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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E
BIOLOGIA EVOLUTIVA
GRACIELA NASCIMENTO LIMA
Manaus, Amazonas Junho, 2010
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE LOCOS MICROSSATÉLITES E
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE DUAS POPULAÇÕES DE
Anopheles (N.) darlingi (DIPTERA: CULICIDAE) DO ESTADO DO
AMAZONAS
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ii
GRACIELA NASCIMENTO LIMA
ORIENTADORA: Dra. Joselita Maria Mendes dos Santos
Dissertação apresentada aos Programas de Pós-Graduação do INPA como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
Manaus, Amazonas
Junho, 2010
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE LOCOS MICROSSATÉLITES E
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE DUAS POPULAÇÕES DE
Anopheles (N.) darlingi (DIPTERA: CULICIDAE) DO ESTADO DO AMAZONAS
iii
Ficha Catalográfica
Sinopse: Anopheles darlingi é o principal vetor da malária no Brasil, principalmente na bacia amazônica. Foram isolados e caracterizados 36 locos microssatélites específicos para A. darlingi por meio de biblioteca genômica enriquecida com microssatélites. Doze locos polimórficos foram selecionados para analisar a variabilidade genética populacional dessa espécie analisadas em duas localidades do Estado do Amazonas. Foi verificada baixa diferenciação genética entre as populações e variabilidade genética intrapopulacional. Palavras-chave: Anopheles darlingi, DNA microssatélite, genética de populações, malária.
Lima, Graciela Nascimento
Isolamento e caracterização de locos microssatélites e análise da
variabilidade genética de duas populações de Anopheles (N.) darlingi
(Diptera: Culicidae) do Estado do Amazonas/Graciela Nascimento Lima –
Manaus: [s.n.], 2010. xi, 81 f.: il. color.
Dissertação (Mestrado) – INPA, Manaus, 2010
Orientador: Joselita Maria Mendes dos Santos
Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
1. Anopheles darlingi. 2. Variabilidade genética. 3. Microssatélite.
4. Malária I. Título.
CDD XXXXXXXX
iv
Dedicatória
A Deus;
A minha mãe, Maria de Fátima;
Aos meus avós maternos, Maria de Lourdes e Virgílio Braga (in memorian).
v
Agradecimentos
Agradeço a Deus por estar ao meu lado em todos os momentos me dando
força, coragem e sabedoria para enfrentar todos os obstáculos.
À minha mãe Maria de Fátima que com muito amor e dedicação me criou,
educou e sempre acreditou nos meus sonhos.
Ao meu amor, companheiro e marido André Felipe, pelo seu imenso amor,
compreensão, apoio, motivação e por estar ao meu lado em mais esta conquista.
À Dra. Joselita Maria M. dos Santos, pela orientação, dedicação e paciência
durante a realização desse trabalho e pela amizade e confiança em mim depositada.
À Dra. Jacqueline da S. Batista, pelo constante apoio, ensinamentos,
sugestões e por me acompanhar nas varias etapas do trabalho.
À MSc. Kyara Formiga, pela contribuição e pelo constante apoio dado no
Laboratório Temático de Biologia Molecular-LTMB/INPA.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e ao Laboratório
Temático de Biologia Molecular – LTBM/INPA, pelas condições técnicas, de infra-
estrutura e logística para realização desta dissertação.
Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva e aos professores, pela oportunidade de aprendizado e aperfeiçoamento.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pelo
financiamento da bolsa de estudo.
Ao PROCAD-Amazônia-INPA/UNICAMP/UFRGS/CAPES (023/2006),
FAPEAM/PIPT, CTPETRO-Rede malária/CNPq/FAPEAM, pelo apoio financeiro.
À Coordenação do programa GCBEv, Conselho e todas as secretárias, pela
dedicação e apoio.
Ao Dr. Wanderlei Pedro Tadei, pelo apoio logístico que tornou possível a
realização deste trabalho.
Às minhas amigas e companheiras Paula Figliuolo, Mellina Naice, Suzana dos
Anjos, Giselle Moura e Luciana Batista por todo carinho, força, apoio, amizade,
compartilhamento de sofrimentos, alegrias e risos.
Aos meus amigos Marcelo Daou, Rafael Lopes, Daniel Bevilaqua e Tatiana
Marques pela amizade, apoio e confiança.
vi
Aos colegas da turma de mestrado Alexandre, Deyla, Mariana, Bárbara,
Mauro, Gabriela, Edson, Edvaldo, Joel, Mellina, Daniela pelo carinho e amizade
compartilhados.
Aos colegas do Laboratório de Malária e Dengue e do Laboratório Temático
de Biologia Molecular, especialmente, Suzana, Paulinha, Letícia, Mel, Gilson,
Giselle, Luciana, Adriel, Saulo, Karen, Larissa, Naiara, Izaura pela ajuda e
companheirismo.
À Jane pela colaboração incondicional no laboratório.
À Adelina e Zilá, por todo carinho e amizade.
A todos os técnicos do Laboratório de Vetores de Malária e Dengue: Carlos e
Bosco pelo pronto auxílio esclarecendo dúvidas sobre identificação de mosquitos.
Ao Bastos, Henrique e Elias nas coletas de campo. E em especial ao Juraci pela
gentileza e apoio técnico do Laboratório, com a utilização dos equipamentos
laboratoriais, pela sua incansável ajuda e ensinamentos com os cuidados do
insetário e alimentação dos mosquitos.
Á PROCAD-CAPES, pelo financiamento do Banco enriquecido em
marcadores moleculares microssatélites para A. darlingi.
Aos monitores Adna Sousa, Fernanda Cidade, Marcos Prado, Tatiana
Campos e professores Anete Pereira, Miriam Rafael, Maria Imaculara Zuchi e
Marcelo Cavallari responsáveis pelo curso "Construção de bancos enriquecidos em
microssatélites de eucariotos: um curso prático e teórico" e por todo apoio
informativo.
Aos avaliadores do projeto de dissertação e membros da banca da aula de
qualificação, Carlos Gustavo Nunes e Silva, Raquel Borges, Miriam Silva Rafael,
pelas valiosas sugestões, as quais aprimoraram consideravelmente este trabalho;
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para que esse sonho se
tornasse realidade.
vii
Resumo Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi é o principal vetor da malária humana em todo o país, e particularmente na Amazônia. É considerada a mais antropofílica e endofágica de todas as espécies de Anopheles nas Américas. Diante disso, vários estudos têm utilizado diferentes marcadores moleculares para conhecer a estrutura genética populacional e entender os mecanismos envolvidos na dinâmica de transmissão da malária. Entre esses marcadores, os microssatélites vêm sendo muito eficientes em estudos populacionais apresentando um elevado conteúdo de informação de polimorfismo e no esclarecimento do status taxonômico das espécies de mosquitos. Considerando a importância epidemiológica e a necessidade de se conhecer melhor a estrutura genética das populações dessa espécie, foram desenvolvidos novos marcadores microssatélites e analisada a variabilidade genética de duas populações do Estado do Amazonas. A biblioteca genômica enriquecida com microssatélites (SSR) apresentou 77 clones (80,2%) com sequências nucleotídicas de boa qualidade e 1,3% de redundância. Destes, 73 clones (94,8%) apresentaram sequências com SSRs, gerando um total de 124 microssatélites na biblioteca, sendo 1,7 a média por clone. A partir de 63 clones (81,8%) foram desenhados 69 pares de primers, sendo 66 sintetizados. Trinta e seis marcadores microssatélites foram isolados e caracterizados em 12-32 indivíduos de A. darlingi coletados em Coari (Amazonas-Brasil). Foram obtidos um total de 280 alelos, variando entre 3 a 14 alelos por loco, com uma média de 7,78. A heterozigosidade observada (HO) variou entre 0,037 a 0,952 (media de 0,524), enquanto a heterozigosidade esperada (HE) variou entre 0,177 a 0,883 (média de 0,735). A amplificação heteróloga de 24 locos microssatélites resultou de 8 a 13 locos polimórficos entre três espécies do gênero Anopheles [A. benarrochi, A. rangeli e A. triannulatus]. Um total de 112 alelos foram observados entre os 12 locos utilizados na análise da variabilidade genética, com uma média de 9,3 alelos por loco, heterozigosidades observada e esperada elevadas (HO= 0,668 e HE= 0,759), indicando elevada variabilidade genética. As estatísticas F de Wright revelaram baixa diferenciação genética entre as populações (FST= 0,028). A distância genética entre as duas populações foi muito baixa (0,0962), indicando grande similaridade genética entre elas. A análise Bayesiana implementada no programa STRUCTURE, evidenciou a existência de apenas um cluster (K=1), sendo considerada uma única população. Palavras chaves: Anopheles darlingi, DNA microssatélite, variabilidade genética, malária.
viii
Abstract Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi is the main vector of the human malaria in all of the country, particularly in the Amazon region. It’s considered the most anthropophilic and endophagic of all Anopheles species in the Americas. Given this many studies have used different molecular markers to know the population genetic structure and understand the mechanisms involved in the dynamics of malaria transmission. Among these markers the microsatellite have been very efficient in population studies presenting a high polymorphism information content and highlight the taxonomic status of the mosquitoes species. Considering the epidemiological importance and the need to better understand the genetic structure of this species’ population new microsatellite markers were developed and analyzed the genetic variability into two Amazonas State populations. The genomic library enriched with microsatellite (SSR) showed 77 clones (80.2 %) with good nucleotide sequences and 1.3% redundancy. Of these, 73 clones (94.8%) had sequences with SSRs generating a total of 124 microsatellite in the library, the average being 1.7 per clone. From 63 clones (81.8%) were designed 69 primer pairs and 66 synthesized. Thirty-six microsatellite markers were isolated and characterized in 12-32 individuals of A. darling collected in Coari (Amazonas-Brazil). Were obtained 280 alleles in total, ranging from 3-14 alleles per locus, with an average of 7.78. The observed heterozygosity (HO) ranged from 0.037 to 0.952 (mean 0.524), while the expected heterozygosity (HE) ranged between 0.177 to 0.883 (mean 0.735). The heterologous amplification of 24 microsatellite loci resulted in 8-13 polymorphic loci among the three species of the Anopheles [A. benarrochi, A. rangeli and A. triannulatus] genus. One such of 112 alleles were observed among 12 loci used in the analysis of genetic variability, with an average of 9.3 alleles per locus, high observed and expected heterozygosities (HO = 0.668 and HE = 0.759), indicating high genetic variability. The Wright's F statistics revealed low genetic differentiation between populations (FST= 0,028). The genetic distance between the two populations was very low (0,0962), indicating great genetic similarity between them. The Bayesian analysis implemented in the program STRUCTURE revealed the existence of only one cluster (K=1), being considered a single population.
Keywords: Anopheles darlingi, DNA microsatellite, genetic variability, malaria.
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................... 1
1.1. Considerações gerais sobre Anopheles darlingi ........................................... 1
1.2. A malária na região amazônica ..................................................................... 3
1.3. Marcadores microssatélites .......................................................................... 5
1.3.1. Isolamento, caracterização e amplificação heteróloga de locos
microssatélites ..................................................................................................... 7
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 9
2.1. Objetivo geral ................................................................................................ 9
2.2. Objetivos específicos .................................................................................... 9
Capítulo 1 : Marcadores de DNA microssatélite de Anopheles darlingi (Diptera:
Culicidae), principal vetor da malária no Brasil: desenvolvimento,
caracterização e amplificação interespecífica ...................................................... 10
Capítulo 2 : Estimativa da variabilidade genética de duas populações de
Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae) do Estado do Amazonas, utilizando
marcadores microssatélites ................................................................................... 21
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 22
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 26
2.1. Obtenção das amostras de DNA de Anopheles darlingi ............................. 26
2.2. Extração e quantificação de DNA ............................................................... 27
2.3. Amplificação e genotipagem das amostras de DNA de Anopheles darlingi 27
2.4. Estimativa do tamanho dos alelos, tratamento e montagem do banco de
dados de genotipagem .......................................................................................... 30
2.5. Análises estatísticas de genética populacional ........................................... 30
2.6. Estrutura genética populacional .................................................................. 31
3. RESULTADOS .................................................................................................. 33
3.1. Análise da variabilidade genética e equilíbrio de Hardy-Weinberg ............. 33
3.2. Estimativas da estrutura genética populacional .......................................... 37
4. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 40
4.1. Variabilidade genética em Anopheles darlingi ............................................ 40
4.2. Estrutura genética em populações de Anopheles darlingi .......................... 44
5. CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................... 49
x
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 51
APÊNDICE A ........................................................................................................... 65
xi
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 01. Oito sistemas multiplex utilizados para genotipagem dos indivíduos de
Anopheles darlingi procedentes de Coari..................................................................17
Tabela 02. Caracterização de 36 locos microssatélites polimórficos de Anopheles
darlingi, procedentes de Coari, Amazonas, Brasil.....................................................18
Tabela 03. Amplificação interespecífica de 24 locos microssatélites desenvolvidos
para Anopheles darlingi..............................................................................................20
CAPÍTULO 2
Tabela 01. Locos microssatélites utilizados nas análises populacionais de Anopheles
darlingi em duas localidades do Estado do Amazonas..............................................28
Tabela 02. Sistema multiplex utilizado para genotipagem dos indivíduos de
Anopheles darlingi procedentes de São Gabriel da Cachoeira..................................29
Tabela 03. Conteúdo de Polimorfismo Informativo (PIC) e o índice de endogamia
(FIS), obtidos para cada um dos doze locos microssatélites de Anopheles darlingi,
analisados em duas populações................................................................................33
Tabela 04. Alelos exclusivos (em pb) e suas frequências (valores entre parênteses)
analisados em doze locos microssatélites de duas populações de Anopheles
darlingi........................................................................................................................34
Tabela 05. Índices de diversidade genética obtidos em doze locos microssatélites de
Anopheles darlingi, analisados em duas populações do Estado do
Amazonas...................................................................................................................36
Tabela 06. Índices genéticos obtidos a partir de doze locos microssatélites de
Anopheles darlingi, analisados em duas populações do Estado do
Amazonas...................................................................................................................37
Tabela 07. Análise da variância molecular (AMOVA) em duas populações de
Anopheles darlingi do Estado do Amazonas, utilizando doze locos
microssatélites,...........................................................................................................38
xii
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 01. Caracteres morfológicos de identificação da forma adulta de Anopheles
darlingi. A- Mosquito fêmea; B-veia C: mancha pré-umeral (ph) maior que mancha
umeral (h); C- tarso posterior. Fonte: Forattini, 2002...................................................2
CAPÍTULO 2
Figura 02. Locais de coleta de Anopheles darlingi no Estado do Amazonas. 1 – São
Gabriel da Cachoeira, 2 – Coari. Fonte: www.riogrande.com.br................................26
Figura 03. Valor de k= 1 cluster, obtido a partir de análise Bayesiana implementada
no programa STRUCTURE, para k variando entre 1 a 4. LnP(D)= probabilidade a
posteriori, K= número de agrupamentos possíveis....................................................39
Figura 04. Triângulo gerado pelo programa STRUCTURE, indicando que todos os
indivíduos se encontram no centro............................................................................39
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. Considerações gerais sobre Anopheles darlingi
Anopheles darlingi Root, 1926 é considerada a principal espécie
transmissora da malária humana no Brasil, especialmente na região
amazônica, onde ocorre à maioria dos casos da doença (Deane et al., 1948),
sendo encontrada em áreas de baixas altitudes, quase sempre associada aos
grandes rios e florestas, podendo ocorrer também no litoral (Consoli e
Lourenço-de-Oliveira, 1994).
