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Bombas de efluxo: características gerais,

importância e inibidores

Dra. Viviane Nakano

Curso de Pós-Graduação em Microbiologia

BMM 5753 – Bacteriologia de Anaeróbios

Introdução

O que são bombas de efluxo e qual sua função na célula bacteriana?

Quais são as famílias de bombas de efluxo relacionadas com a resistência aos antimicrobianos?

Introdução

MATE*: Multidrug and Toxic Compound Extrusion

MSF: Major Facilitator Superfamily

SMR*: Small Multidrug Resistance

RND*: Resistance Nodulation Division

ABC: ATP Binding Cassette

(Piddock, 2006)

* Exclusiva em procariotos

Família MFS

Procariotos e Eucariotos

gram positivas

gram negativas (MFS+Canal ME)

Efluxo realizado por força próton motiva (antiporte)*

(Lynch, 2006)

Caracterização

Membrana Citoplasmática

*Transportadores transmembrânicos e tipos de transporte

Família MFS

Procariotos e Eucariotos

gram positivas

gram negativas (MFS+Canal ME)

Efluxo realizado por força próton motiva (antiporte)

Transporta açúcares, metabólitos e drogas

S. aureus (NorB) e B. subtilis (LmrB)

E. coli (EmrAB-TolC/EmrKY-TolC)(Lynch, 2006)

Caracterização

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Caracterização

Superfamília ABC

Procariotos e Eucariotos

Duas membranas hidrofóbicas e duas hidrofílicas

Efluxo realizado pela hidrólise de ATP

Transporta toxinas, metabólitos e drogas

L. lactis (LmrCD) e S. aureus (AbcA)

E. coli (MacAB-TolC)

(Lynch, 2006)Humanos – agentes tumorais

Família SMR

Menor sistema de efluxo

Transporta drogas catiônicas

Efluxo realizado por força próton motiva

S. marcescens (SsmE) e S. aureus (SepA)

Caracterização

(Lynch, 2006)

Família MATE

Topologia da membrana similar MFS

Efluxo realizado por força próton motiva e gradiente de íons sódio

Transporta detergentes e drogas

S. aureus (MepA) e H. influenza (HmrM)

(Lynch, 2006)

Caracterização

Resistance Nodulation Division(RND)

Caracterização

Família RND

Usam o gradiente de prótons para forçar o efluxo

Transporta moléculas lipofílicas e anfifílicas

Responsável pela tolerância de bactérias a solventes

A bomba está divida em três partes

(Lynch, 2006)

(Poole, 2008)

Caracterização

E. coli

(AcrAB-TolC)

K. pneumoniae

(AcrABR)

P. aeruginosa

(MexAB-OprM)

P. aeruginosa

(MexCD-OprJ)

S. enterica sorovar Typhimurium

(AcrAB-TolC)

P. aeruginosa

(MexXY-OprM)

P. aeruginosa

(MexEF-OprN)

N. gonorrhoeae

(FarAB-MtrE)

A. baumannii

(AdeIJK)

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Caracterização

Membrana Externa

Membrana Interna

Sen

tido

do

eflu

xo

TolC

AcrA

AcrB

(Piddock, 2006)Modelo de bomba de efluxo RND de Escherichia coli

TolC = OMF (outer membrane factor)

AcrA = MFP (Membrane fusion protein)

Acr = Acriflavina

TolC = Tolerância a colicina

Modelo de bomba de efluxo RND de Pseudomonas aeruginosa

Mex = Efluxo múltiploOpr = Proteína de membrana externaCaracterização

Cada um dos três componentes é essencial para o efluxo da droga e a ausência de um deles pode comprometer todo o funcionamento do complexo.

Caracterização Caracterização

(Nikaido, 2009)

Comunicação com o periplasma

AcrB

Caracterização

(Eswaran et al., , 2004)

TolC

TolC

Caracterização

(Koronakis et al., , 2004)

Escherichia coli

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Caracterização

Bomba AcrAB-TolC

(Recio-Fernandez et al., , 2004)

TolC

AcrA

AcrB

Caracterização

(Tornroth-Horsefield et al., , 2007)

4º. Componente????

YajC (associação com AcrB)

Caracterização

(Piddock, 2006)

Regulação

Regulação

Regulador MFP Transportador OMP

E. coli sistema AcrAB-TolC:

Repressor: AcrR

Regulador Global: MarA, SoxS, Rob (Bacteroides MarA-like)

Anaeróbios

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Introdução

Bombas MATE foram encontradas em Bacteroides thetaiotaomicron (Miyamae et al., 2001)

(Miyamae et al., 2001)

bexA (Bacteroides exporter A): similaridade NorM Vibrio parahaemolyticus

orf1: proteína de inserção de membrana externa

orfX: não tem função aparente no sistema de efluxo

(Miyamae et al., 2001)

pBRBT20: orfX, orf1, orf2(bexA)

pBRBT201: orf1, orf2

pBRB201ME: orf2

pBRBT2012: orf1

Primeira bomba RND foi em Porphyromonas gingivalis XepCAB (Ikeda e Yoshimura, 2002)

Introdução

(Ikeda e Yoshimura, 2002)

Bombas MATE foram encontradas em Clostridium difficile (Dridi et al., 2004)

Introdução

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(Dridi et al., 2004)

(Dridi et al., 2004)

Primeiro relato de bombas RND em B. fragilis foi em 2005 (Ueda et al.)

