24 h entre os testes, nos

seguintes grupos abaixo:

- Animais controle naive, que não passaram pelo estresse incontrolável;

- Animais desamparados, que passaram pelo estresse incontrolável e

desenvolveram o fenótipo desamparado;

34

- Animais não-desamparados, que passaram pelo estresse incontrolável e não

desenvolveram o fenótipo desamparado.

Figura 5 - Desenho experimental do protocolo 2 para avaliação do comportamento emocional de camundongos expostos a situação de estresse incontrolável e submetidos aos seguintes testes comportamentais: natação forçada, labirinto em cruz elevado e campo aberto.

3.4.3 Etapa 3: Investigação do efeito de diazepam e Ro65-6570, agonista NOP,

no comportamento de camundongos submetidos a situação de estresse

incontrolável

Após o desenvolvimento das etapas 1 e 2, concluiu-se que as alterações

comportamentais decorrentes da exposição a estresse incontrolável foram

melhor avaliadas no protocolo 1, para tanto a figura 6 ilustra o protocolo adotado

para a investigação dos efeitos dos fármacos sobre o comportamento dos

camundongos submetidos a estresse incontrolável.

35

Figura 6 - Desenho experimental do protocolo escolhido para avaliação do comportamento de camundongos expostos a situação de estresse incontrolável (modelo do desamparo aprendido).

Na etapa 3 foi estudado o efeito do diazepam, comumente utilizados na

clínica para alívio da ansiedade, bem como o agonista NOP, Ro65-6570, no

comportamento dos animais expostos ao estresse. Os animais foram

primeiramente expostos a uma situação de estresse incontrolável e inescapável,

constituída por choques nas patas, conforme descrito anteriormente (modelo do

desamparo aprendido). A partir do dia 3, o comportamento dos mesmos animais

foi avaliado nos testes do labirinto em cruz elevado (dia 3) e campo aberto (dia

4), respeitando um intervalo de 24 h entre os testes. O teste da natação forçada,

por não detectar alteração significativa no comportamento de animais controle

naive, desamparados e não-desamparados foi excluído do protocolo adotado

nesta etapa.

A fim de estudar o efeito do diazepam, nos dias 3 e 4 do protocolo

experimental foi realizado o tratamento com o benzodiazepínico (1 mg/kg) e seu

respectivo controle, 30 min antes do teste comportamental, por via

intraperitoneal, conforme ilustrado na Figura 7.

Os grupos experimentais empregados nesta etapa foram:

- Animais desamparados - que passaram pelo estresse incontrolável e

desenvolveram o fenótipo desamparado:

- salina;

- diazepam 1 mg/kg;

36

- Animais não-desamparados – que passaram pelo estresse incontrolável e não


- salina;

- diazepam 1 mg/kg.

Figura 7 – Grupos de animais utilizados para a avaliação do efeito do diazepam (1 mg/kg) na etapa 3.

Visando investigar o efeito do agonista NOP, Ro65-6570, nos dias 3 e 4

do protocolo experimental adotado, os animais foram tratados com Ro65-6570

(1 mg/kg) ou seu respectivo controle, administrados por via intraperitoneal, 30

minutos antes do teste do labirinto em cruz elevado e campo aberto, respeitando

um intervalo de 24 h entre os testes.

Os grupos experimentais empregados nesta etapa (figura 5) foram:

- Animais controle naive – que não passarem por experiência estressante antes

dos testes comportamentais (labirinto em cruz elevado e campo aberto):

- veículo;

- Ro65-6570 1 mg/kg;

37

- Animais desamparados - que passaram pelo estresse incontrolável e


- veículo;

- Ro65-6570 1 mg/kg;

- Animais não-desamparados – que passaram pelo estresse incontrolável e não


- veículo;

- Ro65-6570 1 mg/kg;

Figura 8 – Grupos experimentais empregados na avaliação do efeito do agonista do receptor NOP, Ro65-6570, na etapa 3.

3.5 Análise Estatística

Os dados apresentados neste trabalho foram reportados como média ±

erro padrão da média. Os dados foram inicialmente submetidos ao teste de

Kolmogorov-Sminorv para avaliar a normalidade e ao teste de Levene para

avaliar a homogeneidade de variância. As comparações entre os grupos tratados

e controle foram feitas por meio do teste t ou por meio do teste ANOVA de uma

via, seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni, a depender do número de grupos

que foram comparados. Foi empregado o teste de ANOVA de duas vias para

38

avaliação do efeito do Ro65-6570 nos animais submetidos ao teste do

desamparo aprendido; neste caso os dois fatores analisados foram: tratamento

(veículo e Ro65-6570) e condição (desamparado e não-desamparado). O teste

estatístico utilizado para cada série experimental está descrito na legenda das

figuras. Valores de p<0,05 foram considerados significativos. Para estas análises

foi utilizado o software Graphpad Prism.