Esta espécie está classificada na ordem Diptera, família Culicidae,
gênero Anopheles, subgênero Nyssorhynchus. É a espécie mais antropofílica e
endofágica dentre as outras espécies de Anopheles nas Américas (Arruda et
al., 1986; Forattini, 2002), contribuindo para o ressurgimento da malária nas
América do Sul e Central (Tadei et al., 1998).
As principais características morfológicas para identificação da forma
alada do A. darlingi encontra-se no tarso posterior, onde o segundo tarsômero
(Ta-2) se apresenta com metade de escuro basal, e os tarsômeros 3 a 5 são
totalmente claros; na asa que possui manchas claras e escuras: a veia C
(costa) apresenta a área escura ph (mancha pré-umeral) com envergadura
correspondente ao triplo do tamanho da área clara h (mancha umeral)
(Forattini, 2002) (Figura 01).
A. darlingi apresenta uma ampla distribuição geográfica, predominando
na região sul-americana. Ocorre desde o sul do México (Chiapas) até a
Nicarágua na América Central, sendo encontrada também na Colômbia e a
leste das Cordilheiras dos Andes, embora ausente no extremo nordeste
brasileiro. No Sul é encontrada até o norte da Argentina (Chaco e Missiones) e
na região de Foz do Iguaçu no Brasil (Forattini, 2002).
A. darlingi tem como principal criadouro grandes coleções de águas
limpas, profundas e ensolaradas ou parcialmente sombreadas, com pouca
correnteza para o desenvolvimento de suas larvas e pupas que habitam as
margens escondidas entre a vegetação flutuante ou detritos. Esses criadouros
são permanentes e funcionam como focos de resistência durante a estação
2
mais seca. Contudo, no período chuvoso, essa espécie pode ser encontrada
em corpos de água de tamanho e profundidade menores, como poças e
buracos feitos por patas de animais (Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1994).
Figura 01. Caracteres morfológicos de identificação da forma adulta de Anopheles darlingi. A- Mosquito fêmea; B-veia C: mancha pré-umeral (ph) maior que mancha umeral (h); C- tarso posterior. Fonte: Forattini, 2002.
Os principais hábitats desse mosquito são as águas pretas e ácidas,
águas brancas, pulso de enchentes e vazantes, que propiciam a existência de
uma diversidade e densidade de anofelinos específicas para cada área.
Estudos realizados com populações de A. darlingi procedentes dos rios
Solimões, Negro e do lago Coari mostraram que no rio Negro e lago Coari,
ambos de água preta, a incidência desse mosquito foi bastante elevada,
representando 99% dos anofelinos em contato com o homem, enquanto que no
rio Solimões, um rio de água branca, a incidência de A. darlingi foi bem menor.
Esses resultados indicam que existe um risco maior de transmissão da malária
nas comunidades que ficam ao longo dos rios de água preta (Tadei et al.,
2003).
Um dos mais importantes fatores biológicos que concorrem para que
esta espécie seja a principal vetora da malária no Brasil é a sua acentuada
preferência em alimentar-se com sangue humano (Tadei et al., 1998). No
território brasileiro é encontrada durante todo o ano, porém apresenta baixa
B
A
C
www.agenciact.mct.org.br
3
hematofagia nas épocas de maiores e menores pluviosidades. Segundo
estudos realizados em diferentes regiões da Amazônia, esse mosquito possui
atividade noturna, apresenta padrão bimodal, com dois picos de atividade,
sendo um muito intenso no início da noite e outro menor ao amanhecer,
podendo sofrer modificações em sua intensidade, no início da noite, de acordo
com o período de inverno e verão (Tadei et al., 1984; 1993).
Vários estudos envolvendo a biologia (Consoli e Lourenço-de-Oliveira,
1994; Forattini, 2002; Gomes et al., 2008), o comportamento hematofágico
(Forattini, 2002; Vittor et al., 2006), e genética de populações (Freitas-Sibajev
et al., 1995; Manguin et al., 1999; Santos et al., 2003; González et al., 2007;
Mirabello et al., 2008; Pedro e Sallum, 2009) têm sido realizados, a fim de
conhecer melhor o status taxonômico e entender a dinâmica das populações
de A. darlingi e os mecanismos envolvidos na transmissão da malária.
1.2. A malária na região amazônica
A malária é conhecida desde épocas remotas e tem assolado a
humanidade por milhares de anos, sendo um dos graves problemas de saúde
pública mundial. É uma doença parasitária que ocorre em áreas tropicais e
subtropicais, porém tem um maior impacto nos países mais pobres e em
desenvolvimento, trazendo-lhes inúmeros prejuízos sócio-econômicos.
O continente africano é o mais atingido por essa endemia, estando
ausente apenas na extremidade das regiões norte e sul. Nas Américas, a
endemia existe em toda a região central e norte da América do Sul, incluindo
mais da metade do território brasileiro. Na Ásia está presente em todo o
subcontinente indiano, Oriente Médio, Irã, Ásia central, sudeste asiático,
Indonésia, Filipinas e sul da China. Ao todo, 3,3 bilhões de pessoas vivem em
regiões endêmicas, em mais de 100 países (OMS, 2009).
A malária é causada pelo protozoário do gênero Plasmodium e
transmitida ao hospedeiro vertebrado pela picada do mosquito fêmea do
gênero Anopheles. Há quatro espécies de Plasmodium que causam malária
humana: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e
Plasmodium ovale, sendo que esta última não é encontrada no Brasil. O P.
4
falciparum causa a forma mais grave, e o P. vivax apresenta gravidade
intermediaria, mas pode se manifestar no mesmo indivíduo após três anos de
aquisição da infecção, por causa das formas resistentes presentes no fígado
(Sweeney, 1999). Essa doença caracteriza-se por acessos de febre com
intervalos de 24, 48 ou 72 horas, provocando danos no fígado e anemia.
A malária foi responsável por 34% das mortes registradas em todo o
mundo no ano de 2006 (OMS, 2008). Estima-se a ocorrência de 300 milhões
de novos casos e um milhão de mortes por ano. No Brasil, o quadro
epidemiológico da malária é preocupante, pois o número de casos ainda foi
superior a 300.000 no ano passado, e destes, 99,9% ocorreram na região
amazônica (Ministério da Saúde, 2010).
Na primeira metade do século XX, a malária provocou mais de 10 mil
mortes entre os trabalhadores durante a construção da ferrovia Madeira-
Mamoré, localizada no estado de Rondônia (Silva e Oliveira, 2002). Antes da
década de 40, essa doença abrangia grande parte do território brasileiro, sendo
considerado um verdadeiro desafio à colonização da Amazônia.
Na década seguinte, o Serviço Nacional de Malária sob o amparo da
Organização Mundial de Saúde (OMS), programou uma campanha de
erradicação da malária, fazendo uso de inseticidas, como o DDT (Dicloro-
Difenil-Tricloroetano) e drogas antimaláricas sintéticas, como a cloroquina.
Essa campanha obteve grande sucesso na região litorânea do país, mas os
casos da doença continuaram presentes na região amazônica (Deane, 1992;
Silva e Oliveira, 2002; Loiola et al., 2002).
Devido a instalações de grandes empreendimentos que provocaram
fortes intervenções ambientais, na década de 80, houve um desequilíbrio no
complexo homem/parasito/vetor, levando ao agravamento da situação
epidemiológica da malária, que passou a ter altos índices de prevalência na
região amazônica, em média 96% a 99% dos casos do Brasil (Tadei et al.,
1993).
Estima-se que, mais de 40% da população mundial está exposta ao
risco de adquirir a malária. A incidência dessa doença no nosso país teve um
aumento em 2005, registrando 607.801 casos, sendo a espécie P. vivax de
maior prevalência (73,4%). Seguido de uma redução no número de casos de
2006 (550.917) a 2009 (306.908). O que mostra uma importante redução de
5
9% em 2006, quando comparado com 2005, e de 44% em 2009 em relação a
2006 (Ministério da Saúde, 2010).
Postula-se que em 2007, somente em três estados, Amazonas,
Rondônia e Pará, registraram 354 mil casos, ou seja, 78% das ocorrências. A
ocupação desordenada dos espaços peri-urbanos tem sido um fator importante
no aumento da malária em cidades como Manaus, Porto Velho e Cruzeiro do
Sul, notificando-se 24% dos casos, nesse mesmo ano, nesses três municípios
(Ministério da Saúde, 2008). Em 2009, esses mesmos estados registraram
239.762 casos, 78% das ocorrências, sendo o estado do Pará o que
apresentou o maior número de casos da doença no decorrer do ano (Ministério
da Saúde, 2010).
Os dados da literatura possibilitaram verificar que ainda é necessário
conhecer com maior profundidade a biologia e o comportamento hematofágico
de anofelinos brasileiros, os quais constituem parâmetros relevantes no
controle da malária (Tadei, 1993). Além desses dados, outros estudos
envolvendo citogenética e genética de populações, com a utilização de
marcadores moleculares têm auxiliado para responder questões sobre essa
problemática.
1.3. Marcadores microssatélites
Diferentes marcadores moleculares têm sido empregados para conhecer
a estrutura genética de populações de mosquitos vetores de doenças na
tentativa de entender a dinâmica populacional e os mecanismos envolvidos na
capacidade vetorial das espécies desses mosquitos (Rafael e Tadei, 1998;
Santos et al., 1999; Manguin et al., 1999; Paupy et al., 2008; Endersby et al.,
2009; Paris et al., 2010). Entre eles, a análise de polimorfismo dos
microssatélites vem sendo muito empregada em estudos populacionais e no
esclarecimento do status taxonômico das espécies de Anopheles (Lanzaro et
al., 1998; Sunil et al., 2004; Li et al., 2005; Temu e Yan, 2005; Conn et al.,
2006; Mirabello e Conn, 2006; Angêlla et al., 2007; Scarpassa e Conn, 2007;
Mirabello et al., 2008, Silva et al., 2008; Midega et al., 2010).
6
Marcadores Moleculares Microssatélites ou Sequências Simples
Repetidas (SSR), também chamadas Variable Number of Tandem Repeats
(VNTR), Sequence Tagged Microsatellites (STMS) ou Single Sequence Length
Polymorphisms (SSLP) são pequenas seqüências com um a seis nucleotídeos,
repetidas em tandem, distribuídas no genoma nuclear dos organismos
eucariotos, sendo caracterizadas como um poderoso marcador molecular para
estudar os padrões de fluxo gênico e estimar a diferenciação genética intra e
interespecífica.
Os microssatélites são os marcadores moleculares mais polimórficos
conhecidos atualmente. Apresentam expressão codominante, multi-alélicos,
taxa de mutação elevada e são seletivamente neutros (Estoup et al., 1995;
Lanzaro et al., 1995). Os locos microssatélites evoluem de processos
mutacionais, decorrentes dos escorregões da DNA polimerase ou de crossing-
over desigual. Apesar de suas altas taxas evolutivas, eles são conservativos
em suas regiões flanqueadoras e podem persistir por um longo período sem
modificações (Zardoya et al., 1996).
Todas as características que fazem os microssatélites serem tão
eficientes para as análises moleculares podem ser verificadas a partir da
técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), a qual é possível
amplificar várias vezes a mesma sequência desejada (Mullins, 1990), utilizando
primers específicos que flanqueiam estas regiões, sendo posteriormente,
visualizadas em géis de agarose ou poliacrilamida.
Nos últimos anos, os microssatélites vêm sendo muito utilizados para
analisar a estrutura genética de populações de vários eucariotos, incluindo os
vetores da malária humana, particularmente, Anopheles gambiae, Anopheles
arabiensis, Anopheles maculatus de regiões africanas (Rongnoparut et al.,
1996; Lehmann et al., 1997; Kamau et al., 1999; Temu e Yan, 2005; Midega et
al., 2010), e A. darlingi, Anopheles marajoara e Anopheles stephensis do Brasil
(Conn et al., 2001; Verardi et al., 2002; Li et al., 2005; Angêlla et al., 2007;
Scarpassa e Conn, 2007; Mirabello et al., 2008).
