Análise Instrumental Avançada

Espectroscopia de Infravermelho Espectrometria de Massas

Profa. Dra. Sonia A. Andrade Chudzinski

Prof. Dr. Erick Polleti

Espectroscopia de Infravermelho e Espectrometria de Massa

Objetivos:

• Ensaio de composição • Qualidade do produto final • Pesquisa e desenvolvimento de novos produtos • Instrumentação

Conteúdo Programático - IV

• Introdução à técnica/aplicações• Teoria da espectrometria de absorção na região do

Infravermelho.• Modos de vibração e deformação• Interações acopladas.• Ligação de hidrogênio.• Instrumentação• Preparação de amostras.• Interpretação de espectros.

Conteúdo Programático - MS

• Espectroscopia de massas/Aplicação• Introdução à técnica.• Teoria da espectrometria de massas.• O espectro de massa e interferências• Determinação da fórmula molecular.• Reconhecimento de picos.• Padrões de fragmentação • Preparação de amostras.• Interpretação de espectros.

Metodologia

• Aulas expositivas.

• Estudo de artigos científicos que utilizam as técnicas estudadas.

• Interpretação de espectros.

• Resolução de problemas.

• Visita a um laboratório de Pesquisa nessas áreas.

Cronograma

• 13/08 - Princípios e Aplicações de MS• 20/08 – Aula Prática MS• 27/08 - Princípios e Aplicações/Exercícios sobre MS• 03/09 -Princípios e Aplicações de IR• 10/09 – Prática IR• 17/09 -Princípios e Aplicações/Exercícios sobre IR• 24/09 -Avaliação Teórica/prática• 01/10 -Resultados Avaliação e Revisão/Discussão de artigos

• Técnica analítica, utilizada para identificar e quantificar compostos conhecidos e elucidar a estrutura e a propriedade química de moléculas

Espectrometria de Massa

• Aplicações:

• Detectar e identificar o uso de substancias por atletas

Análises judiciais (abuso de drogas)• Determinar como as drogas são metabolizadas pelo corpo• Monitorar a respiração de pacientes por anestesistas durante a

cirurgia• Diagnóstico de Cancer o outras doenças• Biotecnologia: Proteomica• Monitorar processos industriais• Análise de poluentes

Espectrometro de massas

É um instrumento que separa íons, positivos ou negativos, produzidos a partir de átomos ou moléculas de acordo com a

razão massa/carga (m/q)

•Vaporização da amostra (amostras voláteis/termolábeis)

• Ionização da fase gasosa (bombardeamento com feixe de elétrons)Ex: C6H5CH2CH3 + e- C6H5CH2CH3

+ + 2 e- (etilbenzeno) (íon molecular)

•Relaxação/fragmentação

•C6H5CH2+ / atraídos por uma fenda/selecionados

•Separação dos íons de acordo com massa/carga(m/z)

Mecanismo

Espectro de massa - Etilbenzeno

Pico base – tem arbitrariamente o valor de intensidade 100

Como funciona? Existem diversos modelos de espectrômetros que diferem quanto à fonte de ionização ou quanto ao analisador de massas

Componentes básicos de um espectrômetro

Ionizador• MALDI• Electrospray (ESI)

Amostra

+_

Analisador de Massa• Tempo de vôo (TOF)• Quadrupolo• Ion-Trap

Detector

Espectrometria de Massas

Métodos de Ionização

• O ponto de partida para uma análise por espectrometria de massa é a formação de íons gasosos do analito.

•O espectro de massa de uma certa espécie molecular é altamente dependente do método usado para a formação dos íons.

•Fontes de íons:

Tipo Básico Nome Agente Ionizante

Fase gasosa Impacto de elétrons (EI) Elétrons energéticos

Ionização Química (CI) Íons gasosos reativos

Ionização por campo (FI) Eletrodo com alto potencial

Dessorção Dessorção por campo (FD) Eletrodo com alto potencial

Ionização por eletronebulização (ESI) Campo elétrico elevado

Dessorção/ionização com laser auxiliada por matriz (MALDI)

Feixe de laser

Bombardeio com átomos rápidos (FAB) Feixe atômico energético

Espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)

Feixe de íons energéticos

Ionização por termonebulização Alta temperatura

Fontes de íons para a Espectrometria de Massa Molecular

Impacto de Electrons

H-C:HH

H+ e H-C

H

HH + 2e

CATION

CH4

H-CH

HH

H-CH

H+ + H

H-CH

HH++

CATIONRADICALClivagem -Ligação

Um elétron de alta energia pode retirar um elétron da ligação, criando um radical cátion (Um íon positivo com e- desemparelhado).