39

4. RESULTADOS


submetidos a situação de estresse incontrolável, com Labirinto em Cruz Elevado

24h após estresse

Tendo em vista que o estresse incontrolável pode gerar alterações

comportamentais nos camundongos a ele expostos, foram testados os efeitos

de dois protocolos, que diferiam em relação a sequência dos testes

comportamentais empregados.

Figura 9 – Protocolo 1 realizado na Etapa 1 deste estudo para avaliação de alterações comportamentais decorrentes da exposição ao estresse incontrolável.

O protocolo 1 (figura 9) consistiu na exposição do animal a situação de

estresse incontrolável, seguido pelos testes comportamentais de labirinto em

cruz elevado, campo aberto e natação forçada. Após a sessão de screening no

dia 2, os animais foram separados em 2 grupos (desamparados e não-

desamparados). No dia 3, o comportamento dos animais desamparados e não-

desamparados, bem como do grupo controle naive, foi avaliado no teste do

labirinto em cruz elevado.

Como ilustrado na figura 10, o percentual de tempo gasto nos braços

abertos é significativamente menor nos camundongos desamparados quando

comparados ao grupo controle naive (Fig. 7a; F(2,32)= 4,012, p<0,05, n=5-15).

Os parâmetros de percentual de entrada nos braços abertos e a frequência de

entrada nos braços fechados não apresentaram diferença significativa entre os

grupos (Fig. 10b,c; p>0,05).

40

Contr

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ampar

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Não

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Figura 10 - Efeito da exposição à situação de estresse incontrolável sobre o comportamento de camundongos submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado (Protocolo 1): (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b) Percentagem de entradas nos braços abertos e (c) Frequência de entradas nos braços fechados do aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15 animais por grupo. ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni. *p<0,05 vs. controle naive.

No dia 4 do protocolo 1, a atividade locomotora dos animais foi

quantificada através do teste do campo aberto. A figura 8 mostra o efeito do

estresse incontrolável na atividade locomotora dos animais no teste do campo

aberto. Não houve diferença significativa entre os grupos analisados nos

parâmetros de distância total percorrida em 30 minutos e a distância percorrida

nos primeiros 5 minutos de teste (Fig. 11a,b; p>0,05).

Contr

ole

Des

ampar

ados

Não

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20

40

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)


comportamento de camundongos submetidos ao teste do campo aberto (Protocolo 1): (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5 min de observação no aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15 animais por grupo. ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni.

41

No dia 5 do protocolo 1, os animais foram submetidos ao teste da natação

forçada. Como mostrado na Figura 12a, não houve diferença significativa entre

os grupos no parâmetro tempo de imobilidade.

Contr

ole

Des

ampar

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Não

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ados

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50

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200

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e (

s)

Figura 12 - Efeito da exposição à situação de estresse incontrolável sobre o comportamento de camundongos submetidos ao teste da natação forçada (Protocolo 1): a) Tempo de imobilidade no cilindro com água. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15 animais por grupo. ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni.



após estresse

Visto que no protocolo 1 não foi encontrada diferença entre os grupos no

teste da natação forçada, foi proposto um segundo protocolo, no qual o teste da

natação forçada foi realizado 24 horas após a sessão de screening do

desamparo aprendido (dia 3).

42

Figura 13 – Protocolo 2 realizado na Etapa 2 deste estudo para avaliação de alterações comportamentais decorrentes da exposição ao estresse incontrolável.

No dia 2 de experimentos, os animais que foram submetidos ao estresse

incontrolável e, de acordo com o comportamento expresso, foram separados em

grupos desamparados e não-desamparados, conforme explanado na

metodologia. O teste da natação forçada foi realizado no dia 3 de experimentos,

nos animais desamparados, não desamparados e nos controles naive. Como

ilustrado na figura 14a, não foi observado diferença significativa para o parâmetro

tempo de imobilidade entre os grupos estudados.

Contr

ole

Des

ampar

ados

Não

-des

ampar

ados

0

50

100

150

(a)

Tem

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comportamento de camundongos submetidos ao teste da natação forçada (Protocolo 2): a) Tempo de imobilidade no cilindro com água. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15 animais por grupo. ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni.