Os marcadores microssatélites têm mostrado também um crescente
potencial para aplicação em estudos genéticos de evolução e conservação
(Angers e Bernatchez, 1996), e em análises de sistemas de cruzamento em
populações naturais (Jones e Avise, 1997).
7
1.3.1. Isolamento, caracterização e amplificação heteróloga de locos microssatélites
O desenvolvimento de marcadores microssatélites é uma etapa
necessária para isolar locos microssatélites eficientes para estimar a variabilidade
genética entre as populações, fluxo gênico e estrutura genética populacional de
uma determinada espécie. Outra característica importante é sua transferibilidade,
que permite a aplicação desses marcadores desenvolvidos em uma espécie para
outras espécies geneticamente relacionadas (Ferreira e Grattapaglia, 1998;
Falcão et al., 2004; Batista et al., 2009; Bataille et al., 2009).
Já foram desenvolvidos marcadores microssatélites em diferentes
organismos, e entre eles, abelha sem ferrão: Melipona seminigra merrillae
(Francini et al., 2009), mamoeiro: Carica papaya (Oliveira et al., 2008), tambaqui:
Colossoma macropomum (Santos et al., 2009) e dourada: Brachyplatystoma
rousseauxii (Batista et al., 2009) entre outros. Dentre os anofelinos, já foram
isolados e caracterizados microssatélites em Anopheles gambiae (Zheng et al.,
1993), Anopheles funestus (Sharakhov et al., 2001; Cohuet et al., 2002;
Schemerhorn et al., 2003), Anopheles stephensis (Verardi et al., 2002),
Anopheles moucheti (Annan et al., 2003), Anopheles maculipennis (Weill et al.,
2003), Anopheles nili (Berthomieu et al., 2003), Anopheles sacharovi (Guillemin et
al., 2003), Anopheles culicifacies (Sunil et al., 2004), A. marajoara (Li et al., 2005),
Anopheles sinensis (Jung et al., 2006; Ma e Fan, 2008) e A. darlingi (Coon et al.,
2001; Lima et al., 2010).
O primeiro trabalho com desenvolvimento de locos microssatélites em
anofelinos foi realizado em A. gambiae por Zheng et al. (1993), com o objetivo
de construir um mapa genético para estudos de linkage. Nesse estudo,
isolaram 24 locos microssatélites no estudo do cromossomo X. Posteriormente,
foram desenvolvidos nessa mesma espécie, mais 131 locos (Zheng et al.,
1996).
Foram isolados e caracterizados 39 locos microssatélites em A.
funestus, um dos principais vetores da malária africana. Foram analisados 20
locos em duas populações: Burkina Faso e Kenya. Nove locos mostraram-se
8
polimórficos, sendo a diversidade genética similar entre as localidades
estudadas, 0,77 em Burkina Faso e 0,78 no Kenya (Schemerhorn et al., 2003).
Neste mesmo ano, Weill et al. (2003) isolaram e caracterizaram 15 locos
microssatélites polimórficos de uma população de A. maculipennis procedente
de Montpellier – França. A análise da variabilidade genética mostrou alta
diversidade genética nessa população (HE=0,37 - 0,77), e o valor de FIS
variando entre -0,12 e 0,65. Apenas três locos apresentaram desequilíbrio de
Hardy Weinberg, decorrentes da deficiência de heterozigotos e presença de
alelos nulos.
Estudo similar também foi realizado por Sunil et al. (2004), que
desenvolveram 31 marcadores microssatélites em A. culicifacies, um
importante vetor da malária no subcontinente indiano. Esta espécie é um
complexo de cinco espécies crípticas, das quais, quatro são vetoras da malária.
A variabilidade de cada loco foi avaliada em duas espécies irmãs, espécie A e
B. A freqüência do número de alelos variou de 2 a 12, na espécie A e de 2 a 7,
na espécie B. A heterozigosidade observada variou entre 0,00 - 0,6.
Regiões contendo microssatélites também foram isoladas e
caracterizadas de A. marajoara a partir de uma biblioteca enriquecida contendo
500 clones recombinantes. A partir de primers desenhados para um total de 40
locos, onze foram polimórficos. Estes locos microssatélites foram usados para
estimar a diferenciação de uma população do norte do Brasil, onde se
mostraram altamente polimórficos, com o numero de alelos variando de 11 a 52
e a heterozigosidade esperada de 0,64 a 0,95 (Li et al., 2005).
Em A. darlingi, foram desenvolvidos oito locos microssatélites
polimórficos em uma população procedente de Capanema (PA), a partir de
uma biblioteca de 242760 clones individuais. Nesse estudo, encontraram
heterozigosidade média observada (HO) variando entre 0,368 a 0,769 (Conn et
al., 2001). Ainda que esses locos tenham sido desenvolvidos, nos testes em
laboratório realizados em populações dessa espécie da Amazônia, não se
obteve amplificação dos mesmos, após várias tentativas de otimização. Diante
disso, bem como da importância epidemiológica de A. darlingi e da eficiência
desses marcadores moleculares para a análise da estrutura genética de
populações, é extremamente importante o isolamento e caracterização de
novos locos microssatélites.
9
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Isolar e caracterizar marcadores microssatélites em A. darlingi, e validá-
los na estimativa da variabilidade genética de duas populações do Estado do
Amazonas.
2.2. Objetivos específicos
• Construir uma biblioteca genômica enriquecida com regiões de DNA
microssatélite de A. darlingi;
• Gerar a seqüência nucleotídica dos clones recombinantes da biblioteca
genômica;
• Caracterizar a biblioteca genômica;
• Desenhar primers a partir das seqüências nucleotídicas dos clones que
possuírem regiões com microssatélites;
• Testar os locos microssatélites para A. darlingi e verificar os locos
polimórficos que possam ser utilizados como marcadores em estudo de
genética de populações;
• Verificar o alcance da amplificação heteróloga dos locos microssatélites
desenvolvidos para A. darlingi em três espécies de Anopheles (A.
benarrochi, A. rangeli e A. triannulatus) do subgênero Nyssorhynchus;
• Analisar a variabilidade e estrutura genética de duas populações de A.
darlingi no Estado do Amazonas.
10
Capítulo 1 : Marcadores de DNA microssatélite de Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae), principal vetor da malária no Brasil: desenvolvimento, caracterização
e amplificação interespecífica
A maioria dos resultados que constam no presente capítulo foi publicado na revista Conservation Genetics Resources durante o desenvolvimento da presente Dissertação (APÊNDICE A). Lima, G. N.; Batista, J. S.; Formiga, K. M.; Cidade, F. W.; Rafael, M. S.; Tadei, W. P.; Santos, J. M. M. New 24 polymorphic DNA microsatellite loci for the major malaria vector Anopheles darlingi and transpecies amplification with another anophelines. Conservation Genet Resour. DOI 10.1007/s12686-010-9237-y. O presente capítulo seguiu as regras de formatação e estilo da referida revista incluindo outros resultados obtidos no presente estudo.
11
Resumo O mosquito Anopheles darlingi é o principal vetor da malária no Brasil,
principalmente na bacia Amazônica. Esta espécie pertence ao subgênero
Nyssorhynchus, sendo considerada a mais antropofílica e endofágica das
espécies de Anopheles nas Américas. Considerando sua importância
epidemiológica foram desenvolvidos e caracterizados 36 locos polimórficos a
partir da construção de uma biblioteca genômica enriquecida com regiões
microssatélites de A. darlingi. Dos 96 clones com inserto da biblioteca foram
obtidos 80,2% de sequências nucleotídica de boa qualidade, e apenas 1,3% de
redundância. Destes, 73 clones (94,8%) apresentaram sequências com SSRs.
Foi verificada a presença de 124 SSRs na biblioteca, sendo 1,7 a média do
número de SSRs por clone. A maioria dos motivos de repetição foi classificada
como dinucleotídeos (56,5%), sendo GT/CA o mais encontrado (42,8%). Foram
selecionados 63 clones recombinantes (81,8%) para o desenho dos primers,
dos quais 66 (95,6%) foram sintetizados. Destes trinta e seis marcadores
microssatélites foram isolados e caracterizados em 12-32 indivíduos de A.
darlingi coletados em Coari (Amazonas-Brasil), com os quais foi obtido um total
de 280 alelos. O numero de alelos variou entre 3 a 14, com uma média de
7,778. A heterozigosidade observada (HO) variou entre 0,037 a 0,952 (media
de 0,524), enquanto a heterozigosidade esperada (HE) variou entre 0,177 a
0,883 (média de 0,735). Dezessete locos mostraram desvio significantivo para
o equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) depois da correção de Bonferroni (P:
(5%) ≤ 0,0014). Não foi encontrado desequilíbrio de ligação entre os locos. A
amplificação heteróloga de 24 locos microssatélites resultou entre 8 a 13 locos
polimórficos entre as três espécies do gênero Anopheles. Os locos
microssatélites polimórficos desenvolvidos poderão ser usados como eficientes
marcadores moleculares para estudos de genética de população e
mapeamento genético para A. darlingi e outras espécies de Anopheles.
Palavras chaves: Anopheles darlingi, DNA microssatélite, vetor da malária,
bacia amazônica
12
Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi é o principal e o mais antropofílico e
endofágico vetor da malária na Amazônia brasileira (Tadei et al. 1998, Gil et al.
2003) e em outros países distribuídos pela América do Sul como o Peru,
Colômbia e Suriname (Rozendaal 1990, Vittor et al. 2006). Embora variações
morfológicas e genéticas tenham sido descritas sugerindo que A. darlingi é um
complexo de espécies (Kreutzer et al. 1972, Tadei et al. 1982, Steiner et al.
1982, Rosa-Freitas et al. 1992, Freitas-Sibajev et al. 1995), análises
morfométricas e genéticas usando isoenzimas, RAPD e ITS2 demonstraram a
existência de uma única espécie simples (Manguin et al, 1999). Estudos
usando marcadores de DNA mitocôndrial (COI) e nuclear (5-8 microsatellite
loci) sugerem moderada estruturação genética no nível populacional (Mirabello
and Conn, 2006; Scarpassa and Conn, 2007; Mirabello et al, 2008).
Marcadores microssatélites tem sido amplamente usados para estudos
de populações e outras questões em nível de espécies. Oito locos
microssatélites foram caracterizados (Conn et al., 2001), mas o
desenvolvimento de novos marcadores é um complemento para análises de
populações, mapeamento genético e locos de caracteres quantitativos -
“quantitative trait loci” (QTL) desse importante vetor. Esse estudo reporta o
isolamento e caracterização de 36 marcadores microssatélites para A. darlingi
e a amplificação heteróloga em três espécies do mesmo gênero.
Uma biblioteca genética enriquecida com regiões microssatélites de A.
darlingi foi construída seguindo o método descrito por Billotte et al. (1999) com
algumas modificações. O DNA genômico foi extraído, utilizando o método que
inclui acetato de potássio 3M (Wilkerson et al. 1995) a partir de um pool de 10
espécimes de A. darlingi adultos recém eclodidos, não alimentados e coletados
13
em Coari-AM, Brasil. O DNA extraído foi digerido com enzima de restrição RsaI
(Invitrogen), e os fragmentos digeridos foram ligados aos adaptadores RSA21 e
RSA25. Fragmentos de DNA contendo regiões com microssatélites foram
selecionados por hibridização com sondas (CT)8 e (GT)8 biotiniladas e
recuperadas por esferas magnéticas contendo estreptavidina (Streptavidin
MagneSphere Paramagnetic Particles, Promega). Os fragmentos selecionados
foram ligados ao vetor de clonagem pGEM-T (Promega), e transformados em
células competentes XL1-blue de Escherichia coli. Posteriormente foram
inoculadas em placas contendo X-Gal/IPTG e meio sólido Luria–Bertani (LB)
com ampicilina (100 mg/ml) e incubados entre 18 a 22 horas a 37°C. Colônias
brancas individuais foram transferidas e incubadas a 37°C em placas (96
poços) contendo meio de cultura 2YT-HMFM com ampicilina (100 mg/ml). O
DNA plasmidial foi extraído (Sambrook et al. 1989) de 96 clones e sequenciado
utilizando os primers T7 e SP6, juntamente com o Kit Big Dye terminator v3.1, e
eletroinjetado em ABI PRISM 3130 automated Genetic Analyzer (Perkin Elmer,
Applied Biosystems).
Sequências nucleotídicas de 77 clones (80,2%) da biblioteca foram
editadas usando o programa STADEN package (Staden 1996). A presença de
124 regiões microssatélites em 73 sequências (94,8%) de clones não
redundantes foi identificada com auxílio do programa WEBSAT (Martins et al.
2009), sendo 1,7 a média do número de SSRs por clone. Foram considerados
microssatélites do tipo dinucleotídeos aqueles com mais de cinco repetições do
motivo, trinucleotídeos e tetranucleotídeos com quatro ou mais repetições,
penta e hexanucleotídeos com três ou mais repetições. A maioria dos motivos
de repetição foi classificada como dinucleotídeos (56,5%), sendo GT/CA o mais
14
encontrado (42,8%), seguidos de 25% de trinucleotídeos, 11,2% de compostos,
4% de tetranucleotídeos, 3,2% de penta e hexanucleotídeos. O motivo de
repetição mais freqüente (GT/CA) variou entre 6 a 19 repetições e o SSR com
maior número de repetições encontrado foi do tipo AC, com 26 repetições.
