INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

Bacteriófagos são agentes virais que infectam bactérias. São amplamente distribuídos na natureza, e sugere-se que tenham papel importante nas dinâmicas das populações microbianas (3,4). A propriedade lítica destes agentes constitui uma importante ferramenta para o microbiologista, aplicada na detecção e identificação bacteriana (2), em análises epidemiológicas (7) e, conforme reavaliado em estudos recentes, com grande potencial no controle biológico de bactérias relacionadas a enfermidades em plantas (6), animais e homem (1,4,8).

OBJETIVOOBJETIVO

Isolar bacteriófagos com atividade lítica em bactérias de importância em medicina veterinária: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter spp., Proteus mirabilis , Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus.

ISOLAMENTO DE BACTERIÓFAGOS COM ISOLAMENTO DE BACTERIÓFAGOS COM ATIVIDADE LÍTICA EM BACTÉRIAS DE ATIVIDADE LÍTICA EM BACTÉRIAS DE

IMPORTÂNCIA VETERINÁRIAIMPORTÂNCIA VETERINÁRIAAsanome, W.Asanome, W.11; Pereira, C.R.; Pereira, C.R.11; Gomes, M.J.P.; Gomes, M.J.P.22

11 Acadêmicos, FAVET, UFRGS. Acadêmicos, FAVET, UFRGS.22 Professor do Departamento de Patologia Clínica Veterinária, FAVET, UFRGS. Professor do Departamento de Patologia Clínica Veterinária, FAVET, UFRGS.

RESULTADOS E DISCUSSÃORESULTADOS E DISCUSSÃO

Com uma metodologia relativamente simples, foi possível isolar bacteriófagos com atividade lítica em Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter spp. (Quadro 1 e Figura 2).

Estudos específicos sobre os bacteriófagos isolados (caracterização genética, morfológica e das interações com as respectivas bactérias hospedeiras) fornecerão embasamento para a avaliação do seu potencial como ferramenta em detecção e identificação bacteriana, em análises epidemiológicas, e como agentes de controle biológico. Das possibilidades citadas, destacamos a última, cuja abordagem tem atraído um número crescente de pesquisas nos últimos anos, devido principalmente à emergência de bactérias com resistência múltipla a antimicrobianos.REFERÊNCIASREFERÊNCIAS

1. CARLTON, R. M. Phage Therapy: Past History and Future Prospects. Archivum Immunologiae et Therapie Experimentalis. v.47, p.267-274, jun. 1999.2. FAVRIN, S. J.; JASSIM, S. A.; GRIFFITHS, M. W . Development and Optimization of a Novel Immunomagnetic Separation-Bacteriophage Assay for Detection of Salmonella enterica Serovar Enteritidis in Broth. Applied and Environmental Microbiology. v.67, n. 1, p. 217-224, jan. 2001.3. HENNES, Kilian P.; SIMON, M. Significance of Bacteriophages for Controlling Bacterioplankton Growth in a Mesotrophic Lake. Applied and Environmental Microbiology. v. 61, n. 1, p. 33-340, jan. 1995.4. NAKAI, T; PARK, S. C. Bacteriophage Therapy of Infectious Diseases in Aquaculture. Research in Microbiology. v. 153, p. 13-18, 2002.5. ROVOZZO, G.C.; BURKE, C.N. A Manual of Basic Virological Techniques. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, 1973, 272 p.6. SCHNABEL, E. L.; JONES, A. L. Isolation and Characterization of Five Erwinia amylovora Bacteriophages and Assessment of Phage Resistance in Strains of Erwinia amylovora. Applied and Environmental Microbiology. v. 67, n. 1, p. 59-64, jan. 2001.7. SANTOS, L. R.; NASCIMENTO, V.P.; OLIVEIRA, S.D.; RODRIGUES, D.P.; REIS, E.M.F.; SEKI, L.M.; RIBEIRO, A.R. & FERNANDES, S.A. Phage Types of Salmonella Enteritidis Isolated from Clinical and Food Samples, and from Broiler Carcasses in Southern Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. v. 45, n. 1, p. 1-4, jan-feb. 2003.8. SULAKVELIDZE, A.; ALAVIDZE, Z.; MORRIS JR., G. Bacteriophage Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. v.45, n.3, p. 649-659, mar. 2001.