Introdução Introdução

(Ueda et al., 2005)bme (Bacteroides fragilis multidrug efflux)

1 9

16

15

14

13

12

11

102

3

4

5

6

7

8

16 bombas RND (BmeABC)

Introdução

Membrana Externa

Membrana Interna

Sen

tido

do

eflu

xo

TolC = BmeC

AcrA = BmeA

AcrB = BmeB

(Piddock, 2006)Modelo de bomba de efluxo RND de Escherichia coli

16 genes bmeABC são expressos

constitutivamente

Bombas podem estar associadas com

resistência intrínseca

Aumento da expressão das bombas podem

aumentar a resistência a múltiplos antibióticos

CARACTERIZAÇÃO

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E como são realizados os estudos de análise das bombas de efluxo?

Clonagem Expressão

ou

Construção de cepas mutantes

Perfil de substrato e de resistência

=

+

Caracterização Caracterização

Srikumar et al. (1998) - P. aeruginosa MexAB-OprM e MexCD-OprJ

MexAB-OprM =MexCD-OprJ

1º experimento

2º experimento

e resistência

MexAB

MexCD

=

=

Não houve alteração da susceptibilidade

resistência

Hospedeiro susceptível ≠ comportamentos

Clonagem Expressão+

Família RND

Caracterização Clonagem Expressão+

pSTV28 – plasmídio/vetor

pSEC38: sedXY

pSEC32: sedY

Clonaram:

E. coli KAM 32 (Δ acrB, Δ ydhE)

(Chen et al., 2003)

Família SMR

Caracterização Clonagem Expressão+KAM3: (ΔacrB) pBET5: ebrA, ebrB

(Masaoka et al., 2000)

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Família ABC

Caracterização Clonagem Expressão+

(Lee et al., 2003)

pAEF82: efrA, efrB

(Lee et al., 2003)

Caracterização Construção de cepas mutantes

(Pumbwe et al., 2006)

Caracterização

↑bme 5, 7 e 15 - sobre pressão antibióticos são reguladas - MDR

↓ outras bombas – situações particulares podem ser reguladas

Construção de cepas mutantes

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Importância

(Martinez et al., 2009)

Família RND

Importância

Resistência a Metais Tóxicos

Resistência a Solventes

Na biosfera do solo – interação planta/bactéria

Homeostase/Detoxificação

Virulência Bacteriana

Comunicação Celular – Quorum Sensing (QS)

Importância

Resistência a Metais Tóxicos

Resistência a Solventes

Na biosfera do solo – interação planta/bactéria

Homeostase/Detoxificação

Virulência Bacteriana

Comunicação Celular – Quorum Sensing (QS)

Importância

Resistência a Metais Tóxicos

Resistência a Solventes

Na biosfera do solo – interação planta/bactéria

Homeostase/Detoxificação

Virulência Bacteriana

Comunicação Celular – Quorum Sensing (QS)

Importância

Resistência a Metais Tóxicos

Resistência a Solventes

Na biosfera do solo – interação planta/bactéria

Fitobactérias:

Erwinia amylovora

Erwinia chrysanthemi

Agrobacterium tumefaciens

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Importância

Resistência a Metais Tóxicos

Resistência a Solventes

Na biosfera do solo – interação planta/bactéria

Homeostase/DetoxificaçãoVirulência Bacteriana

Comunicação Celular – Quorum Sensing (QS)

Importância

Resistência a Metais Tóxicos

Resistência a Solventes

Na biosfera do solo – interação planta/bactéria

Homeostase/Detoxificação

Virulência Bacteriana

Comunicação Celular – Quorum Sensing (QS)

Importância

Comunicação Celular – Quorum Sensing (QS)

Controle da expressão de genes em resposta a densidade celular e aos fatores ambientais.

Envolve a produção e a detecção de moléculas sinalizadoras chamadas de autoindutoras

(ex.: N-acil homoserina lactonas)

E. coli

B. fragilis

Importância

Iniciou com a resistência a antibióticos

Consequência da atividade antropogênica

Mas esse mecanismo não seria recente, talvez uma adaptação?

Inibidores

Pagés e Amaral., 2009

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Inibidores

Redução da expressão de componentes da bomba.

Clorpromazine

Inibidores

Competem com o antibiótico pelo sítio de ligação na bomba de efluxo.

Inibidores

Causam colapso no sistema de energia da bomba.

Perspectivas

By-passing a atividade do efluxo

Maiores estudos sobre inibidores

Novas Tetraciclinas

Novas Fluoroquinolonas

Novos macrolídeos

Bloqueadores dos canais de Membrana (TolC)