Quanto à natureza de origem foram classificados em 85,5% perfeitos, 11,3%
imperfeitos e 3,2% interrompidos. Foi selecionada a sequência nucleotídica de
63 clones recombinantes (81,8%) para o desenho dos primers, dos quais foram
desenhados 69 pares, com a seguinte classificação: 56 perfeitos (81,2%),
sendo 41 dinucleotídeos, 10 trinucleotídeos, três tetranucleotídeos e dois
compostos; 12 imperfeitos (17,4%), destes, seis são dinucleotídeos e seis
compostos; e um interrompido (1,4%). Esses pares de primers foram
desenhados usando o programa PRIMER3 (Rozen e Skaletsky 2000)
implementado no programa WEBSAT (Martins et al. 2009) e foi adicionada uma
cauda M13 na extremidade 5’ de cada primer forward para permitir a marcação
por fluorescência de acordo com o protocolo sugerido por Schuelke (2000). Do
total de primers desenhados, 66 pares (95,6%) foram sintetizados.
Os fragmentos com microssatélites foram amplificados por PCR em um
volume final de 10 µl contendo: 10–50 ng de DNA genômico, 0,4 µM de cada
primer forward e do primer M13 marcado com a fluorescência (FAM ou HEX),
0,8 µM do primer reverso, 200 µM de cada dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 1X de
tampão (10 mM Tris–HCl, 50 mM KCl, pH 8,4) e 0,5 U de goTaq DNA
Polymerase (Promega). O PCR foi realizado em duas etapas: a desnaturação
(68°C, 1 min; 94°C, 30s), seguido por 30 ciclos de 30s a 93°C, 35s a 60°C, 40s
a 68°C; a segunda etapa consiste de 15 ciclos com as seguintes condições de
temperatura e tempo: 25s a 93°C, 35s a 53°C, 30s a 72°C, e uma extensão
15
final a 68°C por 15 min e 72°C por 15 min. O produto amplificado foi checado
por eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo (0,1
mg) e visualizado em fotodocumentador. Foram gerados oito sistemas
multiplex para a genotipagem das amostras, de forma que em cada sistema
dois locos foram genotipados simultaneamente para o mesmos indivíduo em
cada poço da placa, por meio da combinação dos tamanhos dos alelos e das
fluorescências (FAM ou HEX) de cada loco (Tabela 01). Os sistemas foram
eletroinjetados no analisador de DNA MegaBACE1000 (GE Healthcare) e o
tamanho dos alelos foi estimado usando o padrão de genotipagem ET-550
ROX (GE Healthcare).
Foram obtidos 36 locos microssatélites polimórficos avaliados em 12-32
indivíduos de A. darlingi coletados em Coari (Amazonas, Brasil) cuja
temperatura de anelamento variou entre 53°C a 65°C. A estatística descritiva e
o desequilíbrio de ligação (DL) foram inferidos usando o programa FSTAT
v2.9.3.2 (Goudet, 2002). O Conteúdo de Polimorfismo Informativo – PIC
(Botstein et al. 1980) foi estimado com o programa MS TOOLS v3 (Park 2001)
e o teste para o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) com o auxílio do
programa GENEPOP v4 (Raymond e Rousset 1995).
Foram obtidos um total de 280 alelos, com número de alelos por loco
variando de 3 (Ada28) a 14 (Ada35), e média de 7,778. A heterozigosidade
observada (HO) variou entre 0,037 e 0,952 (Ada10 – Ada57, respectivamente)
com uma média de 0,524, enquanto a heterozigosidade esperada (HE) variou
entre 0,177 a 0,883 (Ada10 e Ada35, respectivamente) com a média de 0,735.
O PIC variou entre 0,168 (Ada10) a 0,853 (Ada35), com a média de 0,687
(Tabela1). Dezessete locos (Ada10, Ada14, Ada17, Ada18, Ada21, Ada22,
16
Ada25, Ada29, Ada30, Ada33, Ada37, Ada47, Ada48, Ada59, Ada60, Ada62 e
Ada63) mostraram desvio significativo para HWE depois da correção de
Bonferroni (P: (5%) ≤ 0,0014) (Rice 1989). Esse desvio pode ser devido a um
ou vários fatores como, o intenso uso de inseticidas para controle da malária na
região, onde as amostras foram coletadas causando o efeito gargalo de garrafa
ou pressão seletiva; efeito de amostragem, e principalmente o tamanho
insuficiente das amostras para detectar todos os alelos ou mesmo, a presença
de alelos nulos como sugere o programa Microchecker v2.2.3 (Van Oosterhout
et al. 2004) detectada nos locos Ada10, Ada14, Ada17, Ada18, Ada21, Ada22,
Ada25, Ada33, Ada 37, Ada47, Ada48, Ada59, Ada60, Ada62 e Ada63. Não foi
encontrado desequilíbrio de ligação entre todos os pares de locos, segundo a
correção de Bonferroni (P: (5%) ≤ 0,000061). O poder de discriminação (D)
(Jones 1972) foi estimado para cada loco e variou entre 0.395 (Ada10) e 0,986
(Ada35, Ada57), com uma média de 0,903 (Tabela 02).
Foram testados 24 marcadores polimórficos para amplificação
heteróloga em três espécies de Anopheles (Tabela 03). Oito locos foram
amplificados em todas as três espécies e 17 locos amplificaram em pelo menos
uma espécie. O numero de marcadores amplificados variou entre 10 (A.
rangeli) e 15 (A. benarrochi). Treze locos foram polimórficos em pelo menos
uma espécie (A. triannulatus) e sete nas três espécies, com o número de alelos
variando entre 2 a 5 por loco.
Os 36 microssatélites polimórficos desenvolvidos podem ser usados
como eficientes marcadores para analisar genética de populações e
mapeamento genético de A. darlingi e outras espécies de Anopheles.
17
Multiplex Locos Tamanho (pb) FluorescênciaAda22 158-186 FAMAda32 180-198 HEXAda17 166-208 HEXAda37 231-265 FAMAda39 271-287 HEXAda27 119-163 FAMAda62 227-295 HEXAda09 142-154 FAMAda30 318-331 HEXAda10 142-186 FAMAda48 265-283 HEXAda06 96-118 FAMAda23 124-168 HEXAda03 253-283 FAMAda20 302-332 FAMAda33 140-156 HEXAda41 275-301 FAMAda40 201-235 FAMAda18 240-272 HEXAda60 233-254 FAMAda63 177-213 HEXAda21 280-310 FAMAda25 304-332 FAMAda24 215-225 FAMAda34 89-105 HEXAda47 223-275 HEXAda62 227-295 HEXAda52 134-150 FAMAda57 188-210 HEXAda59 248-263 HEXAda64 116-134 FAMAda61 274-284 HEXAda35 176-226 FAMAda50 189-203 FAMAda28 122-132 HEXAda14 113-143 HEX
6
7
8
2
3
4
5
1
Tabela 01. Oito sistemas multiplex utilizados para genotipagem dos indivíduos de Anopheles darlingi procedentes de Coari.
18
Locos SSR
N° de acesso Genbank
Motivo de repetição Sequência do primer (5'- 3')Ta
(°C)N A
Tamanho (pb)
PIC D HO HE P -HWE FIS
FFAM:AGAGAGCTAATGCGGTTGGTCR:ACGTTCCTCTACTCCGAAAGC
FFAM:TTAATCACTTGCGACAGACCR:GACTCCATTCCTTGAACCA
FFAM:GTCATCATCGTCGTCGGAATR:CTGCAACCAGCGAGTTCTTAC
FFAM:GCAACAGACCAGACCAGACATR:CCTGGACGCTCTGTGCGC
Ada14 x (CA)11x 53 27 10a 113-143 0,773 0,925 0,296 0,810 0,0000* 0,639
FHEX:GGGTAGTAAAGCAACTGAAGCCR:CTACAGCAAGCGAAGGGAAG
FHEX:GACACTCCGCACTCTCTTCACR:GCTTGCCCATAACTCTCACC
FFAM:AGCAATATGTTCCCGACAGCR:CGGCTTCTAAATGACTCCTAGC
FFAM:GGTAGTCCGAGAGGAGAGGTGR:GCAGGACAAAACCAATCTGC
FFAM:GGCTTCCGTCTTCTTCTATTCCR:GTCCTTACGCACGGTTTCTC
FHEX:ACTCGTTCGTGCTCTGTCACTR:TGCAGTGTGTTGTGTCCTCA
FFAM:GTGAGCACATGGAAGCGTAGR:GACTGCTGTGGATGGAAGAAG
FFAM:CTCTCTGTGTTCTGCCTCACCR:GCAACTGGTTCTGGTTCGAG
FFAM:AGCGGATCTACCTACGGGTTAR:CGCTATCAGCATCATCATCG
Ada28 x (CTCG)4 x 54 27 3 122-132 0,391 0,782 0,296 0,507 0,0377 0,42
FFAM:GAAGGAGGCAGCACTAGCACR:GGACAACCGAAGCAATCAAG
FHEX:AAGTCCCACGAAGGTCTCACR:GATGCAGTGACGATGACACAC
FHEX:TCACTAGCGTATGTGCGAGGR:TCGAATGACCTTTGGGAGAC
0,806 0,748 0,8308 -0,08
0,032
Ada32 GU120064 (CAC)6 60 31 7 180-198 0,691 0,907
0,827 0,633 0,654 0,0004*30 7 318-331 0,600Ada30 GU120063 (GT)7 60
0,593 0,762 0,0000* 0,226
0,053
Ada29 GU120062 (CGT)15 60 27 7 66-84 0,706 0,901
0,956 0,781 0,824 0,625232 10 119-163 0,789Ada27 GU065372 (CA)8 60
0,269 0,845 0,0000* 0,686
0,045
Ada25 GU065371 (CA)9 60 26 9a 304-332 0,806 0,950
0,845 0,643 0,673 0,001628 5 215-225 0,606Ada24 GU065370 (AC)9 60
0,613 0,709 0,3689 0,137
0,616
Ada23 GU065369 (AC)7 60 31 8 124-168 0,669 0,903
0,931 0,292 0,750 0,0000*24 8a 158-186 0,703Ada22 GU065368 (CA)8 60
0,548 0,846 0,0000* 0,356
0,113
Ada21 GU065367 (TG)8 60 31 7a 280-310 0,811 0,946
0,962 0,741 0,833 0,028927 9 302-332 0,798Ada20 GU065366 (GT)10 60
0,417 0,826 0,0000* 0,501
0,251
Ada18 GU065365 (AC)9 t (CA)5 60 24 8a 240-272 0,784 0,952
0,966 0,655 0,871 0,0000*29 10a 166-208 0,840Ada17 GU065364 (CA)10 cg (CA)8 60
0,037 0,177 0,0004* 0,794
-0,098
Ada10 GU065363 (AC)10 60 27 4a 142-186 0,168 0,395
0,923 0,833 0,760 0,719430 7 142-154 0,715Ada09 GU059869 (GT)9 60
0,567 0,666 0,1013 0,151
0,311
Ada06 GU059868 (CA)8 60 30 7 96-118 0,591 0,865
0,839 0,429 0,618 0,020828 9 253-283 0,588Ada03 GU059866 (AC)12 60
Tabela 02. Caracterização de 36 locos microssatélites polimórficos de Anopheles darlingi, procedentes de Coari, Amazonas, Brasil.
(continua)
19
Tabela 02. Caracterização de 36 locos microssatélites polimórficos de Anopheles darlingi, procedentes de Coari, Amazonas, Brasil.
Locos SSR
N° de acesso Genbank
Motivo de repetição Sequência do primer (5'- 3')Ta (°C)
N ATamanho
(pb)PIC D HO HE P -HWE FIS
FHEX:CTGCGTTCCCACTATGCTTTR:CTCCGTCTCTCCGTCTCTCTT
Ada34 x (CA)8 x 65 28 8 89-105 0,692 0,927 0,750 0,731 0,3792 -0,027
Ada35 x (CT)15 x 64 27 14 176-226 0,853 0,986 0,704 0,883 0,0612 0,206
FFAM:ACCATCACTGCTTACCGACACR:AACGACACACCAGGAAAAGG
FHEX:GATCGCAGTAGCTGAAAGTCGR:GAATATCGCGGTGGATCAG
FFAM:TACTACTGATTGGCGCTCCTGR:ACTACGGGTCCTCTCGTGTTC
FFAM:CGCTGAGAACATTGGGTAGTCR:GTGGTACTGCGAGGATCAAAG
Ada47 x (AC)8 x 63 25 11a 223-275 0,760 0,950 0,520 0,797 0,0007* 0,352
FHEX:CGACGGTGAACTGAACTCGR:CACTCGTGGGAACTGCTTTC
Ada50 x (GTGC)5 x 64 28 4 189-203 0,646 0,889 0,786 0,717 0,6534 -0,098
Ada52 x (AC)5gg(AC)5 x 64 25 5 134-150 0,623 0,929 0,680 0,696 0,8112 0,023
Ada57 x (CT)8 x 62 21 10 188-210 0,834 0,986 0,952 0,871 0,6598 -0,096
Ada59 x (CAG)8 x 62 26 5a 248-263 0,680 0,909 0,269 0,741 0,0000* 0,641
FFAM:GCATATAGCCCCTTTTCCTCCR:CTGCCGTCTCGTGTTTAGTGT
Ada61 x (TG)14 x 59 12 5 274-284 0,648 0,982 0,500 0,714 0,0258 0,309
Ada62 x (CA)8 x 62 26 13a 227-295 0,850 0,982 0,577 0,882 0,0003* 0,35
FHEX:TGTTGCCTTGACTATCCTTTTGR:TATTCGTTGTGTTGTGTTCGC
Ada64 x (TG)5 x 63 27 8 116-134 0,762 0,942 0,889 0,809 0,2021 -0,102
Ada33 GU120065 (GT)11 60 31 9a 140-156 0,794 0,954 0,516 0,830 0,0006* 0,382
Ada37 GU120066 (AC)3 at (AC)6 60 30 4a 231-265 0,678 0,881 0,333 0,741 0,0000* 0,554
Ada39 GU120067 (GT)13 60 23 4 271-287 0,474 0,855 0,304 0,532 0,0282 0,434
Ada40 GU120068 (TC)19 60 25 9 201-235 0,564 0,883 0,560 0,598 0,1168 0,065
Ada41 GU120069 (TG)10 60 31 10 275-301 0,694 0,913 0,581 0,737 0,1366 0,215
Ada48 GU120070 (GGT)4 60 29 7a 265-283 0,676 0,865 0,345 0,727 0,0000* 0,53
Ada60 GU908493 (AAG)9 60 21 8a 233-254 0,778 0,960 0,286 0,822 0,0000* 0,658
Ada63 GU120071 (GT)9 60 22 11a 177-213 0,778 0,933 0,227 0,815 0,0000* 0,726
Ta = temperatura de anelamento; N = número de indivíduos analisados; A = número de alelos; a = presença de alelo nulo; pb = pares de bases; PIC = Conteúdo de Polimorfismo Informativo; D = poder descriminante; HO = heterozigosidade observada; HE = heterozigosidade esperada; FIS = coeficiente de endogamia; P-HWE* = locos que não se mostraram em equilíbrio Hardy-Weinberg após correção de Bonferroni; x = locos ainda não publicados.