No dia 4 de experimentos foi realizado o teste do labirinto em cruz

elevado. Diferentemente do protocolo 1, os camundongos submetidos a esse

teste não apresentaram diferença estatística entre os grupos na percentagem de

tempo gasto nos braços abertos, assim como nos demais parâmetros avaliados:

percentagem de entradas nos braços abertos e número de entradas nos braços

fechados (Figura 15a, b, c; p>0,05).

43

Contr

ole

Des

ampar

ados

Não

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ampar

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0

10

20

30

40

(a)

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ad

os

Figura 15 - Efeito da exposição à situação de estresse incontrolável sobre o comportamento de camundongos submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado (Protocolo 2): (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b) Percentagem de entradas nos braços abertos e (c) Frequência de entradas nos braços fechados do aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15 animais por grupo. ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni.

No dia 5 de experimentos, foi realizado o teste de campo aberto. Como

mostrado na figura 16, animais expostos a situação de estresse incontrolável,

em comparação cm controles naive, não apresentaram alteração nos

parâmetros de distância total percorrida em 30 minutos e distância percorrida

nos 5 primeiros minutos do teste (Fig. 13a,b; p>0,05).

Contr

ole

Des

ampar

ados

Não

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0

20

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(a)

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25

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0-5

min

(m

)

Figura 16 - Efeito da exposição à situação de estresse incontrolável sobre o comportamento de camundongos submetidos ao teste do campo aberto (Protocolo 2): (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5 min de observação no aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15 animais por grupo. ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni.

44

4.3 Etapa 3: Investigação do efeito de diazepam e Ro65-6570, agonista NOP, no

comportamento de camundongos submetidos a situação de estresse

incontrolável

Após a testagem dos protocolos 1 e 2, foi possível identificar a sequência

de testes comportamentais mais apropriada para dar continuidade aos estudos

que visam investigar os efeitos do diazepam e do Ro65-6570 no comportamento

de camundongos após exposição ao estresse. Portanto, ao serem submetidos

estresse incontrolável, os animais foram separados em dois grupos, de acordo

com seu comportamento, desamparados e não-desamparados. No dia 3 de

experimentos, diazepam 1 mg/Kg (i.p.) foi administrado 30 minutos antes dos

testes do labirinto em cruz elevado (dia 3) e campo aberto (dia 4).

O tratamento com diazepam promoveu aumento significativo na

percentagem de tempo gasto nos braços abertos (Fig. 17a, tratamento:

F(1,16)=5,27, p<0,05, condição: F(1,16)=11,54, p<0,05) e de entradas nos

braços abertos dos camundongos desamparados quando comparados aos

animais desamparados tratados com salina (Fig. 17b, tratamento: F(1,16)=6,07,

p<0,05). Não foi observada nenhuma alteração no número de entradas nos

braços fechados do aparato (Fig. 17c, p>0,05). Além disso, nesta série

experimental foi possível observar que a percentagem de tempo gasto nos

braços abertos em animais desamparados foi significativamente menor

comparado aos camundongos não-desamparados (Fig. 17 a, p<0,05).

Desamparados Não-desamparados0

20

40

60

80

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Diazepam 1mg/kg(a)

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os

Figura 17 - Efeito do benzodiazepínico diazepam no comportamento de camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do labirinto em cruz elevado: (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b) Percentagem de entradas nos braços abertos e (c) Frequência de entradas nos braços fechados do aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15

45

animais por grupo. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. *p < 0,05 vs. salina. &p < 0,05 vs. não-desamparado.

Para avaliar o efeito da administração de diazepam na atividade

locomotora dos animais, o teste comportamental do campo aberto foi realizado

no dia 4 de experimentos. Como visto na Figura 18, a administração de diazepam

tendeu a reduzir a atividade locomotora acumulada durante os 30 min de teste

dos camundongos não-desamparados (Fig. 18a, tratamento: F(1,16)= 4,28, p =

0,06 vs. salina). Entretanto, quando comparou-se a distância percorrida nos

primeiros 5 minutos de teste concluiu-se que não há diferença significativa nos

grupos avaliados (Fig. 18b, p>0.05).


20

40

60

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Salina

Diazepam 1mg/kg(a)

&

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min

(m

)

Figura 18 - Efeito do benzodiazepínico diazepam na atividade locomotora dos camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do campo aberto: (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5 min de observação no aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 5-15 animais por grupo. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. &p = 0,06 vs. salina.