Espectro de Massa

100%

50%

43

58

71114

m/e

ion molecular

Isótopos picos - P+1, P+2, etc

note: 114-71 = 43

note: 43 = massa do radical

Pico base – 100%100%

50%

43

58

71114

m/e

Tipo Básico Nome e Acrônimo Agente Ionizante

Fase gasosa Impacto de elétrons (EI) Elétrons energéticos

Ionização Química (CI) Íons gasosos reativos

Ionização por campo (FI) Eletrodo com alto potencial

Dessorção Dessorção por campo (FD) Eletrodo com alto potencial

Ionização por eletronebulização (ESI) Campo elétrico elevado

Dessorção/ionização com laser auxiliada por matriz (MALDI)

Feixe de laser

Bombardeio com átomos rápidos (FAB) Feixe atômico energético

Espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)

Feixe de íons energéticos

Ionização por termonebulização Alta temperatura

Fontes de íons para a Espectrometria de Massa Molecular

ESI (Electrospray ionization)

Gás nebulizador N2 Análise massa

+ 3.500 V

Eletrodo

IONIZAÇÃO

ESI (Electrospray ionization)

http://www.youtube.com/watch?v=K-GhE1uWoV4

• As amostras são embebidas em uma matrix

• A ionização ocorre através da emissão de um laser

MALDI (Matrix laser assisted desorption/ionization) - Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser

Matrix (uv absorbing)cyano-4-hydroxy cinnamic acid

peptídeo

Placa MALDI

Placa

espelho

LASER

++

++

++

++

+

+

- ve

- ve

MALDI

Analisadores de Massas

Detector

Quadrupolo

AmostraVoltagens

Íon ressonante

Íon não ressonante

QUADRUPOLO• Seleciona determinadas m/z

http://www.youtube.com/watch?v=8AQaFdI1Yow

Analisador de massa

TOF ( Time of Flight) – “Tempo de vôo”

+

++

++

+

++ +

Íons - amostra Detector

Distância fixa

Mais leveMais pesado

Tempo de vôo menor

Tempo de vôo maior

Ìons com a mesma energia cinética Vácuo

Analisador de massa

Espectro de massa - Etilbenzeno

Pico base – tem arbitrariamente o valor de intensidade 100

Espectrometria de Massas em tandem – MS/MS

Célula de colisão: o íon 237 é fragmentado em íons menores

Íons selecionados passam pelo MS-2

Detecção

• Analisadores de massa são conectados em série

• Ideal para amostras complexas (maior sensibilidade)

• Fragmentação de peptídeos – Célula de Colisão (Gás Argônio)

MS-1

O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. MS1 é uma fonte de íons para MS2.

MS2

MS1Cromatografia líquida : íons totais

Quadrupole-Time Of Flight Mass Spectrometry (Q-TOF MS)

Quadrupolo(MS1)

Célula de colisão

Argon

detector

Aceleração - TOF

(MS2)

Dr Kevin MillsInstitute of Child Health, UCL, London

Espectrometria de Massas em tandem – MS/MS

Digestão enzimática

MS1

Fracionamentocromatografia

Seleção do íon precursor

Espectrometria de Massas em tandem – MS/MSPrimeira Espectrometria de

Massa (MS-1)

Seleção do íon precursor

+ fragmentação

MS/MS

Segunda Espectrometria de Massa

• Pares de íons : complementariedade de sequência

a/xb/yc/z

Fragmentação de Peptídeos

Dependendo no tipo de quebra que ocorre (tipo de ligação que é quebrada), tem-se a produção de determinados íons:

• Íons C terminal : a, b, c• Íons N terminal: x, y, z

íons resultantes da quebra das ligações peptídicas !

Fragmentação de Peptídeos

• As ligações peptídicas são as menos energéticas, assim espera-se que a formação do par de fragmentos b/y seja mais frequente que os demais pares de fragmentos

íon yíon b

• Devido às diferenças na força das ligações, diferentes íons ocorrem em diferentes proporções