20
Tabela 03. Amplificação interespecífica de 24 locos microssatélites desenvolvidos para Anopheles darlingi.
* = Temperatura de anelamento usada na PCR conforme descrito na tabela 1 usando N = 5 para todas as espécies; A = número de alelos; x = não amplificou.
Tamanho Tamanho Tamanho (pb) (pb) (pb)
AD03 x x xAD06 85-103 3 103 1 83-103 3AD09 151-153 2 x 143-153 2AD10 x x xAD17 x x xAD18 x x xAD20 300-332 3 320-332 2 310-332 2AD21 x x xAD22 176-182 2 176-182 2 176-182 2AD23 124-126 2 124-126 2 120-124 2AD24 243-253 5 237-247 2 237-247 2AD25 275-295 2 295-307 2 xAD27 124-154 2 134-158 2 126-130 2AD29 x x 82-100 2AD30 x x 335 1AD32 x x 199 1AD33 88-138 2 114-144 2 88-98 3AD37 192-234 4 182-212 3 192-212 2AD39 x x xAD40 204-216 3 212 1 xAD41 262-284 5 x 264-300 2AD48 x x xAD60 x x 233 1AD63 143-189 2 x 187 1
Locos SSR
A. triannulatus* A. rangeli* A. benarrochi*
A A A
21
Capítulo 2 : Estimativa da variabilidade genética de duas populações de Anopheles darlingi (Diptera:
Culicidae) do Estado do Amazonas, utilizando marcadores microssatélites
22
1. INTRODUÇÃO
Anopheles darlingi é conhecido popularmente como mosquito-prego,
pois ao pousar forma um ângulo de 90º com a superfície. Apresenta pequeno
ou médio porte, com tarsos posteriores III a V completamente brancos ou
apresentando pequeno anel escuro basal nos tarsômeros III e/ou V (Faran,
1980). É considerado o principal vetor da malária em todo o país, e
particularmente, na Amazônia. Apresenta-se como a espécie mais antropofílica
e endofágica entre todas as de Anopheles das Américas.
Anopheles, Aedes e Culex são os gêneros de mosquitos mais
estudados, devido a sua importância médica como vetores de doenças e pela
sua complexa posição taxonômica (Santos, 1992). O uso de diferentes
marcadores moleculares para analisar a estrutura genética das populações de
insetos vetores, a caracterização de genes de resistência a inseticidas, o
sequenciamento dos genomas totais e funcionais têm sido intensificados para
tentar subsidiar programas de controle (Manguin et al.,1999; Holt et al., 2002;
Hemingway et al., 2002).
Neste contexto, a biologia molecular, por meio de diferentes marcadores
moleculares tem contribuído para conhecer a estrutura genética populacional e
entender os mecanismos envolvidos na dinâmica de transmissão da malária.
A variabilidade genética é um fenômeno biológico que ocorre
naturalmente entre as populações e tem levado especialistas a desenvolver
métodos para quantificar e explicar essa variabilidade em relação a sua origem,
manutenção e importância para a evolução (Hartl, 1981). Do ponto de vista da
genética de populações a variabilidade genética é o atributo mais importante de
uma população, já que esta constitui a matéria-prima sobre a qual a mutação, a
migração, a deriva genética e principalmente a seleção natural vão atuar
permitindo adaptação, especiação e evolução.
Alguns estudos envolvendo a genética de populações têm sido
realizados com A. darlingi, principalmente, para entender como se comporta a
variabilidade genética a nível populacional. Dados baseado em sítios de
restrição do DNA mitocondrial e caracteres morfológicos em quatro populações
da Amazônia e duas do sudeste brasileiro, sugeriram que essa espécie poderia
23
ser um complexo de espécies (Freitas-Sibajev et al., 1995). Dessas populações
analisadas, a de Manaus apresentou divergência interpopulacional dentro do
limite de distância genética interespecífica para membros de complexos de
espécies de anofelinos.
Estudos realizados por Rafael e Tadei (1998) em duas populações da
Amazônia, utilizando cariótipos metafásicos de células ganglionais cerebrais e
bandamento C mostraram pequenas diferenças quanto à constrição secundária
no cromossomo II da população de Manaus (AM) e no cromossomo III da
população de Macapá (AP). Duas formas de cromossomos X foram
observadas: X1-marcado em cerca de 1/3 a partir do centrômero; e X2 - com
marcação apenas centromérica. O padrão de marcação dos blocos
heterocromáticos dos cromossomos sexuais e da região centromérica dos
autossomos mostrou apenas variação intraespecífica.
Em contrapartida, Manguin et al. (1999), baseados em caracteres
morfológicos, isoenzimas, DNA ribossômico (ITS-2) e RAPD em populações de
A. darlingi procedentes de sete países, incluindo Belize, na América Central e
Venezuela, Guiana Francesa, Colômbia, Peru, Bolívia e Brasil, na América do
Sul, evidenciaram que esta espécie é monotípica, embora divergência genética
significativa tenha sido observada na população de Peixoto de Azevedo (Mato
Grosso), quando comparada com outras populações brasileiras. A população
de Belize apresentou uma pequena deleção de três bases (CCC), quando
comparadas com as populações da América do Sul, que representa uma
diferença de 0,74% de variação intraespecífica no ITS2. Porém, quando as
relações entre os táxons foram construídas usando somente o ITS2 das
populações de A. darlingi da América do Sul e de Belize, os dados sugerem um
táxon monofilético, incluindo uma politomia basal não resolvida.
Utilizando isoenzimas para analisar a variabilidade genética, Santos et
al. (1999) analisaram 19 locos isoenzimáticos em populações de A. darlingi da
Amazônia e verificaram um elevado polimorfismo e uma pequena diferenciação
genética de origem intrapopulacional. Outro estudo foi realizado por Santos et
al. (2003), baseado em oito locos isoenzimáticos em populações de cinco
espécies de Anopheles da Amazônia brasileira: A. darlingi, Anopheles
triannulatus, Anopheles mattogrossensis, Anopheles albitarsis e Anopheles
intermedius.
24
Conn et al. (2006) utilizando oito locos microssatélites em populações de
A. darlingi dos estados do Amapá, Pará e Mato Grosso, encontraram
estruturação genética, com 18% de diferenciação genética entre as populações
das regiões norte e sul do rio Amazonas, propondo um grau de isolamento
genético atribuído, possivelmente, a isolamento por distância.
Ainda, baseados nesses mesmos locos microssatélites, Scarpassa e
Conn (2007), analisaram a variabilidade genética de nove populações de A.
darlingi da Amazônia brasileira e verificaram altos níveis de polimorfismos em
todos os locos analisados. A Análise de Variância Molecular (AMOVA) indicou
que 95-94% da variância foi ao nível populacional, havendo uma correlação
significativa entre a distância genética e geográfica. Os valores de FST reforçam
o modelo de isolamento por distância. Esse estudo sugere pouca estrutura
genética para A. darlingi da Amazônia brasileira central e ocidental.
Angêlla et al. (2007) analisaram populações de A. darlingi provenientes
de quatro localidades de Porto Velho, utilizando o fragmento do gene
mitocondrial ND4. Essas análises não demonstraram estrutura genética
significativa entre as populações.
Também utilizando marcador mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI),
Pedro e Sallum (2009) analisaram a estrutura filogeográfica dessa espécie,
baseada em seis populações da América do Sul: Colômbia, Amazônia central,
sul e sudeste brasileiro, e dois grupos no nordeste do Brasil. A expansão não
foi homogênea, formando no mínimo dois subgrupos decorrentes da barreira
geográfica. Os autores sugerem que esse isolamento se deve ao rio
Amazonas, costas montanhosas do sudeste do Brasil e as Cordilheiras dos
Andes.
Utilizando marcadores RAPD em quatro populações naturais de A.
darlingi da Amazônia brasileira, Silva et al. (2008) encontraram elevada
variabilidade genética nessas populações, revelando pequena estruturação
genética, indicando redução do fluxo gênico entre essas populações. Outro
estudo realizado por Silva et al. (2010), com o mesmo marcador, entre duas
populações de A. darlingi do estado do Amazonas, revelaram moderada
variabilidade genética entre Coari (HE= 0,285- 0,307) e Manaus (HE= 0,273-
0,274), mas com os valores de heterozigosidade média esperada muito similar.
25
Esses dados também evidenciaram que as subpopulações do intradomicílio
apresentaram a maior variabilidade genética.
Mirabello et al. (2008) analisaram a estrutura genética de 31 populações
de A. darlingi procedentes da América Central, Amazônia peruana e brasileira
baseado em 5 a 8 locos microssatélites. Foram encontrados altos níveis de
polimorfismo na Amazônia brasileira e peruana, e baixo nível na América
Central. Estimativas de diferenciação genética entre populações da América
Central e da Amazônia revelaram valores elevados e altamente significativos. A
matriz de distância genética separou as populações em dois grupos: um
incluindo as amostras de Belize e Guatemala (genótipo 1) e o outro, incluindo
todas as amostras da Amazônia peruana e brasileira (genótipo 2). Estimativas
do fluxo gênico revelaram baixo ou nenhuma recorrência entre o genótipo 1 e
2, com moderado nível de diferenciação genética atribuído ao isolamento por
distância.
26
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Obtenção das amostras de DNA de Anopheles darlingi
As amostras foram obtidas em Coari (4° 5′ 6″ S, 63° 8′ 27″ W) e em São
Gabriel da Cachoeira (0° 7′ 48″ S, 67° 5′ 20″ W), Estado do Amazonas (Figura
02). Foram utilizados 30 indivíduos para cada população, sendo um de cada
progênie.
As fêmeas de A. darlingi foram coletadas no peridomicílio, entre 18:00 e
22:00 horas e transferidas para o Laboratório de Vetores da Malária e Dengue
do INPA, para as posturas individuais. Após as oviposições, as fêmeas foram
identificadas, segundo a chave entomológica de Consoli e Lourenço-de-Oliveira
(1994). Os descendentes foram mantidos até o estágio adulto, conforme a
metodologia de Santos et al. (1981), os quais foram congelados imediatamente
após a eclosão, em freezer -70°C até o momento das extrações de DNA.
Figura 02. Locais de coletas de Anopheles darlingi no Estado do Amazonas. 1-São Gabriel da Cachoeira, 2-Coari.
1
2
27
2.2. Extração e quantificação de DNA
A extração de DNA foi feita segundo protocolo de Wilkerson et al.
(1995), utilizando um indivíduo de cada progênie, num total de 30 indivíduos
para cada população. O protocolo de extração consta das seguintes etapas:
macerar larvas individuais em tampão de lise com auxílio de pistilos, incubar
em banho-maria por 30 minutos a 65°C, acrescentar RNAse (100µg/ml) em
cada tubo, centrifugar, adicionar acetato de potássio (3M pH 7,2), misturar em
vórtex, deixar em gelo até o outro dia, centrifugar por dez minutos, transferir o
sobrenadante para outro tubo, adicionar etanol absoluto, deixar precipitar,
centrifugar por 30 minutos, descartar o sobrenadante, adicionar etanol 70%,
centrifugar por dez minutos, retirar o sobrenadante, secar o precipitado e
ressuspender em Tris-EDTA.
A concentração do DNA genômico foi determinada em eletroforese
horizontal, em gel de agarose 0,8% por comparação com a concentração
conhecida do DNA do bacteriófago lambda, para estimar qualitativamente a
concentração do DNA das amostras dos indivíduos de A. darlingi, para
posteriores análises moleculares. O gel foi corado com brometo de etídeo,
visualizado em luz ultravioleta, em transluminador (Eagle Eye 2®) e
fotodocumentado em sistema de captura de imagens (Stratagene).
2.3. Amplificação e genotipagem das amostras de DNA de Anopheles
darlingi
Dos 36 locos microssatélites, isolados e caracterizados de A. darlingi
[Capítulo I Tabelas 02; (Lima et al., 2010)] foram selecionados 12 locos
polimórficos para estimar a variabilidade e diferenciação genética entre duas
populações de A. darlingi, sendo uma situada no município de Coari, às
margens do rio Solimões, e a outra em São Gabriel da Cachoeira, às margens
do rio Negro, Estado do Amazonas (Tabela 01). Os critérios de seleção para o
número de locos utilizados nessa análise incluíram: o padrão eletroforético dos
alelos, a sugestão de ocorrência de alelos nulos nos indivíduos da população,
na qual foram caracterizados (Coari-AM), e o tempo disponível para a
conclusão do presente estudo.