Neste estudo avaliou-se também o efeito da administração de agonista NOP,

Ro65-6570, nos animais ao modelo de desamparo aprendido. Após a sessão de

screening (dia 2) os camundongos foram separados em dois grupos:

desamparados e não-desamparados. Um grupo de animais que não havia sido

submetido ao estresse incontrolável também foi acrescentado ao estudo

(controle naive). No terceiro dia de experimentos foi administrado Ro65-6570 1

46

mg/kg (i.p.), 30 minutos antes da realização dos testes do labirinto em cruz

elevado (dia 3) e campo aberto (dia 4).

Conforme ilustrado na figura 19, a administração de Ro65-6570 aumentou

de maneira significativa a percentagem de tempo gasto nos braços abertos

somente nos animais desamparados quando comparados aos desamparados

tratados com veículo (Fig. 19a, tratamento: F (2,42) = 5,46, p<0,05). Observou-

se também que o percentual de entradas nos braços abertos dos animais

desamparados tratados com o Ro65-6570 foi estatisticamente diferente dos

camundongos desamparados tratados com veículo (Fig. 19b, tratamento: F

(2,42) = 6,42, p<0,05). No entanto, não foi observada diferença estatística entre

os grupos avaliados no número de entradas nos braços fechados (Fig. 19c,

p>0,05).

Controle Desamparados Não-desamparados0

10

20

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40

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Ro65-6570 1,0 mg/kg

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Figura 19 - Efeito do agonista NOP Ro65-6570 no comportamento de camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do labirinto em cruz elevado: (a) Percentagem de tempo gasto nos braços abertos, (b) Percentagem de entradas nos braços abertos e (c) Frequência de entradas nos braços fechados do aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 7-15 animais por grupo. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. *p < 0,05 vs. veículo.

No dia 4 de experimentos, o agonista do receptor NOP, Ro65-6570, foi

administrado nos animais desamparados, não-desamparados e controle naive

30 min antes da avaliação da atividade locomotora no teste do campo aberto.

Como apresentado na figura 20, não houve diferença estatística entre os grupos

tratados com o agonista NOP quando comparados aos camundongos que

receberam veículo (Fig. 20a, p>0,05). Entretanto, ao avaliar os primeiros 5

minutos de teste, os animais não-desamparados administrados com o agonista

47

percorreram uma distância significativamente menor do que os camundongos

tratados com veículo (Fig.20 b, tratamento: F (2,42) = 5,99, p>0,05).


20

40

60

80

100

Veículo

Ro65-6570 1mg/kg(a)

Dis

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perc

orr

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5

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Veículo

Ro65-6570 1mg/kg(b)

*

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0-5

min

(m

)

Figura 20 - Efeito do agonista NOP, Ro65-6570, na atividade locomotora dos camundongos expostos à situação de estresse incontrolável no teste do campo aberto: (a) Distância percorrida em 30 min e (b) Distância percorrida em 5 min de observação no aparato. Cada coluna representa a média ± EPM de 7-15 animais por grupo. ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni. *p < 0,05 vs. veículo.

48

5. DISCUSSÃO

O estudo em questão teve como objetivo analisar as alterações

comportamentais em camundongos submetidos ao modelo desamparo

aprendido, para tanto, foram empregadas duas sequências distintas de testes

comportamentais, denominadas de protocolo 1 e 2. No primeiro protocolo de

experimentos foi observada alteração no comportamento dos camundongos no

teste do labirinto em cruz elevado, mas não no teste de natação forçada.

Considerando que no protocolo 1, o teste da natação forçada foi realizado 72 h

após o estresse de choques nas patas, no protocolo 2 empregou-se uma

sequência de testes distinta, no qual a natação forçada foi realizada 24 horas

após o estresse. No protocolo 2 também não foram observadas diferenças no

tempo de imobilidade no teste da natação forçada dos camundongos

desamparados e não-desamparados comparados ao controles naive. Como não

foram observadas alterações no comportamento dos camundongos no teste da

natação forçada em decorrência do estresse em nenhum dos dois protocolos

testados, optou-se por remover este teste dos experimentos subsequentes.