MW ion ion MW

88 b1 S GFLEEDELK y9 1080

145 b2 SG FLEEDELK y8 1022

292 b3 SGF LEEDELK y7 875

405 b4 SGFL EEDELK y6 762

534 b5 SGFLE EDELK y5 633

663 b6 SGFLEE DELK y4 504

778 b7 SGFLEED ELK y3 389

907 b8 SGFLEEDE LK y2 260

1020 b9 SGFLEEDEL K y1 147

Peptídeo: S-G-F-L-E-E-D-E-L-K

Fragmentação de Peptídeos

100

0250 500 750 1000

m/z

% I

nte

nsit

y

K1166

L1020

E907

D778

E663

E534

L405

F292

G145

S88 b ions

147260389504633762875102210801166 y ions

Fragmentação de Peptídeos

37

100

0250 500 750 1000

m/z

% I

nte

nsit

y

K1166

L1020

E907

D778

E663

E534

L405

F292

G145

S88 b ions

147260389504633762875102210801166 y ions

y7

y2 y3 y4

y5

y8 y9

b3

b5 b6 b7b8 b9

b4

y6

Fragmentação de Peptídeos

A E P T I R

M/z

Inte

nsity

A E P

A

A E

A E P T

72.0201.1

298.1399.2

Íons fragmentados

Determinação da sequência

• Analisa o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer a seqüência do peptídeos

M/z

Inte

nsity

A E P T I R

72.0 129.0 97.0 101.0 113.1 174.1

A-0 AE-A AEP-AE

AEPT-AEP

AEPTI-AEPT

AEPTIR-AEPTI

Workflow para análise MS/MS

• Não utiliza Gel

•Combinação da cromatografia líquida com a espectrometria de massas

• Ideal para misturas complexas de proteínas

• Identificação de proteínas básicas

• Identificação de proteínas de baixa expressão

• A mistura de proteínas é digerida e separada por cromatografia líquida seguida da identificação dos peptídeos através da MS/MS

• Envolve uma série de processos de separação de misturas.

• A cromatografia acontece pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.

Mixtura de Peptídeos

Separação dos

peptídeos

Conc

entr

ação

de

elue

nte

UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatogragphy)

acoplado ao espectrômetro de massa (Q-TOF)

- alta pressão

- microcapilares

Proteômica Shotgun

• Cromatrografia ligada em série com espectrômetro

Cromatografia Líquida ligada em série com o espectrômetro de massa

Melhor separação

A) Coluna usada na cromatografia tradicional (HPLC)

B) Microcapilar usada em UPLC

A

B

Combinações de colunas com fases estacionárias diferentes: troca catiônica / hidrofóbica

ou

troca aniônica / hidrofóbica

Digestão Troca iônica

SCX RP

Fase reversa

2D-LC

Espectrometria de massas

• Cromatografia Multidimensional (2D-LC) - MudPit

Cromatografia Líquida ligada em série com o espectrômetro de massa

•Cromatografia Multidimensional

• As colunas são acopladas ortogonalmente

• Frações da primeira coluna são seletivamente transferidas para a segunda coluna para uma separação adicional

Análise dos dados - Bioinformática

Proteína Peptídeos proteolíticos Espectro de massa

Espectro de massa Teórico

Peptídeos proteolíticos teóricos

Sequência da proteína

As proteínas devem ser completamente solubilizadas e desnaturadas

Solubilização:

• Quebra das interações (interações não covalentes e pontes dissulfeto)

• Prevenir a degradação de proteínas

• Reduzir componentes não protéicos

• Agentes redutores

• Agentes Caotrópicos

• Detergentes

Paba et al (2003) Proteomics.

Uréia + Tiouréia : melhor solubilização!

Preparação da Amostra

• Remoção de sais

- Interferem diretamente no processo eletroforético

- Causam zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminuição do campo elétrico.

- Nessa zonas, as proteínas não focalizam e aparecem como faixas

Separação das Proteínas

Gel 2DGel 1D Cromatografia líquida

Determinação de Massas para identificação

Gel SDS-PAGE (Poliacrilamida Gel Electrophoresis)

• β-mercaptoetanol, DTT, SDS e calor para desnaturação

Calor, agente redutor e SDSSDS : detergente fortemente

aniônico (confere carga negativa às proteínas)

+

-

Proteínas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migração quando em eletroforese livre (sem gel, somente tampão).

Assim, quando em um gel de poliacrilamida, estas proteínas podem ser separadas por peso molecular

O que tem de especial o SDS??

A velocidade de migração em campo elétrico depende da dimensão, forma e carga das

moléculas.

SDS: - romper as estruturas secundárias e terciárias das proteínas

- confere carga negativa

Bandas bem definidas Bandas não definidas

Boa estratégia para comprovar qualidade da extração de proteínas!

Gel SDS-PAGE: unidimensional (1D)

Eletroforese bidimensional (2D)

• Análise simultânea de até 5.000 proteínas

• Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes

• Primeira dimensão: separação pelo pI de cada proteína (Focalização isoelétrica)

• Segunda dimensão: separação pelo peso molecular de cada proteína (SDS-PAGE)

Proteínas com a mesma massa

Proteínas com o mesmo pI

Focalização Isoelétrica: 1a dimensão

• As proteínas são moléculas anfotéricas, ou seja, possuem tanto carga positiva como carga negativa

•A carga líquida de uma proteína é função da soma de suas cargas negativas e positivas.