28
Locos SSR
Motivo de repetição Sequência do primer (5'-3') Ta(°C) Tamanho (pb) Referência
FFAM:TTAATCACTTGCGACAGACCR:GACTCCATTCCTTGAACCA
FFAM:GTCATCATCGTCGTCGGAATR:CTGCAACCAGCGAGTTCTTAC
FFAM:AGCAATATGTTCCCGACAGCR:CGGCTTCTAAATGACTCCTAGC
FHEX:ACTCGTTCGTGCTCTGTCACTR:TGCAGTGTGTTGTGTCCTCA
FFAM:GTGAGCACATGGAAGCGTAGR:GACTGCTGTGGATGGAAGAAG
FFAM:AGCGGATCTACCTACGGGTTAR:CGCTATCAGCATCATCATCG
FHEX:TCACTAGCGTATGTGCGAGGR:TCGAATGACCTTTGGGAGAC
FFAM:TACTACTGATTGGCGCTCCTGR:ACTACGGGTCCTCTCGTGTTC
FFAM:CGCTGAGAACATTGGGTAGTCR:GTGGTACTGCGAGGATCAAAG
(CA)8 60Ada06 96-118
(GT)9 60Ada09 142-154
(GT)10 60Ada20 302-332
(AC)7 60 124-168Ada23
Ada24 (AC)9 60 221-243
Ada27 (CA)8 60 135-163
Ada32 (CAC)6 60 180-198
Ada34
Ada40
Ada41
Ada52
Ada57
(CA)8 89-10565
(TC)19 60 200-242
(TG)10 60 275-301
(AC)5gg(AC)5
(CT)8
64
63
134-152
188-210
Capítulo I, Tabela 01 Lima et al ., 2010
x
x
x
As amplificações foram realizadas de acordo com o protocolo econômico
de Schuelke (2000), que permite a marcação por fluorescência (FAM ou HEX)
por meio da adição de uma cauda M13 na extremidade 5´ de cada primer
forward dos 12 locos microssatélites (Tabela 01).
Tabela 01. Locos microssatélites utilizados nas análises populacionais de Anopheles darlingi em duas localidades do Estado do Amazonas.
Ta = Temperatura de anelamento; pb = estimativa da variação do tamanho dos alelos, FAM e HEX = fluorescência utilizada em cada loco; x = locos ainda não publicados.
Cada reação foi feita conforme descrito em Lima et al. (2010) em um
volume final de 10 µL contendo: 10-50 ng de DNA genômico, 0,4 µM de cada
primer forward e do primer M13 marcado (com a fluorescência FAM ou HEX,
dependendo do loco), 0,8 µM do primer reverso, 200 µM de cada dNTP (GE
Healthcare), 1,5 MgCl2, 1 X de tampão (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.4) e
0,5 U de goTaq DNA polimerase (Promega). O PCR foi conduzido utilizando
dois programas: o primeiro, consistindo na desnaturação do DNA (68 °C, 1 min;
94 °C, 30s), seguida de 30 ciclos de 30s a 92 ºC, 35s da temperatura de
anelamento específica de cada par de primer (Tabela 01), e 40s a 68 ºC; o
segundo programa consistiu em 15 ciclos com as seguintes condições de
29
temperatura e tempo: 25 s a 92 °C, 35 s a 53 °C, 30 s a 72 °C e uma extensão
final a 68 °C por 15 min e a 72 °C 15 min. O produto de PCR foi verificado em
eletroforese, em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio (0,1 mg/mL)
e fotodocumentado em sistema Eagle Eye II (Stratagene). O tamanho do
fragmento amplificado foi estimado por comparação ao marcador Ladder 1kb
plus (Invitrogen).
Os produtos amplificados foram genotipados em analisador automático
de DNA megaBACE 1000 (GE Healthcare), com 1 uL de produto de PCR
diluído (1:5) e 7 uL da solução, contendo Tween 20 a 0,1% + ET 550R (padrão
de bandas marcadas com ET-ROX com tamanho conhecido, GE Healthcare).
Foram formados quatro sistemas multiplex para a genotipagem das
amostras de DNA, procedentes de São Gabriel da Cachoeira, por meio da
combinação dos tamanhos dos alelos e das fluorescências (FAM ou HEX) de
cada loco (Tabela 02). A combinação de mais de um loco em uma única reação
permite otimizar tempo, reagentes e DNA, uma vez que são genotipados e
analisados dois ou mais locos de um mesmo individuo simultaneamente.
Tabela 02. Sistema multiplex utilizado para genotipagem dos indivíduos de Anopheles darlingi procedentes de São Gabriel da Cachoeira.
Multiplex Locos Tamanho (pb) FluorescênciaAda06 96-118 FAMAda32 180-198 HEXAda23 124-168 HEXAda09 142-154 FAMAda41 275-301 FAMAda27 135-163 HEXAda40 200-242 FAMAda20 302-332 FAMAda24 221-243 FAMAda52 134-152 FAMAda34 89-105 HEXAda57 188-210 HEX
3
4
1
2
30
2.4. Estimativa do tamanho dos alelos, tratamento e montagem do
banco de dados de genotipagem
Os resultados da genotipagem foram analisados com o auxílio do
programa FRAGMENT PROFILER 2.1 (GE Healthcare), de onde foi estimado o
tamanho dos alelos (em pb) usando o padrão de genotipagem ET-550 ROX
(GE Healthcare). Foi gerada uma matriz de dados, contendo o genótipo de
todos os indivíduos amostrados nas duas localidades. Essa matriz foi usada
para as análises e estimativas de parâmetros genéticos. Indivíduos idênticos e
diferenças de tamanho entre os alelos de cada genótipo foram checados com o
auxílio dos programas GENALEX 6.2 (Peakall e Smouse, 2006) e MSTOOLS
(Park, 2001). Foram excluídos 18 pb do tamanho de cada alelo
(correspondente ao tamanho do primer/cauda de M13 fluorescente usado na
PCR), conforme sugerido por Schuelke (2000). Com o programa MICRO-
CHECKER 2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) foi observado a presença de
alelos nulos, stutters (“picos/bandas de gaguejos”) e large dropout, em cada
loco das populações.
Para geração e conversão dos arquivos de entrada, utilizados nos
diferentes programas de análise e estimativa de parâmetros genéticos foram
utilizados os programas MSTOOLS (Park, 2001) e FORMATOMATIC 0.8.1
(Manoukis, 2007).
2.5. Análises estatísticas de genética populacional
O programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2002) foi usado para estimar o
número de alelos (A), o coeficiente de endogamia (FIS) para cada loco e em
cada localidade. Com esse mesmo programa foram calculados o desequilíbrio
de ligação (DL), a riqueza alélica (AR) e o número total de alelos (AT). O
Conteúdo de Polimorfismo Informativo (PIC) (Botstein et al., 1980), a
heterozigosidade observada (HO) e esperada (HE) foram estimados com o
programa MSTOOLS (Park, 2001). O desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg
(EHW) foi verificado pelo programa GENEPOP v4 (Raymond e Rousset 1995),
o número de alelos exclusivos em cada localidade foi estimado com o
programa GENALEX 6.2 (Peakall e Smouse, 2006) e a média da diversidade
31
gênica foi calculada com o programa ARLEQUIN (Excoffier et al., 2005). Os
níveis de significância estatísticos foram ajustados por meio da correção
sequencial de Bonferroni para os testes de EHW e DL (Rice, 1989).
2.6. Estrutura genética populacional
A existência de estrutura genética entre as populações estudadas foi
verificada através das estatísticas F de Wright (Wright, 1951), estimada com o
auxílio do programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2002) e confirmada com os
programas ARLEQUIN (Excoffier et al., 2005) e TFPGA (Miller, 1997). A
distância de Nei (1978) e identidade genética foram calculadas no programa
TFPGA (Miller, 1997). O fluxo gênico foi estimado a partir do numero de
migrantes por geração (Nm), onde Nm=0,25(1-FST)/FST, baseado nos valores
de FST, com ajuda do programa POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999).
A análise da variância molecular (AMOVA) foi estimada com o programa
ARLEQUIN 3.1 (Excoffier et al., 2005), utilizando intervalo de confiança de 95%
e 10000 permutações. Essa análise foi realizada para verificar o grau de
diferenciação genética entre as duas populações estudadas, com base nos
valores de FST.
Para verificar se as populações analisadas apresentam diferenciação
genética foi realizada uma análise bayesiana implementada no programa
STRUCTURE 2.3.1 (Pritchard et al., 2000), que atribui indivíduos a numero k
de populações, assumindo equilíbrio de Hardy-Weinberg e ausência de
desequilíbrio de ligação entre os locos analisados dentro de cada população.
Para essas análises foi usado o modelo de mistura (admixture model), onde
cada indivíduo pode ter ancestrais de mais de uma população, e frequências
alélicas correlacionadas, permitindo uma sensível identificação de populações
sub-estruturadas (Falush et al., 2003).
Foram realizadas 10 réplicas para cada valor de k, variando de um a
quatro, com valores de corte (burnin) de 50.000 permutações e Markov Chain
Monte Carlo (MCMC) com 1.000.000 permutações. O número de clusters (k) foi
inferido pelo método proposto por Pritchard et al (2000), realizado com o auxílio
do programa STRUCTURE HARVESTER 0.56.3 (Earl, 2009), disponível no
sítio http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/. A análise envolvendo o
32
programa STRUCTURE foi realizada utilizando os recursos do sítio BioHPC na
internet da unidade de serviço de biologia computacional da Universidade de
Cornell (http://cbsuapps.tc.cornell.edu/index. aspx).
33
Loco A Tamanho (pb) HE HO PIC FIS
Ada06 9 96-118 0,713 0,466 0,662 0,349Ada09 7 142-154 0,764 0,772 0,724 -0,010Ada20 11 302-332 0,823 0,733 0,797 0,111Ada23 10 124-168 0,761 0,603 0,719 0,208Ada24 6 221-243 0,737 0,673 0,684 0,088Ada27 10 135-163 0,764 0,561 0,725 0,267Ada32 7 180-198 0,714 0,683 0,659 0,043Ada34 9 89-105 0,792 0,759 0,756 0,042Ada40 15 200-242 0,758 0,638 0,735 0,159Ada41 10 275-301 0,711 0,552 0,671 0,226Ada52 8 134-152 0,713 0,735 0,657 -0,030Ada57 10 188-210 0,861 0,842 0,833 0,022Total 112 89-332 0,759 ± 0,047 0,668 ± 0,104 0,719 ± 0,056 0,123 ± 0,119
3. RESULTADOS
3.1. Análise da variabilidade genética e equilíbrio de Hardy-Weinberg
Foram observados 112 alelos (A), entre os 60 indivíduos das duas
populações de A. darlingi, distribuídos nos doze locos microssatélites, com uma
média de 9,3 alelos por loco. O número de alelos por loco variou entre seis
(Ada24) a 15 (Ada40), e o tamanho em pares de bases variou de 89 a 332. A
heterozigosidade esperada (HE) variou entre 0,711 (Ada41) e 0,861 (Ada57)
com uma média de 0,759 por loco, e a heterozigosidade observada (HO) variou
entre 0,466 (Ada06) e 0,842 (Ada57) com média de 0,668 por loco. A média do
Conteúdo de Polimorfismo Informativo (PIC) foi de 0,719, sendo que o loco
Ada57 apresentou o maior índice (0,833) e o Ada52 o menor (0,657). O loco
Ada06 apresentou o maior coeficiente de endogamia FIS (0,349) (Tabela 03).
Tabela 03. Conteúdo de Polimorfismo Informativo (PIC) e o índice de endogamia (FIS), obtidos para cada um dos doze locos microssatélites de Anopheles darlingi, analisados em duas populações.
Foram observados 44 alelos exclusivos entre os 112 alelos distribuídos
nas duas localidades amostradas, entre os 60 indivíduos de A. darlingi. O alelo
106 (Ada06), presente em São Gabriel da Cachoeira, mostrou a maior
frequência (0,161). As duas populações estudadas apresentaram o mesmo
número de alelos exclusivos (22). O loco Ada40 apresentou o maior numero de
alelos exclusivos (10) e o loco Ada09 o menor número (1) (Tabela 04).
34
CoariSão Gabriel da
CachoeiraAda06 106 (0,017) 106 (0,161) 5
114 (0,017) 112 (0,089)118 (0,017)
Ada09 142 (0,017) 1Ada20 332 (0,074) 308 (0,139) 4
318 (0,028)322 (0,028)
Ada23 154 (0,033) 132 (0,071) 5162 (0,017) 134 (0,036)168 (0,017)
Ada24 237 (0,019) 2243 (0,056)
Ada27 157 (0,034) 153 (0,018) 3163 (0,034)
Ada32 186 (0,017) 2198 (0,033)
Ada34 89 (0,071) 91 (0,019) 2Ada40 222 (0,048) 200 (0,058) 10
226 (0,024) 202 (0,154)228 (0,024) 224 (0,135)
232 (0,038)236 (0,038)240 (0,019)242 (0,019)
Ada41 285 (0,034) 4289 (0,069)299 (0,017)301 (0,017)
Ada52 134 (0,040) 136 (0,042) 4142 (0,021)152 (0,021)
Ada57 188 (0,024) 2210 (0,095)
Total 22 22 44
Locos Total
População
Foram estimados o numero de alelos, as heterozigosidades observadas
(HO) e esperadas (HE), a probabilidade (P) para o teste de equilíbrio de Hardy-
Weinberg (HWE) e o coeficiente de endogamia (FIS) por loco em cada uma das
duas localidades estudadas (Tabela 05). A heterozigosidade observada (HO)
Tabela 04. Alelos exclusivos (em pb) e suas frequências (valores entre parênteses) analisados em doze locos microssatélites de duas populações de Anopheles darlingi.