Quadro 1. Bacteriófagos isolados: fontes e morfologia de placa

Figura 2. Plaqueamentos em dupla camada de ágar. a) Fago Ec 01; b) Fago Ec 02; c) Fago Ec 03; d) Fago Ec 04; e) Fago Pa 01; f) Fago Pa 02; g) Fago Pa 03; h) Fago Pa 04.

Figura 1. Fluxograma da metodologia de isolamento e purificação de placa

MATERIAIS E MÉTODOSMATERIAIS E MÉTODOS

Culturas bacterianas. Para todas as etapas do experimento, foram utilizados cultivos das cepas bacterianas em caldo triptose, em crescimento exponencial, com concentração aproximada de 3x108 UFC.ml-1.

Amostras para isolamento. As amostras constituíram-se de dejetos de animais em confinamento (local de colheita denominado CFV), de esgoto urbano puro (local Gr) e de águas de coleções que recebem esgoto sem tratamento (locais CV e AD). Foram colhidas amostras com volumes entre 200 e 1000 ml.

Isolamento e purificação de placa. Para o isolamento dos bacteriófagos foi utilizada a técnica do enriquecimento (5). As amostras colhidas foram enriquecidas individualmente em culturas das bactérias-alvo por um período mínimo de 24 horas, a 37°C. A seguir, foram centrifugadas (1400 x g por 10min.), filtradas (membrana com poro de tamanho 0,45 μm) e inoculadas em culturas indicadoras. Os cultivos foram avaliados para atividade lítica após 24 horas de incubação a 37°C. Os filtrados que originaram cultivos líquidos com clareamento e/ou cultivos em placa com áreas sem crescimento foram submetidos a diluições seriadas e plaqueados em dupla camada de ágar pelo método padrão (5). Os filtrados definitivos foram obtidos após três ciclos de purificação de placa lítica isolada e conservados a 6-7°C. Os procedimentos de isolamento e de purificação de placa estão esquematizados na figura 1.Bacteriófag

oCepa

Hospedeira

Características de placa lítica Fonte

de isolamentoDiâmetro Aspecto

Pa 01 P. aeruginosa 113/03 1.0 mm Clara Local CFV

Pa 02 P. aeruginosa 113/03 1.0 mm Clara Local CV

Pa 03 P. aeruginosa 113/03 4.0 mm Clara Local AD

Pa 04 P. aeruginosa 113/03 1.0 mm Clara Local Gr

Ec 01 E. coli O157:H7 099/03 2.5 mm Clara Local CFV

Ec 02 E. coli O157:H7 100/03 0.5 mm Túrbida Local CFV

Ec 03 E. coli O157:H7 101/03 1.0 mm Clara Local CFV

Ec 04 E. coli O157:H7 102/03 1.0 mm Clara Local CFV

Kp 01 K. pneumoniae 064/03 --- --- Local CFV

C 01 Citrobacter spp. 181/03 --- --- Local CFV

a b c d

e f g h

Solidificação;incubação a

37°C por 24h

Recorte de placa lítica

isolada

Suspensão em caldo triptose

Agitação por 10’

Filtração

Despejamento sobre ágar sólido 1,5%

Repouso a 6-7°C por 4h para difusão viral

2. Purificação de placa lítica2. Purificação de placa lítica

Filtrado diluído (0,1ml)

Cultivo bacteriano (0,1ml)

Ágar semi-sólido 0,75% derretido

(3ml, 50°C)

Adsorção viral (37°C, 15’)

Homogeneização

Incubação a 37°C, 24h

Inoculação em cultura indicadora

Tubo controle (túrbido)

Tubo teste (clareamento)

Incubação a 37°C, 24h

Avaliação de atividade lítica

Áreas sem crescimento nos pontos de inoculação

Centrifugação a 1400 x g por 10’

Enriquecimento da amostra

Cultivo bacteriano+

Caldo 10x concentrado+

Amostra p/ isolamento(Proporção 1:1:9)

Filtração (membrana com poro tamanho 0,45

μm)

1. Isolamento1. Isolamento