• A carga das proteínas é determinada pelo pH do meio onde estão suspensas

• O valor do pH onde as cargas se anulam chama-se ponto isoelétrico (pI)

pH ácido: inonizam em seus radicais amina carga positiva

pH básico: ionizam em seus radicais carboxila carga negativa

Gradiente de pH estável

Em pH baixo, muitas proteínas possuem carga positiva enquanto que em pH alto possuem carga negativa

Quando um campo elétrico é aplicado, o cátodo e o ânodo movem as proteínas até seus pontos isoelétricos onde cada proteína possui carga neutra

As proteínas pàram de migrar, pois atingem seu ponto isoelétrico em um pH específico.

Ponto isoelétrico no pH 7,5Ponto isoelétrico no pH 6,8Ponto isoelétrico no pH 8,5Ponto isoelétrico no pH 10,1Ponto isoelétrico no pH 5,6

Focalização Isoelétrica

Remover proteção da fita

Aplicar amostra no sarcófago

Colocar a fita sobre a amostra

Ettan™ Multiphor™ 3

Ettan™ IPGphor™

Focalização Isoelétrica

Poder de Resolução do gel bidimensional

Faixa de pH mais estreita aumenta o poder de resolução das proteínas

Gel Bidimensional (2D)

2D PAGE: Detecção das proteínasCoomassie Blue

Fluorescentes

(Invi

trog

en)

Células Normais de Fígado Células de Tumor de Fígado

Nitrato de Prata

62

Métodos Sensibilidade Características

Coomassie Blue R 250 50-100 ngCompatível EM

Baixo custo

Coomassie Blue G 250 10 ngCompatível EMFácil manuseio

Prata 1 ng Alta sensibilidade

Sypro Ruby 1 ng

Alta sensibilidadeCompatível EM

Necessita de instrumento sofisticado para aquisição

de imagens

2D PAGE: Detecção das proteínas

Análise das imagens de géis

Presença ou Ausência de spots

Posição de spots (Modificações pós-traducionais)

Volume de spots: quantificação relativa

Proteoma Comparativo ou Diferencial

Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões

Condição A Condição B

Análise das imagens de géis

Análise das imagens de géis

• Excisão de spots do gel : manual ou mecânico

Retirada e tratamento de spots ou bandas

Separação dos Ions

• Apenas os cátions são “deflected” por um campo magnético;

• A quantidade de “deflection” depende da relação m/z.• O sinal do detector é proporcional ao número de “hitting”

no detector;

• Pela variação do campo magnético, ions de todas as massas são coletados e contados.

Equipamento

Espectro de Massa

Pico base (100%)

GC-MS

Uma mistura de compostos é separada por cromatografia, então identificada por espectrometria de massa.

Alta Resolução MS

• Massas medidas 1 parte em 20,000.

• Uma molécula com massa de 44 pode ser C3H8, C2H4O, CO2, ou CN2H4.

• Se a massa é mais exata 44.029.......

C3H8 C2H4O CO2 CN2H4

44.06260 44.02620 43.98983 44.03740

Isótopos

=>

81Br

Moléculas com Heteroátomos

• Isótopos: presentes em usual abundância.• Hidrocarbonetos contêm 1.1% C-13, então sempre terá

um pequeno pico M+1.• Se Br está presente, M+2 é igual a M+.• If Cl está presente, M+2 é um terço de M+.• If I , está presente pico em 127;.• If S está presente, M+2 será 4% de M+.

Espectro de Massa com S

=>

Espectro de Massa com Cl

=>

Espectro de Massa com Br

=>

Espectro de Massa com Alcanos

Espectro de Massa com Alcenos

Ressonância estabilizando cátions favoráveis

=>

Problema 1

Problema 1

Problema 2

Problema 2

Problema 3

Problema 3

Problema 4

• Bibliografia

• SILVERSTEIN, R. M., WEBSTER, F. X., KIEMLE, D.J., “Spectrometric Identifications of Organic Compounds”, seventh edition, John Wiley and Sons, Inc., 1997.

• MURADIAN. J., “Espectroscopia no infravermelho”, IQ-USP, São Paulo, 1978.

• WILLARD, M., MERRITT, Jr & DEAN, J., “Análise Instrumental”, Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa, 1974.

• RUSSELL, D.H., Ed. Experimental Mass Spectrometry. New York: Plenum Press. 1994