35
variou entre 0,357 (Ada06 e Ada27 - São Gabriel da Cachoeira) e 0,952 (Ada57
- Coari), enquanto que, a heterozigosidade esperada (HE) variou entre 0,604
(Ada40 - Coari) e 0,871 (Ada57 – Coari). Os valores de FIS variaram entre -
0,064 (Ada09 e Ada32 – Coari) e 0,520 (Ada06 – São Gabriel da Cachoeira).
Foi revelado desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg em apenas uma
localidade amostrada, provavelmente devido ao excesso de homozigotos. A
população de São Gabriel da Cachoeira apresentou dois locos em desequilíbrio
(Ada 06 e Ada27), após a correção de Bonferroni (P=0,0042) (Rice, 1989)
(Tabela 05). Não foi observado desequilíbrio de ligação significativo entre os
locos em nenhuma localidade.
Após uma análise geral, envolvendo os doze locos para cada localidade
(Tabela 06) o número de alelos totais foi igual nas duas populações estudadas
(AT=90), enquanto que a riqueza alélica, a média da diversidade gênica e da
heterozigosidade observada revelaram valores próximos entre elas, sendo que
em Coari encontrou-se valores pouco elevados (AR= 6,74; HO= 0,697;
diversidade gênica = 0,601 ± 0,316). No entanto, a media da heterozigosidade
esperada foi maior em São Gabriel da Cachoeira (0,756) e menor em Coari
(0,737). A média do coeficiente de endogamia (FIS) foi de 0,055 em Coari e
0,166 em São Gabriel da Cachoeira (Tabela 06).
36
População Ada06 Ada09 Ada20 Ada23 Ada24 Ada27 Ada32 Ada34 Ada40 Ada41 Ada52 Ada57Coari N 30 28 27 30 25 29 30 28 21 29 25 21
A 7 6 8 8 4 9 7 8 8 10 5 10HO 0,567 0,821 0,741 0,633 0,600 0,759 0,800 0,750 0,476 0,586 0,680 0,952
HE 0,666 0,773 0,819 0,693 0,673 0,800 0,753 0,751 0,604 0,747 0,696 0,871
FIS 0,151 -0,064 0,097 0,087 0,110 0,052 -0,064 0,002 0,216 0,218 0,023 -0,096
HWE 0,073 0,710 0,172 0,537 0,126 0,485 0,845 0,475 0,034 0,350 0,825 0,650São Gabriel
da Cachoeira
N 28 29 18 28 27 28 30 26 26 29 24 17
A 6 7 10 7 6 8 5 8 12 6 7 8HO 0,357 0,724 0,722 0,571 0,741 0,357 0,567 0,769 0,769 0,517 0,792 0,706
HE 0,736 0,751 0,811 0,747 0,781 0,719 0,662 0,790 0,835 0,679 0,740 0,818
FIS 0,520 0,037 0,112 0,239 0,053 0,508 0,146 0,027 0,080 0,241 -0,071 0,141HWE 0,000* 0,032 0,271 0,026 0,071 0,000* 0,047 0,498 0,225 0,126 0,846 0,392
Tabela 05. Índices de diversidade genética obtidos em doze locos microssatélites de Anopheles darlingi, analisados em duas populações do Estado do Amazonas.
N= Número de indivíduos analisados em cada população; A= Número de alelos; HO= Heterozigosidade observada; HE= Heterozigosidade esperada; FIS= Coeficiente de endogamia; HWE= Probabilidade do teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg; *p<0,004, após correção de Bonferroni
37
População N AT AR
Média da Diversidade
GênicaMédia HO-HE FIS
Coari 30 90 6,741 0,601 ± 0,316 0,697 - 0,737 0,055
São Gabriel da Cachoeira
30 90 6,368 0,593 ± 0,315 0,633 - 0,756 0,166
Tabela 06. Índices genéticos obtidos a partir de doze locos microssatélites de Anopheles darlingi, analisados em duas populações do Estado do Amazonas.
N= número de indivíduos analisados; AT = Número total de alelos; AR = Média do número de alelos por loco ou riqueza alélica; HO= Heterozigosidade média observada; HE=
Heterozigosidade média esperada; FIS = Coeficiente de endogamia.
3.2. Estimativas da estrutura genética populacional
As análises das estatísticas F de Wright (Wright, 1951), considerando
doze locos microssatélites não revelaram estruturação genética entre as
populações estudadas. Os valores mostraram baixa diferenciação genética
entre Coari e São Gabriel da Cachoeira (FST=0,028), com variação maior
dentro de cada população (FIS=0,108), indicando que a variabilidade tem
origem intra-populacional.
Com base nas frequências alélicas, foi estimado o grau de identidade e
de distância genética segundo a metodologia proposta por Nei (1978). Os
valores de identidade genética (0,9082) e de distância genética (0,0962)
indicaram que as duas populações são geneticamente similares.
A análise da variância molecular (AMOVA) mostrou que a maior parte da
variação ocorreu dentro das populações (86,66%). Somente 2,83% da variação
fomos atribuídas entre as populações e 10,5% entre grupos dentro das
populações (Tabela 07). Esses resultados evidenciaram que as populações de
Coari e São Gabriel da Cachoeira não estão estruturadas geneticamente.
A taxa de migração foi calculada pelo programa POPGENE 1.31 (Yeh et
al., 1999), por meio de uma relação não-linear simples, segundo a fórmula
Nm= 0,25 (1- FST) / FST, resultando em uma alta taxa de fluxo gênico (Nm=
9,623) entre as duas populações de A. darlingi do Estado do Amazonas, com
base nos 12 locos microssatélites.
38
Fonte de Variação
Grau de liberdade
Soma dos quadrados
Componentes de variação
Porcentagem de variação
Entre populações
1 11,829 0,13114 2,83%
Entre grupos dentro das populações
58 252,791 0,4861 10,50%
Dentro das populaçoes
60 209,000 4,00906 86,66%
Total 119 473,620 4,6263
O número de populações (k) mais provável foi estimado pelo programa
STRUCTURE 2.3.1 (Pritchard et al., 2000), considerando todos os indivíduos
amostrados nas duas localidades, indicando apenas um cluster (k= 1) (Figura
03). O triangulo gerado por esse mesmo programa mostra que as duas
populações se sobrepõem no centro da figura (Figura 04). Esses resultados
indicam uma única população para A. darlingi amostrados nas duas
populações (Coari e São Gabriel da Cachoeira) do Estado do Amazonas.
Tabela 07. Análise da variância molecular (AMOVA) em duas populações de Anopheles darlingi do Estado do Amazonas, utilizando doze locos microssatélites.
39
Figura 03. Valor de k=1 cluster, obtido a partir de análise Bayesiana implementada no programa STRUCTURE, para k variando entre 1 a 4. LnP(D)= probabilidade a posteriori, k= número de agrupamentos possíveis.
Figura 04. Triângulo gerado pelo programa STRUCTURE, indicando que todos os indivíduos se encontram no centro.
40
4. DISCUSSÃO
A capacidade de adaptação de uma população a um ambiente em
mudança depende da variabilidade genética, que é o conjunto das variações
genéticas que podem existir entre os membros de uma população. A genética
de populações acompanha a variabilidade genética das populações naturais,
delimita populações, define o nível e limite do fluxo gênico, permitindo entender
como a evolução ocorre na natureza. É o estudo de como as leis de Mendel e
outros princípios da genética se aplicam em populações inteiras (Hartl e Clark,
1997).
O modo como à variabilidade genética está organizada nos mostra se
uma população esta estruturada geneticamente, e isso nos permite fazer
melhoramentos genéticos, manejo, conservação, decidir como recuperar
ambientes degradados, ou ainda, subsidiar programas de controle.
4.1. Variabilidade genética em Anopheles darlingi
A variabilidade genética pode ser medida por vários parâmetros, entre
eles, o grau de polimorfismo, o numero total de alelos, e as heterozigosidades
(esperada e observada) são os mais utilizados. A variação genética encontrada
nessas duas populações de A. darlingi, com base nos doze locos analisados
está de acordo com os dados de literatura para essa espécie e outros
culicídeos. A riqueza alélica foi praticamente a mesma nas duas populações
(Tabelas 06). Conn et al. (2006), estudando sete populações brasileiras dessa
espécie, sendo três do Amapá, três do Pará e uma do Mato Grosso do Sul,
utilizando oito locos microssatélites, encontraram um total de 109 alelos com
uma média de 13,5 alelos por loco. Uma grande variação alélica foi encontrada
por Scarpassa e Conn (2007), com sete locos microssatélites, cujo número
total de alelos foi 105, com uma variação entre 5 a 25 alelos por loco, em nove
populações de A. darlingi procedentes da Amazônia brasileira.
Entretanto, Santos et al. (1999), utilizando marcadores isoenzimáticos,
encontraram em média 2,04 alelos por loco em populações da Amazônia
brasileira, indicando baixa diversidade alélica comparada com os marcadores
41
microssatélites. Esses resultados confirmam a eficiência dos microssatélites,
denotando que esses podem ser seis vezes mais variáveis do que isoenzimas.
Freitas-Sibajev et al. (1995) realizaram um estudo baseado nos sítios de
restrição do DNA mitocondrial e caracteres morfológicos em quatro populações
de A. darlingi da Amazônia e duas do sudeste brasileiro. A divergência
nucleotídica interpopulacional estimada não foi significativa (0,001-0,008).
Todavia, a população de Manaus, semelhante aos dados isoenzimáticos,
apresentou divergência interpopulacional (0,011-0,019) dentro do limite de
distância genética interespecífica para membros de complexos de espécies de
anofelinos. Estes dados associados aos de cromossomos sugeriram que A.
darlingi podia ser um complexo de espécie.
Variação alélica elevada também foi encontrada por Muturi et al. (2010)
em populações de Anopheles arabiensis do Quênia, cujo numero de alelos por
loco variou de três a 10 alelos. Maior variação foi encontrada em populações
de Anopheles albimanus da Colômbia por Gutierrez et al. (2009), utilizando
quatro locos microssatélites, onde o numero de alelos variou de 3 a 16, e a
média de alelos por loco foi de 7,94.
Resultados similares também foram encontrados em espécies de Aedes,
vetores da dengue e de outras arboviroses por Endersby et al (2009) e Bataille
et al. (2009). Os primeiros autores analisaram seis locos microssatélites de
Aedes aegypti em populações da Austrália e Vietnã, e encontraram um numero
de alelos por loco variando de 5 a 18. Os segundos autores (Bataille et al.,
2009), caracterizaram doze locos microssatélites polimórficos de Aedes
taeniorhynchus, procedentes da Ilha de Santa Cruz no Equador, e encontraram
uma variação de 2 a 15 alelos por locos.
Em relação ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi encontrado desvio
significativo em dois locos (Ada06 e Ada27) somente na população de São
Gabriel da Cachoeira, provavelmente, devido ao excesso de homozigotos,
indicados pelos valores do coeficiente de endogamia (FIS) desses locos (0,520
e 0,508). Não foi observado desequilíbrio de ligação entre os locos em
nenhuma das populações estudadas.
Desvio do equilíbrio genético resultante do excesso de indivíduos
homozigotos foi também observado por Santos et al. (1999), utilizando
isoenzimas em populações da Amazônia dessa mesma espécie. No entanto,
42
esses dados diferiram, quando comparados com os da variabilidade
cromossômica, que mostraram excesso de heterozigotos em populações da
mesma área geográfica.
Desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg, detectado pelo coeficiente de
endogamia (FIS), indicando deficiência de heterozigoto, devido à presença de
alelos nulos, efeito Wahlund ou seleção foi reportado por vários autores
(Mirabello et al., 2008; Scarpassa e Conn, 2007; Conn et al., 2006). A presença
de alelos nulos pode ser resultado da baixa informação dos primers, devido ao
grande acumulo de mutações na região flanqueadora, impossibilitando a
amplificação da PCR, resultando numa alta frequência de alelos nulos.
Deficiência de heterozigotos em relação ao equilíbrio de Hardy-
Weinberg é comumente detectada por locos microssatélites em anofelinos,
Anopheles dirus (Walton et al., 2001), Anopheles gambie (Lehmann et al.,
2003; Onyabe e Conn, 2001), Anopheles funestus (Temu et al., 2004),
Anopheles albimanus (Molina-Cruz et al., 2004; Gutierrez et al., 2009),
Anopheles arabiensis (Temu e Yan, 2005) e Anopheles moucheti (Antonio-
Nkondjio et al., 2008).
Resultados semelhantes foram encontrados em populações de Aedes
aegypti do Rio de Janeiro, com marcadores microssatélites por Costa-Ribeiro
et al. (2006), que detectaram desvios significativos do Equilíbrio de Hardy-
Weinberg, também, decorrente do déficit de heterozigotos, devido a forte
pressão de seleção, presença de alelos nulos, endogamia ou efeito Wahlund.
A grande variação quanto a heterozigosidade observada (HO= 0,466 -
0,842) e elevada heterozigosidade esperada (HE= 0,711- 0,861) somadas a
grande variação alélica obtida nesse trabalho indicam elevada variabilidade
genética nas duas populações de A. darlingi analisadas com esses
marcadores. Os valores médios de heterozigosidades, em cada uma das
populações estudadas foram semelhantes (Coari - HE= 0,737; HO= 0,697 e São
Gabriel da Cachoeira - HE= 0,758; HO= 0,633). No entanto, a média da
diversidade gênica foi maior em Coari (0,601 ± 0,316).
Valores similares foram encontrados por Scarpassa e Conn (2007)
quando analisaram populações de A. darlingi da Amazônia brasileira e
verificaram elevada variabilidade genética, com a média de heterozigosidade
esperada variando entre 0,692 a 0,855. Entre as populações analisadas no
43
Estado do Amazonas, Coari apresentou heterozigosidade esperada de 0,776 ±
0,41, semelhante a encontrada nesse estudo na mesma localidade (HE=0,737).