Cabe mencionar que semelhante aos nossos achados, num estudo

recente, Kim & Yang (2017) não observaram alterações comportamentais nos

testes de suspensão pela cauda e natação forçada em camundongos

submetidos ao desamparo aprendido comparado a animais controles. No

entanto, diversas evidências na literatura sugerem que exposição ao estresse

favorece o aparecimento de comportamentos relacionados à depressão,

sobretudo em condição de estresse crônico. De fato, Swiergiel & Dunn (2008)

constataram que camundongos expostos cronicamente a choques nas patas

apresentaram maior tempo de imobilidade no teste da natação forçada. Ainda,

camundongos submetidos a um modelo de estresse imprevisível, no qual os

animais foram expostos cronicamente a diferentes tipos de estressores

apresentaram maior tempo de imobilidade no teste da natação forçada que os

controles (Biala et al., 2016; Gazal et al., 2014). Após estresse crônico por

contenção, Zhang et al. (2014) e Chiba et al. (2012) também observaram o

aparecimento de comportamento do tipo depressivo em roedores, com aumento

no tempo de imobilidade no TNF.

49

É interessante destacar que os testes de desespero comportamental, por

mais que estes sejam amplamente utilizados para screening de novos

compostos com ação antidepressiva, evidenciando sua validade preditiva, a eles

não são atribuídas às validades de face e constructo (Abelaira, Réus, &

Quevedo, 2013), o que poderia explicar o fato de não ter sido observado

nenhuma alteração no TNF dos animais que passaram pelo estresse

incontrolável de choques nas patas. Ainda, Molendijk & Kloet (2015) propuseram

que a imobilidade avaliada no TNF deve ser considerada como uma

consequência natural de aprendizado após a exposição aguda ao estresse da

natação forçada, ao invés de considerar essa imobilidade como indicação de

desespero comportamental ou comportamento do tipo depressivo. Por fim, o

protocolo de desamparo aprendido utilizado no presente estudo consiste em

apenas uma sessão de estresse incontrolável, não podendo ser atribuído a ele

um caráter de estresse crônico. Possivelmente, como supracitado, modelos de

estresse crônico podem ser mais eficazes na indução de alterações

comportamentais em testes de desespero comportamental.

No presente estudo, observou-se, no entanto, que os camundongos

desamparados apresentaram comportamento do tipo ansioso no LCE 24 h, mas

não 48 h, após as sessões de choques nas patas quando comparados aos

controles naive, o que está de acordo com as observações de Kim e Yang

(2017), sugerindo um efeito de curta-duração sobre o comportamento do tipo

ansioso dos animais estressados. Kim e Yang (2017) interpretam que o

desamparo aprendido aplicado de forma aguda parece ser eficaz em ativar as

vias de estresse (por exemplo, eixo HPA e sistema nervoso autônomo), sem

apresentar alterações comportamentais sustentadas comumente observadas

em modelos animais de estresse crônico (Zhang et al. 2015; Chiba et al., 2012),

o que explicaria o fato de só observar o efeito do tipo ansiogênico no LCE nas

24 h, mas não nas 48 h, subsequentes à exposição ao aparato.

O modelo do desamparo aprendido é um modelo validado na literatura

que utiliza o estresse incontrolável como indutor de alterações comportamentais

que podem estar relacionadas às alterações observadas em pacientes

diagnosticados com depressão maior (validade de face) (Bougarel et al., 2011;

Pryce et al., 2011). Ratos expostos a esse modelo comportamental desenvolvem

50

alterações, como perda de peso, mudanças no padrão de sono e na atividade

do eixo HPA (Abelaira et al., 2013). Além disso, o comportamento do tipo ansioso

observado nos animais desamparados corrobora com a validade de face do

modelo do desamparo aprendido, visto que existe grande comorbidade entre

transtornos de ansiedade e depressão maior (Fava et al., 2004).

Com base nos resultados obtidos na etapa 1 e 2 deste estudo, definiu-se

o sequência de testes ideal para avaliação do efeito do diazepam e Ro65-6570

no comportamento do tipo ansioso induzido pela exposição ao estresse

incontrolável. Foi observado que a administração de diazepam reverteu o

comportamento ansioso dos animais com fenótipo desamparado, mas não foi

capaz de afetar de maneira significativa o comportamento dos animais não-

desamparados. Ainda, por apresentar um perfil inibitório sobre o sistema nervoso

central, o diazepam pode induzir efeito sedativo nos animais, com diminuição da

atividade locomotora, o que influenciaria a interpretação dos dados no LCE.

Cabe salientar que o tratamento com diazepam não afetou a distância

percorrida dos animais desamparados no campo aberto, o que assegura um

efeito genuíno do diazepam em reduzir a ansiedade dos camundongos

desamparados sem, no entanto, interferir com a locomoção espontânea dos

animais. Já nos animais não-desamparados, foi observada tendência a

hipolocomoção após o tratamento com diazepam, o que poderia justificar a

ausência de efeito ansiolítico desse fármaco nos camundongos não-

desamparados. Outra possível explicação a ser mencionada para a ausência de

efeito ansiolítico do diazepam nos animais não-desamparados é a diferença de

fenótipo entre os camundongos desamparados e não-desamparados no LCE.