Mirabello et al. (2008), analisando populações dessa mesma espécie
procedentes da América Central e do Sul, também com marcadores
microssatélites, encontraram níveis elevados de polimorfismo na Amazônia
brasileira e peruana, e um baixo nível na América Central. No Peru a
heterozigosidade observada variou entre 0,44 – 0,86, no Brasil variou entre
0,74 – 0,93, e em Belize e Guatemala variou entre 0,12 – 0,68.
No entanto, outros estudos utilizando diferentes marcadores moleculares
têm mostrado moderado nível de variabilidade genética entre populações de A.
darlingi. Manguin et al. (1999), usando isoenzimas e RAPD, encontraram
valores de heterozigosidade variando entre 0,063 a 0,122, com media de 0,100
± 0,023 entre todas as populações de A. darlingi da América Central e do Sul.
Nesse estudo, os autores encontraram baixa variabilidade genética nas
populações de Belize (0,063), comparadas com as populações da América do
Sul (0,107). Eles interpretaram como sendo, provavelmente, devido à perda de
alelos em populações que estão confinadas a ambientes restritos, como ocorre
na América Central, causando o efeito gargalo de garrafa (bottleneck),
resultando em populações menos polimórficas.
Pinedo-Cancino et al. (2006), utilizando RAPD em populações de A.
darlingi da Amazônia peruana, encontraram valores de heterozigosidade
esperada variando entre 0,27 a 0,32, demonstrando variabilidade genética um
pouco maior do que as verificadas por Manguin et al. (1999). Contudo esses
resultados ainda foram bem menores do que os obtidos no presente estudo.
Um outro estudo realizado com marcadores RAPD feito por Silva et al.
(2008), em quatro populações de A. darlingi da Amazônia brasileira, revelaram
elevada variabilidade genética nessas populações. Das quatro populações
analisadas, a de São Gabriel da Cachoeira apresentou maior variabilidade
genética (P= 97,37%; HE= 0,3202) e a menor foi observada na população de
Manaus (P= 78,94%; HE= 0,2741).
Níveis elevados de variabilidade genética foram observados em outros
anofelinos, usando marcadores microssatélites. Anopheles albimanus, um
importante vetor do Caribe e regiões da Colômbia, revelaram heterozigosidade
esperada variando entre 0,681 em La Ensenada a 0,784 em Turbo, com média
44
de 0,746 (Gutierrez et al., 2009). Populações de Anopheles arabiensis
provenientes do Quênia, apresentaram média de heterozigosidade observada
elevada, variando entre 0,558 e 0,608, comparada com as observadas nos
mesmos locos na África ocidental (Muturi et al., 2010). Anopheles gambie,
principal vetor da África, apresentou heterozigosidade esperada variando de
0,56 a 0,76 (Midega et al., 2010). Ampla variação foi observada em Anopheles
moucheti, que revelou heterozigosidade esperada variando de 0,228 a 0,833, e
média de 0,689 (Antonio-Nkondjio et al., 2008). Esses resultados foram
similares ao encontrado nas duas populações de A. darlingi analisadas nesse
estudo.
4.2. Estrutura genética em populações de Anopheles darlingi
Estrutura genética populacional é o modo como à variabilidade genética
esta organizada em populações. Entender como uma população está
estruturada geneticamente é importante para conservação genética,
melhoramento genético, manejo, recuperação de ambientes degradados e
controle de vetores de doenças.
A deriva genética, o fluxo gênico, a mutação e a seleção são fatores que
interferem na variação genética, contribuindo para a estruturação genética
populacional. Quanto maior a deriva, a mutação e a seleção, maior a
estruturação da variação genética. Quanto mais intenso o fluxo gênico, menor
a probabilidade de estruturação populacional.
Normalmente, numa dada população, a estruturação genética inicia a
partir da diferenciação genética intrapopulacional ou desvio da panmixia dentro
das subpopulações (FIS>FST). Este processo foi observado nas duas
populações de A. darlingi analisadas com base nos doze locos microssatélites,
em que o valor de FIS (0,108) foi maior do que o de FST (0,028), indicando
diferenciação genética entre as populações de apenas 2,8%.
Pequena diferenciação genética intrapopulacional também foi
encontrada em populações de A. darlingi da Amazônia, numa análise
isoenzimática (FIS= 0,083 > FST= 0,026), permitendo verificar que a maior
variabilidade genética é de origem intrapopulacional. Grande similaridade
45
genética entre as populações da Amazônia (D= 0,010-0,024) também foi
observada (Santos et al., 1999).
Utilizando caracteres morfológicos, isoenzimas, DNA ribossômico (ITS-
2) e RAPD em populações de A. darlingi procedentes de sete países na
América Central e do Sul, valores significantes de FST (0,102 - 0,204) entre
populações dessas localidades foram obtidos, apesar da elevada identidade
genética (I= 0,976- 0,995) dentro das populações. A população de Belize
apresentou uma pequena deleção de três bases (CCC), quando comparada
com as populações da América do Sul, que representa uma diferença de
0,74% de variação intraespecífica no ITS2 (Manguin et al., 1999).
Marcadores RAPD aplicados em quatro populações de A. darlingi da
Amazônia brasileira, revelaram pequena estruturação microgeográfica,
decorrente de alguma barreira, indicando redução do fluxo gênico entre essas
populações (FST= 0,0851 ± 0,0075) (Silva et al., 2008).
Por outro lado, Pinedo-Cancino et al. (2006), encontraram valores
similares aos desse trabalho, em populações desse mosquito na Amazônia
peruana, com esse mesmo marcador, e diferentes dos obtidos por Silva et al.
(2008) em populações desse mosquito da Amazônia brasileira. Os valores de
FST e de distancia genética obtidos nas nove populações peruanas (FST= 0,030;
D= 0,017), mostraram tratar-se de populações homogêneas.
Angêlla et al. (2007) analisaram populações de A. darlingi provenientes
de quatro localidades de Porto Velho, utilizando o sequenciamento de um
fragmento do gene mitocondrial ND4. Do total de 218 indivíduos coletados em
diferentes períodos, foram obtidos 20 haplótipos, com índice de divergência de
0,756, sugerindo presença de sub-populações. Apesar da elevada diversidade
haplótipa, comparações de mosquitos coletados em dois períodos diferentes
(Abril e Outubro) não revelaram diferenciação significativa (FST= 0,005) entre as
populações. O mesmo padrão de distribuição de haplótipos foi observado por
Molina-Cruz et al. (2004) em populações de Anopheles albimanus da América
Central.
Conn et al. (2006) utilizando oito locos microssatélites em populações de
A. darlingi dos estados do Amapá, Pará e Mato Grosso, mostraram valores de
heterozigosidade e de FST bastante elevados (HE= 0,834; FST= 0,1841),
indicando estruturação genética, e grande diferença entre as populações das
46
regiões norte e sul do rio Amazonas, propondo um grau de isolamento genético
atribuído, possivelmente, a isolamento por distância.
Ainda, baseados nesses mesmos locos microssatélites, Scarpassa e
Conn (2007), analisaram a variabilidade genética de nove populações de A.
darlingi da Amazônia brasileira, e verificaram que o FIS foi positivo na maioria
das populações, sendo o valor médio de FST de 0,044, elevado fluxo gênico
entre populações com distância menor ou igual a 152 km, e reduzido, mas não
ausente entre populações com escala geográfica maior. Esse estudo sugere
pouca estrutura genética para A. darlingi na Amazônia brasileira central e
ocidental.
Mirabello et al. (2008) analisaram a estrutura genética de 31 populações
de A. darlingi procedentes da América Central, Amazônia peruana e brasileira,
usando 5-8 locos microssatélites, e encontraram diferenciação genética
significativa (FST = 0,1859 – 0,3901; P < 0,05) entre populações da América
Central e da Amazônia. Baseado na distância genética foram encontrados dois
grupos de populações, um incluindo as populações de Belize e Guatemala
(genótipo 1) e o outro, incluindo todas as amostras da Amazônia peruana e
brasileira (genótipo 2). Estimativas do fluxo gênico revelaram baixo ou
nenhuma recorrência entre o genótipo 1 e 2, com moderado nível de
diferenciação genética, atribuído ao isolamento por distância.
A maior porcentagem de variação genética encontrada dentro das
populações (86,66%) de A. darlingi desse trabalho corrobora com os obtidos
pelo FST, mostrando que não houve diferenciação genética significativa entre as
mesmas. Resultados semelhantes foram obtidos por Scarpassa e Conn,
(2007), que encontraram 94 - 95% (P<0,001) da variação genética entre as
populações, cerca de 3% entre grupos e apenas 2% entre populações dentro
de grupos, havendo uma correlação significativa entre a distância geográfica e
os valores de FST (R²=0,893; P<0,0002), o que apóia o modelo de isolamento
por distância.
Ao analisar a variância molecular em populações de A. darlingi da
Amazônia brasileira oriental Conn et al. (2006) observaram 84% de variação
dentro das populações, mas evidenciaram variação significativa (12-13%) entre
as populações do Estado do Amapá e Pará.
47
Baseado em DNA mitocôndrial Angêlla et al. (2007), não evidenciaram
estrutura genética dentro das populações de Porto Velho (RO), com o teste da
AMOVA. A maior parte da diferenciação genética (99,86%) foi explicada
quando comparados entre indivíduos, independentemente, do ponto de coleta
ou período de coleta, indicando presença de sub-populações.
Muturi et al. (2010), analisando estrutura genética populacional de
Anopheles arabiensis no Quênia Central, com nove locos microssatélites, não
encontraram diferença genética significativa entre as populações analisadas,
com somente 0,6% da variação entre populações, enquanto que uma elevada
quantidade de variação (99,4%) foi observada dentro das mesmas.
A alta taxa de fluxo gênico (Nm= 9,62) encontrada entre as populações
de Coari e São Gabriel da Cachoeira, medida pelo número de indivíduos
migrantes, com base nos valores de FST, indica que elas podem ser
consideradas uma única população panmítica. Segundo Kimura e Maruyama
(1971), as populações estão diferenciadas geneticamente quando o Nm<1, e
consideradas como uma única população panmítica quando o Nm>4.
A existência de uma única população foi corroborada com o programa
STRUCTURE 2.3.1 (Pritchard et al., 2000), por meio da análise Bayesiana,
considerando todos os indivíduos analisados nas duas localidades, indicando
apenas um cluster (k= 1).
Situação semelhante foi observada por Scarpassa e Conn (2007) entre
populações de A. darlingi de Coari (AM) e Porto Velho (RO), separadas por
uma grande distância geográfica, que apresentaram baixa diferenciação
genética e grande fluxo gênico (FST= 0,030 e 0,024; Nm= 16,2 e 20,0;
respectivamente).
Pinedo-Cancino et al. (2006), utilizando RAPD em populações de A.
darlingi da Amazônia peruana, encontraram elevados valores de Nm (8,0 -
29,7), sugerindo que o fluxo gênico, ao contrário da deriva genética, é o fator
evolutivo que está atuando sobre a ausência de estrutura genética dessas
populações de mosquitos, interferindo fortemente na variabilidade genética
entre elas. Os autores acreditam que esses mosquitos pertenceram a uma
única população ancestral que se expandiu muito recentemente e não houve
tempo suficiente para se diferenciar.
48
Dessa forma, apesar das distâncias e barreiras geográficas, as
populações de A. darlingi de Coari e São Gabriel da Cachoeira no Estado do
Amazonas, são geneticamente semelhantes, conforme indicam os valores de
distância genética; apresentam taxas de fluxo gênico elevado e são
consideradas como uma única população, podendo ser usado à mesma ação
epidemiológica nas duas populações estudadas. Assim, o conhecimento da
estrutura genética das populações pode contribuir de forma mais efetiva para
subsidiar programas de controle desse vetor.
49
5. CONCLUSÕES GERAIS
• Os 36 locos microssatélites isolados e caracterizados mostram-se
eficientes para a análise da variabilidade genética de populações de
Anopheles darlingi (Capitulo I);
• A amplificação heteróloga de 24 locos microssatélites resultou em oito
locos amplificados nas três espécies testadas do subgênero
Nyssorrynchus, sendo 17 em pelo menos uma. O número de locos
amplificados variou entre 10 (A. rangeli) e 15 (A. benarrochi). Treze
locos foram polimórficos em pelo menos uma espécie e variou entre oito,
em A. rangeli, e 13 locos, em A. triannulatus (Capitulo I);
• Os locos microssatélites isolados poderão ser usados como eficientes
marcadores para investigar genética de populações e mapeamento
genético de A. darlingi e de outras espécies de Anopheles (Capitulo I);
• Os 12 locos microssatélites foram eficientes para a análise da
variabilidade e estrutura genética nas duas populações de A. darlingi do
Estado do Amazonas (Capitulo II);
• As duas populações estudadas apresentaram níveis elevados de
variabilidade genética (Capitulo II);
• Apenas a população de São Gabriel da Cachoeira apresentou dois locos
desviando do equilíbrio de Hardy-Weinberg, devido ao excesso de
homozigotos (Capitulo II);
• O fluxo gênico entre Coari e São Gabriel da Cachoeira foi elevado,
conforme calculado pelo numero de migrantes (Nm), baseado nos
valores de FST (Capitulo II);
• As estatísticas F de Wright revelaram baixa diferenciação genética entre
as populações, e mostraram que a variabilidade genética é
intrapopulacional (Capitulo II);
• As populações de Coari e São Gabriel da Cachoeira são geneticamente
similares, segundo a distância genética (Capitulo II);
• As duas populações analisadas foram agrupadas em um único cluster
(k=1), sugerindo que elas são altamente homogêneas, consideradas
50
uma única população panmítica. Assim, pode-se usar nas duas
populações estudadas, a mesma ação epidemiológica, em programas
de controle da malária (Capitulo II).
51
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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