De fato, observou-se que camundongos desamparados tendem a ser mais

ansiosos se comparados aos não-desamparados. Sendo assim, o

comportamento de base de camundongos não-desamparados no parâmetro

porcentagem de tempo nos braços abertos é próximo ao teto máximo de efeito,

i.e. 50 %, o que dificultaria a detecção de uma possível ação ansiolítica induzida

por fármacos nestes animais.

O diazepam apresenta um efeito ansiolítico largamente descrito na

literatura, liga-se com afinidade sobre o sítio de ligação benzodiazepínico dos

receptores GABA, aumentando a resposta inibitória desse neurotransmissor

51

sobre a circuitaria neural, o que atuaria atenuando a resposta fisiológica ao

estresse, como visto no presente trabalho. Semelhante aos dados do presente

estudo, Sánchez e colaboradores (1997) observaram que o diazepam foi capaz

de reverter o comportamento do tipo ansioso observado em camundongos

expostos a estresse comportamental antes do teste, como suspensão pela

cauda e choque em patas. Ainda, Li e Murakami (2006) demonstraram que o

diazepam foi capaz de reverter os déficits comportamentais de camundongos

submetidos a um modelo de choque em patas. Ramirez et al., (2016) observou

que camundongos expostos a um modelo de estresse por derrota social repetida

desenvolveram um comportamento do tipo ansioso que foi revertido com o uso

de benzodiazepínicos.

No presente estudo investigou-se também o efeito do agonista do receptor

NOP Ro65-6570, 1 mg/kg, no comportamento do tipo ansioso desenvolvido

pelos animais com fenótipo desamparado após exposição ao modelo de

desamparo aprendido. Semelhante ao diazepam, a administração do Ro65-6570

foi capaz de reverter o comportamento ansioso de camundongos desamparados,

mas não afetou o comportamento dos animais não-desamparados e dos

controles naive. Com o intuito de avaliar o efeito da administração de Ro65-6570

na atividade locomotora dos camundongos, foi realizado o teste do campo

aberto. Nenhuma alteração na atividade locomotora foi observada nos animais

desamparados e controles naive com relação ao grupo veículo correspondente.

Entretanto, a administração Ro65-6570 teve efeito hipolocomotor nos

camundongos não-desamparados nos primeiros 5 minutos de teste, o que

poderia em parte justificar a ausência de efeito ansiolítico do Ro65-6570 nesses

animais. Ainda, cabe mencionar que o tratamento com Ro65-6570 1 mg/kg nas

nossas condições experimentais não afetou o comportamento dos controles

naive, ou seja, naqueles animais não submetidos a sessão de estresse.

A ação ansiolítica da N/OFQ e de agonistas do receptor NOP é bem

descrita na literatura, com a maioria das publicações apontando para um efeito

do tipo ansiolítico de maneira comparável aos fármacos convencionais, como

diazepam (Mallimo & Kusnecov, 2013). Tanto a administração de N/OFQ por via

icv (Jenck et al., 1997; Vitale et al., 2006; Gavioli et al., 2008), quanto de

agonistas não-peptídicos do receptor NOP administrados sistemicamente via

52

i.p.(Hirao et al., 2008; Varty et al., 2005) promoveram efeitos ansiolíticos em

roedores. Dentre os estudos que utilizaram agonistas não-peptídicos, destaca-

se o que observou ação ansiolítica do tipo dose-dependente do agonista Ro65-

6570, testado nas doses de 0,01, 0,03 e 1,0 mg/kg (i.p.), no teste do LCE, sem

no entanto causar prejuízo na locomoção dos camundongos (Asth et al., 2016).

Assim como observado na clínica, a exposição a situações estressoras

pode desencadear um estado de depressão em alguns indivíduos, enquanto

outros mostram-se resilientes ao estresse indutor e não desenvolvem nenhuma

patologia associada (Landgraf et al., 2015). Essa resistência ao estímulo

estressor está associada à eficácia cerebral em encontrar uma forma de superar

a situação desafiadora. Um estudo recente realizado por Kim e colaboradores

em 2016 mapeou as áreas cerebrais ativadas em camundongos desamparados

quando comparados aos animais não-desamparados. Seus achados mostraram

que os camundongos desamparados tiveram, de forma geral, menor ativação

neuronal, visto através da expressão de proteína Fos, em nível de sistema

nervoso central, em especial em áreas córtico-límbicas quando comparados aos

animais não-desamparados, com exceção do locus coeruleus, o qual foi mais

ativado nos camundongos que desenvolveram fenótipo do tipo desamparado.

O locus coeruleus é o principal núcleo encefálico de onde partem as

projeções de neurônios noradrenérgicos para todo o córtex e sistema límbico. A

partir dos achados na literatura, pode-se inferir que a alta ativação de regiões

corticais em animais não-desamparados, confere a eles resistência aumentada

ao estímulo estressor, culminando numa resposta de combate ao estresse mais

eficaz (e.g., maior número de escapes no desamparo aprendido), enquanto que

os animais que falham em escapar e desenvolvem fenótipo do tipo

desamparado, apresentam maior atividade do núcleo noradrenérgico, o que

pode estar relacionada ao comportamento do tipo ansioso e à ativação do eixo

HPA.

É notório o papel do sistema noradrenérgico na resposta ao estresse, bem

como na patogênese de transtornos psiquiátricos relacionados ao estresse

(Bradley & Lenox-Smith, 2013; Gold, 2014; Krishnan & Nestler, 2010). O sistema

da N/OFQ – receptor NOP produz ação modulatória sob a neurotransmissão

noradrenérgica, visto que tanto a N/OFQ quanto seu receptor NOP são

53

expressos no locus coeruleus e estudos in vitro demonstraram que a N/OFQ é

capaz de evocar efeitos inibitórios na liberação de noradrelina no córtex de

roedores (Okawa, Kudo, Kudo, & Guerrini, 2001; Rominger et al., 2002;

Siniscalchi et al., 2002), reduzindo também os níveis de noradrenalina no córtex

pré-frontal de ratos acordados (S. Yoshitake et al., 2013). Considerando os

achados de Kim e colaboradores (2016) que observaram maior expressão de

proteína Fos no locus coeruleus de camundongos desamparados comparado

aos não desamparados, o efeito ansiolítico do agonista NOP - Ro65-6570 - nos

animais desamparados e a ação inibitória sobre a neurotransmissão

noradrenérgica decorrente da ativação do receptor NOP, pode-se propor que o

agonista NOP induziu efeito ansiolítico somente em animais desamparados por

afetar a neurotransmissão noradrenérgica.

Evidências na literatura sugerem que a ação ansiolítica da N/OFQ poderia

ocorrer devido à modulação das monoaminas e também ao antagonismo da

ação do CRF. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que o N/OFQ inibe a

liberação de neurotransmissores, incluindo 5-HT e noradrenalina (Gavioli e

Calo’, 2013), neurotransmissores intrinsecamente relacionados ao controle da

ansiedade e medo (Millan, 2003). Além disso, o eixo HPA é um sistema

endógeno importante na resposta ao estresse e apresenta-se desregulado tanto

em transtornos de ansiedade como na depressão maior (Bale et al., 2002).

Os receptores CRF são necessários para uma resposta em nível

periférico (sistema nervoso autônomo) de estímulos estressores, para suportar

o comportamento de “fuga ou luta”, como mobilizar estoques de energia

(Dallman, Pecoraro, & La Fleur, 2005). Estudos demonstraram que o CRF

modula diversos sistemas de neurotransmissores, tais como glutamato,

dopamina, serotonina e noradrenalina (Commons & Valentino, 2003). Foi

observado que a administração i.c.v. de CRF em animais produz respostas do

tipo ansiogênicas (Chalmers et al., 1995; Lovenberg et al., 1995). Rodi e

colaboradores (2008) mostraram que a administração i.c.v. de N/OFQ bloqueia

o efeito ansiogênico do CRF, sugerindo ação de antagonista funcional do CRF

pela N/OFQ, já que ela não se liga aos receptores CRF (Rodi et al., 2008). Para

tanto, a ação ansiolítica observada pelos agonistas NOP pode ser mediada por

uma interação funcional entre os sistemas do CRF e da N/OFQ.

54

Estudos observaram que durante o estresse agudo, ocorrem

modificações do sistema NOP em estruturas límbicas relacionadas à resposta

ao estresse. Um estudo avaliou o papel do estresse na expressão de receptores

NOP no sistema nervoso central, no qual ratos expostos a um modelo agudo de

derrota social apresentaram elevação na expressão de RNAm decodificante do

receptor NOP na amígdala central e basolateral (Green & Devine, 2009). Ainda,

o estresse agudo por contenção elevou a expressão endógena de N/OFQ no

hipocampo de ratos (Nativio et al., 2012). Esses dados indicam que a exposição

a situações estressoras modifica a expressão de N/OFQ em regiões límbicas,

tornando o sistema da N/OFQ mais eficiente.

No presente estudo a administração do agonista NOP apresenta efeito

ansiolítico apenas nos camundongos desamparados, possivelmente pela maior

expressão de N/OFQ e/ou receptor NOP em áreas límbicas, evento esse

decorrente do estresse. Deste modo, a ação ansiolítica do agonista NOP

observada apenas nos animais desamparados ocorre possivelmente devido à

amplificação do sinal mediado pelo receptor NOP, podendo, em última análise

inferir, que a sinalização do receptor NOP encontra-se mais eficaz nos animais

sensíveis ao estresse incontrolável, i.g., camundongos desamparados.

O paradigma do desamparo aprendido parece ser uma ferramenta de

estudo de transtornos psiquiátricos de muita aplicabilidade, na qual é possível

analisar tanto o comportamento dos animais que desenvolvem o fenótipo do tipo

desamparado, quanto dos animais capazes de desenvolver estratégias para

escapar do estresse incontrolável. Por tal motivo, um número crescente de

estudos com o objetivo de avaliar essas alterações é observado. Apesar do

esforço em analisar as condições que levam alguns animais a desenvolver o

fenótipo do tipo desamparado e outros não, esse mecanismo permanece incerto.

Para tanto, novos estudos devem ser realizados, afim de aumentar as

informações sobre esse tipo de modelo animal.

Como o modelo do desamparo aprendido é um modelo animal de

depressão, o qual, como observado nesse estudo, gera um comportamento do

tipo ansioso nos animais, parece necessária a investigação de como outros

compostos podem afetar o comportamento observado. Sobretudo dos ligantes

do receptor NOP, em especial os antagonistas, apresentados na literatura como

55

compostos de ação antidepressiva e, mais recentemente, com ação ansiolítica

em modelo de estresse crônico (Zhang et al., 2015). Para tanto, pretendemos

ainda realizar experimentos com o intuito de observar a ação do antagonista do

receptor NOP, SB612111, no comportamento do tipo ansioso observado nos

animais desamparados expostos ao modelo do desamparo aprendido, com a

intenção de entender melhor o efeito modulatório do sistema da N/OFQ –

receptor NOP sob o comportamento ansioso de camundongos expostos ao

estresse incontrolável.

56

6. CONCLUSÃO

Em conclusão, o protocolo experimental definitivo proposto para as

nossas condições experimentais, com quatro dias de experimentos, constituídos

de dois dias de paradigma de desamparo aprendido e dois dias de testes

comportamentais foi eficaz para avaliar as alterações comportamentais

observadas nos camundongos que desenvolveram o fenótipo do tipo

desamparo, apresentando um comportamento do tipo ansioso no teste do

labirinto em cruz elevado, sem apresentar qualquer alteração do teste do campo

aberto. Constatando que os camundongos com menor número de escape

desenvolveram um comportamento do tipo ansioso e que os camundongos não-

desamparados não apresentaram esse comportamento, assim como os animais

naive, não expostos ao modelo.

A partir do comportamento do tipo ansioso no LCE pelos camundongos

desamparados, fez-se necessária a investigação de um ansiolítico clássico no

comportamento observado. A administração do benzodiazepínico diazepam foi

capaz de reverter o comportamento dos animais desamparados, aumentando o

número de entradas e tempo gasto nos braços abetos do aparato de maneira

significativa, sem induzir déficit locomotor nos animais, atestando seu efeito

ansiolítico.

A administração do agonista não-peptídico do receptor NOP, Ro65-6570,

foi eficaz em produzir efeito ansiolítico nos camundongos desamparados,

aumentando tanto o tempo gasto quanto o número de entradas nos braços

abertos do LCE de forma significativa quando comparados aos animais tratados

com veículo. Ainda, o agonista NOP não produziu efeito hipolocomotor nos

camundongos desamparados, atestando sua ação ansiolítica.

Por fim, este estudo aponta o sistema da N/OFQ-receptor NOP como um

alvo terapêutico inovador para o tratamento de transtornos psiquiátricos

relacionados ao estresse, o que corrobora em futuro para a melhoria da

qualidade de vida de pacientes, nos quais os fármacos atualmente utilizados são

pouco eficientes e/ou produzem efeitos adversos significativos.

57

7. REFERÊNCIAS

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